Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS | Protocol (Translated to Italian)\nVi presentiamo un semplice protocollo per ottenere filmati di microscopia a fluorescenza di crescita cellule di lievito, e un pacchetto software basato su GUI per estrarre i dati cella singola serie storica. L'analisi include lignaggio automatico e l'assegnazione a divisione di tempo integrato con ispezione visiva e curation manuale dei dati rilevati.\nFluorescenza time-lapse microscopia è diventato un potente strumento per lo studio di molti processi biologici a livello di singola cellula. In particolare, i film che descrivono la dipendenza temporale di espressione genica fornire una conoscenza delle dinamiche della sua regolazione, tuttavia, ci sono molte sfide tecniche per ottenere e analizzare i film di fluorescenza di singole cellule. Descriviamo qui un semplice protocollo utilizzando un dispositivo cultura microfluidica disponibile in commercio per produrre tali dati, e una, interfaccia MATLAB basata utente grafica (GUI) basata su software per quantificare le immagini di fluorescenza. I segmenti software e cellule tracce, consente all'utente di curare visivamente errori nei dati, e assegna automaticamente lignaggio e tempi di divisione. La GUI analizza ulteriormente la serie temporale di produrre tracce cellule intere e le loro derivate prime e seconde tempo. Mentre il software è stato progettato per S. cerevisiae, la sua modularità e versatilità dovrebbero permettere tØ fungere da piattaforma per lo studio di altri tipi di cellule con poche modifiche.\nAnalisi di singole cellule di espressione genica ha favorito la nostra comprensione di molti aspetti della regolazione genica. Istantanee statiche di espressione reporter fluorescente mediante citometria di flusso o microscopia forniscono utili informazioni sulla distribuzione di espressione singola cellula, ma non hanno la storia e l'evoluzione dei dati di serie storiche necessarie per informare direttamente le dinamiche di espressione genica. Fluorescenza time-lapse microscopia presenta un mezzo per ottenere entrambe le misure monocellulari e la loro storia. Varie tecniche sperimentali e analitiche sono state sviluppate per ottenere e quantificare i film d'espressione reporter fluorescente, conferendo così intuizioni funzioni di regolazione genica (vedi 1 per una rassegna) come variazione cella-a-cella 2,3, formazione persister batterica 4, trascrizione iniziazione e di allungamento 5, trascrizionale scoppio 6,7, ciclo cellulare dipendenza da 8,9, e ereditabilità 10. Tuttavia, OBTaining cella singola serie temporale fluorescenza di qualità comporta notevoli difficoltà tecniche coltura un monostrato di cellule in un ambiente controllabile e quantificazione in high-throughput dei film fluorescenza acquisiti. Qui, descriviamo una procedura per ottenere e analizzare i film di fluorescenza di S. cerevisiae con nessuna esperienza richiesta nella produzione di dispositivi di coltura cellulare o in fase di sviluppo del software (Figura 1).\nIn primo luogo, abbiamo dettagliatamente un protocollo di esempio per generare in tempo fluorescenza i film di serie per il lievito in erba esprimere uno o più giornalisti fluorescenti. Sebbene camere di coltura microfluidica personalizzati sono stati costruiti e impiegati con successo in precedenza 11-13, utilizziamo un dispositivo microfluidica disponibile in commercio da CellAsic (Hayward, CA). Le cellule del sistema limita a crescita monostrato e permette il controllo continuo dell'ambiente di perfusione. Il protocollo di microscopia che presentiamo è un semplice mezzo per ottenere flfilm senza di lievito in erba, ma qualsiasi protocollo modificato sperimentale (un dispositivo cultura personalizzata, condizioni di media alternativi, ecc.) che producono dati di filmati fluorescenza simili di cellule di lievito singoli possono essere sostituiti.\nSuccessivamente, abbiamo delineare l'analisi dei filmati utilizzando una interfaccia grafica utente (GUI) basata su software in MATLAB (Mathworks, Natick, MA), soprannominata la GUI per analisi rapide del Tempo fluorescenza Series (INNESTI), per estrarre i dati di serie temporali per singole cellule. INNESTI ha caratteristiche simili al versatile, software open-source pacchetto Cell-ID 14 in segmentazione e monitoraggio delle cellule e nell'estrazione intensità di fluorescenza e di informazioni geometriche. Tuttavia, innesti fornisce importanti funzionalità aggiuntive. In primo luogo, offre un facile editing interattivo di segmentazione e monitoraggio dei risultati per verificare l'accuratezza dei dati, piuttosto che solo gating statistica dei valori anomali regione tracce dopo l'analisi. Inoltre, si estende l'analisi ai automatically designato lignaggio e punti del ciclo cellulare di interesse di lievito in erba. Determinare quando madre e figlia si dividono per formare due regioni di cellule indipendenti, è fondamentale per la determinazione delle cellule insieme (madre compresa qualsiasi gemma collegato) misurazioni durante tutto il ciclo cellulare 8. La suite si compone di tre moduli per eseguire queste operazioni. I primi segmenti regioni cellulari basati sul contrasto tra le immagini in campo chiaro mirate e vago, e permette all'utente di definire e verificare visivamente i parametri di segmentazione. Le seconde tracce (. Utilizzando Blair e MATLAB implementazione di Dufresne della Crocker et al IDL di routine, disponibili presso: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) e le misure regioni cellulari attraverso il tempo; assegna automaticamente lignaggi, e consente l'ispezione visiva e correzione di errori. Una semplice interfaccia grafica complotto è incluso per le proprietà cella singola query. Il terzo modulo attribuisce gemma emergere e divisione TImes, ed emette dati cellula intera serie temporali nonché le loro derivate prime e seconde tempo (come discusso in 9). Il modulo di analisi emette i dati come file di testo delimitato da spazi per studio successivo nel software statistico di scelta. Così, il pacchetto consente all'utente di estrarre dati di serie temporali di elevata qualità mediante un'interfaccia grafica. Abbiamo usato questo metodo per stimare i tassi di trascrizione in tempo reale in singole cellule di lievito in erba in funzione del ciclo cellulare 9. Mentre i moduli sono stati ottimizzati per il lievito in erba, i parametri o, se necessario, il codice liberamente disponibile può essere adattato per altri organismi e tipi di immagine. Segmentazione, tracking, e lignaggio algoritmi di assegnazione possono essere specifiche per i tipi di immagini assegnato e l'organismo in questione. Gli algoritmi esistenti potrebbero essere sostituiti, ma conservano ancora l'interfaccia grafica che permette l'ispezione di facile visiva e la correzione degli errori di segmentazione e monitoraggio che invariabilmente occupantir con qualsiasi algoritmo.\n1. Ottenere fluorescenti Film Microscopia di cellule di lievito singole Crescere in una Camera Microfluidic\nInoculare 1 ml SC supporti (supporti definiti sintetici con 2% di glucosio e completo complemento di aminoacidi) con celle da una piastra di fresco in crescita, e incubare la coltura durante la notte ~ 16 ore su un tamburo rullo a 30 ° C. Preparare la cultura in modo che il finale OD 600nm è ~ 0.1 per la fase di crescita logaritmica presto.\nDiluire la coltura starter come necessario e ricrescere 1 ml in una provetta fresco ulteriori 6-8 ore di OD 600 nm = 0,1. Questo fornisce le cellule che crescono in un nutriente stato stazionario ad una densità adatta per il caricamento nel dispositivo microfluidica. (In alternativa, sostituire i passaggi 1,1-1,2 con la procedura necessaria per preparare cellule come richiesto per l'esperimento.)\nPreparare una piastra di coltura microfluidica Y04C da CellAsic: rimuovere la soluzione di navigazione; lavare i pozzetti con acqua sterile, e con il flusso del sistema di perfusione ONIXacqua attraverso pozzi 1-6 a 6 psi per 5 minuti per lavare i canali. Quindi, il flusso dal carico ben 8 a 6 psi per 10 sec (il canale di carico ha portate molto elevate e deve essere lavata separatamente).\nTogliere l'acqua da tutti i pozzetti e sostituirlo con 250 ml SC nell'insenatura pozzi 1-6 e 50 microlitri della cultura dal punto 1.2 a cella di carico ben 8. (In alternativa, inserire il supporto desiderato nei pozzi di aspirazione 1-6 per esperimenti che richiedono la commutazione tra diverse condizioni.)\nSigillare il collettore ONIX alla piastra, e cominciare adescamento i canali e da camera di coltura fluisce da ingresso a 6 pozzetti 1-6 psi per 2 min seguita da almeno 5 min a 6 psi da solo il bocchettone contenente il supporto di partenza per la esperimento. Fluire questo continuamente fino alla fase 1.7.\nPreparare il microscopio per l'esperimento. Usiamo un Zeiss Axio Observer.Z1 widefield microscopio con una II retroilluminato fotocamera EMCCD Cascade (fotometrici, Tucson, AZ) e di un arco di 200 a ioduri metallici LumenLampada (PRIMA scientifico, Rockland, MA) per eccitazione di fluorescenza attenuato al 10% per evitare photobleaching. Per ridurre al minimo il tempo di commutazione necessario per acquisire in canali fluorescenti più, abbiamo una sola coppia, cubo filtro a tripla banda dicroica ad adeguate eccitazione / emissione filtri per CFP, YFP, e RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; serie 89006) impostare in, fast-switching ruote filtro esterno (Ludl prodotti elettronici, Novato, CA).\nVersare qualche goccia di liquido immersione sull'obiettivo (se necessario, si usa una Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC), e montare il dispositivo microfluidica saldamente nella fase del microscopio invertito. Assicurare la piastra non sposta affatto in fase di tutto l'esperimento migliora il tracciamento delle cellule durante l'analisi dei dati. Abbiamo semplicemente nastro la piastra al supporto stadio per evitare il suo spostamento.\nConcentrarsi sul terzo più a sinistra della prima camera di coltura (dove l'altezza della camera è più piccola) utilizzando uno embedded posizionezione marcatori. Spegnere il flusso dalla bocca dei media bene, e il flusso di celle di carico ben 8 a 6 psi in 5 secondi scoppia. Spostare lo stadio di guardarsi intorno alla camera di coltura per cellule. Aumentare il tempo di caricamento e pressione fino a densità cellulare desiderato è raggiunto, ma evitare il sovraccarico e intasamento della barriera più a sinistra, dove mezzi freschi entra nella camera.\nIniziare fluisce dall'ingresso supporti pozzetto contenente il supporto a partire da 6 psi.\nIn MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) o altri automazione microscopia e software di controllo, impostare una acquisizione multi-dimensionale di una serie di immagini per più posizioni di stage nel corso del tempo. Impostare il numero di e l'intervallo tra i punti di tempo. Seleziona più posizioni di stage con ~ 10 celle ciascuno (più sarà sovraffollamento rapidamente). Usiamo tipicamente intervalli di 5 min e l'immagine fino a 16 posizioni, che richiedono ciascuna ~ 11 secondi per l'acquisizione ad ogni tempo.\nImpostare l'acquisizione in modo che ad ogni posizione fase in ogni punto ª voltaprogramma di e sarà: concentrarsi sul campo chiaro a luce trasmessa (BF) immagine usando di MetaMorph metodo incorporato autofocus (in attuazione della messa a fuoco automatica, come un diario personalizzato scritto all'inizio di ogni posizione di fase fornisce un maggiore controllo sulla precisione di fuoco); acquisire la BF immagine a 1 micron al piano focale (fp); acquisire una BF fuori fuoco (BFOOF) immagine a -4 micron alla fp (utilizzare riviste personalizzate scritte per modificare la messa a fuoco, come richiesto tra le immagini), e acquisire una scala di grigi immagine per ogni reporter fluorescente alla fp utilizzando le impostazioni ottimizzate per una rapida acquisizione con il minimo photobleaching.\nSe necessario, ottenere immagini di sfondo e ombreggiatura di correzione per ogni reporter fluorescente in una zona della camera di coltura privo di celle.\nPreparare il programma di flusso per l'esperimento nel software di controllo ONIX. Iniziare contemporaneamente il programma di acquisizione nel MetaMorph e il programma di flusso nel software di controllo ONIX.\nAlla fine dell'esperimento, correggere ONUanche background e ombreggiatura nelle immagini fluorescenti (se necessario) e, facoltativamente, unire i file. tif per ogni canale dell'immagine in ciascuna posizione stadio in un file di filmato. stk (ad esempio creare BF, BFOOF, CFP, YFP e film RFP per la posizione 1 ).\n2. Formato e segmento dati per puntare Utilizzando la FormatData GUI in MATLAB (figura 2)\nEseguire il file FormatData.m in MATLAB per aprire l'interfaccia grafica di input di dati. Nella parte superiore, specificare o individuare la cartella che contiene i file di immagine per impostare la directory di dati, e quindi utilizzare l'interfaccia grafica per specificare i tipi di dati e file di immagini registrati nell'esperimento.\nA destra, selezionare il pulsante di opzione accanto a "time-lapse" per indicare che tipo di analisi da eseguire. "Time-lapse" tratterà la serie di immagini come una serie temporale (ad esempio, un film di cellule che crescono in una camera microfluidica). "Static" tratterà ogni serie di immagini come una serie di istantanee scattate da una popolazione (ad esempio, le immagini più prese a difrenti posizioni su un campione unico scivolo). In questa versione innesti, dati time-lapse per più posizioni possono essere trattati, ma in un file separato per ogni posizione (vedi punto 2.14).\nSelezionare la casella per la registrazione dell'immagine per correggere la fase dei movimenti imprecisi spostando ogni immagine nei film di ridurre al minimo il movimento delle cellule apparente all'interno della cornice. Consigliamo vivamente questo in quanto migliora notevolmente il monitoraggio (riduzione manuale curation pista dopo), ma aggiungerà, "rumore bianco" valori di pixel casuali a compilare in cui le immagini sono state spostate alla frontiera. Potrebbe anche essere selezionato dopo aver visto le immagini BF segmentate in fase 2.7 o in qualsiasi punto fino al passo 2.13.\nSelezionare la casella "brillante campo" nel pannello "Dati Canali". Fare clic su "Seleziona" per il diritto di caricare le immagini BF. Per i file *. TIF, selezionare tutte le immagini BF corrispondenti ad un unico filmato tenendo premuto il tasto Maiusc durante la selezione, quindi fare clic su "Apri". Per i file *. STK, basta selezionare lo stack BF di interesse. Se le immagini sono successopienamente riconosciuto, saranno elencati i nomi dei file nel menu a comparsa a destra nella "dati riconosciuti" pannello. . * Per i file TIF, accertarsi che i nomi dei file vengono visualizzati nell'ordine corretto (salvare i file con nomi sequenziali durante l'acquisizione - BF_t001, ecc.)\nControllare il "Campo Luminoso (fuori fuoco)" dialogo e utilizzare il pulsante "Select" come al punto 2.4 per caricare i file BFOOF, che verranno elencati nella popup a destra. (BFOOF ottenuto come BF -4 micron rispetto alla fp a 63X segmenti pure.)\nSelezionare la casella "Maschera di cella". Nel pannello "Maschera Source", selezionare il pulsante di opzione accanto a "Segmento BF". Premere il pulsante "Parametri" per aprire la GUI di segmentazione. (In alternativa, selezionare un filmato maschera pre-segmentato selezionando il pulsante di opzione accanto al pulsante "Select File Mask", premendo quest'ultimo, e selezionando il film come al punto 2.4. In questo caso, un film BFOOF non è necessario, e può passare al punto 2.8.)\nImpostare i vari parametri di segmentazione (descrizioni di ogni possibile visualizzarendr premendo "Descrizione dei parametri"), e testare la qualità di segmentazione facendo clic su "Test" (Figura 3). Successo regioni segmentate saranno verdi con bordi magenta. Accertarsi di utilizzare il dispositivo di scorrimento per controllare più punti di tempo nel film. Quando la segmentazione è soddisfacente, selezionare "Fatto" per riportare i parametri di segmentazione per la FormatData GUI.\nSelezionare la casella "Color Images". Immettere il nome del colore per il primo canale immagine fluorescente nella casella di modifica di testo, quindi premere "Aggiungi e selezionare" per caricare i file a colori come al punto 2.4. Il nome del colore viene aggiunto alla casella di riepilogo a sinistra, e sarà aggiunto i nomi dei file per la tabella a destra. Se viene commesso un errore nel caricare i file a colori, selezionare il nome del colore nella casella di riepilogo a sinistra e fare clic su "Rimuovi colore" per rimuovere i file. Ripetere l'operazione per ogni canale di colore.\nSe ulteriori maschere sub-regione basata su uno dei colori fluorescenti (ad esempio fluorescente nucleo → Nuclorecchio regione maschera) sono desiderati, selezionare la casella "Maschera di colore". In caso contrario, passare al punto 2.12. Nel pannello "Color Mask Source", inserire il nome della maschera sub-regione nella casella di modifica di testo. Scegliete un colore dal menu a comparsa nel pannello "Color Mask Source" (richiede il colore sono stati aggiunti al punto 6) e spingere "Parametri" per aprire una soglia di test GUI.\nPremere il pulsante "Auto-soglia" per determinare automaticamente la soglia usando il metodo di Otsu 15, e l'immagine sarà evidenziare le aree protette al di sopra della soglia (Figura 4). La soglia può essere regolata manualmente utilizzando la casella di modifica. Utilizzare la barra di scorrimento per confermare la soglia è appropriato per tutti i punti di tempo. Quando si è soddisfatti, Push "Done" per tornare alla soglia al FormatData GUI.\nPremere "Aggiungi e di settore" per generare la sub-regione maschera utilizzando il modulo di soglia applicata alle immagini a colori selezionate. Il nome maschera colore e sorgente saranno visualizzati nella tabella a sinistra, con la relativa ri nomi dei file ecognized che appaiono nella tabella a destra. (In alternativa, premere il tasto "Aggiungi e selezionare" per caricare i file di pre-fatti maschera sub-regione.)\nIn fondo, specificare o individuare la cartella desiderata da utilizzare come directory di salvataggio.\nPremere "Data Format" per leggere i file di immagine (utilizzando il codice tiffread2.m sviluppato da Francois Nedelec, disponibile all'indirizzo: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), i dati di processo, e di creare un * file. mat nella cartella specificata. Questo file servirà da input per il ProcessTimeSeries GUI.\nRipetere il passaggio 2,4-2,13 per il set di film per ogni posizione palcoscenico.\n3. Cellule della pista e lignaggi nel Tempo con ProcessTimeSeries GUI, e Curato ID e Assegnazioni Lineage (Figura 5)\nEseguire il file ProcessTimeSeries.m in MATLAB per aprire la GUI di monitoraggio. Impostare i seguenti parametri dopo l'apertura delGUI:\n"Altezza camera" ("File I / O" pannello superiore sinistro) - indica l'altezza della camera in cui le cellule sono intrappolati. È usato come un vincolo nel approssimare volume cellulare come un ellissoide 3D basato sull'asse maggiore e minore della regione cella come in 8.\n"Micron / pixel" (pannello "I / O File") - il fattore di conversione per calibrare pixel a distanza micron nelle immagini così sezione trasversale ed il volume può essere calcolato in micron 2 e 3 micron, rispettivamente.\n"Pannello Filtri" (di seguito "File I / O" del pannello) - set minimo e parametri massimi per filtrare le regioni spazzatura nella maschera: "Area" - zona in pixel, "Ecc." - fattore di eccentricità, più circolare come → 0 , "SF" - fattore di forma, più circolare come → 1.\nFare clic su "Carica immagini" nel pannello "I / O File" e selezionare il file di dati *. Tappeto di uscita interesse dal FormatData GUI. La regione maschera (e eventuali maschere sottoregione) viene applicato a ciascun canale di colore, E una serie di misure diverse sono realizzate (Tabella 1). Il file di dati viene quindi salvato. (Se si carica un file in ProcessTimeSeries da una sessione precedente, verrà richiesto se l'analisi deve essere ripetuto dall'inizio. ATTENZIONE:. Questa operazione cancellerà qualsiasi curation traccia già completata e trattare i dati come se fosse fresco dal FormatData GUI Se riavviato accidentalmente, rapidamente premere Ctrl + C nella finestra di comando di MATLAB per evitare che il file. tappetino * precedentemente curata da sovrascrittura.)\nAvanti, monitorare le cellule. Nel pannello "Cells Traccia" (accanto al pannello "Filtri"), impostare i seguenti parametri:\n"Spostamento Max" - la distanza massima in pixel di una cella può viaggiare tra immagini adiacenti prima di essere etichettato come una cella diversa. Cilindrata più elevata significa l'algoritmo può rappresentare le cellule si muovono di più, ma aumenta anche la complessità del confronto regioni cellulari in folle. Si parte alle 12 e diminuire se si verifica un errore nel monitoraggio (vedere il punto 3.4).\n"Lunghezza minima" - minimo numero di occorrenze di una traccia cella da considerare una serie di dati validi. Usiamo 1 per impedire la rimozione di tutte le tracce reali, ma questo può essere aumentato se i risultati di segmentazione a breve durata, regione tracce spurie.\n"Memory Frame" - numero massimo di fotogrammi consecutivi una regione cella può scomparire ed essere dato lo stesso ID quando ritorna. Se scompare per più di "Memory Frame", vi sarà dato un nuovo ID al ritorno. Usiamo 2 per consentire alle regioni da non perdere per segmentazione per 2 telai prima di tornare.\nFare clic su "Cellule Traccia" per monitorare le regioni da un fotogramma al successivo usando la regione centroidi (Blair e Dufresne MATLAB attuazione Crocker, Grier e Settimane di routine IDL, disponibile all'indirizzo: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , per assegnare lignaggi per i germogli appena appaiono, e per salvare i dati. Lignaggi vengono assegnati automaticamente dal minimizing distanze tra germogli putativi e potenziali madri in ogni fotogramma. (Se viene visualizzato un errore nella finestra di comando di MATLAB a causa di "combinatoria difficili", diminuiscono "Spostamento Max" e ripetere il monitoraggio.) Modificare i parametri nelle finestre popup come necessario per i vostri dati.\nCurate le regioni scarsamente segmentato ed errori in ID o assegnazioni lignaggio utilizzando i vari strumenti grafici o tasti di scelta rapida (mostrati in una finestra popup, premendo il pulsante sopra il pannello "Selected Informazioni cella").\nSlider, "Immagine precedente", "Immagine successiva" (Ctrl + sinistra / destra) - utilizzare per visualizzare e spostarsi tra i fotogrammi della serie dell'immagine.\n"Immagine #" - visualizza il numero di fotogramma corrente negli assi destro e sinistro. Spostarsi in una cornice specificata digitando il suo numero nel giusto "Immagine #" casella di modifica.\n"Cornice Delta" - mostra la differenza di numero di telaio tra gli assi destro e sinistro (Δ = destra - sinistra).\n"Hide Text" (Ctrl + T) - commuta tra la visualizzazione degli ID delle celle agli assi giusto o no.\n"Nascondi etichette" (Ctrl + L) - passare dalla visualizzazione del ID di cella negli assi di sinistra o meno.\nMenu "Mask" popup - scegliere tra la visualizzazione di alcuna maschera, la maschera di cellulare, o qualsiasi definiti dall'utente sub-maschera per la visualizzazione nel riquadro di sinistra.\nMenu a comparsa "Overlay" (Ctrl 1-9) - scegliere di visualizzare BF e strati di colore nel frame di sinistra. Spettacolo BF è l'unico che alterna lo strato BF o disattivare in entrambi gli assi. Passare dalla visualizzazione o meno selezionando il nome di sovrapposizione nel menu di nuovo ("*" indica appare overlay). Ctrl +1 alterna BF sovrapposizione, con 2-9 commutando le sovrapposizioni di colore in ordine.\n"Set Colori" - utilizzano per determinare il colore per la visualizzazione di sovrapposizione. Una finestra popup interrogherà quale canale di fluorescenza per impostare, e quindi la tavolozza dei colori appare per definizione utente.\n"Modificare le Regioni e le tracce" panel - questi controlli i cambiamenti effetto sulla regione maschera cellulare e le informazioni di traccia:\n"Aggiornamento brani" (Ctrl + U) - Utilizzo di riassegnare ID di cella. Se non ci sono le celle sono selezionate in assi giusti, la GUI chiederà un ID cella per cambiare. Quando ID X è cambiato in Y, tutte le future istanze di X saranno cambiate a Y, e le eventuali future istanze della Y attuale, saranno passati a X. (Ogni tanto una cella passa avanti e indietro tra due ID, più volte. Questa è dovuto al monitoraggio che deve adattarsi a più ID in una regione oversegmented piuttosto che un errore nella funzione ID di aggiornamento.) Più celle possono essere selezionate e loro ID cambiati contemporaneamente, ma essere sicuri di dare a ciascuno un ID univoco. Per assegnare una regione ad un ID che non esiste nel file corrente, digitare "0" e ne verrà generato. Usare Ctrl + W per scambiare gli ID dei due celle evidenziate.\n"Delete Selected Tracks" (Ctrl + D) - utilizzare per eliminare la cella selezionata o regioni cellulari più nella corrente giusta cornice assi. (Se non sono selezionate le celle, chiederà ID.) Per eliminare definitivamente tutte le istanze di una traccia ID, selezionare la casella accanto al DeLete pulsante brani selezionati (testo cambierà in "Delete All"). Questo è utile per sbarazzarsi di regioni spazzatura persistenti, ma prima controllate fotogrammi futuri per assicurarsi che l'ID non passa in una cella valido o regione nascere.\n"Unisci Regioni" (Ctrl + A o M) - leviga e combina regioni cellulari. Fare clic su una cella o le celle negli assi giusti per selezionare (regione diventerà rosso se selezionato). Unire in una regione morfologicamente vicino per riempire fessure o piccoli pezzi mancanti utilizzando un elemento a forma di disco. Unione di due o più regioni vicine li unirà in una regione e dare l'ID più basso per la nuova regione. Questo è utile per le regioni sopra-segmentati (spesso quando le cellule hanno grandi vacuoli).\n"Disegna regione" - utilizzare il mouse per disegnare una regione negli assi giusti dove desiderato e fare doppio clic per finire. Fornire un ID univoco non presente nel set di dati (compreso tra 1 e 65535). Annullare premendo Canc sulla tastiera.\n"Monitoraggio Lineage" pannello - dopo il rilevamento,assegnazioni lignaggio sono generati automaticamente. Quando compaiono nuove regioni ID, il nuovo ID cella appare in rosa e una linea rossa è attirata sulla regione madre. Nuove regioni troppo grande per essere gemme o troppo lontano da potenziali madri appaiono in verde e vengono assegnati un ID madre di "NaN" ("non un numero", vedi tabella 2). Regioni esistenti al primo punto temporale hanno un ID madre di "0". Per risolvere incarichi individuali, immettere la madre e gli ID gemma nel modificare campi di testo e fare clic su "Fix". Per cancellare la madre di una cella, immettere "0", come la sua mamma. Un metodo più veloce è quello di selezionare due regioni la giusta immagine e premere CTRL + F. Questo assegnerà automaticamente la regione più anziani come la madre e la regione più recente come la figlia, mentre la cancellazione di eventuali incarichi madre precedentemente esistenti per la cellula figlia. ATTENZIONE: Cliccando "Calcola Lignaggi" in qualsiasi momento sarà ricalcolare tutte le assegnazioni lignaggio, compresi quelli che l'utente ha precedentemente curato.\nPannello "Selected Informazioni cella" - "Get INFO "mostrerà alcune misurazioni delle regioni selezionate negli assi giusti." Misure ... "permette all'utente di determinare quali misure sono visualizzate (così come definire la lista di default per le altre operazioni come" Esporta dati "). Può essere utilizzato per determinare gli ID e lignaggi (ad esempio, se la cella X ha una gemma al tempo t, è molto probabile che non hanno un'altra gemma al tempo t + 5 min) corrette.\n"Salva modifiche" (Ctrl + S) - aggiornare il file * tappetino per riflettere le modifiche apportate dall'utente.. Usano più di frequente (non esiste una funzione undo)!\n"Genera Parcelle" - apre la GeneratePlots GUI. Usato per tracciare rapidamente selezionata informazioni variabili e calcoli semplici per le regioni monocellulari evidenziati nelle giuste assi del ProcessTimeSeries interfaccia grafica, la loro media o la media di tutte le regioni in ogni fotogramma. Questa GUI può calcolare derivate prime grezze, ma essere sicuri di specificare l'intervallo di tempo corretto in alto a sinistra. I grafici possono essere inviati a una cifra per il salvataggio premendo il tasto "Generate Figura".\nPer curare correttamente i dati: unire le regioni oversegmented; eliminare eventuali regioni non catturare l'intera cellula; assicurati rapporti madre-gemma sono assegnati correttamente (una linea rossa tra loro al momento di nascere nascita, quando l'ID bocciolo è rosa, vedere Tabella 2), ed eliminare eventuali ID verdi fissando l'ID, l'assegnazione alla regione una madre, assegnando nessuna madre ("0"), o cancellando la regione. Bud dati verranno aggiunti a quello della madre durante l'ultima analisi quindi non unire una regione gemma alla sua madre (che porterà a imprecisa stima del volume).\nControllare visivamente dati per ogni fotogramma fino all'ultimo tempo di interesse, ma non è richiesto di tutta la serie tempo se non utilizzando i frame successivi.\nRipetere i passaggi 3,1-3,7 per il file *. Tappetino per ogni posizione di fase.\n4. Esportazione dei dati per l'analisi\nPer esportare semplicemente misurazioni regione prime per ogni cella tramite time, spingere "Esporta dati". Le misure di interesse possono essere selezionati nella GUI che si apre, e saranno di uscita in uno spazio delimitato da *. Txt con i nomi delle variabili come intestazioni di colonna.\nPer analizzare le serie per le cellule intere nel tempo, calcolare le informazioni del ciclo cellulare, e prendere derivati, premere "Time Series Analysis". Si aprirà una finestra che permette la selezione delle misure di interesse e l'input dei parametri di analisi (Figura 6).\nInserisci il momento dell'ultimo curata nella GUI (tutti i fotogrammi successivi vengono ignorati). I parametri di assegnazione leviganti e del ciclo cellulare di default funzionano bene per la nostra aploidi e ceppi diploidi impressi in intervalli di 5 min, ma questi possono dover essere variato per i migliori risultati. (Verificare che i valori dei parametri sono appropriati determinando manualmente il tempo in erba e la divisione per un set di dati di test e confronto per le prestazioni dell'algoritmo automatico.)\nQuando tutti i parametri sono impostati, spingere "analizzare" a:\nControtruct array per ogni misurazione crudo e sottrarre il fondo (misurata come l'intensità media della zona non-cella del primo frame in ogni film fluorescente, o può essere specificato per tenere conto di autofluorescenza media per pixel cella).\nMontare una spline smoothing per le misure selezionate per eliminare il rumore di misura ad alta frequenza (come discusso in 9).\nDeterminare automaticamente gemma emergere e tempi di divisione cellulare per ogni cella in base alle variazioni della pendenza della serie storica del volume come discusso in 9. Le misure bud saranno poi aggiunti alle misurazioni della madre tra emersione e la divisione di ogni ciclo per tutta una serie temporale delle cellule contigue. Una progressione del ciclo cellulare normalizzato venga calcolato che varia da 0 a 2 da divisione a divisione.\nMontare un smoothing spline di prendere stabile 1 ° e 2 nd derivati delle misure selezionate. (Ai fini di derivati ben definiti, serie temporalisono realizzati continuo attraverso divisione spostando dati per il seguente ciclo cellulare per soddisfare l'endpoint per il ciclo precedente.)\nUscita crudo e serie storiche lisciato per tutte le regioni, e tutta levigata cella, continua, e serie storiche differenziata come un array per ogni misurazione. Il primo elemento è un indice di colore per sottrazione del background, il resto della prima fila è in ID di cella, il resto della prima colonna rappresenta il numero del fotogramma, ed i restanti elementi tenere le serie per ogni singola cella di una colonna con ciascuna riga corrispondente al telaio nella prima colonna. Una simile serie di ciclo cellulare serie temporali progressione e informazioni di derivazione viene anche emesso. L'array "LineageArray" contiene una tabella con ogni riga rappresenta un rapporto madre-bocciolo e il primo al quinto colonne sono ID madre, bud ID, telaio di prima regione gemma, stimato telaio in erba, e la trama a divisione di stima. I dati vengono esportati in un file *. Mat (file di dati MATLAB).\nUn esperimento condotto con successo e analizzato produrrà serie temporali per lo più continua di cellule intere singole con realisticamente assegnato emergere bocciolo e tempi di divisione. Come esempio, abbiamo eseguito il protocollo di cui sopra con un ceppo di lievito aploidi esprimendo una copia integrata della proteina fluorescente Cerulean (PCP) guidato dal promotore costitutivo ADH1 osservare come la crescita e l'espressione globale può variare nel tempo in cellule singole (Tabella 4, Y47 ). Abbiamo eseguito l'analisi serie temporali per ottenere tutta la cella (Figura 7A) misure nel corso del tempo, e una dipendenza dal ciclo delle cellule emerge sia per il volume e di espressione come si trova in 9. Dopo la formazione di gemme, il volume totale combinata (madre + auricolari) aumenta più rapidamente di prima gemma nascita (coerente con 8,16), mentre la concentrazione di proteine, o di intensità media, diminuisce leggermente (figure 7B e 7C). L'aumento combinato IntegraTED proteina (concentrazione x volume in questo caso) accelera anche dopo gemmazione (Figura 7D). Confrontando alla regione madre da sola (Figura 7B & S), questi risultati dimostrano l'importanza di inserire correttamente i contributi gemma alla misurazione cella insieme e mettere in evidenza la necessità di una corretta formazione di gemme e le assegnazioni a divisione di tempo. Come abbiamo riportato 9, possiamo utilizzare le serie storiche differenziato per calcolare una istantanea relativa mRNA livello M (t) e la velocità di trascrizione A (t), che sia aumentare anche dopo gemmazione (Figura 7E e 7F):\ndove P (t) è la proteina totale al tempo t e γ M è il tasso di degradazione dell'mRNA 0.04 min -1\nLa capacità di generare derivati stabili di tempo di serie storiche di misura avvantaggia anche studi cinetici. Usiamo un ceppo di lievito che esprime un osservabile, fattore di trascrizione chimerica con attività di trascrizione commutabile (Tabella 4, Y962). Il fattore di trascrizione maestro della fame percorso fosfato, Pho4p, viene controllato attraverso la localizzazione nucleo-citoplasmatica in risposta a extracellulare fosfato concentratio n 18. Abbiamo sostituito il dominio legante il DNA di Pho4p con tetR, che lega il tet operone (tetO), e C-terminale Fused il nuovo fattore di trascrizione di una proteina fluorescente gialla per creare Pho4-tetR-YFP 9. Con il passaggio del livello di fosfato nei media di perfusione, potremmo quindi alterna l'espressione di un CFP integrata guidata da un promotore sintetico composto da 7 tetO siti di legame and il CYC1 promotore minimo (7xtetOpr-PCP). Una analisi di serie temporali mostra quando il fattore di trascrizione è localizzato nel nucleo (utilizzando una fusione di RFP e la Nhp2p proteina nucleare per creare un submask nucleare RFP-based come al punto 2,9-10), e quando il gene bersaglio avvia e arresta trascrizione (Figura 8). Analizzando la serie derivata nel tempo, tempi di attivazione e disattivazione del promotore bersaglio in ogni singola cella può essere dedotta anche quando la concentrazione del reporter fluorescente stabile è alta.\nFigura 1. Schema di protocollo. Il protocollo descrive passaggi per 1) cultura microfluidica, 2) fluorescenza, time-lapse microscopia, 3) analisi dei dati, e\nFigura 2. FormatData GUI. L'interfaccia viene utilizzato per importare, formato, e dati di immagine del segmento per i calcoli successivi e di controllo visivo. I numeri indicano la fase di protocollo corrispondente a ciascun componente. Clicca qui per ingrandire la figura .\nFigura 3. SegTest GUI. L'interfaccia viene utilizzata per testare segmento cella parametri ation e confermare visivamente l'accuratezza segmentazione come al punto 2.7.\nFigura 4. ColorThreshTest GUI. L'interfaccia è utilizzata per testare la soglia di intensità necessaria per creare una maschera subcellulare dal canale fluorescenza scelto come al punto 2.10.\nFigura 5. ProcessTimeSeries GUI. L'interfaccia è usata per misurare, monitorare, controllare visivamente, e modificare le regioni di cellule e le assegnazioni lignaggio. Numeri indicano il passo di protocollo corrispondente a ciascun componente.target = "_blank"> Clicca qui per ingrandire la figura.\nFigura 6. AnalysisParams GUI. L'interfaccia viene utilizzata per inserire i parametri necessari per l'analisi di serie temporali, come nei passi 4.3 e 4.4.\nFigura 7. Serie temporali singola cellula di un lievito aploidi esprimere ADH1 pr-CFP nella cultura microfluidica per diverse generazioni. (A) Campo chiaro (riga superiore) e CFP (riga in basso) micrografie sono indicati nei punti temporali indicati per una cella di tutto l'esperimento . Per la cellula madre segmentato (blu outline) e le sue gemme (contorno verde), la cella intera contiguo è delineato in rosso. Raw madre e gemma (B) il volume e (C) proteine serie temporale di concentrazione sono state levigate per rimuovere il rumore di misura, e (D) integrato CFP fluorescenza è stata calcolata come il prodotto di volume e la concentrazione. L'intera traccia delle cellule (rosso) è estesa divisione passato per mantenere un totale parziale che è facile da montare per una spline smoothing differenziabile tra divisioni (B e D). La (e) livello di mRNA relativo e (F), velocità di trascrizione istantanea sono calcolate utilizzando le equazioni (1-2) e la misura spline in (D).\nFigura 8. Promotore trascrizione risposta tasso di nucleo-citoplasmaticaspola di una fusione Pho4-YFP in cellule di lievito singoli. (A) Micrografie dai quattro canali di acquisizione indicate sono indicati per una cella con un commutabile YFP-fusa Pho4-tetR transattivatore che (B) localizza alla RFP-marcato nucleo in risposta a basso contenuto di fosfato e (C) l'espressione unità di un giornalista 7xtetOpr-CFP. (D) Le variazioni dei tassi desunti trascrizione con la localizzazione in media (linea nera) e al livello di singola cellula (rosso e linee di Magenta, dove il rosso rappresenta il contiguo regione cella delineato in rosso in A). Crolli improvvisi della espressione PCP in B coincidono con la divisione cellulare in cui alcune proteine si perde alla cellula figlia.\nMisurazione Nome Descrizione\nVolta Numero di telaio Immagine\nSettore Totale numero of pixel che compongono la regione\nVolume (4/3) πabc, dove a = ½ lunghezza dell'asse principale della regione, b = ½ lunghezza dell'asse minore, e c = b oppure ½ "Altezza camera" (la minore)\n(X) _ (Y) significa Intensità media dei pixel per la regione maschera (Y) nel canale di colore (X)\n(X) _ (Y) mediana Intensità dei pixel mediana per la regione maschera (Y) nel canale di colore (X)\n(X) _ (Y) std Deviazione standard di intensità dei pixel per la regione maschera (Y) nel canale di colore (X)\n(X) _ (Y) IQR Range interquartile di intensità dei pixel per la regione maschera (Y) nel canale di colore (X), 75 ° percentile - 25 ° percentile\n(X) _ (Y) T20pct Intensità per il primo 20% di intensità dei pixel per regione maschera (Y) nel canale di colore (X) media. Utilizzareful rispetto alla successiva misurazione per determinare la localizzazione subcellulare senza submask.\n(X) _ (Y) B80pct Intensità per il fondo 80% di intensità dei pixel per regione maschera (Y) nel canale di colore (X) media. Utile rispetto alla precedente misurazione per determinare la localizzazione subcellulare senza submask.\n(X) _ (Y) M50pct Intensità media per la metà 50% di intensità dei pixel per regione maschera (Y) nel canale di colore (X)\n(X) _cellint Fluorescenza integrato di canale di colore (X) (media intensità dei pixel x volume) per tutta la cella (madre e ogni gemma collegato)\n(Z) Raw Serie storiche di dati Raw uscita da "Time Series Analysis" per la variabile (Z)\n(Z) Smooth Spline-lisciata prime serie temporali di dati di uscita da "Time Series Analysis" per la variabile (Z)\n(Z) Intero Cellula intera (maltri + allegato gemma (Z) Rawsmooth) Tempo di uscita della serie di dati da "Time Series Analysis" per la variabile (Z)\n(Z) Cont Dati di serie temporali di cellule intere fatte continuo a divisioni ("totale parziale") in uscita da "Time Series Analysis" per la variabile (Z)\n(Z) WhSmooth Spline-livellata (Z) a cellula intera serie storica dei dati di uscita da "Time Series Analysis" per la variabile (Z)\n(Z) ddt Prima volta-derivato di spline-livellata (Z) a cellula intera serie storica dei dati di uscita da "Time Series Analysis" per la variabile (Z)\n(Z) d2dt2 Seconda derivata temporale di spline-livellata (Z) a cellula intera serie storica dei dati di uscita da "Time Series Analysis" per la variabile (Z)\nTabella 1. Misurazione nomenclatura variabile in ProcessTimeSeries GUI.\nColore Cell ID Stato di Lineage\ngiallo madre assegnato\nrosa nuova gemma (linea rossa alla madre assegnato)\nverde nessuna madre assegnato\nTabella 2. Codice colore Cell ID di stato di assegnazione lignaggio.\nFormatData.m Ingresso dati GUI che formatta i film e segmenti immagini BF per l'elaborazione di ProcessTimeSeries.m\nFormatData.fig FormatData layout della finestra GUI\nBFsegment.m Modulo di segmentazione BF, con extractregions2.m e segmentregions.m\nSegTest.m Segmentazione di qualità test GUI\nSegTest.fig SegTest layout della finestra GUI\nextractregions2.m Primo componente del modulo di segmentazione BF per identificare le regioni\nsegmentregions.m Seconda componente di modulo segmentazione BF a regioni cella separata e pulito\ncolor2submask.m Modulo di segmentazione submask basato sulla fluorescenza\nColorThreshTest.m Basato sulla fluorescenza soglia maschera test GUI\nColorThreshTest.fig ColorThreshTest layout della finestra GUI\ntiffread2.m Estratti dati *. TIF o file *. STK per l'uso in MATLAB\nimalign.m Registrazione dell'immagine utilizzando croce correlazione 2D\nProcessTimeSeries.m GUI elaborazione dati che traccia regioni, assegna lignaggi, e permette una correzione visiva di errori. Inoltre fornisce GUI-based funzionalità di tracciamento e di uscite dati cellule intere serie temporali\nProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries layout della finestra GUI\ncleanMask.m Elimina le regioni maschera sulla base di parametri in ProcessTimeSeries GUI\ntrack.m Tracce regioni cellulari in base alla regione centroidi\nOptimizeLineages.m Modulo di assegnazione Lineage determina ottimali rapporti madre-gemma in base alla distanza fisica ed eventi in erba passati e futuri\ngetClosestObjects.m Reperti cellule vicine per ogni nuovo ID cella (BUD)\nSelectVariables.m Selezione di misura GUI per la scelta di variabili di interesse\nSelectVariables.fig SelectVariables layout della finestra GUI\nGeneratePlots.m Rappresentazione grafica GUI per i dati nella finestra ProcessTimeSeries\nGeneratePlots.fig GeneratePlots layout della finestra GUI\nAnalyzeCellSeries.m Modulo di analisi di serie temporali determina il tempo di divisione cellulare ed emette misurazioni cellule intere, come descritto nel testo\nassignDivisionsInf2.m Assegna gemma germoglio e tempi di divisione cellulare\nAnalysisParams.m Serie storiche dei parametri di input di analisi cellulare\nAnalysisParams.fig AnalysisParams layout della finestra GUI\nTabella 3. INNESTI file di descrizioni.\nID Strain Genotipo (W303-based) Riferimento\nY47 MAT un LEU2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanr :: hisG 19\nY962 MAT un ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9\nTabella 4. Ceppi di lievito utilizzati in questo studio.\nIl protocollo di cui sopra descrive un metodo semplice per ottenere e analizzare i dati di fluorescenza di serie storiche con limitata esperienza in microfluidica o nello sviluppo di software. Esso permette di ottenere in time-lapse film di fluorescenza di cellule di lievito singoli; estrarre dimensioni delle cellule pertinenti e misure di espressione; monitoraggio curato e assegnazioni lignaggio, e analizzare il comportamento delle cellule intere nel tempo utilizzando un dispositivo cultura microfluidica disponibili in commercio e di un versatile utente grafica interfaccia (GUI). Mentre il sperimentali, segmentazione e monitoraggio passi sono stati avvicinati in vari modi precedentemente 11,13,14, la procedura di cui sopra è stato progettato per rendere queste tecniche più accessibile a un più vasto sottoinsieme della comunità biologia. Mentre la procedura di cui sopra è ottimizzata per un particolare dispositivo di coltura microfluidica, l'analisi globale può essere adattato a dispositivi simili come off the shelf tecnologie coltura microfluidica diventare più economico e più personalizzabile. FondamEntally, la segmentazione e algoritmi di misura regione che impieghiamo sono simili ai metodi esistenti 13,14, ma il software INNESTI aggiunge la possibilità di curare visivamente regione di monitoraggio e assegnazioni di lignaggio e di assegnare le fasi del ciclo cellulare con precisione. Entrambe queste caratteristiche sono fondamentali per calcolare con precisione il tempo-derivate di serie di dati.\nCi sono diversi passaggi del protocollo, che incidono in modo significativo la qualità dei dati risultanti serie temporali. Inizialmente sovraccaricare la camera di coltura con cellule diminuisce la perfusione nella camera (particolarmente evidente in esperimenti di cinetica dove camera di tempo di aggiornamento è importante), e la crescita eccessiva si verifica precocemente nel corso tempo dell'esperimento. Ciò può meglio essere evitato iniziando con minore pressione cella di carico per tempi più brevi e gradualmente aumentando uno o entrambi fino a una densità appropriata cellula è raggiunto. Selezione posizione palcoscenico per l'imaging è un consi correlato e altrettanto importanterazione. Conoscendo il tempo di raddoppio del ceppo, piano di quante cellule saranno nella cornice dell'immagine nel tempo e prevedere come affollamento influenzerà la diffusione dei media. Dieci celle disperse si svilupperanno in dieci microcolonie, ma dieci celle inizialmente raggruppate cresceranno in un unico grande colonia (abbiamo notato limitazioni diffusione di nutrienti a 6 psi al centro di una colonia quando è maggiore di ~ 14 celle di diametro) . Sforzo supplementare nella procedura di protocollo monte facilita anche curation manuale dei dati in seguito, e migliora le serie storiche di uscita. Assicurarsi che la piastra sia ben montato il palco e utilizzare l'opzione di registrazione dell'immagine nel FormatData GUI per migliorare notevolmente la precisione nel tracciare automaticamente singole cellule attraverso il tempo. Trascorrere del tempo nella scelta dei migliori possibili parametri di segmentazione anche a ridurre il numero di errori che richiedono attenzione. Il software di monitoraggio funziona meglio con una leggera oversegmentation delle regioni di cellule piuttosto che undersegmentation perché Reinstallare uncella divisione è più semplice di quella disegnando linee per dividere le regioni, tuttavia, una maggiore oversegmentation aumenta errori nelle assegnazioni lignaggio causa della presenza di falsi, nuove regioni. Inoltre, assicurarsi che tutti i rapporti madre-gemma sono assegnati correttamente in modo che le misure per l'intera cella saranno accurati. Se un bocciolo è mancato dalla segmentazione o cresce al di fuori dei confini dell'immagine, considerare che termina serie di dati della madre per evitare falsi risultati. Questo è fatto facilmente cambiando la regione madre di un ID univoco (inserire l'ID di "0") presso la struttura errata, e utilizzando il comando "Cancella" funzione per rimuovere tutte le future istanze della nuova ID. Molta attenzione a questi passaggi aumenterà notevolmente la precisione dei dati di serie temporali grezzi.\nPer stabilire valida interpretazione dei dati in uscita con il tasto "Time Series Analysis", si consiglia di alcune ulteriori indagini. Verificare gemma nascita e tempi di divisione sono accuratamente determinato in base alla user-inpuparametri t. Registrare manualmente i tempi in erba e la divisione per un set cinematografico di test e confrontare i risultati degli algoritmi. Per stimare visivamente il tempo cytokinesis completa tra una madre e figlia, cercare il loro contorno di stretta e scurire. (NB:. Un ceppo test con una fluorescenza segnalati aiuti nucleo di osservazione manuale di divisione di tempo Un altro metodo sarebbe quello di fluorescenza segnare la membrana plasmatica e cercare il divario tra le cellule madre e figlia a chiudere.). Inoltre, verificare se fluorescenza totale per una cellula è meglio calcolato come intensità media regione moltiplicata per il volume (quando la luce catturata proviene da una sezione trasversale sottile della cellula) o come la fluorescenza integrato sulla regione (quando la luce proviene da catturata l'intera cella). Se il profilo fluorescenza attraverso una cella corrisponde alla curva di una semi-ellisse descritta dagli assi maggiore e minore della regione 7, luce catturata origine dalla intera cella, e totale fluorescenza shoULD essere calcolato come (intensità media) x (area). Nel nostro caso ad 63X con una profondità di campo molto inferiore all'altezza cella, il profilo di fluorescenza è relativamente piatta e fluorescenza totale viene calcolato come (intensità media) x (volume). Un'altra considerazione è la photobleaching del fluoroforo. Il software non considera fotodecolorazione nell'analisi, e quindi la produzione di fluorescenza serie storica rappresenta solo il giornalista osservabile. Processi Fotodecolorazione dipendono fortemente dalle impostazioni di acquisizione e l'intervallo di tempo utilizzato per ottenere immagini di fluorescenza, la natura del fluoroforo, e vari altri parametri esperimento-specifici. Fotoscolorimento inoltre non essere ben descritto da una semplice espressione, di velocità di primo ordine, che impedisce un algoritmo generale per il suo trattamento. Noi, pertanto, non tengono conto di fotodecolorazione nell'output serie storiche, ma il metodo di analisi può essere utilizzato per misurare la cinetica di questo processo per aiutare l'interpretazione dell'utente. Infine, scegliere smoothiparametri ng adatti per la serie storica osservata. Idealmente, le scanalature levigante eliminano il rumore di misura ad alta frequenza, preservando le caratteristiche reali nei dati. I parametri necessari per raggiungere questo dipendono dalle caratteristiche del particolare di serie temporali e possono variare tra esperimenti.\nIl software è stato pensato per essere flessibile per l'analisi dei vari time-lapse dati di microscopia a fluorescenza. Qualsiasi numero di canali di colore può essere incluso e qualsiasi può essere utilizzato per creare un sub-regione maschera. Mentre gli algoritmi funzionano bene per i film di cellule di lievito in erba, molte delle funzionalità dovrebbe estendersi a film di altri organismi come bene. Misurazione Regione (ad eccezione del volume), il monitoraggio, e curation dipendono solo la maschera di cellulare e sono quindi adattabili. La segmentazione, assegnazione lignaggio, determinazione divisione cellulare, e di moduli di analisi di serie storiche possono essere modificati in modo indipendente per soddisfare esigenze specifiche. Inoltre, invece di usare l'incluso SEmodulo gmentation, un film maschera pre-segmentato permette di osservare, e di contrasto di fase o di interferenza differenziale immagini a contrasto può essere sostituito per campo chiaro. La GUI può essere utilizzata principalmente per monitorare e curare ID e assegnazioni lignaggio.\nRingraziamo Emily Jackson, Joshua Zeidman, e Nicholas Wren per i commenti sul software. Questo lavoro è stato finanziato da GM95733 (a NM), BBBE 103316 e fondi di avvio del MIT (a NM).


Dove nascono le Philippe Model e le scarpe Made in Italy\nHomePrimo PianoDall'ItaliaDove nascono le Philippe Model e le scarpe Made in Italy\n26 novembre 2015 Redazione Iltabloid Dall'Italia, Primo Piano\nPhilippe Model, Nike, Ungaro e i marchi più prestigiosi di scarpe del Made Italy vengono creati dalle sapienti mani degli artigiani della Riviera del Brenta.\nPhilippe Model, Fendi, Genny, Saint Laurent Paris, Givenchy, Ungaro, Anne Klein, Vera Wang: le scarpe indossate durante le sfilate di queste e altre importanti maison di moda nascono nella Riviera del Brenta, tra le province di Padova e Venezia.\nConosciuta per le incantevoli ville che in passato ospitarono i ricchi patrizi veneziani, la Riviera del Brenta è famosa oggi proprio per la filiera produttiva dedicata al settore della Calzatura, specialmente quella di lusso.\nLa tradizione artigiana che ha dato vita ad uno dei distretti manifatturieri più prestigiosi d’Italia parte da molto lontano, precisamente dal XIII secolo, traendo origine dai “calegheri (calzolai)” che erano al seguito dei nobili veneziani in villeggiatura. La svolta industriale risale al 1898 quando Giovanni Luigi Voltan, forte delle esperienze maturate in America, diede vita a Stra (Padova) al primo complesso calzaturiero meccanizzato d’Italia. Furono in molti a seguire il suo esempio, posando le fondamenta di un sistema destinato a rappresentare il Made in Italy in tutto il mondo.\nIl sigillo della “Confraternita dei Calegheri” rimane da secoli un segno per il settore, che da Venezia si è trasferito in terraferma – in Riviera del Brenta – dove ancora vive e prospera l’arte dei Calegheri. In Riviera del Brenta nascono le calzature che ovunque nel mondo si riconoscono per la fattura, l’eleganza e lo stile. In una parola: per l’anima. Qui, dal 1898 un mestiere antico è diventato un’industria moderna, dove il know how ha ancora l’artigiana valenza del “saper fare”, del saper coniugare passione ed esperienza, gusto e fantasia con la tecnologia, l’efficienza, e i risultati. Questa è la Riviera del Brenta.\nOgni giorno la creatività e l’intuizione dei designers si affida alle maestranze esperte perché traducano in realtà idee, visioni e progetti, nelle oltre 500 piccole e medie imprese che coprono l’intera filiera produttiva (dai calzaturifici ai produttori di componenti, materiali ed accessori per le calzature, fino agli studi professionistici di shoedesigners).\nE proprio sulla dinamicità del settore calzaturiero della Riviera sono arrivati in questi anni dati che fanno capire che la ricetta per battere la crisi è proprio la specificità del “made in Riviera”. Una recente analisi aveva infatti evidenziato che il distretto della Riviera è il secondo polo calzaturiero italiano con il 13,9% degli addetti nazionali. Negli ultimi anni il distretto del Brenta è riuscito a vincere la sfida dei mercati esteri grazie all’alta qualità dei materiali e delle lavorazioni e all’attenzione al design.\nUno stile che firma le griffes più famose: per fare qualche nome ricordiamo Philippe Model Dior Saint Laurent Paris e Nike. Una qualità fatta di passione e tradizione che si riconoscono nei particolari. Un marchio che vive di passione e tradizione. La riviera del Brenta è il referente privilegiato di molte maisons di moda internazionali, con i più alti parametri di qualità, abituate a pretendere la massima affidabilità ai loro business partner. La quasi totalità delle calzature “griffate” (brand-names) presenti sui mercati mondiali sono prodotte – ma in gran parte co-ideate e progettate, ed in parte commercializzate – da calzaturifici della Riviera del Brenta. Un rapporto di lavoro costruito su misura che, dagli anni Sessanta ad oggi, ha permesso allo stile italiano di camminare sulle passerelle di tutto il mondo.\nCross-over Transalpino: quando la Francia incontra l’Italia, dalla cucina alle Philippe Model\nRomanina – Finge di provare un paio di scarpe e scappa, arrestato un 43enne romeno\nLatina – Controlli estivi della Finanza, 21mila capi contraffatti sequestrati\nMinturno – La Guardia di Finanza consegna 20 giubbotti e 30 paia di scarpe alla Caritas\nFrancia, Macron sceglie il primo ministro: è il conservatore Edouard Philippe


kiskio - Treddi.com - Il portale italiano sulla grafica 3D\nInfo su kiskio\nBussola D'altri Tempi\nkiskio ha risposto a kiskio in [FINAL] Architettura e Interior Design\nGrazie a tutti per i commenti Ebbene si, l'ispirazione è stata proprio la bussola di Jack Sparrow con qualche personalizzazione sul tema, bravo aio, hai visto bene. Non sapevo che la cartina fosse quella del signore degli anelli , involontariamente ho fatto una "contaminazione"\nkiskio ha aggiunto una discussione in [FINAL] Architettura e Interior Design\nL'arte della navigazione ha origini antiche...... Programma: 3d Studio Max 2008 Motore di rendering: Mental Ray Photoshop Ogni considerazione è ben accetta.\nkiskio ha cominciato a seguire Camaro Concept - 2. Inserimento, Bussola D'altri Tempi, Orologio Sector e e 2 altri October 9, 2008\n3ds Max Calcio Dal Sapore Antico\nkiskio ha risposto a brigantex in [FINAL] Immagini CG/VFX\nBella compare, mi piace molto l'effetto cartolina con dedica! Nonostante l'ambientazione e gli accessori di scena non propriamente "antichi", l'effetto finale è molto ben riuscito. La dissonanza tra presente e passato è stata ben interpretata.\n3ds Max Orologio Sector\nBel lavoro, complimenti! Il materiale che hai dato alla cassa dell'orologio è veramente realistico, mi piace molto anche l'effetto di riflessione dato al piano, sembra quasi lo scatto per una adv.\n3ds Max Ducati Monster 696\nkiskio ha aggiunto una discussione in [FINAL] Immagini CG/VFX\nIn attesa di vederla dal vivo dai concessionari.......... Modellata in 3d Studio Max 2008, rendering in Mental Ray 3.6.1\n3ds Max Lancia Fulvia\nkiskio ha risposto a brigantex in (W.I.P.) Work In Progress\nEh bravo dottore, finalmente hai completato la MITICA! Lavoro degno da gallery, hai pensato a qualche ambientazione?\n3ds Max Ferrari F2 500 - 1951\nkiskio ha risposto a kiskio in (W.I.P.) Work In Progress\ne per i nostalgici 2 render in ambient occlusion!!\nEcco qui dei nuovi rendering.\nArgonauta vedo che hai preso a cuore questo lavoro, ne sono molto lusingato. Ho aggiornato la modellazione delle ruote, secondo riferimenti visivi delle reference trovate in rete, come per altro ho fatto durante l'intera modellazione del corpo macchina e annessi accessori. Il disegno del battistrada forse non è uno dei migliori, ma bisogna pur sempre ricordare che si riferisce ad un modello di autovetura utilizzato in gara nei lontani anni '50 Posto render con modellazione ruote e reference\naltri 3 rendering\nAggiungo dei nuovi rendering, ho seguito i consigli che mi avete postato, ho modellato la trama degli pneumatici e migliorato la mesch della scocca, inoltre ho provato un nuovo set di luci. Che ne pensate?\nGrazie a tutti per l'interesse e i preziosi consigli, non appena avrò un pò di tempo cercherò di migliorare il modello seguendo le dritte che mi avete dato. Per gli pneumatici seguirò i preziosi consigli di argonauta, grazie ancora per il tutorial! Spero quanto prima di aggiungere altri up, intanto se ci sono altri pareri sono tutti ben accetti, di imparare non si finisce mai.....\nMaya Camaro Concept - 2. Inserimento\nkiskio ha risposto a Argonauta in [FINAL] Immagini CG/VFX\nGrazie mille Argonauta e grazie anche per l'interessamento a Marameo! Non appena avrò un pò di tempo seguirò scrupolosamente i tuoi consigli!! I miei complimenti per il tuo lavoro, davvero notevole, bella la scelta del modello e ottima modellazione e render finale, penso che dovresti modellare le chiavi da inserire nel cruscotto, visto che l'auto è pronta per partire...........\nAggiungo un altro render\nCiao a tutti, dopo la modellazione ecco i primi rendering "sperimentali" sugli shader. Aspetto come sempre consigli e pareri


Teatro di strada. Burattini senza confini | Udine 20\nTeatro di strada. Burattini senza confini\nTagsburattini, Burattini godia, Burattini udine, Manuele Candiago, teatro udine, udine\nTorna, appuntamento estivo tra i più attesi nei quartieri cittadini, il festival “Burattini senza confini”, come sempre ricco di colore, ritmo, fantasia e tanto divertimento. Un appuntamento, promosso dall’assessorato al Decentramento nell’ambito di “Ovunqu(è)Estate Junior”, che quest’anno si arricchisce di un respiro internazionale visto che approderanno in città artisti provenienti dall’Europa e dall’America.\nQuattro, in tutto i pomeriggi offerti all’insegna del teatro di strada. Si parte martedì 19 luglio alle 18 nell’area parrocchiale di via Genova a Godia con “Omino Buffo” di Gianca Clown, un clown moderno, equilibrista e giocoliere, un vero acrobata della risata, circondato da simpatici animali di pezza, omini appendiabiti, palloni birichini e scope animate, sempre pronto a scorrazzare in lungo e in largo sul suo monociclo giraffa. In caso di maltempo lo spettacolo si terrà nella sala parrocchiale.\nSi prosegue martedì 2 agosto, sempre alle 18, in piazza Giovanni XXIII a Cussignacco con la “Zuppa di ladroni”, preparata dall’artista ecuadoriana Yolanda Navas. È la storia, ambientata in un quartiere popolare di Quito (capitale dell’Ecuador), della signora Carlota Tolón e Tolón, pensionata e nubile che spera in un miracolo per sposarsi. In caso di cattivo tempo si andrà in via Veneto 164 nella sala polifunzionale.\nIl 16 agosto alle 18 è la volta dello spagnolo Salvador Puche, che racconterà la divertente storia di “Arlecchino Innamorato” nell’area verde Peter Pan in via Di Brazzà. Uno spettacolo di burattini in stile classico nella più genuina tradizione della commedia dell’arte. Gli eterni fidanzati Arlecchino e Colombina stanno per scambiarsi il primo bacio. Forse. Tra trucchi, trasformazioni e sorprese, scopriremo come andrà a finire. In caso di maltempo, tutti al riparo nella pista di pattinaggio.\nGran finale il 30 agosto, sempre di martedì e ancora una volta alle 18, con “Prestige”, spettacolo di Manuele Candiago, fantasista eccentrico, giocoliere, saltimbanco ed equilibrista. Un viaggio nel mondo colorato del teatro di strada, tra trovate esilaranti, dal tono fresco ed esuberante. Un’iniezione di entusiasmo ed energia per tutto il pubblico presente. Appuntamento nell’area verde Marcello D’Olivo tra viale Afro e via XXV Aprile. In caso di pioggia ci si sposterà nell’area coperta del Centro polifunzionale in viale delle Forze Armate nel quartiere Aurora.


"Anarchia stato e utopia" di Robert Nozick - Libertà in testa\nSe lo stato non esistesse, sarebbe necessario inventarlo? John Locke, che per prima teorizzò il liberalismo, avrebbe sicuramente risposto di no.\nRobert Nozick, discendente di quella tradizione filosofico-politica, nel suo libro “Anarchia stato e utopia” sostiene di sì. La sua formula à quella dello “stato minimo”, che il filosofo statunitense ritiene inevitabile per costruire società capaci di vivere in libertà.\nPostulato: una ferrea difesa dei diritti individuali.\nUn libro provocatorio, in grado di suscitare nei lettori di qualunque fede politica la voglia di ripensare il proprio ruolo di cittadini, insieme ai vincoli che derivano dall’appartenere a uno stato. Dalla giustizia al lavoro, dalla solidarietà alla cooperazione, Nozick si interroga sulle legittime funzioni dello Stato.\nQui trovate il link per l’acquisto su Amazon del libro “Anarchia, stato e utopia” di Robert Nozick.\normai lo Stato Nazionale (monopolista di Forza, Moneta, Territorio, Legge) è palesemente in dissoluzione, sostituito da una pletora di Authority di natura privatistico/economica. il neo-liberismo osservi pure compiaciuto tutto ciò – e in qual disastro ci condurrà. amen\nPrevPrecedenteLibertà in Testa intervista Simone Balestrini, presidente dei Giovani Monarchici\nSuccessivoLa ricetta della crisi italiana del 2020: assistenzialismo, chiusure e sanità impreparata.Next


Agricoltura, Vivarelli Colonna incontra l’assessore regionale Stefania Saccardi – Gstv24\nEcco tutte le proposte per fronteggiare la crisi\nOggi ho incontrato in videoconferenza l’assessore regionale all’agricoltura Stefania Saccardi, una persona disponibilissima, molto gentile e preparata, che ha già informato il collega Leonardo Marras subito attivatosi.\nL’appuntamento ha avuto l’intento di portare in Regione le esigenze del mondo dell’agricoltura maremmano in un momento di difficoltà legata all’emergenza Coronavirus con la richiesta di provvedimenti concreti. Massima sinergia quindi tra Istituzioni, nella speranza che le istanze maremmane vengano accolte. La Regione, attraverso l’assessore Saccardi e l’interessamento di Marras, ha dimostrato grande disponibilità.\nIn particolare ho chiesto alla Regione di prevedere, nell’ambito del Psr di prossima stesura, uno stanziamento di risorse per progetti finalizzati alla Piana Maremma analogamente a quanto avvenuto per la Piana Fiorentina che prevedeva l’aggregazione tra progetti pubblici e privati per affrontare a livello territoriale specifiche criticità ambientali e valorizzare il ruolo svolto dalle aziende agricole nella riqualificazione ambientale del territorio.\nUn’altra richiesta di fondamentale importanza a supporto degli AGRITURISMI è stata avanzata: ho infatti chiesto all’assessore Saccardi di valutare la possibilità di introdurre nel redigendo Piano operativo – per quelle aziende dotate di più centri aziendali – disposizioni che prevedano di poter fare trasferimenti di volumetria in percentuale libera, o di modificare urgentemente la norma rispetto alla Legge Regionale 80/2020. Questo consentirebbe di riutilizzare la porzione di fabbricati eccedente e non più funzionale all’attività agricola in modo da potenziare un “reddito connesso”.\nE poi sarebbe necessario un intervento comunitario che favorisca la transazione digitale, con l’implementazione delle attrezzature e del know-how conoscitivo delle aziende agricole. Questo tipo di investimento è stato infatti ulteriormente ostacolato dal fatto che la Commissione Europea non ha reso cumulabili le provvidenze comunitarie del Psr con il credito di imposta 4.0.\nRingrazio gli assessori regionali Stefania Saccardi e Leonardo Marras per l’accurata attenzione rivolta alla maremma.\nAntonfrancesco Vivarelli ColonnaSindaco di Grosseto\nRelated Topics:agricolturaassessore agricolturasindaco di grossetostefania saccardivivarelli colonna\nI 100 anni del Partito Comunista, “Nessuno deve dare una connotazione politica alla storia”


Freud, Sigmund - Vita sessuale e affettiva dell'adulto\nAppunto di filosofia riguardante la vita sessuale ed affettiva di un adulto secondo il filosofo Freud: proiezione dell'immagine dei genitori sul proprio partner.\nLa vita sessuale e affettiva dell'adulto\nSecondo il filosofo Freud dopo una fase di latenza, con la pubertà, vi è oppure vi dovrebbe essere uno spostamento dall'autoerotismo a un oggetto sessuale "altro" ( ovvero 'il partner') e si dovrebbe stabilizzare una sorta di differenziazione psicosessuale tra uomini e donne. Se questo passaggio non avviene naturalmente a causa di blocchi e traumi anteriori, inevitabilmente l'individuo finisce per ammalarsi.\nDa queste riflessioni sullo sviluppo psicosessuale, Freud aveva teorizzato l'esistenza di una 'specifica pulsione sessuale' o 'libido'. Essa verrebbe innanzitutto rivolta verso il soggetto stesso (anziché verso un oggetto esterno). Da qui deriva il termine "narcisismo". Le immagini del padre e della madre in questa fase dello sviluppo, secondo il pensiero freudiano, sarebbero fondamentali per la vita amorosa futura dell'individuo.\nIn sostanza l'innamoramento sarebbe una sorta di fascinazione dell'immagine della propria madre o del proprio padre proiettata sulla figura del partner. Solo superando o ritirando queste proiezioni si potrà giungere all'amore vero e proprio.\nIn connessione con queste teorizzazioni, Freud ha descritto l'influsso disturbante sul bambino della cosiddetta "scena primaria" (il rapporto sessuale dei genitori a cui il bambino si trova ad assistere e al quale connette valenze sadiche e violente). A risultare emblematica, a questo proposito, è proprio la descrizione del caso del piccolo Hans.


Fine settimana a "Play"\nIl prossimo fine settimana, nelle giornate di venerdì 26 e sabato 27 settembre, sarò al Play, il festival del gioco a modenafiere.\nAnche se non organizzo nulla di ufficiale, come sempre avrò tutto il materiale di LoK con me, pronto per essere utilizzato in caso qualcuno sia curioso di provarlo.\nPubblicato da Ohmnibus alle 15:09 Nessun commento:\nLa Magia c'è!\nDopo un'infinità di tempo sono riuscito finalmente a generare un manuale completo della magia. Completo nel senso che c'è tutto quello che deve esserci, ma tuttavia non ancora completato.\nMi sono inventato un altro sistema, molto più pratico e flessibile, per inserire nel documento i contenuti derivanti dal Database degli Arcani. In pratica, sfruttando il fatto che i documenti OpenOffice sono dei file xml, ho scritto un programma che li analizza e sostituisce a stringhe tipo ###BEGIN_PSYCHOSIENCE### un valore preso dal DB. C'è voluto un po' per risolvere alcuni problemi di "determinazione del testo da sostituire", ma quello che ho ottenuto è euforizzante, come potete constatare scaricando l'ultima versione del manuale della magia.\nPubblicato da Ohmnibus alle 20:08 Nessun commento:\nDatabase degli Arcani II\nIl Database degli Arcani è finalmente completo. In esso sono catalogati tutti gli arcani Psicoscientifici, Rituali e Sciamanici, tutti i Poteri Naga e tutte le Divinità, di tutte le sfere.\nUn esempio delle possibili applicazioni è già presente nell'anteprima di LoK, dove è possibile trovare il file "LoK - Arcani 3.0.odt" generato in modo completamente automatico.\nIl file contiene le tabelle e le descrizioni di tutti gli arcani (presto anche delle divinità), e cioè tutto quello che è stato (temporaneamente?) rimosso dal manuale della magia (ora dedicato unicamente alle meccaniche).


GIOVANNI GASTEL, FOTOGRAFO | De Palma Executive Search\nFOTO DI CRISTIANO MIRETTI\nIl giorno che misi piede nella sede della Tod’s, nella bellissima regione italiana delle Marche, mi accomodai su una delle poltrone presenti di fronte alla grande reception.\nFu in quel momento, mentre ripassavo a mente i concetti da esporre alla persona che avrei dovuto incontrare, che il mio sguardo incrociò per la prima volta dal vivo un’opera di Giovanni Gastel.\nSi trattava di una gigantografia che raffigurava una scarpa, del modello forse più iconico della casa di moda marchigiana (il “Gommino”, ndr), e lo faceva con una prospettiva a me del tutto nuova e inesplorata: in realtà non era la scarpa a essere l’oggetto dell’opera, ma la sua impronta sul terreno. Quell’impronta su fondo blu mi colpì, oltre che per quello che almeno ai miei occhi appariva come un chiaro e immediato riferimento allo sbarco dell’uomo sulla luna, per la capacità di esaltare il protagonista descrivendolo non esattamente in prima persona, ma da un suo riflesso, da una sua declinazione.\nGiovanni Gastel era riuscito a esaltare il convesso dei gommini raffigurando il concavo delle impronte e io quel giorno capii che la fotografia era la forma d’arte che più di tutte le altre poteva valorizzare e sublimare una creazione di moda.\nGiovanni, per quale motivo la storia d’amore tra fotografia e moda è così durevole?\nPer risponderti dobbiamo tornare indietro ai primi anni Ottanta. Le agenzie pubblicitarie a quel tempo cominciarono a porsi la domanda su quale fosse il canale più giusto e idoneo per reclamizzare la moda. Avevano capito che la moda, a differenza dei beni durevoli e a causa della sua estrema propensione al cambiamento, non forniva loro dei parametri stabili sui quali fondare una strategia promozionale. Fu per questo motivo che intorno alla figura di Flavio Lucchini, il grande fondatore di Condé Nast Italia prima e di Donna poi, sorsero dei tavoli di discussione ai quali presero parte stilisti, aziende del settore e pubblicitari. Da queste riunioni fiume, alle quali carinamente Flavio mi fece assistere (“stai zitto e ascolta”, così mi disse), emerse forte un concetto basilare: la comunicazione della moda non deve mai parlare al cliente. Deve creare un mondo di sogno, di riferimento, di bellezza senza mai rivolgersi direttamente alle persone e, in ragione di questa esclusività, convincere i clienti del fatto che comprando quei determinati prodotti si possa, forse, avere accesso a questo mondo meraviglioso. Elaborato questo assunto, la direzione era definita. La non adeguatezza dei canali tradizionali apparve lampante. La televisione, il principale metodo di trasmissione pubblicitaria, affiancava e quindi in un certo senso accomunava prodotti tra loro profondamente differenti: dai pannolini, alle aspirapolvere alle radio nel giro di venti secondi. Non poteva in alcun modo essere il veicolo della moda e del sogno che ne è alla base. La moda aveva bisogno di un canale tutto suo e la fotografia era il percorso da seguire. La fotografia aveva e ha questo potere enorme, che il mezzo televisivo non avrà mai: rendere protagonista l’oggetto e accessorio l’essere umano.\nQuando e come hai capito che la moda poteva essere la direzione giusta da percorrere?\nÈ andata così. Intono alla metà degli anni Settanta, mi sono reso conto che ero stato preparato per un mondo che in realtà non esisteva più. Io, settimo figlio di genitori anziani, sono stato allevato secondo i principi della Patria, dell’onore, della bandiera. Appena misi piede fuori da quel mondo costellato da gentiluomini e gentildonne, mi trovai in un posto profondamente diverso e incredibilmente teso e duro: erano gli anni delle Brigate Rosse e il piombo e le bombe in strada erano all’ordine del giorno.\nRimasi spaesato. Mi rendevo conto della necessità di dover vivere nella realtà, ma allo stesso tempo non volevo rinunciare a quel mondo ricco di bellezza che avevo conosciuto negli anni dell’infanzia e dell’adolescenza. E allora mi sono detto: “Mi chiuderò in una cantina buia e cercherò di ricreare il mondo che mi hanno insegnato e che conosco profondamente”.\nDopo sei o sette anni di gavetta durissima – mio papà mi aveva cacciato di casa, profondamente contrariato dalla mia decisione di rinunciare all’università per inseguire il sogno della fotografia – mi trovai incredibilmente nel posto giusto al momento giusto. Il momento è quello che ti ho descritto prima, e cioè durante l’ascesa del mezzo fotografico quale unico o principale veicolo comunicativo della moda. E così nel giro di una settimana, da lavori trascurabili per piccoli committenti, passai a essere reclutato dalle due riviste di moda più importanti, Vogue Italia e Donna. Sono e sarò sempre grato alla moda, alla quale devo molto se non tutto. La moda è stata per me ciò che i grandi Signori rinascimentali sono stati per i loro pittori. Grazie alla moda ho potuto costruire il mio mondo personale e materiale: per questo motivo non ho mai considerato la committenza un limite alla mia creatività.\nCosa è necessario perché tu ti ritenga soddisfatto di un lavoro che proponi al pubblico?\nTi do due risposte a questa domanda.\nLa prima può sembrare poco poetica, ma è la cruda verità: le campagne pubblicitarie si giudicano alla fine, dai risultati di vendita ottenuti e non dalla bellezza dell’immagine, o per lo meno non esclusivamente. A volte i clienti mi dicono: “che bella questa foto, sono entusiasta”, e io lì a gettare acqua sul fuoco predicando l’attesa dei risultati di vendita. Il mio lavoro è quello di far vendere più copie a una rivista, e dunque il giudizio non può in alcun modo svincolarsi dal risultato commerciale ottenuto. Questo insegnamento, anche piuttosto crudo se vuoi, me l’ha dato – come tanti altri – Flavio Lucchini: un bravo fotografo fa vendere di più il suo datore di lavoro, se poi fa anche una bella foto allora può diventare un grande fotografo. Dal punto di vista più prettamente artistico, sono soddisfatto quando riesco a produrre una foto che sia in linea con la storia, il carattere e il modo di essere della casa di moda per la quale sto lavorando.\nOgni cliente ha diritto a essere capito e rappresentato nel linguaggio giusto.\nBisogna entrare in profondità nella filosofia del committente ed esaltare la potenzialità espressiva dei prodotti che offre al pubblico. È impossibile riproporre la medesima chiave di rappresentazione per tutti, non esiste un passepartout in grado di aprire la serratura di Dior, di Krizia e di Versace allo stesso tempo.\nQuesta è la difficoltà maggiore di fotografare la moda.\nSai Giovanni, questo è un aspetto che accomuna il tuo e il mio lavoro. Anche per me è fondamentale capire il contesto del mio cliente, comprenderne l’organizzazione, i valori, il sistema di funzionamento ufficiale e anche quello sotteso.\nNon è detto che una persona giusta per Versace, per fare un esempio, sia adatta per Armani, e questo a prescindere dalle competenze strettamente tecniche e professionali.\nBravo, è esattamente la stessa cosa! Dubito fortemente (ridendo, ndr) che Giorgio possa assumere uno che ha lavorato da Gianni!\nScherzi a parte, ho notato che a volte i giovani non riescono a capire questa esigenza di diversità: ripropongono la stessa foto – magari la più bella del mondo, eseguita alla perfezione – a clienti diversi e inevitabilmente non ottengono i risultati sperati. Perché non hanno dedicato tempo, attenzione e riflessione all’identità del cliente.\nFOTO DI GIOVANNI GASTEL (4 COLORI ALMENO – “DONNA”, MARZO 1982)\nMolti fotografi, così come molti stilisti, hanno sentito la necessità di identificare una musa, una figura femminile ricorrente che ispirasse e accompagnasse il loro lavoro.\nC’è qualcuno o qualcosa che ha assolto o assolve per te a questa funzione?\nCertamente. Io ho avuto nell’arco di questi quarant’anni di attività alcune modelle che sono state centrali nella mia estetica. La prima è stata Linda (Evangelista, ndr) con cui ho cominciato a lavorare nei primi anni Ottanta e con la quale ho avuto un’intesa straordinaria. Insieme abbiamo fatto la sua prima copertina al mondo. Poi negli anni Novanta c’è stata Shalom (Harlow, ndr) e poi ancora altre che hanno contribuito alla costruzione del mio concetto artistico.\nMa al di là dei nomi, voglio sottolineare l’importanza e la difficoltà del lavoro della modella e ciò che distingue una modella da una modella straordinaria, al di là del fattore estetico. Per essere una modella straordinaria bisogna comprendere tre cose fondamentali: la prima è capire e accettare di non essere la protagonista della foto, ma un accessorio che esalta il vero protagonista, il prodotto. La seconda è capire l’estetica di chi la sta fotografando e infine capire l’estetica del cliente per il quale sta lavorando insieme al fotografo. Capisci bene quanto sia difficile questo lavoro!\nNon usa la parola, ma tutto il resto equipara la grande modella a una grande attrice. Mi piace dirlo, perché spesso il lavoro della modella viene sottovalutato.\nIl mondo della moda negli ultimi anni ha subito trasformazioni epocali: esposizione social, velocità di proposta e di consumo, polarizzazione di molti brands all’interno di pochi grandi gruppi.\nCosa pensi dell’egemonia dei gruppi stranieri in riferimento alle aziende italiane?\nPenso che sia uno sviluppo che tutto sommato si poteva intuire in anticipo. La frammentazione dei marchi in un momento economicamente difficile, in un contesto di internazionalizzazione della produzione, non aveva più molto senso. La cosa che mi dispiace è che non si sia formato un vero grande gruppo del lusso italiano, però devo riconoscere che i francesi prima, e anche gli americani più di recente, hanno comprato le aziende italiane lasciando intatte e anzi rafforzando le realtà produttive presenti nel nostro Paese, sono stati molto rispettosi nei nostri confronti. Bernard Arnault (patron di LVMH, ndr) – e parlo di lui perché lo conosco meglio degli altri avendo lavorato a lungo per Dior – adora davvero il Made in Italy e la fattura italiana, ha investito miliardi nel nostro Paese: quello che voglio dire è che ha avuto tanto dall’Italia, ma anche dato molto indietro e in modo molto concreto, ristrutturando e potenziando fabbriche manifatturiere che erano in difficoltà. Ma potrei dire lo stesso della famiglia Pinault.\nEcco, finché i grandi gruppi fanno questo, credo che non possiamo lamentarci.\nHai a che fare con molti giovani fotografi, come riconosci i più bravi? Esiste una formula per decifrare il talento?\nAssolutamente sì, ho a che fare con tantissimi giovani fotografi e credo di sapere riconoscere quelli sui quali valga la pena di lavorare. E ti dirò, negli ultimi anni è diventato molto più facile individuare chi ha davvero qualcosa da dire.\nL’avvento dell’elettronica ha fatto decadere quelle che io chiamo “le difese tecniche”: un fotografo prima poteva difendersi dietro la conoscenza tecnica, dietro al “io lo so fare e tu no”, adesso non più, e aggiungo finalmente.\nAdesso devi giocarti il cuore, ma se ti giochi il cuore devi prima andare a cercare qual è il tuo cuore. Qual è la tua differenza, il tuo stile, il carattere che ti rende unico e irripetibile. È un percorso interiore prima che professionale, ed è un percorso molto faticoso. Solo dopo questa ricerca introspettiva il tuo cammino sarà ben delineato e artisticamente coerente.\nIo, ad esempio, alla fine della mia ricerca io ho individuato una parola che sarebbe stata la stella polare del mio lavoro, e questa parola è “Eleganza”. Per me l’eleganza è una categoria morale, oltre che una manifestazione empirica.\nQuindi, quando conosco giovani fotografi cerco di capire a che punto sono del loro percorso: all’inizio, a metà, oppure se non hanno nemmeno avvertito l’esigenza di capire dove vogliono andare. Ecco, quando vedo un giovane fotografo che, anche se in fieri, è alle prese con la ricerca della propria unicità, allora mi dico che vale la pena lavorarci su.\nPerò non stronco mai nessuno, dico con estrema chiarezza che adesso le tue foto non vanno bene ma non sono nessuno per dirti di cambiare lavoro. Magari tra cinque anni sarai il fotografo più bravo del mondo. Ognuno ha i suoi tempi e ognuno ha il diritto di coltivare la propria passione e i propri sogni: io da ragazzo facevo delle foto bruttissime!\nÈ importante sapersi prendere dei rischi nel tuo mestiere? Che rapporto hai col rischio?\nMoltissimo, ho un rapporto assoluto col rischio.\nI clienti spesso hanno dei parametri che dipendono quasi sempre dal “già visto” e ciò fa sì che ti chiedano cose magari un po’ diverse, ma fondamentalmente già viste anche loro. Perché sono rassicuranti e omologate con quello che loro conoscono. Quando tu gli proponi foto diverse, pochissimi sono quelli che hanno il coraggio di rischiare.\nIo ho sempre seguito la via della sperimentazione che per definizione è rischiosa, ma se non lo avessi fatto oggi non sarei io. Anche in questo io devo moltissimo a Flavio Lucchini: quando nessuno voleva le mie foto perché definite “strane”, quel signore lì – che è stato il più grande Art Director di tutti i tempi – ha avuto il coraggio di capirle, coglierne l’anima e di letteralmente imporle al mercato.\nMi disse: “Giovanni, io imporrò le tue foto al mondo. E sai come? Pubblicandone quaranta per ogni numero”.\nTre mesi dopo ero diventato un grande fotografo.\nCi racconti l’errore che professionalmente ti ha più di tutti insegnato qualcosa?\nIo credo che lo stile sia l’errore. Se tu analizzi le mie fotografie con un manuale sottomano, sono tutte sbagliate, dalla prima all’ultima. La codificazione, la ripetizione consapevole dell’errore è lo stile. Le mie foto sono quasi sempre sfocate, mosse, sovraesposte, sottoesposte e chi più ne ha più ne metta. A un esame di tecnica fotografica verrei bocciato sicuramente.\nPer cui io ho un grande rispetto per l’errore, purché sia funzionale all’obiettivo che vuoi perseguire.\nMa la cosa più importante di tutte è non avere paura dell’errore o di una scelta che potrebbe rivelarsi sbagliata. Quello è il pericolo più grande: non prendersi dei rischi per paura delle conseguenze. Quando ho scelto di andare via da Vogue nonostante mi avessero offerto cinque volte più del mio compenso di allora, tutti mi diedero del pazzo: ma io volevo lavorare ancora con Flavio (Lucchini, ndr), ero convinto che quella fosse la mia strada. Presi il mio rischio e andai.\nRicordo ancora le urla di Franca (Sozzani, ndr) quando all’offerta economica faraonica di Attilio Fontanesi risposi: “Senta dottore, io però non sono una donna di strada” (ride).\nFOTO DI ANDREA COLZANI – andreacolzani.photographer\nQual è il traguardo professionale più bello che hai raggiunto e quale invece il sogno che ti riprometti di realizzare?\nSemplicemente, il traguardo più bello che ho raggiunto è stato aver vissuto la vita che sognavo. Vivere nell’arte, della mia arte, aver contribuito a formare tantissimi giovani di talento. Non posso chiedere di più.\nPer quanto riguarda il sogno che ancora ho, e sono contento che tu me l’abbia chiesto, è quello di riuscire un giorno a fotografare il nulla. Nel mio percorso artistico ho gradualmente e volutamente tolto piuttosto che aggiunto. La mia ossessione è stata ed è quella di togliere, togliere e ancora togliere. Ecco, mi piacerebbe concludere quest’avventura riuscendo a scattare una foto del nulla. Però che si capisse immediatamente che l’ho fatta io! (ride).\nSo che ami scrivere poesie. Quali analogie e quali diversità ci sono tra fotografia e poesia?\nIo le uso in maniera diametralmente opposta.\nHo deciso di utilizzare la fotografia per parlare del mondo come vorrei che fosse, di alludere al reale per creare un giardino incantato fatto di eleganza, di bellezza e rispetto.\nCon la poesia invece parlo del mondo reale, dei miei sentimenti, della mia solitudine. Vado in profondità, in introspezione. La poesia è per me molto più sofferta e drammatica rispetto alla fotografia.\nUna citazione, una frase che ami che rappresenta la tua visione della vita.\nLa prima è un insegnamento che mi diede mia madre (Ida Visconti di Modrone, sorella di Luchino Visconti, ndr) quando avevo tredici anni:\n“Giovanni, è arrivato il momento che tu scelga un tono. Il tono che userai nella vita. Ma fai attenzione, sceglilo molto bene perché poi dovrai usarlo col Re di Spagna e anche col benzinaio. Perché se cambi tono, sei una merda”\nLa seconda è una poesia:\n“Approdato in quest’epoca\ncome un naufrago su una terra sconosciuta\nho misurato il territorio e appreso la lingua dei nativi.\nSono invecchiato raccontando del mio mondo lontano,\nL’ho scritta io.\nPer chi fosse interessato ad approfondire la figura di Giovanni Gastel, la redazione consiglia la lettura del libro autobiografico: “UN ETERNO ISTANTE. LA MIA VITA.” edito da Mondadori.


Penne - MD Creazioni %le penne %penne stilografiche %penne roller\nLa penna è uno strumento immancabile sulla scrivania in ufficio, in borsa o nel taschino, a casa, a scuola…\nAnche se siamo nell’epoca digitale dove è più semplice e veloce scattare una foto come promemoria o digitare un appunto sulla tastiera di un tablet la penna rimane la regina della scrittura.\nAlzi la mano chi non ha mai avuto la sua penna preferita!\nIo adoro scrivere a mano, sebbene sia più sbrigativo stendere una bozza al computer … è già lì … e poi pubblicarla, preferisco mettere i miei pensieri e le mie idee prima su carta. Nel far questo sono anche esigente, la penna deve avere un tratto scorrevole e in primo luogo mi deve piacere.\nI kit per le penne presenti sul mercato puntano a soddisfare ogni esigenza, ma non basta. E’ qui che entrano in gioco l’abilità e la fantasia dell’artigiano tornitore per creare “la magia”, la giusta combinazione tra funzionalità e bellezza.\nSe vuoi regalare o regalarti una penna artigianale guarda la gallery qui sotto, c’è la possibilità di personalizzare la penna e/o la scatola in legno con il nome, un disegno… contattami, sarò lieto di rispondere alle tue richieste.


Vendita Cappelli offerte online, Negozi cappelli sconti on-line - Last Shopping\nNegozi Shopping > Abbigliamento e Moda > Cappelli\nCappelli54 Negozi online\nAcquista Cappellini, Cappelli, Berretti Firmati, Cappelli per Uomo e Donna a prezzi vantaggiosi nei Negozi di Cappelli trovi: Missoni, Moncler, Moschino, Prada, Gucci, Dolce&Gabbana, Emporio Armani... Cappellini estivi e invernali, in cotone e lana... vari modelli di cappelli per tutte le occasioni.\tscheda negozioZALANDO\nNovit� cappelli firmati: saldi onlineNon perdere l'opportunit� di acquistare online cappelli e berretti firmati a un prezzo molto competitivo. Grandi firme tra cui Belstaff, Adidas, CK, Converse, Diesel, Hilfiger, Levi's, propongono modelli che integrano qualit� e design all'avanguardia. Che aspetti? Guarda il catalogo e rimarrai affascinato. 1 commentoEntra in Negozio\nVendita cappellini e cappelli estivi e invernaliAcquista Berretti e cappellini estivi e invernali, cappelli con visiera, cappelli in lana, acquista online e risparmi.11 commentiEntra in Negozio\nVendita cappelli, berretti uomo, donna, bambinoBellissimi cappelli e berretti in vari modelli e disponibili per uomo, donna e bambino li trovi qui online. Nike, Adidas, Converse, Billabong, Ripcurl sono alcuni dei tanti grandi marchi presenti in vari colori, forme e materiali e a prezzi unici!1 commentoEntra in Negozio\nCappelli e berretti all'ultimo gridoNel negozio online Monnier Fr�res � possibile acquistare cappelli e berretti di vario stile a prezzi molto interessanti. Gli articoli sono firmati da prestigiosi nomi ben conosciuti nel mondo della moda, e sono una vera e propria garanzia in termini di qualit� ed affidabilit�.Scrivi un commentoEntra in Negozio\nCappellini e berrette alla moda, acquistali onlineStylefile vende online cappellini e berrette di grande stile. Adatti ad un abbigliamento giovane e di tendenza, questi cappellini sono disponibili in molti modelli sia per donna che per uomo.Scrivi un commentoEntra in Negozio\nCappelli firmati Cavalli, Fendi, Belstaff, Iceberg, MorelloCon questo importante sito online acquisti cappelli di elevata qualit� a poco prezzo. Marchi leader come Cavalli, Fendi, Belstaff, Iceberg, Morello e non solo assicurano modelli maschili e femminili di ultima moda. 2 commentiEntra in Negozio\nSconti cappelli e berrette Animal baseball, Beanie, Skull..Entra nel sito e acquista tra i tanti cappelli e berrette disponibili, progettati per regalarti un tocco di stile in pi�. Animal baseball, Beanie, Skull sono alcuni dei marchi presenti. Tantissimi modelli sportivi ti aspettano online. Prezzi vantaggiosi assicurati!Scrivi un commentoEntra in Negozio\nVendita online cappelli dallo stile simpatico e di tendenzaCappelli e berrette di ottima qualit� in vendita online in questo negozio. Accessori alla moda per completare il proprio look ed esprimere la propria personalit�. Lelyca riesce ad offrire un'interessante panorama di articoli a buon prezzo.Scrivi un commentoEntra in Negozio\nCappelli per la protezione solare,Acquista online particolari cappelli che sono stati studiati per offrire un'ottima protezione dal sole. A disposizione modelli per donna, uomo e bambino che sapranno soddisfare anche dal punto di vista estetico.Scrivi un commentoEntra in Negozio\nCappelli e berrette per donna e uomo, vendita onlineNel negozio MonShowroom si possono acquistare vari modelli di cappelli e berretti sia per donna che per uomo. Accessori di ottima fattura con cui completare il modo look. Tutti i cappelli venduti dal negozio sono di importanti marche del mondo della moda.Scrivi un commentoEntra in Negozio\nCappelli e Cappellini Uomo firmati in YooxEntra in Yoox e scopri la collezione di cappelli e cappellini maschili da acquistare oline. Alcune delle marche trattate: Hugo Boss, Burberry, D&G, Brunello Cucinelli, Dior, Gucci, Jil Sander, Woolrisch, Areonautica Militare, Malo ... vai »