Material Extra OAB teórico-práctico | Plásmido | Southern Blot\nguardarGuardar Material Extra OAB teórico-práctico para más tarde\nDiapositivas Ingeniería genética\nAUSPICIA Y FINANCIA EL MINISTERIO DE EDUCACIÓN, CIENCIA Y TECNOLOGÍA\nUNIVERSIDAD NACIONAL DE RÍO CUARTO FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS FÍSICO-QUÍMICAS Y NATURALES-\nEditado por Olimpíada Argentina de Biología\nCONCEPTOS DE LAS CIENCIAS BIOLÓGICAS\nSobre la base de los temarios teóricos y prácticos propuestos para la OAB, y considerando la necesidad de lograr un abordaje del conocimiento actualizado es que ponemos a su disposición esta guía orientadora, según la bibliografía disponible en esta Olimpíada, la cual es consultada por los Comités académicos para lograr ideas que permitan la elaboración de los exámenes de todas las instancias de esta Olimpíada. La ampliación de estos contenidos pueden realizarse en cualquier material que Ud. disponga y que se encuentre acorde a lo aquí especificado. En esta primera propuesta se presentan los tres tópicos de los temarios teóricos (Biología Celular, Organismos y Etología, Ecología y Evolución), de los cuales se seleccionaron algunos puntos en función de las dificultades observadas en ediciones anteriores de la OAB, entre ellos Biotecnología, Sistemática de animales, Anatomía de vegetales, Cladismo y conceptos incluidos en Etología. Asimismo se incorporaron algunas destrezas básicas incluidas en los temarios prácticos de ambos niveles.\nCompilación: Lic. y Prof. Analía Barbosa Secretaria Olimpíada Argentina de Biología\nTópico: Biología Celular\nEn 1970 comienza el desarrollo de la tecnología del DNA recombinante, llevando a métodos de investigación novedosos. Las técnicas de DNA recombinante se desarrollaron en un principio como herramientas que permitirían a los científicos obtener una gran cantidad de copias de cualquier segmento de DNA específico, de manera que éste pudiera estudiarse desde el punto de vista bioquímico. Esto se realizó en un inicio introduciendo DNA ajeno en células de microorganismos. En condiciones apropiadas, éste se duplica y transmite a las células hijas cuando la original se divide. Así una secuencia de DNA específica puede ser amplificada o clonada para producir millones de copias idénticas que pueden aislarse en forma pura. En la actualidad son cada vez más importantes los métodos in vitro.\nLa tecnología del DNA recombinante tiene varias aplicaciones, una de las que más avanza es la ingeniería genética, que implica la modificación del DNA de un organismo para producir nuevos genes con nuevas características. Su desarrollo se debe al descubrimiento de las enzimas de restricción y de la transformación bacteriana de los plásmidos. Las bacterias producen enzimas conocidas como de restricción, las cuales cortan las moléculas de DNA sólo en lugares específicos. La amplificación de un fragmento de DNA puede lograrse in vitro, con el uso de polimerasas de DNA de bacterias termorresistentes e in vivo, introduciendo moléculas de DNA recombinante (vector + inserto DNA) en bacterias u otros microorganismos como las levaduras. Las enzimas de restricción son “tijeras moleculares” cuya especificidad permite realizar cortes del DNA de manera controlada. Existen varias enzimas conocidas, un ejemplo es Bam HI que reconoce y corta una molécula de DNA en la secuencia de bases 5´G/GATTCC-3´, otro es EcoRI, que corta la secuencia 5´-G/AATTC-3´. Muchas de las enzimas empleadas para estudios de DNA recombinante cortan secuencias polindrómicas, en las cuales una cadena se lee igual que su complemento pero en sentido opuesto, por ejemplo para 5´-AAGCTT-3´ se lee, 3´-TTCGAA-5´. Cuando la enzima corta, quedan extremos de cadenas sencillas complementarios a los\nque se denomina “pegajosos” por la posibilidad que poseen de unirse entre sí por enlaces de hidrógeno. Además, el fragmento puede tratarse con una ligasa de DNA para lograr una molécula recombinante estable. En la figura se muestra el mecanismo de acción de una enzima de restricción.\nLuego del aislamiento, los fragmento del DNA, deben ser incorporados a un portador adecuado llamado vector para poder ser amplificado.\nVectores Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huésped y replicarse (clonarse). Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas características:\n1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta.\n2. Debe contener varios sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción únicos permiten insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima sin desmembrar el vector, situación que se produciría si se utilizasen sitios de restricción presentes más de una vez en el\n3. Debe tener algún marcador de selección, (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tenga) para poder distinguir las células huésped que transportan al vector, de las que no las contienen.\n4. El vector debería poder extraerse fácilmente de la célula huésped.\nLos plásmidos Un plásmido es una molécula circular separada del DNA bacteriano y mucho más pequeña que éste pero con la capacidad de duplicarse dentro de la célula bacteriana y de brindarles facultades para desarrollarse en condiciones específicas en las que no podrían hacerlo si no estuvieran transformadas. Son moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en células bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos. El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos diseñados que se utilizó.\nFigura. Mapa de restricción del plásmido pBR322, que muestra las localizaciones de los sitios de las enzimas de restricción que cortan el plásmido por un solo sitio. Estos sitios pueden utilizarse para insertar los fragmentos de DNA a clonar. También se muestran las localizaciones de los genes de resistencia a antibióticos.\nEste plásmido tienen un origen de replicación (ori), dos genes de selección (resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de restricción únicos. Dentro del gen de resistencia a tetraciclina hay sitios de restricción únicos para las enzimas BamHI, SpbI, SalI, XmaIII y NruI, y dentro del gen de resistencia a ampicilina hay sitios de restricción únicos para las enzimas RruI, PvuI, y PstI. Si se introduce un pBR322 en una célula bacteriana sin plásmidos y sensible a antibióticos, la célula se convertirá en resistente a la tetraciclina y a la ampicilina. Si se inserta un fragmento de DNA en los sitios de restricción RruI, PvuI, o PstI, se inactivará el gen de resistencia a ampicilina, pero el gen de resistencia a tetraciclina seguirá activo. Si este plásmido recombinante se transfiere a una célula bacteriana que no contenga plásmidos, las células que contengan el plásmido recombinante podrán identificarse, ya que serán resistentes a tetraciclina y sensibles a ampicilina.\nFigura. El plásmido pUC18 ofrece varias ventajas como vector de clonación. Debido a su pequeño tamaño, puede aceptar fragmentos de DNA relativamente grandes; se replica hasta un alto número de copias y tiene un gran número de sitios de restricción en el sitio de clonación múltiple, localizado dentro del gen lacZ. Las bacterias que contienen pUC18 producen colonias de color azul si crecen en un medio que contenga X-gal. El DNA insertado en el sitio de clonación múltiple interrumpe el gen lacZ, resultando en colonias blancas, lo que permite la identificación directa de las colonias que tienen insertos de DNA clonados.\nLos bacteriófagos lambda y M13 Lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de DNA recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes de lambda, y se conoce toda la secuencia nucleotídica de su genoma. El tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse por DNA exógeno sin afectar la capacidad del fago para infectar células y formar calvas. Se han desarrollado más de 100 vectores basados en el fago lambda, eliminado diversas porciones del grupo génico central. Para clonar utilizando el vector lambda, se corta el DNA del fago con una enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un brazo derecho y una región central. Se aislan los brazos y se ligan (utilizando la DNA ligasa) a un segmento de DNA obtenido tras cortar DNA genómico con la misma enzima de restricción (en este ejemplo EcoRI). Las moléculas recombinantes resultantes pueden introducirse en células huésped bacterianas de dos maneras: Por transformación. Una vez en las células huésped, se replican generando fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. Por infección , se mezcla el DNA de lambda que contiene el inserto con los componentes proteicos del fago (cabezas y colas); de esta mezcla se forman partículas fágicas infectivas (empaquetamiento “in vitro”). Los fagos pueden amplificarse haciéndose crecer en placas sembradas con bacterias, donde se formarán calvas, o bien infectando células en un medio líquido y recogiendo las células lisadas.\nclonación utilizando el fago\npreparación de fago lambda y se elimina el grupo central\nrestricción. El DNA a clonar\nenzima y se\nliga entre los\nrecombinante dentro de las\ncromosoma, inserto de DNA.\nLos cósmidos y los vectores transbordadores\nLos cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación (ori) y de genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen. El DNA de los cósmidos que contienen insertos de DNA se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas. Una vez que el cósmido entra en la célula huésped se replica como un plásmido. Puesto que la mayoría del genoma lambda se ha delecionado, los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho más grandes que los que lambda puede llevar. Los cósmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado; los vectores fágicos pueden acomodar insertos de DNA de unas 15 kb, y los plásmidos generalmente están limitados a insertos de 5- 10 kb. Existen otros vectores híbridos, construidos con orígenes de replicación provenientes de distintas fuentes (por ejemplo, plásmidos y virus animales como SV40), que pueden replicarse en más de un tipo de célula huésped. Generalmente, estos vectores transbordadores contienen marcadores genéticos que permiten su selección en los dos sistemas huésped, y pueden utilizarse para transportar insertos de DNA entre E. coli y otras células huésped como levadura y viceversa. A menudo, estos vectores se emplean para investigar la expresión génica.\nFigura. El cósmido pJB8 contiene un origen de replicación bacteriano (ori), un solo sitio cos (cos), un gen de resistencia a ampicilina (amp) para seleccionar las colonias que han incorporado el cósmido, y una región que contiene cuatro sitios de restricción para la clonación (BamHI, EcoRI, Clal y Hind III). Las cubiertas víricas que contienen un cósmido pueden utilizarse para infectar células huésped adecuadas, y el vector que transporta el inserto de DNA se transferirá a la célula huésped por infección. Una vez dentro, la secuencia ori permite que el cósmido se replique como un plásmido bacteriano.\nPara cartografiar y analizar genomas eucarióticos complejos, se desarrolló un vector multiuso llamado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. Éste es un plásmido que se replica independientemente y está implicado en la transferencia de información genética en la conjugación bacteriana. Como los factores F pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1 Mb, se diseñaron para que funcionen como vectores de DNA eucariótico. Los vectores BAC tienen los genes de replicación y de número de copia del factor F, e incorporan un marcador de resistencia a un antibiótico y sitios de restricción para insertar el DNA exógeno a clonar. Además, el sitio de clonación está flanqueado por regiones promotoras que pueden utilizarse para generar moléculas de RNA y expresar así el gen clonado, o para utilizarlas como sonda para paseo cromosómico, y para secuenciar el DNA del inserto clonado.\nFigura. Resumen de los pasos seguidos en la clonación de un vector plasmídico. Los vectores plasmídicos se aíslan y se cortan con una enzima de restricción. El DNA a clonar se corta con la misma enzima de restricción, produciendo una colección de fragmentos. Estos fragmentos se reparten entre los vectores y se transfieren a huéspedes bacterianos para su replicación. Las células bacterianas que contienen plásmidos pueden identificarse por crecimiento en un medio selectivo, y pueden aislarse. El DNA clonado puede recuperarse del huésped bacteriano para nuevos análisis.\nClonación de DNA en E. coli Para replicar el DNA clonado se pueden utilizar distintos tipos de células huésped. Uno de los huéspedes más utilizados es la cepa de laboratorio K12 de E. coli. Ésta y otras cepas de E. coli se utilizan como huéspedes ya que están bien caracterizadas genéticamente y pueden aceptar un amplio espectro de vectores, incluyendo los plásmidos, los fagos y los cósmidos. Para crear moléculas de DNA recombinante se precisan varios pasos. Si se utiliza un plásmido como vector, el procedimiento es el siguiente:\n2. Estos fragmentos se ligan a moléculas de plásmido que han sido cortadas con la misma enzima de restricción, obteniéndose un vector recombinante.\n3. El vector recombinante se transfiere a células huésped bacterianas, generalmente por transformación, un proceso en el que las moléculas de DNA atraviesan la membrana de la célula huésped transfiriéndose a su interior.\n4. La célula huésped se hace crecer en una placa de cultivo, donde formará colonias. Puesto que las células de cada una de las colonias provienen de una sola célula inicial, todas las células de la colonia, y los plásmidos que contienen, son genéticamente idénticas, o clones. Se rastrean las colonias para identificar las que han incorporado el plásmido recombinante.\nSe utilizan varios métodos para seleccionar las colonias que contienen plásmidos con el inserto de DNA. Este proceso se denomina rastreo (o cribado). Para vectores como pBR322, el rastreo es un proceso que consiste en dos etapas. Por ejemplo, si el DNA que se desea clonar se inserta dentro del gen de resistencia a tetraciclina, este gen se inactivará. Después de transformar células huéspedes con el plásmido recombinante, éstas se hacen crecer en placas de cultivo que contienen el antibiótico ampicilina. Todas las células que hayan incorporado un plásmido (con o sin inserto) crecerán y formarán colonias, mientras que las células que no lo hayan incorporado morirán ya que son sensibles a la ampicilina. En el segundo paso, se identifican las colonias que contiene plásmidos con el inserto de DNA. En este paso, se transfieren las colonias de la placa que\ncontiene ampicilina a una placa que contiene tetraciclina, debido a que el inserto ha inactivado el gen de resistencia a tetraciclina. Entonces, el patrón de colonias de la placa con tetraciclina se compara con el de la placa con ampicilina, y se identifica las colonias de la placa con ampicilina que no han crecido en la placa con tetraciclina. Las células de estas colonias contienen vectores con el inserto de DNA, y se transfieren a un medio de crecimiento para nuevos análisis.\nFigura. Selección de colonias que contienen un vector plasmídico que tiene dos genes de resistencia a antibióticos, uno para tetraciclina y otro para ampicilina. En este experimento, la presencia del inserto de DNA en el plásmido inactivará el gen de resistencia de tetraciclina.\nOtros vectores, como pUC18, tienen construcciones que producen colonias azules cuando están en células bacterianas sembradas en un medio que contiene una sustancia denominada X-gal. Los sitios de restricción del sitio de clonación múltiple de pUC18 están dentro del gen lac, el gen responsable de la capacidad de formar colonias azules, y la inserción de DNA en el sitio de clonación múltiple interrumpe esta capacidad. Como se ha expuesto anteriormente, los plásmidos que contienen los segmentos de DNA insertados producen colonias blancas, mientras que los que no tienen insertos producen colonias azules. De igual modo, los fagos que contengan DNA exógeno también pueden utilizarse para infectar células huésped de E. coli, y cuando se siembran en un medio sólido, cada una de las calvas resultantes representa los descendientes clonados de\nun solo fago inicial. Los cósmidos infectan a las células bacterianas como los fagos, pero luego se replican como los plásmidos dentro de la célula huésped. Las células que contiene cósmidos con DNA clonado pueden identificarse y recuperarse de la misma manera que los plásmidos.\nClonación en huéspedes eucarióticos Hemos descripto la utilización de E. coli como huésped para la clonación. También pueden utilizarse otras especies de bacterias como huéspedes, como B. subtilis y Streptomyces. Estos sistemas huésped bacterianos y sus vectores son parecidos a los descriptos para E. coli. Sin embargo, para estudiar la expresión y regulación de los genes eucarióticos, a menudo es conveniente e incluso necesario utilizar huéspedes eucarióticos. En esta sección describiremos sistemas de clonación que utilizan células eucarióticas como huéspedes.\nAunque la levadura es un organismo eucariótico, puede manipularse y crecer de manera parecida a las células bacterianas. Además, la genética de las levaduras se ha investigado exhaustivamente, lo que ha proporcionado un gran catálogo de mutaciones y unos mapas genéticos altamente detallados de sus cromosomas. En levadura hay un plásmido de origen natural, denominado plásmido 2 micras (o plásmido 2 µ), que se ha utilizado para construir varios vectores de clonación para levadura. Combinando secuencias de plásmidos bacterianos con plásmidos 2 micras, se pueden producir vectores con muchas propiedades útiles.\nConstrucción de bibliotecas de DNA Puesto que cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeño, deben construirse muchos clones diferentes para incluir todas las pequeñas porciones del genoma de un organismo. El conjunto clonado de todas las secuencias genómicas de un solo individuo se denomina biblioteca. Las bibliotecas clonadas pueden provenir del genoma completo de un individuo, del DNA de un solo cromosoma, o del conjunto de genes transcripcionalmente activos en un único tipo celular.\nBibliotecas genómicas Las bibliotecas genómicas (o genotecas) suelen construirse utilizando vectores fágicos, que pueden contener grandes fragmentos cromosómicos. Para preparar una biblioteca en el fago lambda, se corta el DNA de lambda con una enzima de restricción para eliminar el grupo génico central. El DNA genómico que se desea clonar se corta con la misma enzima, y se purifican los fragmentos cortados de tamaño óptimo para el empaquetamiento (de 15 a 17kb) mediante electroforesis en gel o por centrifugación. Estos fragmentos de DNA se ligan con los brazos del cromosoma de lambda para formar la biblioteca.\nEn una biblioteca genómica están representados todos los genes de un organismo. La biblioteca es un medio para recuperar cualquier gen del genoma del organismo, pudiéndose estudiar con detalle junto con sus secuencias reguladoras adyacentes. Teóricamente, una biblioteca genómica contiene al menos una copia de todas las secuencias representadas en el genoma. Sin embargo, cada molécula de vector puede contener sólo relativamente pocas kilobases de DNA insertado, por lo que una de las primeras tareas al preparar una biblioteca genómica es seleccionar el vector más adecuado para contener el genoma completo en el menor número posible de clones. El número de clones necesarios para contener todas las secuencias de un genoma depende del tamaño medio de los insertos clonados y del tamaño del genoma a clonar. Este número puede calcularse con la siguiente fórmula:\nN= ln (1-P) ln (1- ƒ) Donde N es el número de clones necesarios, P es la probabilidad de recuperar una secuencia determinada, y ƒ representa la fracción del genoma presente en cada clon.\nSi deseamos preparar una biblioteca del genoma humano utilizando como vector el fago lambda. El genoma humano tiene 3,0 x 10 6 kb; si el tamaño medio de los insertos clonados en el vector es 17 kb, y queremos tener una probabilidad del 99 % (P=0,99) de que cualquier gen humano esté representado al menos en una copia, precisaremos una biblioteca de unos 8,1x 10 5 fagos (donde f= 1,7 x10 4 /3,0 x 10 9 ). Si hubiésemos seleccionado a pBR322 como vector, con una tamaño medio de insertos de 5 kb, la biblioteca necesitaría contener varios millones de clones.\nBibliotecas de cDNA Se puede construir una biblioteca que represente los genes que se están transcribiendo en una célula eucariótica en un momento dado, utilizando el mRNA aislado de esa célula. Casi todas las moléculas de mRNA eucariótico tiene una cola de poli-A en su extremo 3’. Primero, se hibrida la población de moléculas de mRNA que tienen colas de poli-A 3’ con oligo-dT (DNA corto de cadena sencilla formado sólo por dexositimidina). La secuencia de oligo-dT híbrida con la cola de poli –A, y sirve de cebador para la síntesis de una cadena complementaria de DNA utilizando la enzima retrotranscriptasa (transcriptasa inversa). Esta enzima es una DNA polimerasa dependiente de RNA que copia un molde de RNA de cadena sencilla en un DNA de cadena sencilla. El resultado es un dúplex RNA-DNA de doble cadena. La cadena de RNA se elimina y la cadena sencilla de DNA se utiliza como molde para sintetizar la cadena complementaria de DNA, utilizando la DNA polimerasa I. El extremo 3’ de la cadena sencilla de DNA se dobla sobre sí mismo formando una horquilla (un lazo), por lo que puede servir de cebador para sintetizar la segunda cadena. El resultado es un DNA dúplex con las cadenas unidas por un extremo. La horquilla puede abrirse, obteniéndose una molécula de DNA de doble cadena (denominada DNA complementario o cDNA), cuya secuencia nucleotídica deriva de una molécula de\nSi se añade un trozo corto de DNA con sitios de restricción en cada uno de sus extremos, el cDNA puede clonarse. Este sitio de clonación puede cortarse con la enzima de restricción adecuada, produciendo extremos pegajosos, lo que permite que el cDNA se inserte en el sitio de restricción de un vector plasmídico o fágico. Una biblioteca de cDNA es diferente de una biblioteca genómica ya que representa sólo un subconjunto de todos los genes del genoma. Otra diferencia es que las bibliotecas de cDNA no contienen las secuencias promotoras adyacentes al gen, ni tampoco contienen las secuencias intercaladas o intrones, ya que éstos han sido eliminados del pre-mRNA durante la reacción de corte y empalme y no se encuentran en el mRNA maduro. Las bibliotecas de cDNA utilizan mRNA como punto de partida, de manera que sólo representan a las secuencias que se están expresando en un tipo celular, en un tejido, o en un estadio concreto del desarrollo embrionario. La decisión de construir una biblioteca genómica o de cDNA depende del problema planteado. Si se está interesado en un gen particular, podría ser más fácil preparar una biblioteca de cDNA del tejido en el que se expresa dicho gen. Por ejemplo, los glóbulos rojos producen grandes cantidades de hemoglobina, y la mayoría del mRNA de estas células es mRNA de la β-globina. Una biblioteca de cDNA preparada utilizando mRNA aislado de glóbulos rojos permite aislar con facilidad un gen de la globina. Si se interesaran las secuencias reguladoras adyacentes al gen de la globina, se necesitaría construir una biblioteca genómica, ya que estas secuencias reguladoras no se encuentran en el mRNA de la globina, y por lo tanto no estarían representadas en la biblioteca de cDNA.\nIdentificación de secuencias clonadas específicas Una biblioteca genómica puede contener varios cientos de miles de clones. El problema ahora es identificar y seleccionar sólo el clon o clones que contienen el gen que nos interesa, y determinar si un clon contiene todo el gen o sólo una parte de él. Hay varias maneras de hacerlo, y la elección depende de las circunstancias y de la información disponible. Los métodos que se describen a continuación utilizan diversos enfoques para encontrar una secuencia específica de DNA en una biblioteca.\nSondas para rastrear clones específicos Muchos de los protocolos utilizan una sonda para rastrear la biblioteca e identificar el clon que contiene el gen de interés. A menudo, las sondas son polinucleótidos radioactivos que contienen una secuencia de bases complementaria a todo o parte del gen de interés. Otros métodos utilizan sondas que dependen de reacciones químicas o colorimétricas para indicar la localización de un clon específico. Las sondas pueden provenir de distintas fuentes; genes relacionados aislados de otras especies pueden servir de sonda si la secuencia se ha conservado suficientemente. Por ejemplo, se aislaron copias extracromosómicas de genes ribosómicos de la rana Xenopus laevis por centrifugación, se cortaron con enzimas de restricción, y se clonaron en vectores plasmídicos. Como las secuencias de los genes ribosómicos se han conservado enormemente durante la evolución de los eucariotas, estos genes clonados de Xenopus se marcaron con radioisótopos y se utilizaron como sonda para aislar los genes ribosómicos humanos de una biblioteca genómica. Si el gen que se quiere seleccionar de la biblioteca es transcripcionalmente activo en determinados tipos celulares, se puede utilizar una sonda de cDNA para encontrarlo. Esta técnica es especialmente útil cuando puede obtenerse el mRNA purificado o enriquecido. Se sabe que el mRNA de la $-globina es el RNA mensajero predominante en determinados estadios del desarrollo de los glóbulos rojos. Para hacer una sonda, se aísla el mRNA de estas células, se purifica, y se copia con la retrotranscriptasa en una molécula de cDNA. Este cDNA puede utilizarse como sonda para recuperar el gen de la $-globina de una biblioteca genómica, incluyendo los intrones y las regiones de control adyacentes.\nMétodos de análisis de las secuencias clonadas La identificación y recuperación de secuencias de DNA clonadas especificas es una herramienta poderosa para analizar la estructura y la función de los genes. Las técnicas que se describen a continuación se utilizan para responder a preguntas experimentales de la organización y de la expresión de las secuencias clonadas.\nCartografía de restricción Un mapa de restricción es la recopilación del número, del orden y de la distancia entre los sitios de corte de enzimas de restricción en un segmento clonado de DNA. Las unidades de mapa se expresan en pares de bases (pb) o, para largas distancias, en pares de kilobases (kb). Los mapas de restricción proporcionan información que puede utilizarse para subclonar fragmentos de un gen, o bien para comparar la organización de un gen y de su cDNA con el fin de identificar los exones y los intrones en la copia genómica del gen. Los fragmentos generados tras cortar el DNA con enzimas de restricción pueden separarse mediante electroforesis en gel, método que separa los fragmentos por su tamaño, y en el que los fragmentos más pequeños se mueven más rápidamente. Los fragmentos aparecen como una serie de bandas que pueden visualizarse tiñendo el DNA con bromuro de etidio e iluminándolo con luz ultravioleta (siguiente figura). El tamaño de los fragmentos individuales puede determinarse corriendo un conjunto de fragmentos marcadores de tamaño conocido en otro carril del mismo gel.\nFigura. Gel de agarosa que contiene fragmentos separados de DNA, teñidos con un colorante (bromuro de etidio) y visualizados mediante iluminación ultravioleta.\nLa siguiente figura muestra los pasos que deben seguirse para construir el mapa de restricción de un segmento de DNA clonado que contiene sitios de corte para dos enzimas de restricción. Para construir el mapa, empecemos con una segmento de DNA clonado de 7 kb de longitud. Tres muestras del DNA clonado se digieren con enzimas de restricción: una con HindIII; otra con SalI; y la última con las dos\nenzimas nombradas. Los fragmentos generados por la digestión con las enzimas de restricción se separan por electroforesis. El tamaño de estos fragmentos se estima por comparación con un conjunto de patrones de tamaño separados electroforéticamente en carriles adyacentes del mismo gel. Para construir el mapa, se analizan los fragmentos generados con las enzimas de restricción.\n1. Cuando el DNA se corta con HindIII, se producen dos fragmentos, uno de 0,8 kb\ny otro de 6,2 kb, indicando que sólo hay un sitio de restricción para esta enzima (y que está localizado a 0,8 kb de uno de los extremos).\n2. Cuando el DNA se corta con SalI, se producen dos fragmentos, uno de 1,2 kb y\notro de 5,8 kb, lo que significa que hay un único sitio de restricción localizado a 1,2 kb de uno de los extremos. En conjunto, estos resultados muestran que hay un sitio de restricción para cada enzima, pero se desconoce la relación existente entre estos dos sitios. Con esta información, hay dos mapas posibles. En un modelo, el sitio HindIII está a 0,8 kb de uno de los extremos (modelo I), y el sitio SalI está a 1,2 kb del mismo extremo. En el modelo alternativo (modelo 2), el sitio HindIII está localizado a 0,8 kb de un extremo, y el sitio SalI está localizado a 1,2 kb del otro extremo. El modelo correcto puede determinarse si se consideran los resultados de la digestión de ambas enzimas, HindIII y SalI. El modelo 1 predice que la digestión con ambas enzimas generará tres fragmentos de 0,4, 0,8 y 6,2 kb; ambas enzimas generarán tres fragmentos de 0,8, 1,2 y 5 kb. El patrón real de fragmentos observado después de la digestión con ambas enzimas indica que el modelo correcto es el modelo 1 de la Figura. En la mayoría de los casos, la cartografía de restricción es más compleja e implica un mayor número de enzimas y un mayor número de sitios para cada enzima. Los mapas de restricción proporcionan una manera importante de caracterizar un segmento de DNA, y pueden construirse sin tener ninguna información de la capacidad codificadora ni de la función del DNA cartografiado. Junto con otras técnicas, el cartografiado de restricción puede utilizarse para definir los extremos de un gen, y proporciona una manera de diseccionar la organización molecular de un gen y de sus regiones flanqueantes. El cartografiado también puede servir de punto de partida para analizar un gen intacto de segmentos clonados de DNA, y proporciona una\nmanera de localizar sitios de mutación en los genes. Los mapas de restricción también pueden utilizarse para refinar los mapas génicos. En la mayoría de los casos, la exactitud de los mapas construidos por análisis genéticos se basa tanto en la frecuencia de recombinación entre marcadores genéticos como en el número de marcadores genéticos utilizados en la construcción del mapa. Si hay una gran distancia entre los marcadores y/o variación en la frecuencia de recombinación, el mapa genético puede no corresponder al mapa físico de esa región cromosómica. Por ejemplo, el genoma humano es grande (3,2 x 10 9 pb), y el número de genes cartografiados es pequeño (unos pocos millares), lo que significa que cada unidad del mapa está compuesta por millones de pares de bases de DNA. El resultado es una correlación baja entre los mapas genético y físico de los cromosomas. Los sitios de corte de las enzimas de restricción pueden utilizarse como marcadores genéticos, reduciendo así la distancia entre los distintos sitos del mapa, incrementando la fidelidad de los mapas, y proporcionando puntos de referencia para la correlación de los mapas genético y físico. Los sitos de restricción han desempeñado una función importante en la cartografía de genes en cromosomas humanos específicos y en regiones definidas de cromosomas concretos. Además, si un sitio de restricción está cerca de un gen mutante, puede utilizarse como marcador de diagnóstico. Estos sitios son conocidos como polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción o RFLP. Su utilización ha demostrado ser especialmente útil, ya que los genes mutantes que provocan muchas enfermedades genéticas humanas están muy poco caracterizados a nivel molecular, y los sitios de restricción cercanos se han utilizado con éxito en la detección de los individuos afectados y de los heterocigotas con riesgo de tener hijos afectados.\nFigura. Construcción de un mapa de restricción.\nTransferencia de Southern y Northern Los insertos de DNA clonados en vectores pueden utilizarse en experimentos de hibridación para caracterizar la identidad de genes específicos, para localizar regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias clonadas y para investigar la organización molecular de las secuencias genómicas. Edward Southern desarrolló la utilización de segmentos de DNA clonado, separados por electroforesis, transferidos a filtros, y rastreado con sondas.\nConocido como transferencia de Southern (Southern blot), este procedimiento tiene muchas aplicaciones. En la transferencia de Southern, el DNA clonado se corta en fragmentos con una o más enzimas de restricción, y estos fragmentos se separan por electroforesis en gel (Figura 20). El DNA se desnaturaliza dentro del gel en fragmentos de cadena sencilla, y éstos se transfieren a un filtro de un material, normalmente nitrocelulosa o un derivado de nylon, que une el DNA. La transferencia se hace colocando la hoja de la membrana encima del gel, y provocando que el tampón pase por el gel y por la hoja de nitrocelulosa o de nailon por capilaridad. El tampón pasa por el gel y por la membrana, arrastrando al DNA fuera del gel e inmovilizándolo en la membrana. En la práctica, esto se hace poniendo el gel con el DNA desnaturalizado sobre una gruesa esponja que actúa de mecha. La esponja está parcialmente sumergida en una cubeta con tampón. Se pone una membrana encima del gel, y se cubre con hojas de papel secante o absorbente y un peso. La acción capilar arrastra el tampón de la cubeta a través de la esponja, del gel, de la membrana, y del montón de papel secante. Al pasar el tampón por el gel, los fragmentos de DNA se transfieren a la membrana, a la que se unen. Después de la transferencia, el DNA de cadena sencilla se fija a la membrana calentándola a 80 ºC o exponiéndola a la luz ultravioleta para que se hagan uniones entre los fragmentos y la membrana. Entonces, los fragmentos de DNA del filtro se hibridan con una sonda. Sólo formarán híbridos los fragmentos de DNA de cadena sencilla presentes en la membrana que sean complementarios a la secuencia nucleotídica de la sonda. Se lava la sonda no unida, y se visualizan los fragmentos hibridados. Si se utiliza una sonda radioactiva, la posición de la sonda se determina por autorradiografía, utilizando película fotográfica. Además de para caracterizar DNA clonado, la transferencia de Southern se utiliza para muchos otros fines, como la cartografía de sitios de restricción en un gen o cerca de él, la identificación de fragmentos de DNA que contienen un gen determinado de entre una mezcla de muchos fragmentos, y la identificación de genes relacionados en diferentes especies. La transferencia de Southern también se utiliza para detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades genéticas humanas y cánceres.\nFigura. Transferencia de Southern.\nExiste una técnica de transferencia relacionada que puede utilizarse para determinar si un gen clonado es transcripcionalmente activo en un tipo celular o en un tejido dado. Esta técnica detecta la presencia de RNA que sea\ncomplementario al segmento de DNA clonado. Esto se lleva a cabo extrayendo RNA de uno o varios tipos celulares o tejidos. Se fracciona el RNA por electroforesis en gel, y el patrón de bandas se transfiere a una membrana que une el RNA como en la transferencia de Southern. El filtro se hibrida con una sonda de DNA de cadena sencilla, proveniente de DNA genómico clonado o de cDNA. Si hay RNA complementario a la sonda de DNA, éste se detectará por autorradiografía como una banda en la película fotográfica. Como el protocolo original que utiliza DNA unido a un filtro se conoce como transferencia de Southern, el protocolo que utiliza RNA unido al filtro se denominó transferencia Northern. La transferencia Northern proporciona información de la presencia de un transcripto de RNA complementario de un gen clonado en una célula o en un tejido determinado, y se utiliza para examinar patrones de expresión génica en tejidos embrionarios y adultos. La transferencia Northern también puede utilizarse para detectar cortes y empalmes alternativos del mRNA, y para detectar múltiples tipos de transcriptos provenientes de un solo gen. La transferencia Northern también proporciona otras informaciones de los mRNA transcriptos. Si se corre un RNA marcador en un carril adyacente, se puede calcular el tamaño del mRNA de un gen de interés. Además, la cantidad de RNA transcripto presente en una célula o en un tejido está relacionado con la densidad de la banda de RNA del film de autorradiografía. Se puede cuantificar la cantidad de RNA midiendo la densidad de la banda, lo que proporciona una medida relativa de la actividad transcripcional. De esta manera, la transferencia Northern puede utilizarse para caracterizar y cuantificar la actividad transcripcional de un gen determinado en distintas células, tejidos, u organismos.\nSecuenciación de DNA En cierto sentido, la caracterización definitiva de un segmento de DNA clonado es la determinación de su secuencia de nucleótidos. La capacidad de secuenciar DNA clonado ha permitido grandes avances en el conocimiento de la estructura génica y de los mecanismos de regulación. Aunque desde la década de los 40 hay técnicas que permiten determinar la composición de bases del DNA, fue en la década de los 60 cuando se desarrollaron los métodos para determinar la secuencia de los nucleótidos. En 1965, Robert Holley determinó la secuencia de una molécula de tRNA que contenía 74 nucleótidos. Se necesitó un año de esfuerzo para realizar este trabajo. En la\ndécada de los 70 se desarrollaron métodos más eficientes de secuenciación y, actualmente, en un laboratorio de biología molecular, es posible secuenciar más de mil bases en una semana. En un futuro cercano, con la automatización de este proceso, se podrán secuenciar miles de bases en un solo día. Un método de secuenciación de DNA diseñado por Alan Maxam y Walter Gilbert utiliza productos químicos para cortar el DNA. Este método se utilizó para determinar la secuencia de bases de los 4.362 nucleótidos del plásmido pBR322. El segundo método, que es el que generalmente se utiliza, lo desarrollaron Frederick Sanger y sus colaboradores. El método de Sanger se basa en la elongación 5’ – 3’ de las moléculas de DNA por la DNA polimerasa. Ambas estrategias generan un conjunto de moléculas de DNA de cadena sencilla de diferentes longitudes. Para determinar la secuencia de los nucleótidos en un segmento de DNA, ambos métodos utilizan una serie de cuatro reacciones, realizadas en tubos separados. Estas secuencias, cuya diferencia en tamaño es de un solo nucleótido, se separan por electroforesis en gel en cuatro carriles adyacentes. El resultado es una serie de bandas que forman un patrón parecido a una escalera. La secuencia puede leerse directamente del patrón de bandas de los cuatro carriles. Los secuenciadores automáticos de DNA utilizan colorantes fluorescentes en vez de sondas radioactivas. Se utilizan cuatro colorantes, produciendo un patrón de picos de colores que, al leerlos, proporcionan la secuencia de DNA. La secuenciación de DNA proporciona información de la organización de los genes y de los sucesos mutacionales que alteran a los genes y a los productos génicos, confirmando la conclusión de que los genes y las proteínas son moléculas colineares. La secuenciación también se ha utilizado para examinar la organización de las regiones reguladoras que flanquean los genes procarióticos y eucarióticos, y para deducir la secuencia de aminoácidos de las proteínas. El gen de la fibrosis quística (CF), una enfermedad genética humana autosómica recesiva, se identificó clonando y secuenciando el DNA de una región del brazo largo del cromosoma 7. Como no se conocía el producto proteico de este gen, se utilizó la secuencia de DNA para identificar una región codificadora. Se utilizó la secuencia de DNA de esta región para generar una probable secuencia de 1.480 aminoácidos. Esta secuencia se utilizó para buscar secuencias aminoacídicas de proteínas conocidas en las bases de datos, lo que permitió inferir que la proteína CF tiene características similares a las proteínas de membrana que desempeñan una función en el transporte de iones. Nuevos\nexperimentos confirmaron que el producto del locus de la fibrosis quística es una proteína de membrana que regula el transporte de iones cloro por la membrana plasmática. En la mayoría de casos de CF, el gen mutante tiene una secuencia de DNA alterada que causa la producción de una proteína defectuosa. Además de identificar los defectos del DNA que causan los fenotipos mutantes, la secuenciación de DNA también se utiliza para examinar la organización de un gen (el número de intrones y de exones, y sus límites), para proporcionar información de la naturaleza y de la función de las proteínas codificadas por los genes, como el tamaño, el número y tipo de dominios (región transmembrana, de unión al DNA) y de la relación con proteínas similares y con proteínas de otros organismos.\nFigura. La secuenciación del DNA se ha automatizado con la utilización de colorantes fluorescentes, uno para cada base; las bases se leen en orden de izquierda a derecha.\nReacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR) Las técnicas de DNA recombinante se desarrollaron a principios de la década de los 70, y en los años posteriores revolucionaron la manera en que los genetistas y los biólogos moleculares dirigían sus investigaciones. En 1986, se desarrolló una nueva técnica denominada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha ampliado enormemente el poder de la investigación del DNA recombinante. Incluso ha reemplazado algunos de los métodos anteriores. El análisis de PCR ha encontrado aplicaciones en una amplio abanico de disciplinas, entre las que se encuentran la biología molecular, la genética humana, la evolución e incluso la medicina forense.\nUno de los prerrequisitos para muchas técnicas de DNA recombinante es la disponibilidad de grandes cantidades de un segmento específico de DNA. Estos se obtenían a menudo después de un trabajo intensivo y tedioso de clonación y reclonación. La PCR permite la amplificación directa de segmentos de DNA específicos sin clonación, y puede utilizarse en fragmentos de DNA que estén presentes, inicialmente, en cantidades infinitesimalmente pequeñas. El método de PCR se basa en la amplificación de un segmento de DNA utilizando DNA polimerasa y cebadores, oligonucleótidos que hibridan con la cadena complementaria a la secuencia a amplificar. Hay tres pasos fundamentales en la reacción de PCR, y la cantidad de DNA amplificado producido sólo está limitado, en teoría, por el número de veces que se repiten estos pasos.\n1. El DNA que se requiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas. Este\nDNA no necesita estar ni purificado ni clonado, y puede provenir de distintas fuentes, incluyendo DNA genómico, muestras forenses como sangre seca o semen, muestras almacenadas en registros médicos, pelos, restos momificados, y fósiles. El DNA de doble cadena se desnaturaliza por calor (a unos 90º C) hasta que se disocia en cadenas sencillas, normalmente unos 5 minutos.\n2. Los cebadores hibridan al DNA de cadena sencilla. Estos cebadores son\noligonucleótidos sintéticos que hibridan con las secuencias flanqueantes del segmento a amplificar. Generalmente se utilizan dos cebadores diferentes. Cada uno de ellos tiene la secuencia complementaria a una de las dos cadenas del DNA. Los cebadores se alinean con sus extremos 3’ encarados ya que hibridan a cadenas opuestas, como se observa en la figura 22. La utilización de cebadores sintéticos significa que se debe tener alguna información de la secuencia de DNA a amplificar.\n3. A la mezcla de reacción se le añade una DNA polimerasa resistente al calor, la\npolimerasa Taq. La polimerasa extiende los cebadores en dirección 5’ – 3’, utilizando\ncomo molde al DNA cadena sencilla unido al cebador. El producto es una molécula de DNA de doble cadena con los cebadores incorporados en el producto final.\nCada grupo de tres pasos\ndenomina ciclo. Generalmente, cada paso\ndel ciclo se realiza a una temperatura diferente. El ciclo puede repetirse llevando a cabo otra vez todos los pasos. Empezando con una molécula de DNA, el primer ciclo produce dos moléculas de DNA, dos ciclos producen cuatro, tres ciclos producen ocho, etc. Veinticinco ciclos amplifican varios millones de veces el DNA en cuestión. El proceso es automático y se utiliza una máquina denominada termociclador, que puede programarse para realizar un número predeterminado de ciclos, produciendo grandes cantidades de segmentos de DNA amplificado en unas pocas horas. La PCR es ampliamente utilizada en laboratorios de investigación y tiene muchas aplicaciones en campos entre los que se incluyen las enfermedades infecciosas, la arqueología, el control de alimentos, la genética humana, la terapia del cáncer y la evolución molecular, entre otros. En aplicaciones clínicas, la PCR se utiliza para identificar los agentes infecciosos como el bacilo de la tuberculosis y otras bacterias, el HIV y otros virus. La PCR tiene la ventaja de ser rápida y menos laboriosa que las técnicas de clonación convencionales, y ha reemplazado a la utilización de sondas clonadas en campos como el diagnóstico prenatal. Aunque el desarrollo de la técnica de PCR representa un adelanto importante, también tiene sus limitaciones. Puesto que la PCR amplifica secuencias de DNA, incluso la más pequeña contaminación del material inicial con DNA de otras fuentes puede provocar dificultades. Células desprendidas de la piel de uno de los empleados del laboratorio mientras se realizaba la PCR pueden contaminar las muestras recogidas del escenario del crimen, dificultando la obtención de datos fiables. La PCR debe realizarse siempre con controles adecuados.\nESTRATEGIAS BÁSICAS PARA EL CLONADO MOLECULAR\nEl clonado de ADN basado en células se usa para amplificar ADN con el objeto de\npoder caracterizarlo físicamente y llevar a cabo estudios funcionales de los genes, de\ngrupos de genes o de otras secuencias de ADN de interés.\nFig. Esquema de clonado molecular en plásmido.\nLa figura de arriba sintetiza los distintos pasos a seguir en un experimento de clonado básico. Analiza el esquema y describe cada uno de ellos.\nHERRAMIENTAS BÁSICAS PARA EL CLONADO\n1. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN.\nLas endonucleasas de restricción reciben el nombre según la bacteria a partir de\nla cual se han aislado. A continuación, a modo de ejemplo, se muestra una tabla con\nlos sitios de reconocimiento y corte de varias enzimas de restricción tipo II.\n5’ -G-A-A-T-T-C- -C-T-T-A-A-G- 5’\n5’ -N-G-A-T-C-N- -N-C-T-A-G-N- 5’\n5’ -G-T-Py-Pu-A-C- -C-A-Pu-Py-T-G- 5’\n5’ -G-G-A-T-C-C- -C-C-T-A-G-G- 5’\n5’ -G-C-G-G-C-C-G-C- -C-G-C-C-G-G-C-G- 5’\na)¿ Qué son las endonucleasas de restricción?\nb) ¿Qué características poseen los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción?\nc) ¿Qué tipos de corte pueden producir y qué nombres reciben las terminaciones\nd) Además de ser útiles como “ tijeras moleculares” ¿qué otro uso se les da a las\nendonucleasas de restricción?\n2. VECTORES DE CLONADO\nExisten vectores naturales tales como plásmidos o bacteriófagos que han sido modificados artificialmente para poder ser utilizados en el clonado. Otros han sido\nconstruidos por el hombre como los cósmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs) y los cromosomas artificiales de mamíferos (MACs). Los vectores empleados más frecuentemente comparten las siguientes propiedades:\n1. Molécula pequeña, bien caracterizada.\n2. Origen de replicación en la molécula que permita su propia reproducción así como también la del fragmento insertado.\n3. Fácil recuperación de la molécula híbrida.\na) ¿Qué son los plásmidos y qué características naturales poseen?\nb) Los plásmidos naturales han sido modificados para hacerlos más adecuados como\nvectores de clonado. Observa la estructura del pBR322 y deduce qué condiciones debe reunir un plásmido para que sirva como vector.\nEcoR I Hind III\nSph I 562\nSal I 651\nBstZ I 939\nFig.2 Esquema del plásmido vector pBR322\nc) Volvamos nuevamente a la figura donde se muestra el clonado en plásmidos y\nsupone que el vector usado fue el pBR322. Las moléculas de pBR322 circular purificadas deben ser cortadas con una enzima de restricción para insertar un\nfragmento de ADN extraño ¿Qué enzima usarías y por qué?.\nd) ¿Con qué enzima cortarías el ADN fuente? ¿ Por qué?\ne) ¿Cómo ligarías los pBR322s con los fragmentos del ADN fuente? ¿Cómo evitarías\nque los plásmidos recircularicen sin incorporar un inserto?\nf) ¿Cómo se origina la molécula quimera cuando el ADN de interés es cortado con una\nenzima diferente a la empleada para cortar el plásmido?\ng) ¿Qué tamaño máximo de fragmentos puede ser clonado en plásmidos?\nh) ¿Cómo se introducen las moléculas recombinantes en las bacterias hospedadoras?\ni) ¿Cómo identificarías las colonias de bacterias que han incorporado los plásmidos con\nj)¿Qué es una biblioteca genómica o genoteca? ¿Cómo se construye?\ncomo ejemplo el Fago lambda\nRegión no esencial\nposición de algunos genes.\nMapa sintetizado del cromosoma lineal del bacteriófago lambda mostrando la\na) ¿Qué son los sitios cos?\nb) ¿Qué regiones del lambda pueden ser reemplazadas por ADN exógeno sin afectar\nsu capacidad de infectar bacterias?\nc) ¿Cuál es el tamaño máximo de fragmentos que pueden ser insertados en el fago\nlambda? ¿por qué?\nd) ¿Qué ventajas ofrece clonar usando como vector un bacteriófago en lugar de un\na) ¿Qué son los cósmidos?\nb) Analiza las ventajas del clonado en cósmidos en relación con el clonado en los dos\nEl objetivo primario del clonado de genes para aplicaciones biotecnológicas es la\nexpresión del gen clonado en el hospedador seleccionado. Pero, la inserción de un gen\nen un vector no necesariamente asegura que será expresado con éxito. La producción\nde una proteína a partir de un gen requiere que el mismo sea transcripto adecuadamente y que su mRNA sea traducido. En respuesta a esta necesidad se han creado varios vectores de expresión especializados como el que se muestra a continuación.\nFigura. Esquema del vector de expresión pKK233-2. Amp r = gen de resistencia a la amicilina.\nptac = promotor del operon lac. rbs = sitio de unión a los ribosomas . Noc I, Pst I y Hind\nIII = sitios de cortes para esas endonucleasas de restricción. T1 y T2 = secuencias\nterminadoras de la transcripción.Ori 0 origen de replicación. La flecha indica la\ndirección de la transcripción.\nEjercicio 6 Compara al pKK233-2 con el pBR322 ¿Qué similitudes y qué diferencias observas?\nTÉCNICAS DE RASTREO (SCREENING) POR HIBRIDACIÓN DEL ADN.\nUna vez construida la biblioteca genómica, se puede localizar dentro de ella un gen o bien algún segmento de ADN de interés. Se han diseñado numerosas técnicas de sondeo: Hibridización Southern, hibridización Northern, hibridización Western entre otras.\na) ¿Qué es una sonda, qué tipos de sondas existen y para qué sirven?\nb) Describe brevemente cada una de las técnicas de sondeo mencionadas arriba.\na) ¿A qué se denomina cADN o ADN copia y cómo se obtiene?\nb) ¿Cómo se construye una biblioteca de cADN?\nCLONADO POR PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)\nEl PCR es un procedimiento efectivo para obtener grandes cantidades de una secuencia específica de ADN in vitro. Se puede obtener una amplificación de hasta más de un millón de veces. Para que el PCR ocurra se necesita:\n• Dos cebadores o primers (repasar transcripción del ADN)\nregiones sobre cadenas opuestas del ADN a ambos lados de la secuencia a\n• Una ADN polimerasa termoestable que soporte temperaturas de 95 º C o más (Taq, ADN polimerasa de Thermus aquaticus).\n• Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato.\nEsta técnica consiste en alrededor de unos 30 ciclos de replicación del ADN. Cada ciclo contiene 3 etapas:\n1. Desnaturalización: 95º C\n2. Renaturalización: ~55º C\n3. Síntesis: ~75º C\nVentajas del clonado por PCR.\n• Rapidez: Una reacción típica de 30 ciclos de 3 a 5 min cada uno. El tiempo requerido para el clonado en células es de semanas o meses.\n• Sensibilidad de la reacción: Es posible amplificar secuencias a partir de diminutas cantidades de ADN, aún de una única célula.\n• No es necesario que el ADN esté muy purificado: Permite amplificar secuencias específicas de material en el que el ADN está muy degradado o embebido en un medio que hace problemático su aislamiento.\na) Esquematiza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) hasta el cuarto ciclo.\nGenética. Ed. McGraw Hill Interamericana. 5 ta edición.\nKLUG, W y M. CUMINGS. 1999. Conceptos de Genética. Ed. Prentice Hall. 5ta. ed.\nTAMARÍN, R. 1996. Principios de Genética. Edit. Reverté\nLa diversidad biológica actual ha sido dividida en tres dominios basado principalmente en la evidencia molecular, dado que los organismos que pertenecen a un dominio particular han ido evolucionando separadamente de los hallados en los otros dominios durante más de 1.000 millones de años; por esto constituyen las divisiones más profundas en la historia de la vida evolutiva hasta ahora conocida.\nLOS CARACTERES QUE DEFINEN A LOS TRES DOMINIOS SON:\nbacterias gram-positivas, bacterias verdes no-sulfurosas. Características: Células procarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente por diésteres de diacil-glicerol. El RNA ribosomal de la subunidad pequeña de los ribosomas (16S-rRNA) es del tipo eubacteriano, es decir, posee un bucle entre las posiciones 500-545.\nmetanobacterias, metanomicrobiales, halófilos extremos. Características: Células procarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente por diéteres de glicerol isoprenoides o tetraéteres de diglicerol. El RNA ribosomal de la subunidad pequeña de los ribosomas (I6S-rRNA) es del tipo arqueobacteriano, es decir, tiene una estructura única entre las posiciones 180-197 ó 405-498.\nDominio Eukarya Organismos: Animales, protozoos ciliados, protozoos flagelados, plantas, hongos, diplomonas, algas rojas, euglenoides, microsporidias. Características: Células eucarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente por diésteres de acil-glicerol. El RNA ribosomal de la subunidad pequeña de los ribosomas (18S-rRNA) es del tipo eucariota, es decir, posee una estructura única entre las posiciones 585-655.\nCuadro de los tres dominios\nNúcleo rodeado por membranas\nOrganelas rodadas por membrana\nEnlazado por éster no ramificado\nAlgunos son metanógenos\nAlgunos fijan nitrógeno\nAlgunos conducen una fotosíntesis basada en la clorofila\n(Purves, el al. 2003)\nFigura. La estructura filogenética más profunda de la diversidad biológica obtenida por Carl Woese a partir de la secuenciación de rRNA.\nFigura. La naturaleza jerárquica de la clasificación biológica consiste en la formación de grupos dentro de grupos. El mayor es el Dominio, en el cual se incluye al Reino (Curtis, 2000)\nLos tres dominios Archaebacteria , Bacteria y Eukarya, incluyen a los seis Reinos tal como se muestra:\nDominio Archebacteria: Reino Archaebacteria. Dominio Bacteria: Reino Bacteria (Eubacteria) Dominio Eukarya: Reinos: Protista, Fungi, Plantae, Animalia.\nLOS CARACTERES GENERALES QUE DEFINEN A CADA REINO, SON:\nSe caracterizan por la ausencia de peptidoglucano en las paredes celulares y la presencia de lípidos de composición distintiva en las membranas celulares que no se encuentra en ninguna otra bacteria. La mayoría vive en lugares calurosos y ácidos\nCélulas de vida libre; diferenciación celular incipiente en algunos grupos. Incluye a todas las bacterias.\nCélulas eucariotas. Flagelo de estructura 9+2 en algún momento de su ciclo de vida. La distinción entre unicelularidad y multicelularidad es irrelevante. Es un grupo definido por exclusión, es decir, no son animales, ni plantas, ni hongos ni procariotas. Contiene aproximadamente 27 phyla incluyendo a protozoos y algas como los organismos más comunes.\nCélulas eucariotas. Formación de esporas y ausencia de flagelos (amastigotas). Las esporas haploides germinan generando hifas que por un proceso de septación más o menos incompleto da lugar a la formación de células. El citoplasma puede fluir en mayor o menor grado a través de la hifa. Al conjunto de hifas se le llama micelio y constituye la estructura visible de la mayor parte de los hongos. Las hifas adyacentes pueden compartir núcleos por conjugación dando lugar a una célula heterocariótica cuyos núcleos se dividen por mitosis y originan una hifa dicariótica. En la reproducción sexual, ambos núcleos se fusionan y forman una célula cigótica diploide que se dividirá por meiosis y formará las nuevas esporas haploides.\nOrganismos multicelulares eucariotas desarrollados a partir de un embrión que no produce una blástula. Las células eucariotas de la mayor parte de las plantas poseen plástidos fotosintéticos, sin embargo, ésta no es una característica exclusiva ni general de las plantas. A diferencia de los animales -cuyas células son en su mayoría diploides- y fungi -cuyas células son haploides o dicarióticas- las plantas alternan de manera ordenada un estadio haploide o de gametofito -donde se producen gametas por mitosis- y otro diploide o de esporofito -donde se producen gametas por meiosis. En las plantas con flores, el esporofito domina el ciclo de vida y el gametofito, en lugar de producir una nueva planta independiente, se reduce a unas pocas células dentro de la flor del esporofito. Del mismo modo, en los helechos, el esporoflto es la forma que domina el ciclo de vida y el gametoflto, a pesar de tener una fase de vida libre, no es visible a simple vista.\nOrganismos multicelulares eucariotas desarrollados a partir de un embrión que pasa por un estadio de blástula. Aunque la multicelularidad ha surgido independientemente en todos los reinos, en los animales es característica ya que las células están unidas por complejas estructuras como los desmosomas uniones denominadas “gap" y septadas. A diferencia de las plantas, en los animales la meiosis es gamética, es decir, a la reducción cromosómica le sigue inmediatamente la formación de gametas sin posibilidad de originar individuos haploides como el gametofito.\nUbicar en las categorías taxonómicas especificadas (Dominio y Reino) a: Trifolium repens (alfalfa), Tripanosoma cruzi (agente causante de Mal de Chagas), Dipilidium caninum (gusano parásito de perros), Ascaris lumbricoides (gusano parásito de vertebrados), Amynthas hawayanus (lombriz de tierra), Azolla sp (planta flotante), Zea mays (maíz).\nCURTIS, H. y N. BARNES. 2000. Biología. Ed. Med. Panamericana. 6ta. Ed. PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia de la Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.\n¿Cómo iniciar el estudio de un animal?\nExisten distintos arquetipos que subyacen a la biodiversidad de formas animales con aspectos estructurales comunes que son compartidos por ellos. Los principales atributos que definen la arquitectura corporal (plan corporal) son: la multiceluridad, la simetría, el diseño del tubo digestivo, la cavidad corporal (celoma), el desarrollo embrionario y la metamería. A continuación se presenta un esquema de conceptos que muestra los mencionados atributos y la forma en que unos se relacionan con los otros. Para interpretarlo adecuadamente se aconseja utilizar el glosario que se presenta debajo.\nsegún la relación de las células que lo componen\nMetazoos (mesozoos y\nSegún la simetría y número de capas tisulares\nSegún la disposición del tubo digestivo\nEn saco ciego\nDe tubo en tubo\nSegún la presencia o ausencia de\nSegún el modo de formación del celoma\nSegún la metamería\n(Equinodermata *1 ,\n*1 Equinodermata: es considerado por su\nbilateralidad en estadíos larvales.\nMetazoos (mesozoos y parazoos): Animales multicelulares con capas celulares no homólogas a las de los blastodermos de los eumetazoos. Presentan un mayor nivel de organización que el que se encuentra en las colonias de protozoos, no obstante se considera que poseen un grado celular de organización, en el cual la organización celular es una agregación de células funcionalmente diferenciadas, con división de trabajo, pero con escasa tendencia a organizarse como tejido.\nEumetazoos: Animales multicelulares con una organización estructural, en la cual combinan sus células en unidades mayores, aquí una célula es una parte especializada del conjunto del organismo que es incapaz de vivir por sí sola. Existe un grado de organización celular-tisular, en el cual las células similares se agregan según patrones definidos, de lo cual surgen los tejidos.\nSimetría: Es el equilibrio de las proporciones, o correspondencia en tamaño y forma de las partes o estructuras situadas en lados opuestos de un plano (plano de simetría)\nSimetría radial: Cuando el organismo puede quedar dividido en mitades semejantes por más de dos planos que contengan un eje longitudinal (plano de simetría).\nSimetría bilateral: Cuando el organismo puede ser dividido en dos mitades especulares (derecha e izquierda) en un solo plano sagital.\nDiploblástico: disposición básica de tejidos embrionarios con dos capas tisulares, endodermo y ectodermo.\nTriploblástico: disposición básica de tejidos embrionarios con tres capas tisulares, endodermo, mesodermo y ectodermo.\nSistema digestivo en saco ciego: Existe una abertura que funciona como boca y ano que se abre a un saco ciego.\nSistema digestivo de tubo en tubo: Tubo unidireccional, con dos aberturas, boca y ano.\nCeloma: Cavidad llena de fluido que rodea al tubo digestivo, proporcionando un diseño del tipo “tubo dentro de un tubo”, lo que permite una flexibilidad mucho mayor de la cavidad interna. También supone la disponibilidad de espacio para los órganos viscerales y permite un mayor tamaño y complejidad al dejar mayor superficie expuesta para intercambios celulares. Funciona adicionalmente como un esqueleto hidrostático en ciertos casos, especialmente en muchos gusanos contribuyendo a actividades como traslación y excavación.\nAcelomado: No existe cavidad corporal alrededor del tubo digestivo. El espacio entre la epidermis (ectodérmica) y el tubo digestivo (Endodérmico) está completamente ocupado por una masa esponjosa de células denominada parénquima (mesodermo).\nPseudocelomado: Existe una cavidad corporal alrededor del tubo digestivo limitada por blastocele persistente que deriva del blastocele embrionario, por ello se denomina a esta cavidad pseudoceloma o pseudocele.\nCelomado: Hay una verdadera cavidad desarrollada dentro del mesodermo tapizada por peritoneo mesodérmico.\nMetamería (segmentación): la repetición seriada de unidades corporales a lo largo del eje longitudinal de un organismo. Cada una de esas unidades se denomina segmento o metámero. Esta disposición afecta a estructuras externas e internas de varios sistemas.\nLa segmentación del cuerpo (metamería) se llama verdadera o mesodérmica, cuando existen tabiques internos que separan las secciones sucesivas del animal. Se opone a la llamada segmentación superficial o aparente, que se observa en algunos gusanos – Acantocéfalos, aschelmintos – y dónde sólo la cutícula o la pared corporal, incluso la musculatura, presenta las divisiones sucesivas a lo largo del eje longitudinal, pero faltan los tabiques y no hay repetición de órganos internos. También se observa el pseudomatamerismo – Platelmintos, Nenertinos – cuando en el cuerpo existe una tendencia a la repetición de las partes y de los órganos (por ejemplo, las gónadas), sin que estos sean separados por tabiques. (Novikoff, M. M. 1976.)\nSe conoce como Metámero cada uno de los segmentos que se repiten en ciertos grupos de animales, celomados de simetría bilateral (Bilateria). La metamerización es una de las principales modificaciones del celoma. Cada metámero tienen cavidades celómicas separadas de las de otros metámeros por tabiques, y las estructuras internas (ganglios nerviosos, nefridios, gónadas, etc.) y externas (patas, branquias, etc.) están repetidas en cada metámero.\nMetamería Homómera: Los segmentos son semejantes entre sí.\nMetamería Heterónoma: Los segmentos se fusionan entre sí en grupos funcionales llamados tagmas para funciones especiales.\nEsquizocelomado: El celoma surge de la división de bandas mesodérmicas originadas a partir de células de la región del blastoporo (abertura al exterior del tubo digestivo primitivo) , las cuales proliferan y se ahuecan para formar la cavidad celómica.\nEnterocelomado: El celoma se origina por invaginaciones del tubo digestivo primitivo que se independiza de éste y aumentan de tamaño para formar la cavidad celómica.\nDeuterostomado: El blastoporo origina el ano, en tanto que la boca se forma secundariamente.\nTagmosis: metamerización heterónoma en tagmas que presentan los Arthropodos para funciones especializadas. La asociación de tagmas y la presencia de apéndices especializados permite la distinción exomorfológica entre las Clases de Artrópodos, estas características se muestran en el siguiente cuadro.\n* Considerando los conceptos expuestos, realizar un cuadro comparativo entre los Phyla más conocidos. * Elige al menos dos animales mencionados en el ejercicio 1 y descríbelos considerando todos los aspectos mencionados en este apartado.\n* Busca un dibujo de pata birrámea y unirrámea, identifica sus partes y explica a qué se debe el nombre e hipotetiza cuál será la importancia adaptativa de cada tipo.\n* Completa el cuadro dado arriba mencionando dos ejemplos de cada una de las Clases.\nBARNES, R. D. 1989. Zoología de los Invertebrados. Ed. Mc Graw Hill Interamericana 5ta. ed. CURTIS, H. y S. BARNES 2000. Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. HICKMAN, C., L. ROBERTS y A. PARSON. 2002. Principios integrales de Zoología. Ed. Mc Graw Hill Interamericana 11ma. ed. PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia de la Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. SOLOMON, E. P; L. R. BERG y D. W. MARTIN, 1999. Biología. Ed. Mc Graw Hill Interamericana 5ta. ed.\nEl estudio de los vegetales, como cualquier ser vivo, implica abordarlo desde diferentes perspectivas, entre ellas su morfología externa.\nNo siempre el cuerpo de las plantas superiores sigue, el modelo estructural básico (raíz, tallo y hoja). Además de la variabilidad en el aspecto externo, que es causada por diferentes modos de ramificación y simetría, la multitud de formas de los órganos vegetativos aumenta por modificaciones morfológicas. Estas modificaciones o adaptaciones están generalmente relacionadas con el ambiente en el que se desarrolla la planta, algunas son la acumulación de reservas y la existencia de mecanismos de multiplicación vegetativa. Este texto hace referencia a las adaptaciones del cormo no relacionadas y relacionadas con la acumulación de reservas.\nA- Adaptaciones independientes de la acumulación de reservas\n1- Hoja a- Espinas foliares: son modificaciones agudas, muy ricas en tejidos de sostén y como consecuencia, rígidas; pueden ser ramificadas o sencillas. Este tipo de adaptación está difundida en vegetales típicos de zonas áridas, pero aparece también, como defensa contra herbívoros, en algunos vegetales no xeromorfos de otras regiones climáticas y en ciertas plantas trepadoras. Las espinas foliares se producen por transformación de hojas o de partes de éstas (fig. 1). En Berberis sp, por ejemplo, son parte de la lámina foliar, que además presenta estípulas modificadas. Éstas se desarrollan también en Acacia, Robinia y Prosopis (algarrobo).\nFigura 1: Estípulas transformadas en espinas de Robinia pseudoacia.\nb- Zarcillos foliares: son órganos filamentosos, simples o ramificados, haptotrópicos que la planta utiliza exclusivamente para trepar. Tienen origen por transformación del limbo foliar o de otra parte de la hoja. Ejemplos: zapallo (Cucurbita pepo) los zarcillos foliares resultan de hojas reducidas a la nervadura media, arveja (Pisum sativum) los últimos folíolos de la hoja pueden transformarse en zarcillos ramificados (fig. 2); en Lathyrus aphaca (Leguminosa) el limbo se ha transformado en un zarcillo simple y su función originaria, es decir, la asimilación de C 2 O, es desempeñada por dos grandes estípulas.\nFigura 2: Zarcillos foliares en una hoja pinnada de Pisum sativum; con desarrollo de una rama lateral florífera.\nc- Filodios: se le da este nombre a un pecíolo dilatado y lámina que sustituye a la lámina de la hoja, por lo general totalmente abortada. Se presenta en algunas especies de género Acacia (fig. 3).\nFigura 3: Filodios de Acacia heterophylla; transiciones de las hojas pinnadas (abajo) a los filodios (arriba).\na- Espinas caulinares: aparecen como toda rama lateral en la axila de las hojas. Pueden ser simples o ramificadas, generalmente presentan una foliación reducida, aunque en algunos casos producen hojas normales con yemas en las axilas. Ejemplo: Crataegus (fig. 4) y Prunus spinosa.\nFigura 4: Espina de Crataegus sp.\nb- Zarcillos caulinares: son semejantes en forma y función a los zarcillos foliares, difieren en su origen. Se originan de una yema axilar, del mismo modo que las ramas laterales normales.\nFigura 5: Zarcillo caulinar de Passiflora sp.\nc- Braquiblastos: en las plantas superiores la intensidad de crecimiento de las ramas laterales puede ser muy variada; en unos casos se desarrollan ramas con entrenudos largos, son los macroblastos, y otras dan lugar a braquiblastos, ramas cortas y con aspecto de roseta (fig. 6).\nLos braquiblastos tienen, con frecuencia, una vida limitada, suelen ser simples o escasamente ramificados. En algunas plantas leñosas las hojas normales, al menos en estado adulto, se forman únicamente en los braquiblastos por Ejemplo: Prunus cerasus (guindo), Malus y Ginkgo.\nFigura 6: Macro y braquiblastos de Pinus sp\nd- Cladodios y Filóclados. Cladodios: son ramas de forma comprimida o hasta laminar,\ngeneralmente con hojas rudimentarias, color verde, en la que se realiza, por lo tanto la función fotosintética.\nA pesar de su semejanza con los nomófilos, con quienes coinciden funcionalmente,\ndifieren de ellos por el origen y por tener crecimiento ilimitado. Es frecuente su desarrollo en\nplantas de lugares secos, por ejemplo Cactáceas, en las que además se acumula agua (figs. 7 a y b).\nFigura 7: Opuntia sp tallos aplanados con ramas laterales (aréolas), las hojas de dichas ramas se han transformado en espinas. Derivación de una forma suculenta (a la derecha) a partir de una forma cactácea con hojas (a la izquierda)\nSi las ramas laminares fotosintetizantes son braquiblastos y presentan por ello aspecto\nmuy semejante al de las hojas, reciben el nombre de filóclados. Ejemplo :Ruscus sp (fig. 8).\nFigura 8: Rama de Ruscus aculeatus mostrando filóclados con aspecto de hoja, sobre las que aparecen las flores.\ne- Estolones: ramas laterales, más o menos delgadas, a menudo muy largas que nacen de las base de algunos tallos. Los estolones pueden desarrollarse arrastrándose por la superficie de la tierra y constituyen estolones epígeos, por ejemplo el fresal (fig. 9); o bien pueden hacerlo por debajo del suelo formando estolones subterráneos, por ejemplo la menta.\nFigura 9: Formación de un estolón de fresa (Fragaria sp).\n(Acanthorrhiza) producen espinas radicales en la base del tallo, originadas por transformaciones de las raíces adventicias.\nb- Raíces contráctiles: son raíces embrionarias o adventicias encargadas de enterrar más profundamente la planta o de favorecer su dispersión. Cumplen su función por medio de contracciones que se observan como estrías en la superficie.\nSe desarrollan preferentemente en las especies con tubérculos, bulbos o rizomas (fig.10).\nFigura 10: Raíces contráctiles de Arum maculatum. Hundimiento progresivo del tubérculo por contracción de la raíz:\nI germinación, II principio del segundo año, III finales de dicho año, IV planta adulta, tubérculo a 10 cm por debajo\nB- Adaptaciones relacionadas con la acumulación de reservas\nBulbos: brote subterráneo con los catáfilos o las bases foliares convertidos en órganos reservantes. En un bulbo de cebolla (Allium cepa) en corte longitudinal se distingue el tallo en forma de disco con entrenudos breves, en su extremo se ubica la yema terminal de donde brota el vástago epígeo con la inflorescencia. Las hojas cercanas al ápice tienen vaina engrosada y lámina fotosintetizante normal. Las ubicadas en la parte media han perdido la lámina, y se reducen a la vaina gruesa. Las más externas son muy delgadas, y constituyen las vainas foliares de hojas viejas que han muerto después de la reabsorción de sus sustancias de reserva. En otros casos, el bulbo está constituido por catáfilos escamosos y reservantes que se disponen de manera imbricada, a este tipo se lo llama escamoso, por ejemplo la azucena.\nEn las plantas con bulbo, éste permanece latente en la estación desfavorable; al finalizar\neste período se reactiva la yema, produciendo hojas y flores a expensas de las reservas almacenadas en él.\nEn las axilas de las hojas se producen yemas, cuyas hojas también acumulan reservas en\nla base formando nuevos bulbos; éstos al independizarse y formar raíces adventicias contribuyen\na la multiplicación vegetativa de la planta.\na- Rizoma: tallo subterráneo reservante, con crecimiento horizontal; como vive fuera de la zona de la luz, carece de nomófilos u hojas propiamente dichas capaces de asimilar o transpirar; en su lugar hay catáfilos, la mayoría de las veces en forma de escamas membranosas. Posee yemas y produce vástagos folíferos y floríferos; también raíces adventicias. Podría confundirse con una raíz, difiere de ella por sus catáfilos y yemas, por no tener caliptra y principalmente por su anatomía. Durante el período del año desfavorable a la vegetación, en los países con inviernos fríos\no con estaciones excesivamente secas, el rizoma defiende a la planta contra los rigores del ambiente.\nFigura 11: Rizoma: a, yema que dará el brote epígeo el año siguiente; b, c, d y e, cicatrices de los brotes de los años anteriores.\nFigura 12: Esquema de una planta rizomatosa; a, b, c las ramas floríferas que se han formado como ramas laterales, en tres años consecutivos, el eje principal continua el crecimiento monopódico.\nb- Tubérculos caulinares: son tallos subterráneos, engrosados en mayor o menor grado y con función de reserva. Al igual que los rizomas, presentan escamas catafílicas membranosas fugaces, o sus cicatrices. Se distinguen de dichos rizomas por su considerable grosor y por su crecimiento limitado. El ejemplo mejor conocido es el de la papa (Solanum tuberosum). Los tubérculos de la papa se originan en el extremo de ramas laterales subterráneas plagiótropas (estolones), éstas nacen en las axilas de las hojas inferiores del tallo. Se produce el engrosamiento de los entrenudos terminales, se almacenan sustancias de reserva y estos tubérculos nuevos viven para multiplicar la planta madre. Las oquedades que se advierten distribuidas de un modo regular en todos los tubérculos, alojan yemas axilares (ojos). La planta madre muere luego de haber producido el desarrollo de los tubérculos. Los tubérculos caulinares pueden originarse también por fuerte engrosamiento primario o secundario del hipocótilo. Tubérculos puramente hipocotíleos se desarrollan, por ejemplo en algunas plantas bienales como el rabanito (Raphanus sativus var. sativus) o la remolacha roja (Beta vulgaris var. conditiva); en el caso de la remolacha forrajera algo de las reservas se acumulan en la raíz (fig. 13). Un típico tubérculo caulinar, formado exclusivamente por segmentos elevados, foliosos, del tallo, es el del calinabo (Brassica oleracia var. gongyloides). Tanto el rabanito como la remolacha emplean las reservas acumuladas para la producción de flores y semillas.\nFigura 13: Beta spp, remolacha, a: azucarera, b: forrajera, c: roja\na- Tubérculos radicales: los producen algunas plantas herbáceas bianuales y perennes. Con frecuencia se asemejan a los tubérculos caulinares, pero se diferencian de ellos por la falta de hojas y yemas axilares y por su estructura anatómica. Se desarrolla por transformación de raíces adventicias que detienen su crecimiento en longitud y no desarrollan raíces laterales. Todos los tubérculos radicales realizan la función de almacenamiento en el parénquima cortical, que está muy engrosado a consecuencia de procesos de crecimiento primario. Ejemplos: dalia (Dahlia sp) (fig. 14) y batata (Ipomea batata).\nFigura 14: Tubérculos radicales de una dalia.\nb- Raíces napiformes: son raíces principales engrosadas total o al menos parcialmente; se\nencuentran en las Dicotiledóneas alorrizas. Como la mayoría de las veces, intervienen también\npartes variables del hipocótilo y epicótilo, estos órganos resultan morfológicamente\nheterogéneos, y a pesar de su semejanza externa, pueden presentar considerables diferencias en\nla estructura anatómica.\nEjemplo de ello es la zanahoria (Daucus carota) y la remolacha azucarera, donde además\nde la raíz, el hipocótilo participa e la acumulación de reservas.\nHábito de crecimiento de los órganos de un vegetal. Que se produce sobre la\nsuperficie de la tierra ya sea de porte aéreo o rastrero.\nEstípulas: Estructuras membranosas o foliosas que se suelen desarrollar en la base de las\nhojas ubicándose a ambos lados del peciolo.\nHaptotrópico: perteneciente o relativo al haptotropismo.\nHaptotropismo: conjunto de fenómenos relativos a los movimientos de orientación que\nrealizan determinados órganos vegetales estimulados por el contacto unilateral.\nHipocótilo: Primer entrenudo, ubicado entre el cuello de la raíz y el nudo cotiledonar. Su\ngrado de desarrollo varia con las especies.\nImbricada: Superpuesta de manera escalonada llegando a cubrirse los bordes laterales Limbo foliar= Lámina foliar\nMonopólico: Sistema de ramificación de las plantas superiores, cuyas ramas se originan\nporque la yema terminal de los tallo y ramas es\na partir de yemas axilares, y que se caracteriza\nde larga duración. Las ramas más viejas (más largas) están más alejadas de estas yemas terminales. Nomófilo: Hoja normal cuya función principal es fotosíntesis y regulación de la transpiración. Plagiótropa/po: la planta o el órgano que, como consecuencia de la acción unilateral de un estímulo, se coloca en posición oblicua o transversal con respecto a la dirección del mismo. En un pino, cedro o abeto, el tronco es ortótropo pero las ramas son plagiótropas. Ortotrópo: en los fenómenos trópicos, la planta o el órgano que, como consecuencia de la acción de un estímulo unilateral, se orientan en la misma dirección del estímulo. En el geotropismo, por Ejemplo: la raíz y el tallo de la mayoría de las plantas son órganos ortótropos, porque la dirección de la vertical del punto en que crece. Simpódico Sistema de ramificación de las plantas superiores , cuyas ramas se originan a partir de yemas axilares, y que se caracteriza porque la yema terminal de los tallo y ramas es de vida corta transformandose tempranamente en flor. Xeromorfo: aplícase a los vegetales que por su morfología externa o por su estructura están adaptados a la sequedad; como los xerófitos.\nAnaliza la exomorfología de los siguientes vegetales, para cada uno, nombra los órganos\nmarcados con flechas. Menciona el órgano modificado, nombre de la modificación y su función.\nAllium cepa L. (cebolla) en corte longitudinal\nSorghum halepensis L. Pers. (sorgo de halepo)\nFlor e inflorescencias en Gramíneas\nLas Gramíneas= Poaceas son una de las familias dentro de las Liliopsidas= Monocotiledóneas más importante dentro del Reino Plantae. Cobran esta importancia ya que incluyen una gran cantidad de géneros de gran valor e importancia económica, como los pastos que constituyen la base de la alimentación del ganado (Bromus, Poa, Panicum, Eragrostis, etc.) y los cereales que alimentan a la humanidad (Zea, Oryza Triticum, Avena, etc), además hay plantas sacaríferas, como la caña de azúcar (Saccharum), industriales (Arundo, Saccharum, etc), ornamentales (Lolium, Cynodon) oleaginosas, medicinales, aromáticas etc. Si analizamos la exomorfología y la anatomía del cuerpo de las plantas de las diferentes especies que están incluidas en esta familia nos encontraremos que en general todas responden a un plan básico de organización con características comunes, (con excepciones), que nos permiten identificarlas, aunque no podemos desconocer que en ellas existe una prodigiosa diversidad de delicadas e interesantes estructuras. Es así como el análisis de raíces, tallos, hojas, flores y frutos, entre otros, nos pueden indicar la pertenencia de un vegetal a esta familia. Este texto trata sobre el estudio de la flor e inflorescencias. Para poder arribar a su estudio se deben recordar algunos conceptos básicos.\n¿Qué se entiende por inflorescencia?\nSon inflorescencias aquellos sistemas de ramas que están destinados a la formación de flores y se hallan metamorfoseados (modificados) en relación a su especialización.\n¿Qué Elementos constituyen una inflorescencia?\nUna inflorescencia consta de: un eje principal, el raquis con hipsófilos llamados brácteas. En la axila de cada bráctea nacen flores sostenidas o no por un pedicelo, o bien ramificaciones con flores que constituyen inflorescencias parciales. Toda la inflorescencia está sostenida por un pedúndulo.\n¿Cómo se clasifican las inflorescencias?\nA- Inflorescencias simples y complejas\nEn las inflorescencias simples cada rama lateral del eje principal forma una sola flor.\nEn las inflorescencias complejas, el eje principal produce inflorescencias parciales provistas de un mayor o menor número de flores.\nB- Inflorescencias cerradas y abiertas\nEn las inflorescencias cerradas tanto el eje principal, como el de las inflorescencias\nparciales acaban en flores terminales. Estas flores se reconocen claramente porque se abren antes\nque las flores laterales inmediatas.\nEn las inflorescencias abiertas, en cambio, el eje principal y sus ramas laterales de primer orden detienen su crecimiento después de un cierto tiempo, pero no concluyen en una flor terminal; en otras palabras quedan teóricamente abiertos.\nC- Inflorescencias racemosas y cimosas\nLas inflorescencias racemosas son abiertas, y las cimosas son cerradas.\nflor e Inflorescencia de gramineas\nPrevio al análisis de las inflorescencias, identificaremos como está constituida la flor. En las Gramíneas la flor puede considerarse como una forma extremadamente reducida del tipo\nbásico de una Monocotiledónea adaptada a la anemofilia (fig. 1).\nFigura 1: Flor de Gramínea.\nConsta de los verticilos fértiles y de un perianto rudimentario, las glumélulas. En general\nson perfectas, (es decir presentan androceo y gineceo), en el arroz por ejemplo tienen androceo\ncon seis estambres y un gineceo, pero en diversos géneros son imperfectas, (es decir que\npresentan un androceo o un gineceo), en el maíz por ejemplo en la misma planta se encuentran\nflores estaminadas y carpeladas.\nEl perianto está constituido por las lodículas o glumélulas. Son dos pequeñas\nformaciones, membranosas dispuestas a los lados del ovario.\nCada flor está protegida por un par de glumelas (brácteas estériles) que constituyen la\ncasilla o Antecio floral.\nSalvo muy raras excepciones, las inflorescencias de las Gramíneas son compuestas. La inflorescencia parcial o elemental es la espiguilla y las totales son panojas o espigas de espiguillas. Espiguilla o Espícula (= espiguita, fig. 2)\nFigura 2: Espiguilla (inflorescencia elemental).\nLa espiguilla representa la inflorescencia parcial o elemental de las Gramíneas (fig. 2);\nconsta de un pequeño eje, la raquilla, de longitud variable, que soporta las flores. La totalidad de\nla espiguilla está protegida por dos brácteas estériles denominadas glumas, cada flor de la\nespiguilla se encuentra protegida por las glumelas.\nEl número de flores de cada espiguilla es variable según los diversos grupos; se\n• Espiguillas plurifloras: poseen dos o más flores (Avena, Bromus).\n• Espiguillas unifloras: constan de una sola flor ( arroz, maíz);.\nA- Panoja: cada espiguilla está sostenida por un pedicelo de longitud variable, originando varias\nformas diferentes (fig 3).\nFigura 3: Panoja laxa (A) y densa (B).\n• Panoja laxa: las ramas y pedicelos son alargados y las espiguillas un tanto separadas\nentre sí (ej. Avena byzantina, Poa annua, oriza sativa).\n• Panoja densa: las ramificaciones y pedicelos son cortos y las espiguillas están\napretadas junto al raquis principal (ej. Phleum, Alopecurus).\nB- Espiga compuesta: las espiguillas están sostenidas sobre el raquis o sostenidas por un brevísismo pedicelo (fig 4). Existen tres tipos:\n• Espigas unilaterales: las espiguillas están dispuestas en dos o más rangos hacia un\nsolo lado del raquis. Es posible distinguir las que tienen raquis articulado y las que\ntienen raquis continuo y tenaz (ej. Cloris).\n• Espigas dísticas: las espiguillas están ordenadas en dos series opuestas y alternas a lo\nlargo del raquis articulado (ej. Triticum).\n• Espigas cilíndricas: las espiguillas se disponen en varios rangos sobre el raquis,\ngeneralmente ensanchado (ej. Zea).\nFigura 4: Espiga unilateral (A), dísticas (B y C) y cilíndrica (D).\nEjercicio (pregunta extraída del cuadernillo de entrenamientos correspondiente a la XII OAB)\nLa diversidad de disposición de las flores sobre las ramas de las plantas o la extremidad del tallo (inflorescencia) es enorme. Los esquemas de abajo representan algunas de ellas. Señala si las mismas son inflorescencias simples o complejas y busca un ejemplo para cada una.\nPURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia de la Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. STRARBURGER, E.; F. NOLL; H. SCHENCK y A. SCHIMPER. 1994. Tratado de Botánica. Ed. Omega. 8va. ed.\nTópico: Etología, Ecología y Evolución\nUna teoría taxonómica establece los principios que rigen el recocimiento y la jerarquización de grupos taxonómicos. Actualmente hay dos corrientes más populares, la taxonomía evolutiva tradicional y la sistemática filogenética (cladismo), ambas difieren en el modo de utilización de los principios evolutivos. La relación entre los grupos taxonómicos puede ser de tres formas:\nmonofiletismo, parafiletismo y polifiletismo. En el primer caso un grupo monofilético (A) contiene al antecesor común más reciente de todos los miembros del grupo y a sus descendientes. Un grupo parafilético (B) contiene al antecesor común más reciente pero no a los descendientes. Y un grupo polifilético (C) no contiene al antecesor común más reciente, lo que implica más de un origen filogenético del grupo.\nSistemática filogenética cladística\nLos sistemáticos usan el llamado método cladístico para encontrar relaciones evolutivas. Los organismos son descriptos primero en términos de caracteres específicos, un carácter ancestral, es aquel que se encuentra presente en el antecesor común, en tanto que las formas del carácter que evolucionaron más tarde son los estados derivados. La presencia de los mismos en las especies indica que\npueden existir relaciones entre ellas; sin embargo las similitudes compartidas podrían ser el resultado de una evolución convergente y llevar a conclusiones erróneas al intentar reconstruir las relaciones evolutivas del grupo estudiado. Sólo las similitudes que son debidas a una descendencia común pueden ser verdaderos indicadores de relaciones, porque podrían ser el resultado de descender de un ancestro, pero por sí solas no dicen nada sobre los patrones de ramificación evolutiva a partir de este ancestro. Para distinguir los caracteres primitivos de los que han evolucionado recientemente, el análisis cladista usa el concepto de comparación de grupos externos. Un grupo externo es aquel conjunto de organismos que se encuentra relacionado al estudiado, pero no incluido en el mismo. Con esto se puede deducir que cualquier estado de un carácter que se encuentre tanto en el grupo en estudio como en el externo, es un carácter ancestral en tanto que los estados del carácter que no aparezcan en el grupo externo serán derivados. Los organismos que comparten estados derivados de un carácter constituyen subconjuntos internos del grupo denominados clados (klados= rama). Así un carácter derivado, compartido por los miembros del clado es una sinapomorfía, en tanto que si es sólo de uno de estos miembros se denomina autopomorfía. De la asociación jerárquica de clados, en la cual algunos quedarán incluidos en otros surgen esquemas ramificados denominados cladogramas. El mejor cladograma es aquel en el cual el patrón de ramas refleja más claramente la distribución de caracteres entre los organismos y el menor número de cambios independientes.\n- cuatro patas, huevo amniota\n- vértebras, mandíbulas\npelo, glándulas mamarias\nFigura: Se presenta un cladograma en el cual, el anfioxo es el grupo externo, y el grupo en estudio comprende cuatro vertebrados (carpa, lagarto, caballo y mono). Para generar este cladograma se han utilizado cuatro caracteres que varían entre los vertebrados: la presencia o ausencia de cuatro extremidades, huevos amnióticos, pelo y glándulas mamarias. Para todos estos caracteres, la ausencia es el estado ancestral porque es la condición que aparece en el grupo externo (anfioxo); por lo tanto la presencia es el estado derivado. La posesión de cuatro extremidades y de huevos amniotas permiten que el lagarto, el caballo y el mono (recuadro) formen un clado “pariente” de la carpa. Este clado se subdivide posteriormente por la presencia de pelo y de glándulas mamarias, que reúnen al caballo y mono (óvalo) frente al lagarto. Por comparación con animales más alejados se conoce que la presencia de vértebras y mandíbulas constituyen sinapomorfías de los vertebrados; así el anfioxo que carece de tales caracteres queda fuera del clado de los vertebrados (recuadro punteado) y puede ser usado como grupo externo. (Hickman et al, 2002)\n* Analizando el cladograma descripto anteriormente, identificar las sinapomorfías correspondientes a cada clado.\n* ¿Cuántos clados hay en el ejemplo?\n* Mencionar alguna autopomorfía para el grupo de mono y de caballo.\n* ¿La carpa, lagarto, mono y caballo formarán un grupo mono, para ó polifilético? Justificar la respuesta.\nLa ecología del comportamiento se ocupa de analizar cómo los animales toman “decisiones “ que influyen sobre su supervivencia y su éxito reproductivo. Los animales deciden dónde llevar adelante sus actividades y cómo seleccionar los recursos que necesitan (alimento, agua, protección, sitios de nidificación). Los animales también responden a los predadores y competidores y deciden cómo interactuar con otros miembros de su propia especie. Las elecciones individuales son fundacionales de gran parte de la ecología porque los cambios en densidades y distribuciones de las poblaciones son el resultado acumulativo de las decisiones de innumerable individuos. Es decir que a lo largo de muchas generaciones la selección natural ha moldeado el comportamiento de manera acorde con los costos y beneficios. El costo del comportamiento posee tres componentes. El energético, que resulta de la diferencia entre la energía que el animal hubiera invertido en descanso y la invertida en realizar este comportamiento. El costo del riesgo, que corresponde al incremento en la probabilidad de ser dañado o muerto por haber ese comportamiento, comparado con el descanso. Y el costo de oportunidad de un comportamiento es la suma de los beneficios que el animal pierde por no haber realizado otros comportamiento durante el mismo intervalo de tiempo. Estos costos miden la eficacia involucrada en realizar comportamientos diferentes durante cantidades de tiempo diferentes. Un ejemplo del estudio de estos costos es el que sigue: Se observó que durante la estación reproductiva (abril- marzo), los machos de una lagartija mantienen territorios de los cuales excluyen a los machos de la misma especie. Se evaluó el costo de este\ncomportamiento estimulando el comportamiento territorial tres meses antes de la estación reproductiva (enero-febrero), cuando este comportamiento es poco visible. Para lograrlo insertaron pequeñas cápsulas que contenían testosterona debajo de la piel. Los machos control también fueron capturados y liberados sin recibir el implante. Al observarlos se detectó que los machos implantados patrullaban más sus territorios, realizando más despliegues de amenazas que los control, quienes ocupaban más tiempo en alimentarse. Por lo tanto los primeros que capturaban menos insectos, acumulaban menos energía y murieron en mayor número en los meses siguientes. Esto demostró que quienes presentan un comportamiento territorial en el verano mueren en mayor porcentaje que quienes no lo presentan y que este comportamiento aparece cuando la hembra es receptiva para lograr el mayor éxito reproductivo, siendo este beneficio mayor que los costos que demanda este comportamiento. (Purves et al,\n* Analizando el ejemplo antes expuesto, indicar, en qué parte del párrafo se refleja el costo energético, el costo de oportunidad y el costo de riesgo considerados en el comportamiento territorial.\nCorrelación temporal del comportamiento: Ritmos biológicos\nEntre las causas próximas del comportamiento están aquellos que determinan su organización a través del tiempo. Los estudios sobre esta correlación temporal permitieron descubrir los mecanismos encefálicos y hasta el nivel molecular que permiten a los animales organizar su comportamiento en el tiempo. Dentro de los ritmos biológicos se conocen a los diarios, mensuales y anuales. En muchos animales, incluyendo al hombre los períodos de actividad y sueño, alimentación e ingestión de agua, fluctuación de la temperatura corporal y secreción de algunas hormonas tienen ciclos que parecen seguir un ritmo interno. Estas actividades rítmicas diarias son ritmos circadianos que significa “aproximadamente un día”. Esto sugiere que los animales poseen relojes biológicos ajustados o reprogramados con precisión por indicios ambientales.\nParece ser que el comportamiento de muchos animales o las actividades de una planta está organizado en torno a ritmos circadianos, así existen animales diurnos como las abejas, crepusculares como los mosquitos, y nocturnos como los murciélagos; éstos presentan su máxima actividad en esos momentos del día Algunos ciclos biológicos reflejan el ciclo lunar, esto es notable en los organismos marinos que se sincronizan con los cambios en las mareas y las fases de la luna. Por ejemplo una combinación de ciclos de marea, lunares y anuales rige el comportamiento reproductivo del “gronio”, un pequeño pez del Pacífico. Éste forma grandes cardúmenes de abril a junio, durante tres o cuatro noches en que se presentan las mareas más altas del año. En el punto más alto de la marea los peces salen del mar, depositan óvulos y espermatozoides en la arena de la playa y regresan al mar con la siguiente ola. Cuando la siguiente marea alta llega a esa porción de la playa, unos 15 días después, los pececillos han hecho eclosión en la arena y están listos para ir al mar. Este ejemplo reafirma la idea que en condiciones normales, los procesos metabólicos de un organismo y su comportamiento están sincronizados con los cambios cíclicos del ambiente externo, de modo que su comportamiento puede anticipar esos cambios regulares. Al parecer muchos ritmos biológicos son regulados por mecanismos de cronometraje internos que actúan como relojes biológicos. Los datos disponibles hacen pensar que casi ningún organismo tiene un solo reloj biológico, sino que la interacción de varios procesos bioquímicos podrían encargarse de regir los ritmos fisiológicos y conductuales.\nMigraciones: Proceso en el que interactúan los ritmos biológicos, la fisiología y el ambiente.\nLa migración es el desplazamiento periódico a larga distancia y es una adaptación al cambio ambiental. La pregunta que surge en primera instancia es ¿Por qué migran los animales? Al parecer las causas últimas de la migración tiene que ver con las ventajas de desplazarse de una zona cuya estación se torna menos hospitalaria a una región más propicia para la reproducción o supervivencia. Algunos animales migran al madurar, en otros, determinados indicios\nambientales activan reacciones fisiológicas que inducen la migración. En las aves migratorias, pro ejemplo, la glándula pineal percibe cambios en la duración del día entonces libera hormonas que provocan un comportamiento inquieto característico, el ave muestra una creciente disposición a volar, haciéndolo por períodos cada vez más largos. Al analizar este comportamiento deben considerarse los siguientes aspectos:\n*orientación direccional: se refiere al viaje en una dirección específica. *sentido de orientación: se refiere a dirigirse a un destino en línea recta. *Navegación: Proceso que implica integrar información de distancia y tiempo y dirección para arribar al destino específico. Es decir que deben tener el sentido de la orientación como el cartográfico (“conciencia” de la ubicación).\nLos sentidos de orientación que usan los animales son variados, en muchos casos es el sol, también pueden ser los olores, el campo magnético terrestre o las constelaciones.