Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells | Protocol (Translated to Spanish)\nAquí, presentamos un protocolo para generar clones de células de cáncer que contiene una etiqueta de secuencia de MS2 en un sola subteloméricas. Este enfoque, basándose en el sistema MS2-GFP, permite la visualización de los transcritos endógenos de telomeric repetición que contiene ARN (TERRA) de un telómero solo en las células vivas.\nLos telómeros se transcriben, dando lugar a telomeric repeat-con larga noncoding RNAs (TERRA), que se han propuesto para desempeñar un papel importante en la biología telomérica, incluyendo formación de heterocromatina y homeostasis de longitud telomérica. Recientes descubrimientos revelaron que las moléculas TERRA también interactúan con regiones cromosómicas internas para regular la expresión génica en las células madre embrionarias (ES) de ratón. En consonancia con esta evidencia, RNA fluorescencia en situ del hibridación (pescado de RNA) análisis han demostrado que sólo un subconjunto de TERRA transcripciones localización en los extremos del cromosoma. Una mejor comprensión de la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción. Aquí, describimos un método para marcar y visualizar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células cancerosas mediante el sistema MS2-GFP. Para ello, presentamos un protocolo para generar clones estables, utilizando la línea celular del cáncer de estómago humano AGS, con secuencias de MS2 integradas en una sola subteloméricas. Transcripción de TERRA de telomere tagged MS2 se traduce en la expresión de moléculas etiquetadas MS2 TERRA que se visualizan por microscopia de fluorescencia de células vivas sobre la expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (GFP-MS2). Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de las moléculas TERRA solo telómeros en células cancerosas, y puede ser aplicado a otras líneas celulares.\nLa larga noncoding TERRA de ARN es transcrito desde la región subteloméricas de los cromosomas y su transcripción procede hacia los extremos del cromosoma, que termina dentro de la zona de repetición telomérica1,2. Por esta razón, las transcripciones TERRA consisten en secuencias subtelomeric deriva en su extremo 5' y terminan con repeticiones teloméricas (UUAGGG en vertebrados)3. Importantes roles han sido propuestos para TERRA, incluyendo la formación de la heterocromatina en telómeros4,5, ADN replicación6, promoviendo la recombinación homóloga entre cromosoma termina7,8 , 9, regulación de telomere estructura10y telómeros longitud homeostasis2,11,12,13. Por otra parte, las transcripciones TERRA interactúan con numerosos sitios de extratelomeric para regular la expresión génica generalizada en ratón de células madre embrionarias (ES)14. En consonancia con estas pruebas en situ hibridación de RNA fluorescencia (RNA-pescado) los análisis han demostrado que sólo un subconjunto de las transcripciones TERRA localizar en los telómeros1,2,15. Además, TERRA se ha divulgado para formar agregados nucleares de la localización en los cromosomas X e Y en células de ratón2,16. Estos resultados indican que las transcripciones TERRA experimentan dinámicas complejas dentro del núcleo. Comprender la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción.\nEl sistema MS2-GFP ha sido ampliamente utilizado para visualizar las moléculas de ARN en las células vivas de varios organismos17,18. Este sistema se ha utilizado previamente la etiqueta y visualizar moléculas TERRA solo telómeros en S. cerevisiae12,19. Mediante este sistema, fue demostrado recientemente que las transcripciones TERRA de levadura localización dentro del citoplasma durante la fase de post-diauxic cambio, sugiriendo que TERRA puede ejercer funciones extranuclear20. Recientemente hemos utilizado el sistema MS2-GFP para estudiar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células de cáncer21. Para ello, se emplea la herramienta de edición de genoma CRISPR/Cas9 para integrar secuencias MS2 en un telómero solo (telomere 15q, de ahora en adelante Tel15q) y se obtuvieron clones expresando tagged MS2 endógeno Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones). La expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (MS2-GFP) que reconoce y se une MS2 ARN secuencias permite visualización de transcripciones TERRA telómero solo en la vida de las células de21. El propósito del protocolo ilustrado aquí es describir en detalle los pasos necesarios para la generación de clones de TERRA-MS2.\nPara generar clones de TERRA-MS2, un cassette de MS2 se integra dentro de la región subtelomeric del telomere 15q, aguas abajo del TERRA promotor región y transcripción Inicio. El cassette de MS2 contiene un gen de resistencia a neomicina flanqueado por sitios lox-p, y su integración en subteloméricas 15q se realiza utilizando el sistema CRISPR/Cas9 del22. Después de transfección de MS2 cassette, solo los clones seleccionados e integración subtelomeric del cassette es verificado por PCR, ADN secuenciada y Southern blot. Clones positivos se infectan con un adenovirus que expresan Cre para quitar el marcador de selección en el cassette, dejando solamente secuencias de MS2 y un sitio de solo lox-p en subteloméricas 15q. Expresión de las transcripciones de MS2-tagged TERRA de Tel15q se verifica por RT-qPCR. Por último, se expresa la proteína de la fusión de GFP MS2 en TERRA-MS2 clones mediante infección retroviral para poder visualizar las transcripciones MS2-TERRA por microscopía de fluorescencia. Transcripciones TERRA pueden ser fácilmente detectadas por RNA-peces y proyección de imagen de células vivas mediante telomeric repeat-específico sonda1,2,15,23. Estos enfoques proporcionan información importante sobre la localización de la población total de moléculas TERRA en la resolución de la célula. La generación de clones que contienen secuencias de MS2 en un subteloméricas solo permitirá a los investigadores a estudiar la dinámica de las transcripciones TERRA solo telómeros en las células vivas, que ayudarán a definir la función y mecanismos de acción de TERRA.\n1. Selección de Clones resistentes a la neomicina\nCultivar células AGS en medio F-12_K del jamón (Kaighn) suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio) y estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) a 37 ° C y 5% CO2. Transfectar las células en un 50-60% de confluencia con el sgRNA/Cas9 expresando el vector y el cassette de MS2 en un 1:10 cociente molar21.\nNota: En un experimento paralelo, comprobar eficacia de transfección transferencia un vector de expresión de GFP (es decir, GFP Cas9 vector). Al menos debe alcanzar el 60-70% de eficiencia de transfección.\nAl día siguiente, reemplace el medio de cultivo con medio que contiene neomicina en concentración final de 0.7 μg/mL (medio selectivo).\nNota: División de las células y les siembra en medio selectivo el día después de la transfección acelerará el proceso de selección. Todas las células transfectadas no va a morir inmediatamente. Si realiza la transfección en 6 placas de pozos, en cuyo caso cada bien en un 60% confluencia contendría aproximadamente 0,7 x 106 células, que las células pueden dividirse de un pozo único a un medio selectivo que contiene 10 cm plato al día siguiente.\nMantener las células en medio selectivo para 7-10 días, cambiando el medio cada uno o dos días, hasta que los clones solo son accesibles.\nSelección de clones de células\nPreparar un plato bien 96 con 10 μl de tripsina 0.25% en cada pozo.\nNota: Prepare dos 96 placas bien en caso de que se espera que más de 96 clones recogidos.\nCon el uso de un microscopio, marque la posición de cada clon visible en el plato 10 cm haciendo un punto en la parte inferior del plato usando un marcador. Cada punto corresponderá a una colonia a ser recogido.\nReemplazar el medio de cultivo con suficiente fosfato tampón salino (PBS) que forman una fina película de líquido sobre los clones y no dejar que las células secas durante la cosecha de clones.\nEscoge solo colonias con una pipeta de 10 μl. Fije la punta con 5 μl de tripsina a la Colonia y suelte lentamente la tripsina que permanecerá localizada en la Colonia. Permiten tripsina separar las células durante 1 minuto, luego raspar la Colonia con la punta y aspirar en la punta.\nNota: Durante este procedimiento, cambiando el plato un poco de un lado así que disminuir el volumen de PBS alrededor de la Colonia burlan ayudará el proceso de selección evitando diluir la tripsina alrededor de la Colonia. Usando un anillo clon también puede ayudar a recoger solo clones.\nColoque las células de la Colonia en un pocillo de la placa bien 96 con 10 μl de tripsina 0.25%.\nIncubar 5 min a temperatura ambiente, luego llene el pozo con 150 μL de medio selectivo (medio Ham F - 12K (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL.\nNota: Durante el tiempo de incubación otros clones se pueden seleccionar. Se recomienda escoger tantos clones como sea posible. Se recogen los clones más mayor será las posibilidades de identificación positivas.\nUna vez que todos los clones son seleccionados y transferidos en la placa de la pozo 96, permite a las células a crecer durante unos días en medio selectivo F - 12K de Ham (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg / mL del medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL a 37 ° C y 5% CO2, hasta llegar a 90% de confluencia.\nPartir de los clones\nPreparar tres 96 placas bien cubiertas con gelatina por agregar 100 μl de gelatina por pozo, incubar durante 30 min a temperatura ambiente, luego lavar dos veces con PBS. Estas placas se utilizará para la extracción de ADN (placa de ADN) y clon congelación (placas de congelación).\nNota: La gelatina promoverá la fijación de las células y del ADN en los pocillos. En particular, la capa de gelatina permitirá el ADN pegue en el fondo de los pozos durante la extracción de ADN y lavar procedimientos (discutidos abajo). Durante el procedimiento de separación de clon, es recomendable utilizar una pipeta multicanal.\nUna vez que clones alcanzan el 90% de confluencia, aspirar el medio de cada pocillo de la placa de la pozo 96, lavar con PBS, Añadir 30 μl de tripsina 0.25% por pozo e incubar 5 min a 37 ° C.\nNota: Clones crecerá a tasas diferentes, que también dependerá del número de células recogidas por clon. Por lo tanto, este paso se realizará durante los días cuando los clones diferentes a 90% de confluencia.\nAñadir 70 μl de medio selectivo por pozo, desbaratar grumos de células mediante pipeteo arriba y abajo dentro de los pozos, luego transferir 30 μl de 100 μl a la placa de ADN gelatinizada prellenada con 120 μl de medio selectivo por pozo y 30 μL en el ingenio prellenada gelatinizado de congelación las placas h 50 μl de medio (sin selección).\nColocar la placa de la DNA en la incubadora y permitir a las células para crecer a 37 ° C y 5% de CO2 hasta 90% de confluencia.\nAñadir 80 μl de helado recién hecho 2 x congelación medio (80% FBS y 20% dimetil sulfóxido (DMSO)) a cada pocillo de la placa de congelación, añadir parafilm (rociado con etanol al 70%) sobre la placa para sellar cada pocillo, coloque la tapa en la parte superior y envolver la placa con papel de aluminio. Coloque las placas de congelación a-80 ° C.\nAgregar 90 μl de medio selectivo por bien a la placa bien 96 original que contiene los clones que se han dividido y no se en cultura hasta resultados de PCR. Esta placa se utilizará como placa de respaldo.\n2. selección de Clones resistentes a la neomicina\nExtracción de ADN de la placa de ADN bien 96.\nUna vez que los clones cultivados en la placa de ADN llega a 90% de confluencia, lavar 2 veces con PBS y lyse con 50 μl de tampón de lisis (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA, 10 mM de NaCl, 0.5% SDS y proteinasa K de 1 mg/mL). Cubra la placa con parafilm, sellando cada pocillo, coloque la tapa, cubierta con el abrigo de saran y colocar a 37 ° C durante la noche.\nAñada 100 μl de etanol frío (Et-OH) y una solución de NaCl (0,75 M de NaCl en 100% de etanol) a cada uno bien, precipitar por 6 horas o durante la noche a temperatura ambiente.\nNota: El protocolo se puede detener aquí.\nQuitar el Et-OH/NaCl solución invirtiendo la placa y lavar 3 veces con 200 μL de etanol al 70% por pozo.\nAñadir 25 μl de ARNasa A solución en agua destilada e incubar a 37 ° C durante 1 h.\nUtilice 3 μl de ADN genómico para la amplificación por PCR. Realizar investigación de la polimerización en cadena de los clones seleccionados usando las cartillas recocido dentro del gen de resistencia a neomicina y subteloméricas 15q. Amplificación por PCR se realiza utilizando enzimas de polimerasa estándar y protocolos PCR21.\nNota: Las condiciones PCR para cartillas de MS2 (cartilla MS2-subtel15q-primer-S y MS2 como) y cartillas del CTR (primer CTR S y cartilla CTR como) son los siguientes: 98 ° C por 20 s como paso de desnaturalización y luego 34 ciclos a 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , en 25 μl de enzima polimerasa reacción mezclar (véase Tabla de materiales). Secuencias de la cartilla se indican en la tabla 1.\nEjecutar reacciones de PCR en gel de agarosa y extracto de bandas PCR obtenidas de clones positivos mediante procedimientos de extracción de gel estándar (véase Tabla de materiales reactivos de extracción de gel).\nRealizar análisis de la secuencia de ADN del gel extraído del producto de PCR para la confirmación de la presencia de las secuencias de MS221.\nNota: El análisis de secuencia pueden realizarse utilizando los cebadores utilizados para la detección de PCR.\nProyección de la mancha blanca /negra meridional de clones positivos de PCR\nCrecen los clones positivos en PCR y detección de la secuencia de la original 96 bien placa (la copia de seguridad) a 6 platos bien en medio Ham F - 12K (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg por mL de medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL a 37 ° C 5% CO2.\nNota: Como alternativa, si algunos de estos clones se han perdido, deshielo de una de las placas de congelación (véase protocolo 2.6).\nUna vez que los clones están en 90% de confluencia en la placa bien 6, lavan las células con PBS y añadir 250 μl de tampón de lisis que contienen 0,5 μg de proteinasa K por pozo.\nRaspar las células usando un raspador celular y transferir el lisado en un tubo de 1,5 mL.\nIncubar a 37 ° C por 16 h.\nAñadir 1 mL de etanol al 100%, agitar con fuerza y permitir el ADN precipitado por lo menos 2 horas o toda la noche a-20 ° C.\nVuelta a 13.400 x g a 4 ° C por 10 min, descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%. Deje que el pellets aire seco a temperatura ambiente. Como alternativa, utilice un concentrador de vacío.\nResuspender el pellet de DNA en 50 μl de agua destilada conteniendo Rnasa A e incubar 1 h a 37 ° C.\nDigerir el 5-10 μg de DNA genómico con enzimas de restricción Brochothrix y BamHI (dos digestiones independiente) en el volumen de reacción de 100 μl por incubación de las reacciones de digestión a 37 ° C durante la noche.\nEjecutar 4 μL de la digestión en gel de agarosa (agarosa 0,8%) para la confirmación de la digestión completa.\nAñadir 1/10 volumen de sodio acetato 3 M solución pH 5.2 y 2 los volúmenes de etanol al 100% a las reacciones de digestión de restricción e incubar por lo menos 2 horas o durante la noche a-20 ° C para precipitar el ADN.\nCentrifugue a 13.400 x g a 4 ° C por 20 min, descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%. Dejar secar el pellet al aire a temperatura ambiente. Como alternativa, utilice un concentrador de vacío.\nResuspender el pellet en 20 μl de agua destilada y el ADN digerido en un gel de agarosa al 0,8% de la carga.\nNota: Para una mejor resolución del ADN digerido, preparar un gel por lo menos 15 cm de largo y correr toda la noche en baja tensión (̴30 v). Debe optimizarse la electroforesis establecida.\nAl día siguiente, teñir el gel con un agente etiquetado ADN, como el bromuro de etidio en concentración final de 1 μl/10 mL, 30 min a temperatura ambiente y tomar una foto con una regla cerca el gel en un gel de instrumento de proyección de imagen.\nEstablecer a la transferencia de ADN a una membrana de nylon y realizar hibridación de la membrana con una sonda de secuencia-específica de MS2 utilizando procedimientos estándar21.\nDescongelar los clones que son positivos en PCR, ADN secuenciada y Southern blot de una de las dos placas de congelación (ver siguiente paso).\nDescongelación de clones\nPreparar un tubo de 15 mL que contiene 5 mL de precalentado Ham F - 12 K medio (de Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio) y estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) por cada clon que se descongelarán.\nRetire una de las placas de congelación de-80 ° y añadir 100 μl de precalentado F12K medio completo al bien que contiene la copia positiva que se descongelarán.\nNota: Este procedimiento debe realizarse rápidamente y la placa de la pozo 96 debe colocarse en hielo seco después de cada clon se descongele, para permitir que los otros clones que permanecen congelados. Esto es particularmente importante si necesitan ser descongelado del mismo plato bien 96 múltiples clones.\nTransferencia de las células al tubo de 15 mL que contiene 5 mL de medio y centrifugue a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.\nAspire el medio resuspender las células en 500 μl de medio de F12K completo precalentado y transferir cada clon a un único pozo de una placa bien 12.\nEliminación del gen de resistencia a neomicina del cassette de MS2 integrado en subteloméricas 15q.\nPermita que los clones a crecer de una placa bien 12 a un plato de 10 cm en el medio F12K completo.\nNota: Neomicina no se incluyera en el medio a menos que se indique lo contrario.\nAñadir el adenovirus Cre-expresar las células cultivadas en un plato de 10 cm en confluencia de 70% en 10 mL de medio completo F12K.\nNota: Utilizando un adenovirus expresando GFP Cre permitirá la evaluación de la eficacia de la infección, que debe acercarse al 100%. El adenovirus replicación defectuosa se perderán después de pocos pasos en la cultura.\n48 horas después de la infección, dividir las células en tres platos de 10 cm. Dos platos se utilizará para la verificación de la eliminación del gen neomicina por selección negativa, cultivo de las células que contienen neomicina medio (primer plato) y por Southern blot (segundo plato).\nEl tercer plato que contiene el clon para congelación de células y la extracción de RNA de la cultura.\n3. verificación de la TERRA-MS2 transcripción expresión por RT-qPCR\nPrevia verificación de la eliminación del gen de neomicina, realizar extracción de RNA total de clones de TERRA-MS2 con solventes orgánicos (fenol y guanidina isothiocynate solución)21.\nResuspender el ARN extraído de un plato de 10 cm en 100 μl de agua de dietil pirocarbonato (DEPC).\nEjecutar 3 μl de ARN en un gel con ácido (MOPS) propanesulfonic denaturating (1% formaldehído que contienen) 1 x 3-(N-Morpholino) para verificar la concentración y la integridad del ARN. También analizar la concentración de RNA usando un espectrofotómetro.\nTratar 3 μg de ARN con DNasa I con 1 unidad de la ADNsa I enzima en el volumen de reacción final de 60 μL.\nIncubar la reacción por 1 h a 37 ° C.\nRevertir la reacción y qPCR análisis de transcripción\nAñadir los siguientes componentes a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasas: 2 μl de un 1 primer específico de TERRA μm, 1 μl de mezcla de dNTPs (10 mM), 6 μl de DNasa tratados con ARN (correspondientes a ̴300ng RNA). Ajustar el volumen a 13 μl con 4 μL de agua DEPC.\nNota: Para que cada RNA a analizar, un segundo tubo que contiene los mismos reactivos pero una cartilla específica de referencia, en vez de primer específico de TERRA, debe estar preparado.\nCalienta la mezcla a 65 ° C durante 5 minutos e incubar en hielo durante al menos 1 minuto.\nRecoger el contenido de los tubos por centrifugación breve y añadir 4 μL de la enzima RT X 5 Buffer, 1 μl 0.1m dithiothreitol (DTT), 1 μl (4 unidades) de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de transcriptasa reversa (véase Tabla de materiales).\nIncubar las muestras a 42 ° C durante 60 min, luego use 2 μl de la reacción de RT para análisis de qPCR.\nPreparar la mezcla de reacción de qPCR en un volumen final de 20 μl de 10 μl de la mezcla principal de 2 x qPCR, 2 μl de cDNA plantilla, 1 μl de cebador forward (10 μm), 1 μl de cebador reverso (10 μm) y 6 μl de agua.\nRealizar la reacción de qPCR en un termociclador usando protocolos estándar21.\n4. producción de un Retrovirus expresando GFP MS2\nPara generar el retrovirus expresando GFP MS2, transfectar 80% confluente phoenix packaging de células con una proteína de fusión de MS2-GFP expresar vectores de retrovirus (pBabe-MS2-GFP PURO) y un gen env expresando el vector (por ejemplo, pCMV-VSVG) con una relación molar de 4:1 de los dos vectores.\nAl día siguiente, reemplace el medio de cultivo (DMEM había suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina y pluma/Strep) con fresco medio que contiene 10mM butirato.\nIncubar durante 8 h a 37 ° C, 5% CO2, a continuación, sustituir el medio por medio fresco de cultivo desde que el virus será recogido.\nDespués de 48 h, retire el medio de retrovirus que contienen las células de phoenix. Este medio puede ser utilizado directamente para la infección de clones de TERRA-MS2, en cuyo caso el medio del filtro a través de un filtro de 0.45 μm, agregar polibreno (concentración final de 30 μg/mL) y agregar a las células (en este caso el protocolo continúa en el paso 5). Por otra parte, retrovirus se puede precipitar en un tubo falcon de 50 mL agregando 1/5th volumen 50% PEG-8000/900 mm solución de NaCl y incubando toda la noche a 4 ° C en una rueda de rotor.\nAl día siguiente, las partículas de retrovirus de pellets por centrifugación a 2.000 x g durante 30 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en F12K medio sin suero.\nNota: Las partículas de virus pueden se resuspendió en 1/100th del volumen de sobrenadante original. Una prueba de infección debe realizarse para verificar el volumen mínimo de retrovirus necesaria para infectar eficientemente las células.\n5. visualización de TERRA-MS2 transcritos en células vivas\nTERRA-MS2 clones y células AGS WT en platos con fondo de cristal de la placa. En el día de la infección, añadir polibreno el medio (concentración final de 30 μg/mL) y los retrovirus expresando GFP MS2.\nDespués de 24 horas, descartar el medio que contiene el virus y añadir medio fresco sin rojo de fenol.\nAnalizar las células en un microscopio invertido usando el microscopio adecuado. Imagen de las células con un 100 X u objetivo de 60 X con apertura numérica grande (1.4 X) y usando una cámara sensible (EMCCD). Utilizar un sistema de control ambiental para mantener las muestras a 37 ° C y 5% CO2 durante la proyección de imagen.\nFigura 1 representa un resumen de la estrategia experimental. Los principales pasos del protocolo y un calendario indicativo para la generación de clones de TERRA-MS2 en células AGS se muestran (figura 1A). En el día 1, múltiples pocillos de una placa bien 6 son transfectados con el cassette de MS2 y sgRNA/Cas9 expresando vectores (se muestra en la figura 1B). Dos secuencias de 15q-específica guía RNA diferentes subteloméricas se clonan en el Cas9 nickase-expresión pX335 vector, generando dos vectores sgRNA-pX335 que son co transfected con el cassette de MS2. Un pocillo de la placa puede transfectado con un GFP expresión vectorial para verificar la eficiencia de transfección. En el día 2, las células se tripsinizaron y transferidas de un pozo único a un plato de 10 cm conteniendo medio selectivo. En el día 3, se deberá cambiar medio como más untransfected las células muertas. Las células se cultivan en la selección hasta que los clones son visibles y listo para ser recogido. Durante este tiempo, las células no deben se tripsinizaron y medio de cultivo debe ser cambiado cada 1-2 días para la primera semana y luego cada 2-3 días después. Una vez que los clones solo son visibles, son recogidos y transferidos en una placa bien 96 donde se les permite crecer hasta llegar a 80-90% de confluencia. En este punto, clones están divididos en 4 diferentes 96 bien las placas, que están marcadas en la figura 1 con un código de color. Una vez que los clones cultivados en la placa de ADN (verde) llega a 80% de confluencia, lisis y extracción de ADN genómico extraído para PCR de detección; los clones en la placa de respaldo (azul) se mantendrá en cultivo hasta los resultados de la detección de PCR, mientras que las placas de congelación rojo son congeladas a-80 ° C. Figura 2 B muestra resultados representativos de un examen de PCR de clones resistentes a la neomicina. Para esta investigación, se utilizan dos sistemas de cartillas: un cartilla par (cartillas de MS2) recocido dentro de la secuencia de 15q neomicina gene y subteloméricas es utilizado para verificar la presencia de la cassette de MS2 (una imagen representativa de la localización de cartillas se muestra en Figura 2A). Un segundo primer par (cartillas CTR) recocido en una región cromosómica interna se utiliza para verificar la presencia de falsos negativos clones (secuencias de la cartilla se indican en la tabla 1). Clones negativos para la integración de la cinta deben ser negativo a la amplificación de los iniciadores de MS2 y positivo a la amplificación de los iniciadores CTR. Problemas técnicos en la extracción de ADN genómica resultando en la ausencia de ADN genómico o su contaminación impediría la amplificación por PCR de las reacciones de la cartilla de MS2 y CTR. En estos casos, los clones implicados pueden volver a someterse a por PCR en extracción de ADN genómico de la placa de respaldo. Bandas de amplificación de cartillas de MS2 de clones positivos pueden ser gel extraído y secuenciado usando los cebadores MS2, con el fin de confirmar la presencia de secuencias de diez MS2.\nLos clones que son positivos en el examen de PCR son cultivados desde la placa bien backup 96 (la placa azul en la figura 1) a una placa bien 6, luego de lisis para análisis de Southern blot y la extracción de ADN genómica. Figura 2 D muestra imágenes representativas de un gel (izquierda) y la membrana hibridada con radiactivo con MS2 secuencia específica sonda (derecha) de una proyección de Southern blot de clones positivos de PCR. Para la confirmación de la integración de secuencias de MS2 en subteloméricas 15q, DNA genomic extraída de cada clon debe ser digerida con dos diferentes enzimas de restricción (Brochothrix y BamHI) en dos reacciones de digestión separada. Las enzimas de restricción Brochothrix y BamHI son convenientes para la verificación de la integración de cassettes de MS2 en subteloméricas 15q. También pueden utilizarse otras enzimas. El gel muestra una digestión completa de la DNA genomic usando la enzima de restricción BamHI, tal como se indica por la presencia de un frotis. Los resultados de Southern blot indican que un clon es positivo para la integración de la cassette de MS2 en subteloméricas 15q mientras varios clones muestran múltiples eventos de integración de la cinta, como se indica por la presencia de varias bandas. Un clon positivo debe analizarse por un segundo Southern blot sobre Brochothrix digestión del ADN genómico21. Una imagen representativa de un cassette subteloméricas 15q que contiene el MS2 y la posición de los sitios de enzimas de restricción BamHI y Brochothrix se muestran en la figura 2C.\nLos clones positivos a PCR y Southern blot análisis están infectados con un adenovirus expresando GFP Cre para eliminar el gen de la neomicina presente en la cinta de MS2. Figura 3 A representa un subteloméricas tagged MS2 15q antes y después de la expresión de la Cre. Una imagen de una copia positiva para la integración de cassettes de MS2 en subteloméricas 15q infectados con un Cre-GFP expresión adenovirus se muestra en la figura 3B. Para un retiro completo del gen neomicina en todas las células, la eficacia de infección debe alcanzar aproximadamente 100%. Como se muestra en la figura 3C, con el fin de verificar la eliminación del gen neomicina, células infectada Cre-GFP se dividen en tres placas después de 48 horas de la infección. Una placa se cultivan en presencia de neomicina. Todas las celdas de esta placa deben morir dentro de 6-7 días. En una segunda placa, las células pueden crecer en medio completo sin selección a 80-90% de confluencia. En este punto, la DNA genomic es extraída y analizada por Southern blot. La tercera placa se cultiva en medio completo para permitir la preparación de las acciones congeladas de la copia y para la extracción de RNA y RT-qPCR análisis de expresión de transcripción de TERRA-MS2. Figura 3 D muestra imágenes representativas de los análisis de Southern blot de una copia positiva antes y después de la infección de Cre-GFP. Gel de agarosa del ADN (imagen de la izquierda) confirma la digestión completa de la DNA genomic usando la enzima de la restricción de Brochothrix. Se realizó análisis de Southern blot con una sonda específica de MS2-secuencia radiactivo etiquetados (imagen de la derecha). Este análisis confirma la eliminación del gen de la neomicina. La presencia de un frotis de la muestra de Cre-GFP infectado confirma la integración telomeric de las secuencias de MS2. En la figura 3Ase muestra la posición de los sitios de restricción de Brochothrix dentro subteloméricas 15q.\nUna vez confirmada la eliminación del gen de resistencia a neomicina, los clones se pueden probar para la expresión de las transcripciones de TERRA-MS2. Para ello, ARN total es extraído de cada clon y correr en un gel de MOPS denaturating para confirmar su integridad (figura 4A). Bandas de ARN ribosómico deben ser visibles en 4.700 bases (rRNA 28S) y 1.900 bases (rRNA 18S). Reacción de retrotranscripción es realizada usando una cartilla específica de repetición telomeric y referencia gene-específico primer (figura 4B, arriba) mientras que análisis de qPCR de expresión TERRA se realizan con dos sistemas de cartillas: cartilla de uno par de recocido dentro de la secuencia de MS2 y la secuencia subteloméricas 15q; un segundo par de primers recocido dentro subteloméricas 15q. Secuencias de la cartilla se indican en la tabla 1. El gráfico presentado en la figura 4B muestra análisis de RT-qPCR de la expresión de la TERRA de las células de la WT de AGS y dos clones diferentes de TERRA-MS2. Estos análisis confirman la expresión de las transcripciones de TERRA-MS2 en los dos clones a niveles que son comparables a las transcripciones de la TERRA de subteloméricas 15q en células WT. Estos datos indican que los dos clones de TERRA-MS2 seleccionados son adecuados para el análisis de las transcripciones de TERRA-MS2 por proyección de imagen de células vivas.\nPara poder visualizar las transcripciones de TERRA-MS2 en células vivas, los clones seleccionados están infectados por un retrovirus que expresan la proteína de la fusión de GFP MS2. Figura 5 A muestra el procedimiento para generar retrovirus expresando GFP MS2, tal como se describe en el paso 4 de protocolo. Infectan a las células AGS WT y clones de TERRA-MS2 en platos con fondo de cristal. Después de 24 h de la infección, las células son analizadas por microscopía de fluorescencia. La especificidad de la señal se confirma por la presencia de focos de TERRA-MS2-GFP en el núcleo de clones de TERRA-MS2 y no en las células AGS WT (figura 5B). En una población de MS2-GFP expresando células, heterogeneidad en términos de niveles de MS2-GFP entre células se espera y las células que expresaban niveles bajos deben elegirse para el análisis de imágenes. Por otra parte, las células expresa GFP MS2 se pueden clasificar por análisis de microscopia previa FACS para recoger la subpoblación de células que expresan bajos niveles de GFP. Previamente hemos detectado focos de TERRA-MS2-GFP en 40% a 60% de las células de AGS TERRA-MS2 clones21. En estas células, una a cuatro focos de TERRA-MS2-GFP se reflejada por la célula. TERRA-MS2-GFP focos mostrando dinámicas y diferentes tamaños pueden ser detectado21. TERRA-MS2 clones pueden utilizarse para estudiar la dinámica de las transcripciones TERRA solo telómeros en las células vivas. Como ejemplo de esta aplicación, la figura 5C muestra imágenes representativas de los análisis de microscopía de un clon de TERRA-MS2 expresando la proteína de la fusión de GFP de MS2 y la proteína telomérica de que TRF2 fusionado a mCherry a fin visualizar transcripciones TERRA tagged MS2 y telómeros en las células vivas. Usando este acercamiento, anteriormente observamos que focos de TERRA-MS2-GFP localización junto con los telómeros en el 44% de las células, lo que indica que las transcripciones TERRA sólo transitoriamente co localización con los extremos del cromosoma en células AGS21.\nFigura 1 . Resumen de la estrategia experimental y cronograma indicativo para la generación de TERRA-MS2 clones de células AGS. A) se muestran los pasos descritos en el protocolo y un cronograma indicativo para la selección de TERRA-MS2 clones. Células son transfectados en una placa bien 6 con el cassette de MS2 lineal y sgRNA/Cas9 expresando vectores. Un código de color se utiliza para distinguir la placa de la DNA, la placa de respaldo y las placas de congelación indicaron en la sección de protocolo. B) MS2 el cassette consta de una secuencia de largo subteloméricas 15q nt 800 seguido por 10 repeticiones de las secuencias de MS2 y un gen de resistencia a neomicina flanqueado por lox-p sitios y termina con un tracto repetición telomeric larga 300 del nt en su extremo 3'. vectores de expresión sgRNA/Cas9 fueron generados por clonación de secuencias subteloméricas 15q-específica guía RNA pX335 vector usando el BbsI restricción sitio21,22. Se generaron dos vectores diferentes sgRNA-pX335 y una mezcla 1:1 de los dos vectores se utilizó para la transfección. Las secuencias de la sgRNAs se indican en la tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 2 . Imágenes representativas de PCR y Southern blot selección de clones resistentes a la neomicina. A) imagen representativa de subteloméricas 15q que contiene el cassette de MS2. Se indica la posición de los iniciadores de MS2 (cartilla MS2-subtel15q-primer-S y MS2 como) utilizado para la detección de PCR. En rojo se muestran los sitios loxP en el cassette. B) imagen representativa de la detección de PCR de clones resistentes a la neomicina utilizando dos cartillas, cartillas de MS2 y cartillas del CTR (primer CTR S y cartilla CTR como). C) imagen representativa de subteloméricas 15q que contiene el cassette de MS2. Sitios de restricción BamHI y Brochothrix y la sonda de MS2, utilizado para la proyección de Southern blot se muestran. D) izquierda: 10 μg de ADN genómico por clon eran digerido con BamHI y correr en un gel de agarosa. La imagen fue adquirida después de una noche a 30 voltios. Derecha: ADN genómico digerido con enzimas de restricción BamHI fue transferido a una membrana de nylon cargada positivamente y cruzado por hibridación con una sonda marcada radiactivamente con MS2 secuencia-específica. El cuadro rojo indica el tamaño esperado de la banda positiva. La flecha roja indica una copia positiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 3 . Eliminación de los experimentos de resistencia a neomicina gene y validación. A) imagen representativa de subteloméricas 15q que contiene el cassette de MS2 antes y después de la expresión de la Cre. La sonda específica MS2 utilizada para el análisis de Southern blot y Brochothrix enzima de la restricción sitios aparecen. En rojo se muestran los sitios loxP en el cassette. B) análisis de la microscopia de la fluorescencia de un clon de TERRA-MS2 infectado con adenovirus expresando su Cre-GFP. Se muestra imagen representativa en un solo plano focal. MOI, multiplicidad de infección, es la relación entre el número de los virus utilizados para la infección y el número de las células del huésped. Barra de escala: 30 μm C) Resumen de la estrategia experimental para verificar la eliminación del gen de la neomicina. Las células Cre-GFP infectada se dividen en tres placas después de 48 horas de la infección de selección i) negativo, análisis ii) Southern blot y iii) preparación de las poblaciones de células congeladas y la extracción de RNA. D) análisis de Southern blot de un TERRA-MS2 clon antes y después de la infección de adenovirus Cre-GFP. 10 μg de ADN genómico fueron digeridos con la enzima de restricción Brochothrix. Gel de agarosa confirma que la digestión completa se logra en ambos clones (izquierda). El ADN genómico digerido fue transferido a una membrana de nylon cargada positivamente y cruzado por hibridación con una sonda de secuencia-específica de MS2. Eliminación completa del gen neomicina se confirma por la ausencia de la banda específica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 4 . Análisis de RT-qPCR de Tel15q-TERRA y Tel15q-TERRA-MS2 expresión de las transcripciones. A) imagen representativa de un gel de MOPS con ARN total extraído de las células AGS WT y clones de TERRA-MS2. Bandas correspondientes a los RNAs ribosomales 28S y 18S están indicados. B) parte superior: un esquema de la subteloméricas tagged MS2 15q expresando las transcripciones TERRA. Cebadores utilizados para análisis de qPCR de TERRA-Tel15q (azul) y TERRA Tel15q-MS2 (rojo) y TERRA retrotranscripción (amarillo) se muestran. En rojo se muestra el sitio loxP. Abajo: RT-qPCR análisis de expresión de las transcripciones Tel15q TERRA y TERRA Tel15q-MS2 en células AGS WT y TERRA-MS2 clones. p < 0.05, t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 5 . Celular directo imágenes análisis de TERRA-MS2 clones. A) un resumen del procedimiento para producir un retrovirus expresando GFP MS2, tal como se describe en el paso 4 de protocolo. Un esquema del MS2-tagged subteloméricas 15q y transcripciones TERRA, reconocidas por la proteína de la fusión de GFP MS2 se muestra a la derecha. B) imagen de microscopía de fluorescencia representante de AGS WT y dos TERRA-MS2 clones expresando GFP MS2. TERRA-MS2-GFP focos están indicados por flechas. Se adquirieron imágenes utilizando un microscopio confocal de disco giratorio equipado con una cámara EMCCD. Las imágenes fueron capturadas utilizando un 100 X / 1.46 apochromat objetivo en una cámara de proyección de imagen se mantiene a 37 ° C con 5% CO2. Un laser de 488 fue utilizado como fuente de luz. Barra de escala: 5 μm. C) celular directo imágenes análisis de focos de TERRA-MS2-GFP y TRF2 mCherry etiquetados los telómeros. Se muestra un evento de colocalización entre un foco de TERRA-MS2-GFP y un telómero solo. Imágenes fueron adquiridas como en B, con 488 y 520 láseres como fuente de luz. Una proyección máxima de un experimento de pila z realizado en una sola vez se muestra el punto del experimento de Time-lapse. Barra de escala: 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nNombre de la cartilla Secuencia de primer Aplicación\nMS2-subtel15q-primer-S TGCATTAAAGGGTCCAGTTG Cartilla de MS2 adelante utilizada para la detección de PCR de clones resistentes a la neomicina\nCartilla de MS2 como CCTAACTGACACACATTCCACAGA Cartilla de MS2 inversa utilizada para la detección de PCR de clones resistentes a la neomicina\nCartilla CTR S TGT ACG CCA ACA CAG TGC TG Cartilla CTR adelante utilizada en la detección de PCR de clones resistentes a la neomicina\nCartilla CTR como GCT GGA AGG TGG ACA GCG A Cartilla CTR inversa utilizada en la detección de PCR de clones resistentes a la neomicina\nTel15q-S1 GCAGCGAGATTCTCCCAAGC Primer sentido utilizado para detectar la expresión Tel15q y TERRA Tel15q-MS2 por qPCR\nhTel15q-AS TAACCACATGAGCAATGTGGGTG Primer antisentido utilizado para detectar la expresión Tel15q y TERRA Tel15q-MS2 por qPCR\nTel15q-MS2-AS ATGTTTCTGCATCGAAGGCATTAGG Primer antisentido utilizado para detectar la expresión TERRA Tel15q-MS2 por qPCR\nTERRA-RT-cartilla CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA Cartilla utilizada por retrotranscripción de transcripciones TERRA\nsgRNA1 TTGGGAGAATCTCGCTGGCC Secuencia de la guía corta ARN 1 clonado en el vector pX335 y solía dirigir Cas9 nickase actividad enzimática a subteloméricas 15q\nsgRNA2 TGCATTAAAGGGTCCAGTTG Secuencia de la guía corta ARN 2 clonado en el vector pX335 y solía dirigir Cas9 nickase actividad enzimática a subteloméricas 15q\nTabla 1 : Lista de los cebadores utilizados en este estudio. Se proporciona una lista de los cebadores y las secuencias de la sgRNAs utilizado en este protocolo. Las secuencias son 5' a 3'.\nEn este artículo presentamos un método para generar clones de células de cáncer humano que contiene secuencias de MS2 integradas en subteloméricas 15q. Usando estos clones, las moléculas etiquetadas MS2 TERRA transcritas de subteloméricas 15q son detectadas por microscopía de fluorescencia por la expresión de una proteína de la fusión de GFP MS2. Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de TERRA expresado desde una sola células del telómero en la vida de21. En este protocolo, TERRA-MS2 clones se seleccionan en la línea celular AGS, que representa un interesante sistema de modelo para el estudio de TERRA, como expresión de TERRA es upregulated en el estómago humano cáncer muestras24. Sin embargo, el protocolo descrito aquí puede ser adaptado para la selección de clones de TERRA-MS2 en otras líneas celulares. La integración de las secuencias de MS2 puede en principio promoverse a una diferente del telomere 15q subteloméricas usando un cassette específico de MS2 y estrategia CRISPR. En el método presentado aquí, una enzima de nickase Cas9 y doble guía RNAs son empleados para aumentar la especificidad de la integración22. Usando esta estrategia, un 2% general de clones positivos deben ser identificados en células AGS. Otras versiones de la enzima Cas9 pueden probarse en el intento de aumentar la tasa de éxito de la selección de clones de25. Además, los siguientes pasos del protocolo son críticos a tener en cuenta para maximizar la eficiencia de la selección de clones:\nI) con el fin de aumentar las posibilidades de la selección de los clones de TERRA-MS2, es importante lograr una eficacia de transfección alta de los vectores CRISPR y el cassette de MS2. Líneas de células transfected mal probablemente requerirá varias rondas de transfección, selección de clones y proyección para seleccionar clones positivos.\nII) es importante determinar la concentración exacta de la neomicina a utilizar para la selección de los clones. De hecho, usando una concentración baja de la droga producirá clones positivos falsos mientras que una concentración alta puede impedir la identificación de clones positivos. La concentración de neomicina indicada en este protocolo es letal para las células AGS dentro de 6-7 días de la adición al medio de cultivo.\nIII) clon picking es un paso crítico. De hecho, durante este procedimiento se requiere que los clones solos son recogidas. Para ello, las colonias que están muy cerca que entre sí se deben evitar para evitar la mezcla con células de diferentes clones, dando por resultado la selección de una población mixta de clones que pueden contener secuencias de MS2 integrado en múltiples sitios genómicos. Estos eventos deben ser identificados durante la prueba de Southern blot.\nIV) la cantidad de DNA genomic extraída de una placa de ADN bien confluentes 96 (protocolo 2) se estima que alrededor de 5 μg y debería bastar para cada clon por PCR y Southern blot con una sola enzima de la restricción digestión de la pantalla. Sin embargo, para confirmar la integración del cassette en el telómero esperado, será importante para cada clon por Southern blot digiriendo el ADN genómico con dos enzimas de restricción diferentes. Para ello, como se indica en el protocolo, los clones positivos en detección de PCR deben ser cultivados en placas de pozos 6. La cantidad de la DNA genomic extraída de un pozo de una placa bien 6 será suficiente para por lo menos dos digestiones de la restricción necesarias para el análisis de Southern blot.\nEn el protocolo descrito aquí, las secuencias de MS2 se integran dentro subteloméricas 15q por una serie de razones: i) región del promotor TERRA y TERRA transcripción Inicio sitios han sido identificados en este subteloméricas26,27; II) expresión TERRA de subteloméricas 15q ha sido validado mediante el uso de vitro técnicas4,27,28,29,30; III) la región subtelomeric del cromosoma 15q ha sido secuenciada y contiene una única región adyacente a la zona de repetición telomérica que puede orientarse para la integración de la cassette de MS221. Enfoques de Southern blot y PCR fueron desarrollados con el fin de confirmar la integración única de las secuencias de MS2 en 15q subteloméricas en los clones de TERRA-MS2. Sería interesante realizar también experimentos de DNA-FISH de cromosoma se separa para poder visualizar la localización cromosómica de las secuencias de MS2 en cromosomas metafásicos fijo. Sin embargo, las secuencias de la longitud de la 10xMS2 (450 bp) impone el uso de sondas muy corto en comparación con las sondas generalmente utilizadas en los experimentos de DNA-FISH de cromosoma se separa (cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (Bac) y plásmidos)31. Este reto nos ha impedido visualizar las secuencias de MS2 en extensiones de cromosoma que representa una limitación del protocolo. Una limitación adicional del método es el tiempo y el esfuerzo necesario para la selección de los clones de TERRA-MS2. Además, se requiere laboratorio específico establecido y equipo para el uso de virus, material radiactivo y los análisis de microscopía.\nEl método descrito aquí puede ser implementado para la generación de clones de TERRA-MS2 en diferentes líneas celulares para definir la dinámica de la tierra en diversos contextos biológicos, tales como durante la senescencia de la disfunción o celular telómero, ayudarnos a comprender la función de TERRA en estos procesos. Un desarrollo interesante de este enfoque será la generación de clones de TERRA-MS2 con TetO repite integrado en un subteloméricas específicas, incluyendo el telomere tagged MS2. La expresión de una proteína Tet unida a una proteína fluorescente (es decir, mCherry) permitirá la visualización de este telómero particular en la vida de las células de32. Este enfoque permitirá la investigación de si humanas transcripciones TERRA localizan y actúan en cis en la TERRA transcribir telómeros y cromosoma o en trans reubicando a otros cromosomas. Esta pregunta el biología de TERRA queda por aclararse.\nLos autores no declaran a intereses financieros que compiten\nEstamos muy agradecidos al personal de la facilidad avanzada de la proyección de imagen del CIBIO en la Universidad de Trento y la instalación de microscopía de luz de BioOptics en el Max F. Perutz laboratorios (MFPL) en Viena. La investigación conduce a estos resultados ha recibido no financiación de la Stiftung Mahlke Obermann y séptimo programa marco de la Unión Europea para la investigación, desarrollo tecnológico y demostración en convenio de subvención 609431 de la CE. CE es apoyado por una beca Montalcini del Ministerio italiano de la Universidad de la educación y la investigación (MIUR).


Huawei MediaPad M6 filtrada: así será la tablet de gama alta que anunciarán en unos días - AndroideMix\nHuawei MediaPad M6 filtrada: así será la tablet de gama alta que anunciarán en unos días\n18 junio, 2019 18 junio, 2019 Borja Vivas Otros, Tablets\nHuawei no parece intención de echarse atrás pese al veto impuesto por Estados Unidos que pesa sobre su compañía, razón suficiente para mantener una ambiciosa hoja de ruta con numerosos lanzamientos entre manos; teniendo incluso entre manos una sucesora para la conocida MediaPad M4 presentada en febrero del pasado año.\nExistían rumores de que una Huawei MediaPad M6 estaba en camino, renovación para esa tablet con unas especificaciones técnicas de gama alta y precio de gama media que, a tan sólo unos días de su lanzamiento, su fabricante ha querido filtrar parcialmente para mostrarnos un pequeño adelanto sobre que esperar de su próxima tableta estrella.\nUtilizando su perfil en la red social china Weibo, esta firma ha decidido confirmar que será durante el próximo 21 de junio, y lo ha hecho publicando una imagen dónde se puede ver una sala de cine con su nueva tableta como pantalla; y lo hace presumiendo de unos marcos notablemente más reducidos respecto a los vistos en su generación anterior.\nEste fabricante ha preferido no hablar de sus características, pero numerosos rumores nos han adelantado que este dispositivo esconderá en su interior un SoC Kirin 980, el más potente de la firma en la actualidad; acompañado de dos chips NPU dedicados en exclusiva a la inteligencia artificial junto a dos versiones a elegir entre 4 y 6 GB de memoria RAM.\nReforzando su apartado multimedia tendremos una pantalla IPS de 10.7” con resolución QHD+ y soporte para contenidos HDR, una única cámara trasera de 13MP y una generosa batería con nada menos que 7.500 mAh con carga rápida; todo ello corriendo bajo Android 9 Pie con EMUI.\nTampoco echamos en falta cuatro altavoces Dolby Atmos con certificación Harman Kardon, sensor de huellas dactilares oculto bajo su pantalla, puntero M-Pen para tareas que requieran precisión como, por ejemplo, dibujar, o un Jack 3.5mm para poder utilizar unos auriculares convencionales sin necesidad de utilizar esos odiosos adaptadores.\nComo os habíamos adelantado, la nueva Huawei MediaPad M6 se anunciará el próximo 21 de junio en un evento convocado por esta compañía en China; dónde podría comercializarse inicialmente de forma exclusiva. Se desconoce si llegará a otros mercados internacionales, algo que dependerá de la acogida en su país natal y como avance el veto comercial de Estados Unidos.\nAdelanto Aspecto Diseño Especificaciones Ficha técnica Filtración Hardware Huawei Huawei MediaPad M6 Leak M-Pen MediaPad Tablet Tableta Weibo


PARTIDO POPULAR - Página 22\npor Máximo Escudero el Vie 4 Mar 2011 - 19:36\nHéctor Fernández. escribió: Mmm... ¿Salcedo n fue el que se fue del PP haciendo daño y criticando al Partido? algo de eso recuerdo....\nAsí fue. Yo era el Presidente, si no recuerdo mal.\nBastante cantamañanas, sí.\npor Héctor Fernández. el Vie 4 Mar 2011 - 23:20\n¿Y tu recuerdas lo que pasó exactamente? es que a mi me suena que hubo mal rollo, pero no me acuerdo exactamente de lo que pasó.\npor Alberto Rodríguez Conde el Mar 15 Mar 2011 - 11:41\nSolicito mi baja del partido tras larga ausencia (que aún no se si seguirá alargándose).\npor Héctor Fernández. el Mar 15 Mar 2011 - 15:14\nAdmin, quítale el acceso a la sede dle PP y en rango con el logo.\npor AdminComandante el Mar 15 Mar 2011 - 15:59\npuede darte de baja tu mismo, entra en grupo y poner algo como desescribir arriba\npor Fabián de la Torre el Mar 15 Mar 2011 - 16:55\nPerdona, Héctor, no había visto eseto.\nAntes de irse, Salcedo se dedicó a clamar al cielo por afirmar que el PP Nacional no le apoyaba. Además, votó a favor de alguna cosa tipo legalización de la marihuana en algún parlmento Autonómico, o algo así... Solo recuerdo que fue la primera y única persona a la que "invité a irse" del PP.\nHéctor Fernández. escribió: Aceptada.\nUna lástima la baja. Una buena notiia si vuelves, Alberto.\npor Alberto Rodríguez Conde el Miér 16 Mar 2011 - 0:16\nAdminComandante escribió: puede darte de baja tu mismo, entra en grupo y poner algo como desescribir arriba\nGracias, no tenía ni idea. Ya está.\npor Alejandro Estrada el Lun 11 Abr 2011 - 17:46\nAquí tienes el cuestionario que debes rellenar Alejandro.\nADMISION PARTIDO POPULAR\npor Alejandro Gutierrez el Lun 11 Abr 2011 - 18:25\nAlejandro Estrada escribió: Aquí tienes el cuestionario que debes rellenar Alejandro.\nMe considero una persona de centro derecha,liberal y sobre todo democrata ya que es la base por la cual se rige nuestra constitucion. Tambien tengo un gran orgullo y sentimiento español\nLa libertad individual de las personas, igualdad de derechos entre civiles y ante la ley pero siempre ha de ser diferenciado del libertinaje que es lo que predomina en nuestra actual sociedad\nEstoy en contra, ya que es un asesinato, una muerte provocada.\nAl igual que con la Eutanasia me declaro totalmente en contra ya que eso es asesinar a un ser vivo y cohibe la libertad a vivir\nNo, porque esta demostrado que es perjudicial para la salud y los gobiernos tienen que mirar por el bienestar y la salud de sus ciudadanos.\nRadicalmente en contra, es una verguenza que a esta union se le llame matrimonio.\nSi, puesto de lo contrario cohibiriamos la libertad de los ciudadanos en su creacion y gestion de empresa.\nEl actual pero con algunas reformas, pero siempre monarquico y democrata. Asegurar la seguridad y el bienestar de los ciudadanos\nEs absurdo ya que son ciertos sectores muy concretos en los cuales su conocimiento de lo que pasaria son muy escasos. Seria una autentica deblace para las regiones que lo consiguieran.\nEs la mas conveniente para un estado como el español, mas aun viendo lo que ha hecho este manarqua por el pueblo español. Estas personas que la siguen deberian tener alguna pena, aunque sea un estado democrata en el que se puede expresar tu opinion estas personas estan violando la constitucion, que en su tiempo tanto demandaban. Si, se deberia endurecer las penas\nEl de Adolfo Suarez, tuvo la dificil tarea de ejecutar la transicion\nNo, ya que españa no tenia nada que ver.\npor Alejandro Estrada el Lun 11 Abr 2011 - 18:29\nBien, a continuacion tu cuestionario pasara a nuestra sede y los miembros debatiremos sobre tu entrada, en cuanto tengamos respuesta, se te avisara.\nTen paciencia y suerte!!\npor Héctor Fernández. el Lun 11 Abr 2011 - 21:46\nAdmin, no me olvido, comprueba dobles cuentas, topos y demás.\npor Héctor Fernández. el Miér 13 Abr 2011 - 22:07\nAdmin, seguimos esperando.\nAlex, acosa a Jesús con privados.\nsu ip coincide con otra ip... ¿ tiene alguna explicacion?\npor Alejandro Estrada el Miér 13 Abr 2011 - 22:16\nDinos de quien coincide...\npor Héctor Fernández. el Miér 13 Abr 2011 - 22:24\nAlejandro Estrada escribió: Dinos de quien coincide...\npor AdminComandante el Miér 13 Abr 2011 - 22:26\nespera su explicacion.\npor Héctor Fernández. el Miér 13 Abr 2011 - 22:38\nAdminComandante escribió: espera su explicacion.\nContxo, mándamelo por mp aunque sea...\npor AdminComandante el Miér 13 Abr 2011 - 22:40\npor Héctor Fernández. el Miér 13 Abr 2011 - 22:50\nAdminComandante escribió: un socialista\nY DALE, nombre leche, el nombre\npor AdminComandante el Miér 13 Abr 2011 - 22:53\npor Pedro Morales el Jue 28 Abr 2011 - 18:53\nAlejandro Estrada escribió: Aquí tienes el cuestionario que debes rellenar.\nMe defino como persona conservadora,patriota y liberal en lo economico\nPersigue la libertad civil, en contra de cualquier autoridad por lo que lo considero anarquismo pero en realidad tienen las bases republicanas.\nAbria que mirar los casos pero generalmente estoy en contra es un asesinato\nEn contra al igual que ocurre con la eutanasia es un asesinato\nNo un estado como el español debe mirar por la salud de sus ciudadanos aun mas si ellos no lo hacen por si mismos.\nPara empezar no se puede llamar matrimonio a esa union porque eso es un rito religioso ademas estoy en contra.\nSi estoy a favor ya que de lo contrario se violaria la libertad de los ciudadanos, pero se debe tener cierta intervencion para garantizar algunos servicios basicos para la ciudadania como por ejemplo la sanidad\nDemocratico y monarquico como el actual. Asegurar el bienestar de sus ciudadanos y resolver sus problemas e inquietudes.\nSon personas con poca formacion en general por lo que no saben a ciencia cierta lo que les ocurria si pasara lo que ellos persiguen\nEs el sistema que prefiero ya que soy monarquico. Creo que eso no debe imponerse en España nunca por que ya tenemos experiencias negativas con republicas anteriores las cuales no han traido nada bueno. Si, para darle mas poder a aun a la monarquia.\nAznar y Suarez Aznar relanzo la economia y Suarez fue uno de los que mas lucho por la democracia.\nNo porque españa no tenia nada que ver en esa guerra\nBueno a medias en VP\npor Alejandro Estrada el Jue 28 Abr 2011 - 20:42\nGracias Pedro, como ya te he dicho por MP, ahora los miembros del Partido Popular tomaremos una decision y al cabo de dos o menos dias se te informará de tu acceso.\nA LA MODERACION/ADMINISTRADOR, QUIERO SABER SI ESTA LIMPIO.\npor Héctor Fernández. el Jue 28 Abr 2011 - 23:03\nMe sumo a la petición de Alex.\npor AdminComandante el Vie 29 Abr 2011 - 13:09\nsu ip coincide con antiguos jugadores, uno del PP y un canario\npor Alejandro Estrada el Vie 29 Abr 2011 - 17:46\nDinos quien es.


Detective - HeroFreaks\nDetective cuenta historias fascinantes, historias en las que participarás. Esperemos que puedas deducir la conclusión antes de que haya un nuevo crimen… El juego te desafiará con cinco casos distintos.\nDetective: Crímenes en L.A. es una expansión de Detective, un juego de investigación moderno. Este caso te transporta a los años 80 y a la ciudad de Los Ángeles que se ha convertido en un enjambre de corrupción, drogas y crímenes. Ha aparecido un caso inusual, pero se necesita un detective que no tenga miedo de hacer lo que sea necesario.\nDuración de la partida: 120 - 180 Minutos\nImportante: Es necesaria una copia de la caja básica del juego Detective para poder jugar a esta expansión.\nDetective: Sigue la Pista es una expansión de Detective: un juego de investigación moderno. La mecánica es la misma y utiliza la mayoría de las reglas del juego base. Este caso, te transporta a Boston en la década de los 70, donde tu objetivo es resolver el misterio de la prematura muerte de un político local.\n11,45€ Add to cart\nDetective: Temporada 1 es un juego completamente cooperativo e inmersivo en el que de 1 a 5 jugadores asumen el papel de investigadores que intentan resolver un crimen.


Cómo quitar pegatinas del vidrio de las ventanas nuevas |\nCuando compras ventanas nuevas, es más probable que un profesional vaya a tu vivienda a instalarlas. El equipo de instalación colocará las ventanas, pero no va a eliminar las pegatinas comerciales que hay sobre ellas. En este artículo te brindamos algunos consejos con toda la información que necesitas para quitar esas pegatinas. Además, la información también será útil para quitar cualquier tipo de pegatina que tus hijos adhieran sobre las ventanas.\nTrata de jalar las pegatinas para quitarlas. En algunos casos, las pegatinas nuevas saldrán sin demasiado esfuerzo. Realiza este paso antes de realizar los métodos siguientes.\nCorta un trozo del papel film que sea más grande que la pegatina. Humedece una cara del papel y adhiérelo sobre la pegatina de la ventana. Deja que se asiente durante 5 minutos y luego quítalo. La pegatina debería despegarse de la ventana junto con el papel film.\nVierte un poco de aceite para bebés sobre una bolita de algodón y frota la pegatina. Con el borde de una tarjeta de crédito, levanta los bordes de la pegatina y luego despega el resto con tus dedos.\nToma una o dos toallitas desinfectantes Clorox y apóyalas sobre las pegatinas durante un minuto. Luego, con la ayuda de tus uñas (o el borde de la tarjeta de crédito), levanta los bordes de la pegatina y despégala de la ventana.\nHumedece la pegatina con un poco de quitaesmaltes. Deja que la pegatina se ablande durante 5 minutos, luego quítala con una espátula.\nSalpica un poco de refresco de cola en el área de la ventana en donde está la pegatina. Este líquido ablanda el pegamento, de modo que la pegatina se podrá desprender con más facilidad.\nTambién puedes usar el lubricante WD-40 para quitar pegatinas de una gran variedad de superficies.\nDespués de realizar alguno de los métodos que mencionamos, deberás lavar las ventanas.


Posted: June 4th, 2009, by Matoga\nTags: nuevo vicario general de Lomas de Zamora, Pbro. Jorge Vázquez.\nCHARLA PARTICIPATIVA: DE HABITANTES A CIUDADANOS\n(Pastoral Social y Centro de Estudios de Doctrina Social de la Iglesia)\nSábado 6 de junio 17hs a 19hs.\nNUESTRA RESPONSABILIDAD ANTE LAS PRÓXIMAS ELECCIONES DEL 28 DE JUNIO\nNadie lo puede hacer por vos.\nTu rol es importante.\nUn proceso electoral limpio\nes la base de una democracia.\nNo es una tarea exclusiva\nde gobiernos y partidos .\nUna república se construye entre todos.\nSalón parroquial Sagrada Familia.\nPosted: June 1st, 2009, by Matoga\nTags: Santísima Trinidad.\nCIUDAD DEL VATICANO, 1 JUN 2009 (VIS).-La intención general del Apostolado de la Oración del Papa para el mes de junio es: “Para que la atención internacional a las naciones más pobres suscite una ayuda concreta, en especial para aliviarlas del abrumante peso de la deuda externa”.\nSu intención misional es: “Para que las Iglesias particulares que trabajan en las regiones azotadas por la violencia sean sostenidas por el amor y la cercanía concreta de todos los católicos del mundo”.\nTags: Intenciones, junio, oraciÃ³n, papa.\nPosted: May 29th, 2009, by Matoga\nDesde hoy, en el canal de TV de la parroquia, que se encuentra en Marana – Thá, haciendo “click” dende dice ON -DEMAND, podrán ver la mini serie Crónica de un Hombre Santo que la TV de la Universidad Católica de Chile realizara sobre la vida y obra de San Alberto Hurtado.\nCreo que su obra debería ser más divulgada…Creo que podemos aprender (o al menos deberíamos) mucho de este enorme santo chileno.\nTags: CrÃ³nica de un Hombre Santo, Padre Alberto Hurtado.\nFiled under: Media, Parroquia | No Comments »\nPosted: May 28th, 2009, by Matoga\nTags: Jornada de las Comunicaciones Sociales.\nBuenos Aires, 27 May. 09 (AICA) La Comisión Episcopal de Ecumenismo, Relaciones con el Judaísmo, el Islam y las Religiones, que preside monseñor Carlos Humberto Malfa, obispo de Chascomús, presentó hoy una guía pastoral sobre el sacramento del Bautismo en las relaciones de la Iglesia Católica con las demás iglesias y comunidades eclesiales, al que definió como un paso en el camino hacia la comunión real, aunque imperfecta o incompleta con los cristianos.\nEl prelado explicó que se reconoce como único y válido el Bautismo realizado mediante la administración o inmersión en agua con la forma trinitaria Padre, Hijo y Espíritu Santo, y subrayó que el Bautismo es imborrable e indeleble y fundamento del compromiso ecuménico de la Iglesia.\nDada la fragmentación religiosa de los cristianos, no siempre es posible dar una respuesta inmediata para certificar la validez de un Bautismo, por eso este subsidio es un aporte enriquecedor para un discernimiento iluminado de esos interrogantes, subrayó.\nEl obispo recordó que muchos papas a lo largo de la historia de la Iglesia aconsejaron que no es conveniente rebautizar, e insistió en la necesidad de avanzar en la reciprocidad en el reconocimiento mutuo del sacramento del Bautismo, como el suscripto por la Iglesia católica en la Argentina con la Iglesia Evangélica del Río de la Plata y la Iglesia Evangélica Luterana Unida.\nEn tanto, monseñor Gustavo Help, obispo de Venado Tuerto y miembro de la Comisión Episcopal, destacó que las ansias de unidad en el espíritu se llevan en el corazón y advirtió que sin unidad no hay vida y es necesario conducir la comunión en el encuentro con Dios:\nHay que clarificar las ideas para que la comunión sea verdadera y profunda, subrayó. A lo que monseñor Malfa acotó: Hay que priorizar el ecumenismo espiritual, es decir, descubrir que el acercamiento a Cristo nos acerca a los hermanos, mientras que el presbítero Fernando Giannetti, secretario ejecutivo de la Comisión, sostuvo que el objetivo en el camino ecuménico es buscar lo que nos une y no lo que nos separa.\nMonseñor Malfa negó que este reconocimiento del Bautismo pueda ser interpretado como proselitismo por parte de la Iglesia católica, porque como dijo Juan Pablo II la misión evangelizadora apunta a proponer la fe y no a imponerla. No obstante, aclaró que no se puede oponer el ecumenismo al mandato evangelizador y misionero.+\nPosted: May 27th, 2009, by Matoga\nVATICANO, 27 May. 09 En su habitual catequesis de los miércoles, el Papa Benedicto XVI pidió a los creyentes vivir el camino de la pobreza personal, aprender a renunciar, vivir con austeridad y sobriedad para lograr una sociedad solidaria.\nContinuando con el ciclo de catequesis sobre los grandes escritores de la Iglesia de Oriente y de Occidente de la Edad Media, en la Audiencia General de hoy, el Papa habló sobre San Teodoro el Estudita y señaló que “el compromiso a vivir la pobreza, la castidad y la obediencia distingue a los monjes con respecto a los seglares”.\nLa pobreza personal, continuó, “es un elemento esencial del monaquismo y también indica un camino para todos nosotros. Los monjes deben vivir de forma radical esta renuncia a la propiedad privada, la libertad de las cosas materiales, la sobriedad y la sencillez, pero el espíritu es igual para todos. No debemos depender de la propiedad material; debemos aprender la renuncia, la sencillez, la austeridad y la sobriedad. De este modo puede crecer una sociedad solidaria y se puede superar el gran problema de la pobreza de este mundo”.\nEl Papa explicó ante más de 15 mil peregrinos congregados en la Plaza de San Pedro que San Teodoro nació en el 759 “en el seno de una familia noble y piadosa”. Abrazó la vida monástica a los 22 años en el monasterio de Sakkudion. “A causa de su oposición al matrimonio adúltero del emperador Constantino VI, fue desterrado a Tesalónica en el 796. Sin embargo, al año siguiente pudo regresar a Sakkudion gracias a la intervención de la emperatriz Irene, que persuadió al santo a trasladarse al monasterio de Studios para evitar las incursiones de los sarracenos”.\nSan Teodoro “capitaneó la resistencia contra la iconoclasia de León V el Armenio”, lo que le costó otra vez “el exilio en diversos lugares de Asia Menor. Al final, pudo volver a Constantinopla, pero no a su monasterio. Murió el año 826”.\nBenedicto XVI subrayó que “San Teodoro se distinguió en la historia de la Iglesia por ser uno de los grandes reformadores de la vida monástica y también como defensor de las imágenes sagradas durante la segunda fase iconoclasta, junto al patriarca de Constantinopla, San Nicéforo”.\nSan Teodoro “insistió en la necesidad del orden y de la sumisión por parte de los monjes para que el monasterio fuese de nuevo una verdadera comunidad orgánica, una verdadera familia, o como dice él, un verdadero “Cuerpo de Cristo”, teniendo en cuenta que las persecuciones habían obligado a dispersarse a los monjes.\n“Una convicción de fondo de Teodoro es que los monjes asumen el compromiso de observar los deberes cristianos con mayor rigor e intensidad para ofrecer un signo, una indicación a todos los cristianos. Por eso, pronuncian una especial profesión, como un “nuevo bautismo”.\n“Las renuncias principales para San Teodoro son las exigidas por la obediencia, que califica como ‘martirio de la sumisión'”. En este contexto, el Santo Padre destacó que “el tejido social no puede funcionar si cada uno se sigue únicamente a sí mismo; solo aprendiendo la sumisión, la obediencia al bien común, a las reglas de la vida común, puede sanar una sociedad y Dios mismo puede sanar de esta soberbia que está en el centro del mundo“.\n“Para Teodoro el Estudita, una virtud importante junto a la obediencia y a la humildad, es la philergia, es decir, el amor al trabajo”, pero “no admite que bajo el pretexto de la oración y de la contemplación, el monje se dispense del trabajo, que en realidad es el medio para encontrar a Dios”.\nBenedicto XVI destacó que el santo era “el padre espiritual de sus monjes, estando a su disposición para escuchar sus confidencias. Además, aconsejaba espiritualmente a muchas personas fuera del monasterio”.\n“La Regla, que fue codificada poco después de la muerte de Teodoro y adoptada con algunas modificaciones en el Monte Athos, sigue siendo de gran actualidad”, aseguró el Papa.\nEl Santo Padre concluyó afirmando que “hoy existen numerosas corrientes que insidian la unidad de la fe común y conducen a un individualismo espiritual peligroso, también de soberbia espiritual. Es necesario comprometerse en defender y hacer que crezca la perfecta unidad del Cuerpo de Cristo, en la que pueden componerse en armonía la paz del orden y las relaciones personales sinceras en el Espíritu”.\nTags: El Papa.\nSan Nicolás (Buenos Aires), 26 May. 09 (AICA) Una multitud de fieles participó ayer en San Nicolás de la celebración eucarística de coronación canónica de la imagen original de María del Rosario, advocación mariana que se venera desde hace más de 25 años.\nEn medio de fuegos artificiales y de vivas a la Virgen, el obispo de San Nicolás de los Arroyos, monseñor Héctor Cardelli, procedió a colocar, cuando el reloj marcaba exactamente las 16.29, las coronas de plata y oro, confeccionadas por el orfebre Juan Carlos Pallarols con donaciones de los devotos, sobre la imagen de la Virgen y también del niño Jesús que lleva en sus brazos.\nPreviamente, hubo una procesión por los alrededores del campito de la Virgen, donde se celebró la Eucaristía concelebrada por los arzobispos Mario Maulión, de Paraná; José Luis Mollaghan, de Rosario; Eduardo Mirás, emérito de Rosario, y los obispos Luis Eichhorn, de Morón; Santiago Olivera, de Cruz del Eje; Gustavo Help, de Venado Tuerto; Luis Stöckler, de Quilmes; Juan Horacio Suárez, de Gregorio de Laferrère, y Reinaldo Bredice, emérito de Santa Rosa.\nLa coronación fue precedida por una procesión con la imagen réplica de la Virgen, cuya salida del templo fue bajo una lluvia de pétalos de rosa.\nMonseñor Cardelli dijo en la homilía que esta corona resume el querer de todos, es un gesto de alegría y de gozo que nace del reconocimiento de tu humilde, silencioso y fecundo servicio que estamos felices por recibir y de alguna manera, queremos expresar la prioridad que le damos de nuestra parte.\nEres la reina del corazón, de la mano tendida, del cobijo y el acompañamiento, del estar y caminar juntos, de tu mirada serena y de tu ofrenda divina al entregarnos a tu Hijo. Eres la inspiradora de nuestros grandes ideales de comunión y fraternidad, ayudándonos a vivir en la alegría y en el dolor, en la siembra, en la poda y la sazón del fruto que madura al calor de tu mirada. Has entrado en el quehacer cotidiano de nuestras vidas, haciendo de nuestras casas tu Nazaret; de nuestras vidas, tu misión; de nuestras conductas, tu obrar; de nuestra oración, tu disponibilidad, a lo que Dios te pidió, de nuestras comunidades, la fraternidad que nos imprime tu presencia de madre, destacó.\nEl artista reveló que “la Virgen de San Nicolás pidió en uno de sus últimos mensajes que le pusieran una corona, pero aclaró que será ‘puesta por el pueblo’, por eso el obispo me encargó llevarla por todo el país”.\nLa imagen de María del Rosario fue bendecida en Roma en 1884 por el Papa León XIII, mientras el rosario que porta recibió la bendición de Juan Pablo II. A pedido del obispo Cardelli, Benedicto XVI hizo lo propio con las cruces que integrarán las coronas que portarán la Virgen y el Niño.+\nTags: María del Rosario de San Nicolás.\nPosted: May 24th, 2009, by Matoga\nEl obispo, Mons. Benítes Astoul y las autoridades de la Escuela Santa Teresa de los Andes, dependiente del arzobispado de Buenos Aires, obraron correctamente, pero la exposición de los hechos a través de los medios de comunicación llevaron el caso a un marco de gran confusión y manipulación, implicando a personas e instituciones que en su momento actuaron buscando el bien de los menores, dice un comunicado que será leído en todas las parroquias e iglesias de la capital federal al término de las misas vespertinas del sábado, y de todas las que se celebren el domingo próximo. El comunicado está firmado por el Consejo Episcopal, presidido por el arzobispo de Buenos Aires, Card. Jorge Bergoglio, e integrado por los obispos auxiliares Joaquín Sucunza, vicario general; Eduardo García, provicario general; Raúl Martín, Oscar Ojea, Enrique Eguía Seguí y Luis Fernández, vicarios episcopales respectivamente de Devoto, Centro, Flores y Belgrano. El texto del comunicado puede verse en la noticia completa.\nBuenos Aires, 22 May. 09 (AICA): Arzobispado de Buenos Aires El obispo, monseñor Horacio Ernesto Benítes Astoul y las autoridades de la Escuela Santa Teresa de los Andes, dependiente del arzobispado de Buenos Aires, obraron correctamente, pero la exposición de los hechos a través de los medios de comunicación social llevaron el caso a un marco de gran confusión y manipulación, implicando a personas e instituciones que en su momento actuaron buscando el bien de los menores, dice un comunicado que será leído en todas las parroquias e iglesias de la capital federal al término de las misas vespertinas de mañana, sábado, y de todas las que se celebren el domingo próximo.\nEl comunicado está firmado por el Consejo Episcopal de la arquidiócesis de Buenos Aires, organismo presidido por el arzobispo de Buenos Aires, cardenal Jorge Mario Bergoglio SJ, e integrado por los obispos auxiliares Joaquín Mariano Sucunza, vicario general; Eduardo Horacio García, provicario general; Raúl Martín, Oscar Vicente Ojea, Enrique Eguía Seguí y Luis Alberto Fernández, vicarios episcopales respectivamente de Devoto, Centro, Flores y Belgrano.\nCon respecto a los hechos ocurridos esta semana, vinculados al Hogar San José Obrero, de la Fundación Felices los Niños, queremos aclarar algunos puntos:\n1. El Obispo, monseñor Benítes Astoul y las autoridades de la Escuela Santa Teresa de los Andes, dependiente del arzobispado de Buenos Aires, obraron correctamente.\n2. Luego de un informe presentado por la Vicaría de la Educación del arzobispado, y considerando la seriedad de los hechos, se realizó un trámite al cual están obligadas todas las personas e instituciones cuando esos hechos suceden con menores. Este trámite consiste en una presentación o comunicación ante la justicia. No es una denuncia, sino que se comunica a la justicia lo conocido en el informe para que ella actúe si lo cree necesario.\n3. La Jueza interviniente y el Defensor de menores consideraron oportuno iniciar una investigación a través de personal idóneo, profesionales, peritos y psicólogos especialistas, encontrando una serie de irregularidades, muchas de las cuales constaban en los mismos legajos y partes diarios del Hogar. Estas irregularidades fueron dadas a conocer ampliamente a través de informaciones públicas.\n4. La exposición de los hechos a través de los medios de comunicación social llevaron el caso a un marco de gran confusión y manipulación, implicando a personas e instituciones que en su momento actuaron buscando el bien de los menores: monseñor Benítes Astoul, autoridades de la escuela, el párroco de la zona, y otros.\n5. Para evitar mayores conflictos, especialmente teniendo en cuenta el cuidado de los niños y adolescentes allí alojados, la Jueza ha pedido al Arzobispado de Buenos Aires, a través de la Comisión de Pastoral Social, se haga cargo de la custodia de los menores que aún quedan en el Hogar, hasta que se cumpla a la brevedad lo dictaminado por ella.\nBuenos Aires, 21 de mayo de 2009.\nEn segundo lugar, sería óptimo que este texto, presentando la enseñanza y la disciplina vigente de la Iglesia católica, alentara a alguna de nuestras iglesias diocesanas a dar pasos concretos hacia un reconocimiento recíproco del bautismo con las iglesias y comunidades eclesiales presentes en su región. Un paso semejante ofrecería referentes claros para todos. Sin duda que esto puede comprometer, y es aún tarea en parte pendiente, a teólogos en cuanto a la iluminación-, y a la jerarquía en cuanto a decisiones concretas-, pero esto no ahorra el resto de los cristianos una parte de responsabilidad. ¿Cuál por ejemplo?\nSi leemos el subsidio en su totalidad y en el orden de presentación, podremos ser más conscientes de que si hay alguna respuesta que puede iluminar un caso concreto que se nos ha presentado ¿este bautismo es válido?-, a esa respuesta se llega a través de una fundamentación teológica, que la Iglesia se ha encargado de fundar y explicitar. No hay norma disciplinar que busque expresar, a su modo, una afirmación doctrinal. El mayor conocimiento de la fundamentación nos ofrecerá los elementos que quizá necesitemos cuando la respuesta no esté escrita y, por eso mismo, sea necesario realizar un discernimiento pastoral in situ.\nTags: El sacramento del bautismo.\nPosted: May 22nd, 2009, by Matoga\nEl siguiente es el cronograma para la Vigília de Pentecostés que se realizará en el Santuario Basilica de la Sagrada Familia de Nazareth,de la ciudad de Banfield, el sábado 30 de mayo.\nLa celebracion se realizará a partir de las 18.30 hs hasta las 24hs\n18.30 a 20 hs – reuniones de grupos, por un lado los jovenes de Acción Católica y por otro las agrupaciones parroquiales con los miembros de la comunidad que asistan aun cuando no pertenezcan a ningun grupo particular\n20 a 21 hs cena a la canasta.\n21 a 22 hs. Momento de oración\n22 a 23 hs misa de la vigilia.\n23 a 24 hs hora santa de adoracion al Espiritu Santo.\nTags: Vigília de Pentecostés.\nFiled under: Diócesis, Espiritualidad, Oraciones, Parroquia | No Comments »\nPosted: May 20th, 2009, by Matoga\nBuenos Aires, 20 mayo 09 (AICA) Con motivo del Año Sacerdotal convocado por el papa Benedicto XVI, a partir de junio próximo, la Conferencia Episcopal Argentina envió una carta a los sacerdotes en la que los obispos les agradecen su fidelidad ministerial”, los animan e invitan a “renovar la alegría de la fe, la firmeza de la esperanza y el gozo del ministerio recibido, y los llaman a ser pastores y padres de la comunidad.\nTras reconocer que la escasez de vocaciones, dicen sentirse especialmente cercanos a quienes atraviesan momentos de tribulación o viven su ministerio en situaciones de particular exigencia: periferias urbanas y rurales; soledad, enfermedad, pérdida del sentido de la acción pastoral; incomprensión y desaliento, y exhortan a los sacerdotes a tomar a San Juan María Vianney, al venerable José Gabriel Brochero y al Siervo de Dios Eduardo Pironio, entre otros, como ejemplos de discípulos misioneros de Jesús Buen Pastor.\nNos disponemos a comenzar el próximo mes de junio el Año Sacerdotal especial, propuesto por el Papa Benedicto XVI al cumplirse los 150 años de la muerte del Santo Cura de Ars. El Santo Padre nos invita a meditar sobre la fidelidad de Cristo y la fidelidad del sacerdote.\nComo San Pablo decimos: Cristo me amó y se entregó por mí (Gal 2,20). Y como el amor de Cristo nos apremia (2 Cor 5,14), sentimos la urgente necesidad de anunciar a otros la Buena Nueva hasta exclamar con el Apóstol: Ay de mí si no predicara el Evangelio (1 Cor 9,16)\nEn efecto, queridos hermanos, el sacerdocio es Misterio de Amor recibido y entregado, actualizado cada día en la celebración eucarística y en el don generoso de la propia vida hasta el extremo (Jn. 13,1). Es hermoso vivirlo con radicalidad, como todo amor verdadero. Por eso la Iglesia ha visto desde sus inicios una múltiple armonía entre sacerdocio y celibato y llama al ministerio presbiteral a quienes han recibido y aceptado libremente vivir este fecundo carisma de entrega total. Asumidos por Cristo Cabeza y Esposo, los sacerdotes estamos llamados a ser signos fecundos del amor de Cristo a su Iglesia, pastores y padres de la comunidad. Esta verdad sólo se puede comprender y vivir a la luz de la fe, animada por el fervor de la caridad, en la espera gozosa de la plenitud del cielo.\nPero como todo amor humano es vulnerable, -llevamos este tesoro en recipientes de barro (2 Cor 4,7)-, necesitamos también acoger la invitación de San Pablo a Timoteo: te recomiendo que reavives el don de Dios que has recibido por la imposición de mis manos (2 Tim, 1,6). La lectura orante y la predicación de la Palabra de Dios; la celebración gozosa de la Eucaristía y de toda la liturgia; el servicio fiel, paciente y generoso a los fieles, sobre todo a los pobres y enfermos, son el camino indispensable para ir forjando cada día más en nosotros los sentimientos y la imagen de Jesús, el Buen Pastor.\nLomas de Zamora (Buenos Aires), 19 mayo 09 (AICA) Mañana a las 19.30, en la catedral Nuestra Señora de la Paz (Sáenz 438, Lomas de Zamora), se presentará La catedral de Lomas de Zamora, historia y memoria de un templo bonaerense, obra póstuma del arquitecto Alberto S.J. de Paula.\nEl acto es organizado por la Comisión Nacional de Museos, Monumentos y Lugares Históricos -que De Paula presidió hasta su muerte el 10 de mayo de 2008- y la Fundación Fondo para el Patrimonio Argentino y el Instituto Histórico Municipal de Lomas de Zamora.\nLa obra fue redactada en colaboración con el doctor Oscar Andrés De Masi y publicada por la Editorial Eustylos (colección MonumentArgentina).\nEl arquitecto De Paula era además una voz de consejo dentro del obispado lomense en el ámbito de la historia y de la conservación del patrimonio de la Iglesia.\nPara mayor información: comisiondemuseos@yahoo.com.ar.+


Puedo prometer y prometo, que de lo prometido…, mierda! (en Pamplona) – IBASQUE.COM\nPuedo prometer y prometo, que de lo prometido…, mierda! (en Pamplona)\nPais Vasco - Juan martes, 12/Jun/2007 0\nviagra «sans-serif»»>Puedo prometer y prometo que de lo prometido…, medic mierda! (enPamplona)\nimpotent «sans-serif»»>En los mitines últimos de la campaña electoral el PSN hablaba de «abrir las puertas de la ciudad» (Torrens, el 23 de mayo) y de «huracán de cambio» (Chivite). Conozco muchos/as socialistas que ayer y hoy están tristes por el engaño realizado en el Ayuntamiento de Pamplona.\nRamón Sola, en un comentario titulado Del «orear Pamplona» a las palabras que se llevó el viento hace una buena relación de este engaño a los pamploneses:\n“Torrens hizo las afirmaciones anteriores en el mitin del PSOE del 23 de mayo, en Baluarte de Iruñea, ante el ex presidente del Gobierno español Felipe González. Carlos Chivite, secretario general del PSN, le introdujo hablando de también de nuevos aires; más aún, de «huracán de cambio». Cuatro días antes, ante la vicepresidenta de Zapatero, María Teresa Fernández de la Vega, Torrens había prometido que, al contrario que Barcina, «yo no haré ciudadanos de primera y de segunda». Censuró a UPN que «confunda el Paseo de la Castellana con el de Sarasate», que «traiga aquí a los monigotes del guiñol del PP» y que «perturbe la tranquilidad de esta ciudad». Y añadió como contrapunto: «Nosotros no tenemos precio, tenemos principios».\nDos semanas antes, el candidato del PSN se había estrenado también en Baluarte ante José Luis Rodríguez Zapatero, que le ovacionó cuando Torrens dijo con énfasis que «estamos cansados, hartos de esta forma de gobernar». «Basta ya de mirarse al ombligo y olvidarse de la mayor parte de la ciudadanía. Basta ya del olvido sistemático de los movimientos y de los colectivos que no se han plegado a su voluntad», añadió el alcaldable. Luego tomó el turno Fernando Puras, que avanzó por la misma senda: «La sociedad navarra quiere cambio, ¿cómo no lo va a querer si está harta del Gobierno y de Sanz?». Es el PSN de siempre. El del pánico a que cualquier cambio, profundo o no, le perjudicará electoralmente”\nVolver a dejar el ayuntamiento en manos de Barcina-UPN, por tercera vez consecutiva, es una traición al electorado al que prometió el cambio. Que como excusa pongan que no quieren que los de ANV voten, es una infamia a la democracia. ¡Qué bajo has caído PSN!,


Jorge Saavedra, de Omnicom Media Group, campeón de la primera Azerion Race - IPMARK | Información de valor sobre marketing, publicidad, comunicación y tendencias digitales\nJorge Saavedra, de Omnicom Media Group, campeón de la primera Azerion Race\nAzerion, la plataforma digital de entretenimiento y medios de comunicación, concluye con éxito la primera edición en Madrid de la Azerion Race, carrera de coches gaming coorganizada con los principales grupos de agencias de medios. Jorge Saavedra, de Omnicom Media Group, se ha alzado como el máximo campeón.\n15/06/2022 Ana Egido 619 Views Gaming\nDurante dos semanas y con un gran éxito de participación, Azerion ha llevado a las oficinas de WPP, Publicis Group, Mediabrands, Havas Media Group, Omnicom Media Group y Dentsu, la competición de gaming donde los empleados luchaban entre ellos, representando a su grupo de agencias para hacerse con el título de campeón de la Azaerion Race.\nLa competición, que congregó a más de 600 inscritos, consistía en hacer el mejor tiempo en un circuito de carreras virtual pilotando un simulador de coches. Durante cada participación, los jugadores han podido ver una campaña display programática del formato in-game.\nCon esta acción, Azerion pretende mostrar las posibilidades de este formato publicitario inmersivo que no interfiere en el desarrollo de la partida. Gracias al novedoso emplazamiento gaming, los empleados de las agencias pudieron ver, en tiempo real, los logos de sus agencias totalmente integrados en el escenario del videojuego mientras recorrían el circuito de la competición.\nEsta semana se comunica la lista de los pilotos ganadores con los mejores tiempos, siendo Jorge Saavedra de Omnicom Media Group el máximo campeón de la Azerion Race; Alejandro Lahera de WPP, Francisco Martínez de Dentsu, Carlos Fernández de Publicis Group, Jesús Chercoles de Mediabrands, y Luis Moneje de Havas Media Group cómo subcampeones de cada agencia. A lo largo de estos días se entregarán los premios.\n«Estamos muy satisfechos de haber mostrado en una simulación real como la Azerion Race las posibilidades que ofrece el gaming, y en concreto el formato In-Game, para las marcas. Agradecemos enormemente la participación de todos los grupos de agencias y esperamos poder repetir nuevas ediciones próximamente”, afirma Dominique Loumaye, director general de Azerion en España.\nAzerion Race persigue consolidarse en una competición de frecuencia anual en su edición de Madrid y Barcelona.\n← Risi garantiza un 70% de llenado en sus bolsas de patatas fritas\n→ El primer metaverso inmersivo del fútbol verá la luz para el Mundial de Qatar 2022\nNace Witailer STAT, la herramienta que identifica oportunidades de negocio en Amazon\n09/06/2022 09/06/2022 Laura Briones\nGoogle lleva Privacy Sandbox a Android y pone fin a su identificador


¿Cómo conquistar a una chica 2 años menor que yo? - Adolescentes - Todoexpertos.com\nAnónimo el 21 ago. 13\nVoy a hacer mi pregunta rápido y específico. Cuando salía de la escuela (Voy en 2do Año, tengo 14) vi a una chica HERMOSA con todas las letras XD, que tiene 13 (va a 7mo Grado) y me gusta mucho. El tema es que no me conoce, solo yo la conozco a ella de vista, pero enserio me gusta mucho. ¿Cómo hago para acercarme y después conquistarla?.\nBueno primero que nada tienes que ver alguna forma de hacerte amigo de ella. No la agregues al facebook sin antes conocerse posta que queda muy fantasma. ¿Y cómo hacerlo de manera mas rápida? Bueno fijate con que amigos/as se junta, si tienen algún amigo en común, eso seria un punto a favor tuyo. Otra forma es que veas que actividades hace en la escuela, otra es que busques algún momento para acercarte a ella y buscar algún pretexto para hablar, como por ejemplo: que lindo clima, ¿te ayudo con tal cosa?. Suena un poco idealista pero personalmente me parecen las formas mas cuerdas de acercarse a una persona. Osea situaciones sencillas que se dan naturalmente.\nY bueno si ya diste ese paso, podes seguir con el siguiente y mas importante. CONOCERSE , aquí se define todo, si se caen bien, si pueden mantener una charla, salir, etc, en fin como una relación de verdaderos amigos. Pero bueno conocer a una persona en toda su dimensión toma mucho tiempo. Pero bueno lo mínimo podes conocerla para ver que onda .\nY si te fue bien en el paso 2, hubo conexión entre vos y ella, felicidades :D . empieza otra etapa que es salir, tener citas, pasar momentos juntos, etc.Aqui algo importante es que si llegan a gustarse y eso, VAYAN DESPACIO,si me decis que te gusta mucho cuidala. Lo que viene facil, facil se va. Y si no hubo conexión, me parece que es lindo también conservar una amistad ! :) Éxitos con todo esto.\nNo te olvides de cerrar la pregunta, contame si queres como te va con esto saludos :) cami\nEl Big problema es que vamos a la misma escuela, pero esta dividida en dos, yo en secu y ella en primaria. Por lo tanto, necesito encontrar otra forma de acercarme. Había pensado en preguntar la hora, pero aparte soy tiiiiiiiiiiiimiiiiiiiddoooooooo.\n¿Preguntarle la hora a ella?. Y bueno pero que este dividida en dos no impide que puedas acercarte a ella, fijate en lo que detalle arriba, va a ser un poquito mas complicado pero si se puede :). Otra cosa que te digo, si tiene 13 años esta en plena edad de cambios, mas las chicas somos un torbellino, no te digo todas las mujeres pero a la gran mayoria nos pega mal los cambios, que no te sorprenda que sea indecisa, fria, y al momento piola, pero yo no la conozco asi que puede que sea tranquila como no.\nTrata de vencer, poquito a poco la timidez, porque posta (te lo digo por experiencia propia) no te lleva a nada. Es más te limita mucho, pero con esto no quiero que entiendas que seas un loco extrovertido, bueno todo depende de vos. Pero a lo que voy es que hay que ser equilibrado, sencillo ser natural. Y no tener miedo a hablar con las personas, no nos van a comer jaja :). Tal vez digas que es dificil, pero te digo que no porque si ponemos un poco de voluntad todo se puede!. Contame como te va ! Exitos!\nSi desde un principio hubiera sabido todos los trucos de seducción no me habría tardado en descargarlo, pues desde que lo vi pasaron dos meses para que lo descargara realmente estoy sorprendido con los resultados, nunca imagine que esto pudiera haber sido tan fácil, y es que es cierto lo que dicen… El que tiene la información tiene el PODER.\nAquí te dejo la pagina para que lo veas http://unseductorirresistible.com/trucos-de-seduccion\nY yo sigo con mi vida conquistando y seduciendo mujeres guapas de mi universidad.\n¿Qué hago si el chico que me gusta ya no me habla como antes?\nEste chico es mi amigo y no la pasábamos muy padre, de echo casi siempre hablábamos y la mayoría del tiempo me hacia reír y molestarme a veces, en clase siempre nos tocaba juntos y nos enojábamos de broma y así incluso varias veces nos mirábamos...\nTengo 18 años y mis papas me prohibieron ver a mi novio por que se enteraron que tuvimos relaciones sexuales\nTengo 18 años y llevo 11 meses en una relación pero mis papas se opusieron a ella por que se enteraron que tuve relaciones sexuales con mi novio y esty muy triste por eso, amo al chico que era mi novio y voy a cumplir 2 meses sin verlo por que mis...\n¿Por qué a mi hija de 7 años la dejan de lado?\nHace un par de meses estoy viviendo una situación muy triste con mi hija de 7 años, no se porque, pero últimamente la dejan mucho de lado su grupo de amigas, a veces la buscan solo por compañía, porque al momento que llegan las otras niñas le hacen...\n¿Cómo hacer que una chica me busque?\nPorque tener novio es tan difícil para mi ?


Maserati Grecale: versiones de más de 300 CV y etiqueta ECO acompañan al primer eléctrico de la marca – Consultores Lizarazo.net\nConsultores Lizarazo.net > IT Technology > Maserati Grecale: versiones de más de 300 CV y etiqueta ECO acompañan al primer eléctrico de la marca\nPantalla de 12,3 pulgadas para el sistema de infoentretenimiento. Pantalla auxiliar de 8,8 pulgadas para funciones accesorias. Sistema operativo basado en Android Automotive con función “Hey Maserati”.\nLa experiencia de uso correrá a cargo del sistema multimedia Maserati Intelligent Assistant (MIA), su sistema de infoentretenimiento de última generación, con Maserati Connect y basado en Android Automotive, con función “Hey Maserati” para los comandos de voz. Se podrá incluir el sistema de sonido envolvente Sonus faber 3D, con 14 o 21 altavoces, según el acabado elegido.