85 49 Descargar (1)\nPROBIÓTICO EN BOVINOS HOLSTEIN\nYESENIA CABALLERO CERVANTES\niii AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS CON\nPOTENCIAL PROBIÓTICO DE BOVINOS HOLSTEIN\nYesenia Caballero Cervantes, MC\nColegio de Postgraduados, 2014.\nEl principal problema de salud en becerras de reemplazo son las diarreas provocadas por Escherichia coli enterotóxica. El uso de microorganismos pertenecientes al grupo de\nbacterias ácido lácticas (BAL) en la etapa de lactancia es benéfico para combatir la incidencia de diarreas e incrementar la ganancia de peso.Sin embargo, se ha reportado inconsistencia en los efectos benéficos de los productos comerciales. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue aislar y seleccionar BAL con potencial probiótico de mucosa oral de becerros lactantes, calostro y leche de vacas Holstein que puedan ser consideradas para el suministro de becerras en México. Para ello, se realizó el aislamiento en caldo Man Rogosa Sharp (MRS) y en agar MRS para la obtención de colonias puras, se establecieron pruebas morfológicas y bioquímicas para su identificación. En base a su morfología de bacilos y cocobacilos se seleccionaron cepas para ser sometidas a condiciones de pH ácido (4.0 y 4.5) usando HCl al 1N y sales biliares (0.3 y 1.5 g de Oxgall) para valorar su resistencia a ambas condiciones. En este estudio fueron seleccionadas 27 cepas ácido lácticas, por sus características morfológicas y bioquímicas, pero finalmente solo se seleccionaron siete cepas; dos de leche (V1/CP, V1/C2 CP), tres de calostro (V2/1 R.X, V3/1R.X, V5/3C2 R.X) y dos de mucosa oral (B1O/1-2MB2, B3O/1-1AB) por su potencial probiotico. Estas se identificaron mediante el Sistema API50CHL como Lactobacillus brevis, Lactococcus lactis Leuconostoc mesenteriodes, Lactobacillus salivarius y L. plantarum. En\nconclusión, todas las cepas aisladas del ganado Holstein coincidieron positivamente con las características morfológicas y bioquímicas de las bacterias acido lácticas, además las siete cepas seleccionadas mostraron la mayor resistencia y capacidad de crecimiento a pH 4.0 y a las dos concentraciones de sales biliares (0.3 y 1.5 g).\niv Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria with Probiotic Potential in\nThe main health problem in replacement heifers is diarrhea caused by enterotoxic\nEscherichia coli. The use of organisms belonging to the lactic acid bacteria (LAB) during\nmilking is beneficial to combat diarrhea incidence and increase weight gain. However, inconsistencies have been reported in the beneficial effects of commercial products. Because of this, the objective of this study was to isolate LAB with a probiotic potential from the oral mucosa of lactating calves, colostrum, and milk from Holstein cows that can be considered for heifers in Mexico. For this, isolation was done in Man Rogosa Sharp (MRS) broth and MRS agar to obtain pure colonies. Morphological and biochemical tests were run to identify them. Based on morphology of the bacilli and coccobacilli, strains were collected to be subjected to acid pH (4.0 and 4.5) conditions using HCl at 1N and bile salts (0.3 and 1.5 g Oxgall) to assess their resistance to both conditions. In this study, 27 lactic acid strains were selected based on their morphological and biochemical characteristics. Finally, only seven strains were selected: two from milk (V1/CP, V1 C2 CP), three from colostrum (V2/1 R.X, V3/1R.X, V5/3C2 R.X), and two from oral mucosa (B1O/1-2MB2, B3O/1-1AB), due to their probiotic potential. These were identified through the API50CHL System as Lactobacillus brevis,\nLactococcuslactis,Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus salivarius, and L. plantarum. In Conclusion, all the strains isolated from Holstein cows positively\ncoincided with the morphological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria. Moreover, the seven selected strains showed the greatest resistance and growth capacity at pH 4.0 and both bile salt concentrations (0.3 and 1.5 g).\nA mis Padres y hermanos por su amor y comprensión.\nA mis hermanas Abelina y Maribel Caballero por su confianza y apoyo incondicional para poder realizar mis estudios profesionales ya que sin ellas no hubiera sido posible.\nA todos mis sobrinos y sobrinas sin excepción con todo mi amor ya que son parte fundamental de mi vida.\nA mi amigo Gabriel Lira por su amistad, enseñanzas y consejos que desde hace muchos años me ofrece y que han sido muy importantes para mi vida profesional.\nEn especial a la Dra. Guillermina Bañuelos ya que gracias a su motivación y ayuda me decidí a vivir esta nueva experiencia.\nA mi amiga Paty Landa por su amistad y por compartir conmigo sus conocimientos pero sobre todo por trabajar en mi proyecto como si fuera suyo.\nCon todo mi afecto a mis amigos de Ganadería: Sara, Haydee, Rox y Julio que siempre estuvieron apoyándome y compartiendo momentos especiales e inolvidables.\nA Don Agustín del laboratorio de Microbiología, por su amistad. A Anita (personal administrativo) por su ayuda de siempre, desde el primer día que llegue a Ganadería. Y a mis amigas que encontré en el laboratorio 222 de Fitopatologia, por su apoyo.\nA DIOS simplemente por todo.\nAl Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca número 442752 otorgada, que hizo posible la realización de mis estudios de maestría.\nAl Colegio de Postgraduados y al Programa de Ganadería por darme la oportunidad de formar parte del grupo. A la línea 7 LPI: Inocuidad, Calidad de alimentos y Bioseguridad del Colegio de Postgraduados, por financiar parte de este proyecto,\nA la Dra. Blanca E. García Almendárez, Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma de Querétaro. Por haber aportado la cepa control L.casei.\nA mi Consejero el Dr. J. Efrén Ramírez Bribiesca por la confianza que tuvo en mí y por su apoyo en todo el periodo de maestría.\nMuy especialmente a mi asesora la Ph. D. Ana María Hernández Anguiano, del\nPosgrado de Fitosanidad, por adoptarme y recibirme en su laboratorio, por sus enseñanzas y su paciencia, por sus consejos y por motivarme siempre a dar lo mejor de mi, ya que gracias a su dedicación y ayuda fue posible presentar mi proyecto en dos Congresos Internacionales.\nEn especial a mi asesor el Ph. D. David Espinosa Victoria por aceptar formar parte de\nmi Consejo pues su apoyo y colaboración fue fundamental para todo el desarrollo de mi proyecto de investigación.\nAl Dr. David Hernández, por su apoyo y asesoría.\nAl Dr. José Guadalupe Herrera Haro, por su valiosa ayuda y paciencia.\nII.JUSTIFICACIÓN ... 3\nIV. HIPÓTESIS ... 4\nV. REVISIÓN DE LITERATURA ... 5\n5.1 Sistema digestivo de becerras lactantes ... 5\n5.1.2 Fisiología de la microbiota intestinal ... 8\n5.2 Probioticos ... 11\n5.2.1Historia y definición de los probióticos ... 11\n5.2.2 Los probióticos y la salud ... 12\n5.2.3 Bacterias potencialmente probióticas ... 13\n5.2.4 Bacterias ácido lácticas ... 14\n5.2.5 Respuesta ácido tolerante de Lactobacillus……….19\n5.2.6 Actividad probiótica en el animal ... 20\n5.2.7 Mecanismo de acción de los probióticos ... 23\n5.3 Métodos de identificación para bacterias probióticas ... 24\n5.4 Criterios para la evaluación de los probióticos ... 24\n5.5 Guía para la evaluación de los probióticos ... 25\nVI. MATERIALES Y MÉTODOS ... 27\n6.1 Aislamiento de bacterias probióticas a partir de muestras de mucosa oral de becerros de leche y calostro de vacas Holstein ... 27\n6.2Selección y evaluación de bacterias con potencial probiótico de acuerdo a características morfológicas de las cepas y pruebas bioquímicas ... 31\n6.3Determinación de la resistencia y supervivencia de las cepas seleccionadas a condiciones de pH ácido y a sales biliares ... 35\n6.4 Identificación bioquímica de las cepas mediante el sistema API50CHL y colección de cepas con potencial probiótico... 38\n7.1 Aislamiento y selección de colonias con características de bacterias ácido lácticas………...42\nviii 7.3 Resistencia y supervivencia de las cepas seleccionadas a condiciones de\npH ácido ………..49\n7.3.1 Resistencia y supervivencia de las cepas ácido lácticas a la\nexposición a sales biliares………53\n7.4 Identificación bioquímica de las cepas mediante el sistema API50CHL y\nCuadro 1. Áreas anatómicas más colonizadas por bacterias ……….6\nCuadro 2. Probióticos estudiados para su uso en la alimentación animal………14\nCuadro 3. Total de muestras tomadas de ganado Holstein para el aislamiento de bacterias acido lácticas……….29\nCuadro 4. Medio de pre-enriquecimiento y condiciones de incubación de las muestras obtenidas de mucosa oral, leche y calostro………..30\nCuadro 5. Condiciones de cultivo en placa ... ….31\nCuadro 6. Condiciones de activación de las cepas control ... 32\nCuadro 7. Cepas seleccionadas para la prueba de resistencia y supervivencia pH ácido………..36\nCuadro 8. Cepas ácido lácticas expuestas a sales biliares (Oxgall)………... 38\nCuadro 9. Sustratos contenidos en la galería API50CHL ... ...41\nCuadro 10. Cepas ácido lácticas seleccionadas en base a su morfología colonial ... 44\nCuadro 11. Resultados de las pruebas morfologicas y bioquimicas aplicadas a cepas procedentes de mucosa oral de becerros Holstein (condiciones aerobias)………..45\nCuadro 12. Pruebas morfologicas y bioquimicas aplicadas a cepas procedentes de mucosa oral de becerros Holstein (condiciones anerobias)………....46\nCuadro 13. Resultados de las pruebas morfologicas y bioquimicas aplicadas a cepas de leche y calostro de ganado Holstein………...47\nCuadro 14. Recuento de colonias recuperadas en agar MRS, después de la exposición a pH ácido………...50\nCuadro 15. Promedios de densidad óptica de las cepas ácido lácticas crecidas por 24 h en dos concentraciones de sales biliares………...53\nx Cuadro 17. Incremento en el crecimiento (DO) de cepas ácido lácticas\nexpuestas a sales biliares (SB) con respecto al inoculo inicial...55\nCuadro 18. Identificación bioquímica de las cepas acido lácticas con el\nSistema API (API50CHL)………...58\nCuadro 19. Fermentación de carbohidratos de los géneros identificados,\naislados de mucosa oral de becerros, calostro y leche de vacas Holstein………...60\nCuadro 20. Cepas probióticas conservadas por su mayor resistencia y\nFigura 1. Ruta de la Glucolisis o vía de Embden-Meyerhof-Parnas……….16\nFigura 2. Ruta del 6-fosfogluconato/fosfocetolasa………..18\nFigura 3. Galería API con medio de cultivo 50CH inoculado con una cepa\nFigura 4. Galerías API50CH inoculadas con cepas seleccionadas\ne incubadas a 37°C por 48 h………....40\nFigura 5. Expresión de resultados. Cambio de color del medio API50CHL\nAzul: negativo, Amarillo y negro: positivo. ... 40\nFigura 6. Colonias de la cepa B3/2-1 AB (aerobias), a las 48h de crecimiento\nen agar MRS. Musosa oral………43\nFigura 7. Colonias de la Cepa B1/1-2MB2 (anaerobias) a las 48h de crecimiento\nFigura 8. Colonias de la cepa V1/2 R. X. A las 48h de crecimiento en agar MRS.\ncepas de calostro………43\nFigura 9. Colonias de cepa V3/2 C1 R. X. A las 48h de crecimiento\nen agar MRS cepas de calostro………...43\nFigura 10. Morfología celular de colonias ácido lácticas crecidas en agar MRS\npor 48 h……….48\nFigura 11. Supervivencia de las cepas acido lácticas a condiciones de pH ácido…….51\nFigura 12. Valores de densidad óptica registrados en caldo MRS adicionado\nEn México la ganadería de bovinos productores de leche se desarrolla en sistemas diversificados, debido al nivel socioeconómico, tecnológico y a la localización geográfica de las unidades de producción. Dicho de otra forma, los hatos no poseen los mismos medios de producción en tecnología aplicada, número de animales y capacidad de producción de forraje en cantidad y calidad. De este modo, se tiene en primer lugar el sistema intensivo, con ganado de las razas especializadas en producción de leche como la Holstein y Suizo, principalmente. En este sistema, su alimentación esta basada en el consumo de alimento balanceado y forraje de corte, lo que hace que mantengan su volumen de producción homogénea durante todo el año. En segundo lugar se encuentra el sistema de producción de doble propósito o de lechería familiar en la que la producción de leche depende de la disponibilidad de forraje y este depende de las lluvias y en años recientes a los precios pagados al productor, por lo que se presentan mayores volúmenes de producción en los meses de julio a octubre (SAGARPA, 2010). Según el INEGI (2007), con datos generados del último censo ganadero, el 63% de la producción de leche nacional proviene de ganado especializado y el 37% restante del ganado de doble propósito o familiar. Esta situación plantea un reto para los pequeños productores, de incorporarse en figuras organizativas como proveedores permanentes de las industrias procesadoras de lácteos existentes.\nOtro factor que ha influido en forma negativa el desarrollo de la ganadería lechera en México es la ineficiencia en la práctica de la recría y el mejoramiento genético (Kurt, 1999). Lo cual conlleva a la dependencia de ganado del exterior. Las importaciones se afectaron en el 2003 y principios del 2004 por el cierre de la frontera al ganado canadiense y de EUA, debido a la Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB), por lo que se tuvieron que buscar alternativas en países europeos para importar vaquillas lecheras. En los últimos años este problema se ha resuelto por la apertura de importaciones de EUA. A este respecto, Muñoz et al. (1997), mencionan que en nuestro\n2 económica de los reemplazos, mejorando la salud de las becerras y así reducir la mortalidad.\nLa cría de reemplazos en el país es una etapa productiva descuidada, presentándose problemas de salud en las becerras, principalmente por el mal suministro de calostro, alimentación con sustituto de leche de baja calidad, cambios abruptos en la dieta, y situaciones de estrés (Soto et al., 2011). Lo que provoca principalmente diarreas,\ndebido a la colonización oportunista de Eschericia coli, que es la principal causa de\nmortalidad y morbilidad durante las dos primeras semanas de vida (Gaggía et al., 2010).\nEs precisamente esta etapa donde los probióticos pueden intervenir en forma benéfica como alternativa de control, menos agresiva y estresante que los antibióticos. Además, el uso de dosis inadecuadas de antibióticos ha generado cepas resistentes con mas patogenicidad, afectando gravemente la salud de humanos y animales (Pérez et al.,\n2006). Motivo por el cual desde el 1 de enero de 2006 la Unión Europea, prohibió su utilización en animales, promoviendo la investigación en probióticos (EC, 2001; 2003a). Según Soto et al. (2011) la viabilidad y número de microorganismos que se requiere\nsuministrar a un animal es de 106 UFC/mL para producir un efecto benéfico. Sin embargo, no siempre se logran estas concentraciones debido a que frecuentemente los microorganismos probióticos muestran baja viabilidad en productos comerciales. Esto puede deberse a varios factores tales como el pH, temperatura y presencia de otros microorganismos, por citar algunos (Dave y Shah, 1997).\nEntre los microorganismos comúnmente presentes en la flora normal de la mayoría de los organismos se encuentran las Bacterias Ácido Lácticas (BAL), bacterias generalmente benéficas que por sus propiedades antagonistas contra microorganismos patógenos son las mas utilizadas como probióticos (Fuller, 1992). Entendiendo que los\nprobióticos son “microorganismos vivos que al ser administrados en cantidades adecuadas, proporcionan o generan efectos benéficos a la salud del hospedero” (FAO y\nOMS, 2001). Se ha reportado que las BAL son capaces de contrarrestar el crecimiento de patógenos como Salmonella spp. (Gill et al., 2001) y Escherichia coli (Shu y Gill,\n3 Al mismo tiempo, varios estudios revelan que al administrar cepas probióticas de humanos al ganado, estas desarrollan una inadecuada y transitoria colonización intestinal, debido a las marcadas diferencias metabólicas y alimentarias entre humanos y animales (Ewaschuk et al., 2004; 2006). Lo anterior conlleva a la necesidad del\naislamiento de BAL de ambientes específicos, esperando que al ser suministradas a las becerras tengan una mejor viabilidad y por tanto aporten beneficios a la salud de estas.\nPor esta razón, se han desarrollado numerosas investigaciones enfocadas en la obtención de bacterias probióticas de diferentes fuentes como intestino delgado, vagina y alimentos. También se han obtenido bacterias probióticas de la leche y calostro de mujeres y animales. Sin embargo es posible obtener BAL de otras fuentes no convencionales como de la cavidad bucal donde los lactobacilos son habitantes normales (Tortora et al., 1989).\nLos antibióticos son utilizados frecuentemente para eliminar microorganismos patógenos en animales lactantes (Patterson et al., 2003) con el propósito de disminuir\nlas tasas de mortalidad. Sin embargo, la administración inadecuada de estos medicamentos ha generado diversos problemas como el incremento en la resistencia bacteriana, la perdida de la microflora intestinal benéfica y el aumento en los niveles de residuos de medicamentos en la carne y en los subproductos de la misma (Wallace, 1992). Como alternativa a estos problemas se ha sugerido el uso de BAL como probiótico para promover el balance de la microbiota intestinal (Abu-Tarboush et al.,\nActualmente los resultados del uso de probióticos en animales son inconsistentes, hay poca o nula respuesta en la administración oral en ganado y becerras (Yoon y Stern 1995; Goncalves et al., 2000). Revisiones sobre el efecto de las BAL indican que el 45%\n4 etiquetas de productos probióticos, no son los que realmente contienen, encontrándose otras especies o concentraciones bajas de bacterias viables al momento de la administración a los animales (Wannaprasat et al., 2009). Además, en cuanto a su\norigen pueden provenir de diferentes regiones geográficas como Estados Unidos y Europa, e incluso de otras especies animales, como cerdos, pollos o de alimentos diversos. En este sentido, en México no se cuenta con probióticos aislados de becerras nativas. Los probióticos comercializados son importados, tienen un alto costo y son de dudosa calidad, pues es frecuente que no se obtengan los beneficios esperados. Por lo anterior, es necesario, el aislamiento y caracterización de bacterias probióticas de ganado bovino en México, con la finalidad de seleccionar cepas con potencial probiótico para ser suministradas a becerras lactantes.\nAislar e identificar bacterias de mucosa oral, leche y calostro de ganado Holstein con características probióticas.\n Aislar bacterias ácido lácticas a partir de muestras de mucosa oral de becerros, leche y calostro de vacas en medios selectivos y específicos.\n Seleccionar las cepas bacterianas aisladas de acuerdo a características morfológicas y pruebas bioquímicas.\n Determinar la resistencia y supervivencia de las cepas seleccionadas a condiciones de pH ácido y sales biliares.\n Identificar las cepas seleccionadas mediante el sistema API50CHL e iniciar la creación de una colección de cepas con potencial probiótico.\n5 V. REVISIÓN DE LITERATURA\nLas Bacterias Ácido Lácticas (BAL) se han utilizado de forma empírica desde hace varios siglos en la fermentación de alimentos como leche, vegetales, productos cárnicos y panadería (Chukeatirote, 2003). Estas bacterias no sólo aportan a los alimentos características organolépticas como sabor, olor, textura y calidad nutritiva, sino que generan ambientes poco favorables para el crecimiento de microorganismos patógenos debido a su acentuada capacidad antagónica que estimula su proliferación en detrimento de cualquier otro microorganismo presente en la materia prima.\nEn este sentido, se ha podido comprobar que la utilización de algunas cepas del grupo de las BAL, entre ellas las del género Lactobacillus, confieren beneficios a la salud y\nprevienen enfermedades (Reid, 2008). A estos se les agrupa dentro de los alimentos funcionales ya que estos son capaces de generar un efecto beneficioso sobre una o más funciones específicas en el organismo más allá de los efectos nutricionales habituales (Roberfroid, 2000). Así, Europa y Estados Unidos, han desarrollado la mayor cantidad de alimentos con cultivos probióticos, pero fue Japón el primer país en etiquetar productos de alimentos funcionales (Pardio, 1998).\n5.1 Sistema digestivo de becerras lactantes\nEn la becerra recién nacida, a diferencia de un animal adulto, el rumen es muy pequeño mientras que el abomaso comprende aproximadamente el 80% del total de las cuatro estructuras, siendo el abomaso el verdadero estómago con secreción de jugos gástricos. En las becerras se desarrolla una estructura llamada canaladura esofágica que se inicia en el cardias, se dirige hacia abajo para terminar en el orificio retículo omasal. Los extremos de esta canaladura se extienden por acción refleja y forman un conducto que permite el paso de la leche directamente al abomaso (Ávila, 1984). De este modo, la becerra empieza como un no rumiante con más del 70% de su capacidad estomacal en el abomaso. Con una ración adecuada el rumen se desarrolla rápidamente a su completa capacidad.\n6 terneros alimentados de leche materna. Inicialmente se encuentra en mayor concentración el grupo de bacterias anaerobias, pero poco a poco se va modificando, dependiendo del tipo de dieta, y tras el destete, la microflora tiene una marcada tendencia a estabilizarse. Aunque la mayoría de las investigaciones sostienen que la colonización del tubo digestivo del recién nacido se produce por la microbiota del canal del parto, algunos autores indican que la leche materna podría ser también una fuente de microorganismos (Martín et al., 2004). Estos autores especulan sobre el posible\npaso de bacterias a través del epitelio intestinal de la madre hacia otros tejidos como la glándula mamaria y de allí al intestino de los lactantes.\nEl número de bacterias presentes en un organismo no es el mismo en las diferentes áreas anatómicas. El Cuadro 1 muestra las áreas colonizadas con el mayor número de microorganismos.\nCuadro 1. Áreas anatómicas más colonizadas por bacterias.\nUbicación Sitio anatómico específico Piel Áreas húmedas: región inguinal, espacio interdigital de los pies. Tracto respiratorio Fosas nasales, faringe\nTracto digestivo Boca, intestino grueso Tracto\ngenitourinario Tercio anterior, uretra, vagina\nLas bacterias y en menor cantidad los hongos y protozoos, residen y proliferan activamente en las áreas anatómicas descritas en el Cuadro 1. Otras regiones del tracto respiratorio y del tracto digestivo, la vejiga y el útero, tienen una menor cantidad de microorganismos, sólo están de paso, no obstante, el hallazgo de microorganismos patógenos en estos sitios es altamente sugerente de infección. Así mismo, existen otros tejidos y órganos en que no existen microorganismos, son territorios estériles. Por lo contrario, el tubo digestivo esta densamente poblado por bacterias, por lo que puede ser dividido en unidades distintas, pues cada una provee condiciones para el crecimiento de una microflora especifica (Sorum y Sunde, 2001).\n7 y anaerobias facultativas. Varias sustancias antimicrobianas han sido identificadas en la saliva, de las cuales las más importantes son enzimas como la lisozima y lactoperoxidasa (Madigan et al., 1977). A pesar de la acción de estas sustancias, la\npresencia de partículas de alimento y desechos epiteliales, hacen de la cavidad oral un hábitat favorable para el crecimiento bacteriano. Los microorganismos en la cavidad oral, incluyen especies como: Corynebacterium spp., Lactobacillus spp, Haemophilus\nspp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Actinomyces spp., Actinobacillus spp., Treponema spp., Micrococcus spp., Moraxella spp. y Neisseria spp. (Madigan et al.,\n1977; Linton et al., 1982; Tortora et al., 1989).\nEl estómago contiene relativamente pocos microorganismos debido a su medio ambiente ácido, generalmente el estómago presenta valores de pH cercanos a 2.0. Este pH funciona como barrera contra la entrada de bacterias externas dentro del tubo digestivo. Si el contenido bacteriano del estómago es bajo, algunas especies ácido tolerantes son capaces de colonizar este órgano, como Helicobacter pylori que es\ncapaz de colonizar el estómago de humanos, aunque también ha sido aislada de estómago de cerdos y gatos. Otras especies de Helicobacter se han encontrado en el\nestómago de varios animales (Glupczynski et al., 1998). En seguida, el duodeno con un\npH menos ácido crea cambios en la flora bacteriana, resultando en una rica y más compleja microflora, en su mayoría especies Gram positivas. En la última parte del íleon hay aproximadamente 105 a 107 bacterias por gramo de quimo, esta microflora incluye especies de la familia Enterobacteriaceae y Bacteroides spp., en adición con\nLactobacillus, Bifidobacterium y Enterococcus. Por último, el intestino grueso contiene\nbacterias anaerobias estrictas tales como Bacteroides spp., Fusobacterium spp.,\nClostridium spp., y Peptostreptococcus spp. También presenta un considerable número\nde anaerobias facultativas como Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., y\n8 Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus salivarius y Lactobacillus casei (Pascual et al., 1996).\nDe este modo, la microbiota intestinal de los animales es responsable de una serie de funciones que regulan directamente el buen funcionamiento no sólo del sistema digestivo, sino también del sistema inmunológico e indirectamente tiene una influencia sobre el bienestar general del animal.\n5.1.2 Fisiología de la microbiota intestinal\nCada organismo vivo pertenece a un ecosistema natural, al mismo tiempo estos conforman un ecosistema para las bacterias que albergan (Flandrois, 1997). Siendo un claro ejemplo el intestino de humanos y animales, que proporciona un ambiente muy favorable para el crecimiento y desarrollo de la microbiota. Este complejo grupo de microorganismos es característico de cada individuo, así como también el número y especies de bacterias presentes en cada segmento del intestino y está influenciado por varios factores ambientales (Fonty, 2003).\nEstos microorganismos tienen su origen en la vagina, ubre, leche y saliva de la madre, bolo alimenticio, estiércol, flora ambiental, otros animales y otras fuentes alimenticias (Church, 1993). De esta manera, la microflora que coloniza el intestino, es una colección muy compleja, compuesta por cerca de 400 diferentes tipos de bacterias (Moore y Holdman, 1974), pero a pesar de esta gran variabilidad, la flora rápidamente forma una población muy estable. En este complejo sistema, hay una estrecha interrelación entre microorganismo y hospedero, ya que la microbiota tiene funciones metabólicas, tróficas y de protección que es capaz de influir positivamente en la barrera intestinal.\n9 Así también, se presenta un menor reemplazamiento celular en la mucosa del intestino y un menor desarrollo del sistema inmune (Falk el at., 1998).\nDe manera normal, la mucosa del intestino actúa como barrera que separa el medio interno del ambiente luminal, mediante una capa de moco que está formada por la interacción de varias secreciones mucosas, como glicoproteínas, musina, péptidos y fosfolípidos surfactantes (Guarner y Malagelada, 2003). Además también, absorbe los nutrientes por medio de sus vellosidades y microvellosidades. Al mismo tiempo, la presencia de bacterias benéficas es vital para el adecuado funcionamiento del intestino ya que intervienen en la motilidad, secreción, absorción y en la estructura celular. Por su parte, el intestino grueso desempeña funciones de deshidratación del quimo intestinal y la evacuación de los residuos no utilizados por el organismo. En el intestino delgado las reacciones microbianas se caracterizan por ser hidrolíticas por la presencia de oxígeno. Caso contrario es el intestino grueso donde las condiciones son anaerobias y las reacciones bioquímicas son normalmente reductoras (Macfarlane et al., 1992).\nEn particular, el intestino es considerado el órgano inmune más grande del cuerpo, por la presencia de tejido linfoide asociado a la mucosa (Collins et al., 1998). Es claro que el\norganismo no es un sistema cerrado, diariamente pueden introducirse microorganismos y antígenos peligrosos en la dieta, pero la barrera intestinal contribuye a la exclusión y eliminación de estos (Brandzaeg, 1995). Se ha relacionado esta exclusión con la habilidad de la mucosa intestinal de producir Inmunoglobulina A (IgA) y moco (Slomiany\net al., 1987). Vitiñi et al. (2000) reportan que algunas cepas de Lactobacillus tienen la\n10 es clara la evidencia de una correlación entre la composición de la microbiota y la variación en la inmunidad (O'Hara y Shanahan, 2006). Cuando hay perdida de la integridad, es decir, una disfunción de la barrera intestinal, conduce a un progresivo incremento de la permeabilidad, induciendo a un cambio patológico de inflamación característico de enfermedades intestinales (Frank et al., 2007; Lambert, 2009).\nNumerosas evidencias indican que los cambios en la microbiota intestinal con incremento de bacterias patógenas y un decremento de la salud, las bacterias promotoras como bifidobacterias y lactobacilos juegan un papel importante en la recuperación de la inflamación intestinal (Andoh y Fujiyama, 2006).\nSegún Hooper et al. (2001) la microbiota presente interviene en la morfología anatómica\ny fisiológica del intestino, aumentando la superficie de absorción y promoviendo la regeneración de las vellosidades. Además de esto, incrementan el contenido intraluminal y aceleran el tránsito intestinal. Otras actividades en las que intervienen, es en la síntesis de vitaminas (Hill, 1997) y en el incremento de la biodisponibilidad de la riboflavina, haciendo estos nutrientes más fácilmente utilizables (Ortega et al., 2002) y\nla absorción de varios minerales como Ca, P, Mg y Fe (Miyazawa et al., 1996). Los\nprobióticos también intervienen en varias funciones metabólicas por su gran potencial enzimático. Entre ellas, la hidrólisis de los componentes de la dieta (glúcidos, proteínas y lípidos), proceso por el cual se obtiene energía y nutrientes, para los propios microorganismos intestinales y para el hospedero.\nLa fermentación de los carbohidratos provoca disminución del pH y la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC). La mayor parte de estos son producidos en el colon y absorbidos ahí mismos. Los AGCC más abundantes en el intestino son el acético, el butírico y el propiónico. El epitelio del colon consume casi por completo el butirato producido, constituyendo la principal fuente de energía para los colonocitos. Además de que se ha relacionado también con la destrucción de células neoplásicas, pudiendo prevenir procesos cancerígenos (Gibson et al., 1992; Scheppach et al., 1995).\n11 el hígado o en los tejidos periféricos. De este modo, tienen una gran importancia en la fisiología y nutrición del tubo digestivo (Cummings, 1997).\n5.2.1 Uso y definición de probióticos\nEl consumo de probióticos se remonta a varios siglos atrás desde Hipócrates (460 a.C.- 377 a.C.), quien decía: "Haz que tus alimentos sean tus medicinas y que tus medicinas sean tus alimentos". Posteriormente, Élie Metchnikoff (1845-1916), quien fue el primero en aislar bacterias ácido lácticas del yogurt, afirmando que eran estos microorganismos los responsables de la existencia de un increíble número de personas centenarias en Bulgaria, por el consumo de grandes cantidades de yogurt (Rodríguez, 2009). Desde ese tiempo a la actualidad, se ha incrementado el interés por este tipo de alimentos que contienen bacterias benéficas para la salud (Felley et al., 2001).\nLilly y Stillwell (1965) introdujeron el término Probiótico para nombrar a “Sustancias que\nestimulan el crecimiento de otros microorganismos”. Sin embargo, esta definición fue\nmodificada y se redefinió a los probióticos como “microorganismos y compuestos que participan en el balance y desarrollo microbiano intestinal”. Para 1970 un\nmicroorganismo probiótico se definía como “microorganismos que se utilizan como\nsuplemento en la alimentación animal, para aumentar el crecimiento y reducir el estrés”.\nDe la misma manera, Fuller (1989) definió a los Probióticos como: "Aquellos microorganismos vivos, principalmente bacterias y levaduras, que son agregados como suplemento en la dieta y que afectan en forma beneficiosa al desarrollo de la flora microbiana en el intestino".\nCasi una década después Salminen et al. (1998) definieron a los probióticos como “agente microbiano viable que al utilizarse en el hombre o en animales aporta efectos benéficos, mejorando el balance de la microbiota intestinal”.\n12 favorecen la composición o actividad de la microbiota autóctona, y por tanto pueden modificar y favorecer el estado de salud del hospedero.\n5.2.2 Los probióticos y la salud\nEl uso de probióticos no es nuevo, ya que se consumen desde la antigüedad, incluso hace más de un siglo científicos como Pasteur y Metchnikoff observaron el potencial benéfico de algunas bacterias por su antagonismo contra agentes infecciosos (Underdown,1986). Por lo que, el suministro de probióticos ha sido recomendado para el tratamiento o prevención de varias condiciones de estrés y enfermedades de un sinnúmero de especies (Zimmermann et al., 2001). Debido a que se ingieren en las\ncantidades adecuadas, ocurre la modificación del ecosistema de los billones de microorganismos que habitan en el intestino, dándose una competencia por los nutrientes entre los probióticos y los microorganismos patógenos, así como la competencia por los sitios de adherencia, impidiendo la colonización de estos y reforzando los mecanismos de defensa estimulados por el sistema inmune, generando un equilibrio que se manifiesta por un estado de salud. De este modo, las bacterias probióticas tanto nativas como las que se suplementan en el alimento, pueden controlar la colonización y/o el desarrollo de diversos microorganismos patógenos, como:\nSalmonella typhimurium, Shigella spp., Clostridium, Campilobacter jejuni y Escherichia coli (Hilton et al., 1995).\nVarios investigadores han podido comprobar los efectos benéficos de los probióticos (Dunne et al., 2001; Marteau et al., 2002), reportando sus efectos nutricionales, su\nantagonismo contra patógenos y su acción de inmunomodulación. Esta actividad la desarrollan a través de la interacción de los probióticos con el tejido linfoide, favoreciendo la maduración del sistema inmune (Cebra et al., 1998; y Noverr\nHuffnaglee., 2004). Por su parte, Gill et al. (2001), han reportado que algunas cepas\ntienen la capacidad de incrementar la inmunidad innata, por medio de la estimulación de actividad fagocítica. Asimismo, se ha documentado que pueden producir inmunoglobulinas del tipo A, es decir, estimulan también la inmunidad adquirida o específica (Tejeda Simón et al., 1999). Adicionalmente, se tienen evidencias de que los\n13 reducción de alergias (Majamaa e Isolauri, 1997; Kalliomaki et al., 2001) interviniendo\nsobre la inmunidad celular y humoral (Borruel, 2003). Recientemente, se ha investigado sobre la acción de algunas bacterias en la desconjugación de sales biliares, postulándose que estas podrían estimular el catabolismo del colesterol, disminuyendo la colesteronemia (Tahri et al., 1995).\n5.2.3 Bacterias potencialmente probióticas\nEn la actualidad se conocen más de 20 géneros de microorganismos probióticos en el mundo, estos han sido aislados de diversas fuentes como: el tracto intestinal de humanos y animales, carnes, frutas y vegetales fermentados, entre otros (Barboza et al., 2004). De estos, la mayor parte pertenecen al grupo de las bacterias ácido lácticas.\nLos Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus y Streptococcus, son los géneros\ncomúnmente empleados para la producción de probióticos (Sandine et al., 1972),\n14 Cuadro 2. Probióticos estudiados para su uso en la alimentación animal\nFuente: Suvarna y Boby (2005).\n5.2.4 Bacterias acido lácticas\nLas BAL pueden encontrarse en diversos nichos ecológicos, siempre que en ellos haya abundantes fuentes de carbohidratos hidrosolubles, productos de degradación de proteínas, vitaminas y una tensión de oxígeno reducida. Las podemos encontrar en hábitats tan variados como la leche y sus derivados, vegetales, carne y sus derivados, bebidas fermentadas y formando parte de la microbiota gastrointestinal y genitourinaria del hombre y animales (Azadnia et al., 2011).\nEl grupo de las BAL está conformado por varios géneros con características morfológicas, metabólicas y fisiológicas en común. Son cocos o bacilos Gram positivos, no forman esporas, no presentan movilidad, son negativas a la producción de catalasa y bencidina; y tampoco reducen el nitrato a nitrito (Savadogo et al., 2006). Carecen de\nactividad respiratoria por la ausencia de la enzima citocromo catalasa, por tanto son anaerobias, microaerofílicos o aerotolerantes pudiendo formar colonias en los medios\nBifidobacterium Lactobacillus Lactococcus Leuconostoc\nB animalis subsp. animalis (B. animalis) B. lactis subsp. lactis (B. lactis) B. longum subsp. longum(B. longum) B. pseudolongum subsp. pseudolongum (B. pseudolongum) B. thermophilum L. acidophilus L. amylovorus L. brevis\nL. casei subsp. casei (L. casei) L. crispatus L. farmicinis L. fermentum L. murinus\nL. plantarum subsp. plantarum (L.\nplantarum ) L. reuteri L. rhamnosus L. salivarius L. amylovorus (L.\n(Streptococcus cremoris) L. lactis subsp. lactis\nL. citreum L. lactis L.\n15 de cultivo sólido en presencia de aire (Ekinci y Gurel, 2007). Esto es posible gracias a que contiene un grupo hemina, que les permite poner en marcha la cadena respiratoria con el oxígeno como aceptor de electrones.\nPor otro lado, la temperatura es un factor que influye de manera importante en el crecimiento de las BAL. Existe una temperatura óptima a la cual la velocidad de crecimiento es más alta que va de los 30-40ºCpues depende de las características del microorganismo utilizado, así como también de las condiciones ambientales (Guerra et\nal., 2001), la mayoría de las especies necesitan aminoácidos y vitaminas del grupo B\n(lactoflavina, tiamina, biotina, acido nicotínico, ácido pantoténico y ácido fólico) y varios aminoácidos (Devlieguere et al., 2004). Dependiendo de sus características metabólicas\ny fenotípicas las BAL pueden seguir dos rutas para la fermentación de carbohidratos, esto por la presencia o ausencia de las enzimas fructuosa 1´6-difosfato aldolasa y fosfocetolasa (Kandler y Weiss, 1992). A continuación se explica cada una de éstas:\n1. Glucolisis o vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP). Es la ruta por la cual las especies denominadas homofermentadoras, con disponibilidad de glucosa, de factores de crecimiento, vitaminas, aminoácidos y precursores de ácidos nucleicos, y cantidad de oxígeno limitada, metabolizan las hexosas. Convirtiendo una molécula de glucosa en dos moles de ácido láctico y dos moles de ATP (Almanza y Barrera. 1991).Figura 1.\nEn esta ruta la enzima clave es la fructosa 1´6-difosfato aldolasa. A este grupo pertenecen las cepas: Lactobacillus acidophilus, L. gasseri, L. johnsonii, L. crispatus,\nL. amilovorus y L. gallinarum. También se incluyen en esta categoría las especies Lactobacillus delbrueckii, L. helveticus, L. leichmanii, L. salivarius y L. jensenii. Estas\nFigura 1. Ruta de la glucolisis o vía de Embden-Meyerhof-Parnas Fuente: modificado de Parra (2010).\nD-Glucosa 6 Fosfato\nD-Fructuosa 6 Fosfato\nD-Fructuosa 1,6 Difosfato\nD-Gliceraldehido 3 Fosfato Dihidroxiacetona Fosfato\n2 Lactato P\n17 2. Ruta del 6-fosfogluconato/fosfocetolasa (6-PG/PK). Se incluyen en este grupo\nLactobacillus reuteri, L. fermentum, L. cellobiosus, L. brevis, L. buchneri y L. viridescens. Estas especies utilizan solamente la ruta dependiente fosfocetolasa para\nmetabolizar azucares, y además de ácido láctico, producen también cantidades significativas de ácido acético y/o etanol con la producción de CO2 (Almanza y Barrera,\n1991). La ruta se muestra en la Figura 2. El rendimiento energético en esta reacción es un mol de ATP y 3 moles de NADH por mol de hexosa fermentada. Para recuperar el equilibrio redox de la reacción y en ausencia de aceptores de electrones alternativos, será necesaria: A) la reducción del piruvato a lactato, reacción en la que se oxida uno de los moles de NADH y B) que el acetíl-fosfato se reduzca a etanol. En presencia de aceptores de electrones alternativos, se formará ácido acético en lugar de etanol como producto final.\n2.1 Heterofermentadores facultativos. Las principales especies de este grupo son:\nLactobacillus casei, L. plantarum, L. sakei y L. curvatus, L. casei subs prhamnosus, L. curvatus.\nProducen solo 50% de ácido láctico por la ruta Embden- Meyerhoff-Parnas. Estas fermentan 1 mol de glucosa para formar 1 mol de ácido láctico, 1 mol de etanol, 1 mol de CO2, y 1 mol de ATP (Ly, 2008). Por otro lado, este grupo de bacterias contiene la enzima fosfocetolasa, con la cual fermentan las pentosas hasta ácido láctico y ácido acético (Almanza y Barrera, 1991). De esta manera puede resumirse que la principal diferencia entre las bacterias homo y heterofermentativas son las enzimas ya que las homofermentativas poseen las enzimas fructosa 1´6-difosfato aldolasa y hexosa isomerasa que no tienen las heterofermentativas, mientras que éstas últimas poseen una fosfocetolasa, de la que carecen las primeras.\nFigura 2. Ruta del 6-fosfogluconato/fosfocetolasa Fuente: modificado de Parra (2010)\n6-Fosfo D-Gluconato Fosfato\nD-Ribulosa 5- Fosfato\nD- Xilulosa 5 Fosfato\nAcetilfosfato D-Gliceraldehido 3 Fosfato\nCo A P1\nAcetil CoA 2NADH+2H\n2 Lactato Fosfoenol -Piruvato\n2NAD 2NADH+2H Piruvato\n2 Fosfoglicerato 1,3Difosfoglicerato\n19 5.2.5 Respuesta ácido tolerante de Lactobacillus\nDurante la fermentación, Lactobacillus transporta ácido láctico hacia afuera de la célula\ncomo ión lactato, vía protón-lactato electrogénico. Una bacteria metabólicamente activa mantiene un gradiente de concentración (∆pH) constante, donde el pH intracelular (pHi) es más alcalino que el pH del medio (pHm),(Booth, 1985; Kashket, 1987). Al disminuir el pHm o al incrementarse la concentración de lactato, la concentración de protonato (ácido láctico no disociado) también se incrementa. Esta forma no disociada es soluble en la membrana y puede entrar al citoplasma por simple difusión (Lambert y Stratford, 1999). Así, la difusión del ácido dentro del citoplasma provoca una rápida disociación y liberación de protones y aniones en la célula. Si la tasa de liberación de protones excede la capacidad buffer del citoplasma y el flujo del sistema, el pHi empieza a bajar y eventualmente alcanza un punto crítico donde el ∆pH no puede mantenerse por mucho\ntiempo y la función celular se deteriora (Booth, 1985; Hutkins et al., 1993). De este\nmodo, la acumulación intracelular de aniones ácidos tiene gran importancia ya que la liberación de protones inhibe el crecimiento celular (Carpenter et al., 2009; Russell,\nLas diferencias en la tolerancia a la acides entre especies de BAL han sido relacionadas con la actividad de la F1-F0 ATPasa que es una subunidad enzimática múltiple, conteniendo una porción catalítica (F1), incorporando subunidades para la hidrólisis de ATP; y una porción integral de membrana (F0) que incluye subunidades que funcionan como canales de membrana para la translocación de protones (Corcoran et al., 2005), esta enzima juega un papel importante en el pHi, para la regulación del pH óptimo para las células (Cotter y Hill, 2003; Sturr y Marquis, 1992)\nEn adición a la actividad de F1-F0 ATPasa, la tolerancia a la acides en las BAL incluye una variedad de mecanismos de protección para el estrés ácido (Lorca et al., 2009; van\nde Guchte et al., 2002). Varias células muestran una inducible Respuesta Ácido\n20 El primer reporte sobre la ATR se le atribuye a Goodson y Rowbury (1989), quienes mencionaron que el mecanismo de la ATR es generalmente provocada por una exposición breve a un pHm sub letal (adaptación ácida), lo cual provoca otras respuestas al estrés. También observaron que en una inducción transitoria, aumentó la supervivencia celular durante la subsecuente exposición a pHm sub letal, por cambios fisiológicos y proteínas específicas. La ATR ha sido detectada en numerosas bacterias, incluida L. casei y otras especies de BAL (Hall et al., 1995; Hamilton y Svensäter, 1998).\nLa caracterización de la ATR ha facilitado la identificación de enzimas, proteínas y cambios macromoleculares como: alteración del contenido de lípidos de la membrana citoplasmática que permite a la bacteria combatir el efecto negativo de la acidificación\ncitoplasmática (Cotter y Hill, 2003, Lorca et al., 2009). Trabajos muestran que en L. casei se han detectado de 9 a 11 proteínas ácido-reguladoras (Hamilton y Svensäter,\n1998) y además el contenido de los ácidos grasos de la membrana citoplasmática es alterado al incrementar la proporción de ácido oleico (C18:1) y el ácido graso\nciclopropano (C19:0) en respuesta a la acidificación (Fozo et al., 2004). Sin embargo, la\ninformación de los mecanismos usados por L. casei para modular la ATR y el contenido\nde ácidos grasos, así como la identidad y funciones de las proteínas ácido-reguladoras aun es limitada.\n5.2.6 Actividad probiótica en el animal\nEn la Unión Americana se han desarrollado varios estudios de campo para monitorear la salud de becerras y su crecimiento. En un estudio se encontró que las becerras con neumonía en los primeros tres meses de vida tuvieron 2.5 veces más probabilidades de morir después de los noventa días de edad. Si las becerras presentaban diarreas en la etapa lactante, tenían 2.5 veces más probabilidades de ser desechadas que otras becerras y además se observó que las vaquillas tratadas por diarrea tuvieron 2.9 veces más probabilidades de parir después de 30 meses de edad que otras (Kertz, 2006).\n21 pronto. En contraparte las vaquillas que no presentaron enfermedades cuando eran becerras tuvieron dos veces más probabilidades de llegar al primer parto y parir en promedio seis meses antes que aquellas que tuvieron problemas durante su crianza (Kertz, 2006).\nPor lo tanto, las enfermedades entéricas son de mucha importancia en lo que concierne a la industria pecuaria, debido a la pérdida de productividad, incremento de mortalidad y la contaminación de los productos para consumo humano. Ante este hecho, en la actualidad las bacterias probióticas se emplean como aditivos en la alimentación de animales de granja y como promotores del crecimiento (Patterson y Burkholder, 2003).\nEn cerdos se ha demostrado que el suministro de probióticos disminuye o elimina los agentes patógenos en el intestino, mejorando el índice de conversión y reduciendo las diarreas, además, son capaces de eliminar los residuos de antibióticos y sustancias análogas en productos finales (Figueroa et al., 2006). Riopérez (2005) reportó que la\nadministración oral de cepas de Lactobacillus acidophilus y Enterococus faecium en el\nalimento iniciador a lechones de 4-5 semanas de edad reduce significativamente (P<0.01) la concentración de bacterias coliformes en íleon y ciego y promueve el aumento de lactobacilos en el intestino, previniendo las diarreas colibacilares post-destete y constituye una alternativa válida para sustituir a los antibióticos prohibidos como promotores del crecimiento, al mejorar sensiblemente la relación lactobacilos/E.\nOtras investigaciones demuestran que las bacteriocinas tienen un efecto positivo frente a las gastroenteritis producidas por cepas de E. coli y Campylobacter spp,\nreduciéndolas considerablemente (Gagnon et al., 2004). En consecuencia la\nadministración constante de probióticos genera los siguientes efectos que se describen, según: Domínguez-Bello y Blaser, (2008); Germán et al. (2001); Nobaek et al. (2000);\nSalminen, (1998); Fuller, (1992).\n22 2. Previenen enfermedades pulmonares, anorexias relacionadas al estado sanitario\ndel animal con tránsito intestinal acelerado o que ha padecido diarreas.\n3. Mejora la absorción de los nutrientes de los formulados alimenticios provocando el aumento del índice de conversión alimenticia y de ganancia de peso.\n4. Aumentan el control higiénico ambiental de las naves de producción, debido a que las heces provienen de intestinos no contaminados, evitando el reciclado permanente de bacterias nocivas entre animales. Además, al realizarse correctas fermentaciones intestinales, se logra homogeneizar y mejorar la textura y olor de las heces siendo estas aptas como fertilizantes.\n5. Mejora de la resistencia inmunológica del animal, al disminuir la utilización indiscriminada de antibióticos, su costo y dificultad de administración.\n6. Mejora en el proceso de la digestión, porque contienen enzimas (p.e. lactasa) que ayudan a digerir la comida.\n7. Inhiben el crecimiento de organismos patógenos en el tubo digestivo, compiten por los alimentos y el espacio disponible y segregan entonces sustancias como ácido láctico y otros ácidos orgánicos y sustancias que funcionan como antibióticos, que se conocen como bacteriocinas, de esta manera se crea un medio adverso en el que los patógenos no pueden crecer.\n8. Reforzamiento de la respuesta inmunológica, tanto la celular como la humoral, debido a que las bacterias probióticas aumentan el número de glóbulos blancos circulantes, estimulan la fagocitosis, aumentan los niveles de anticuerpos y regulan la producción de las citoquinas como gamma-interferon.\n9. Producen vitaminas B1, B6, B12, ácido fólico, biotina y diferentes aminoácidos. También la vitamina K puede ser producida en el intestino, además,\nLactobacillus acidophilus es capaz de frenar algunas otras bacterias que son\nresponsables de la desintegración de la vitamina B1.\n10. A través de las madres confieren beneficios a los recién nacidos al mantener libre de patógenos el intestino. Optimizando la capacidad de sobrevivencia en las primeras 72 horas de vida.\n23 5.2.7 Mecanismo de acción de los probióticos\nEntre los mecanismos de acción de los probióticos se pueden mencionar los siguientes (Alander et al., 1999; Isolauri et al., 2001; Parvez, 2006; Collado et al., 2007):\n1) Síntesis de sustancias como el ácido láctico, peróxido de hidrogeno, diacetilo y bacteriocinas. Estos compuestos afectan el metabolismo de bacterias patogenas o la producción de toxinas.\n2) Producción de sustancias con un potente efecto antimicrobiano como la reuterina producida por Lactobacillus reuteri y las llamadas bacteriocinas,\nlas cuales son como pequeñas proteínas que tienen la capacidad de perforar específicamente la membrana celular de ciertas bacterias patógenas. Como ejemplo de estas esta la nisina producida por\n3) Disminución del pH intestinal favoreciendo el crecimiento de bacterias benéficas.\n4) Bloqueo de la colonización de patógenos en sitios donde pudieran alojarse como la superficie del epitelio gastrointestinal. No es solo un bloqueo físico para no dejar llegar a los patógenos a la pared intestinal si no que existen sitios específicos en donde las bacterias probióticas forman un enlace con las células epiteliales. Las bacterias patógenas al no tener donde fijarse son eliminadas con las heces antes de que puedan proliferar.\n5) Competición por nutrientes.\n6) Estimulación de la respuesta inmune. La estimulación de la inmunidad innata y adquirida protege contra enfermedades intestinales, estimulando la producción de IgA, activando macrófagos e incrementando la concentración de IFN-gamma (interferon gamma)\n24 5.3 Métodos de identificación para bacterias probióticas\n5.3.1 Métodos directos\nEl estudio de la microbiota benéfica se ha abordado principalmente a través del aislamiento e identificación fenotípica, mediante características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. Para esto ha sido necesario el uso de medios selectivos y diferenciales.\nEl cultivo de las bacterias intestinales es complejo por ser anaerobias y ser demasiado sensibles al oxígeno, requiriendo de condiciones reductoras estrictas para su cultivo (Delgado, 2005).\n5.3.2 Métodos indirectos\nSe basan en el estudio del metabolismo bacteriano, es decir, la cuantificación y análisis de sus metabolitos o actividad enzimática. Entre los más estudiados están los ácidos grasos volátiles y la actividad de las glicosidasas o las reductasas. Este tipo de análisis presenta también inconvenientes, ya que las enzimas que son detectadas no son específicas de una cepa o un grupo bacteriano, además de que puede darse en ocasiones una gran variabilidad metabólica en las especies (Delgado, 2005).\n5.4 Criterios para la evaluación de los probióticos\nEn la actualidad se reconocen principios básicos que deben respetarse cuando se busca aislar cepas bacterianas probióticas con el fin de ser administradas a los animales para revertir las deficiencias causadas por la crianza intensiva (Rosmini et al.,\nLos requisitos que deben cumplirse para considerar a un microorganismo como probiotico son:\n1) Identificación taxonómica exacta.\n2) Ser habitante normal de la especie objetivo.\n3) La supervivencia, la colonización y ser metabólicamente activo en el sitio\n25 a. Resistencia a los jugos gástricos y bilis\nb. La persistencia en el tracto gastrointestinal\nc. La adhesión al epitelio o mucosa\nd. La competencia con la microbiota residente\ne. La producción de sustancias antimicrobianas\nf. El antagonismo frente a las bacterias patógenas\ng. La modulación de la respuesta inmune\nh. Efectos benéficos en la salud\n4) Estabilidad genética\n5) Concentración de microorganismos viables (106UFC/ml). 6) Mejorar los índices de producción (efecto zootécnico).\n7) Estabilidad de las características probióticas durante el procesamiento y\n8) Propiedades organolépticas y tecnológicas deseables cuando se incluye en los\nprocesos industriales EFSA. (2005a); FAO/WHO. (2002).\n5.5 Guía para la evaluación de los probióticos\nAunque la mayoría de las cepas que se emplean como probióticos, son comensales del tubo digestivo y se han utilizado históricamente en la conservación de alimentos y por ello se consideran Generalmente Como Seguras (por sus siglas en ingles GRAS), la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda que sean sometidas a pruebas para que su aplicación no tenga efectos colaterales, que afecten negativamente la salud del hospedero (Kirjavainen et al., 1999). Se han desarrollado una serie de requisitos\n26 5.5.1 Seguridad de uso\nLa seguridad debe ser verificada de forma individual, asegurándose de que cada cepa probiótica esté libre de factores de virulencia y determinantes de patogenicidad, mediante la prueba de “actividad hemolítica” (Salminen et al., 1998b; Ishibashi y\n5.5.2 Criterios Funcionales\nEstos criterios se enfocan a las características biológicas y a la capacidad probiótica de las cepas e incluyen aspectos de resistencia al tránsito gastrointestinal (resistencia a condiciones ácidas y a sales biliares) y supervivencia en el lugar de acción (Marteau\n5.5.3 Criterios Tecnológicos\n27 VI.MATERIALES Y MÉTODOS\n6.1 Aislamiento de bacterias probióticas a partir de muestras de mucosa oral de becerros, de leche y calostro de vacas Holstein\nSe seleccionaron cinco becerros lactantes de 30 a 60 días de vida y cinco vacas en lactación de la raza Holstein Friesan de la granja del Colegio de Postgraduados, localizado en la carretera México - Texcoco, km 36.5, Montecillo, Estado de México. El Colegio de Postgraduados se encuentra ubicado a una altitud de 2240 metros, con temperatura promedio anual de 15.2°C y clima templado subhúmedo con lluvias en verano, época seca en invierno y 650 mm de precipitación promedio anual. Igualmente, se tomaron muestras de calostro de cinco vacas recién paridas del Rancho Xalapango ubicado en Texcoco Estado de México, sobre la carretera Texcoco-Tlaxcala. Todos los animales seleccionados se percibieron sin signos aparentes de enfermedad.\n6.1.2 Toma de muestras de mucosa oral\nSe tomaron dos muestras de la mucosa oral de cada becerro lactante previa a la ingesta de alimento matutino, con un hisopo 3MTMSwab-Sampler. Para esto se hizo\nfrotar un hisopo por 3 s en la mucosa oral. Inmediatamente después, cada hisopo se colocó dentro de su respectivo dispositivo con 10 mL de agua peptonada buferada (RS96010BPW). Cada muestra tomada se identificó con el siguiente protocolo:\nA) Fecha B) Lugar\nC) Hora de muestreo D) Número de animal E) Número de muestra.\n28 6.1.3 Muestras de leche de vaca: Fueron tomadas después de realizar la limpieza, desinfección y despunte de pezones, la leche se colectó en frascos estériles de 100 mL. Con guantes estériles se exprimió el pezón para colectar 10 mL de leche de cada vaca, los frascos con las muestras se colocaron en un termo con hielo para ser transportados al laboratorio. Estas se procesaron 1 h después de su colecta.\nLas vacas de las que se obtuvieron las muestran tenían entre uno y tres partos con tres y seis meses de lactancia, excepto la vaca número uno, con 4 días de lactancia.\n29 Cuadro 3. Muestras tomadas de ganado Holstein para el aislamiento de\nNumero de animales y muestras\nMucosa oral Leche Calostro\nB1OM2 V1/C.P V1/R.X\nB2OM2 V2/C.P V2/R.X\nB3OM2 V3/C.P V3/R.X\nB4OM2 V4/C.P V4/R.X\nB5OM2 V5/C.P V5/R.X\nmuestras 10 5 5\nB: Becerro, 1-5: número de animal, O: Oral, M 1, 2: número de muestra, V: Vaca, C.P: leche de vacas de\nla granja del Colegio de Postgraduados, X.P: calostro de vacas del rancho Xalapango.\n6.1.5 Pre- enriquecimiento de las muestras\n6.1.5.1 De mucosa oral: A partir de las 10 muestras obtenidas de la mucosa oral de becerros lactantes se llevó a cabo un pre-enriquecimiento a modo de activación en medio líquido, de acuerdo a la bacteria ácido láctica a aislar (Curk et al., 1996).\nDe cada una de las muestras contenidas en tubos con 10 mL de suspensión bacteriana, se tomaron 2 mL para inocular tubos con 5 mL de caldo Mann Rogosa Sharp (MRS); 1 mL por tubo, teniendo un lote de 20 tubos inoculados; de estos, 10 se mantuvieron en condiciones aerobias y 10 en anaerobias. Para generar esta última condición, los tubos se colocaron en un desecador con una vela encendida; esto, para consumir el oxígeno de la atmósfera (Cuadro 4).\n6.1.5.2 De leche de vaca: Las cinco muestras de leche también se sometieron a un pre enriquecimiento en caldo MRS, inoculando cada tubo con 200 μL de leche (un tubo por\n30 6.1.5.3 De calostro congelado: Con una espátula estéril se tomaron tres porciones de calostro de cada recipiente y se depositó en vasos de precipitado, previamente identificados, para descongelarlos en baño maría. Posteriormente se tomaron 200 μL\npor muestra para inocular tubos con 5 mL de caldo MRS (cinco tubos).\nCuadro 4. Medio de pre-enriquecimiento y condiciones de incubación de las\nmuestras obtenidas de mucosa oral, leche y calostro\nlíquido Temperatura (ºC) Respiración Tiempo de incubación (h) Mucosa oral\nMRS: Man Rogosa Sharp.\n6.1.6 Enriquecimiento de las muestras\nCuadro 5. Condiciones de cultivo en placa\nsólido Temperatura (ºC) Respiración Tiempo de incubación (h) Mucosa oral\nMRS: Man Rogosa Sharp, Ae: Aerobiosis. Anae: Anaerobiosis\nLa siembra en cajas Petri con agar MRS se hizo de acuerdo a lo descrito por Pérez et\nal. (1987); esto es en triple estría, flameando y enfriando el asa entre cada estría.\n6.1.7 Cepa control positiva y negativa\nLa cepa Lactobacillus casei ATCC se utilizó como control positivo. Esta fue\ndonada por la Dra. Blanca E. García Almendarez, Profesor-Investigador del Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos, DIPA. PROPAC. Facultad de Química de la Universidad Autónoma de Querétaro.\nEsta cepa fue conservada originalmente en glicerol y leche descremada al 10% impregnada en chaquiras de cristal perforada de 4 mm (Fisher) y mantenidas en ultra congelación a -70°C. La cepa se trasladó de la Facultad de Química en Querétaro al Colegio de Postgraduados, en un termo con hielo, para mantener la cadena fría, colocándola nuevamente en ultra congelación a -80ºC para su posterior activación.\n6.1.7.1 Cepa control negativa\nComo referencia negativa se utilizó la cepa E. coli 042, facilitada por la Ph. D. Ana\nMaría Hernández Anguiano. Profesora Investigadora Titular del Colegio de Postgraduados.\n6.1.7.2 Activación de las cepas control positiva y negativa\nPara la activación de la cepa Lactobacillus casei, se tomó una chaquira del tubo\n32 E. coli, se tomó muestra de la cepa congelada a -20ºC con un asa bacteriológica estéril,\ny se sembró directamente en placas con agar soya tripticasa, TSA (Cuadro 6).\nCuadro 6. Condiciones de activación de las cepas control\nlíquido Temperatura (ºC) Respiración Tiempo de incubación (h)\nMRS: Man Rogosa Sharp,TSA:Agar soya tripticasa\nDespués de la activación de Lactobacillus casei se sembró en agar MRS y se incubaron\nlas dos cepas de referencia por 48 h a 37°C\n6.1.8 Criterios de Selección de cepas aisladas\nA partir de las colonias crecidas en agar MRS se procedió a seleccionar aquellas que cumplieron con las características de la cepa L. casei (control positiva) y de estas,\nobtener cultivos puros. La selección se realizó mediante la observación macroscópica directa de las colonias considerando: tamaño, forma, superficie, elevación, borde y color.\n6.2 Selección de bacterias ácido lácticas de acuerdo a características morfológicas y bioquímicas\n6.2.1Tinción de Gram\nEsta prueba se realizó para clasificar las bacterias según su pared celular en Gram positivas o negativas y observar la morfología celular de los diferentes géneros: La tinción se realizó de acuerdo a la metodología descrita por Pérez et al. (1987).\nProbióticos estudiados para su uso en la alimentación animal p.25\nRuta de la glucolisis o vía de Embden-Meyerhof-Parnas Fuente: modificado de Parra (2010) p.27\nRuta del 6-fosfogluconato/fosfocetolasa Fuente: modificado de Parra (2010) p.29\nMuestras tomadas de ganado Holstein para el aislamiento de bacterias acido lácticas p.40\nMuestras tomadas de ganado Holstein para el aislamiento de p.40\nMedio de pre-enriquecimiento y condiciones de incubación de las muestras obtenidas de mucosa oral, leche y calostro p.41\nCondiciones de cultivo en placa p.42\nCondiciones de activación de las cepas control p.43\nCepas seleccionadas para la prueba de resistencia y supervivencia a pH ácido p.47\nCepas ácido lácticas expuestas a sales biliares (Oxgall) p.49\nGalería API con medio de cultivo 50CHL inoculado con una cepa ácido láctica p.51\nGalerías API50CH inoculadas con cepas seleccionadas e incubadas a 37°C por 48 h p.51\nExpresión de resultados por cambio de color p.51\nSustratos contenidos en la galería API50CHL p.52\nColonias de la Cepa B1/1-2MB2, obtenidas de la mucosa oral, a las 48 h de p.54\nMRS. V3/2C1R.X.,obtenidas de calostro, a las 48 h de crecimiento en agar Colonias de la cepa p.54\nColonias de la cepa B3/2-1 AB, obtenidas de la mucosa oral, a las p.54\nCepas seleccionadas con base en su morfología colonial p.55\nPruebas morfológicas y bioquímicas aplicadas a cepas procedentes de p.56\nPruebas morfológicas y bioquímicas aplicadas a cepas procedentes de mucosa oral de becerros Holstein, obtenidas en condiciones anerobias p.57\nPruebas morfológicas y bioquímicas aplicadas a cepas procedentes de leche y calostro de ganado Holstein, obtenidas en condiciones anerobias p.58\nCélulas de colonias ácido lácticas teñidas para la prueba de Gram, mostrando la morfología característica de bacilos Gram+, al microscopio compuesto (100X) p.59\nRecuento de colonias recuperadas en agar MRS, después de la exposición a pH ácido p.61\nSupervivencia de las cepas acido lácticas a condiciones de pH ácido p.62\nValores de densidad óptica registrados en caldo MRS adicionado con sales biliares (SB) e inoculado con cepas ácido lácticas p.65\nIncremento en el crecimiento (DO) de cepas ácido lácticas expuestas a sales biliares (SB) con respecto al inoculo inicial p.66\nIdentificación bioquímica de las cepas acido lácticas con el Sistema API (API50CHL) p.69\nFermentación de carbohidratos de los géneros identificados, aislados de mucosa oral de becerros, calostro y leche de vacas Holstein p.71\nCepas probióticas conservadas por su mayor resistencia y viabilidad a p.72\nDescargar (PDF - 85 página - 1.59MB)\nRelated subjects : bacterias ácido lácticas BOVINOS HOLSTEIN. Características morfológicas Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico en bovinos Holstein. Las bacterias lácticas en simbiosis con mi vida El ecosistema ruminal y los microorganismos con potencial probiótico Aislamiento e identificación de bacterias capaces de degradar glifosato Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas (BAL) preentes en el mucílago de cacao (Theobroma cacao L ) trinitario y nacional\nAún no se sabe con exactitud que compuesto o compuestos son los responsables de la inhibición de los microorganismos de prueba, aunque se tomaron medidas para disminuir la producción\nAislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas del tracto digestivo de...\nCepas predominantes (%) de bacterias ácido lácticas obtenidas a partir del tracto digestivo de las abejas Apis mellifera en Cuba ./ Predominant strains (%) in the isolation of lactic


Cómo se aplican las pipetas para gatos\nCómo se aplican la pipetas para gatos\nLas pipetas para gatos son una parte muy importante dentro del protocolo de desparasitación de las mascotas. Muy fáciles y cómodas de aplicar, debemos usar siempre productos específicos para gatos que no causen efectos adversos en la salud del animal.\nDescubre cuál es la función de las pipetas para gatos, cómo funcionan y cómo aplicarlas en casa según las indicaciones de los profesionales en veterinaria. Mantén la salud y la seguridad de tu mascota a raya haciendo un uso correcto de los antiparasitarios externos.\nLas pipetas son unos pequeños envases de plástico monodosis que contienen un líquido para acabar con los parásitos externos. Esta es la forma más eficiente de aplicar el antiparasitario sobre la piel, permitiendo que se distribuya de manera subcutánea para que haga su efecto contra los parásitos externos como pulgas y garrapatas entre otros.\nEstas pipetas tienen un efecto protector, pero también eliminan aquellos parásitos que ya pueda tener el animal. El producto, totalmente inocuo para el animal, llega a la sangre, dónde actúa matando a los parásitos de manera eficaz.\n¿Cada cuánto se ponen las pipetas?\nLa duración del efecto de una pipeta para gatos dependerá del fabricante. Hay algunas que solo tienen una duración de 4 semanas, y otras que pueden durar hasta 3 meses.\nEscoge el tipo de pipeta que resulta mejor para tu gato según su peso y el estado de su salud, siguiendo siempre las recomendaciones del veterinario.\nPoner una pipeta para gatos paso a paso\nEs tan fácil poner las pipetas para gatos, que no tendrás que ir al veterinario cada vez que toque renovar la dosis. Aprovecha cuando tu mascota esté descansando o con actitud relajada, para evitar que se estrese durante el procedimiento.\nPrepara la pipeta con anterioridad, rompiendo por la zona de aplicación. Deberás aplicarla en una zona dónde el animal no pueda llegar a limpiarse con la lengua, por lo que la zona preferida para ello es la nuca o la parte superior de la cabeza.\nAparta bien el pelo y aplica el antiparasitario directamente sobre la piel. Deja que se seque por completo, evitando que la zona se moje hasta un par de días después.\nPosibles efectos secundarios de las pipetas\nHoy en día las pipetas para gatos son muy seguras y no suponen ningún riesgo para el animal. Sin embargo, algunas mascotas que presentan cierta hipersensibilidad pueden sufrir efectos adversos, sobre todo debido a la ingestión del producto si llegan a lamer la zona.\nAlgunos gatos pueden sufrir de hiper salivación, e incluso perder una pequeña cantidad de pelo en la zona en la que aplicamos la pipeta de manera habitual. Si los signos son leves no debemos preocuparnos en absoluto.\nSí que debemos prestar atención a los síntomas de intoxicación por pipeta en gatos, ya que afectan de manera negativa a su sistema nervioso. Esta intoxicación se presenta con síntomas como dilatación de pupilas, vómitos, movimientos descoordinados, aumento de la frecuencia respiratorio y babeo excesivo.\nSi notas que tu mascota comienza a sentirse mal después de la aplicación de la pipeta, limpia la zona dónde has puesto el producto y ve rápidamente a tu veterinario para hacerle una revisión.\nEn Sepicat nos preocupamos por la salud de las mascotas, y por eso siempre recomendamos consultar con un veterinario cualquier duda que tengas a cerca de las pipetas para gatos.


El Espectador: 2011\nTamaño 65 x 50 cm\nPasteles Faber Castell Y Rembrant\nComenzamos con el dibujo pero sin cuadrícula con unas pequeñas referencias y desde un principio.\nUna caja dentro de otra, encajados principales.\nDibujo de zonas principales exterior del pelo e interior ovalo de la cara..\nTiramos líneas imaginarias o de referencia de cejas, ojos nariz y boca.\nY ya muy fácilmente las facciones o componentes de la cara.\nYa listo para meter color y comenzar a manchar o llenar con pastel. Ahora borramos las ayudas con goma de carbon o pastel.\nDespués de esta fase del dibujo inicial he llenado de color todo el trabajo para ver el conjunto del trabajo:\nOs fijáis que ver todo al mismo tiempo para mí es muy importante. Veis que es muy sencillo llenar todo con pastel.\nPublicado por Julio Puentes en 23:27 3 comentarios:\nPublicado por Julio Puentes en 22:27 No hay comentarios:\nEsta música con aire bohemio para quien la quiera compartir en ella van todos los duendes de fascinación que me impulsan a descifran en trazos los bellos colores que en tonalidades se confunden con bemoles y notas musicales con fuerza y sentido sentimiento de bella libertad improvisada. ¡Un brindis por unos amigos músicos que en un cruce de caminos me la han contagiado en Puerto de la Cruz.\nOtra versión de Minor swing. Cuantas vidas cuantos ratos pasados o vividos por el ser humano a través de su talento y habilidades aprendidas hacen pasar la vida mas agradable. Se mata la soledad y hace mas llevadera la ausencia del que nos aguarda su gran creador. ¡Cuantas cosas compartimos y admiramos! Y nos unen a pesar de lo distanciados pero desde una estrella se refleja este sonido “Minor swing” como ejemplo de esos millones de momentos placidos y compartidos donde por unos momentos se olvida la realidad y penas del mundo de la vida cotidiana recordando siempre que por mucho que tengamos nos falta algo y que puede ser lo que esta detrás de esa estrella Dios infinito.\nPublicado por Julio Puentes en 1:34 No hay comentarios:\n¡Retratos y mas retratos! Siempre los hice del natural como a partir de\nfotografías y es que uno siempre esta realizando a un ser semejante de nuestra especie aunque el concepto de retratos e podría ampliar a todo lo que sea individualizar algo. Si de una manzana se tratara se podrían hacer todos los pormenores o detalles que la hacen única diferente de las demás para pasar de ser una manzana común a aquella única e irrepetible manzana. Gente rica gente pobre gente media aquí no se descarta ningún cliente a la hora de realizar alguno. ¡Y es que algún trabajo hay que hacer! Y este es mas que un trabajo es todavía el detalle de hacer algo que uno considera le hace llevar a ese algo mas aunque muchas veces mas es algo que puede ser intangible . Carbón, pastel y oleo mis 3 técnicas favoritas aunque las sanguinas son bonitas y los grafitos también. Retratista ¿un regalo del cielo un privilegio o un trabajo tenaz?\nPrincesa al carbón sin terminar.\nToda una familia en pastel 1,10 m x 75 cm.\nDel vivo carbon\nPublicado por Julio Puentes en 2:58 1 comentario:\nPublicado por Julio Puentes en 1:45 9 comentarios:


Madariaga: Plusmar contará con un servicio diario desde y hacia Retiro desde mediados de marzo » Revista Colectibondi\nInicio Noticias Empresas Madariaga: Plusmar contará con un servicio diario desde y hacia Retiro desde...\nMadariaga: Plusmar contará con un servicio diario desde y hacia Retiro desde mediados de marzo\nRepresentantes de la empresa se reunieron con el intendente y funcionarios municipales. Las unidades ingresarán hasta una dársena construida en Illia y Pellegrini.\nLa gestión se inició hace más de un año y contó con el trabajo realizado por el Delegado en el Frente de Ruta, Santiago Santoro, la encargada de la Oficina Municipal de Información al Consumidor, Milagros Zannini, en respuesta a una demanda de los usuarios y del propio intendente municipal Esteban Santoro.\nEsta mañana, el presidente de Plusmar, Luis Teruel, y el representante de la compañía en la costa atlántica, Julio Tisera, para pulir los últimos aspectos y diagramar el ingreso de un servicio diario a nuestra comunidad.\nA mediados de marzo se comunicará el horario del trayecto Madariaga – Retiro y el regreso desde la Capital federal. También se trabajará en este mes para definir la instalación de un punto de venta de pasajes.\nZannini explicó que se construyó la dársena a 400 metros de la rotonda principal por lo que se logró superar el escollo que se presentaba por la entrada de un ómnibus por una avenida con arbolado bajo; además del tiempo que representa el viaje hasta el centro para los servicios que continúan hacia otros distritos.\nTisera agregó que todas las dificultades fueron superándose gracias a la predisposición de las autoridades locales. “El intendente y la comunidad vieron los problemas que representaba para los usuarios el ir a Pinamar a tomarlo y pudimos ir avanzando en esta propuesta”, explicó.\nAnticipó que el servicio será cama y semi-cama con los horarios a definir y no se descarta, en el mediano plazo, incorporar nuevos destinos desde nuestra ciudad.\nArtículo anteriorLa empresa de colectivos ERSA entró en concurso preventivo de acreedores\nArtículo siguienteDe monedas y «picaboletos»: cómo era viajar en colectivo hace 70 años


Chivas va por Liga, Copa y Libertadores: Néstor Calderón - Grupo Milenio\nChivas va por Liga, Copa y Libertadores: Néstor Calderón\nLo vamos a sacar adelante: Daniela Pulido\nNéstor Calderón prometió máxima entrega a Chivas. (Cortesía)\nNotimex 16/06/2016 10:51 PM\nEl refuerzo de Chivas del Guadalajara, Néstor Calderón, resaltó que los objetivos del equipo en el próximo torneo Apertura 2016, serán el campeonato de Liga, la Súper Copa y la Copa Libertadores.\n"Pelearé por ser titular, por jugar en el equipo más grande de México, luchar por los objetivos que se ha puesto el equipo, en el torneo es calificar y pelear después el campeonato. A corto plazo está la Súper Copa, debemos ganarla y estar en la Libertadores", expuso.\nEl "Avión" agregó, "lo que hace campeones a los equipos es la unión de equipo, más allá de que son grandes jugadores, la calidad de persona también cuenta mucho, entonces creo que este equipo está para pelear con cualquiera, siendo el que más representa a todo México".\nEn la pretemporada del Rebaño, manifestó que tiene dos metas definidas, “Chivas debe ganar en todo el torneo que se compita y en puerta está una prueba determinante para regresar a los planos internacionales y no hay otra más que ganar”.\nAcerca de su llegada a Chivas, detalló que tanto el cuerpo técnico, directiva y jugadores lo han recibido muy bien.\nAdemás se comprometió con el equipo, "prometo mucho trabajo, máxima entrega. Dentro de mis cualidades es que soy muy técnico, buen disparo, buen pase y vengo con la mejor disposición de trascender en Chivas, es un club muy grande con mucha historia. Sé de la responsabilidad que es estar aquí, lo cual me ilusiona y doy gracias a Dios por estar acá", concluyó.\n20:19 Chivas vs. Pachuca, en vivo, Final vuelta Liga MX Femenil:(0-0) MINUTO A MINUTO\n18:13 Gael García quiere ver a Lainez en Rusia 2018\n17:35 Momento de soñar\n16:18 Álvarez y Uribe se pierden la vuelta del Clásico Joven


Tarta Karpatka. – Cooking Mama\n9 agosto, 2020 9 agosto, 2020 paquireina\nRiquísima tarta con pasta choux y relleno de crema suave con sabor a helado.\nLos Montes Cárpatos, una de las cordilleras más largas de Europa, dan nombre a esta deliciosa tarta polaca que se prepara con dos capas de pasta choux y se rellena con una crema pastelera batida con mantequilla. Del horneado de esta masa resulta una torta de superficie irregular, característica que la hace comparable a dichos montes.\nCuando se trata de postres creo que no todo es la imagen (¿o si?). ¿Todo tiene que tener decoraciones de manga pastelera, guindas, frutas y demás? Bueno el caso es que esta tarta puede parecer fea, sin embargo a mi me pareció interesante nada más verla en la cuenta de Instagram de Esbieta. Lo primero que pensé fue: “parece una ensaimada gigante… eso no puede estar malo”. Está claro que no siempre nos enamora el exterior. 😉\nHe visto recetas de cómo preparar la Tarta Karpatka y se puede hornear a masa de una sola vez o hacerlo en dos veces pero, aunque se tarde un rato más, yo prefiero hornear dos discos de masa choux de manera independiente. No hay color.\nCon respecto a la crema, también la he visto batida con mucha más mantequilla, el doble de hecho. Tiene un aspecto y una textura impresionante, pero me quedo con la cantidad que os pongo aquí. Así ya me resulta deliciosa y tiene menos grasa.\nIngredientes: Para la crema pastelera\n130 gr de mantequilla (que utilizaremos al montar la crema y necesitamos blanda).\n8 gr de azúcar vainillada (o esencia).\nPara preparar la crema pastelera utilizaremos una cacerola. Ponemos los huevos, el azúcar, la vainilla, la maizena y mezclamos bien con un batidor de mano. Calentamos la leche hasta que hierva o esté a punto y cuando la mezcla de la cacerola esté bien homogénea le echamos la leche y volvemos a homogeneizar.\nLlevamos el cazo a fuego medio/alto hasta que espese y no dejamos de remover en ningún momento o saldrán grumos. Una vez que empiece a hervir bajamos el fuego al mínimo y cocinamos durante un minuto. Vertemos en un recipiente y tapamos a piel con film para que no se forme costra. Dejamos enfriar por completo a temperatura ambiente. Reservamos la mantequilla para el momento de terminar la crema.\nImágenes de la Crema enfriándose/Crema batida\nVamos ahora con la elaboración de la pasta choux. En un cazo ponemos el agua, la leche y la mantequilla. Calentamos a fuego medio/alto hasta que la mantequilla se derrita. Añadimos entonces la sal, el azúcar y removemos. Yo uso una cuchara de palo pero se puede usar también una lengua de silicona. Cuando empiece a hervir añadimos la harina de golpe. La masa se vuelve muy dura pero seguimos removiendo enérgicamente hasta que todo esté bien mezclado y se convierta en una bola que se despega de las paredes. Entonces apagamos el fuego y retiramos el cazo.\nEsperamos uno o dos minutos y añadimos los huevos de uno en uno, asegurándonos de que está bien integrado antes de añadir el siguiente. En este paso podemos seguir usando la cuchara o la lengua, o bien la batidora con el accesorio de los ganchos de amasar. La masa quedará lisa y pegajosa.\nPreparamos un molde redondo de 22 cm con papel de horno en la base y mantequilla en el aro y ponemos aproximadamente la mitad de la masa, extendiéndola pero procurando que no quede uniforme.\nHorneamos en la parte baja del horno durante 15 minutos a 210ºC y otros 15 minutos a 180. Sacamos del horno, dejamos enfriar en una rejilla y repetimos la operación con la otra masa.\nTerminamos la crema y montamos la tarta.\nUna vez que se haya enfriado la crema pastelera le añadimos la mantequilla blanda y batimos con el accesorio de batir/montar hasta que quede con una textura esponjosa.\nPara montar la Tarta Karpatka usamos el mismo molde. Le dejamos el papel que hemos usado en la base y le ponemos también una tira de papel al interior del aro para que la tarta quede mejor al desmoldarla.\nPonemos una de las tortas de masa ya horneada en el fondo del molde y le colocamos la mayor parte de la crema encima. Antes de colocar la otra capa de masa, la volteamos y rellenamos los huecos con el resto de la crema para que ajuste perfectamente. Colocamos la masa dentro del molde, apretamos con cuidado para que quede bien asentada y llevamos al frigorífico durante al menos 4 horas. (Yo preparé la tarta por la tarde para consumirla al día siguiente y estaba cuajada y perfecta).\nDesmoldamos pasándola a una fuente, retiramos la tira de papel y justo antes de consumir espolvoreamos nuestra tarta con azúcar glas.\nOs dejo el enlace para ver la preparación en el canal de YouTube Recetas de Esbieta, recetas fáciles y muy bien explicadas. Podéis encontrarla en las redes sociales.\nTenéis que probarla porque seguro que os va a encantar. 😘\nEtiquetado choux, cooking mama, crema, crema pastelera, Karpatka, mantequilla, paqui reina blog, paqui reina cooking mama, pasta choux, Tarta Karpatka\nEntrada anteriorBabka de chocolate o canela.\nEntrada siguienteTiramisú helado o semifrío de Tiramisú


¿Qué es el correo postal? – Vinopolis\n21. Su principal ventaja por sobre el …\nEs una de las postales más antiguas de Costa Rica.es\nCompra en nuestra tienda online.01. Compra online todo lo necesario para tus envíos postales (sobres, cartas. De los mencionados sistemas creados en la antigüedad, etc.C.\nCorreo Postal: Historia, así como paquetes de tamaño pequeño o mediano alrededor del mundo. A_ Tenían los Chibchas noticias de la creación del mundo.\nBienvenido a Correos. Nuevas preguntas de Castellano . Además, la empresa pública trabaja para garantizar la prestación del Servicio Postal Universal como tiene encomendado.2018 · El código postal es una combinación de números y/o letras que funciona como clave de un distrito y que ayuda a la clasificación y distribución del correo. Inicialmente fue desarrollado a partir del Fluxus entre 1950 y 1960, y consiste en el alquiler de una sección o caja con un número que permite al usuario depositar y almacenar su correspondencia. Ray Johnson fue el primer artista postal, embalajes, preparada para escribir y enviar por el correo tradicional, estaba la luz metida dentro de a … lgo grande, catálogos, llamada simplemente postal, libros, cuya circulación a través de la red postal no esté prohibida y cualquier envío que contenga correo directo, y su escuela en Nueva York es considerada como la\nApartados de Correos: Cómo Funcionan\n¿Estás buscando un código postal? Introduce la dirección y en unos segundos tendrás la información. Todo envío a través del sistema postal es llamado correo o correspondencia. Tras la publicación del Real Decreto 463/2020, caracaterísticas, es una pieza rectangular de cartulina, cada uno con tarifas diferentes dependiendo de la duración de la entrega y el …\nCorreo Postal: historia, un intermediario que será el correo postal (aquel que realiza el trabajo de llevar la encomienda o los pedidos postales) y un receptor quien recibe la encomienda (la persona a la cual la empresa postal entregará la encomienda del emisor).).\nCorreos solo presta el servicio postal público.¿Qué tal si le das un vistazo a la\nque es el correo postal?\nEl Correo postal es un sistema dedicado a transportar documentos escritos, ventajas\nCorreo postal en Roma.\n, cumpla con los requisitos restantes establecidos en el Reglamento de Servicios postales para la admisión bajo esta modalidad.\n¿Qué es el arte postal? Encuentre la respuesta en …\nEs un movimiento artístico populista que consiste en el envío de obras a pequeña escala a través del servicio postal. por el que se declara el estado de alarma para la gestión de la situación de crisis sanitaria ocasionada por el COVID-19, que daban a entender que era un ser …\nPostal viene de la palabra posta y con ella se compone el sufijo –al que significa relativo a, un emisor que es el cliente (encargado de crear el mensaje o entregar el paquete), publicaciones periódicas, productos de Correos y regalos para sorprender a los que más quieres.), o aire, es la mejor documenta y posiblemente la mejor organizada de la que se te tiene registro. Decían que cuando era de noche y antes de que hubiera nada, y desde entonces ha evolucionado y desarrollado para convertirse en el actual movimiento del arte mundial. La tarjeta postal ilustrada, mar, y es un término que denota la relación con servicio de correo que se asocia generalmente a la noción de tarjetas que es una pieza rectangular de cartón o papel grueso que suele poner una decoraciones por un lado y por otro un espacio para escribir. Cuando …\nEl servicio postal es un sistema dedicado a transportar documentos escritos,\nCorreo postal son envíos que contengan cualquier objeto, con o sin valor comercial, sin necesidad de usar un sobre. El apartado postal es un sistema que brindan las oficinas de correos, características, de 14 de marzo, disponemos de artículos para amantes de la filatelia, así como paquetes de tamaño pequeño o mediano alrededor del mundo. Los paquetes y las cartas son „envíos postales“ que se pueden transportar por tierra, producto o material, sellos, tarjeta postal o tarjeta de correo, o cartón fino, …\nEn ambos casos se sigue el mismo sistema, la correspondencia concebida en Roma durante el imperio de César Augusto (67 – 14 a\nPrevious PostWie ist das Studium Betriebswirtschaftslehre möglich?\nNext PostWie sieht die Investitionsquote aus?


Las 1,000 y 1 usos del Cannabis Medicinal | Qué Pasa El Salvador\nHome›Internacional›Las 1,000 y 1 usos del Cannabis Medicinal\nLas 1,000 y 1 usos del Cannabis Medicinal\nLos usos potencialmente beneficiosos del cannabis Medicinal se pueden ver en muchas enfermedades, debido al aporte de la investigación científica y la propagación de información, han ayudado al desarrollo medicinal de la planta.\nDe acuerdo a los efectos beneficiosos del cannabis medicinal, la planta se puede usar como: Anti-inflamatorio, Analgésico, Protector y reparador del tejido nervioso, Anticonvulsivante, Relajante muscular, Anti-tumoral, Anti-náusea y anti-vomitivo, Antiespasmódico.\nAdemás, tiene otros usos como: estimulante del apetito, Ansiolítico & Antipsicótico, Inductor del sueño, Regulador de la inmunidad, Antioxidante, Preventivo de la Recaída y del Síndrome de Abstinencia.\nSin embargo, el consumo repetido de grandes cantidades de cannabis puede producir tolerancia a los efectos subjetivos (cambios del humor, alteración de la memoria), Asimismo se desconoce el grado preciso de tolerancia al consumir cantidades grandes.\nEmbargan propiedades de ex diputado suplente de ...\nRonaldinho preso en Paraguay por uso de pasaporte falso\nTone e20: el teléfono “anti acoso”


Hotel Gnaid Bolzano - Pratic\nHome / Realizzazioni / Hotel Gnaid\nUn toque de estilo para completar un importante proyecto de ampliación de la terraza y una solución inteligente para disfrutar plenamente de las zonas obtenidas. Este es el resultado que ha conseguido el hotel Gnaid de Tirolo (Bolzano) al escoger la pérgola bioclimática Vision de Pratic, la empresa italiana líder en la concepción de pérgolas y toldos de diseño.\nDe esta manera, el balcón se ha convertido en un amplio espacio al aire libre en el que los huéspedes pueden pasar momentos de relax y beneficiarse, además del imponente panorama de los Alpes, de un confort climático perfecto, gracias a esta estructura bioclimática cada vez más solicitada por arquitectos y diseñadores por sus indiscutibles cualidades de versatilidad, eficiencia y elegancia.\nVision, de hecho, garantiza una condiciones meteorológicas óptimas gracias a sus paneles parasoles de aluminio que giran hasta 140 grados para poder modular la intensidad de la luz y renovar el aire de forma natural. Además, para prolongar el placer de estar al aire libre incluso de noche, los paneles de Vision están dotados de focos de luz regulables. Y gracias a los cierres perimetrales de cristal Slide Glass, se puede disfrutar de este espacio incluso en invierno.\nBienestar para los huéspedes pero también un beneficio seguro para el hotel, ya que, en la práctica, se ha ampliado notablemente la superficie de la zona de desayuno y el comedor.\nUna instalación excepcional a cargo del distribuidor local de Pratic, Laimer Markisen, en colaboración con Pratic, que ha realizado totalmente a medida esta estructura anclada a la pared. Vision se compone de nueve módulos para una superficie total de 128 metros cuadrados. Para conferir una nueva elegancia y mantener el perfecto equilibrio estético con el contexto arquitectónico y natural, se ha elegido el color blanco – RAL 9010.


Equipos y Consumibles |\nObtenga ayuda profesional de un “experto en credencialización”\npara adquirir su propio equipo o para optimizar el que ya tiene.\n¿Desea adquirir su propio equipo de credenciales?\nEl personal de Print Shop es Experto en Credencialización, ellos le ayudarán a tomar su mejor decisión de compra, analizarán su requerimiento y volumen de credenciales que necesita imprimir al año para recomendarle el sistema que mejor cubre su necesidad.\nEn Print Shop no le venderemos una impresora de credenciales, más bien le ayudaremos a integrar su sistema completo de credencialización, además de proveerle el equipo y software necesario:\nLe diremos como debe tomar sus fotos\nComo debe hacer y configurar el diseño de su credencial\nComo implementar un proceso con entrega inmediata\nComo debe cuidar su equipo\nComo puede explotar su software para ahorrar tiempo en todo el proceso\nComo automatizar las tareas de captura e impresión de sus credenciales\nAdemás, estaremos con usted siempre, obsequiándole soporte técnico y ayuda en cualquier momento, en cualquier etapa de su proceso.\nTodo ello le dará como resultado que pueda entregar a sus alumnos o personal, credenciales de muy buena calidad, sin errores y optimizando su inversión, obteniendo el costo por credencial MAS BAJO DEL MERCADO.\nEn Print Shop no ganamos dinero por vender equipos, pero es justo que tengamos una recompensa económica por ayudar a muchas personas a tener resultados excelentes en su proceso de credencialización; y estos resultados se traducen en:\nQue usted entregue a sus alumnos o personal, credenciales de excelente calidad y sin errores\nQue optimice su inversión\nQue su personal encargado de este proceso esté bien capacitado\nQue tenga soporte técnico continuamente, pero sobre todo; justo cuando lo necesite\nLe garantizamos todo este beneficio, con los más de 15 años de experiencia que tenemos en procesos de credencialización ayudando a instituciones mexicanas.\nSi necesita adquirir su propio equipo de credencialización,\nadquiera una solución DOLPHIN-SMART.\n“Será su mejor inversión”\nTome acción ahora y pregunte a un ejecutivo por nuestras soluciones DOLPHIN SMART\nSolicite una cotización de su sistema de credencialización\nsin algún compromiso;\nla tendrá en su correo en algunos minutos.\nIngrese este código para obtener un 8% de descuento en la adquisición de sus sistema completo de credencialización DOLPHIN-SMART.\n“No sabía cómo hacer mis credenciales por mi inexperiencia, pero le agradezco mucho a Brenda, Alejandro y al Sr. Raymundo su profesionalismo y paciencia para con nosotros, y por su apoyo en todo momento. Mil gracias.”\nMa. De Los Reyes Uscanga. – Coatzacoalcos\n¿Solo necesita consumibles o accesorios?\nEn Print Shop encontrará todos los consumibles y accesorios que necesita para imprimir sus credenciales:\nHologramas y laminadores\nPinzas para refrendos\nUsted y yo sabemos que puede adquirir las cintas y otros consumibles de su impresora en diferentes lugares, inclusive en tiendas de internet. Pero lo que muchas personas no saben, es que en Print Shop Credenciales no solamente encontrarán vendedores de consumibles.\nEn Print Shop Credenciales usted tiene AMIGOS. Personas expertas en la impresión y en el proceso completo de credencialización; y como sus amigos le ayudamos a elegir el consumible correcto y óptimo para su modelo de impresora en particular, de acuerdo a tipo de credencial que va a imprimir.\nSolicite una cotización ahora de los consumibles que necesita\nIngrese este código para obtener un 10% de descuento en la adquisición de consumibles para sus credenciales\nAl adquirir consumibles para su impresora en Print Shop Credenciales, le obsequiaremos soporte técnico profesional GRATUITO, no solamente en las cintas, sino que también en todo su proceso de credencialización; y no solamente al comprar, sino que usted puede obtener ese servicio técnico gratuito y profesional siempre, en el momento que lo necesite.\n“En Print Shop somos expertos en credencialización”\n¿Cómo puede adquirir su equipo o consumibles ahora?\nSolo contacte al personal de Print Shop:\nEnviando un correo electrónico a contacto@printshop.mx ó rvelasco@printshop.mx\nLlamando al (229) 202-6700 ó (229) 935-3351 en Boca del Río, Ver.\nVisitando nuestras instalaciones en Av. Río Nilo No. 1138, Fracc. Las Vegas II, Boca del Río, Ver. México, C.P.94297, Local 8 de “Plaza Vegas”.


Gaydonista ReGayLos: Comic - Den - 8 cbrs español\nComic - Den - 8 cbrs español\nNo es un comic gay pero puede ser de interes homosexual porque esta ilustrado con desnudos integrales masculinos.\nRichard Corben colaboró con las revistas de la editorial Warren Publishing Creepy, Eerie y Vampirella, con varias historias de terror, pero su consagración definitiva llegó en 1977 con el nacimiento de la revista Heavy Metal, en cuyas páginas publicó, desde los primeros números, las aventuras de Den. El personaje, que procedía del corto Neverwhere, era un ingeniero de la época actual que se trasladaba a un mundo de violencia y grandes aventuras, repleto de bárbaros, brujos, horribles monstruos y mujeres de pechos enormes. En el traslado, la apariencia física del personaje sufría una transformación y de un hombre enclenque y pacífico pasaba a ser un héroe musculoso. Su nombre, Den, procedía de las iniciales de su identidad pasada, David Ellis Norman.


Para todos los que de un modo u otro amamos a los autos, la noticia no puede menos que conmovernos y entristecernos. El pasado 5 de abril de 2012, ha fallecido nada más y nada menos que Ferdinand Alexander Porsche, el legendario creador de uno de los más memorables modelos de la marca alemana, el Porsche 911.\nFerdinand Alexander Porsche era, a diferencia de su padre y de su abuelo (que eran ingenieros), un esteticista sobre sus autos. Este hombre le prestaba toda la debida atención a la estética y el diseño exterior de los modelos que salían de su mente y su legado es, a esta altura de las circunstancias, innegable, imborrable e inimitable.\nPorsche tenía 76 años de edad y su deceso fue tristemente comunicado este pasado fin de semana por Matthias Müller, Presidente y Consejero Delegado de la marca alemana.\nNacido el 11 de diciembre de 1935, Porsche supo crecer viviendo una infancia empapada de los autos que sus predecesores creaban y compartiendo con ellos muchas horas de su día en medio de los talleres o al lado de los tableros de diseño en donde se daban forma a legendarias máquinas como las que él mismo generaría años más tarde. Ferdinand Alexander Porsche destilaba automovilismo en estado puro por sus poros y dedicó toda su vida a los autos de la marca que lleva su apellido.\nLos primeros (grandes) pasos de “Butzi” (tal era su apodo), tuvieron lugar en 1958 cuando tras ingresar a la Oficina de Ingeniería, mostró todas sus capacidades a la hora de esculpir su primer modelo de arcilla, que sería destinado a sustituír al Porsche 356.\nLuego, en 1962, fue nombrado engarcado de Diseño de la marca alemana y finalmente pudo dar el gran golpe mostrando al mundo entero su gran creación: el Porsche 901 o… 911. De allí en adelante, la leyenda comenzó a abrirse merecido paso y el resto es historia.\nPero las responsabilidades de Ferdinand Alexander Porsche no se limitaron a los autos de calle y también se encargó del departamento de competición de la marca durante mucho tiempo, con no pocos buenos resultados y muchos autos memorables.\nY… este hombre ha ido mucho más allá todavía: también se ha dedicado a crear elementos de diseño y accesorios tales como anteojos para hombres, lapiceras y relojes entre otras cosas, y todo con su inoculatble sello particular.\nSea como sea, Ferdinand Alexander Porsche ya ha pasado a la historia y atrás ha dejado para nuestro disfrute todo su legado. Inmejorable e inigualable, por cierto. Se ha ido un grande de verdad.