Jak interpretovat matici procento identity vytvořenou Clustal Omega? - Informace - 2022\nJak interpretovat matici procent identity vytvořenou Clustal Omega?\nProvedl jsem vícenásobné zarovnání sekvencí pomocí Clustal omega. ověřena podobnost pro 3 proteinové sekvence: aspartylaminopeptidáza [Homo sapiens], aminopeptidáza P (APP) [Plasmodium falciparum 3D7], kvasinková aminopeptidáza (S000001586)APE1. Mám Procentní matici identity jako\nProcentní identitní matice - vytvořil Clustal2.1\n1: PF3D7_1454400 100,00 16,18 20,35 2: gi|5902181|gb|AAD01211,2| 16,18 100,00 29,66 3: S000001586 20,35 29,66 100,00\nChtěl bych vědět, jak interpretovat tento výsledek matice\nKdyž se vrátím k výsledkům zarovnání sekvence, když kliknu na „Zobrazit barvy“, shrnutí zarovnání je vybarveno ve 4 barvách - červené, zelené, modré a růžové. Může mi někdo pomoci s dekódováním barevné reference souhrnu zarovnání?\nGen-1 Gen-2 Gen-3 Gen-1 100,00 16,18 20,35 Gen-2 16,18 100,00 29,66 Gen-3 20,35 29,66 100,00\nGene-1 a Gene-1 mají 100% podobnost (a všechny ostatní diagonální prvky). Gene-1 a Gene-2 mají 16,15% podobnost atd. Matice je proto symetrickáM (i, j) = M (j, i).\nMůžete také zobrazit pouze horní trojúhelníkovou část této matice a to by stačilo.\nGen-1 Gen-2 Gen-3 Gen-1 100,00 16,18 20,35 Gen-2 100,00 29,66 Gen-3 100,00\nBarvy v zásadě označují typ (molekulární povahu) zbytku. Podívejte se na toto a toto.\nClustal Omega je nejnovějším přírůstkem do rodiny Clustal. Nabízí výrazné zvýšení škálovatelnosti oproti předchozím verzím, což umožňuje zarovnání stovek tisíc sekvencí během několika hodin. Bude také využívat více procesorů, pokud jsou k dispozici. Kromě toho je kvalita zarovnání lepší než předchozí verze, měřeno řadou oblíbených benchmarků.\nVezměte prosím na vědomí, že Clustal Omega je v současné době nástroj pouze pro příkazový řádek.\nWebové rozhraní pro Clustal Omega je dostupné na: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/\nSpuštění nástroje z webového formuláře je jednoduchý proces s několika kroky, který začíná v horní části stránky a postupuje podle pokynů až do spodní části.\nKaždý nástroj má alespoň 2 kroky, ale většina z nich má více:\nPrvní kroky jsou obvykle tam, kde uživatel nastaví vstup nástroje (např. sekvence, databáze. )\nV následujících krocích má uživatel možnost změnit výchozí parametry nástroje\nA konečně, posledním krokem je vždy krok odeslání nástroje, kde uživatel může určit název, který má být spojen s výsledky, a e -mailovou adresu pro e -mailové oznámení. Pomocí tlačítka Odeslat efektivně odešlete informace uvedené dříve ve formuláři pro spuštění nástroje na serveru\nUpozorňujeme, že parametry jsou ověřovány před spuštěním nástroje na serveru a v případě chybějící nebo nesprávné kombinace parametrů bude uživatel upozorněn přímo ve formuláři.\nKrok 1 - Sekvence\nOkno pro zadávání sekvencí\nPřímo do tohoto pole lze zadat tři nebo více sekvencí, které mají být zarovnány. Sekvence mohou být ve formátu GCG, FASTA, EMBL (pouze nukleotidy), GenBank, PIR/NBRF, PHYLIP nebo UniProtKB/Swiss-Prot (pouze proteiny). (Viz příklady vstupních formátů). Částečně formátované sekvence nejsou akceptovány. Přidání návratu na konec sekvence může pomoci určitým aplikacím porozumět vstupu. Přímé používání dat z textových procesorů může přinést nepředvídatelné výsledky, protože mohou být přítomny skryté/řídicí znaky.\nNahrání sekvenčního souboru\nSoubor obsahující tři nebo více platných sekvencí v libovolném formátu (GCG, FASTA, EMBL (pouze Nucleotide), GenBank, PIR, NBRF, PHYLIP nebo UniProtKB/Swiss-Prot (pouze protein)) lze nahrát a použít jako vstup pro více zarovnání sekvence. (Viz příklady vstupních formátů). Soubory textového procesoru mohou přinést nepředvídatelné výsledky, protože v souborech mohou být skryté/řídicí znaky. Nejlepší je ukládat soubory s možností formátu Unix, abyste se vyhnuli skrytým znakům Windows.\nDefinuje typ sekvencí, které mají být zarovnány\nKrok 2 - Nastavte své parametry\nDealignovat vstupní sekvence\nOdstraňte veškeré existující zarovnání (mezery) ze vstupních sekvencí.\nVýchozí hodnota je: no [false]\nFormát výstupního zarovnání\nFormát pro generované vícenásobné zarovnání. (Viz příklady výstupních formátů).\nClustální formát zarovnání s číslováním bází/zbytků\nVýchozí hodnota je: ClustalW s počtem znaků [clustal_num]\nStrom stromů klastrování podobný mBed\nTato možnost používá vzorek vstupních sekvencí a poté představuje všechny sekvence jako vektory těchto sekvencí, což umožňuje mnohem rychlejší generování vodicího stromu, zvláště když je počet sekvencí velký.\nVýchozí hodnota je: ano [true]\nIterace shlukování podobná mBed\nBěhem následných iterací použijte klastrování podobné mBed.\nPočet kombinovaných iterací\nPočet iterací (kombinovaný vodicí strom/HMM). Hodnoty 0-5.\nVýchozí hodnota je: default(0) \nMaximální počet iterací stromu průvodce\nPo nastavení počtu kombinovaných iterací lze tento parametr změnit, aby se omezil počet iterací vodicích stromů v rámci kombinovaných iterací. Hodnoty - 1 (vypnuto) nebo 1-5.\nVýchozí hodnota je: výchozí [-1]\nMax Iterace HMM\nPo nastavení počtu kombinovaných iterací lze tento parametr změnit, aby se omezil počet iterací HMM v rámci kombinovaných iterací. Hodnoty - 1 (vypnuto) nebo 1-5.\nPořadí, ve kterém se sekvence objeví v konečném zarovnání\nzarovnaný Určeno zarovnáním zarovnaný\nvstup Pořadí zadávání je zachováno vstup\nKrok 3 - Podání\nVýsledek nástroje je možné identifikovat zadáním názvu. Tento název bude spojen s výsledky a může se objevit v některých grafických znázorněních výsledků.\nSpuštění nástroje je obvykle interaktivní proces, výsledky jsou dodávány přímo do prohlížeče, jakmile jsou k dispozici. V závislosti na nástroji a jeho vstupních parametrech to může trvat poměrně dlouho. Je možné být informováni e-mailem, když je úloha dokončena, jednoduše zaškrtnutím políčka „Být upozorněno e-mailem“. E -mail s odkazem na výsledky bude odeslán na e -mailovou adresu uvedenou v odpovídajícím textovém poli. E -mailová oznámení vyžadují platné e -mailové adresy.\nJe-li požadováno upozornění e-mailem, musí být uvedena platná internetová e-mailová adresa ve tvaru [email protected] To není vyžadováno při interaktivním spouštění nástroje (výsledky budou doručeny do okna prohlížeče, jakmile budou připraveny).\nStandardní metodou měření přesnosti více algoritmů zarovnání je použití srovnávacích testovacích sad referenčních zarovnání generovaných odkazem na trojrozměrné struktury. Zde uvádíme výsledky z řady balíčků testovaných na třech benchmarcích: BAliBASE (Thompson a kol(2005), Prefab (Edgar, 2004) a rozšířená verze HomFam (Blackshields a kol, 2010). Pro tyto testy pouze hlásíme výsledky s použitím výchozího nastavení pro všechny programy, ale se dvěma výjimkami, které byly potřeba k tomu, aby umožnily MUSCLE (Edgar, 2004) a MAFFT sladit největší testovací případy v HomFam. Pro testovací případy se sekvencemi & gt3000 spouštíme MUSCLE s parametrem –maxiter nastaveným na 2, abychom zarovnání dokončili v rozumných časech. Za druhé, spustili jsme několik různých programů z balíčku MAFFT. MAFFT (Katoh a kol, 2002) se skládá ze série programů, které lze spustit samostatně nebo je lze automaticky volat ze skriptu s -auto sada vlajek. Tento příznak volí spuštění pomalého programu založeného na konzistenci (L-INS-i), když je počet a délka sekvencí malá. Když čísla překročí vestavěné prahy, použije se konvenční progresivní zarovnávač (FFT-NS-2). Ten je také programem, který je ve výchozím nastavení spuštěn, pokud je MAFFT volán bez nastavených příznaků. U velmi velkých datových sad je --parttree příznak musí být nastaven na příkazovém řádku a následně je použit velmi rychlý výpočet vodícího stromu.\nVýsledky srovnávacích testů BaliBASE jsou uvedeny v tabulce I. BALIBASE je rozdělena do šesti „referencí.“ Pro každou referenci jsou uvedena průměrná skóre spolu s celkovým počtem běhů a průměrným celkovým skóre ve sloupci (TC), které udávají podíl celkem zarovnané sloupce, které jsou obnoveny. Skóre 1,0 znamená perfektní shodu s benchmarkem. Balíček MAFFT obsahuje dva řádky: MAFFT (auto) a MAFFT default. Ve většině (203 z 218) testovacích případů BAliBASE je počet sekvencí malý a skript spouští L-INS-i, což je pomalu přesný program, který používá heuristiku konzistence (Notredame a kol, 2000), který také používá MSAprobs (Liu a kol, 2010), Probalign, Probcons (Do a kol(2005) a T-Coffee. Všechny tyto programy jsou omezeny na malý počet sekvencí, ale mají tendenci poskytovat přesné zarovnání. To se jasně odráží v časech a průměrných skóre v tabulce I. Časy se pohybují od 25 minut do 22 hodin pro tyto balíčky a přesnosti se pohybují od 55 do 61% správných sloupců. Clustal Omega trvá pouze 9 minut na stejné běhy, ale má úroveň přesnosti, která je podobná jako u Probcons a T-Coffee.\nAv skóre (218 rodin)\nBB11 (38 rodin)\nBB12 (44 rodin)\nBB2 (41 rodin)\nBB3 (30 rodin)\nBB4 (49 rodin)\nBB5 (16 rodin)\nMSAprobs 0.607 0.441 0.865 0.464 0.607 0.622 0.608 12 382.00 Ano\nProbalign 0.589 0.453 0.862 0.439 0.566 0.603 0.549 10 095.20 Ano\nMAFFT (automaticky) 0.588 0.439 0.831 0.450 0.581 0.605 0.591 1475.40 Většinou (203/218)\nProbcons 0.558 0.417 0.855 0.406 0.544 0.532 0.573 13 086.30 Ano\nClustal Ω 0.554 0.358 0.789 0.450 0.575 0.579 0.533 539.91 Ne\nT-káva 0.551 0.410 0.848 0.402 0.491 0.545 0.587 81 041.50 Ano\nKalign 0.501 0.365 0.790 0.360 0.476 0.504 0.435 21.88 Ne\nSVAL 0.475 0.318 0.804 0.350 0.409 0.450 0.460 789.57 Ne\nMAFFT (výchozí) 0.458 0.258 0.749 0.316 0.425 0.480 0.496 68.24 Ne\nFSA 0.419 0.270 0.818 0.187 0.259 0.474 0.398 53 648.10 Ne\nDialign 0.415 0.265 0.696 0.292 0.312 0.441 0.425 3977.44 Ne\nŽERT 0.376 0.223 0.680 0.257 0.321 0.360 0.356 128 355.00 Ne\nClustalW 0.374 0.227 0.712 0.220 0.272 0.396 0.308 766.47 Ne\nČísla jsou celková skóre sloupců vytvořená pomocí skóre bali pouze na základních sloupcích. Průměrné skóre ze všech rodin je uvedeno ve druhém sloupci. Výsledky pro podskupiny BAliBASE jsou ve sloupcích 3–8. Celková doba běhu pro všech 218 rodin je uvedena ve druhém posledním sloupci. Poslední sloupec označuje, zda je metoda založená na konzistenci.\nZbytek tabulky zabírají hlavně programy, které používají progresivní zarovnání. Některé z nich jsou velmi rychlé, ale této rychlosti odpovídá značný pokles přesnosti ve srovnání s programy založenými na konzistenci a Clustal Omega. Nejslabším programem je Clustal W (Larkin a kol(2007) a poté PRANK (Löytynoja a Goldman, 2008). PRANK není určen k zarovnání vzdáleně souvisejících sekvencí, ale poskytuje dobré zarovnání pro fylogenetickou práci se zvláštním důrazem na mezery. Tyto pozice mezer nejsou v těchto testech zahrnuty, protože obvykle nejsou strukturálně konzervovány. Dialign ( Morgenstern a kol, 1998) nepoužívá konzistenci ani progresivní zarovnání, ale je založeno na nalezení nejlepších lokálních vícenásobných zarovnání. FSA (Bradley a kol, 2009) používá vzorkování párových zarovnání a „hybridizaci sekvencí“ a v minulosti bylo prokázáno, že přináší dobré srovnání nukleotidových sekvencí.\nVýsledky benchmarkových testů montovaných staveb jsou uvedeny v tabulce II. Zde jsou výsledky rozděleny do pěti skupin podle procentuální identity sekvencí. Celkové skóre se pohybuje od 53 do 73 % správných sloupců. Programy založené na konzistenci MSAprobs, MAFFT L-INS-i, Probalign, Probcons a T-Coffee jsou opět nejpřesnější, ale s dlouhou dobou běhu. Clustal Omega se blíží programům konzistence v přesnosti, ale je mnohem rychlejší. Pak je zde mezera k rychlejším progresivním programům MUSCLE, MAFFT, Kalign (Lassmann a Sonnhammer, 2005) a Clustal W.\n0 & lt%ID⩽100 (1682 rodin)\n0⩽%ID⩽20 (912 rodin)\n20⩽%ID⩽40 (563 rodin)\n40⩽%ID⩽70 (117 rodin)\n70⩽%ID⩽100 (90 rodin)\nCelkový čas (s) (1682 rodin)\nMSAprobs 0.737 0.591 0.889 0.965 0.971 51 286.00 Ano\nMAFFT (auto) 0.721 0.569 0.876 0.961 0.979 4544.45 Ano\nProbalign 0.719 0.563 0.881 0.961 0.977 35 117.30 Ano\nProbcons 0.717 0.562 0.876 0.955 0.972 46 908.30 Ano\nT-Coffee 0.710 0.558 0.865 0.950 0.972 175 789.00 Ano\nClustal Ω 0.700 0.535 0.866 0.967 0.980 1698.06 Ne\nSVAL 0.677 0.507 0.850 0.946 0.976 2068.56 Ne\nMAFFT 0.677 0.513 0.836 0.961 0.979 225.56 Ne\nKalign 0.649 0.474 0.817 0.957 0.979 80.81 Ne\nClustalW2 0.617 0.430 0.797 0.933 0.975 3433.53 Ne\nDialign 0.595 0.398 0.783 0.940 0.974 18 909.70 Ne\nŽERT 0.586 0.390 0.767 0.951 0.978 351 498.00 Ne\nFSA 0.534 0.277 0.791 0.965 0.976 229 391.00 Ne\nCelkové skóre sloupce (TC) jsou uvedeny pro různá rozmezí procent identity, druhý sloupec je průměrné skóre ze všech testovacích případů. Celková doba běhu v sekundách je uvedena v předposledním sloupci. Poslední sloupec označuje, zda je metoda založená na konzistenci.\nVýsledky z testování velkých zarovnání až s 50 000 sekvencemi jsou uvedeny v tabulce III pomocí HomFam. Zde je každé zarovnání tvořeno jádrem Homstradu (Mizuguchi a kol, 1998) uspořádání založené na struktuře alespoň pěti sekvencí. Tyto sekvence jsou poté vloženy do testovací sady sekvencí z odpovídající homologní domény Pfam. To poskytuje velmi velké sady sekvencí, které mají být zarovnány, ale testování se provádí pouze na sekvencích se známými strukturami. Pouze některé programy jsou schopny poskytnout zarovnání s datovými sadami této velikosti. Omezili jsme srovnání na Clustal Omega, MAFFT, MUSCLE a Kalign. MAFFT s výchozím nastavením má limit 20 000 sekvencí a pro poslední část tabulky III používáme pouze MAFFT s --parttree. Když získáte více než 3000 sekvencí, bude MUSCLE stále pomalejší. Proto jsme pro sekvence &gt3000 použili MUSCLE s rychlejším, ale méně přesným nastavením –maxiters 2, které omezuje počet iterací na dvě.\n93⩽N⩽2957 (41 rodin)\n3127⩽N⩽9105 (33 rodin)\n10 099⩽N1550 157 (18 rodin)\nzarovnávač TC/t TC/t TC/t (s)\nClustal Ω 0.708/2114.0 0.639/11 719.5 0.464/27 328.9\nKalign 0.569/324.9 0.563/6752.0 0.420/286 711.0\nVýchozí MAFFT 0.550/238.9 0.462/3115.4 −/−\nMAFFT – parttree −/− −/− 0.253/6119.4\nMUSCLE výchozí 0.533/104 587.0 −/− −/−\nMUSCLE –maxitery 2 −/− 0.416/8239.2 0.216/110 292.0\nSloupce ukazují celkové skóre kolony (TC) a celkovou dobu běhu v sekundách pro skupiny testovacích případů HomFam malých (<3 000 sekvencí), středních (3 000–10 000 sekvencí) a velkých (> 10 000 sekvencí).\nCelkově je Clustal Omega snadno nejpřesnějším programem v tabulce III. Doby běhu ukazují, že výchozí nastavení MAFFT a Kalign jsou výjimečně rychlé v menších testovacích případech a MAFFT --parttree je velmi rychlé v největších rodinách. Clustal Omega se však dobře stupňuje s rostoucím počtem sekvencí. Toto škálování je podrobněji popsáno v Doplňkových informacích. Máme ještě dva další testovací případy s více než 50 000 sekvencemi, ale nebylo možné pro ně získat výsledky z MUSCLE nebo Kalign. Ty jsou také popsány v doplňkových informacích.\nTabulka III uvádí celkové doby běhu pro čtyři programy hodnocené pomocí HomFam. Obrázek 1 řeší tyto doby běhu případ od případu. Kalign je velmi rychlý pro malé rodiny, ale také se neškáluje. Celkově je MAFFT rychlejší než ostatní programy ve všech velikostech testovacích případů, ale Clustal Omega se škáluje podobně. Body na obrázku 1 představují různé rodiny s různými průměrnými délkami sekvencí a párovými identitami. Trend škálovatelnosti je proto nejasný, přičemž větší tečky se obvykle vyskytují nad menšími tečkami. Doplňkový obrázek S3 ukazuje data škálovatelnosti, kde jsou podmnožiny rostoucí velikosti vzorkovány pouze z jedné velké rodiny. To snižuje variabilitu párových identit a délky sekvence.\nZarovnání externího profilu\nClustal Omega může číst další informace z profilu HMM odvozeného z již existujících zarovnání. Například, pokud si uživatel přeje zarovnat sadu globinových sekvencí a má existující globinové zarovnání, lze toto zarovnání převést na profilový HMM a použít jej stejně jako vstupní soubor sekvence. Tento HMM je zde označován jako „externí profil“ a jeho použití tímto způsobem jako „zarovnání externího profilu“ (EPA). Během EPA je každá sekvence ve vstupní sadě zarovnána s externím profilem. Informace o pseudoúčtu z externího profilu jsou poté přeneseny, pozice po pozici, do vstupní sekvence. V ideálním případě by to bylo použito s velkými upravenými zarovnáními konkrétních proteinů nebo požadovaných domén, jaké se používají v metagenomických projektech. Spíše než brát vstupní sekvence a zarovnávat je od začátku, pokaždé, když jsou nalezeny nové sekvence, by se zarovnání mělo pečlivě udržovat a používat jako externí profil pro EPA. Clustal Omega také může zarovnat sekvence k existujícím zarovnáním pomocí konvenčních metod zarovnání. Uživatelé mohou přidávat sekvence k zarovnání, jeden po druhém nebo zarovnat sadu zarovnaných sekvencí k zarovnání.\nV tomto příspěvku demonstrujeme přístup EPA na dvou příkladech. Nejprve vezmeme 94 testovacích případů HomFam z předchozí části a použijeme odpovídající Pfam HMM pro EPA. Před EPA byla průměrná přesnost testovacích případů 0,627 správně zarovnaných poloh Homstradu, ale po EPA stoupá na 0,653. Toto je zakresleno, testovací případ pro testovací případ na obrázku 2A. Každý bod je jeden testovací případ se skóre TC pro Clustal Omega vyneseným proti skóre pomocí EPA. Druhý příklad je znázorněn na obrázku 2B. Zde vezmeme všechny referenční sady BAliBASE a zarovnáme je jako normální pomocí Clustal Omega a získáme výsledek benchmarku 0,554 sloupců správně zarovnaných, jak již bylo uvedeno v tabulce I. Pro EPA používáme samotné referenční srovnání referenčních hodnot jako externí profily. Výsledky nyní skočí na 0,857 správných sloupců. Jedná se o skok o více než 30 % a ačkoli to není platným měřítkem přesnosti Clustal Omega pro srovnání s jinými programy, ilustruje to potenciální sílu EPA využívat informace ve vnějších zarovnáních.\nEPA lze také použít v jednoduchém iteračním schématu. Jakmile byl MSA vytvořen ze sady vstupních sekvencí, lze jej převést na HMM a použít pro EPA, aby pomohl vyrovnat vstupní sekvence. To lze také kombinovat s úplným přepočtem vodícího stromu. Na obrázku 3 ukazujeme výsledky jedné a dvou iterací na každém testovacím případu z HomFam. Graf je vynesen jako průběžné průměrné skóre TC pro všechny testovací případy s N nebo méně testovacích případů, kde N je vynesena na vodorovnou osu pomocí logaritmického měřítka. U některých menších testovacích případů má iterace ve skutečnosti škodlivý účinek. Jakmile se však přiblížíte 1000 nebo více sekvencím, objeví se jasný trend. Čím více sekvencí máte, tím příznivější je účinek iterace. S většími testovacími případy je stále výhodnější použít dvě iterace. Tento výsledek potvrzuje užitečnost EPA jako obecné strategie. Potvrzuje také obtížnost zarovnání extrémně velkého počtu sekvencí, ale poskytuje jedno dílčí řešení. Poskytuje také velmi jednoduché, ale efektivní schéma iterací, nejen pro iteraci vodicího stromu, jak se používá v mnoha balíčcích, ale i pro iteraci samotného zarovnání.\nNové probiotické mechanismy ústní bakterie Streptococcus sp. A12, jak je prozkoumáno s funkční genomikou\nBiofilmy související se zdravím v dutině ústní se skládají z různorodé skupiny mikrobiálních druhů, které mohou vytvářet prostředí, které je méně příznivé pro růst patogenů zubního kazu, např. Streptococcus mutans Nová orální bakterie, označená Streptococcus A12, byl dříve izolován ze supragingiválního zubního plaku jedince bez kazu a ukázalo se, že silně interferuje s růstovými a virulentními vlastnostmi S. mutans V této studii jsme použili funkční genomiku, abychom začali identifikovat molekulární mechanismy používané A12 k antagonizaci a odolávání antagonistickým faktorům, S. mutans Pomocí bioinformatiky geny, které by mohly kódovat faktory, které zvyšují schopnost A12 konkurovat S. mutans byly identifikovány. Vybrané geny, určené potenciální konkurenční faktory (pcf), byly smazány. Některé mutantní deriváty vykazovaly sníženou schopnost konkurovat S. mutans ve srovnání s rodičovským kmenem. A12 pcfO mutant ztratil schopnost inhibovat com X - I nducing P eptide (XIP) signaling by S. mutans, zatímco mutanti se změnami v pcfFEG lokus měli zhoršené vnímání a byli citlivější na lantibiotický nisin. Ztráta PcfV, označovaného jako biosyntetický protein kolicin V, vedla ke snížení antagonismu S. mutans Data společně poskytují nový pohled na složitost a rozmanitost faktorů, které ovlivňují ekologii a virulenci biofilmu. Pokračující zkoumání genomických a fyziologických faktorů, které odlišují komenzály od skutečně prospěšných členů orální mikrobioty, povede k lepšímu porozumění mikrobiomu a novým přístupům k podpoře orálního zdraví.DŮLEŽITOST Pokroky v definování složení biofilmů spojených se zdravím zdůraznily důležitou roli prospěšných druhů při udržování zdraví. Bylo však provedeno poměrně málo pro řešení genomických a fyziologických základů, které jsou základem probiotických mechanismů prospěšných komenzálů. V této studii jsme zkoumali schopnost nového orálního bakteriálního izolátu, Streptococcus A12, soutěžit se zubním patogenem Streptococcus mutans pomocí různých genových produktů s různými funkcemi. A12 vykazoval zvýšenou konkurenceschopnost (i) narušením mezibuněčných komunikačních cest S. mutans(ii) snímání a rezistence antimikrobiálních peptidů a (iii) produkce faktorů podílejících se na produkci domnělé antimikrobiální sloučeniny. Výzkum probiotických mechanismů používaných Streptococcus A12 poskytuje zásadní pohled na to, jak prospěšné bakterie mohou pomoci udržovat orální zdraví, což pomůže při vývoji biomarkerů a terapeutik, které mohou zlepšit praxi klinické stomatologie.\nKlíčová slova: antimikrobiální peptidy biofilm ekologie zubní kaz mezidruhová soutěž orální mikrobiom.\n(A) Schematický diagram lokusů…\n(A) Schematický diagram lokusů kódujících potenciální konkurenční faktory ( pcf geny)…\nDopad potenciální konkurenceschopnosti A12…\nVliv potenciálního konkurenčního faktoru A12. (A) Kultury S. mutans UA159 (Sp…\nÚčinky supernatantů S. gordonii nebo A12 na P comX nebo P cipB…\nVymazání pcfFEG nebo pcfRK…\nVymazání pcfFEG nebo pcfRK zvyšuje citlivost A12 k lantibiotickému nisinu.…\nExprese hypotetického proteinu…\nExprese hypotetického proteinu před pcfV je upregulován v nepřítomnosti…\n(A) Pangenomová analýza A12,…\n(A) Pangenomová analýza A12, izolátů podobných A12, S. australis ATCC 700641 a S.…\nVyhodnocení vašeho zarovnání ¶\nExistují tři možné strategie pro vyhodnocení vašeho zarovnání proteinových sekvencí:\nSekvenční metody jako je CORE index a TCS, pokud nemáte žádnou strukturu (poměrně často). Ty fungují docela dobře v jádrových oblastech zarovnání (které mohou odpovídat proteinovým doménám, záhybům, strukturním prvkům atd...), ale mohou být omezeny ve více variabilních oblastech (které mohou odpovídat smyčkám, neuspořádaným oblastem atd...).\nStruktura je zabiják, takže pokud máte pro svou proteinovou rodinu k dispozici alespoň dvě struktury, jste v ideální situaci a můžete použít iRMSD. Pokud máte k dispozici pouze jednu strukturu, vyvinuli jsme STRIKE pro porovnání alternativního zarovnání.\nDalším zabijákem je používání funkčních informací, ale je mnohem méně často po ruce. Pokud víte, některé zbytky MUSÍ být zarovnány, protože jsou funkčně příbuzné. Vzhledem k tomu, že informací je vzácné a nejsou standardní, neexistuje žádný automatizovaný postup speciálně navržený pro tento druh analýzy, ale přesto můžete nastavit postup hodnocení pomocí T-Coffee.\nVětšina metod hodnocení je navržena pro proteinové sekvence (zejména metody založené na struktuře), nicméně T-Coffee prostřednictvím indexu TCS/CORE nabízí určité možnosti pro vyhodnocení také uspořádání DNA.\nMetody založené na sekvenci¶\nIndex CORE je základem odhadu konzistence T-Coffee, nicméně pro hodnocení zarovnání doporučujeme použít postup TCS popsaný v další části.\nVýpočet místního indexu CORE¶\nIndex CORE je odhad konzistence mezi vaším zarovnáním a vypočítanou knihovnou. Čím vyšší je konzistence, tím lepší je zarovnání. Skóre hlášené při každém zarovnání T-Coffee je skóre konzistence (v závislosti na verzi může být normalizováno na 100 nebo 1 000). Pokud chcete jít dále a odhadnout místní konzistenci (známou jako CORE index), automaticky se vytvoří soubor html při každém spuštění T-Coffee, je to barevná verze vašeho zarovnání, kde jsou zbytky vybarveny podle jejich skóre konzistence, od modrá (nízká konzistence) až červená (vysoká konzistence). Není to úplný důkaz, ale v zásadě můžete očekávat, že pozice se skóre nad 6 budou správně zarovnány.\nVýpočet indexu CORE jakéhokoli zarovnání¶\nPomocí indexu CORE můžete vyhodnotit jakékoli existující zarovnání. Vše, co musíte udělat, je poskytnout toto zarovnání s příznakem -infile a určit, že jej chcete vyhodnotit. Další informace o filtrování/ořezávání zarovnání pomocí skóre indexu CORE naleznete v podsekci Příprava dat: Přeformátování, oříznutí dalších .../Úprava samotných dat.\nTransitive Consistency Score (TCS) ¶\nTCS je skóre hodnocení zarovnání, které umožňuje identifikovat nejsprávnější pozice v MSA. Ukázalo se, že tyto polohy jsou s největší pravděpodobností strukturálně správné a také nejvíce informativní při odhadu fylogenetických stromů. Procedura hodnocení a filtrování TCS je implementována v balíčku T-Coffee a lze ji použít k vyhodnocení a filtrování jakékoli MSA třetí strany (samozřejmě včetně T-Coffee MSA!).\nTCS byl nedávno začleněn do T-Coffee, to znamená, že ne všechny distribuce mají implementovaný TCS, měli byste nainstalovat nejnovější stabilní verzi T-Coffee, abyste měli TCS spolu s T-Coffee.\nHodnocení stávající MSA¶\nTCS je nejvíce informativní, když se používá k identifikaci částí s nízkým skóre v rámci MSA. Je také třeba poznamenat, že TCS není informativní při zarovnání méně než pěti sekvencí.\nsample_seq1.score_ascii zobrazuje skóre MSA, sekvence a zbytky.\nsample_seq1.score_html zobrazuje skóre barevné verze MSA, sekvencí a zbytků.\nBarevný kód v score_html označuje shodu mezi knihovnou a uvažovaným zarovnáním. Je důležité pochopit, že toto skóre nezávisí pouze na vstupním MSA, ale také na knihovně.\nFiltrování nespolehlivých pozic MSA¶\nTCS vám umožňuje odfiltrovat z vašich oblastí zarovnání, které se zdají nespolehlivé podle skóre konzistence, které lze filtrovat na úrovni zbytků nebo na úrovni sloupců:\nsample_seq1.tcs_residue_filter3 Všechny zbytky se skóre TCS nižším než 3 jsou odfiltrovány\nsample_seq1.tcs_column_filter3 Všechny sloupce se skóre TCS nižším než 3 jsou odfiltrovány\nsample_seq1.tcs_residue_lower4 Všechny zbytky se skóre TCS nižším než 3 jsou malá písmena\nTCS vytvoří výstupní soubory obsahující vaše výsledky, pokud znovu spustíte podobné úlohy nebo se stejným názvem, TCS nepřepíše předchozí výstupy, ale připojí nové výsledky k již existujícím souborům.\nVšechny tyto výstupní funkce jsou také kompatibilní s výchozím T-Coffee (příkaz 1) při výpočtu zarovnání nebo s seq_reformat (příkaz 2) pomocí souboru T-Coffee & ltname & gt.score_ascii.\nVáha MSA pro vylepšené stromy¶\nJedním skvělým trikem ohledně TCS je možnost dodávat zatížené MSA, kde se každý sloupec vynásobí podle skóre konzistence, což se jeví jako zvláště užitečné pro stavbu fylogenetického stromu. Fylogenetické stromy jsou hodnoceny pomocí bootstrap skóre, takže každý sloupec má stejnou hmotnost, bez ohledu na jeho relevanci, v případě vážených TCS jsou spolehlivější sloupce zastoupeny více, čímž se zlepšuje podpora informativních a spolehlivých pozic vašeho MSA.\nsample_seq1.tcs_weighted Všechny sloupce jsou duplikovány podle jejich skóre TCS\nsample_seq1.tcs_replicate_100 Obsahuje 100 replikátů ve formátu phylip, přičemž každý sloupec je vykreslen s pravděpodobností odpovídající jeho skóre TCS\nVšimněte si, že všechny tyto výstupní funkce jsou také kompatibilní s výchozím T-Coffee (příkaz 1) při výpočtu zarovnání nebo s seq_reformat (příkaz 2) pomocí souboru T-Coffee .score_ascii.\nPoužití různých knihoven pro TCS¶\nJe možné změnit způsob odhadování spolehlivosti TCS. To lze provést vybudováním různých knihoven T-Coffee. Proba_pair je výchozí zarovnávač T-Coffee, který spouští pár HMM k naplnění knihovny páry zbytků s nejlepšími pozdějšími pravděpodobnostmi (příkaz 1). Můžete také kombinovat místní a globální zarovnávače (příkaz 2). Existuje také rychlá alternativa pomocí speciálního režimu ke spuštění řady rychlých více zarovnávačů, je velmi rychlá a používá ji ENSEMBL Compara (příkaz 3)\nPráce s kódující DNA¶\nPři práci s DNA je vhodné nejprve zarovnat sekvence na úrovni proteinů a později navléknout DNA zpět na vaše zarovnané proteiny. Filtrování musí být provedeno ve dvou krocích, jak je uvedeno níže. Všimněte si, že vaše DNA a proteinové sekvence musí mít stejný název. Tento první krok vytvoří vyhodnocovací soubor TCS sample_prot_thread.score_ascii (příkaz 1). Poté, -out dna.replikace možnost vytvoří 100 replikátů DNA s pozicemi vybranými podle jejich aminokyselinového skóre TCS (příkaz 2). Nakonec, -out dna.filtrováno možnost bude filtrovat zarovnání DNA podle jejich skóre ve sloupci TCS.\nSouhrn možností výstupu¶\nscore_ascii Výstupem je vyhodnocovací soubor TCS\nscore_html Obsahuje formát ascii ve formátu html\nskóre_pdf Převede score_html do formátu pdf\nsp_ascii Hlásí skóre TCS každého zarovnaného páru v cílové MSA\ntcs_residue_filter_N Odstraní všechny zbytky se skóre TCS nižším než N\ntcs_columns_filter_N Odstraní všechny sloupce se skóre TCS nižším než N\ntcs_weighted Formát Phylip s duplikovanými sloupci podle jejich skóre TCS\ntcs_replicate_N Generuje N replikátů sloupců nakreslených podle jejich skóre TCS\nStrukturální hodnocení MSA¶\nCo je APDB/iRMSD?¶\nAPDB a iRMSD jsou dvě úzce související opatření určená k vyhodnocení přesnosti MSAt bez použití referenčního zarovnání založeného na struktuře. iRMSD navazuje na opatření APDB a nyní doporučujeme používat spíše iRMSD než APDB. Ačkoli se může zdát, že iRMSD byl pokus získat zdarma iPOD od Apple, není (nebo alespoň jsme iPODy nikdy nedostali). iRMSD je speciální RMSD (což znamená RMSD založené na intramolekulárních vzdálenostech), kde jsou zarovnání hodnocena pomocí strukturních informací sekvencí se známými strukturami.\nSilou iRMSD je jeho nezávislost na konkrétních superpozičních modelech. Při použití iRMSD k vyhodnocení skóre MSA není třeba překrývat dvě struktury a odvodit sekvenční zarovnání, které bude poté porovnáno s cílovým zarovnáním. Vzhledem ke dvěma zarovnaným zbytkům (X a Y) je skóre iRMSD pokusem odhadnout podporu sousedství pro zarovnání XY. To se provádí měřením rozdílu vzdáleností mezi X a Y a každým dalším párem zarovnaných zbytků ve stejné sféře (W a Z). iRMSD se získá měřením průměrné střední hodnoty (RMS) těchto rozdílů vzdáleností. Prvním krokem APDB/iRMSD je měření vzdáleností mezi Ca (uhlík alfa) každého zbytku a jeho sousedy. Sousedství je definováno jako sféra poloměru *-maximální_vzdálenost (10 ve výchozím nastavení). Nicméně nastavením -local_mode do „okna“ lze kouli nahradit oknem o velikosti 1/2 -max_distance zbytky.\nČím nižší je iRMSD, tím lepší je zarovnání. Přesto může zarovnání získat dobré skóre iRMSD jednoduše tím, že má několik zarovnaných zbytků. Aby se tomu zabránilo, program také hlásí normalizovanou verzi iRMSD, uvažované sloupce NiRMSD= MIN(L1,L2)*iRMSD/číslo. Pro porovnání alternativních vyrovnání různých délek se doporučuje použít NiRMSD. Ze strukturálního hlediska má NiRMSD význam velmi podobný iRMSD a chová se podobným způsobem z numerického hlediska (podobné rozsahy v Angstromech).\nAPDB je starší míra méně robustní než iRMSD, jedná se o pokus odhadnout zlomek párů zbytků, jejichž zarovnání se zdá být strukturálním pohledem správné. Čím vyšší je APDB, tím lepší je zarovnání a naopak čím nižší je NiRMSD, tím lepší je zarovnání.\nJak efektivně využívat strukturální informace? ¶\nPokud jde o hodnocení MSA, není nic lepšího než strukturální informace. Chcete -li použít metody, které zde popisujeme, budete potřebovat alespoň dvě struktury, dostatečně podobné (> 60%) sekvencím obsaženým ve vaší datové sadě. Zde je nástin toho, jak nejlépe postupovat:\nZkuste zahrnout dvě struktury se vzdáleně příbuznými sekvencemi, přičemž ostatní sekvence jsou meziprodukty.\nZarovnejte své sekvence bez použití strukturálních informací (tj. T-Coffee, MUSCLE, MAFFT ...).\nVyhodnoťte své sladění s iRMSD/NiRMSD (viz dále v této části) přidělte tomuto sladění skóre S1.\nUpravte své sekvence, ale tentokrát pomocí strukturálních informací s Expresso.\nZměřte skóre tohoto zarovnání, skóre bude S2.\nPokud jsou S1 a S2 téměř podobné, znamená to, že vaše vzdáleně příbuzné struktury byly dobře zarovnány a můžete očekávat, že budou dobře zarovnány také mezilehlé sekvence. Pokud je S2 mnohem lepší než S1, můžete očekávat, že struktury budou dobře zarovnány ve druhém zarovnání, přičemž neexistuje žádná záruka, že se zlepšilo také zarovnání mezilehlých sekvencí, i když v praxi často ano.\nVyhodnocení zarovnání s balíčkem iRMSD¶\nVyhodnoťme zarovnání vytvořené Expresso pomocí souboru šablony, který vrací. Vyhodnocení MSA pomocí iRMSD přinese dlouhý výstup (porovnají se všechny páry), nejzajímavější bit je dole u globálního skóre iRMSD v Angstromu (NiRMSD je skóre iRMSD normalizované na délku MSA).\nHodnocení alternativních zarovnání¶\nSíla strukturovaných vyrovnání spočívá v tom, že umožňují porovnávat alternativní zarovnání. V tomto případě uvažujme následující výsledky v tabulce níže (APDB v %, iRMSD/NiRMSD v Angstromech a vyhodnocené sloupce v %). Jak se dalo očekávat, Expresso přináší nejlepší zarovnání ze strukturálního hlediska. To dává smysl, protože Expresso výslovně POUŽÍVÁ strukturální informace. Ostatní obrázky nám ukazují, že strukturální vyrovnání je jen nepatrně lepší než většina uspořádání založených na sekvencích, ale s výraznou výjimkou ClustalW.\nPoužitím podobného přístupu je možné odhadnout variace intramolekulárních vzdáleností napříč více strukturními MSA pro každý pár zbytku každé sekvence. Následující příkaz také vrátí průměrnou variaci (stdev) pro každý zbytek a jeho sousedy v rámci &ltradius>\nVýstup je rozdělen do dvou sekcí, které lze popsat prvním klíčovým slovem:\nDruhá frakce shrnuje osud každého zbytku. Všimněte si, že parametr radius potenciálně činí každý zbytek ve sloupci, což má různé úrovně zachování\nTato funkce také zobrazuje barevné verze vstupních PDB pomocí souboru PDB Bfactor. Výstupní soubory jsou následující:\nSTRIKE: Hodnocení založená na kontaktu¶\nSTRIKE používá kontaktní matici k vyhodnocení zarovnání pomocí jedné nebo více struktur. Přitom se kontakty vyjmou ze sekvencí se známými strukturami a promítnou se do ostatních sekvencí. Každá sekvence je poté vyhodnocena z hlediska kvality předpokládaných kontaktů. Pokud je k dispozici více než jedna struktura, výsledky jsou poskytovány pomocí každé struktury jako šablony. Tuto analýzu provede následující příkazový řádek. Jako vstup vyžaduje MSA obsahující alespoň jednu sekvenci s jednou ze šablon defiend v souboru šablony. Soubory PDB musí být v aktuálním adresáři.\nPrvní částí výstupu je STRIKE RAW SCORE. Udává skóre každé sekvence při použití buď jedné struktury jako šablony, nebo průměrováním všech struktur je nejvyšší hodnota v každém sloupci označena hvězdičkou. Různá pole jsou následující:\nRS Hrubé skóre Průměrné skóre STRIKE\nRn Náhodné skóre Průměrné skóre při šifrování kontaktů\nBg Pozadí skóre Průměrné skóre všech kontaktů proti všem\nJe také možné použít tři další parametry. Tyto tři parametry musí být předány. Každý může být nahrazen provázkem "Def" pokud má být použita výchozí hodnota.\nmax 1.2 Maximální vzdálenost mezi dvěma kontaktními AA (Angstrom)\nkonec 3 Počet vyloučených sousedů mezi kontakty\nmatice stávkovat Soubor obsahující matici STRIKE\nHodnocení MSA podle vašeho vlastního kritéria¶\nJakýkoli druh funkce lze snadno proměnit v hodnotící mřížku. Sekvence proteázy, které zde používáme, mají například dobře charakterizované vazebné místo. Možné vyhodnocení lze provést následujícím způsobem: uvažujme anotaci UniProt dvou vzdáleně příbuzných sekvencí, tyto dvě sekvence obsahují elektronový reléový systém proteáz.Můžeme jej použít k vytvoření hodnotící knihovny: v P29786 (TRY3_AEDAE) je histidinový zbytek v poloze 68, zatímco v P21844 (MCPT5_MOUSE) funkčně ekvivalentní histidinový zbytek je v poloze 66. Můžeme tedy postavit knihovnu, která bude kontrolovat, zda tyto dva zbytky jsou správně zarovnány v jakékoli MSA. Knihovna bude vypadat takto:\nJednoduše musíte vyjmout a vložit tuto knihovnu do souboru a použít tento soubor k měření konzistence mezi vaším zarovnáním a korespondencemi deklarovanými ve vaší knihovně. Následující příkazový řádek také umožňuje vizuálně zobrazit shodu mezi vašimi sekvencemi a knihovnou.\nPři zkoumání evolučních vztahů mezi různými organismy je důležité pečlivě zvolit, který gen nebo protein použijete. Existuje několik dobře známých homologních genů, které lze použít, například pro proteiny hemoglobin nebo cytochrom c, a při této aktivitě použijeme druhý z nich. Cytochrom c je malý hemový protein, který je ústřední součástí řetězce přenosu elektronů v mitochondriích. Všechny aerobní organismy se vyvinuly ze společného předka, který jako první používal cytochrom c, takže je pro naše účely dobrou volbou w3 .\nTato činnost se provádí ve třech různých sekcích:\nnalezení aminokyselinové sekvence cytochromu c v různých organismech,\njejich zarovnání a\nvytvoření fylogenetického stromu.\nNakonec jsou zahrnuty některé otázky, které vedou ke zkoumání evolučních vztahů.\nHledání proteinových sekvencí\nPřejděte na webovou stránku NCBI w1.\nVe vyhledávací oblasti v horní části stránky vyberte z rozbalovací nabídky „protein“.\nZadejte název druhu, např. Homo sapiensa cytochrom c.\nNa nové stránce se zobrazí výsledky vyhledávání. Většina z nich jsou stejné sekvence z různých zdrojů, ale jiné mohou být částečné sekvence nebo patří k jinému druhu nebo proteinu. Pečlivě vyberte správný požadovaný protein a klikněte na odkaz pod označením „FASTA“.\nZ nové stránky, která se načte, zkopírujte řetězec velkých písmen označujících posloupnost aminokyselin. Vložte písmena do dokumentu aplikace Word, nezapomeňte sekvenci označit názvem organismu, ze kterého pochází.\nUdělejte to samé pro tolik organismů, kolik chcete, podle toho, co chcete se svými studenty zkoumat. Můžete zahrnout různé primáty, abyste viděli, jak se lidé vyvinuli, nebo organismy z pěti tradičních království, abyste viděli, jak se život obecně vyvíjel. V této aktivitě se použijí 3 zvířata, 2 rostliny, 2 řasy, houba a prvok.\nPřejděte na webovou stránku Evropského bioinformatického institutu (EBI) w2 a klikněte na „Služby“. Poté zvolte „proteiny“.\nKlikněte na Clustal Omega. Zkopírujte text z dokumentu aplikace Word a vložte jej do textového pole označeného „KROK 1“.\nV KROKU 2 vyberte formát pro výstup zarovnání, například „Clustal w/ numbers“, který zobrazí délku každé sekvence. Nakonec KROK 3 dokončete kliknutím na „Odeslat“.\nZarovnání pro více sekvencí se zobrazí v novém okně. První věc, kterou můžete udělat, je kliknutím zobrazit barvy. Tato možnost dá stejnou barvu každé aminokyselině, takže je snazší je identifikovat.\nPři analýze zarovnání mějte na paměti následující symboly: hvězdička (*) znamená, že sekvence jsou na této pozici identické, dvojtečka (:) označuje konzervované substituce (stejná barevná skupina) a tečka (.) označuje polokonzervované substituce (podobné tvary). Barvy seskupují aminokyseliny podle charakteristik. Červené jsou malé, hydrofobní, aromatické modré jsou kyselé purpurové jsou zásadité zelené jsou hydroxylové, aminové, amidové, zásadité a šedé jsou ostatní.\nPokud kliknete na možnost ‚Shrnutí výsledků‘, uvidíte procento identity zachované mezi různými organismy po zarovnání. V této matrici můžete zjistit procentuální identitu dvou organismů pro sekvenci proteinového cytochromu c. Kromě toho, pokud máte v počítači nainstalovanou Java™, můžete použít Jalview, bezplatný program pro editaci, vizualizaci a analýzu vícenásobného zarovnání sekvencí. S Jalview budete moci vidět konsensuální sekvenci pro cytochrom c a úroveň konzervace pro různé aminokyseliny.\nSoftware Clustal Omega má mnoho různých možností, které zahrnují sofistikovanější matematické znalosti, než je nutné pro naše účely. Pokud se chcete dozvědět více o používání přípravku Clustal Omega, podívejte se na článek Sievers et al. (2011)\nVytvoření fylogenetického stromu\nVe výsledcích Clustal Omega klikněte dole na „Fylogenetický strom“ (budete muset mít nainstalovanou Java ™).\nMůžete získat fylogenetický nebo kladogramový strom. V kladogramu jsou délky větví ve stromu libovolné, zatímco ve fylogenetickém stromě délky větví ukazují, jak moc se protein v průběhu času vyvinul.\nHomologní molekuly jsou příkladem rozdílné evoluce. Jak můžete vysvětlit divergentní evoluci pomocí cytochromu c?\nZarovnání lze provést pomocí nukleotidových (genů) nebo aminokyselinových (proteinových) sekvencí. Proč si myslíte, že je užitečnější používat k analýze evolučních vztahů protein spíše než DNA?\nVe fylogenetických stromech tvoří ‚klad‘ všechny organismy, které mají společného předka. Uveďte příklad ze svého cladogramu.\nKteré organismy podle fylogenetických analýz cytochromu c v poslední době prodělaly speciační událost? Jaký je celkový počet speciačních událostí?\nProč si myslíte, že se některé aminokyseliny změnily v důsledku mutace, ale jiné ne? Myslíte si, že konzervované aminokyseliny se nezměnily, protože jejich kodony vůbec neprošly žádnou mutací?\nUkažte některé z těchto konzervovaných aminokyselin ve svém uspořádání. Prozkoumejte jejich funkci na internetu.\nNový kód, CombAlign, byl vyvinut pomocí Pythonu 2.6. CombAlign bere jako vstup sadu párových sekvenčních zarovnání založená na struktuře a generuje vzájemné zarovnání sekvencí založené na více strukturách (MSSA, viz metody), přičemž uživatel může snadno identifikovat oblasti na referenční struktuře, které mají zbytek -korespondence zbytků s každým z ostatních proteinů, proti kterému byla referenční struktura strukturována. Ačkoli záměrem při vývoji CombAlign bylo konstruovat zarovnání více sekvencí ze strukturních dat, kód je agnostický pro program, který se používá ke generování párových zarovnání používaných jako vstup. Protože však uspořádání založená na struktuře mohou odhalit strukturální (a tedy potenciální funkční) rozdíly mezi proteiny, které nemusí být nutně odhaleny prostřednictvím sekvenčních vyrovnání, byl vývoj CombAlign zaměřen na usnadnění konstrukce více zarovnání pomocí formátů vytvořených dvěma společnými nástroje pro strukturu proteinů: TM-align  a DaliLite .\nCombAlign obsahuje skript (combAlign.py), který čte ve fasta sekvenci referenčního proteinu následovanou řadou párových zarovnání, poté vytvoří objekt zarovnání (alignment.py), který se používá ke spojení zarovnání do MSSA a nakonec vytiskne výsledky do souboru. Referenční fasta se používá jako rámec pro záznam korespondence mezi zbytky referenční struktury a zbytky každé struktury ve srovnávací sadě datová struktura zachycuje každou polohu/zbytek v referenčním fasta a označí je seznamem odpovídajících zbytků, jeden zbytek z každé zarovnané struktury (nebo 'null', pokud zbytek chybí nebo není zarovnán). Kromě toho jsou pro každé párové zarovnání odpovídající zbytky v porovnávané struktuře a pozice, které si nekorespondují (mezery v porovnávané struktuře), zaznamenány mezery, které se vyskytují v referenční struktuře vzhledem k porovnávané struktuře, jsou vloženy jako nulové pozice do seznamu připojeného k předchozí zbytek v referenčním rámci sekvence fasta. Pozice mezer, které se vyskytují v referenční struktuře vzhledem k více než jedné porovnávané struktuře, jsou sloučeny, aby se zabránilo nadbytečnému vkládání mezer. Výsledná MSSA typu one-to-many s mezerami je formátována pro výstup rozdělením referenčního rámce fasta na segmenty odpovídající uživatelem zadanému nebo výchozímu parametru velikosti řádku a je vytištěna do výstupního souboru. Korešpondenční data ze vstupních párových zarovnání se promítnou do výstupního MSSA. Symboly (‘-‘, ‘:‘, ‘.‘, ‘|‘, “) Používané ve výstupu CombAlign mají význam identický se symboly programu používaného ke generování párových zarovnání a obecně udávají míru, s jakou zbytky odpovídaly. CombAlign nepoužívá žádná další data poskytovaná metodou párového zarovnání (např. skórování, predikce sekundární struktury).\nTestovací případ 1: Zarovnání proteinů virové matrice (VP40s) jedna k mnoha\nPoužití a užitečnost CombAlign bylo demonstrováno vytvořením mezerovitého MSSA za použití strukturního modelu matricového proteinu (VP40) z Reston Ebolavirus (jako referenční struktury) a párových zarovnání mezi referenčními a strukturními modely VP40 z Bundibugyo, Súdán, Tai Forest a Zaire Ebolavirus a Marburg Marburgvirus (obr. 1). Mezera MSSA odhalila strukturně založené korespondence zbytků a reziduí mezi Reston Ebolavirus VP40 a každým z dalších VP40 proteinů, což umožnilo identifikaci strukturně podobných versus odlišných oblastí v Restonu ve srovnání s každým z blízce příbuzných proteinů.\nZarovnání sekvencí založené na více strukturách (MSSA) modelu Reston Ebolavirus VP40 (referenční) bylo zarovnáno s modely VP40 ze čtyř ebolavirů a jednoho druhu Marburgviru. Párová zarovnání TM-align byla spojena pomocí combAlign.py\nPři zkoumání MSSA (obr. 1) je zřejmé, že modely VP40 jsou velmi podobné na úrovni struktury, ačkoli se objevují jasné rozdíly na N- a C-koncích a mezi proteinem Reston Ebolavirus jsou pozorována malá přerušení korespondence. a to Marburg Marburgvirus. Nejviditelnější rozdíly jsou pozorovány v N- a C-koncových oblastech. Většinou konzervované motivy PTAP/PPEY (konzervované v sekvenci mezi ebolaviry, ale nepřítomné v proteinu Marburgviru), byly narušeny v párových strukturních zarovnáních, a proto byly také distribuovány mezi mezery v CombAlign MSSA. Zjistilo se, že rozlišovacím znakem proteinu Reston Ebolavirus ve srovnání s každým jiným proteinem je dalších 5 zbytků na extrémním C-konci (qnsyq), které chybí ve všech ostatních VP40. Protože se předpokládá, že tato koncová oblast funguje při pučení viru, dalších 5 zbytků v proteinu Reston může mít v tomto ohledu nepříznivý účinek na funkci VP40 [9, 15, 16].\nTestovací případ 2: Zarovnání ebolaviru „jeden k mnoha“ Pre-malé/sekretované glykoproteiny (sGP)\nDruhý testovací případ zahrnující strukturní srovnání Reston Ebolavirus sGP s odpovídajícími proteiny z několika dalších druhů ebolavirů (obr. 2) ukazuje, že kombinace strukturních vyrovnání může odhalit strukturální (a tedy potenciální funkční) rozdíly, které nemusí být zřejmé při použití pouze sekvenční metody (obr. 3). Zarovnání CombAlign na obr. 2 naznačuje, že mezi sGP Reston Ebolavirus mohou existovat značné strukturální rozdíly ve srovnání s jeho patogenními blízkými sousedy v N-koncové oblasti, v přibližném středu peptidového řetězce a ve velké části C -minus, zatímco zarovnání Clustal Omega  zobrazené na obr. 3 znamená těsnou globální a lokální korespondenci mezi zbytky těchto proteinů. Zvláště pozoruhodná je divergence pozorovaná na C konci, který obsahuje delta peptid (obr. 3, rámeček). Tato oblast je dokonale zarovnaná na úrovni sekvence, přesto vykazuje špatnou strukturální homologii při zkoumání pomocí strukturních nástrojů. Odpovídající MSSA byly zkonstruovány pomocí CombAlign, aby se určilo, zda jakýkoli daný ebolavirus sGP (jako referenční struktura) vykazoval blízkou strukturní homologii k jakémukoli jinému (data nejsou uvedena), a nebylo nalezeno žádné, které by se dobře shodovalo s jakýmkoli jiným. Tato zjevně špatná homologie struktury může být způsobena poruchou v této oblasti proteinu. Nicméně MSSA na obr. 2 podporuje použití CombAlign pro detekci strukturálních odchylek v požadovaném proteinu vzhledem k jeho strukturálním blízkým sousedům. Předpokládalo se, že delta peptid může fungovat buď jako prevence superinfekce produkčních buněk v počátečních stádiích infekce, nebo mohou zabránit zachycení viru začínajícího potomstva . Protože funkce delta peptidu může být kritická pro patogenitu nebo progresi onemocnění, je zajímavé si všimnout zjevných strukturálních rozdílů mezi sGP z druhů znázorněných na obr. 2 a na základě tohoto pozorování by bylo rozumné odůvodnit strukturu- funkční studie těchto peptidů v kontextu jejich navrhovaných funkcí.\nZarovnání sekvencí založené na více strukturách (MSSA) modelu sekretovaného glykoproteinu (sGP) vylučovaného Reston Ebolavirus (odkaz) zarovnáno s modely sGP ze čtyř ebolavirů. Zarovnání Pairwise TM-align byla kombinována pomocí combAlign.py\nEbolavirus vylučoval glykoproteiny (sGP) v souladu s Clustal Omega. Box: delta peptid\nDostupnost kódu a požadavky\nZdrojový kód CombAlign je k dispozici ke stažení z archivu kódu GitHub. Pro přístup ke kódu je třeba nejprve stáhnout a nainstalovat klienta git [18, 19]. Soubory projektu CombAlign lze klonovat buď pomocí rozhraní GUI, nebo jednodušeji z příkazového řádku (po instalaci softwaru by se po zadání „git“ měla zobrazit nabídka nápovědy). Soubory CombAlign lze poté stáhnout zadáním „git clone https://github.com/carolzhou/Protein“. CombAlign byl napsán v Pythonu 2.6 a lze jej spustit na libovolném počítači nebo serveru, který podporuje Python. Nejsou uvedeny žádné specifické požadavky na zpracování. Nabídka nápovědy se zobrazí zadáním „python combAlign.py help“.\nZde je uvedena podrobná charakterizace proteinu Cysu hemeperoxidázy s ohledem na jeho roli v procesu dozrávání křídel hmyzu. Z naší analýzy je zcela zřejmé, že Cysu heme peroxidáza je mezi bezobratlými zvláště dobře konzervována. Zadruhé, Cysu peroxidáza nese peroxinektinový podpis s motivem vázajícím integrin, Arg-Gly-Asp (RGD), který je podobný peroxinektinům dříve popsaným u raka říčního a u krevety černé tygří. Penaeus monodon . Dosud nebyl hlášen žádný peroxinectin obratlovců. Krevety peroxinektin je velmi podobný Drosophila proteiny související s peroxinektinem, kromě toho, že krevetový protein ve skutečnosti nese dva motivy vázající integrin, RGD a Lys-Gly-Asp (KGD) . Integriny se primárně podílejí na buněčné adhezi. Proto ztráta integrin PS1 Funkce způsobuje výrazné puchýře naplněné tekutinou v křídlech Drosophila, protože dorzální a ventrální křídelní vrstvy se nedaří znovu usadit a vytvořit stabilní spojení. Toto zjištění nás vedlo k otázce, zda jediný motiv vázající integrin v Cysu může být zapojen do adhezní funkce v Drosophila. Existovaly značné pochybnosti, protože ani Cysu mutace mutantů ani RNAi tohoto genu vykazovala fenotyp puchýřního křídla a nepodařilo se nám najít oddělení mezi dorzální a ventrální kutikulární vrstvou kdekoli ve zborcených křídlech, a to navzdory našemu nejlepšímu úsilí. Za druhé, adhezní spoje nebo kontaktní body mezi buňkami se zdají být zcela neporušené Cysu mutantní křídla. A konečně, od přírody, adherenové proteiny musí zůstat v ECM, aby mohly difundovat na dlouhé vzdálenosti . Vzhledem k tomu, že Cysu lze rozdělit, nelze jeho lokalizaci v ECM ospravedlnit. Proto Cysu nezabírá adhezní funkcí mezi dorzální a ventrální vrstvou.\nPokud Cysu pravděpodobně není zapojen do adhezní funkce a pokud naše analýza také vyloučila její požadavek během vývoje křídelního disku, jak je ovlivněna expanze křídla u mutanta Cysu? Nedávno bylo navrženo, že jak Cysu hemeperoxidáza, tak Duox mohou být vyžadovány v procesu zrání křídel hmyzu . Duox je schopen generovat superoxid (O2 .-) radikály nebo peroxid vodíku (H2Ó2) přenosem elektronů z NADPH na kyslík prostřednictvím FAD v savčích buňkách [8, 9]. Drosophila Duox však možná ztratila schopnost využívat H2Ó2 protože postrádá několik zásadních aminokyselin , ačkoli in vitro testy s Duoxem toto tvrzení vyvracejí . Z biochemických studií na hmyzí kutikulární sklerotizaci je zřejmé, že různé katecholické sloučeniny a tyrosiny působí jako prekurzory pro zesíťování proteinu, což pomáhá při stabilizaci křídel po eklosi . Bylo hlášeno, že nedostatek aktivity Duox vede ke snížení hladin katecholových sloučenin a dityrosinových zbytků v křídlech, což pravděpodobně vysvětluje křehká křídla  a fenotyp křídlového (Cy) křídel mutantu Duox . Pokud jde o Cysu, hemové peroxidázy jsou schopné generovat H2Ó2 a tím pomáhají při oxidaci katecholických sloučenin a tyrosinů pro síťování proteinů . Nyní jsme to ukázali Cysu mutant má pozdně se objevující fenotyp křídla, stejně jako Duox. Proto tvrdíme, že Cysu heme peroxidasa využívá H generovaný Duoxem2Ó2 k oxidaci katecholických sloučenin (obr. 8). V mutantském křídle Cysu takové využití H2Ó2 nestává se, což ovlivňuje oxidaci katecholových sloučenin a zesíťování tyrosinu ve zralém křídle. Stále však zůstává mnoho otázek o možné interakci mezi Duoxem a Cysu peroxidázou v křídle, zvláště když knockdown Cysu v mutantu Duox s fenotypem křídla Cy potlačuje fenotyp Cy, takže křídla Cy vypadají téměř normálně . Naštěstí, v dobré víře mutanti Duox a Cysu jsou nyní k dispozici, což nám umožní provádět více interakčních studií a biochemických analýz dvojitého mutanta. Dostupnost těchto dvou mutantů také eliminuje zapojení systému závislého na GAL4, který velmi závisí na časovém požadavku řidiče a síle ovladače. Konečně, partnerství Cysu-Duox by mohlo být zásadní i pro další biologické funkce, jako je odolnost vůči patogenům. Tato zjištění tak mohou vysvětlit zkrácenou životnost Cysu mutant.\nSoučasné poznatky o působení Cysu hem peroxidázy v morfogenezi křídel. Peroxidázová doména Cysu využívá Duox, který generuje H2Ó2 k oxidaci katecholových sloučenin a tyrosinů, které jsou přítomny v proteinových řetězcích kutikuly [1, 2, 11].Oxidace katecholových sloučenin a tyrosinů pomáhá při síťování proteinových řetězců, což je proces, který zpevňuje strukturu křídel\nPredikce sekundární struktury – alfa helixů, vláken beta listů a oblastí vinutí – je dlouhodobým problémem ve výpočetní biologii . Vzhledem k aminokyselinové sekvenci je úkolem předpovědět sekvenci stejné délky, která označuje sekundární strukturu definovanou abecedou určité velikosti. Běžně používané DSSP program  označuje sekundární strukturu experimentálních struktur s 8písmennou abecedou (H, B, E, G, já, T, S), který lze redukovat na menší abecedu (běžně H, E, C) podle definovaných pravidel. Výsledky predikce sekundární struktury byly často použity jako vstupy do metod predikce terciární struktury [3–9], odhad rychlosti skládání , predikce expozice rozpouštědla zbytkům aminokyselin [11–13], predikce beta- polohy a typy obratů [14–16], diskriminace vnitřně neuspořádaných oblastí [17, 18], přesné zarovnání více sekvencí [19–22], predikce proteinové funkce [23, 24] a predikce fenotypů mutace missense .\nProblém predikce sekundární struktury ze sekvence má dlouhou historii, počínaje rokem 1965 . V průběhu více než 50 let se přesnost postupně zvyšovala v důsledku nárůstu počtu experimentálně určených struktur v Protein Data Bank (PDB), množství informací o sekvencích, které jsou k dispozici pro stanovení znaků odvozených z více sekvenčních zarovnání , výpočetní výkon a evoluce algoritmů strojového učení. Struktury v PNR poskytují informace pro odvození základních pravdivých sekundárních strukturních štítků používaných pro trénování a testování prediktivních modelů. V současnosti obsahuje více než 150 tisíc experimentálních struktur a asi 15 tisíc neredundantních proteinů (s <25% vzájemnou sekvenční identitou) . Počet dostupných proteinových sekvencí v sekvenčních databázích se dramaticky zvýšil z 5 milionů v roce 1999, kdy byl široce používán PSIPRED bylo dnes publikováno  na 168 milionů.\nVyvíjely se a zlepšovaly se také metody predikce sekundární struktury a naše schopnost je porovnávat. Několik recenzí [1, 19, 29–33] poskytuje vynikající zdroj historie vylepšení metod predikce. Tyto metody byly rozděleny do souboru čtyř generací metod pokrývajících 50leté období od roku 1960 do roku 2010 [1, 30, 34], rovněž navrhujeme novou pátou generaci od roku 2010 do dneška a popisujeme ji podrobněji.\nThe první generace metod - jako např C+F , Lim  a GORI  — od 60. a 70. let se spoléhalo na preferenci jedné aminokyseliny H, E, a C sekundární typy struktur. V roce 1983 byla původní přesnost 65–70% uváděná metodami první generace revidována směrem dolů na 48–56% . Dickerson a kol. byli první, kdo prokázal, že evoluční informace byly užitečné pro predikci sekundární struktury . Evoluční přístup během tohoto období byl však omezen malým počtem homologních proteinových sekvencí dostupných pro jakýkoli cíl.\nThe druhá generace metody z 80. a počátku 90. let - jako např Schneider , ALB , GORIII , KOMBAJN , a S83  - využilo statistickou analýzu řady sousedních zbytků k předpovědi sekundární struktury centrálního zbytku [30, 34]. Ty byly založeny na statistických informacích, sekvenčních vzorech, fyzikálně-chemických vlastnostech, neuronových sítích (NN), teorii grafů, multivariační statistice, expertních pravidlech a algoritmech nejbližšího souseda . Metody druhé generace těžily z větších sekvenčních databází a využití evolučních informací. Například Zvelebil et al. začlenily evoluční informace do své metody předpovídáním sekundární struktury pro každý protein v souladu a poté hlášením průměrné predikce . Metody druhé generace však saturovaly s nízkou přesností 3 značek 58–63 % a zaznamenaly dva problémy: 1) beta řetězce byly předpovězeny na velmi nízké úrovni přesnosti 28–48 %, mírně lepší než náhodné 2) předpovídané šroubovice a prameny byly příliš krátké na to, aby byly praktické .\nMetody třetí generace z poloviny 90. let – jako např PHD , LPAG , SSP  — dosáhl 10procentního zlepšení přesnosti 3 štítků oproti metodám druhé generace, což vedlo k přesnosti 68–72 %. Metody z konce 90. let do počátku 20. století, včetně PSIPRED , JPred2 , SSpro  a PROF , dále dosáhl 75–77%. Úspěch přinesly tři faktory [30, 34]: 1) použití evolučních informací zakódovaných v zarovnání více sekvencí (MSA) nebo matici bodového hodnocení (PSSM) jako přímé vstupy do predikčního programu 2) větších databází než pro metody druhé generace a 3) pokročilejší algoritmy. Největší zlepšení prokázaly algoritmy založené na neuronových sítích [30, 46, 49, 53, 54].\nInspirován evolučními informačními funkcemi, které jsou vstupem v předchozích aplikacích, čtvrtá generace metody od poloviny dvacátých let minulého století dále využívaly řadu dalších vstupních funkcí , včetně statistik penta-peptidů [55, 56], profilů konzervovaných domén , častých vzorců aminokyselin , předpokládaných úhlů torze [59, 60], predikované kontaktní mapy zbytků , předpokládaná dostupnost zbytkového rozpouštědla , predikovaná terciární struktura [62, 63] a predikované pseudoenergetické parametry pro tvorbu šroubovice . Většina z nich jednotlivě vedla k malým vylepšením. Například Meiler et al. navrhl jako vstup sedm reprezentativních vlastností aminokyselin a ukázal jejich desetinásobnou křížově ověřenou přesnost zvýšenou pouze o 0,5 procentního bodu ze 77% . Předpokládaná dostupnost reziduálního rozpouštědla zlepšila přesnost 3 značek o 3 body . Předpovězené dihedrální úhly pomohly 2 body . Tyto funkce však společně nezlepšily přesnost 3 štítků nad 80% . Některé z metod čtvrté generace-jako např HYPROSP , PROTEUS , MUpred  a DESTILOVAT  - využili výhody strukturních fragmentů nebo šablon homologních sekvencí k pokusu o průlom. Přineslo pouze mírné zlepšení o 3 procentní body a nezvyšovalo přesnost 3 štítků nad 80% s dalšími vstupními funkcemi nebo bez nich.\nIdentifikovali jsme 69 prací publikovaných za posledních 10 let o metodách predikce sekundární struktury. Některé z těchto metod přiřadíme novému pátá generace pokud byly vyvinuty pomocí sofistikovanějších architektur neuronových sítí, jako jsou hluboké konvoluční neurální sítě (CNN), obousměrné rekurentní NN, jako je dlouhodobá krátkodobá paměť, a zbytkové NN a jejich kombinace, [73–82] a/nebo začleněny více pokročilé evoluční vstupní funkce, jako jsou párové koevoluční modely [74, 76–78, 82]. Někteří z nich také přehodnotili přístup založený na šabloně [73, 83] nebo použili soubor modelů s průměrným hlasováním [73, 74, 78, 80, 82, 84] nebo byli vyškoleni v předpovídaných kontaktech zbytků, přístupnosti povrchu zbytků, Expozice Ca-atomů, torzní úhly páteře a předpovědi sekundární struktury 3 štítků z jiných programů . Bezšablonové metody [74–81, 83, 84] uváděly přesnost od 82 do 87 %, což je podstatné zlepšení oproti přesnosti čtvrté generace 80 %. Teoretický limit přesnosti 3 štítků je 90–95% [1, 30, 72, 82, 85, 86] na základě rychlosti, s jakou různé programy, jako např. DSSP a Krok  přiřadit experimentálním souřadnicím stejnou sekundární strukturu.\nV roce 2015 metoda páté generace SPIDER2 [81, 88] využili tři iterativně propojené CNN, z nichž každá se skládala ze tří skrytých vrstev, čímž se dosáhlo přesnosti 3 štítků 82%. Jpred4  měl ve stejném roce opět 82% přesnost kombinací několika CNN vycvičených na stejných vícenásobných zarovnáních prezentovaných sítím různými způsoby. O rok později v roce 2016, DeepCNF  dosáhl zlepšení přesnosti o 2 procentní body na 84 % kombinací 5–7 vrstvého CNN s podmíněným náhodným polem jako další vrstvou. CNN byla zkonstruována ve stylu trychtýře prosazováním stejných vah v sousedních vstupních a skrytých uzlech, a tím omezením celkového počtu parametrů, které se mají trénovat, a umožněním sekvenčních informací delšího dosahu. Finální podmíněná vrstva náhodného pole byla použita pro zohlednění korelace sousedních zbytků. V roce 2017 autoři SPIDER2 upgradovali svou předchozí metodu na novou architekturu NN v SPIDER3 , spoléhající se na čtyři skryté vrstvy s prvními dvěma obousměrnými rekurentními vrstvami NN (BRNN) následovanými dvěma plně propojenými vrstvami a vykazující 84% přesnost 3 štítků, což je zlepšení o 2 procentní body oproti SPIDER2. Také v roce 2017, FSVM  byla hlášena s 83% přesností bez šablony dosaženou pomocí fuzzy podpůrného vektorového stroje. v roce 2018 MUFOLD-SS  uvedli přesnost 3 štítků 84%, přičemž neurální síť spoléhala na vnořené počáteční modely, což jsou vnořené sítě několika paralelních CNN, které se ukázaly jako nejmodernější v rozpoznávání obrazu. Ve stejnou dobu, PORTER5  opět dosáhli 84% přesnosti použitím souboru BRNN. V roce 2018 přišla další metoda, PSRSM  uvádějí zlepšení o 1–2 body na 85–86% přesnost, avšak v nezávislé studii byla uváděná přesnost revidována směrem dolů na 82 % . The PSRSM publikace nezmiňuje vyloučení sekvenční podobnosti mezi tréninkovými a testovacími sadami, což by mohlo být příčinou tohoto nadhodnocení. Metoda 2018, CNNH_PSS (5vrstvá víceúrovňová CNN s dálnicemi mezi sousedními vrstvami), byla vycvičena pouze pro 8 štítků a vykazovala 70% přesnost . Další metoda roku 2018, eCRRNN, soubor 10 sítí založených na kombinaci konvolučních, reziduálních a obousměrných rekurentních NN), prohlásil dosud nejvyšší přesnost 8-label a 3-label 74% a 87% .\nMetody páté generace [73–84] závisí na vícenásobném zarovnání sekvencí cílových sekvencí, zatímco několik z těchto metod také spoléhá na šablony [73, 83], tj. Skutečné proteinové struktury z tréninkové sady sestávající z experimentálních souřadnic proteinové fragmenty. Tyto „šablonové“ metody mohou dosáhnout vyšší přesnosti, v rozmezí 86–93 %, než metody bez šablon. Homologní struktury však nejsou dostupné pro mnoho proteinů, které by byly cílem predikce sekundární struktury, a takové metody nejsou řešením obecného problému predikce sekundární struktury. Přesnost metod založených na templátech klesá z 86–93% na 80–83% bez šablon a dále až na 74–77% bez homologních sekvencí [73, 82, 83]. Podobně přesnost metod založených na MSA bez templátu klesá z 82–84 % na 73–75 % bez použití homologních sekvencí .\nNa základě šablony SSpro5 z roku 2014  využívá a VÝBUCH  vyhledávání PDB za účelem nalezení podobných sekvenčních fragmentů o délce alespoň 10 až cílové sekvence a uvádí nejčastější DSSP-přiřazená třída v sadě proteinů vybraných pro danou pozici. Když žádné podobné sekvence nebo žádná dominanta DSSP třídy v podobných sekvencích, predikce sekundární struktury je založena na souboru 100 BRNN trénovaných na souboru dat. Se šablonami, SSpro5 dosahuje 93% přesnosti 3 štítků bez šablon SSpro5 má pouze 79–80% přesnost. FSVM  popsaný výše může také běžet v režimu založeném na šablonách s použitím stejného konceptu strukturní podobnosti založeného na sekvenci jako v SSpro5. V tomto režimu FSVMPřesnost 3 štítků se zvyšuje z 83% na 93%.\nJedním z běžných problémů, které se opakovaně opakovaly během historie predikce sekundární struktury, je to, že hlášené přesnosti nebyly vždy dodržovány, když byly metody aplikovány na nové srovnávací testovací sady [30, 34, 38, 46, 82, 90]. Rost a Sander  uvádějí, že příliš optimistická tvrzení jsou způsobena nedostatečnou kvalitou a velikostí testovacích sad nesplňujících několik požadavků. Za prvé, mezi proteiny použitými pro trénink a testovací sadou nelze pozorovat významnou identitu párových sekvencí [90, 91]. Například v  bylo školení prováděno na sadě představující celý sekvenční prostor PDB, což vedlo k velmi podobným proteinům v trénovacích a testovacích sadách. Za druhé, velikost testovací sady musí být větší než několik desítek proteinů . Za třetí, kvůli různé strukturní složitosti s určitými rysy, které se snadněji předpovídají, musí být pro testování použity všechny dostupné jedinečné proteiny. Zdrojem nadhodnocení přesnosti může být také neúmyslné několikanásobné nebo několikanásobné testování testovací sady . Je náročné porovnávat programy na běžných sadách benchmarků, protože programy jsou trénovány na různých sadách struktur, z nichž některé mohou být v jakémkoli konkrétním benchmarku. Například CB513 soubor dat  byl použit opakovaně [75, 77, 79, 80, 83], přestože v tréninkových datech pro nový program mohou být použity související proteiny [73, 76, 78, 82].\nV tomto článku zkoumáme faktory, které přispívají k přesnosti sekundární struktury proteinu bez templátu, pomocí (1) souboru 10 jednoduchých tradičních 4vrstvých CNN a (2) přísně definovaných a nezávislých tréninkových, validačních a testovacích sad. Vyvinuli jsme několik testovacích sad a popisujeme, jak porovnat stávající nebo budoucí metody s novými testovacími sadami (nebo podobně konstruovanými testovacími sadami v budoucnu) a jakých chyb se při školení a testování vyvarovat.\nNaše hlavní testovací sada, Test2018, sestává z proteinů, jejichž struktury byly stanoveny v roce 2018 a které nesdílejí více než 25% sekvenční identitu s žádnou strukturou jakéhokoli rozlišení nebo typu experimentu uloženou před 1. lednem 2018. To nám umožňuje porovnat náš program, SecNet, s metodami, které byly trénovány před začátkem roku 2018. Zatímco tam bylo pouze\nZlepšení o 5 procentních bodů oproti metodám třetí generace z počátku dvacátých let minulého století, prokazujeme zvýšení přesnosti o 2–3 procentní body v přesnosti tří a osmi značek ve srovnání se dvěma nedávno vyvinutými modely hlubokého učení, které vykazovaly nejvyšší přesnost na populární CB513 soubor dat dostupný od roku 1999.\nPřerušení identity sekvence 25–30% mezi tréninkovými a testovacími sadami je běžnou praxí již mnoho let [42, 46, 48, 69, 75, 79, 92]. Vyvinuli jsme tři další testovací sady, kde jsme prosadili přísnější kritéria, která by odstranila většinu, ne-li všechny evoluční vztahy mezi naší školicí/ověřovací sadou a testovací sadou. Například jsme použili ECOD (evoluční klasifikace domén) k vývoji testovací sady proteinů, které nesdílejí žádnou homologní doménu s proteinem v naší tréninkové sadě. Klastry domén ECOD na úrovni homologie („úroveň H“), i když jsou domény velmi vzdáleně příbuzné a mají různé topologie (obvykle sdílející společné jádro a určitou funkční podobnost jako důkaz společného předka). Naše přesnost predikce sekundární struktury klesá pouze o jeden procentní bod, když jsou vynucena tato přísnější kritéria.\nProstřednictvím ablační studie, která následovala SecNet Při vývoji jsme zkoumali faktory, které jsou důležité pro vysoce přesnou predikci, jako je složitost metody, typy vstupních funkcí, velikost okna, zdroj a velikost databáze, parametry zarovnání a trénovací hyperparametry. Například na rozdíl od mnoha metod, které používají extrémně široká okna sekvence (pokud jsou celá sekvence) [75, 76, 80, 93], naše výsledky ukazují, že CNN neprospívají z hlediska celkové přesnosti nad 15 zbytků vzdálených od prediktivní štítek. Diskutujeme o praktičnosti predikce sekundárních strukturních značek pro predikci terciární struktury proteinů a navrhujeme nová schémata 4 a 5 predikční značky, která by měla být užitečnější pro strukturální biologii.\nSpecifické funkce SWeeP použité v této studii byly implementovány pomocí programovacího jazyka MATLAB. Kroky uvedené v definici parametrů pro studii 1 a studii 2 byly provedeny na 40jádrovém procesoru Intel Xeon s 256 GB RAM se systémem Ubuntu 16.04.1 LTS. Porovnání s metodami bez zarovnání bylo provedeno na procesoru Intel Core i5 s 16 GB RAM se systémem Biolinux 8.0 (na základě Ubuntu 18.04.01 LTS). Implementace je volně dostupná pro oba operační systémy (viz Dostupnost dat). Pro testy strojového učení jsme použili Weka Software 37.\nSekvence mitochondriálních proteinů byly získány z databáze RefSeq dostupné na ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/. Vizualizace a manipulace s fylogenetickými stromy konstruovanými pomocí SWeeP byla provedena pomocí Dendroscope 3 38.\nCDS bakteriálních genomů použitých pro grafické znázornění matrice M byly získány od NCBI. Organismy a jejich příslušná přístupová čísla jsou uvedena v doplňkové tabulce S4.\nV této studii je reverzibilní matice taková, kde 1 je brána jako ε ( ( varepsilon = 1 )) a binární matice je ta, kde 0 je vzato pro (( varepsilon to 0 )). U všech příkladů a případových studií W (vyšší dimenzionální vektory) byly získány z binární matice. Tato volba je dána skutečností, že nejrelevantnější metrikou v této studii je výpočetní proveditelnost (rychlost komprese a zpracování SWeeP) v kombinaci s našimi výsledky testů, které ukazují, že SWeeP (projekce souřadnic 600) vysoce koreluje s W s rychlostí 0,98 a p -hodnota < 0,01. The slova s mezerami byly vybrány aplikací masky „11011“ ve všech případech, protože se v literatuře doporučuje jako dobrá volba pro proteiny 23 . Metoda SWeeP je nicméně nastavitelná a umožňuje několik projekcí a více k-merů (prostřednictvím změny a/nebo přidání masek), což umožňuje přizpůsobení modelu těženým datům 14,15 jako zvýšený k-mer velikost zvyšuje výpočetní obtížnost.\nNejlepší metrikou vzdálenosti pro mitochondriální proteomy je euklidovská vzdálenost a pro analýzu byla po manuální validaci a plotové analýze zvolena projekce velikosti 600 souřadnic (viz doplňkový obrázek S5 a tabulka S5).\nPodívejte se na video: Beginners Guide to Clustal Omega. Multiple Sequence Alignment (Červenec 2022).\nMyslím, že tohle je lež.\nCopyright 2022 \_ Jak interpretovat matici procent identity vytvořenou Clustal Omega?...


Rozmanitosti - výtvarné a hobby potřeby, vše ke křtu dětí a dospělých\nCírkevní předměty - Devocionálie\nOriginální dárky pro muže, pro ženy i pro děti\nHáčkované taštičky a drobnosti\nFormy k odlévání\nOBRÁZKY PRO ŠTĚSTÍ\nKORÁLKY a BIŽUTERIE\nLátkové ubrusy, prostírání, bylinkové pytlíčky\nDrobnosti pro potěchu srdce...\nRádi bychom Vás upozornili, že poslední balíky v letošním roce odesíláme 14. prosince 2018. S odesíláním balíčků začínáme 7.1.2019. Přejeme vám všem radostné a pohodové Vánoce a vše nejlepší do nového roku 2019.\nElektronická evidence tržeb je zde prováděna v běžném režimu.Podle zákona o evidenci tržeb je prodávající povinen vystavit kupujícímu účtenku. Zároveň je povinen zaevidovat přijatou tržbu u správce daně online. V případě technického výpadku pak nejpozději do 48 hodin.\nKřestní sada - bílá s křestní šálou\nVhodný dárek pro kmotry nebo pro rodiče většího dítěte nebo dospělého.\nKřestní sada obsahuje:\nKřestní svíci, ozdobu na křestní svíci, křestní šálu (Rozměr 25x140cm), bílý růženec s krabičkou ve tvaru srdíčka\nv barvě bílé\nKřestní sada - pro chlapečky - sv. modrá\nVhodný dárek pro kmotry nebo pro rodiče děťátka, kteří chtějí mít vše pěkně sladěno...\nKnihu-Svátost křtu, křestní svíci, ozdobu na křestní svíci, křestní roušku (rozměr 42x19cm), modrý růženec s krabičkou ve tvaru srdíčka\nv barvě světle modré\nSvíčkový vosk - parafín - čínský 1kg\nDo středu formy vložíme knot, který vypneme do svislé polohy např. pomocí špejlí. Netěsnosti ve formě můžeme zalepit plastelínou.Vosk tuhnutím zmenšuje objem, proto je nutné ho průběžně dolívat.\nPozor! Parafin roztápějte zásadně v hrnci ponořeném do jiného hrnce s vodou nebo s dvojitým dnem\nParafín naléváme při teplotě 75-80 °C. Do parafínu vždy přidáváme přísady: stearin nebo aditivum ke zlepšení vlastnosti hotové svíčky...\nKřestní rouška - bílá\nKřestní rouška zhotovená z bavlněné látky dozdobena krajkou.\nKřestní sada - bílozlatá\nKřestní roušku (rozměr 44x19cm)\nOči realistické - 4mm - hnědé\nRealistické oči v hnědé barvě.\nPrůměr barevného oka je 4 mm, celkový rozměr 8x11mm, oči jsou nalepovací, ze spodní strany mají prohlubeň pro snadnější aplikaci lepidla.\nMýdlo s vůní, glycerínové - "Gerbera" - červené\nLuxusní glycerínové mýdlo s nádhernou vůní ve tvaru květu gerbery.\nTavná pistole TAV - 25 -mini\nTavná pistole určená k výrobě dekorací, vhodná rovněž k opravám hraček, nábytku apod.\nKřestní sada - bílá- světle zelená- zlatá\nKřestní roušku ze saténu (rozměr 42x19 cm)\nOzdoba na křestní svíci\nKřestní sada - růžová - pro holčičky\nKřestní svíci( rozměr 30x4,5 cm), ozdobu na křestní svíci, křestní roušku (rozměr 42x19cm), růžový růženec s krabičkou ve tvaru srdíčka.\nKřestní sada růžovobílá\nOzdobu na křestní svíci\nKřestní sada - modrá - pro chlapečky\nKřestní svíci( rozměr 30x4,5 cm), ozdobu na křestní svíci, křestní roušku (rozměr 42x19cm), modrý růženec s krabičkou ve tvaru srdíčka.\nSada k prvnímu svatému přijímání, křtu nebo biřmování\nSada obsahuje věneček z bílých kytiček, možno nakombinovat s barevnými, růženec a přáníčko.\nTermolín 180g/m2, šířka 180cm\nGel svíčkový světle růžový 200g\nSADA NA VÝROBU GELOVÝCH SVÍCÍ obsahuje 2 ks plíšku pod knot, knot a 200g gelu.\nGel svíčkový tmavě zelený 200g\nHedvábný, ručně obroubený šátek čistě bílý, určený k malbě, sítotisku, mramorování, šablonování či razítkování.\nPongé 5, 55x55cm\nMýdlová hmota čirá, transparentní 220g\nMýdlová hmota (glycerínová), barvená, přírodní\nKřestní roušky a svíčky, výtvrné potřeby a materiál, dárky pro každou příležitost\nKabelka háčkovaná - raneček - tyrkysový\nFixa na textil černá\nCena .... 12,- Kč\nMýdlová hmota žlutá neprůhledná 220g\nKruh na výrobu lapače snů - průměr 40cm - béžový - výroba ČR\nCena .... 52,- Kč\nMýdlo s vůní, glycerínové - "Srdíčko" - sv.oranžov


Kvalitní bavlněné povlečení Chameleon v neonových barvách. Matějovský\nKvalitní bavlněné povlečení Chameleon v neonových barvách. 1x 140/200, 1x 90/70\nChamba1 1x 140/200, 1x 90/70 995,- Kč 5 dní\nPřevládající barva: zelená,černá,tyrkysová,oranžová\nKrásné bavlněné povlečení s přírodním motivem v moderním provedení od předního výrobce ložního prádla Matějovského.\nNabízíme vám kvalitní bavlněné povlečení Chameleon,které je veselé a překvapí svým moderním,exotickým zjevem.\nSouvisející zboží - Kvalitní bavlněné povlečení Chameleon v neonových barvách.\nZboží ze stejné kategorie - Kvalitní bavlněné povlečení Chameleon v neonových barvách.\nPodívej se na https://www.byttextil.cz/kvalitni-bavlnene-povleceni-chameleon-v-neonovych-barvach/


Gynekologie Beata 29.6.2016\nDobrý den, měla jsem zapáchající výtok, jsem ve 22tt těhotenství. Byla jsem u svého gynekologa, který mi napsal polygynax, výtok se lepší, ale udělal se mi na pochvě opar. Prosím Vás o radu. Je to pro plod nebezpečné?\nDobrý den, myslím, že opar s léčbou antibiotik nesouvisí, měla byste navštívit Vašeho gynekologa\nVšechny infekce patřící do rodiny herpetických virů představují v těhotenství riziko. Ne jinak je tomu i u herpes genitalis. V prvních dvaceti týdnech těhotenství se může plod nakazit skrze placentu. Často pak dochází k potratům, virus však může způsobit i vrozené vady dítěte. Největší riziko je nákaza dítěte při porodu. V té době nemá miminko dostatečně silnou imunitu a vytvořeny protilátky, proto je velmi ohroženo. Kontrola by tedy byla více než vhodná.


Příjmení bez koncovky -ová - - Dokumenty, doklady...\nlady5 Ahoj holky prosím o radu\nChtěla bych příjmení bez koncovky -ová, všude jsem četla, že mám zaškrtnout poslední možnost a to, že se hlásím k jiné národnostní menšině, ovšem ty diskuze jsou všechny dost staré a já nevím jak to platí teď. Má někdo zkušenost z poslední doby?\n3. led 2016 ve 21:24 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nzorro4 @lady5 uveď, že plánujete život v zahraničí\n3. led 2016 ve 21:33 • Svatba byla v srpnu 2014 • Odpověz • To se mi líbí •\nzorro4 @lady5 "občanku, která má nebo bude mít trvalý pobyt v cizině"\n3. led 2016 ve 21:34 • Svatba byla v srpnu 2014 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 no jenže jsem četla že chtějí nějaké potvrzení a to já nemám.\n3. led 2016 ve 21:54 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nzorro4 @lady5 na potvrzení nemají nárok. Můžete mi věřit, jsem právník. Jedná se o úmysl žít v zahraničí, klidně v horizontu několika let, přičemž o tom samozřejmě nemůžete mít žádný doklad. Postačuje tedy čestné prohlášení. Matrikářka nemá žádný právní titul prozkoumávat cokoliv dalšího.\n(A je to tak schválně, vzniklo to v zákona jako berlička - aby to šlo vždycky, ale bay se jazykovědci nepo...)\n3. led 2016 ve 22:12 • Svatba byla v srpnu 2014 • Odpověz • To se mi líbí •\nantakka @lady5 Ahoj, vdávala jsem se vloni a nechala si příjmení bez "ová". V Praze to problém na matrice nebyl žádný a postup byl přesně takový, jak píše @zorro4 . V Praze je požadavek na nepřechýlené příjmení celkem běžný, takže to nikdo moc neřeší. Na malých městech to ale prý někdy tak jednoduché není. Matrikářky tomu někdy nebývají nakloněny a snaží se budoucím nevěstám tento krok rozmluvit a nebo znepříjemnit. Držím palce\n3. led 2016 ve 22:30 • Odpověz • To se mi líbí •\ndanna987 Ahoj, já jsem teď bez ová. Vše bylo v pohodě. Jen jsem zaškrtla jeden z důvodů v dotazníku a nikdo mi nic neřekl... Ani po mne nikdo nechtěl žádné čestné prohlášení či co. Kdyby na vás bába blbě koukala tak to je jen z toho důvodu že je naštvaná na svou práci\n3. led 2016 ve 23:51 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 @zorro4 ale teoreticky, když bych napsala že nejsem české národnosti, tak mi také nikdo nemůže nic říct ne? Národnost se nikde neuvádí, občanství mám české, ale národností můžu být třeba němka podle toho jak se cítím. je to tak ne?\n4. led 2016 ve 14:57 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nviki999 @lady5 Mám v plánu taky příjmení bez -ová (přítelovo příjmení je cizí).. Přesně přemýšlím, která možnost je snesitelnější, ale obě mi přijdou skoro rovnocenné...\n@danna987 předpokládám, že spadám pod stejnou matriku (resp jsem si 100% jistá)... Ráda čtu, že zde nebude problém... Díky ;)\n4. led 2016 v 15:12 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 @antakka na které matrice jsi byla?\n4. led 2016 v 15:28 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 @viki999 ještě mi kamarádka říkala, že na vydání občanky i řidičáku musela vypsat národnost, tak nevím zda není lepší tam fakt napsat že budu bydlet v cizině.\n4. led 2016 v 15:29 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nviki999 @lady5 no, v OP by měla být jen příslušnost, pokud se nepletu.. edit: vyhledala jsem si i formulář a je tam občanství.. národnost ne..\n4. led 2016 v 17:22 • Odpověz • To se mi líbí •\nl_a_u Eviduje se jen státní občanství, národnost ne. Národnost se uvádí jen 1x za deset let při sčítání lidu. Ale to je jen pro statistiku, nezavádí se to do evidence.\n4. led 2016 v 19:02 • Odpověz • To se mi líbí •\nba2te Vdávala jsem se na konci října a příjmení mám též bez -ová. Jak už zde bylo napsáno, uvedla jsem, že mám nebo budu mít trvalý pobyt v zahraničí. Malé město, paní koukala, ale problém to nebyl. Prý bude problém až po narození dcery, ta bude automaticky s -ová a pokud si poté zažádám o zkrácení, už bych tu adresu v cizině doložit musela.\n4. led 2016 v 19:59 • Odpověz • To se mi líbí •\ndajous Vdávala jsem se v červenci, a dělala jsem to stejně jako už říkaly holky viz výše ;) jen zatrhneš, že jsi jiné národnosti, nikdo nic jiného potom neřeší ;)\n4. led 2016 ve 20:15 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 @dajous furt mě tu děsí ty dvě možnosti. můžu zaškrtnout že budu žít v zahraničí ale až se mi narodí dítě tak mu budu muset zaškrtnout, že je jiné národnosti a nevím jak moc to kontrolují aby nedělali problémy. Líbí se mi víc to že jsem jiné národnosti, jen jsem se bála aby mi to vůbec povolili.\n4. led 2016 ve 20:20 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nlucineni @lady5 a jsi jiny narodnosti? Protoze to se da snadno zjisti,jestli je to pravda ne..\nMyslim,ze jsou i vyjimky kdy manzelovo prijmeni konci na nejaky samohlasky.Nevim,jak se budes jmenovat ale mozna by to slo pres to,ale tvrdit,ze planujes zivot v zahranici kdyz to neni treba pravda mi prijde zbytecny a nechala bych ova.\nlady5 @lucineni no zda jsem jiné národnosti asi nezjistí jelikož je velký rozdíl mezi občanstvím a národností. Co já vím tak občanství mám české a národnos si určuju já sama podle svého rozhodnutí. Pokud se cítím např jako němka, tak se řadím k jiné národnostní menšině a to se nikam nepiše\n4. led 2016 ve 20:47 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nlucineni @lady5 Ja vim,ze je tam rozdil,jen mi prijde tak nejak zvlastni hlasit se k jiny narodnosti,kdyz napr ziju v CR,ale kdyz se tak citis,tak at Ja jsem zastance prijmeni s -ova,pokud zena zije v CR. Pokud si beres cizince,je logicky,ze nebudes mit -ova.\nAle pani Mracek, Smetana a podobne jsou odstrasujici pripady\n4. led 2016 ve 20:53 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 @lucineni nebudu mít české jméno, přítel má německé jméno takže se mi to bez ová zdá lepší\n4. led 2016 ve 20:55 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nlucineni @lady5 tak tam to prave jde bez ova s tim,ze si beres cizince a nemusis ani resit narodnost\n4. led 2016 ve 20:56 • Odpověz • To se mi líbí •\nlucineni "Při zápisu uzavření manželství nebo vzniku partnerství lze na základě žádosti ženy, jíž se uzavření manželství nebo vznik partnerství týká, uvést příjmení, které bude po uzavření manželství nebo vstupu do partnerství užívat, v mužském tvaru, jde-li o občanku, jejíž manžel je cizinec..." zadny zbytecny vymyjsleni duvodu.\n4. led 2016 ve 20:58 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 @lucineni nj jenže přítel je čech, jen má po předcích asi :D cizí jméno\n4. led 2016 ve 21:33 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nmr_falko no, muj je taky cech s ceskym prijmenim a ja chci byt bez -ová, tak sna to projde, dneska jsem volala na matriku pro termin a pani byla velmi prijemna, tak doufam, ze to projde\n4. led 2016 ve 21:55 • Odpověz • To se mi líbí •\nlucineni @lady5 tak jeste moznost,ze konci "blbe",kdysi jsem to nejak zkoumala,pritele prijmeni konci y a jsou i dalsi vyjimky kdy nemusis mit ova. Asi by bylo nej se vazne odstehovat z CR\n4. led 2016 ve 21:59 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 @lucineni ono je totiž i možný, že se někdy odstěhujeme za prací ale teď určitě ne.\n4. led 2016 ve 22:55 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 @mr_falko jinak když jsem volala já na matriku tak byla taky paní velice milá, dnes jsem tam byla osobně a ze začátku žádná sláva, ale nakonec byla celkem hodná\n4. led 2016 ve 22:56 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nzorro4 osobně bych volila možnost "občanku, která má nebo bude mít trvalý pobyt v cizině", neboť úvahu, že budeš mít trvalý pobyt v cizině ti není nikdo schopen vyvrátit, a to ani v budoucnu, zatímco s jinou národností, pokud se k ní nehlásíš, prostě matrice lžeš... ale upřímně, je to prašť jako uhoď, to ustanovení slouží skutečně jen k uspokojení jazykovědců...\n5. led 2016 v 09:58 • Svatba byla v srpnu 2014 • Odpověz • To se mi líbí •\nlahvan @lady5 Antakka byla na Praze 1\n5. led 2016 v 11:43 • Odpověz • To se mi líbí •\nlady5 Tak jsem psala na matriku zda když zaškrtnu možnost že se budu stěhovat do zahraničí, zda bude potřeba něco dokládat. Paní matrikářka mi odepsala:\npři uzavření manželství není třeba tuto možnost nijak dál dokazovat, stačí jí zaškrtnout na dotazníku.\n5. led 2016 v 16:03 • Svatba byla v září 2017 • Odpověz • To se mi líbí •\nantakka @lady5 Praha 1\n8. led 2016 ve 13:33 • Odpověz • To se mi líbí •


Jedlá prachová barva růžová - Blossom Tint - 7 ml - Sugarflair Colours - Práškové barvy bez třpytu - Práškové a prachové barvy, Potravinářské barvy a barviva, Suroviny - Svět cukrářů\nKód produktu: P24561 Výrobce: Sugarflair Colours Zajímá vás něco? Zeptejte se, rádi poradíme.\tOdebrat z oblíbených\tDo oblíbených\nSugarflair Blossom Tint Dusting colors jsou jedlé práškové barvy vhodné k vytváření krásných, přirozených, realistických efektů např. na listech, okvětních lístcích figurek z marcipánu nebo fondánu. Doporučujeme nanášet malé množství prášku měkkým štětcem.\nČást prášku smíchejte s kapkou alkoholu (např. Rejuvenator Spirit).\nSložení: E171, E122. E122 může mít nepříznivý vliv na aktivitu a pozornost dětí.\nVaše zkušenost s produktem Jedlá prachová barva růžová - Blossom Tint - 7 ml:


Aktuální předpověd počasí Jilove u Prahy online - Extrémnípočasí.cz\nPředpověď počasí Jilove u Prahy\nPředpověď počasí Jilove u Prahy (Česká Republika)\nZajímá vás, jaké počasí můžete očekávat ve městě Jilove u Prahy? Bude sněžit, pršet, mlhy, slunečno nebo vše dohromady?\nJilove u Prahy je město, které leží v České republice. Město Jilove u Prahy má mírné podnebí. Vyznačuje se vzájemným pronikáním oceánských vlivů ze zápasu a kontinentálních vlivů z východu, přičemž podle Koppnerovy klasifikace podnebí patří Jilove u Prahy do klimatické oblasti Dfb. To znamená, že srážky v této oblasti nejsou rovnoměrně rozložené. Díky chladnějším zimám je tak v létě větší úhrn srážek, než v zimě. Nejvyšší teploty se pak v této klimatické oblasti pohybují okolo 30°C. Nejnižší teploty pak od -10°C do -35°C. Podobné počasí jako ve městě Jilove u Prahy tak panuje v pobaltských zemích, jihozápadní části Ruské federace, nebo například na hranicích mezi Kanadou a USA. S trochou nadsázky lze říct, že podobně rozmarné počasí jako platí pro Jilove u Prahy platí i pro New York, Toronto, nebo Chicago, ale i Berlín, Budapešť, Kyjev, Bukurešť i Moskvu.\nVliv na podnebí města Jilove u Prahy má jeho nadmořská výška a reliéf. Je totiž třeba počítat s tím, že střední nadmořská výška pro Českou republiku je 430m nad mořem. S každým 100m navíc je průměrná teplota nižší 0,65°C.\nJaké jsou srážky ve městě Jilove u Prahy? Průměrně naprší 500 až 800 mm srážek za rok. Nejsušší místo v České republice je v Mostecké pánvi, kde naprší jen 410 mm srážek ročně. Naopak nejdeštivěji je v Bílém Pooce, kde spadne 1 705 mm.\nMapa Jilove u Prahy (Česká Republika)\nWebkamery - Jilove u Prahy (Česká Republika)


V bulharské vesnici Dolní Cibar Romové usilují o vzdělání, říká se jí romský Cambridge | Vysočina\nRomský Cambridge – takovou přezdívku si vysloužila jedna bulharská vesnice na břehu Dunaje. Má zhruba dva tisíce obyvatel, téměř všichni z nich jsou Romové a vyznačují se velikou touhou po vzdělání. Předloni o ní byl natočen dokumentární film, s nímž se čeští diváci mohli seznámit na nedávném Festivalu bulharských filmů.\nPo dobu jednoho roku natáčel tým režisérky Eldory Trajkovy ve vesnici Dolní Cibar v severozápadním Bulharsku. Jak se o ní dozvěděl, vypráví producent Asen Vladimirov:\n„V jednu dobu se objevilo několik reportáží na různých televizních stanicích, a protože novináři nejsou vůči Romům nijak blahosklonní, tak se objevil ten spíše ironický název této vesnice Cambridge, protože obyvatelé této vesnice mají zájem o vzdělání. Obvykle ta média, konkrétně z televize, vyšlou štáb, ten na místě stráví hodinku-dvě a má hotovo. Ale my jsme šli jinou cestou, strávili jsme tam rok, abychom mohli analyzovat tamní situaci. Ukázali jsme tu vesnici ve všech čtyřech ročních obdobích a ten film provází hudba z Vivadiho koncertu Čtvero ročních období. Byli jsme tam tak 10x – 15x vždy tak na tři-čtyři dny. Předtím jsme ještě měli přípravné období, kdy jsme hledali nějaké podklady atd.“\nA čím to je, že Romové z této vesnice tolik usilují o vzdělání?\n„Patrně to byla náhoda. Několik mladých lidí z té vesnice vystudovalo pedagogické školy, vrátili se domů a patrně tam postupně zapůsobili na ostatní a vzbudili u nich zájem o vzdělání. Pro Bulhary je typické, že vzdělání je pro ně něco takřka posvátného. Rodičům není líto žádné sumy na to, aby jejich děti získaly co nejlepší vzdělání. A u Romů je to téměř naopak, nic jim to neříká, děti velmi často nechodí do školy, rodiče je nenutí, a tak zůstávají negramotní. A v tomto směru je Dolní Cibar zvláštní fenomén.“\nPřestože tým režisérky Eldory Trajkovy natáčel film o Romech už počtvrté, Dolní Cibar na něj udělal velký dojem.\n„V tamní základní škole je několik mladých vysokoškolsky vzdělaných učitelů, kteří se vrátili do té své vesnice, aby tam mohli působit. Je tam jedna mimořádně krásná mladá učitelka, její rodiče pracují ve Španělsku, ona by se tam také mohla velice dobře uplatnit, ale dala přednost návratu do své vesnice, aby tam učila děti. Učitel angličtiny by také s angličtinou mohl dělat cokoliv, ale radši učí děti. Ti mladí učitelé projevují takovou vášeň, že ty děti nakazili a děti mají skutečně zájem o studium. Ve filmu vystupují také dvojčata, chlapec a dívka, a ten chlapec sní o tom, že bude studovat na Harvardu. To je prostě unikum! Obvykle ten zájem o studium není. A přitom je to chudá vesnice, i když je velká. Dřív tam byl nějaký průmysl, Ale teď už tam není žádný zaměstnavatel.“\nZ dokumentárního filmu Cambridge|foto: Bulharský kulturní institut\nDosud mluvil producent Asen Vladimirov o tom pěkném, ale nabízí pohled i z druhé strany.\n„V Bulharsku se často říká, že pro integraci Romů je podstatné vzdělání. Ale tady se ukazuje, že vzdělání – jak středoškolské, tak dokonce i vysokoškolské – nestačí k tomu, aby ti lidé získali práci. V Bulharsku je rasová diskriminace a ti lidé nemohou najít ani tu nejjednodušší práci. Takže to vzdělání jim nestačí.“\nTo dokazuje i situace rodiny, která původně žila v Dolním Cibaru.\n„Ve filmu také vystupuje rodina, která žije v Norsku, a přijela do Bulharska do protestantského kostela pokřtít dítě. Vypráví svůj příběh, kdy otec byl podnikatel ve stavebnictví, matka byla porodní asistentka, vystudovala vyšší odbornou školu a žili normálně. Měli dceru velmi nadanou na matematiku, která šla studovat do Sofie na specializované gymnázium, ale tam narazila na šikanu, děti se jí posmívaly. Do toho přišla ekonomická krize a ve stavebnictví se už nedařilo, takže rodina začala mít potíže. Ale do Norska se rozhodli odejít hlavně kvůli tomu, že jejich dítě trpělo šikanou ve škole. Ta rodina se v Norsku adaptovala velmi dobře, matka hned našla práci ve svém oboru a dívka také velmi dobře studuje, chce se stát architektkou a prohlašuje, že do Bulharska se už nikdy nevrátí.“\nŘíká o filmu Cambridge jeho producent Asen Vladimirov.


Hotely Hampton by Hilton v Oklahoma City, OK - TripAdvisor\nHotely v Oklahoma City s nejlepším poměrem cena / kvalita\nHotely Homewood Suites v Oklahoma City\nHotely Home2Suites v Oklahoma City\nHotely Embassy Suites v Oklahoma City\nHotely Staybridge Suites v Oklahoma City\nHotely Hilton Garden Inn v Oklahoma City\nHotely Country Inns And Suites v Oklahoma City\nO destinaci Oklahoma City\nHotely Hampton by Hilton v Oklahoma City\n6 z 183 zařízení odpovídá Vašim filtrům. Vymazat všechny filtry\nČ. 1 z 183 cenově nejvýhodnějších ubytování – Oklahoma City\nČ. 2 z 183 cenově nejvýhodnějších ubytování – Oklahoma City\nČ. 3 z 183 cenově nejvýhodnějších ubytování – Oklahoma City\nČ. 4 z 183 cenově nejvýhodnějších ubytování – Oklahoma City\nČ. 5 z 183 cenově nejvýhodnějších ubytování – Oklahoma City\nČ. 6 z 183 cenově nejvýhodnějších ubytování – Oklahoma City\nZobrazit všechny nabídky od 248 US$ (celkem 7)\nČ. 20 z 163 hotelů – Oklahoma City\nČ. 12 z 163 hotelů – Oklahoma City\nČ. 33 z 163 hotelů – Oklahoma City\nČ. 5 z 163 hotelů – Oklahoma City


Nejsem historik, byť rád čtu životopisy. Milujeme generála Pattona (osvoboditele Plzně), byť mu několikrát hrozil polní soud za jeho prudkou povahu. Napadal v nemocnicích domnělé simulanty a Eisenhower ho (po jednom z těchto incidentů) v roce 1943 na deset měsíců zbavil velení. Na Sicílii v Acate Pattonovi vojáci zmasakrovali 72 italských zajatců a měl z toho velký konflikt s generálem Bradleym. Ale to je přece úplně jedno. Máme Pattona rádi — je symbolem vítězství nad nacismem, jeho socha není oslavou pruďase Pattona, ale amerických vojáků — vítězů nad fašismem — a on byl jejich velitel. Byl to výborný voják.\nKoněv spolu s Žukovem byli oba ve Stalinově nemilosti — jakožto populární maršálové a vítězní vojáci. Odvolaní a znovu ve vyšších funkcích až po Stalinově smrti. Koněv předsedal soudu s vrahem a šéfem NKVD Berijou — jeden z okamžiků, kdy odstartovalo Chruščovovo uvolnění režimu. Lze se dočíst i to, že během invaze 1968 byl Koněv v penzi a roku 1970 odmítl dojet si od Husáka převzít titul Hrdina ČSSR.\nKdyž Koněv zahájil útok na Berlín — bylo to dobře, nebo špatně? Vaši a moji prarodiče a praprarodiče — vítali v květnu 1945 Koněva, nebo jim vyhovoval K. H. Frank?\nVědí to i ničitelé soch. Jenže jako mnohokrát v minulosti, dnes nejde o minulost. Jde o současnou českou politiku. Možnost beztrestně urážet všechny lidi nepapouškující vládnoucí mantry. Když obdivujete Trumpa a Johnsona a kritizujete čím dál bizarnější politbyro eurosojuzu — tak jste „proruskej“. Vlastně se to hodí vždycky a místo všech argumentů.\nDiskuse se okolo toho ještě povedou, ale ničitelé soch (jako vždy v historii) vyhrávají nad těmi uvážlivými. Pro Rusy se svými miliony mrtvých a obrovskou hrdostí na statečnost svých dědů — je útok na sochu oslavující hrdinu 2. světové války podobný, jako by nám někdo rozkopal Husův dům v Kostnici, protože to byl kacíř (z pohledu bavorských katolíků). Brali bychom to jako zbytečný útok na něco z dávné historie, nenávistný akt.\nVíce se dočtete na osobním webu autora vkml.cz, nebo na Facebooku autora\nAutor článku: Klaus V. ml. | Vydáno: 3. 9. 2019 | Přečteno: 354 × | Prestiž Q2: 16,67\nPodobné články: :: ↓ ↓ :: Když se chce, tak to jde Rusové byli šokováni, když k nám přijeli Když estébák bojuje proti komunismu a politik proti korupci Když chtějí bohové někoho zničit, nejdřív mu seberou rozum Když trh poskytuje trh Kdy, když ne teď? Problém časových preferencí Šlechtová lže jako když Babiš tiskne Když poslanci potřebují zaparkovat Babiš prostě na zákony kašle, když se mu nehodí! Když česky nemusí umět ministr, nemusí ani děti Můžeš si to myslet, ale běda ti, když to budeš někde prezentovat Když vám policie přijde zakázat tibetskou vlajku R. Sulík se mýlí — se Slovenskem budeme obchodovat, i když vystoupí Bystrčáci: Když jste aktivista, je vám všechno jedno Když se zprávy mění v poker Proč matematiku? Stačí, když lidé budou umět počty! …stalo se co muselo, když ukázal jim záda Když se naštve mladý muž v Mnichově, o jehož víře se mlčí Když si doma čteme knížku Když jsou úřady všemocné, firmy jsou bezmocné Když umřít, tak levně Nové daně — Když (kdekoliv) vládnou dlouhá léta socialisté… Když do Prahy přijiždi německy kancleř, byva to často vyzva… Když vám píše vlastní babička, že mrháte svým nadáním Když jde o všechno Když přišli pro mě… Když menšina vládne většině. Nebo je to jinak? Když volá poslanec, je to jízda Když voliči podléhají „fake news“ Když se ucpe důchodové potrubí Když úředník „dělá“ zákony Nestaň se idiotem, ani když jsou na to dotace Kdo zůstane hladový, když se zvýší minimální mzda? Když (politická) žumpa vyteče na povrch Když Československo přijalo Marshallův plán Když potírali kouření, mlčel jsem, jsem přeci nekuřák Když jde západní civilizace do kopru Když zlo je líčeno jako dobro a dobro jako zlo Dobrý úmysl nestačí, když minimální mzda mrzačí Když si ten Adolfek Stalina bral Když se falšuje historie …když pracujete v Lidovém domě (1/4) …když pracujete v Lidovém domě (2/4) …když pracujete v Lidovém domě (3/4) Když se v Praze kácel mariánský sloup Teď když máme, co jsme chtěli… Když už ani král neskrývá svou nahotu Co když se i mistr MMF v předpovědi růstu utnul? Kde jsou všichni aktivisté, když jsou vražděni bílí farmáři? Tak já si tu německou okupaci připomenu sám, když mainstream mlčí Když se dva mají rádi… Když lékař je Bůh Když potrefená husa začne kejhat Když zloděj křičí: Chyťte zloděje! Když mají soudci pravdu Když uděláte chybu v Ústavě Proč nejsme nejlepší na světě? I když bychom měli… Problém „liberálů“ na celém světě, … když pravda je horší než lež Když se vaše noční můra zhmotní a ukradnou vám dítě Máme se až moc dobře. Když to vidím, začínám se bát Když podepisuješ, tak se nediv Když stát selhává aneb Ochrana postavená na hlavu Když se dva přes oceán perou Když revoluce začne požírat své děti Když hoři symboly, přichaza blba doba Když jde do tuhého, musíme lhát V co teda věřím, když nevěřím ve stát? Když jste si mě upekli… Když nemáte limetku, dejte tam antisemitismus Když německý bankster kýchne… Když komunisté přebírají moc Když politikům neziskovka přeroste přes hlavu Manipulátoři.cz aneb Když manipulují experti Když dochází státu peníze, přijde na řadu zvůle úředníků… Když je oběd křivdou Proč nechci emigrovat, i když mě tu mnoho věcí štve Když Česká televize lže jako Rudé právo Když byl Zeman premiérem Když Piráti přepadnou svůj vlastní koráb Vzpomínka na Margaret Thatcherovou a odhalení Churchillovy sochy Jako když nehty přejíždějí po tabuli Mám rád, když jsou na sebe lidi hodný Když není po jejich, cítí se opět bezmocní Nevěřte jim, když přicházejí s … dětmi(?) Když se levá ruka tluče do levé nohy Když už likvidace, tak likvidace aneb Hospody v době koronavirové Když se socáč vrací Co když je koronavirus opravdu jen o něco horší chřipka? Když je prázdný barel dražší než barel plný ropy Ad kauza Opočno: Když jedna nespravedlnost plodí další Zálohované výživné = když stát platí alimenty Když vláda lže, až se práší Když dva dělají totéž, je to totéž Když jde hlavně o zdraví Když necháme vládu u vesla déle, vyrobí i zápornou nezaměstnanost\n+28 Známkuj článek –31\nLibor 4. 9. 2019 09:03:38\nRedakce 4. 9. 2019 11:07:35


Aktuální nabídka půdní prostory Lešná denně zásobovaná stovkami realitních kanceláří. Vyberte si půdní prostory Lešná než Vás někdo předběhne.\nKategorie půdní prostory Lešná se neobjevuje v nabídce tak často. Hledáte-li pro sebe, rodinu či přátele půdní prostory Lešná neváhejte ani chvilku a pokud Vás některá z nemovitostí osloví je dobré kontaktovat prodejce či makléře. Většinou je půdní prostory Lešná právě druhem nemovitosti, který je obvykle hledaný a díky menší četnosti v nabídce je hojně poptávaný.\nLevné půdní prostory Lešná\nPrávě hledáte své nové bydlení či jiný druh nemovitosti v kategorii půdní prostory Lešná, pokud v této kategorii nemůžete nalézt vhodnou nemovitosti zkuste i kategorii následující půdní prostory Lešná, a to půdní prostory na prodej Lešná, pronájem půdního prostoru Lešná, dražby půdních prostorů Lešná.\nPokud nalezené nemovitosti v kategorii půdní prostory Lešná nesplňují Vaše představy, rozšiřte své hledání na nemovitosti v následujících kategoriích půdní prostory Lešná, půdní prostory na prodej Lešná, pronájem půdního prostoru Lešná, dražby půdních prostorů Lešná.\nNehledáte půdní prostory Lešná ?\nPokud jste v této kategorii půdní prostory Lešná omylem a hledáte jiný typ nemovitosti zkuste si vybrat z následujících :\nDalší lokality v okolí půdní prostory Lešná\nPro ještě lepší výsledek ve Vašem hledání v kategorii půdní prostory Lešná, si můžete upřesnit lokalitu pro Váš současný výběr půdní prostory Lešná. Určitě lépe naleznete půdní prostory Lešná, který hledáte.