A la Directora del Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Dra. Alicia Mattiazzi por permitirme trabajar en él.\nEn primer lugar quiero expresar mi agradecimiento a mi directora de tesis, la Dra. Gladys Chiappe de Cingolani por guiarme en la realización de la presente tesis, por su paciencia y tolerancia, y al Dr. Horacio Cingolani, Gracias! porque sin conocerme me permitió trabajar en su grupo, por trasmitirme sus conocimientos y su gran vocación, que es hacer ciencia.\nA mis compañeros del laboratorio, que desde que llegué de Mar del Plata, me hicieron sentir cómoda y parte del grupo.\nA la Dra. Irene Ennis, Dr. Alejandro Aiello, Dr. Gustavo Pérez y Dra. Susana Mosca por estar siempre!, por su buena disposición, aunque estén súper ocupados estuvieron y están ayudandome, por responder mis dudas y por las charlas y buenos consejos: Muchas Gracias!.\nA la Dra. Claudia Caldiz, por soportarme diariamente en el laboratorio, gracias por los consejos mate de por medio, Gracias!. A los becarios: Verito, no hace mucho que nos conocemos pero en estos pocos años hemos sembrado una linda amistad, Gracias!. A Alejandro Orlowski, Romi, Miriam, Gisel, Ceci, Vero, Omin, Luciana, Mariela, Carolina, Juliana, Mónica y Julieta, Gracias por compartir tantos lindos momentos !.\nA mis amigos marplatenses….que aunque ya no estemos juntos nos unen miles de recuerdos hermosos, Muchas gracias. Por saber escuchar y por compartir conmigo momentos alegres, tristes, aventuras, por las guitarreadas, campamentos…en fin… Gracias ! A Diego Ruiz, Victoria Ordoñez, Leda Orfei,\nEmo, Fernando Mappelli, Cecilia Grierson, Marina Sammarone, Ayelén Blanco, Valeria Turowski, Maqui, Guadalupe Degreff y Pablo Denuncio.\nEsta tesis está dedicada a mi MAMÁ, por enseñarme que nada es imposible si tenés fé y perseverancia, te quiero con todo mi corazón y a pesar de la distancia seguís siendo mi guía. A mi hermana Yasmina, gracias por los sobrinos hermosos que me diste, Estefi y Joaquin, Los Amo mucho. A David, mi hermano, gracias por estar. A mi papá, aunque la vida nos haya separado, sabes que te quiero, y gracias por tus consejos y por trasmitirme tus vivencias. Saben todos que los tengo en el corazón.\nA mi esposo, GUSTAVO, Gracias por tu apoyo incondicional, por escucharme, por tus consejos y sobre todo por el hijo hermoso que me diste: MATEO. Los Amo, son mi vida!.\nEn esta tesis se presentan resultados sobre el mecanismo por el cual la angiotensina II y endotelina 1 aumentan la producción de especies reactivas del oxígeno (ERO) en tejido cardíaco. A través de las ERO, dichas hormonas producen señales intracelulares que pueden conducir a la insuficiencia e hipertrofia cardíaca debido al aumento de calcio intracelular por activación del intercambiador Na+/H+ (NHE-1). Entre las estrategias estudiadas para prevenir/revertir la hipertrofia cardiaca se encuentra la inhibición de la actividad del NHE-1 con sildenafil, un inhibidor de la fosfodiesterasa 5 A (PDE5A). Debido a esto, como ya se adelantó en el último informe de avance de la tesis, se consideró importante incluir el estudio del mecanismo por el cual el sildenafil inhibe la actividad del NHE-1.\n1.1. Hipertrofia cardíaca………...……..…...1\n1.2. Angiotensina II (Ang II) y Endotelina -1 (ET-1)… ………...2\n1.2.1. Formación de Ang II………..………...2\n1.2.2. Formación de ET-1…...3\n1.2.3. Receptores de Ang II y ET-1 1.2.3.1. Receptores de Ang II: AT1 y AT2………….………...5\n1.2.3.2. Receptores de ET-1: ETA y ETB……….5\n1.4. Vía de señalización intracelular activada por Ang II/ ET-1………...7\n1.5. Especies reactivas del oxígeno (ERO)………...……...10\n1.5.1.4.2. Mitocondria como fuente de ERO………...…………...15\n1.5.2. Sistemas antioxidantes………...16\n1.6. Mecanismo de “liberación de ERO inducida por ERO”………..17\n1.3. Relación entre Ang II y 1: Efectos de Ang II mediados por ET-1.5.1. Fuentes de ERO...10\n1.5.1.1. NAD(P)H oxidasa...10\n1.5.1.2. Xantino oxidasa...11\n1.5.1.3. Óxido nítrico sintasa………..12\n1.7. ERO como segundos mensajeros en Hipertrofia cardíaca………...19\n1.8. Importancia de la regulación del pH intracelular en el miocardio…….21\n1.9. Regulación del pHi por transportadores iónicos\n1.10. Características estructurales y funcionales del NHE-1…………..….22\n1.11. Rol fisiológico y patológico del NHE-1...24\n1.11.2. Rol patológico...24\n1.12. Factores que regulan la actividad del NHE-1………24\n1.13. Inhibición del NHE-1 y su relación con PKG\n1.13.2. Acción de sildenafil y su efecto sobre el corazón……..……….27\n. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS\n2.1. Objetivo I………..………...29 2.2. Objetivo II………..………....30\n3.1. Animales………....31 1.11.1. Rol fisiológico...24\n1.13.1. Cardioprotección por inhibición específica del NHE-1. ……….26\n3.2. Cortes de tejido ventricular ……...………...31\n3.3. Aislamiento de miocitos ventriculares………...31\n3.4. Viabilidad celular………...32\n3.6. Protocolo 3.5. Producción de O2 •-experimental...33\n3.7. Medición del pH intracelular………34\n3.8. Calibración de pH……….34\n3.9. Actividad del NHE-1……….35\n3.10. Protocolo experimental………....36\n3.11. Capacidad intrínseca buffer………..………...37\n3.12. Determinación de la fosforilación de ERK1/2 y p90RSK………..38\n3.13. Determinación de la fosforilación del NHE-1…...………..…………..40\n3.14. Análisis estad\n4.1. Producción de O2•- por acción de la Ang II en tejido cardíaco….…...42\n4.2. Producción de O2•- por Ang II en tejido cardíaco: rol autócrino de\n4.3. Producción de O2•- por ET-1 en tejido cardíaco………...44\n4.4. Participación de la mitocondria en la producción de O •- inducida por •- 4.7. Actividad del NHE-1 cuando se inhibe la PDE5A………...49\n4.7.1. Efecto de sildenafil sobre la actividad del NHE-1 en acidosis 4.7.2. Efecto de sildenafil sobre el pHi basal………...…….…….50\ninhibe a la PDE5A………..53\n4.11. Inhibición de fosfatasas sobre la fosforilación del NHE-1 cuando se 2 ET-1………..45\n4.5. Producción de O2 por ET-1 en miocitos cardíacos……..……….46\n4.6. Fosforilación de ERK1/2 y p90RSK inducida por Ang II………...…47\n4.8. Fosforilación del NHE-1: acción de sildenafil………...51\n4.9. Fosforilación de las quinasas ERK1/2 y p90RSK cuando se inhibe a la PDE5A………...52\n4.10. Inhibición de fosfatasas sobre la actividad del NHE-1 cuando se inhibe a la PDE5A………...55\nAng II………... Angiotensina II\nBCECF-AM………. Tetra-acetoximetil 2-7 bis(carboxietil)-5(6) carboxifluoresceína\nBCECF……… Acetoximetil ester de BCECF CTE……… Cadena de transporte de\nelectrones DAG………. Diacilglicerol ET-1………. Endotelina 1\nERO………. Especies reactivas del oxígeno IP3………. Inositol trifosfato\nMIM Membrana interna mitocondrial\nMPG………. Mercaptopropionilglicina Nox……… NADP(H) oxidasa\nO2•-………... Anión superóxido H2O2………... Peróxido de hidrógeno OH•……….. Radical hidroxilo PDE5A………... Fosfodiesterasa 5A PLC……… Fosfolipasa C PKC……….. Proteína quinasa C PKG……… Proteína quinasa G PP1……….. Proteína Fosfatasa 1 PP2A……… Proteína Fosfatasa 2A\nRAPGq……… Receptores acoplados a Proteína Gq\n5-HD……….. Ácido 5-hidroxidecanoico XO……….. Xantina oxidasa\n1.1. Hipertrofia cardiaca\nLa hipertrofia cardiaca consiste en el aumento del peso del corazón, determinado principalmente por aumento del tamaño de los miocitos a expensas de la formación o agregado de sarcómeros, de modo que crecen en largo y/o en ancho.\nLa hipertrofia cardiaca que se desarrolla con el ejercicio físico intenso, en embarazadas y durante el crecimiento postnatal es fisiológica y no está relacionada con la progresión a insuficiencia cardiaca. La respuesta a la sobrecarga hemodinámica se caracteriza por aumento del tamaño de los miocitos con incremento proporcional de los elementos estructurales del miocardio, cumpliendo una función de adaptación, ya que se preserva la función contráctil, no se desarrolla fibrosis intersticial, ni se induce la expresión de genes fetales y es completamente reversible [1, 2]. A este tipo de respuesta se la denomina Hipertrofia cardíaca fisiológica.\nEn la Hipertrofia cardíaca patológica hay un aumento de la fibrosis intersticial, mayor incidencia de apoptosis, disminución de la densidad capilar y reprogramación de la expresión génica, que involucra la inducción de genes fetales que codifican las siguientes isoformas proteicas: el factor natriurético auricular y de cerebro (ANP y BNP respectivamente), la cadena  pesada de la miosina (-MHC) y la -actina esquelética, y represión de los genes que codifican las respectivas isoformas del adulto (-MHC y -actina) [3-9]. Estas alteraciones en la estructura del miocardio están asociadas con deterioro de la función ventricular evolucionando habitualmente a insuficiencia cardíaca.\nPara revertir la HC patológica se han desarrollado distintas estrategias terapéuticas que regulan las señales intracelulares que están involucradas en este proceso complejo.\n1.2. Angiotensina II (Ang II) y Endotelina-1 (ET-1)\n1.2.1. Formación de Ang II\nEn la forma clásica de secreción de Ang II, las células yuxtaglomerulares renales liberan renina al plasma en respuesta a la disminución de la presión arterial o a la disminución de Na+ extracelular a nivel sistémico .\nEl angiotensinógeno es un glucopéptido circulante de 14 aminoácidos sintetizado en el hígado, el cual es degradado por la proteasa renina, dando como producto un péptido de 10 aminoácidos, la angiotensina I (Ang I). La enzima convertidora de angiotensina (ECA) degrada la Ang I produciendo angiotensina II (Ang II). Ésta tiene una vida media breve (~ una hora), y es degradada por peptidasas presentes en diferentes tejidos, dando como producto angiotensina III (Ang III), que posee menor actividad (Figura 1A) [11, 12].\nSi bien originalmente el sistema renina-angiotensina (SRA) se describió como un sistema hormonal general , actualmente se conoce la existencia del SRA local, capaz de modular la fisiología de diversos tejidos, incluyendo el miocardio [14, 15]. Al respecto, varios componentes del SRA se encontraron en diferentes tejidos y la síntesis local de Ang II se encontró en órganos aislados, como el cerebro, riñón, glándula adrenal y corazón [14-16]. En el miocardio se comprobó la expresión del ARN mensajero (ARNm) del angiotensinógeno, de la\nECA y de receptores de angiotensina II [16, 17]. Además, se ha demostrado que las concentraciones de Ang I y II que se hallan en el espacio intersticial del miocardio son del orden nanomolar . Otros estudios también demostraron la existencia del SRA en el miocardio luego de su estiramiento [19-22].\nLa angiotensina II es un octapéptido que además de su efecto vasoconstrictor ejerce numerosos efectos en otros tejidos. En el miocardio, produce aumento del inotropismo y de la frecuencia de contracción,\nestimulación de la síntesis proteica e hipertrofia de los cardiomiocitos, estimulación de la proliferación de fibroblastos y producción de colágeno .\n1.2.2. Formación de ET-1\nLa endotelina es un potente péptido vasoconstrictor, aislado inicialmente de cultivo de células endoteliales de aorta porcina . Se conocen tres isoformas derivadas de genes diferentes, cuyo producto son péptidos de 21 aminoácidos denominados ET-1, ET-2 y ET-3 . Los precursores de las endotelinas son las pre-pro-endotelinas (de aproximadamente 212 aminoácidos), que por acción de una proteasa dan lugar a las ET- grandes (”big-ETs”) de 38 aminoácidos. Éstas son nuevamente clivadas por la metaloproteasa llamada enzima convertidora de la endotelina (ECE), para dar los polipéptidos de 21 aminoácidos mencionados en la Figura 1B. Las distintas isoformas de ET se expresan en una gran variedad de tejidos. ET-1 se expresa en células endoteliales, miocardio, riñón, en el sistema nervioso central y en músculo liso vascular [24, 25]. ET-2 es sintetizada en riñón, placenta, intestino, corazón y células endoteliales . Finalmente, la ET-3 es producida en grandes cantidades en el cerebro, se la encuentra también en miocardio y en tracto gastrointestinal . En preparaciones multicelulares de miocardio, las tres isoformas tienen efectos inotrópicos positivos de potencias similares . Sin embargo, la eficacia y potencia de ET-1 es mayor en cultivo de células cardíacas .\nFigura 1. Formación de los péptidos vasoactivos: Ang II y ET-1. A. Esquema que representa el SRA. El angiotensinógeno es clivado por la renina a Ang I,\néste decapéptido mediante la ECA produce Ang II, la cual por acción de aminopeptidasas es clivado a Ang III. B. Esquema que representa la formación de endotelinas. La preproendotelina es clivada por una endopeptidasa para dar Big- ET precursora de ET-1, ET-2 y ET-3 por acción de la ECE.\n1.2.3. Receptores de Ang II y ET-1\n1.2.3.1. Receptores de Ang II: AT1 y AT2\nMediante estudios de unión a ligandos, se comprobó la existencia de dos receptores de Ang II: el tipo I (AT1), y el tipo II (AT2), sensibles al bloqueo con losartán y PD123319, respectivamente [28-30]. Estos receptores se expresan en el corazón humano y de otros mamíferos como el gato, rata, conejo y mono . Los efectos de la estimulación de los receptores AT1 y AT2 sobre el crecimiento son opuestos. Al respecto, se demostró en corazón que la estimulación de los receptores AT2 tiene efectos antiproliferativos, proapoptóticos, de diferenciación celular, y de disminución de la matriz extracelular [32, 33]. Por el contrario, la estimulación de los receptores AT1 produce efecto inotrópico positivo, vasoconstricción, aumento de la expresión génica, de la síntesis proteica, generación de radicales libres, de la fibrosis y del remodelamiento cardíaco que conduce al desarrollo de HC [28, 34-36]. La vía de señalización desencadenada por la estimulación de los receptores AT1 con Ang II se estudió con más detalle en la presente tesis.\n1.2.3.2. Receptores de ET-1: ETA y ETB\nInicialmente se identificaron dos tipos de receptores para ET-1: los receptores tipo A (ETA) y los de tipo B (ETB) . Ambos se expresan en una\ngran variedad de tejidos, incluyendo el cardíaco, aunque en proporciones variables según el tipo . En general, la activación de los receptores ETA,\nestá ligada al efecto inotrópico positivo y a la vasoconstricción.\nPor otra parte, hay evidencias de que los efectos de la estimulación de los receptores ETB están asociados a la vasodilatación y vasoconstricción, según\n1.3. Relación entre Ang II y ET-1: Efectos de Ang II mediados por ET-1\nComo se señaló anteriormente, los efectos de ET-1 son similares a los observados con Ang II, como la vasoconstricción, crecimiento celular, aumento del inotropismo y generación de radicales libres. Sin embargo, se demostró que muchos de los efectos de la Ang II son atribuidos a la liberación/formación de ET-1, la cual mediante una acción autócrina/ parácrina produce su efecto. A continuación se describen algunos estudios que demuestran este mecanismo.\nIto y colaboradores describieron la inhibición de la hipertrofia cardiaca inducida por Ang II mediante el uso de bloqueantes del receptor ETA o con\noligonucléotidos antisentido contra el ARNm de la pre-pro-endotelina en\nmiocitos cardiacos de ratas recién nacidas .\nPosteriormente, Liang y Garner, trabajando con el mismo modelo experimental demostraron que el aumento de la actividad del promotor del gen de ANP inducido por Ang II, se previno por el bloqueo de receptores ETA .\nRecientemente Cingolani y colaboradores demostraron en miocitos ventriculares aislados de gato que el efecto inotrópico positivo inducido por una dosis fisiológica de Ang II (1 nmol/L) es mediado completamente por la liberación/ producción de ET-1. Además demostraron que el efecto inotrópico positivo producido por una dosis equipotente de ET-1 exógena (0.4 nmol/L), se bloqueó con MPG, un secuestrador de especies reactivas del oxígeno (ERO), sugiriendo que una cascada de señalización entre Ang II, ET-1 y ERO es la responsable del efecto inotrópico positivo .\nEn nuestro laboratorio, también se demostró que el estiramiento del miocardio induce la liberación de Ang II, que a través de ET-1 activa al intercambiador Na+/ H+ (NHE-1) y como consecuencia de esto se produce un incremento lento de la fuerza que desarrolla el músculo (Slow force response) [19, 20, 45, 46].\n1.4. Vía de señalización intracelular activada por Ang II/ ET-1\nEn la hipertrofia cardíaca patológica la sobrecarga hemodinámica de presión y/o de volumen induce estrés mecánico (estiramiento), y representa el estímulo hipertrófico inicial más importante. El estiramiento provoca la liberación de factores humorales circulantes o provenientes de las mismas células cardíacas (mecanismos autócrinos y/o parácrinos) como los péptidos vasoactivos (angiotensina II y endotelina 1), catecolaminas, citoquinas y factores de crecimiento [47-51] que a través de la activación de señales intracelulares, promueven el aumento del tamaño de los cardiomiocitos .\nNumerosos estudios involucran al aumento del Ca2+ intracelular [Ca2+i]\ncomo la señal inductora de la hipertrofia cardiaca. Factores humorales como la Ang II, ET-1 y fenilefrina (FE) conducen al aumento del [Ca2+i] [49, 52, 53].\nAdemás, como se mencionó anteriormente se ha demostrado que muchos de los efectos de la Ang II son atribuidos a la formación/ liberación de ET-1, la cual mediante una acción autócrina/ parácrina produce su efecto [19, 20, 42-46]. Asimismo, ambos agonistas activan al intercambiador Na+/H+ (NHE-1), que al aumentar la concentración de Na+ intracelular [Na+]i, promueve el ingreso de\nCa2+ a la célula a través del aumento de actividad del modo reverso del intercambiador Na+/Ca2+ (NCX rev) [19, 45].\nPor otra parte, estudios más recientes sugieren que varios de los efectos hipertrofiantes de la Ang II están mediados a través de la generación de especies reactivas del oxígeno (ERO). Las ERO incluyen al anión superóxido (O2•-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y al radical hidroxilo (OH•) (para mayor\ndetalle ver la siguiente sección) que activan la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) [54-56]. Es decir, a través de lo señalado anteriormente, el aumento de la producción de ERO induciría el aumento de la actividad del NHE-1 seguido del aumento de [Ca2+] i e hipertrofia cardiaca.\nEn la Figura 2 se describe la vía de señalización intracelular propuesta para explicar la acción de Ang II y ET-1 a través de la activación de los receptores AT1 y ETA respectivamente. Los receptores AT1 de Ang II, y ETA de\nET-1 están acoplados a la proteína Gq (RAPGq), cuyo nombre deriva de su capacidad de unir nucleótidos de guanina, específicamente a la proteína G de tipo q . Esta proteína G es heterotrimérica, es decir, está formada por 3 subunidades: alfa (α), beta (β) y gama (γ). La subunidad α, presenta un sitio de unión a nucleótidos de guanina y actividad GTPasa. En el estado inactivo, una molécula de GDP se encuentra unida al sitio de unión de nucleótidos de α . La estimulación del receptor AT1 con Ang II, produce un cambio conformacional en la subunidad α, que causa el reemplazo de GDP por GTP y la disociación del trímero. Esta subunidad αq activa a la isoforma β de la\nfosfolipasa C (PLCβ). Esta enzima hidroliza el fosfatidil inositol-4,5-bifosfato (PIP2) para dar inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). El IP3 puede\ninducir la liberación de Ca+2 hacia el citosol desde el retículo sarcoplasmático [59, 60]. El DAG que permanece unido a la membrana, es un activador de la proteína quinasa C (PKC). Esta quinasa a través de la activación de la NAD(P)H oxidasa aumenta la producción de O2•- , que activa a la ERK1/2. La\nMAPK ERK1/2 fosforila a la quinasa p90RSK, que al fosforilar al NHE-1 lo activa . De este modo, el aumento de Na+, como consecuencia de la hiperactividad del NHE-1, induce el modo reverso del intercambiador Na+/Ca+2 (NCX), por el cual aumenta la concentración de Ca+2 intracelular, que induce al desarrollo de hipertrofia cardiaca [19, 20, 45, 46, 62-65], a través de la activación de fosfatasas y/o quinasas, cuyo blanco de acción son factores de transcripción como el NFAT, GATA4, MEF-2 y AP-1 [48, 50, 66, 67] (Figura 2).\nEn resumen, la Ang II y la ET-1 producen efecto inotrópico positivo [68-71], e hipertrofia a través de la activación de RAPGq, que inicia una cascada de señales intracelulares que conduce a la producción de ERO y activación de las quinasas: PKC, MAPKs, y CaMK y fosfatasas como calcineurina. Estas últimas promueven el crecimiento celular, a través de la activación de factores de transcripción prohipertróficos (NFAT, GATA4, MEF-2 y AP-1) y factores relacionados con la síntesis de proteínas [48, 50, 66].\nFigura 2. Vía de señalización intracelular que conduce a hipertrofia cardíaca. La estimulación del receptor AT1 por Ang II (1), induce la producción/ liberación\nde ET-1 que a través de la estimulación de su receptor ETA acoplado a la proteína Gq (2), produce la disociación de la subunidad α de las subunidades βγ de\nesta proteína, y unión a GTP. Esto lleva a la activación de la fosfolipasa C (PLC) (3), que hidroliza el PIP2 en DAG e IP3. La activación de PKC por DAG (4)\nactiva a la NAD(P)H oxidasa (5) que produce superóxido (O2\n•-), el cual al activar la vía de las quinasas ERK1/2-p90RSK (6), conduce a la fosforilación e hiperactividad del NHE-1 (7). En consecuencia aumenta el Na+ intracelular que favorece el modo reverso del NCX (8) e incrementa el Ca+2 citosólico (9). Por otro lado, la liberación de Ca+2 desde el retículo sarcoplasmático por IP3 (10), producto de la hidrólisis del PIP2 por PLC, contribuye al aumento de la\nconcentración de este ión. La activación de calcineurina dependiente de Ca+2 (11) es responsable del desarrollo de hipertrofia cardiaca, a través de la activación de factores de transcripción, como el NFAT, GATA4 y MEF2.\n1.5. Especies reactivas del oxígeno (ERO)\nLas ERO incluyen a los radicales libres: anión superóxido (O2•-), y radical\nhidroxilo (OH•), y especies no radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2).\nDebido a que los radicales libres tienen electrones desapareados son más reactivos que las especies no radicales . Pueden producirse durante la reducción del oxígeno a agua con 4 electrones, como ocurre en la cadena de transporte de electrones mitocondrial (CTE). La donación de un electrón al oxígeno molecular produce O2•-. La donación de un segundo electrón al O2•-\ncuando se reduce con un ión hidrógeno rinde H2O2, mientras que la donación\nde un tercer electrón al H2O2 como ocurre en la reacción de Fenton, resulta en\nla producción del radical OH• altamente reactivo .\n1.5.1. Fuentes de ERO\nLas fuentes de ERO en el corazón incluyen a la xantina oxidasa, NAD(P)H oxidasa, los complejos I y III de la cadena de transporte de electrones, y en determinadas circunstancias de la óxido nítrico sintasa (NOS).\n1.5.1.1. NAD(P)H oxidasa\nInicialmente, se identificó bioquímica y funcionalmente a la familia de proteínas de NAD(P)H oxidasa (Nox) de neutrófilos, cuya función oxidante es importante en la defensa contra microbios.\nLa Nox es una enzima que contiene 6 dominios de transmembrana, y una cola citoplasmática a la cual se une el NADH/NAD(P)H. Está asociada a la\nmembrana plasmática y cataliza la reducción del oxígeno con un electrón a expensas de la oxidación del NAD(P)H a NAD(P)+ para dar O2•-.\nLa familia de Nox comprende 7 miembros: Nox1-5 y Duox 1 y 2 (oxidasa dual 1 y 2, las cuales tienen un dominio de peroxidasa adicional). En cardiomiocitos, se expresan la Nox2 y la Nox4 [74, 75].\nLa Nox cardiaca consiste en las subunidades de membrana: gp91phox (isoforma 2: Nox2) y p22phox y los componentes citosólicos: p47phox, p67phox, p40phox, y la pequeña proteína GTPasa, Rac. El mecanismo de activación de la Nox por agonistas como Ang II, ET-1, agonistas α-adrenérgicos y factor de necrosis tumoral-α, involucra la fosforilación de p47phox\ndependiente de PKC. Asimismo, la activación de Rac-GDP hacia la forma de Rac-GTP, induce la translocación de las demás subunidades citosólicas hacia la membrana plasmática y cambio conformacional que promueve la activación de la subunidad catalítica gp91phox .\nA diferencia de los neutrófilos, en los miocitos cardiacos, como en otros tipos celulares, la Nox se expresa constitutivamente, produce niveles más bajos de O2•- y éste puede actuar como segundo mensajero regulando vías de\nseñalización intracelular [73, 77, 78].\n1.5.1.2. Xantina oxidasa\nLa xantina oxidoreductasa (XOR) se expresa en bajos niveles en el corazón, y su actividad aumenta en insuficiencia del miocardio y en isquemia por aumento de la disponibilidad de su sustrato, las purinas .\nEsta enzima es codificada por un gen simple, pero existe como un homodímero en dos formas interconvertibles: la xantina deshidrogenasa (XDH) y la xantina oxidasa (XO). La XDH puede convertirse en XO por oxidación reversible de los grupos tioles, o irreversible por clivaje proteolítico. La XOR\ncataliza los dos pasos finales de la degradación de purinas, convirtiendo la hipoxantina en xantina, y la xantina en ácido úrico. La XOR es reducida durante la oxidación de la xantina, por lo cual cuando se reoxida, se transfieren al oxígeno dos electrones en cada uno de los pasos, generando H2O2 y O2•- (Figura 3). La XO parece ser la responsable de la generación de O2•-, mientras que la XDH prefiere al NAD+ como aceptor de electrones (es importante destacar que esta enzima no actúa como Nox) .\nLa XOR está presente en el retículo sarcoplasmático de miocitos cardiacos .\nFigura 3. Formación de O2 •-por reoxidación de la XO durante la degradación de purinas, que ocurre en situaciones de isquemia e insuficienciacardiaca.\n1.5.1.3. Óxido nítrico sintasa\nSe han publicado varios trabajos que demuestran que no sólo las células endoteliales producen óxido nítrico por la óxido nítrico sintasa (NOS) sino que los miocitos cardiacos también la expresan [79, 80]. El óxido nítrico (NO) se forma durante la conversión de la L-arginina a L-citrulina por la NOS en presencia de oxígeno y NAD(P)H. En ausencia del sustrato arginina y/o del cofactor (6R)-5,6,7,8-tetrahidro-L biopterina reducido (H4B), la NOS desacopla\n.Figura 4. Formación de O2 •-por desacople de la NOS (óxido nítrico sintasa) que ocurre por la oxidación de su cofactor H44B.B.\nSe han identificado tres isoformas de la NOS: neuronal (nNOS o NOS1), inducible (iNOS o NOS2) y endotelial (eNOS o NOS3). En cardiomiocitos, la eNOS se encuentra en caveolas, mientras que la nNOS se encuentra en retículo sarcoplasmático y también se ha encontrado en mitocondria (mtNOS). Aunque las tres isoformas se postularon como candidatas para la mtNOS, en el corazón la mayor parte de las evidencias involucran a la nNOS como la isoforma mitocondrial .\nEn la Figura 5 se resumen las fuentes de ERO y los sistemas antioxidantes presentes en las células cardíacas.\n1.5.1.4. Mitocondria 1.5.1.4. Mitocondria\nLa mitocondria es una organela esencial para el mantenimiento de la función celular, ya que en ella se producen reacciones de óxido-reducción que conducen a la síntesis de ATP durante la respiración celular. La glucosa y ácidos grasos son sustratos metabólicos para el corazón. La oxidación de éstos a acetil-CoA conduce a la formación en el ciclo de Krebs del poder reductor representado por NADH y FADH2 que entran a la cadena de transporte de\nelectrones (CTE). La CTE contiene la coenzima Q (ubiquinona; Q) y 5 complejos respiratorios en la membrana interna mitocondrial (MIM):\nComplejo II (succinato deshidrogenasa, única enzima del ciclo de Krebs unida\na la MIM),\nComplejo III (citocromo bc1),\nComplejo IV (citocromo c oxidasa o aa3) y Complejo V (F1F0 ATP sintasa).\nFigura 5. Fuentes de ERO y sistemas antioxidantes en tejido cardíaco. La activación de la Nox\ninducida por factores como Ang II y ET-1, se produce por la translocación de los componentes regulatorios (p47phox, p67 phox, p40 phox y Rac) hacia la membrana plasmática, conduciendo a la producción del anión superóxido (O2\n•-) por la subunidad catalítica, Nox2 asociada a p22 phox. Mediante la reacción de Fenton se genera el radical hidroxilo (OH•) a partir de peróxido de hidrógeno (H2O2). El anión O2•- también se genera por desacople de la óxido nítrico sintasa (NOS), por los complejos I y III de la cadena de transporte de electrones mitocondrial (CTE) y a través de la xantina oxidasa (XO). La superóxido dismutasa (SOD) mitocondrial (MnSOD) y citoplasmática (Cu-ZnSOD), dismutan el O2\na H2O2, mientras que la glutatión peroxidasa (GPx) y catalasa catalizan la conversión de H2O2 a agua y oxígeno molecular.\nLa transferencia de electrones entre los complejos I, II y III no ocurre secuencialmente. Los electrones provenientes de la oxidación del NADH a\ntravés del complejo I y de la oxidación del FADH2 y del succinato a fumarato\npor el complejo II reducen a la ubiquinona (Q). Ésta a través del ciclo Q media la transferencia de electrones desde estos complejos (I y II) al complejo III. El complejo III reduce al complejo IV y por último, éste reduce el oxígeno molecular a H2O. La reacciones redox que ocurren en los complejos I, III, y IV\nestán acopladas a la translocación de H+ a través de la membrana interna mitocondrial, estableciendo la fuerza protón motriz (∆p), formada por: el gradiente de pH, y por el potencial de la membrana interna mitocondrial (Ψm).\nLa fuerza protón motriz permite la producción de ATP a través del complejo V, que es exportado al citosol por la adenina nucleótido translocasa  (Figura\nMitocondria como fuente de ERO\nAunque la cadena de transporte de electrones (CTE) durante la óxido-reducción de los transportadores, utiliza con bastante eficiencia el O2, es\ninevitable la producción de O2•- durante la fosforilación oxidativa. Ha sido\nestimado que aproximadamente del 1-5 % de los electrones que fluyen por la CTE se pierden en la formación de ERO .\nEl O2•- se produce a través de los complejos I y III de la CTE (Figura 6)\n[82, 83]. La producción de O2•- por el complejo I puede bloquearse con\nrotenona y ser estimulada cuando la dupla NADH/NAD+ está mayoritariamente reducida, mientras que, la producción de O2•- por el complejo III, puede\nbloquearse frenando el transporte de electrones antes y después de este complejo (con rotenona al complejo I, con cianuro al complejo IV, o con oligomicina que inhibe al complejo V) o inhibiendo con myxotiazol la formación de semiubiquinona (QH•, intermediario del ciclo Q)  (Figura 6).\n1.5.2. Sistemas antioxidantes\nEl estrés oxidativo se produce por un desbalance entre los sistemas productores de ERO y los sistemas antioxidantes. En el miocardio, como en\nFigura 6. Producción de superóxido mitocondrial. El anión superóxido (O2\n•-) se produce en la cadena de transporte de electrones a nivel del complejo I (NADH deshidrogenasa) y complejo III (citocromo bc1: citocromo c coenzima Q oxidoreductasa). CN-= cianuro,Q= ubiquinona.\notros tejidos, los mecanismos antioxidantes (enzimáticos y no enzimáticos) protegen a las células del daño oxidativo, ya que mantienen bajos los niveles de H2O2 y O2•-. Se conocen tres isoformas de la enzima superóxido dismutasa\n(SOD) en mamíferos: MnSOD (mitocondrial), Cu-ZnSOD (citoplasmática), y ECSOD (extracelular, también tiene Cu-Zn), las cuales dismutan el O2•- a H2O2\n. La MnSOD, codificada por un gen nuclear, se encuentra en la matriz mitocondrial, y corresponde a aproximadamente el 90% de la actividad total de SOD en miocitos cardíacos. Esta isoforma participa en el control del O2•-\nmitocondrial producido durante la fosforilación oxidativa normal. La Cu/ZnSOD se localizan en el citosol y unida a la matriz extracelular .\nLas enzimas catalasa y glutatión peroxidasa (GPx), ésta última a través de la oxidación del glutatión reducido (GSH), catalizan la conversión de H2O2 a\nagua y oxígeno molecular [74, 77] (Figura 5).\nLos antioxidantes no enzimáticos incluyen al glutatión, vitaminas A, E y C, y ácido lipoico .\n1.6. Mecanismo de “liberación de ERO inducida por ERO”\nZorov y coautores propusieron el mecanismo de “liberación de ERO inducida por ERO”. En dicho trabajo, se demostró que la acumulación de ERO por la fotoactivación de derivados de la tetrametil rodamina en miocitos cardíacos, produce la disipación del potencial de la membrana interna mitocondrial (Ψm), lo cual promueve la liberación de ERO desde la mitocondria\na través de la apertura del poro de transición mitocondrial (MPT) . Esto sugirió que las ERO del citoplasma pueden inducir la producción de ERO por la mitocondria. Al respecto, se vinculó a los canales mitocondriales de K+ dependientes de ATP (mitoKATP), con el mecanismo de “liberación de ERO\ninducida por ERO”. En relación a ésto, se demostró que los abridores de los mitoKATP, como pinacidil y cromakalina, despolarizan la membrana interna\nmitocondrial (Ψm) y al acelerar la respiración celular, estimulan la producción\nde ERO .\nRecientemente, Garlid y Costa demostraron que la apertura de los mitoKATP, produce la entrada de K+ hacia la matriz mitocondrial, lo cual induce\naumento del volumen y alcalinización de la matriz, que activa la producción de O2•- por inhibición del complejo I de la CTE .\nKimura y colaboradores demostraron que el efecto precondicionante de Ang II contra el daño por isquemia y reperfusión, se debe a la producción de ERO mitocondrial y ésta es dependiente de la producción de O2•- por activación\nde la Nox. Ellos sugieren que la Ang II estimula la Nox cardíaca por un mecanismo dependiente de PKC, y éstas ERO disparan la apertura de los mitoKATP, lo cual induce la despolarización del Ψm que estimula la producción\nde ERO mitocondrial  (Figura 7). Al respecto, un estudio reciente en células endoteliales relacionó las ERO citoplasmáticas, producto de la activación de la Nox por Ang II, con las ERO producidas por la mitocondria . Estos autores proponen que Ang II a través de AT-1 conduce a la rápida producción de ERO, producto de la activación de la Nox dependiente de PKC. Este superóxido produce aumento de la producción de ERO mitocondrial, despolarización del\nΨm y disminución del contenido de tioles de bajo peso molecular  (Figura 7).\nPor otra parte, existen evidencias que sustentan que las ERO citoplasmáticas se relacionan con la apertura de los mitoKATP. Zhang y\ncolaboradores demostraron que el O2•- estimula la apertura de los mitoKATP\nreconstituidos en bicapas lipídicas de corazón bovino, ya que oxida directamente los grupos sulfidrilos de los residuos de cisteína de este canal . Sin embargo, Garlid y Costa en estudios in vitro demostraron que las ERO no activan directamente la apertura de los mitoKATP, ellos proponen que la\nfosforilación de los éstos canales está mediada por la activación de PKCε inducida por ERO .\nDe acuerdo a las evidencias señaladas anteriormente, en la Figura 7 se resume el mecanismo de liberación de ERO inducida por ERO en cardiomiocitos.\nFigura 7. Vía de señalización intracelular que involucra la liberación de ERO inducida por ERO.\nLa estimulación de RAPGq con Ang II/ ET-1, activa la producción de O2\npor la Nox. Este radical libre abre los canales de K+ mitocondriales dependientes de ATP (mitoKATP) (aunque es controversial si por un mecanismo directo o indirecto), lo cual conduce al aumento del potencial de la membrana interna mitocondrial (Ψm), y producción de ERO por la mitocondria, que salen hacia el citoplasma por el poro de transición mitocondrial (MPT).\n1.7. ERO como segundos mensajeros en Hipertrofia cardiaca\nComo se mencionó anteriormente, las ERO en bajas concentraciones (0.05-0.07 μmol/L intracelular)  pueden actuar como segundos mensajeros en cascadas de señalización intracelular, mientras que a altos niveles están asociadas con el estrés oxidativo y muerte celular [92, 93] (Figura 8).\nFigura 8. Esquema que representa la acción de las\nERO en la modulación de las funciones celulares. Cuando los mecanismos de producción de ERO exceden a los sistemas antioxidantes se produce estrés oxidativo que puede conducir a la disfunción y muerte celular. Las ERO a bajas concentraciones intracelulares pueden actuar como segundos mensajeros en la transducción de señales.\nVarios factores involucrados en la cascada de señalización hipertrófica y de apoptosis son activados directa o indirectamente por las ERO, mediante la regulación de la transcripción y/o mediante fosforilación de proteínas quinasas. Estas incluyen PKC, las MAPKs: p38, JNK y ERK1/2, ASK-1, PI3K, Akt, y tirosina quinasas como Src y FAK, calcineurina y factores de transcripción como NF-κB y la proteína-activadora -1 (AP-1) [92, 93]. El grupo de Collucci demostró que dependiendo de la concentración de H2O2 puede promover\nhipertrofia o apoptosis. A baja concentración (~10 μmol/L) se produjo la activación de la ERK1/2 y de la síntesis de proteínas, mientras que a altas concentraciones (100- 300 μmol/L) puede promoverse la HC o la apoptosis en miocitos cardiacos de rata adulta . Algunos estudios reportaron que las ERO activan a src y PKC a través de la oxidación de los residuos de cisteína dentro de sus dominios regulatorios, mientras que las ERO pueden indirectamente regular la cascada de señalización de las tirosina quinasas mediante la inhibición de las proteínas tirosina fosfatasas .\nEstudios recientes demostraron que varios de los efectos hipertrofiantes de la Ang II están mediados a través de la generación de ERO. En miocitos ventriculares de ratas recién nacidas se observó que los antioxidantes eliminan la hipertrofia cardiaca inducida por Ang II . Mas aún, se reportó que la expresión inducida por Ang II del marcador de hipertrofia: isoforma β de la cadena pesada de la miosina (β-MHC), está mediada por la activación de las quinasas Ras/Rac/ ERK1/2 dependiente de O2•- y H2O2 . Estudios\nposteriores revelaron que la generación de ERO conduce a la activación del factor de transcripción NF-κB que produce hipertrofia . Los efectos regulatorios directos de ERO sobre la actividad de los factores de transcripción AP-1 y NF-κB se demostraron en varios tipos celulares, incluyendo los cardiomiocitos . Mas aún, posteriormente se demostró que la activación de AP-1 inducida por Ang II es dependiente de la activación de la p38 MAPK secundariamente a la activación de la Nox en miocitos ventriculares de rata adulta . Un trabajo posterior demostró en miocitos ventriculares de ratas recién nacidas que la Ang II activa a AP-1 a través de la generación de ERO . Además, se demostró que la hipertrofia inducida por estimulación α-adrenérgica con norepinefrina, es mediada por las ERO que producen modificación oxidativa de los tioles de Ras, quinasa que participa en la vía de señalización que involucra la activación de MEK1/2, ERK1/2 y p90RSK en miocitos ventriculares de rata adulta.\nPor otra parte, hay evidencias que relacionan a las ERO con la activación del NHE-1. Al respecto, varios autores demostraron que las ERO activan al NHE-1 a través de la activación de ERK1/2 y p90RSK en cardiomiocitos de rata adulta y recién nacida [54-56].\nRecientemente, Caldiz y colaboradores propusieron que el aumento lento de la fuerza contráctil del miocardio inducida por el estiramiento (“Slow force response”), se produce como consecuencia de la liberación de Ang II preformada, la cual induce la producción de O2•-, que activa la cascada de\nquinasas ERK1/2-p90RSK conduciendo a la fosforilación y activación del NHE-1  (ver Figura 2).\n1.8. Importancia de la regulación del pH en el miocardio\nComo producto del metabolismo celular se generan ácidos. El metabolismo aeróbico produce CO2 , que cuando se hidrata libera H+, mientras\nque la oxidación incompleta de biomoléculas en condiciones anaeróbicas genera H+ en la forma de ácido láctico . La primera barrera de defensa contra los desequilibrios ácido-base está constituida por los sistemas buffer. Estos incluyen: grupos imidazol de residuos de histidina de proteínas, aminoácidos, como taurina, fosfato inorgánico, y lactato. Estos amortiguadores intracelulares de pH constituyen el sistema buffer intrínseco (β) (ver su determinación en materiales y métodos, sección 3.8). Mientras que el sistema extrínseco comprendido por CO2/bicarbonato también tiene una participación\nimportante en la regulación del pH .\nAdemás existen proteínas transportadoras iónicas de membrana que se encargan de regular el pH intracelular (pHi).\n1.9. Regulación del pHi por transpotadores iónicos sarcolemales\nEl pH citoplasmático se mantiene en un rango de pH de 7.1 a 7.2, debido a la actividad de 4 transportadores iónicos de membrana. La actividad de estas proteínas es muy baja en condiciones basales. Sin embargo, frente a una carga ácida se activan los intercambiadores alcalinizantes: el intercambiador Na+/H+ (NHE) y el cotransporte Na+/HCO3- (NBC), mientras que los intercambiadores\nacidificantes: Cl-/HCO3- independiente de Na+ (AE) y Cl-/OH- (CHE) se activan\nFigura 9. Esquema que representa un miocito cardíaco, donde se muestran las proteínas\ntransportadoras de equivalentes de H+ que mantienen el pHi~7.2. El NHE y el NBC, se activan por una carga ácida intracelular, mientras que el AE y el CHE se activan bajo condiciones de alcalosis intracelular. Los 4 transportadores iónicos presentan isoformas electroneutras (estequiometría de intercambio iónico 1:1), además el NBC presenta isoformas electrogénicas (estequiometría 1 Na+-2 HCO3\n-) mientras que la estequiometría del AE cardíaco electrogénico es controversial (1 Cl-- 2 HCO3-).\n1.10. Características estructurales y funcionales del NHE-1\nEl intercambiador Na+/H+ (NHE) cataliza el intercambio electroneutro de un H+ intracelular por un Na+ extracelular. Según la sensibilidad a inhibidores farmacológicos, distribución tisular y estructura molecular, se describieron hasta el momento 9 isoformas del NHE (NHE-1 a NHE-9) .\nEn particular, la isoforma 1 (NHE-1) es la que mayoritariamente se expresa en el tejido cardiaco, a nivel de los discos intercalares . El NHE-1 es una glicoproteína situada en el sarcolema de los miocitos cardiacos, cuyo peso molecular es de 91 kDa, correspondiente a los 815 aminoácidos que constituyen su estructura primaria, mientras que la estructura terciaria glicosilada es de 110 kDa.\nContiene dos dominios: un dominio transmembrana de 500 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 315 aminoácidos. El dominio transmembrana está formado por 12 segmentos que son esenciales para la función del transporte iónico. Además, contiene un sitio alostérico sensible al pH ya que sensa los H+  (Figura 10).\nLa región citoplasmática hidrofílica participa en la regulación de su actividad, a través de reacciones dependientes e independientes de fosforilación, como la unión de proteínas accesorias, como la anhidrasa carbónica II (ACII) y calmodulina (CaM) en presencia de altos niveles de Ca+2 . Se ha sugerido que la activación por fosforilación del NHE-1 en ciertos sitios, se produce por un cambio conformacional del extremo citoplasmático, que altera la asociación de ésta con el sensor de H+ del dominio transmembrana  (Figura 10).\nFigura 10. Modelo topológico del NHE-1 de 815 aminoácidos. En la membrana plasmática se\nubica el dominio transmembrana, que presenta el sitio alostérico sensor de H+ y el sitio catalítico. El dominio regulatorio, ubicado en el citoplasma, contiene sitios de fosforilación y de unión a proteínas accesorias como anhidrasa carbónica II (ACII) y calmodulina (CaM), que modulan su actividad.\n1.11. Rol fisiológico y patológico del NHE-1\n1.11.1. Rol fisiológico\nEl NHE-1 participa en el crecimiento celular, así se demostró en numerosos estudios de inhibición y “knock out” del NHE-1. Ratones que carecen del NHE-1 (Nhe1-/-) presentaron una disminución de la tasa de crecimiento y ataques epilépticos. Regula a través del control del pH numerosos genes que participan en la progresión del ciclo celular .\n1.11.2. Rol patológico\nAunque en condiciones basales el NHE-1 tiene muy baja actividad, se activa en situaciones patológicas como isquemia y reperfusión, remodelamiento del miocardio después del infarto, y por agonistas como Ang II, ET-1, y estimulación - adrenérgica .\nLa hiperactividad del NHE-1 conduce al daño del miocardio por cambios estructurales (apoptosis e hipertrofia), y cambios funcionales (arritmias e hipercontractura), debido a que la acumulación intracelular de Na+ induce sobrecarga de Ca+2, a través de la estimulación del modo reverso del intercambiador Na+/Ca+2 (NCX)  (ver Figura 2).\n1.12. Factores que regulan la actividad del NHE-1\nEl estímulo primario que activa al NHE-1 es la acidosis intracelular. También puede ser activado por factores extracelulares como hormonas, que incluyen a Ang II, ET-1, factores de crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico, por agonistas α1 -adrenérgicos y por estímulos mecánicos como el\nestiramiento de manera dependiente de la fosforilación mediada por las quinasas ERK1/2- p90RSK y por PKC  (Figura 11). Recientemente se ha reportado que la acidosis intracelular sostenida (producida por la inhibición de la activación del NHE-1 en ausencia de Na+ o con inhibidores específicos),\nmodula la interacción de los H+ con el sitio alostérico del NHE-1 a través de la fosforilación de la cola citoplasmática. En ese trabajo la acidosis sostenida por unos pocos minutos, inicia una cascada de señalización que activa al NHE-1 a través de la fosforilación mediada por ERK1/2-p90 RSK  (Figura 11). Otro mecanismo por el cual el NHE-1 se activa incluye la fosforilación de ciertos sitios inducida por las ERO. Wei y colaboradores demostraron que el H2O2 (50\nμmol/L) induce la activación del NHE-1, que se bloquea por la inhibición de ERK1/2 [54-56]. En estudios in vitro se demostró que la Ca+2 Calmodulina quinasa II (CaMKII), fosforila el dominio C-terminal del NHE-1 . Recientemente, Vila-Petroff y colaboradores demostraron en cardiomiocitos de rata que la CaMKII fosforila y activa al NHE-1 .\nLos mecanismos de activación del intercambiador independientes de fosforilación involucran la interacción con proteínas, como calmodulina (CaM)  y ACII .\nUn mecanismo inhibitorio del NHE-1 se produce a través de la activación del receptor de adenosina (A1) que activa a la proteína fosfatasa 2A (PP2A), la\ncual desfosforila probablemente su sitio Ser 703 fosforilado por ERK1/2- p90RSK  (Figura 11). Otros factores que regulan negativamente al NHE-1 incluyen a la estimulación β-adrenérgica, a través de PKA , y a través de la activación de PKG inducida por sildenafil aunque por un mecanismo aún no conocido [116, 117]. La inhibición del NHE-1 por sildenafil se describe con mayor detalle en la sección 1.13.2 y fue motivo de investigación de esta tesis evaluar la vía de señalización involucrada (ver objetivo II, sección 2.2).\nFigura 11. Representación esquemática que muestra los factores que regulan la actividad del\nNHE-1. Los factores activadores del NHE-1, indicados con +, incluyen a la acidosis intracelular aguda, la cual constituye el activador primario, actuando sobre el sitio alostérico. El estiramiento del miocardio (a través de la liberación de Ang II/ ET-1 endógena), la acidosis intracelular sostenida, la estimulación de receptores acoplados a proteína Gq, (con agonistas como Ang II, ET-1 y α1-adrenérgica), y las ERO, activan al NHE-1, de manera dependiente de fosforilación mediada por ERK1/2 y p90RSK. También se ha descripto la fosforilación por CAMKII del NHE-1. Además, la interacción del dominio regulatorio con proteínas accesorias (Ca+2/ CaM, también activa al NHE-1. Los factores que lo inhiben, indicados con -, incluyen a PKA y PKG que median la estimulación β1-adrenérgica, y con sildenafil y ANP, respectivamente, aunque por mecanismos aún no conocidos. Laestimulación de receptores de adenosina (A1) a través de la desfosforilación del NHE-1 mediada por PP2A, tiene un efecto inhibitorio sobre éste. La estimulación con Ang II de receptores AT2, por un mecanismo aún no dilucidado también lo inhibe.\n1.13.1. Cardioprotección por inhibición específica del NHE-1\nKarmazyn demostró que la inhibición del NHE-1 con amiloride, mejora la recuperación contráctil de los corazones aislados de rata luego de una isquemia .\nEste efecto cardioprotector se confirmó en varios modelos animales y con diferentes inhibidores específicos del NHE-1 [119-124]. Esto condujo a aumentar el interés de investigar los efectos clínicos de la inhibición del NHE-1.\nEn los estudios realizados en pacientes con infarto de miocardio las evidencias clínicas del GUARDIAN (Guard During Ischemia Against Necrosis) y del ESCAMI (Evaluation of the Safety and Cardioprotective Effects of eniporide in acute myocardial infarction) no fueron concluyentes [125, 126], mientras que los resultados del EXPEDITION (sodium-hydrogen exchange inhibition to Prevent coronary Events in acute cardiac conditions) indicaron una alta tasa de incidencia de accidente cerebrovascular . Las especulaciones respecto a las diferencias de los resultados entre los modelos animales y estudios clínicos apuntaron a la duración y grado del insulto isquémico, así como al régimen de administración, dosis y duración de la acción de los inhibidores farmacológicos .\n1.13.2. Acción de sildenafil y su efecto sobre el corazón\nEl sildenafil es un inhibidor específico de la PDE5A, que hidroliza el enlace fosfodiester del nucleótido guanosina monofosfato cíclico (GMPC)\nresultando en la forma lineal GMP. Esta enzima pertenece a la familia de 11 isoenzimas de PDE (PDE1- 11) (Tabla 1).\nTabla 1. Familia de PDE. La familia de\nPDE comprende 11 isoenzimas, que se divide en una subfamilia de 21 isoformas (designadas con letras A, B y C). Las variantes de las isoformas producidas por splicing alternativo no se muestran en la tabla, pero se designan con un número seguido de la letra, dando un total de 48 PDE. En verde se resalta la isoforma cardíaca que cataboliza al GMPc.\nEn miocitos cardíacos, se expresan las PDE: 2, 3 y 5 . Sólo esta última es selectiva para el GMPc y se localiza en el citosol . También se\nha publicado que la PDE5 puede localizarse en la línea Z de los cardiomiocitos [131-133].\nEn los últimos años se publicaron varios trabajos que demuestran los efectos cardíacos benéficos de la inhibición con sildenafil de la PDE5A, en modelos de isquemia-reperfusión [134-136]. Además se ha publicado que los pacientes con insuficiencia cardíaca avanzada, presentan un aumento de la expresión de PDE5A y contribuye al remodelamiento del miocardio después del infarto en un modelo de ratones que sobrexpresan la PDE5A .\nEl sildenafil, al inhibir a la PDE5A, aumenta los niveles de GMPc\nactivando así a la PKG, siendo ésta la responsable del efecto cardioprotector [117, 136, 138-141].\nHace varios años se demostró que un aumento de la actividad de PKG inhibe al NHE-1 en células mesangiales renales y en epitelio ciliar ocular, por un mecanismo aún no conocido . Sin embargo, hasta ese momento no se había observado dicho efecto en tejido cardíaco.\ncomo mediadores intracelulares de la señales inducidas por Ang II y ET-1 . Además, en nuestro laboratorio se demostró en cardiomiocitos ventriculares aislados de gato que el aumento de la contractilidad inducido por una concentración fisiológica de Ang II (1 nmol/L), es completamente mediado por la liberación/producción de ET-1 . En ese trabajo, además se demostró que el efecto inotrópico positivo de una dosis equipotente de ET-1 exógena (0.4 nmol/L), se bloqueó con MPG, un secuestrador de las ERO, sugiriendo que éstas inducen una cascada de señales intracelulares promovidas por la acción de Ang II y ET-1 .\nEstudiar en tejido cardiaco y miocitos aislados la producción\na la Ang II (1 nmol/L), y ET-1.\nEspecíficamente si el efecto de la Ang II se produce\ncompletamente por el mecanismo de liberación de ET-1.\nComo se señaló en la introducción entre los mecanismos que conducen a la activación del NHE-1, se encuentran las ERO [54-56], con el consiguiente efecto deletéreo sobre el corazón debido al aumento de la concentración de Ca+2 intracelular secundario al aumento intracelular de Na+ promovido por el aumento de la actividad del NHE-1 [105, 144, 145].\nPor otra parte, debido a que se demostró que la inhibición del NHE-1 resulta beneficiosa, ya que produce inhibición/regresión de la hipertrofia cardiaca [119-124], se diseñaron experimentos en los cuales se inhibe al NHE-1 como estrategia terapéutica para prevenir-revertir la hipertrofia cardiaca. Al respecto, Pérez y colaboradores demostraron que el tratamiento crónico con sildenafil activa a PKG y protege al corazón del remodelamiento post- infarto en ratas con oclusión de la arteria coronaria. Además, estos resultados demuestran en tejido cardíaco que esta protección está asociada a la inhibición del NHE-1 .\nDeterminar la vía de señalización intracelular por la cual la\ninhibición de la PDE5A con sildenafil produce inhibición del\nNHE-1 en un modelo in vitro de miocitos cardíacos aislados.\nSe utilizaron gatos adultos (peso corporal ~5 kg). Los animales se anestesiaron por inyección intraperitoneal con pentobarbital (35 mg/kg de peso corporal) y los corazones se extrajeron rápidamente.\n3.2. Cortes de tejido ventricular\nEl corazón se perfundió en forma retrógrada con una jeringa a través de la aorta con buffer Krebs-Ringer a pH 7.4 para eliminar la sangre. Se realizaron cortes del de ventrículo izquierdo (1 x 5 mm) y se conservaron a 4 ˚C hasta iniciar los experimentos.\n3.3. Aislamiento de miocitos ventriculares\nEl corazón se heparinizó (heparina 200 U/ml) y luego se extrajo rápidamente.\nPara obtener miocitos cardiacos aislados, el corazón se perfundió por el método de Langendorff con perfusión retrógrada a través de la aorta (Figura 12), a 37˚C con un buffer HEPES de la siguiente composición en mmol/L: NaCl 146.2; HEPES 10; glucosa 11; KCl 4.7; NaHPO 4 0.35; MgSO4 1; llevado a pH 7.4 con\nNaOH equilibrado con O2 99.5 %, según el siguiente protocolo:\n1) Perfusión con buffer HEPES + 1.35 mmol/L de CaCl2 para lavar la sangre.\n2) Perfusión con buffer HEPES (0 Ca+2) en presencia de EGTA 100 μmol/L durante 5 min. Se ha descripto que en este paso la ausencia de Ca+2, produce el desacople intercelular por disociación de los discos intercalares .\n3) Perfusión con buffer HEPES + 60 μmol/L de CaCl2 en la solución\nenzimática (colagenasa tipo II 1 mg/ml, proteasa 0.03 mg/ml, albúmina 1 mg/ml) de forma recirculante durante 15-20 min.\n4) Luego de la digestión enzimática el corazón se removió del aparato de perfusión. Los cardiomiocitos aislados se separaron del tejido no digerido y se filtraron a través de una malla de nylon de 210 m de diámetro. Se les restableció el Ca+2 hasta 1.35 mmol/L en cuatro pasos (60, 120, 240, 480 μmol/L de CaCl2), para evitar el daño causado por la entrada masiva del\nCa+2 al interior de la célula proceso conocido como “paradoja del Ca+2”. La\n“paradoja del Ca+2” ocurre cuando las células desacopladas enzimática y\nmecánicamente, se exponen nuevamente al Ca+2 para restablecer sus funciones fisiológicas, se produce la entrada masiva del ión, que conduce al aumento excesivo de la contracción (hipercontractura) y ruptura celular . Hasta el momento de las determinaciones, los miocitos se mantuvieron a temperatura ambiente (20-25 ˚C).\n3.4. Viabilidad celular\nLos miocitos se contaron con una cámara de Neubauer y se determinó el porcentaje de viabilidad celular. Sólo aquellas células cardíacas con forma de bastón se consideraron viables (Figura 12).\nFigura 12. Esquema que representa el sistema de Langendorff a partir del cual se aislaron los\n3.5. Producción de O2\n•-La producción de O2•- se determinó por quimioluminiscencia con lucigenina\n(Bis-N-metilacridinium) 5 mol/L, en un luminómetro (Chameleon, Hidex). Se utilizó esta concentración de lucigenina, ya que estudios previos demostraron que a mayor concentración se sobrestima la producción de O2•- por el fenómeno\nllamado ciclado redox, en el cual el radical lucigenina puede reaccionar con el oxígeno para generar O2•- [147, 148].\n3.6. Protocolo experimental\nEl tejido o los miocitos se preincubaron 30 o 15 min respectivamente en presencia de la droga a estudiar en buffer Krebs-HEPES de la siguiente composición en mmol/L: NaCl 118.3; KCl 4.7; CaCl2 1.35; MgSO4 1.2; K2HPO4\n1.0; NaHCO3 25; glucosa 11; HEPES 20 (llevado a pH 7.4 luego de 1,5 h de\nequilibrio con una mezcla gaseosa de 95% O2/ 5% CO2 a 37°C), antes de la\nmedición de O2•-. Cuando se utilizaron inhibidores se agregaron 5 min previos al\n/105 células (Figura\nde 0 seg. Los resultados corresponden al valor promedio de todos los obtenidos.\nLos resultados de las intervenciones farmacológicas se expresaron como diferencia de la señal obtenida del tejido en ausencia de drogas (control), en unidades arbitrarias (UA)/min/mg de peso seco, o en UA/min\nreviamente se sustrajo la señal en ausencia de tejido.\nLa luminiscencia en cortes de tejido se determinó durante 30 min con intervalos de 30 seg. y los resultados que se muestran corresponden al valor a los 15 min. La determinación en miocitos se realizó durante 10 min con intervalos 1\nFigura 13. Protocolo experimental para det\nrdiacos aislados de gato. Para mayor detalle ver el\nerminar la producción de O2\nen tejido y miocitos texto.\n3.7. Medición del pH intracelular\nLa medición del pH intracelular (pH ) se realizó de acuerdo a la técnica de epifluorescencia con 2´-7´-bis (2 carboxyethyl) -5´,6´- carboxyfluoresceína (BCECF-AM) con el microscopio de epifluorescencia (Ion Optix, Milton, MA)\n(Figura 14). Los miocitos cardíacos se incubaron con el indicador fluorescente\nBCECF-AM (5 mol/L) a temperatura ambiente durante 10 min en oscuridad y luego\nma composición que la usada para aislar los cardiomiocitos (ver página 33 y 66).\nncia utilizado en determinación del pH intracelular en miocitos\ncos aislados de gato (Ion Optix, Milton, MA). i\nse lavaron en buffer HEPES durante 30 min.\nLos miocitos cardíacos se colocaron en una cámara de perfusión sobre la platina de un microscopio invertido (Nikon y Olympus CK2 respectivamente). Se perfundieron continuamente a una velocidad de 1.33 ml/ min a 30 ˚C y se estimularon a una frecuencia de 0.5 Hz. Los experimentos se realizaron en presencia de un buffer HEPES libre de bicarbonato (para eliminar el efecto del cotransportador Na+/ HCO3- sobre el pHi) de la mis\nFigura 14. Microscopio de epifluoresce\n3.8. Calibración de pH\nLa fluorescencia del indicador BCECF-AM se obtuvo por excitación del indicador a dos longitudes de onda: 440 y 495 nm (con una lámpara xenon de 75 watt), mientras que la fluorescencia de emisión se colectó con un fotomultiplicador después del pasaje por un filtro a 535 nm. El pH se calculó a partir del cociente i\nde fluorescencia entre 495 nm y 440 nm. Los cocientes se convirtieron a valores de pH a través del método del BCECF de calibración in situ con nigericina (1 mol/L) al final de cada experimento, utilizando soluciones de pH conocido. La solución de calibración de pH contenía en mmol/L\ni : KCl 140, MgCl2 1, HEPES 12,\nlucosa 11, EGTA 2 , nigericina 0.001, 2,3- butanodionamonoxima (BDM) 20, con justados con KOH [149, 150].\nvalores de pH entre 7.7 a 6.6 a\n3.9. Actividad del NHE-1\nLa actividad del NHE-1 se midió a través de la recuperación del pHi luego de\nuna carga ácida intracelular inducida por un prepulso de amonio (NH4+) a pH\nextracelular constante (pHo 7.4).\nFundamento de la técnica de Pulso de amonio. La exposición abrupta al\nNH4Cl aumenta rápidamente el pHi debido a que el NH3 entra en los miocitos y\ncaptura los H+. Luego el pHi cae levemente a medida que el NH4+ entra a la célula\na través de canales de K+ y se disocia. Cuando se lava el NH4Cl extracelular, éste\nse disocia en NH3, que sale de la célula, e iones hidrógeno, que quedan retenidos\nentro de ella, generando la acidosis intracelular que activa al NHE-1  (Figura\nn intracelular ya que el NH3 sale, y los H quedan retenidos en la ión del NHE-1 (3).\ne calculó como la derivada del ajuste exponencial del registro pHi\nvs. Tiempo. (Figura 16).\nEl eflujo neto de H+ (JH+, en mmol/L/min) durante la recuperación del pHi se\n15. Fundamento de la técnica de pulso de amonio. El amonio (NH4 +\n) en el medio extracelular se disocia a amoniaco (NH3) y H+, el primero, por ser permeable a la membrana del cardiomiocito ingresa y captura los H+ intracelulares produciendo alcalinización (1). El lavado del\namonio (2) produce acidificació +\ncélula conduciendo a la activac\nLa velocidad de recuperación del pHi (dpHi / dt) a cualquier pHi\nacológicas se compararon a pHi 6.8, dado\nue el pH de acidificación máxima, varió con cada intervención farmacológica. Las diferentes intervenciones farm\n3.10. Protocolo experimental\nLa actividad del NHE-1 se determinó en un modelo de Acidosis sostenida en el cual, el amonio se lava con un buffer HEPES libre de Na+ que inhibe al\nNHE-dor (Figura 16).\ndurante 10 min, (que se mantuvo\n4Cl (20 mmol/L) durante 3 min\n4) Acidosis sostenida con 0 Na+ (5 min).\n5) Recuperación del pHi por activación del NHE-1 a través de la restitución del Na+ (Figura 16).\n1 y luego al restablecer este ión se activa el intercambia\nLos registros de pHi vs Tiempo se realizaron de acuerdo al siguiente protocolo\n1) Estabilización de la señal fluorescente (~3 min). 2) Incubación con la droga a ensayar\ndurante el resto del experimento, excepto en el control). 3) Pulso de amonio con NH\nFigura 16. Registro representativo control de pHi vs tiempo en miocitos cardiacos de gato. En rojo se muestra el mejor ajuste exponencial, a partir del cual se calculó la derivada (dpHi/dt). El lavado del NH4Cl con buffer HEPES 0 Na\ndurante 5 min produce la acidosis intracelular sostenida. La recuperación del pHi por activación del NHE-1 se produjo por la restitución del Na+.\n3.11. Capacidad intrínseca buffer\nLa capacidad intrínseca buffer (βi) se define como la cantidad de ácido o\nbase que se debe adicionar al citosol para cambiar el pHi en 1 unidad. Para\ndeterminarla se utiliza la siguiente ecuación:\nLa concentración de amonio intracelular NH4+i se calcula a partir de la\nexposición de los cardiomiocitos de gato a distintas concentraciones de NH4Cl\nextracelular (20, 15, 12, 9, 5 y 3 mmol/L, NH4+o) en buffer HEPES libre de Na+,\nsiendo el pK del NH4+= 9.21 y pHo el pH extracelular .\nEl buffer HEPES libre de Na+ se preparó reemplazando el NaCl por N-metil-D-glucamina, cuya composición en mmol/L es: HEPES 25, KCl 4.66, MgSO4 1.05,\nCaCl2 1.35, N-metil-D-glucamina 148, glucosa 11 ajustado a pH 7.4 con HCl 1N.\nEn la Figura 17 se observa la capacidad intrínseca buffer que se obtuvo para cardiomiocitos de gato a partir del ajuste lineal de la capacidad intrínseca buffer en respuesta a los diferentes pHi,: βi =125.76- 14.76 x pHi. La relación\ninversa entre la capacidad buffer y el pHi coincide con resultados previos, en los\ncuales βi es máxima a pH ácidos cercanos a los valores de pK de las proteínas y\naminoácidos intracelulares que amortiguan los cambios de pHi [151, 152].\n3.12. Determinación de la fosforilación de ERK1/2 y p90RSK\nLos miocitos ventriculares de gato se incubaron en placas de cultivo de 35 mm (5 x 105 células por placa). El efecto de sildenafil se estudió en las células de acuerdo al protocolo usado en los pulsos de amonio. También se determinó la fosforilación de las quinasas siguiendo un protocolo de incubación farmacológica similar al empleado en la medición de ERO, por lo cual los cardiomiocitos se preincubaron 15 min en presencia de los inhibidores losartán, apocinina, MPG, 5H-D y glibenclamida, y luego 30 min con Ang II (1 nmol/L).\nAl finalizar la preincubación, los miocitos se lavaron con buffer PBS y se homogeneizaron en buffer de lisis de la siguiente composición en mmol/L: Tris-HCl 50, EGTA 5, EDTA 2, NFa 100, NaVO4 1, Tritón X-100 0.05% a pH 7.5.\nLuego de una centrifugación a 14,000 × g durante 60 min a 4 °C, se determinó la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford. Las muestras se desnaturalizaron, se sometieron a PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear las membranas con leche en polvo descremada se\nFigura 17. Relación entre la capacidad intrínseca buffer (βi) y pHi en cardiomiocitos aislados de gato. A. La capacidad buffer intrínseca se determinó mediante los cambios de pHi registrados a distintas concentraciones de NH4Cl en presencia de un buffer HEPES libre de Na+ (ver fórmulas en el texto). La βi permitió expresar la actividad del NHE-1 como eflujo de H+ (JH+=dpHi / dt x βi.).\nB. Los parámetros del\najuste lineal son la ordenada al origen y la pendiente: A= 125.76 y B= -14.76, respectivamente (n=32 mediciones de 8 miocitos).\nincubaron toda la noche con anticuerpos policlonales anti P-p90RSK y P-ERK1/2 (Santa Cruz Biotechnology). Se utilizó un anticuerpo secundario conjugado a peroxidada anti Rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology). Las bandas se visualizaron usando el sistema de detección de quimioluminiscencia ECL-Plus (Amersham). Las formas fosforiladas de p90RSK y ERK1/2 se normalizaron por las formas no fosforiladas.\nDescargar ( - 95 página - 2.36MB)\nRegulación de la actividad internacional del Estado en la Constitución\n*^ Diario de Sesiones de las Cortes Generales y Extraordinarios.. derse de dicha Comisión el conocimiento técnico necesario para el seguimiento de cualquier tratado, independientemente\nActividad No 1. Actividad No 2. Tamaño de la figura. 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corte en placa gruesa corte por láser - National -Fábrica de placas de acero\nInicio / acero ASTM / corte en placa gruesa corte por láser\n¿Cuál es el precio de corte de un láser?¿Cuál es el precio de corte de un láser?Algunos servicios prefieren cobrar un precio por centímetro de corte en vez de por minuto de uso, es otra de las maneras que existen de reflejar el trabajo del láser en el precio de la pieza. A continuación, tenemos el rasterizado y el grabado de vectores, que es cortar superficialmente un trozo de material sin llegar a traspasarlo.¿Cuánto cuesta el corte láser? Cómo lo presupuestamos paso corte en placa gruesa corte por láser ¿Qué es un cabezal de corte láser?¿Qué es un cabezal de corte láser?Piezas que tienen muchos cortes sin conexión (como un patrón de encaje), que tardan más en cortarse. Esto es debido a que el cabezal de corte láser tiene que detenerse y moverse de corte en corte con más frecuencia que cuando corta a lo largo de un recorrido continuo.¿Cuánto cuesta el corte láser? Cómo lo presupuestamos paso corte en placa gruesa corte por láser ¿Qué es un corte láser de última tecnología?¿Qué es un corte láser de última tecnología?Corte láser de última tecnología en acción. que nuestros proyectos cumplan con los más altos estándares, el control de calidad es de suma importancia. If playback doesn't begin shortly, try restarting your device. Videos you watch may be added to the TV's watch history and influence TV recommendations.Corte Láser en Santiago de Chile Provimetal\nCorte con Láser MIPSA Metales Industriales de Puebla S corte en placa gruesa corte por láser\nEl corte con láser en dos dimensiones (2D), se emplea para corte de láminas y placas, donde el movimiento del cabezal de corte, se realiza sobre la pieza de trabajo formando una perpendicular entre el rayo láser y la superficie del material. El rayo láser por si sólo, no es capaz de realizar el proceso de corte.¿Cómo debe cortar la máquina de corte por láser de fibra corte en placa gruesa corte por láserEn este momento,cortadora láser de fibraentra en los ojos del públi Sin embargo, en el corte de placas, ocurrirán algunos problemas en la máquina de corte por láser y afectarán el efecto de procesamiento. 1. Cortar agujeros en una gruesa placa de acero al carbono¿Cómo funciona el corte láser? Trotec Laser FAQEl corte láser es un tipo de proceso de separación térmica. El rayo láser impacta la superficie del material y lo calienta con tanta fuerza que se derrite o se vaporiza por completo. Una vez que el rayo láser ha penetrado completamente el material en un punto, comienza el proceso de corte real.\nCoste por minuto / hora del corte láser. El costo principal del corte láser se basa en el tiempo que tarda en cortar las piezas, y esto depende sobre todo del área del grabado, tipo de material de corte y grosor del mismo. Por eso se cobra una cantidad por minuto de uso de la máquina cuando está cortando.Bienvenido - Acerolaser - Acero láserEn Acerolaser hacemos realidad esa idea que tiene en mente mediante una gran variedad de servicios relacionados con el corte por láser. 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La empresa, creada en 2002 dentro del grupo Láser Ebro y nacida de la amistad y colaboración entre Pablo Ezquerra Lasheras y Manuel López Rodríguez, se caracteriza por su apuesta por la tecnología TRUMPF más avanzada y por buscar siempre el modo de dar el servicio más corte en placa gruesa corte por láser\nCorte & Grabado Láser en Querétaro - Arsan Grafics\nEmpresa 100% Queretana de Corte & Grabado Láser con más de 15 años en el mercado, nuestro objetivo radica en proporcionar la mejor solución en servicios de grabado y corte láser con innovación y calidad, ya sea en el sector industrial, educativo, comercial, diseño.Corte - PinalPara la fabricación de piezas de metal, el corte láser se ha separado de los demás por su precisión y calidad sin micro-grietas, fragmentación o astillados, con bordes limpios y cuadrados. además, el corte láser aprovecha al máximo en las placas de corte gracias a un nesting (anidado) avanzado, por lo que resulta bastante rentable.Corte CNC Plasma HD MIPSA Metales Industriales de corte en placa gruesa corte por láserCorte con plasma. 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Para dichos procesos cuenta con una nave industrial de 1600 M2 con maquinaria y equipos de alta tecnología asegurando con esto los estándares de calidad del producto con el objetivo de lograr la satisfacción plena de nuestros corte en placa gruesa corte por láser 8 minsCuál es la mejor manera de cortar placa de aceroAdemás, el chorro de agua no está limitado en el espesor de la manera que que sí lo están el corte por plasma y por láser. El límite práctico del corte por chorro de agua es de aproximadamente 6 (152.4 mm) a 8 (203.2 mm) pulgadas debido a la duración de tiempo que lleva cortar ese espesor y a la tendencia que tiene el chorro de agua a corte en placa gruesa corte por láserFollowers 611CORTE Y GRABADO LÁSER EN MADERA BOGOTÁ Madera. La madera es uno de los materiales más versátiles para hacer grabados láser. Para procesos de corte solamente se puede realizar en maderas delgadas hasta de aproximadamente 6mm como chapilla, triplex y balso. 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La Serie A puede cortar estos materiales en lotes, como acero al carbono, acero inoxidable, chapa galvanizada, aluminio y aleaciones de aluminio, latón, etc. Además, puede cortar corte en placa gruesa corte por láserMaquila de corte con láser Maquimetálica - Maquila de corte en placa gruesa corte por láserNuestros sistemas de corte láser HK Laser & Systems son rápidos, flexibles y requieren un tiempo mínimo de preparación, por lo que podemos ofrecer tanto el corte de una sola pieza como la producción en serie de piezas a bajo costo.\nJul 23, 2009El corte por láser también requiere una inversión en equipo mucho más alta, dijo Fernicola. Los talleres de fabricación tienen que comprar el equipo láser en sí, así como cajas de protección.OEM Placa gruesa de corte por láserOEM Placa gruesa de corte por láser. corte en placa gruesa corte por láser CNC OEM de Metal hoja personalizada la fabricación acero inoxidable cortar el servicio corte por láser. CAS 154-17-6 Venta caliente en polvo 2-DG/2-deoxi-D-glucosa con precio razonable . Tubo de Caldera sin fisuras la OREE es un fabricante de máquinas de corte por láserEl corte por láser se ha convertido en uno de los métodos de procesamiento de metales importantes de las empresas modernas. El corte con láser consiste en utilizar un rayo láser enfocado de alta densidad de potencia para irradiar la pieza de trabajo, de modo que el material irradiado se derrita, se vaporice, se extirpe o llegue al punto de corte en placa gruesa corte por láser\nPALESA, Corte láser y doblez de placa y lámina, Corte corte en placa gruesa corte por láser\nCORTE LÁSER Y DOBLEZ DE LÁMINA Y PLACA. Somos una empresa de procesos metalmecánicos, consolidada en la ciudad de Puebla, Méxi Dedicada a transformar el metal para ofrecerle los servicios, productos y materiales adecuados con la calidad y rapidez que usted requiere.PINAP Corte y Grabado Laser Lerma-Toluca-Estado de Corte con Oxigeno. Corte con Nitrógeno. Corte con Aire Comprimido. Corte por Laser CNC (por medio de CO2) REALIZAMOS CORTES EN MATERIALES COMO Láser de Fibra Óptica. Acero al Carbono. Acero Inoxidable. Acero al Cilicio.People also ask¿Cómo se realizan los cortes láser?¿Cómo se realizan los cortes láser?Si se realiza con equipo mecanizado, los cortes láser brindan resultados altamente reproducibles con anchuras de ranuras angostas, mínimas zonas afectadas por el calor y prácticamente ninguna distorsión.Corte con láser - Wikipedia, la enciclopedia libre\nPersonalizar 304 Placa de acero inoxidable placa gruesa corte en placa gruesa corte por láser\nPersonalizar 304 Placa de acero inoxidable placa gruesa procesamiento corte por láser. Quantity corte en placa gruesa corte por láser El 31 de aleación níquel en los pezones B622 Uns N08031 accesorios tubería sin costura 4110000011081 Buena resistencia al desgaste-13A 4110000011082 SEAL RING YB315Z5-33:Sistemas de corte por láser BystronicEl corte por láser es un procedimiento de división térmico para el tratamiento de chapas. El rayo láser se genera en la fuente láser (resonador) y se guía mediante una fibra transportadora o un espejo al cabezal de corte de la máquina, donde se concentra en un diámetro muy reducido y de mucha potencia con una lente. El rayo láser enfocado entra en contacto con la chapa y hace que esta corte en placa gruesa corte por láserSoldadura de placa gruesa - ABICOR BINZELPara garantizar tanto la eficiencia como la calidad durante el tardado proceso de soldadura de placa gruesa, es esencial seleccionar materiales y antorchas aptas para el proceso de soldadura. Cada vez más, se utilizan nuevos procedimientos, por ejemplo técnicas híbridas de soldadura GMAW y láser o técnicas MAG en tándem.\nEl uso de maquinaria con tecnología láser para el corte de placas de gran grosor está ganando terreno. Encuentre algunos de los avances en este campo. 2017 recibió a los fabricantes de máquinas de corte por láser con buenas noticias la demanda global de estos equipos aumentará de forma sostenida durante los próximos diez años.Tecnologías de corte láser de placas metálicasEl uso de maquinaria con tecnología láser para el corte de placas de gran grosor está ganando terreno. Encuentre algunos de los avances en este campo. 2017 recibió a los fabricantes de máquinas de corte por láser con buenas noticias la demanda global de estos equipos aumentará de forma sostenida durante los próximos diez años.\nMay 31, 2021Es por eso que los fabricantes tienen que ver los ahorros en costos que implica el poder usar ambas tecnologías de corte en la misma mesa sin tener que mover las partes entre dos mesas. Debe observarse que estas máquinas de combinación pueden usarse con mesas que pueden medir cerca de 50 pies (15 m) y aceptan placa hasta de 12 pies (3.6 m corte en placa gruesa corte por láser


Repasando la Historia: 30 de enero de 2021 - Segundo Paso\n31 enero 2021 - 08:07\nCódigo para noticias 1329\npublicado el: 31 enero 2021 - 08:07\nSegundopaso – estimada audiencia bienvenidos a Repasando la historia hoy hablaremos sobre Adolf Hitler, Gandhi y mucho mas nuestra frase de hoy viene de Charles Baudelaire que dijo” Para trabajar basta estar convencido de una cosa: que trabajar es menos aburrido que divertirse”.\n1. Un día como hoy hace 87 años, el 30 de enero de 1934:\nComenzó el reinado de Adolf Hitler, el dictador racista alemán. El Partido Nacionalsocialista, fundado por Hitler, obtuvo 107 escaños en el Reichstag de 1930 (parlamento alemán). Después de convertirse en canciller y luego presidente de Alemania en 1934, se declaró líder del país y envió a sus oponentes a campos de trabajos forzados mediante el establecimiento de una notoria organización de seguridad llamada SS y el establecimiento de grandes cámaras de tortura. Hitler sacrificó a millones de personas por sus objetivos racistas. Comenzó la Segunda Guerra Mundial con la captura del corredor de Danzig en Polonia en septiembre de 1939, lo que finalmente condujo a la derrota de Alemania y sus aliados. Hitler se suicidó en 1945 tras su derrota.\n2. Un día como hoy hace 73 años, el 30 de enero de 1948:\nMohandas Karamchand Gandhi, líder nacional y popular de la India y fundador de la independencia del país, fue asesinado por un fanático joven hindú. Nacido en 1869, Gandhi se graduó en derecho en Inglaterra y durante algún tiempo en Sudáfrica dirigió a los militantes indios. Se le conoció como Mahatma, el gran espíritu, por liderar al pueblo desfavorecido de la India en la lucha contra el gobierno colonial británico. Gandhi fue sentenciado a seis años de prisión en 1922 por cantar “muerte o independencia” y, después de su liberación, dirigió una política de lucha negativa contra el colonialismo británico en India. La acción de Gandhi, junto con sus esfuerzos por cerrar la brecha entre hindúes y musulmanes, asestó un golpe fatal al cuerpo del colonialismo británico en la India. India finalmente obtuvo su independencia en agosto de 1947 bajo Gandhi.\nFalleció Orville Wright, uno de los constructores del primer avión motorizado del mundo. Orville Wright nació el 19 de agosto de 1871 en Ohio, Estados Unidos, y era cuatro años menor que su hermano Wilbur. Eran los hijos de un sacerdote que no podía pagar debido a su escasez. Entonces los dos hermanos, que estaban interesados en el trabajo técnico y la construcción de motores y automóviles, montaron un taller de bicicletas. Los hermanos Wright, que estaban demasiado interesados en volar, finalmente realizaron su sueño de larga data el 17 de diciembre de 1903 e inventaron el primer avión motorizado del mundo que voló en el cielo durante 59 segundos. Sin embargo, aún intentaron completar su invento hasta que en los siguientes vuelos lograron registrar un vuelo de 56 minutos en el cielo. Aunque Wilbur Wright murió en 1912, Orville siguió los pasos de su gran invento mucho después de él, tratando de completarlo aún más e introducir al mundo en el mundo de los aviones. Orville Wright finalmente murió a la edad de 77 años el 30 de enero de 1948, exactamente 45 años después de la exitosa prueba del primer avión motorizado del mundo, después de décadas de esfuerzo.


La Prima de la discordia en Finect\nLos jugadores de la Selección Española de Fútbol se embolsarán quince millones de euros si ganan el Mundial. Confieso que cuando me enteré de la noticia me sentí indignado. ¿Cómo se atreven a pagar esa millonada a veinticinco privilegiados (600.000 € x 25 jugadores) cuando a los demás españoles nos están pidiendo sacrificios, recortando prestaciones y salarios y subiendo impuestos? ¿Cómo consiente ese despilfarro nuestro gobierno?\nAhora imagina un grupo de trabajadores que, según contrato, les corresponden vacaciones. Imagina que su empresa recibe un encargo extraordinario y les piden ayuda a los que deberían estar de vacaciones. “ Sé que os corresponden vacaciones, pero tenemos un pedido muy importante y necesitamos que vengais a trabajar “. Los representantes de los trabajadores llegan a un acuerdo con la empresa: “ La mitad de lo que ganemos con este pedido es para nosotros, los trabajadores, en concepto de prima. La otra mitad, para la empresa“. ¿Te parece justo?\nEste es el acuerdo al que han llegado los representantes de los futbolistas y la Federación Española. Los derechos de imagen del mundial y todo el negocio que mueve, permite que la FIFA premie a la Federación del país que gane el mundial con 30 millones de euros. Los futbolistas han pedido el 50% para ellos y el restante 50% para la Federación. ¿A que ya no te parece tan injusto? Al fin y al cabo, no saldrá ni un solo euro de tus impuestos ni de los míos para pagar esa prima a los futbolistas. Si ganan el mundial, ganamos todos.\nComo decía D. Ramón de Campoamor, en su célebre poema “las dos linternas”\nAunque el acuerdo sea justo las cifras que se manejan en el fútbol siempre me han parececido absolutamente desproporcionadas; son una ofensa para cualquier trabajador. Por poner un ejemplo "sangrante": ¿cómo puede ganar (mucho) más dinero un futbolista por darle patadas a un balón que un cirujano que salva vidas en un quirófano? Lo miremos por donde lo miremos es injusto: el mensaje para los jóvenes es que estudiar no compensa porque hay otras actividades, el fútbol a la cabeza (pero no solo eso) mucho más lucrativas. Estamos viviendo una época de gran confusión donde los valores que se priman no son los que hacen prosperar a la sociedad sino los que la aturden.\nNo estaba defendiendolos pero me parece injusto contar las cosas a medias y solo completaba la noticia ;)\nSolo decirte que estudiar,aunque necesario, esta sobrevalorado,sobre todo la parte teorica,plagando las aulas de clases teoricas y con suerte alguna practica,cuando deberian tener 1 peso parecido la practica y la teoria, ademas este pais tiene1 sistema educativo de risa que cambia cada 2 o 3 años.\nDe hecho de los 10 hombres mas ricos del siglo 20 solo 1 tenia carrera,y lo que si tenian todos era conocimientos tecnicos amplios especificos de 1 area,donde trabajaban(por poner el ejemplo mas famoso el de henry Ford:\nen 1879 tenia 16 años y se fue para no trabajar en la granja familiar,al morir su madre,mas tarde seria ingeniero en la compañia Edison ,y como ves tenia estudios practicos no teoricos ;)\nYo la vedad ,no soy futbolero que conste,pero dicen que entretener es 1 arte y si son capaces de entretener a medio mundo tendran que cobrarlo supongo,tampoco entiendo porque valen tanto algunas antiguedades o como cobran tanto los cantantes de algunos grupos de musica,pero si a la gente les gusta tendran derecho a pagarlo.....ademas puntualizar que solo los de primera cobran mas que los medicos ,los de segunda contentos con 2000 o 3000 euros vs 7000 del medico ;)(por cierto la mitad de mi familia son medicos incluidos mi padre y madre).\nAlfred Nobel, quien hizo su fortuna por medio de la venta de dinamita y otros explosivos, donó al momento de su muerte $9.2 millones de dólares para el premio que lleva su nombre, el Premio Nobel de la Paz. Algunos dicen que estaba consternado por haber incrementado la habilidad de la humanidad para matarse unos con otros.\nYa ves cotiza mas matar que salvar vidas, lo que menos dinero deberia dar es lo que mas dinero da .\nEs justo que sea famoso el inventor de tantos explosivos ?\nPD: Quitada la B d sobrevalorado XD\n@edus: yo no defiendo el sistema pero si que reconozco lo que tiene más valor dentro de la escala. Los ejemplos que citas son muy ilustrativos pero, para que se me entienda, "sobrevalorado" se escribe con uve no con be.\nupss se me colo no sirvo para 2 cosas a la vez ...y mira que veo el vocablo "valor" a lo largo del dia XD


Etiqueta: «Foro eMallorca Challenge» / Página: 1\nEtiqueta 'Foro eMallorca Challenge'\nNova Producciones\t11/06/21\nMartín es técnico de la Fundación Musol.\nRedacción Especiales11/06/21 15:15\nRedacción Especiales11/06/21 14:47\nRedacción Especiales11/06/21 14:01\nSoraya Romero: «Si un cliente cambia su alimentación ¿cómo no va a cambiar de marca?»\nSoraya Romero, directora de sostenibilidad EMEA Iberostar, explicó en el Foro eMallorca Challenge que el grupo ya es libre de plásticos de un solo uso en todos sus hoteles y detalló los retos que se han marcado en un futuro próximo.\nNova Producciones\t10/06/21\nGarcía Cuenca: «En el sector hotelero la sostenibilidad será la mayor disrupción de la época reciente»\nFrancisco Javier García Cuenca, presidente del Instituto Tecnológico Hotelero, se presentó en el Foro eMallorca Challenge como un «converso de la sostenibilidad».\nAniol Esteban, director de Marilles Foundation, abogó en el Foro eMallorca Challenge por un Blue New Deal.\nMiquel Àngel Verd, director de Producció Nord B2B Endesa X, explicó en el Foro eMallorca Challenge el gran cambio que ha afrontado la cadena de valor de suministro eléctrico.