Analyser baseret på Bioluminescens Resonance Energy Transfer (BRET) give en følsom og pålidelig måde at overvåge protein-protein interaktioner i levende celler. BRET er den ikke-radiative overførsel af energi fra en "donor" luciferaseenzym til en "acceptor" fluorescerende protein. I den mest almindelige konfiguration af dette assay donoren Renilla R. reniformis luciferase og acceptoren er gult fluorescerende protein (YFP). Da effektiviteten af energioverførsel er stærkt afstand-afhængig, observation af BRET fænomen kræver, at donor og acceptor være i tæt nærhed. For at teste for en interaktion mellem to proteiner af interesse i dyrkede pattedyrceller, er et protein, der udtrykkes som en fusion med luciferase og den anden som en fusion med YFP. En interaktion mellem de to proteiner af interesse kan bringe donor og acceptor tilstrækkelig tæt til energioverførsel at forekomme. Sammenlignet med andre teknikker til at undersøge protein-protein iteractions, den BRET analysen er følsom, kræver lidt hands-on tid og få reagenser, og er i stand til at detektere interaktioner, som er svage, forbigående, eller afhængig af den biokemiske miljø findes inden for en levende celle. Det er derfor en ideel metode til bekræftelse af formodede interaktioner foreslået af gær to-hybrid-eller massespektrometri proteomics undersøgelser, og derudover er det velegnet til kortlægning interagerende regioner, vurdere effekten af post-translationelle modifikationer på protein-protein interaktioner, og evaluere virkningen af mutationer identificeret i patientens DNA.\nBåde klassisk kobling og næste generation sekventering analyser af menneskelige lidelser er afslørende den kliniske relevans af proteiner involveret i en række biologiske veje. Det er ofte tilfældet, at forud for deres identifikation i sådanne undersøgelser, har der været lidt eller ingen undersøgelse af den biologiske rolle af disse proteiner. En frugtbar vej til at begynde at udforske den biologiske funktion af et protein af interesse er at identificere, hvilke andre proteiner, det interagerer med i sin fysiologiske sammenhæng. Karakterisere molekylære netværk på denne måde giver indsigt i de biologiske veje ligger til grund for menneskelig fænotype.\nDen hyppigst anvendte storstilet screening tilgange til at identificere kandidat interaktion partnere for proteiner af interesse er gær to-hybrid screening 1 og massespektrometri-baserede proteomics 2. Disse metoder kan være meget vellykket i at foreslå potentielle interagerende proteiner, men are sårbar over for falske positive resultater. Derfor bekræftelse af en vekselvirkning identificeret af gær to-hybrid-eller massespektrometri screening kræver validering af interaktionen ved hjælp af en anden teknik. Typisk en co-immunopræcipitation eller pull-down assay anvendes til dette formål 3. En ulempe ved anvendelse af sådanne teknikker til validering er kravet om cellelyse, som ødelægger de intracellulære betingelser, der kan være afgørende for at opretholde visse protein-interaktioner. En anden ulempe er, at svage eller forbigående protein-interaktioner kan forstyrres under vasketrin. Desuden kræver disse analyser betydelige hands-on tid, er begrænset i antallet af prøver, der kan behandles samtidigt, og kræver ofte tidskrævende optimering af reagenser og protokoller.\nFor at overvinde nogle af de problemer, der er forbundet med co-immunpræcipitationseksperimenter har flere assays blevet udviklet baseret på fluorescerende og bioluminescent proteiner, der kan anvendes i levende celler. De første af disse assays blev baseret på fluorescens (eller Forster) Resonance Energy Transfer (FRET), den ikke-radiative overførsel af energi mellem to fluorescerende proteiner med overlappende emissions-og excitationsspektre 4. Effektiviteten af energioverførsel er stærkt afstand afhængig af, derfor observation af FRET fænomen kræver, at donor-og acceptor fluorophores være i tæt nærhed. For at teste for en interaktion mellem to proteiner af interesse, er et protein, der udtrykkes som en fusion med donorfluorophor (almindeligvis cyan fluorescerende protein; FFP) og den anden som en fusion med acceptorfluoroforen (almindeligvis gult fluorescerende protein; YFP). En interaktion mellem de to proteiner af interesse kan bringe donor-og acceptor-fluoroforer tilstrækkelig tæt til energioverførsel at forekomme, hvilket vil resultere i en målelig forøgelse i emissionen af lys fra YFP acceptoren i forhold til donor FFP. FRET har været en succes i forbindelse med afsløring af protein-protein interaktioner i levende celler 4. Den største ulempe ved anvendelse af FRET til påvisning af protein-protein interaktioner er kravet om ekstern belysning til excitation af donorfluoroforen. Eksterne resultater belysning i høj baggrund i udledningen signal, uønsket excitation af acceptor, og fotoblegning af både donor og acceptor fluorophores. Disse virkninger reducere følsomheden af assayet til påvisning af protein-protein interaktioner.\nEn modifikation af FRET-assay, der overvinder problemet med høj baggrund fra ekstern belysning er Bioluminescens Resonance Energy Transfer (BRET)-assay 5,6. I BRET systemet donorfluoroforen er erstattet af et luciferaseenzym. Således energi til excitation af acceptoren fluorofor genereres i systemet ved oxidation af et luciferasesubstrat, rendering ekstern belysning unødvendig. I de mestfælles konfiguration af denne analyse, donor er Renilla reniformis luciferase og acceptor er YFP (for en diskussion af alternativ donor og acceptor proteiner se Pfleger et al. 5). Derfor i dette system, er et protein af interesse er fusioneret til luciferase og et potentielt interagerende protein til YFP, eller omvendt. Den BRET analysen kræver tilsætning af coelenterazin som et substrat for luciferase. Fordi coelenterazin er celle-permeabel, er det muligt at udføre BRET assays levende celler. Men native coelenterazin er ustabilt i vandig opløsning, og enzym-uafhængig fordeling af coelenterazin både reducerer koncentrationen af substratet til rådighed for analysen og genererer autoluminescence, hvilket reducerer følsomheden af målinger af luciferaseaktivitet. Brugen af BRET i levende celler er blevet fremmet af udviklingen af beskyttede coelenterazines, som er stabile i vandig opløsning, men spaltes af cytosol esterases efter diffusion over cellemembranen til at generere aktive coelenterazin i cellen 7.\nEfter tilsætning af substrat til celler, som udtrykker luciferase-og YFP-fusionsproteiner, er energioverførsel som følge af protein-protein interaktioner kvantificeres ved at overvåge emission fra luciferase og YFP. Fordi protein interaktioner kan overvåges direkte i levende celler i flere brønde, den BRET analysen udgør en enkel, skalerbar metode til validering af formodede interaktioner, der er omkostnings-og tidsbesparende.\nUd over at validere putative interaktionskandidater identificeret i proteom screening undersøgelser kan BRET systemet også bruges til at teste interaktionskandidater følger kendte biokemiske og strukturelle undersøgelser af proteinet af interesse. Når forekomsten af en protein-protein interaktion er blevet etableret (enten ved at bruge BRET analysen eller ved andre teknikker), der er potentiale for BRET assay at være employed yderligere at karakterisere interaktion. For eksempel kan de interagerende regioner kortlægges ved at generere afkortede versioner af proteiner, og inddragelse af specifikke rester i samspillet kan påvises ved at skabe punktmutationer. Endvidere kan modulerende virkning af posttranslationelle modifikationer eller små molekyler (såsom lægemidler eller ligander) på protein-protein interaktioner undersøges 8-10.\nDen BRET analyse har også et stort potentiale for at undersøge mutationer identificeret i patientens DNA. I tilfælde, hvor en sygdomsfremkaldende rolle for en mutation er blevet etableret, studere effekten af mutationen på protein-protein interaktioner ved hjælp BRET kan afsløre mere om den molekylære ætiologi fænotype 11. Siden indførelsen af næste generation sekventering metoder, er det mere almindeligt, at flere potentielt skadelige mutationer skal identificeres inden for et individ, i hvilket tilfælde det er uklart, som er relevante for fænotype 12. I denne situation BRET analysen kan være værdifulde i at evaluere effekten af mutationer på protein funktion og dermed deres relevans for uorden.\n1.. Oprettelse af plasmider\nSubklone cDNA'er for hvert protein af interesse i både pLuc og pYFP vektorer ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker (figur 1). For detaljerede protokoller se Green et al 13.\nSequence alle konstruktioner at kontrollere, at proteiner af interesse er i ramme med Luc / YFP sekvens uden nogen mellemliggende stopcodons.\nUdfør funktionelle assays som ønsket for at bekræfte, at fusionsproteinerne bevarer biologisk aktivitet. I tilfælde præsenteres her den subcellulære lokalisering af YFP fusionsproteiner blev konstateret ved fluorescensmikroskopi.\nGør ekspressionsplasmider til passende Luc og YFP kontrol proteiner ved engineering de relevante målretning signaler ind i pLuc og pYFP ekspressionsvektorer. I tilfælde, der præsenteres her, generere nukleare målrettet Luc og YFP-konstruktioner ved at indsætte et kernelokaliseringssignal ind i pLuc og pYFP vektorer.\nForetagen positiv kontrol-konstruktion, hvor Luc og YFP fusioneres til et enkelt polypeptid. I tilfælde, der præsenteres her, genererer en positiv kontrol, hvor kodningssekvensen YFP indsættes i pLuc vektoren.\nVælg en neutral fyldstof plasmid anvendes til at udligne massen af DNA i transfektion blandinger. Brug et plasmid, der ikke har nogen eukaryot promotor og vil derfor være transkriptionelt inaktive i mammale celler, såsom en bakteriel kloningsvektor.\n2. Fremstilling af DNA-miks\nEstimere koncentrationen af alle de plasmider er beskrevet i afsnit 1 på grundlag af absorbans ved 260 nm (1 absorbansenhed svarer til 50 mg / ml af DNA). Bestem molekylvægten af hvert plasmid ved at multiplicere antallet af basepar med 650 Da. Brug koncentration og molekylmasse at beregne den molære koncentration af hvert plasmid præparat. Fortynd plasmid-DNA-præparater i en koncentration på 36 nM. Disse vil være de arbejdende lagreder vil blive anvendt til at fremstille DNA-blandinger til transfektion.\nDer fremstilles en DNA-blanding indeholdende 1.800 ng fyldstof plasmid i et slutvolumen på 20 pi vand.\nForbered en kontrol-DNA-blanding indeholdende 5 ul af pLuc-kontrol konstruktion. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.\nForbered en kontrol-DNA-blanding indeholdende 5 pi pLuc-kontrol konstruktion og 5 pi pYFP-kontrol konstruktion. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.\nForbered en kontrol-DNA-blanding indeholdende 5 pi positiv kontrol konstruktion. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.\nKlargør følgende DNA blander at teste for homodimerisering af et protein af interesse, X. For hver DNA mix kombinere 5 ul af relevante pLuc konstruere og 5 pi af pYFP konstruere. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.\nA) pLuc-kontrol og pYFP-X\nB) pLuc-X og pYFP-kontrol\nC) pLuc-X og pYFP-X\nKlargør følgende DNA blander til at teste for en interaktion mellem et par af proteiner af interesse, X og Y. For hver DNA mix kombinere 5 ul af relevante pLuc konstruere og 5 ul af pYFP konstruere. Tilføj fyldstof plasmid til at bringe den samlede DNA-masse til 1.800 ng. Tilsæt vand til at bringe det endelige volumen til 20 ul.\nC) pLuc-kontrol og pYFP-Y\nD) pLuc-Y og pYFP-kontrol\nE) pLuc-X og pYFP-Y\nF) pLuc-Y og pYFP-X\nHarvest Subkonfluente HEK293-celler fra en 75 cm2 kolbe. Fortynd 10% af de totale celler i 13 ml dyrkningsmedium. Doser 130 pi af cellesuspension i hver brønd i en hvidklar bund 96-brønds vævskulturplade. Kultur-celler i 24 timer.\nBeregne antallet af brønde, der skal transficeres ved at multiplicere antallet af DNA-blandinger med 3. Bring serumfrit dyrkningsmedium til stuetemperatur. Forbered en master-blanding indeholdende 6,3 pi serum-frit medium og 0,18 pi transfektionsreagens pr godt. Vortexes og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.\nForbered transfektionseksperimenter blander ved tilsætning af 2 ul DNA mix til 20 ul serum-frit medium / transfektionsreagens mester mix. Undlad at slynge. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.\nTransficere tre brønde med hver transfektion blanding dispensering 6.5 pi Transfektionsblandingen per brønd. Kultur cellerne i yderligere 36-48 timer.\n4.. Måling af BRET Signal\nOpløs live-cell luciferasesubstrat til 34 mg / ml i DMSO ved hvirvelbehandling.\nFortynd rekonstitueret live-cell luciferasesubstrat på 1:1000 i substrat fortyndingsmediet pre-opvarmet til 37 ° C. Tillad 50 pi substrat fortynding medium per brønd. Vortex at blande. Et præcipitat kan dannes, men ikke vil interferere med analysen.\nAspirer dyrkningsmediet fra 96-brønds plade. Doser 50 ul fortyndet live-cell luciferasesubstrat i hver brønd. Kultur-celler i mindst 2 timer (op til 24 timer).\nFjern låget fra 96-brønds plade og inkuber pladen i 10 minutter ved stuetemperatur inde i luminometeret.\nMåle emission fra Luc og YFP et godt ad gangen. Måle emission fra Luc hjælp af et filter blokerer bølgelængder længere end 470 nm. Måle emission fra YFP ved hjælp af en 500-600 nm band-pass filter. Integrer emission signaler over 10 sek.\nGennemsnittet af emissions aflæsninger Luc fra de 3 brønde, der kun fik fyldstof plasmid. Trække denne værdi fra alle andre Luc emission aflæsninger til at producere Luc emissionsværdier baggrundssubtraktion.\nGennemsnittet af emissions aflæsninger YFP fra de 3 brønde, der kun fik fyldstof plasmid. Trække denne værdi fra alle andre YFP emission aflæsninger til at producere YFP emissionsværdier baggrundssubtraktion.\nFor hvert godt, opdele værdi baggrundssubtraktion YFP emission af værdi baggrundssubtraktion Luc emission for at give den ukorrigerede BRET forhold.\nGennemsnittet af ukorrigerede Bret nøgletal fra de tre brønde, der blev transficeret med kun pLuc-kontrol plasmid. Trække denne værdi fra alle de andre ikke-korrigerede Bret nøgletal til at give de korrigerede Bret nøgletal.\nFor hver af de resterende sæt af korrigerede Bret nøgletal gennemsnittet af værdierne fra de tre transficerede brønde for at opnå en endelig BRET forhold.\nPrincippet i BRET assay er illustreret i fig. 2. Assay opsætning anvendes i eksperimenterne præsenteret her er afbildet i fig. 3. Påvisningen af et stærkt BRET signal fra celler transfekteret med et luciferase-YFP fusionsprotein bekræftede, at energioverførsel var observerbare i denne forsøgsopstilling (figur 4).\nVores forskning fokuserer på den rolle, FOXP familien transkriptionelle repressorer i hjernens udvikling. Heterozygote mutationer påvirker FOXP2 føre til en sjælden form for tale-og sprogforstyrrelser, hvoraf det mest fremtrædende træk er udviklende verbal dyspraksi-vanskeligheder med at producere de komplekse sekvenser af orofocial muskelbevægelser kræves for tale 14-16 FOXP1 mutationer er blevet rapporteret hos patienter. med autismespektrumforstyrrelser og intellektuelle handicap ledsaget af svær tale-og sprogproblemer 17-20. Samspillet mellem FOXPs med andre proteiner bliver undersøgt at få indblik i de molekylære mekanismer, der er relevante for den rolle, som disse proteiner i hjernens udvikling.\nFOXP2 er kendt for at danne homo-eller heterodimerer med andre FOXP familiemedlemmer 21, derfor FOXP2 homodimerisering blev brugt til at validere BRET assay (figur 4). At udelukke muligheden for, at samspillet mellem FOXP2 fusionsproteiner i denne analyse skyldtes blot at proteinoverekspression blev specificiteten af interaktionen påvist ved at indføre en mutation i leucinzipperen dimeriseringsdomæne af FOXP2 (i-frame sletning af rest E400), som er kendt for at forstyrre homo-og heterodimerisering 21 (figur 5A). Når Luc-FOXP2.DE400 og YFP-FOXP2 fusionsproteiner var samudtrykt blev en reduktion i BRET observerede signal i forhold til da Luc-FOXP2 og YFP-FOXP2 var samudtrykt (figur 5B). Denne signal reduktion var ikke på grund af en ændring i den subcellulære lokalisering af det muterede protein (figur 5C), eller en forskel i ekspressionsniveauer vurderet ved Western blotting (data ikke vist). Reduktionen signal blev også observeret, når Luc-FOXP2 blev udtrykt med YFP-FOXP2.DE400 (data ikke vist). Således BRET er effektiv i forbindelse med afsløring protein homodimerisering, og samspillet mellem proteiner forbliver specifik, når disse proteiner overudtrykt som luciferase-og YFP-fusioner. Desuden er brugen af BRET i kombination med en målrettet mutation af proteiner har potentialet til at identificere individuelle rester, der er involveret i protein-protein interaktioner.\nFor at vurdere effektiviteten af BRET analysen i forbindelse med afsløring heterotypic interaktioner blev samspillet mellem FOXP2 med FOXP1 testes (figur 6). En BRET signal blev observeret i begge mulige konfigurationer af assayet (dvs. FOXP2 som donor eller acceptor fusion protein). Derfor BRET assayet er i stand til at påvise både homo-og heterotypiske interaktioner. Desuden blev egnethed BRET assay til påvisning af interaktion af FOXP2 med ikke-FOXP proteiner testes ved at undersøge interaktionen med CtBP1, en transkriptionel co-repressor og kendt FOXP2 interaktion partner 21. Samspillet mellem CtBP1 og FOXP2 blev oprindeligt foreslået af en gær to-hybrid skærm og blev efterfølgende valideret af co-immunpræcipitationseksperimenter 21. Den FOXP2-CtBP1 interaktion blev påvist ved BRET testen, når FOXP2 var donor fusionsproteinet og CtBP1 var acceptor, men ikke i den modsatte konfiguration (figur 7A). Sådanne resultater er kan forventes med det BRET systemet (se Diskussion afsnit). Samspillet mellem FOXP2 og CtBP1 blev observeret, selvom kun en mindre del af CtBP1 blev lokaliseret til kernen (figur 7B), fremhæver følsomheden af denne analyse. Således BRETAnalysen er nyttige for validering af formodede identificerede interaktioner gennem gær to-hybrid screening.\nEndelig blev BRET analysen ansat til at undersøge virkningerne af patogene mutationer i FOXP2 på protein-protein interaktioner. To punktmutationer i FOXP2 er blevet rapporteret at forårsage en sjælden autosomal dominant lidelse påvirker tale og sprog (figur 8A). Den R553H missense mutation blev opdaget ved en kobling studie i en stor familie, hvor halvdelen af medlemmerne blev ramt af lidelsen 14. Den R328X nonsense mutation blev opdaget gennem målrettet sekventering af FOXP2 locus i probander med en diagnose af udviklingsmæssig verbal dyspraksi 22. Evne mutantproteinerne at dimerisere med vildtype FOXP2 blev vurderet ved hjælp af BRET analysen. Resultaterne via vildtype FOXP2 som donor og mutant FOXP2 som acceptor er vist i figur 8B. De samme resultater blev observeret ved anvendelse af mutant FOXP2 som donor og vild-type som acceptor (data ikke vist). Den R553H mutation, hvilket er inden for DNA-bindende domæne af FOXP2, som ikke påvirker evnen af mutant protein til at dimerisere med vildtypen. Den patogene mekanisme af denne mutation kan derfor omfatte en dominerende negativ effekt som følge af dimerisering af mutanten med det normale protein 23. Den R328X mutation indfører en tidlig stopkodon, med det resultat, at det kodede protein mangler leucin-zipper-dimerisering domæne og det DNA-bindende domæne, og viser nogle cytoplasmatisk mislocalization (figur 8C). I overensstemmelse med fraværet af dimeriseringsdomænet og mislocalization til cytoplasmaet, viser det afkortede protein stærkt reduceret interaktion med vildtype FOXP2. Denne mutation er derfor sandsynligvis være patogene grundet haploinsufficiency. Således BRET analysen kan give indblik i de biologiske effekter af mutationer opdaget i patienter.\nFig. 1. Vektorer til ekspression af YFP-og luciferase-fusionsproteiner. A) Circle kort over de pYFP og pLuc vektorer. Den pLuc Vektoren anvendes til ekspression af luciferase fusionsproteiner som Bret donorer. Den pYFP Vektoren anvendes til ekspression af YFP fusionsproteiner som BRET acceptorer. Vektorer har en CMV-promotor (P CMV) til højniveau-ekspression i mammale celler, et multipelt kloningssted (MCS) til indsættelse af cDNA'er for proteiner af interesse, og et kanamycinresistensgen (Kan r) og bakterielt replikationsorigin til formering af plasmidet i bakterier. B) multipelt kloningssted af pLuc og pYFP vektorer. Den ende af kodende sekvens YFP er vist i blåt. Valgte restriktionssteder er kommenteret. Bemærk, at XbaI-sitet er blokeret af overlapping dæmning methylering i standard stammer af E. coli. cDNA'er, der koder for proteiner af interesse bør klonet i ramme med aminosyresekvensen vist. I forsøgene, der er beskrevet her, blev inserts klonet ind i BamHI-og Xbal-restriktionssites (understreget). Stop codoner er blevet fjernet fra enden af luciferase og YFP-kodende sekvenser til at give en åben læseramme, der omfatter luciferase / YFP og subklonet cDNA'et af interesse. Stop codoner er til stede ved slutningen af det multiple kloningssite i alle tre læserammer (vist i rødt), det er derfor ikke nødvendigt at medtage et stopcodon i det indsatte cDNA.\nFigur 2. Princip for BRET systemet. Proteiner af interesse, X og Y, er fusioneret til en donor luciferaseenzym (Luc topemission 475 nm) og en acceptor fluorescerende protein (YFP, peak emission 530 nm) hhv. Fusionsproteiner udtrykkes i dyrkede pattedyrceller og efter tilsætning af en celle-permeabel luciferasesubstrat, emission Luc måles under anvendelse af et filter blokerer bølgelængder længere end 470 nm og emission fra YFP måles med et 500-600 nm båndpasfilter. A) Ingen interaktion mellem protein X og protein Y. energi overførsel fra Luc til YFP ikke forekommer. B) Samspil mellem protein X og protein Y. resonans energi overførsel sker fra Luc til YFP forårsager en stigning i forholdet mellem emission målt ved hjælp af Den 500-600 nm båndpasfilter forhold til filteret blokerer bølgelængder længere end 470 nm.\nFigur 3.. Assay setup. Assay setup til at teste foren interaktion mellem to proteiner af interesse, X og Y. proteiner af interesse er smeltet til luciferase (Luc) som BRET donor og gult fluorescerende protein (YFP) som BRET acceptor. I kontrolgrupperne proteiner er Luc og YFP fusioneret til et peptid indeholdende en målrettet signal for den relevante subcellulært afsnit (P), hvis det er relevant. A) kontrol, der skal inkluderes i hver plade. 1) Mock-transfektion kontrol for at etablere baggrundsniveauer af luminescens og fluorescens som følge af luminometer støj og enzym-uafhængig opdeling af substrat; 2) pLuc-kontrol kun transfektion at fastslå andelen af luciferase emission, der er fundet inden emissionen vifte af YFP i mangel af en BRET acceptor; 3) Transfektion af pLuc-kontrol og pYFP-kontrol for at etablere baseline BRET signal som følge af Luc-YFP interaktion; 4) Transfektion af Luc-YFP fusion som en positiv kontrol for at sikre, at der kan måles en BRET signal. B) Sæt af experimENTAL betingelser for at teste for en interaktion mellem to proteiner af interesse, X og Y. 1, 2, 4, 5) Controls for ikke-specifik interaktion mellem proteiner af interesse og Luc / YFP; 3) Test tilstand med X som donor og Y som acceptor; 6) Test tilstand med Y som donor og X som acceptor.\nFig. 4. Påvisning af FOXP2 homodimerisering. A) at validere BRET assay til påvisning af FOXP2 homodimerer blev HEK293-celler transficeret med konstruktioner til ekspression af luciferase (donor) eller YFP (acceptor) fusioneret til enten FOXP2 (P2) eller et nukleart lokaliseringssignal (-). Det nukleare målrettet luciferase og YFP proteiner tjener som negative kontroller. Som en positiv kontrol til påvisning af en BRET signal blev cellerne også transficeret med en konstruktion til ekspression af et luciferase-YF. P fusionsprotein (+) B) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP fusioneret til et kernelokaliseringssignal (-) eller med YFP fusioneret til FOXP2 (P2).\nFigur 5.. Brug af dimerisering-mangel FOXP2 at demonstrere assay specificitet. A) Skematisk diagram af FOXP2 protein viser placeringen af den DE400 mutation, der forstyrrer dimerisering. Leucinzipperen dimeriseringsdomæne vises i grønt, og DNA-bindende domæne i gult. B) For at teste, om overekspression af proteiner kan føre til falsk-positive resultater i BRET assay blev specificiteten af analysen vurderet ved hjælp af FOXP2.DE400 variant. Celler blev transficeret med konstruktioner til ekspression af luciferase (donor) eller YFP (acceptor) fusioneret til FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) eller en nuclear lokaliseringssignal (-). C) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP fusioneret til FOXP2 (P2) eller FOXP2.DE400 (DE).\nFigur 6.. Påvisning af FOXP1-FOXP2 heterodimerisering. A) at validere BRET assay til påvisning af heterodimerisering mellem homologe proteiner FOXP2 og FOXP1 blev celler transficeret med konstruktioner til ekspression af luciferase (donor) eller YFP (acceptor) fusioneret til enten FOXP2 (P2), FOXP1 (P1) eller kernelokaliseringssignalet (-). B) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP fusioneret til FOXP1 (P1) eller FOXP2 (P2).\nB) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP fusioneret til CtBP1 (CtBP) eller FOXP2 (P2).\nFigur 8. Evaluering af virkningerne af patogene FOXP2 mutationer på protein-protein interaktioner. A) Skematisk diagram af FOXP2 protein viser placeringen af de R553H og R328X mutationer, der forårsager en sjælden form af tale og sprog uorden. Leucinzipperen dimeriseringsdomæne vises i grønt, og DNA-bindende domæne i gult. B) For at vurdere anvendeligheden af BRET analysen for at vurdere virkningen af patologiske mutationer på protein-protein interaktioner, virkningerne af R553H og R328X mutationer på evnen af mutant FOXP2 proteiner dimerisere med normal FOXP2 blev undersøgt. Celler blev transficeret med konstruktioner til ekspression af luciferase (donor) eller YFP (acceptor) fusioneret til enten normal FOXP2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), eller et nukleart lokaliseringssignal (-). C ) Fluorescens mikroskopi billeder af celler transficeret med YFP kondenseret til FOXP2.R553H (R553H), eller til FOXP2.R328X (R328X). I dette billede FOXP2.R328X overvejende nukleare, men i andre celler i populationen viser en mere cytoplasmatisk distribution.\nUdformningen af fusionsproteinekspression konstruktioner er et afgørende skridt i oprettelsen af BRET analysen. I eksperimenterne præsenteret her blev proteinerne af interesse fusioneret til den C-terminale ende af luciferase eller YFP. Det er også muligt, og kan være nødvendig for at smelte proteiner til den N-terminale ende af luciferase / YFP. For nogle proteiner kan fusioner kun blive accepteret på enten N-eller C-terminalen for at undgå forstyrrelse af proteiners struktur og funktion. Endvidere er det for transmembrane proteiner, hvor N og C termini er bosiddende i forskellige subcellulære rum, luciferase / YFP protein skal fusioneret til terminalen, som er i samme rum som samspillet partner. For eksempel, i studier af samspillet mellem transmembrane G-protein-koblede receptorer og cytoplasmatisk β-arrestin, blev luciferase fusioneret til den intracellulære carboxyl hale transmembranreceptor 8. I andre tilfælde geometrien af et protein-protein-interactiden kan føre til energioverførsel er mere effektive ved hjælp af en af de to mulige kombinationer af fusionsproteiner. Lejlighedsvis energioverførsel registreres muligvis ikke på alle, hvis du bruger kun én kombination, der fører til falsk negative resultater.\nSekvensen af peptidlinker mellem luciferase / YFP og proteinet af interesse, kan også påvirke effektiviteten af resonans energi overførsel. Linkeren bør være lang nok til at tillade luciferase / YFP og proteinet af interesse til at folde uden hindring. En længere linker vil give større fleksibilitet til polypeptid ved krydset mellem luciferase / YFP og det interessante protein, hvilket kan øge BRET effektivitet ved at lette tilpasning af donor-og acceptor dipoler. Dog BRET effektivitet kan falde, hvis der er for meget fleksibilitet i linker. I forsøgene her, kloning af proteiner af interesse ind i BamHI-og Xbal-stederne i udtrykket vectorer resulterede i en 23-aminosyre-linker, som vist i fig. 1. Denne linker har været vellykket til at detektere interaktioner mellem flere par af proteiner.\nInden vi går videre til Bret eksperimenter bør det sikres, at de fusionsproteiner bevarer normal biologisk aktivitet. Driften af YFP kan vurderes ved direkte visualisering under anvendelse af et fluorescensmikroskop. Driften af luciferase kan analyseres under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits. Virkningen af fusion af den subcellulære lokalisering af proteiner af interesse kan vurderes ved immunfarvning, eller i tilfælde af YFP-fusioner, ved direkte visualisering. Virkningen af fusion på funktionen af proteinet af interesse kan undersøges ved protein-specifikke assays - fx til en transkriptionsfaktor kan det være hensigtsmæssigt at analysere DNA-bindende aktivitet. Bemærk at luminescens målinger foretaget under eksperimentet giver praktisk i-assay confirmtion af luciferaseaktivitet.\nDet er vigtigt at overveje, hvad de relevante kontrolforanstaltninger konstruktioner er for din protein af interesse. YFP og luciferase er overvejende cytoplasmatisk og er derfor passende kontroller, når proteiner af interesse er cytoplasmisk. Men når proteinerne af interesse er lokaliseret til andre subcellulære afsnit kan det være ønskeligt at modificere luciferase og YFP med peptid-signaler til at styre deres handel til det relevante rum. Her proteinerne af interesse var transkriptionsfaktorer, som er lokaliseret til kernen derfor luciferase og YFP blev modificeret ved tilsætning af kernelokaliseringssignalet. Specifikt blev et peptid med kernelokaliseringssignalet af SV40 stort T-antigen (CGYGPKKKRKVGGLDN) føjet til C-terminalen af luciferase og YFP ved ligering af syntetiske dobbeltstrengede oligonukleotider mellem BamHI og XbaI-steder af the pLuc og pYFP vektorer. Tilsætning af dette signal forårsagede en signifikant omfordeling af protein til cellekernen (fig. 4B).\nHerunder passende kontrol er afgørende for fortolkningen af Bret eksperimenter. En mock-transfektion styring med et inaktivt fyldstof plasmid er vigtigt at etablere baggrundsniveauer af luminescens og fluorescens som følge af luminometer støj og enzym-uafhængig opdeling af substrat. Med moderne luminometre og luciferase substrater baggrund luminescens niveauer er typisk meget lavt. Transfektion med den passende kontrol luciferase konstruere i mangel af en YFP konstruktion er vigtigt at fastslå andelen af luciferase emission, der er fundet inden emissionen vifte af YFP i mangel af en BRET acceptor. Transfektion med kontrol luciferase og kontrol YFP konstruktionerne giver baseline BRET signal, der resulterer fra Luc-YFP interaktion. For every par af proteiner, der er testet for interaktion, er det vigtigt at transficere hver alene med passende kontrol-konstruktionen, som illustreret i figur 3B, for at kontrollere for ikke-specifik interaktion mellem proteinerne testes og luciferase / YFP. Især når du udfører en BRET eksperiment for første gang, er det vigtigt at medtage en Luc-YFP fusionsprotein som positiv kontrol for at sikre, at en BRET signal kan observeres i din forsøgsopstilling. Her den kodende sekvens af YFP blev klonet ind pLuc på Bam HI og Xba I-stederne for at generere et fusionsprotein, hvori YFP er fusioneret til den C-terminale ende af luciferase.\nI protokollen beskrevet her, sammensætningen af DNA blander til transfektion blev beregnet ud fra den antagelse, at den gennemsnitlige størrelse af Luc / YFP fusionsprotein ekspressionskonstruktioner ikke er større end 7,5 kb. Hvis udtrykket konstruktionts er væsentligt større end dette, så antallet af mol af hver ekspressionskonstruktion tilsat til Transfektionsblandingen muligvis nedsættes, således at den samlede mængde DNA i blandingen ikke overstiger den maksimalt tilladte af mængden af transfektionsreagens. Alternativt mængden af transfektionsreagens og mængden af DNA i alle transfektion blandinger kan øges i overensstemmelse med producentens retningslinjer. Eksperimentel manipulation af 96-brønds plader fremskyndes ved anvendelse af multikanal pipetter og aspiratorer. Det er ønskeligt at minimere variationen mellem prøver i længden af Transfektionsblandingen inkubationstid efter tilsætning af DNA til serum-frit medium / transfektion reagensblanding derfor begynde at tilføje transfektion blander celler, så snart den første blanding er inkubering i 10 minutter . Fordi BRET acceptor proteiner er YFP-fusioner, er det muligt at vurdere transfektionseffektivitet ved fluorescensmikroskopi eller ved måling af fluorescens i en mikroplade reAder. Succes for en BRET eksperiment afhænger af et godt niveau af transfektion så det er tilrådeligt at sikre, at transfektion er tilfredsstillende, før du fortsætter til tilsætning af substrat og måling af BRET signal. YFP tag muliggør også kvantificering af acceptor-protein-ekspressionsniveauer ved anvendelse af en mikropladelæser. Kvantificering af acceptor protein niveauer kan være nyttige for optimering og fejlfinding af Bret eksperimenter.\nCellerne inkuberes i mindst 2 timer med luciferasesubstrat før måling af BRET signal for at sikre, at et stabilt signal er opnået. Det er også acceptabelt at inkubere cellerne med substrat for op til 24 timer. I dette tilfælde totalluminescens tæller vil være lavere, men BRET forhold bør være uændret. Længere inkubationer med substrat kan være mere bekvemt (fx natten over), og også tillader måling af Bret signaler før og efter en eksperimentel manipulation sådansom tilsætning af en farmaceutisk forbindelse. Ideelt optimere celle podningstæthed således at cellerne når konfluens omkring tidspunktet for målingen. Hvis celletæthed er over optimal så kan det være fordelagtigt at måle BRET signal på et tidligere tidspunkt for at undgå celle overvækst. Hvis du bruger en celletype andet end HEK293, skal du sørge for at optimere cellekultur og transfektion forhold. BRET eksperimenter er også blevet udført i HeLa-celler under anvendelse af protokollen beskrevet her.\nI forsøgene, der er beskrevet her, blev luminescens tællinger målt ved stuetemperatur, hvilket er den optimale temperatur for Renilla-luciferase-aktivitet. Hvis der udføres et tidsforløb eksperiment i luminometeret foretrækkes det at indstille temperaturen ved 37 ° C. Vi har udført samme eksperimenter ved stuetemperatur og ved 37 ° C og ingen signifikant forskel i resultaterne blev observeret. Hvis der udføres forsøg ved stuetemperatur the plade bør have lov til at ækvilibrere 10 min inde i luminometeret før målingen for at muliggøre stabilisering af Renilla-luciferase-aktivitet. Her blev luminescens signaler integreret over 10 sekunder, hvilket typisk giver høj følsomhed, især for proteiner med lave ekspressionsniveauer. Dog kan signaler integreres over kortere perioder, hvis det giver tilstrækkelig følsomhed. På grund af stabiliteten af luminescenssignal produceret af live-cell luciferasesubstrat, er det acceptabelt at måle op til 10 sek per brønd ved hver bølgelængde.\nEn interaktion mellem to proteiner af interesse bekræftes af BRET analysen, når signalet fra testbetingelsen overstiger signalerne fra de relevante kontrol-betingelser markant. Fraværet af et BRET signal er ikke nødvendigvis bekræftelse af, at en interaktion ikke forekommer. I tilfælde af en uventet eller negativt resultat, totalluminescens og fluorescererNCE tæller bør undersøges for at sikre, at alle brønde blev transficeret korrekt.\nDen BRET signalet påvirkes også af forholdet mellem protein udtryk niveauer derfor er det nyttigt at undersøge de relative ekspressionsniveauer for de to proteiner af interesse ved at sammenligne fluorescens tæller fra brønde transficeret med YFP fusioner af de to proteiner (eller luminescens tællinger fra brønde transficeret med luciferase fusioner). Når et fusionsprotein udtrykker stærkere end den anden, sandsynligvis vil blive opnået, hvis proteinet med den lavere ekspressionsniveau er fusioneret til luciferase, som det var tilfældet med FOXP2 og CtBP1 i eksperimenterne præsenteret her bedre resultater. Det er også muligt at manipulere proteinniveauer ved justering af molforholdet af ekspressionsplasmider i transfektion mix. Energioverførsel mellem visse par af fusionsproteiner kan være meget ineffektive på grund af geometrien af det protein-kompleks. I et sådanttilfælde kan det være umagen værd at forsøge at sammensmelte de proteiner, af interesse for alternative termini af luciferase / YFP.\nDet er nødvendigt at bekræfte, at BRET signalet repræsenterer en fysiologisk protein-protein interaktion og er ikke blot på grund af protein overekspression. Af denne grund er det vigtigt at undgå grov overekspression af proteiner. Specificitet af et protein-protein-interaktion i BRET systemet kan yderligere bekræftes ved at indføre mutationer i de proteiner, der er kendt for at reducere affiniteten af interaktion, som påvist her ved hjælp af DE400 variant af FOXP2. De mutante proteiner kan endvidere anvendes i konkurrence og mætningsbinding Bret assays. I et kompetitivt assay, holdes konstante koncentrationer af donoren og acceptoren fusionsproteiner samtidig øge koncentrationen af et ukodet version af et af de interaktionspartnere som en konkurrent. Untagged vildtypeprotein skal konkurrere med den mærkede vertering for binding til dens interaktion partner, hvilket resulterer i et fald i BRET signalet, mens mutant protein bør udvise en reduceret evne til at konkurrere ud interaktionen. I en mætning bindingsassay koncentrationen af donor fusionsprotein holdes konstant, og samtidig øge koncentrationen af acceptoren. For en specifik interaktion BRET signalet med tiden skal plateau som alle donor molekyler bliver mættet med acceptor. For en ikke-specifik interaktion, vil BRET signalet typisk viser en lille lineær stigning skyldes en stigning i tilfældige kollisioner mellem donor-og acceptor-molekyler. I praksis for interaktioner af moderat affinitet mellem opløselige proteiner, kan det være vanskeligt at opnå en tilstrækkelig høj acceptor: donor-forholdet for at observere mætning samtidig opretholde tilstrækkelige niveauer af donor protein til påvisning signal.\nDer bør udvises forsigtighed i fortolkningen af differences mellem Bret nøgletal. Den BRET analysen ikke giver en kvantitativ måling af affinitet af et protein-protein interaktioner, fordi effektiviteten af energioverførsel påvirkes af andre end styrken af interaktionen protein-protein faktorer. Sådanne faktorer omfatter forholdet mellem niveauerne af fusionsproteinerne i cellen, geometri interaktion, og satserne for association og dissociation af komplekset. Forholdene opnået med to forskellige par af proteiner kan derfor ikke nødvendigvis sammenlignes, men sammenligninger kan være muligt mellem de forskellige varianter af det samme protein, såsom med vildtype-og ΔE400 varianter af FOXP2 vist her. Indimellem kan en anelse negativ Bret nøgletal overholdes. Negative nøgletal kan skyldes fejl i måling af baseline-forholdet i celler transficeret med kun pLuc-kontrol vektor. Meget høje forhold er ofte tegn på proteinaggregering, hvilket kan bekræftes ved observation af transficerede ceLLS med et fluorescensmikroskop. Det bør bestemmes, hvis sammenlægning er biologisk relevant eller en artefakt af protein overekspression.\nAfslutningsvis BRET assayet beskrevet her er en kraftfuld metode til at undersøge protein-protein interaktioner i levende celler. Anvendelsen af BRET er påvist med henblik på validering interaktionskandidater fra proteom screening undersøgelser, identificere specifikke rester involveret i protein-protein interaktioner, og evaluere virkningerne af mutationer findes i patientens DNA. Fordi interaktioner detekteres i realtid uden kravet om cellelysis kan måles BRET signal før og efter en behandling, såsom tilføjelse af en farmaceutisk forbindelse eller ligand 7. Den BRET analysen viser meget lovende til brug i funktionelle genomforskning for at vurdere den biologiske relevans af genetiske varianter opdaget gennem næste generation sekventering.\nDette arbejde blev støttet af Max Planck Society.


Kapitalismen vil trække kvinder opad | Djøfbladet\nKapitalismen har et godt øje for, hvor den dygtigste humankapital befinder sig – og kvinders stadig stigende forspring i uddannelsesniveau vil derfor også hjælpe dem opad i hierarkierne i de kommende år, vurderer Claus Holm fra DPU. Foto: Olga Otto/Shutterstock\nTendensen til, at pigerne overgår drengene i uddannelsessystemet, er stærkere end nogensinde. Samme trend er ikke slået igennem på arbejdsmarkedet – men det er formentlig et spørgsmål om tid, forudser Claus Holm, leder af Danmarks institut for Pædagogik og Uddannelse.\nAt piger klarer sig bedre i skolen end drenge, er ingen nyhed. Sådan har det været i årtier.\nMen tendensen og kønsforskellen forandres og forstærkes i de her år, og mit bud er, at det vil få konsekvenser på arbejdsmarkedet.\nHistorisk har tendensen været, at pigerne klarede sig bogligt bedre end drengene i grundskolen. Men der har også været en tendens til, at forskellen blev udjævnet i løbet af ungdomsuddannelserne og de videregående uddannelser. Dels dalede pigernes ambitioner i de højere klasser og på ungdomsuddannelserne, og dels blev drengene med alderen mere selvsikre og ambitiøse.\nDet er under forandring. Der er en tydelig og stadig kraftigere tendens til, at pigernes ambitioner holder længere, og at de bliver mere selvsikre. I dag klarer pigerne sig også bedst på både ungdomsuddannelserne og på de videregående uddannelser. Aldrig har uddannelsessystemet uddannet så mange dygtige kvinder i forhold til mænd som i dag. Og kløften vokser.\nSlut med Paula-princippet?\nEn klassisk kliché er, at det er kvindernes uddannelsessystem, men mændenes arbejdsmarked. Det tror jeg vil forandre sig. Spørgsmålet er, hvornår det sker og hvordan. Hvornår går tendensen populært sagt ud af skolen og ind på arbejdsmarkedet?\nManglende ligestilling på arbejdsmarkedet er og har i årtier været et strukturelt problem, som er særdeles sejlivet at bekæmpe. Topstillingerne og de højtlønnede jobs går mere til mænd end til kvinder, og der er stadig ikke lige løn for lige arbejde.\nÉn ting er, at Brian Mikkelsen prøver at friste kvinderne med bedre barselsordninger. Noget andet, og mindst lige så vigtigt, er, hvordan kvinderne vil bruge deres historisk stærke position\nDer er profit i at få flere kvinder i ledelse\nDet handler om strukturer og traditioner i samfundet, i erhvervslivet og på arbejdsmarkedet. Barselsorlov er et ofte brugt og ganske sigende eksempel – det er stadig sådan, at kvinder tager ’børnestraffen’ og altså mest barselsorlov, mens mændene i højere grad går under radaren. Og så handler det yderligere om det såkaldte 'Paula-princip'. Det dækker kort fortalt over, at kvinder karrieremæssigt går et skridt kortere, end deres kvalifikationer rækker til, mens mændene går et skridt længere – dokumenteret og beskrevet af den britiske professor Tom Schuller.\nSpørgsmålet er nu, om Paula-princippet overlever det stadig større uddannelsesgab i kvindernes favør. Og her tænker jeg ikke primært på, om kvinderne vil udfordre strukturerne hårdere end i dag, eller om politikerne griber mere resolut fat om ligestillingsdagsordenen.\nBegge dele er selvfølgelig tænkeligt. Men balancen kan lige så godt tippe et helt andet sted. Det er kapitalismen, jeg har i tankerne.\nKapitalismen er i princippet kønsblind, og det vil være en illusion at tro, at kapitalismen vil tage en helhjertet kønskamp for kvindernes skyld. Men den vil sikkert gerne tage kampen for profittens skyld. Kapitalismen har historisk haft et godt øje for, hvor den dygtigste humankapital befinder sig – for det er her, der er flest penge at hente.\nI takt med at kvinderne så markant, som det sker nu, overhaler mændene uddannelsesmæssigt, så er mit bud, at kapitalismen før eller siden vil udfordre Paula-princippet. Altså efterspørge kvinderne – måske så meget, at lønningerne vil følge med, og det vil blive stadig sværere for kvinderne at modstå presset.\nEt spirende tegn ses netop på det førnævnte barselsområde. Brian Mikkelsen, der er direktør for Dansk Erhverv, har tidligere i år aktivt bakket op om øremærket barsel til mænd – stik modsat af, hvad han mente som konservativ politiker. Han argumenterer direkte for holdningsskiftet med, at det handler om virksomhedernes (kapitalens) behov for at få flere kvinder ind i ledelserne.\nMeget tyder altså på, at markedskræfterne kan fremme ligestilling på arbejdsmarkedet. Ikke af kønspolitiske årsager, men af profit-årsager.\nGrib chancen – og tilpas topstillingerne\nMen én ting er, at Brian Mikkelsen prøver at friste kvinderne med bedre barselsordninger. Noget andet, og mindst lige så vigtigt, er, hvordan kvinderne vil bruge deres historisk stærke position.\nHvad vil de historisk mange dygtige unge kvinder bruge deres stadig større valgfrihed til?\nSamme Tom Schuller, som har formuleret Paula-princippet, har undret sig over, at kvinderne i netop de skandinaviske lande ikke er længere fremme: For hvis der er noget sted på jorden, hvor kvinder skulle have frihed til at vælge, hvor, hvordan og på hvilket niveau de vil arbejde, så skulle man tro, det var i de skandinaviske lande. Men de vælger meget traditionelt. Faktisk overraskende traditionelt i sammenligning med lande, hvor der er et mindre moderne blik på kvinders rolle som fx Italien eller Japan, konstaterer Tom Schuller i bogen 'The Paula Principle' fra 2017.\nSå hvad kommer til at ske?\nDet er nyt, at Brian Mikkelsen og erhvervslivet, som han repræsenterer, vil kæmpe for øremærket barsel, og for at kvinderne bruger deres frie valg til at tage topstillingerne. Men det er langtfra nok, og ligestillingskampen vil helt sikkert fortsætte. Der er stadig lang vej hjem.\nMin opfordring er derfor ikke, at kvinderne (og de af os mænd, der opfatter os som feminister) skal kravle ned fra barrikaderne og opgive den mere strukturelle kønskamp.\nMin opfordring er, at kvinderne parallelt med den klassiske kønskamp griber den historiske mulighed og tager chancen – og ansvaret – for ikke alene at tage, men også at forme topstillingerne, så de lader sig forene med et rigt liv – personligt, familiært og arbejdsmæssigt.\nLeo Tolstoj har engang sagt, at man lever et aldeles fremragende liv, hvis man forstår sig på at arbejde og elske: Arbejd for den person, du elsker, og elsk dit arbejde!\nEn idé om chefer som livsduelige personer, der er i stand til at leve et samlet berigende arbejds- og familieliv, vil være et attraktivt ideal for mange – også for kvinder med den humankapital, Brian Mikkelsen gerne ser i topstillingerne.\nClaus Holm er ph.d., lektor og leder af Danmarks institut for Pædagogik og Uddannelse ved Aarhus Universitet.


• Køb Tagplader B7 fra de bedste danske webshops – Klik her\nEn stor portion e-forhandlere giver i vore dage alverdens billige former for levering til tagplader b7. En favorit er nu om dage at afsende til en pakkeshop, og så kan du blot gå forbi efter din bestilling lige når det passer dig. Fragtløsningen er altså særligt nem, samt mange gange desuden den mindst kostelige leveringstype.\nDu kan på samme måde forsøge at få ordren bragt til din lejlighed eller ud til dit arbejde. Leveringsmetoden viser sig godt nok en tak mere bekostelig, men desuden vældig ligetil for tagplader b7 online. Den mest prisbevidste leveringsversion vil dog til enhver tid være at hente ordren selv, men den løsning forudsætter at du opholder dig nær online shoppens byggemarked, fx Harald Nyborg, Silvan, Bauhaus eller Jem og Fix.\nLeveringshastigheden på tagplader b7 er naturligvis temmelig væsentlig i tilfælde af at vi skal bruge varen inden for kort tid, og af den grund er det rimelig klogt at du ser nærmere på den estimerede leveringsdato på tagplader b7. En stor portion online firmaer – fx Silvan, Jem og Fix, Bauhaus og Harald Nyborg – reklamerer med billig levering på blot en enkelt hverdag på deres favorit varenumre online, som imidlertid afhænger af at orden realiseres forud for et konkret klokkeslæt, med det formål at de har mulighed for at nå at få dit nye produkt ekspederet forinden medarbejderne har fri.\nIndtil flere internet virksomheder yder gebyrfri levering på tagplader b7 online, men tit forudsætter det at der købes for et konkret beløb. Som alternativ kan man gribe den mest letkøbte fragtløsning, der typisk vil være at få fragtmanden til at køre dine produkter til en pakkeshop.\nEn lang række netbutikker tildeler klik-og-hent hvor du køber billig tagplader b7 derhjemme men selv henter i byggecenteret. Eksempelvis Harald Nyborg, Jem og Fix, Davidsen, Stark, Silvan, Bygma, Bauhaus, 10-4 og XL-Byg. Byggecentrene udlover for eksempel klik-og-hent på tagplader b7 i følgende områder:\nDragør, Albertslund, Thisted, Højbjerg, København, Viborg, Brøndby, Ballerup, Hillerød, Kolding, Hedensted, Skanderborg, Herning, Næstved, Lillerød, Aarhus, Kalundborg, Nakskov, Aalborg, Solrød Strand, Odense, Farum, Vallensbæk, Frederiksværk, Silkeborg, Jyllinge, Holstebro, Randers, Middelfart, Brabrand, Frederiksberg, Virum, Værløse, Roskilde, Glostrup, Hvidovre, Nærum, Holbæk, Odder, Nykøbing Falster, Risskov, Varde, Birkerød, Vordingborg, Lystrup, Tårnby, Fredericia, Grenaa, Ikast, Vejle, Frederikssund, Esbjerg, Allerød, Rønne, Lyngby, Kokkedal, Haderslev, Svendborg, Slagelse, Ølstykke, Herlev, Åbyhøj, Charlottenlund, Valby, Brønshøj, Gladsaxe, Hobro, Aabenraa, Struer, Skive, Korsør, Brønderslev, Tilst, Helsingør, Gentofte, Hjørring, Køge, Ishøj, Nørresundby, Rødovre, Nyborg, Greve, Hørsholm, Stenløse, Vanløse, Hedehusene, Søborg, Frederikshavn, Sønderborg, Haslev, Horsens, Ringsted, Taastrup, og Rudersdal, .\nAfhentning af tagplader b7 er en mulighed i alle dele af Danmark: Sjælland (Bornholm, Sydsjælland, Hovedstaden, Falster, Amager, Vestsjælland, Østsjælland, Nordsjælland, Midtsjælland, Lolland), Jylland (Østjylland, Sønderjylland, Vestjylland, Sydjylland, Syddanmark, Midtjylland, Nordjylland) og Fyn (Nordfyn, Sydfyn, Vestfyn, Østfyn, Midtfyn).\nSes der på tendenserne fremstår det klart, at online shoppere mange gange efterspørger eksempelvis køb tagplader b7 og billig tagplader b7. Vi ser derudover tit mennesker kigge efter eksempelvis tagplader b7 online, tagplader b7 priser og tagplader b7 tilbud, plus de velkendte byggemarkeder som Bauhaus, Harald Nyborg, Davidsen, Stark, Bygma, 10-4, XL-Byg, Silvan og Jem og Fix.\nRabat på tagplader b7\nDet er i dag super smart for almindelige dødelige at sammenligne tilbud på billige tagplader b7 online fra diverse e-handler, og ergo har massevis af online varehuse været presset til at at stampe priserne på tagplader b7 markant, og i øvrigt byde på fragtfri levering.\nDet kan dog til hver en tid vise sig rentabelt at analysere diverse internet butikker efter billige priser på tagplader b7 online forud for at du bestiller, så man er usvigeligt sikker på at modtage den mest billige pris. Se ikke bare hos de udbredte byggemarkeder som Bygma, Davidsen, Silvan, 10-4, XL-Byg, Bauhaus, Jem og Fix og Harald Nyborg.\nMan bør bare være så påvagt, at når en e-butik frembyder billige tagplader b7 online til en pris som virker ufattelig overkommelig, så er det for det meste være et faresignal om en falsk internet forhandler. Kortbestillinger er i hvert fald omfattet af et regulativ, der beskytter dig som kunde imod uærlige internet handler.\nGenerelt slår vi et slag for kortbestillinger eller betalinger med mobilen. Alternativt burde du vælge en billig afdragsordning som f.eks. ViaBill, ifald du foretrækker at afbetale omkostningerne til tagplader b7 af flere omgange. Det fås normalt i niche webshops, i modsætning til de udbredte byggekæder som for eksempel Davidsen, Bauhaus, Harald Nyborg, Stark, XL-Byg, Jem og Fix, 10-4 og Bygma.\nVed indkig i tendenserne bliver det klart, at internet shoppere typisk kigger efter fx køb tagplader b7 og billig tagplader b7. Man ser derudover typisk folk søge fx tagplader b7 tilbud, tagplader b7 online samt tagplader b7 priser.\nTrustpilot frembyder fuldstændig anstændige løsninger til at betragte adskillige tidligere køberes vurderinger og af den grund tilråder vi, at du iagttager internet selskabets omtaler forinden du shopper billige tagplader b7 online.\nFacebook bringer dig på samme måde stort set passelige løsninger til at få indblik i e-butikkens popularitet. Herinde ses faktisk internet shops hvor du kan give en bedømmelse af virksomhedens service, hvilket tillige burde bruges til afvejning af tilfredsheden hos kunderne.\nForinden nogen bestiller billige tagplader b7 online hos en e-butik behøver man i virkeligheden gennemløbe virksomhedens vilkår, dog er det tit et tidskrævende arbejde, særligt på de udbredte byggekæder som 10-4, Bauhaus, Stark, Jem og Fix, Harald Nyborg, Silvan, XL-Byg, Davidsen og Bygma.\nEn anden mulighed kunne være at se om e-forhandleren er e-mærke godkendt, som kan være et sympol på at online butikken forsvarer de officielle danske regler, tillige med at butikken tit ses til af specialister som har megen viden om lovene på området.\nDet er en rigtig god anledning til at få assistance, for så vidt du forvoldes udfordringer ved din ordre på tagplader b7. I øvrigt støtter vi at køber er opmærksom på de mest aktuelle betingelser der er gældende for købet af tagplader b7 online, som eksempelvis hvilken ombytningspolitik e-handlen anvender.\nI den relation er det virkelig vigtigt, at man permanent bevarer sin e-mail kvittering, således man fremadrettet vil kunne påvise sit køb af tagplader b7, hvad end man har handlet fra Davidsen, Stark, Bauhaus, XL-Byg, Bygma, Harald Nyborg, 10-4, Silvan eller Jem og Fix.


Sejl og æd - SNV.DK\nTorsdag den 18. august afholdte vi i sejl og studer opstartsarrangementet ”Sejl og æd”\nDet var et arrangement vi holdte, med henblik på at få nogle nye sejle, samt at markere sæsonens start. Vi havde derfor udvidet den traditionelle torsdagssejlads til dobbelt så mange deltagere og tid til hygge og spisning bagefter.\nVi havde 28 deltagere, hvilket var super succesfuldt, da vi så havde nået vores grænse for deltagere! Vi lavede så en kort turnering hvor vi havde fordelt alle på 4 hold, og så skiftede mellem at være i en gummibåd og være på match racerne. Vi sejlede på en standard op-ned bane, som vi kort forklarede for alle deltagere inden sejladserne startede.\nVi kom på vandet og alle fik prøvet kræfter med at begå sig på en båd. Efter cirka to timers god og hyggelig sejlads (hvor vi også fik sejlet en kort finale), sejlede vi ind og blev mødt af Carsten Lauridsen og Claus Seierup fra SDE, som stod klar med grillede pølser og brød.\nDette var super hyggeligt, da alle fik en chance for at lære nye mennesker at kende, og det var samvær på en lidt anden måde end de traditionelle torsdagssejladser.\nMed en så succesfuld opstart på sæsonen, kan resten kun blive godt! Vi sejler fortsat hver torsdag fra 15:45 til 18:30, hvor alle der går på Rosborg Gymnasium og HF, HTX eller SDE er meget velkomne. Det kræver ingen tidligere sejlererfaring, og så er det også gratis.\nSejl og studer Vejle har også en facebookgruppe, hvor man kan tilmelde sig til torsdagssejlads – hvis du har spørgsmål, er du altid velkommen til at skrive til arrangøren af en torsdagssejlads-begivenhed.\nYoungsters stævne i Sletten — Fredag den 21. august kørte vi fra Vejle for at deltage i d [...]


Selvom der er mange gode anledninger til at komme ud i naturen, kan der nogle gange være behov for et par hyggelige timer indenfor. Men hvis du har børn, er det måske ikke altid lige let at finde på indendørs underholdning. Her får du 12 forslag til hyggelige indendørsaktiviteter.\n1. Gør skrald til skatte\nToiletrullerne kan laves til små, sjove figurer, hvis I tegner tøj og klistrer øjne, hår og hatte på dem – eller de kan klistres sammen to og to, dekoreres og få sat snor i, så de fungerer som kikkerter. Syltetøjsglassene kan I lave til flotte vaser eller lysestager ved at male eller découpere dem med gamle servietter eller flotte blade. Bunden af mælkekartonerne kan I klippe af og dekorere, og så kan I så karse i dem. Korkpropperne kan sættes sammen med tandstikker til små dyr, ligesom man gør med kastanjedyr. Og de tomme dåser kan beklædes med flot papir og bruges til blyantholdere på skrivebordet.\n2. Styrk krop og sind\nRul nogle måtter, tæpper eller håndklæder ud på stuegulvet, og lav en halv times yoga sammen, mens I lytter til rolig musik. Måske kender I ikke nogen officielle yogaøvelser eller -stillinger, eller kender deres navne på sanskrit, men det er ligegyldigt. Prøv jer frem, og mærk efter, hvad der føles rart for jer. Og slut så af med et par minutter, hvor I bare ligger på ryggen med lukkede øjne, lytter til musikken og har fokus på jeres vejrtrækning.\n3. Tag naturen med indenfor\n5. Ryd op i skuffer og skabe\nSelvom oprydning måske ikke er det ord, der resonerer bedst hos børn, kan oprydning faktisk gøres til en ganske hyggelig aktivitet sammen som familie. Hvis I har god tid på en grå regnvejrsdag, kan I sætte god musik på anlægget og sammen gennemgå skuffer, skabe og hengemte kasser.\n7. Inddrag børnene i køkkenet\nPrioriter at bruge lidt ekstra tid i køkkenet, når du har mulighed for det – og inddrag gerne dit barn i madlavningen. Mindre børn kan sagtens hjælpe med at blande salaten i skålen, forme boller, pynte kage eller dække bord. Det vigtige er, at de får en følelse af at hjælpe til i familien. Og når de hjælper til i køkkenet, føler de tit også større ansvar for maden – og dermed øges nysgerrigheden, og kræsenheden falder.\n8. Tag på biblioteket\n9. Lav fine fotobøger\nDer findes mange hjemmesider, der tilbyder fotobogsløsninger – og det er faktisk muligt at få en fotobog, der er trykt på et svanemærket trykkeri, nemlig gennem firmaet FotoSjov.dk, som får sine fotobøger produceret hos LaserTryk.dk. På et svanemærket trykkeri er der bl.a. skrappe krav til de kemikalier, som trykkeriet bruger, og til det papir, der bliver brugt.\nPodcasts har mange af de samme gode egenskaber som bøger. Du kan fordybe dig i spændende historier, blive klogere på et specifikt emne eller bare lade dig underholde af et hyggeligt sludreprogram. Og fordi, du hverken skal bruge øjnene til at læse eller hænderne til at bladre, giver podcasts dig mulighed for enten at lukke øjnene og slappe helt af, imens du lytter – eller du kan lytte, mens du bruger dine hænder til noget andet, såsom at strikke, rydde op eller lave mad.\n11. Brug tid på velvære\nI de fleste børnefamilier er hverdagen travl og til tider stressende. Og det kan være svært at få klemt selvpleje og velvære ind mellem madpakker, møder og myldretid. Det vigtigste udgangspunkt for velvære er din søvn, din kost og din krop: sørg for at få nok søvn, sund og varieret kost, frisk luft samt rigelig motion. Men i din ferie eller weekend, hvor du har ekstra tid, kan du give den et ekstra nøk op på velvære-skalaen og lave en hyggelig hjemmespa på en regnvejrsdag. I artiklen her får du fem trin, som du kan følge, for at lave en lækker hjemmespa.\nHar du børn, kan du twiste konceptet og forkæle familiens yngste med en børne-spa. Du kan fx servere en sund smoothie til dem, som de kan nyde, mens de lytter til rolig musik og slapper af i deres badekåber. Det kan også være, at de gerne vil have forkælet fødderne med et fodbad og lidt fodmassage. Har du børn med langt hår, kan en del af forkælelsen være opsætning af håret, mens de fleste børn nok vil nyde lidt forsigtig hovedbundsmassage.\n12. Gør hovedrent\nVi danskere opholder os typisk i hjemmet i 12-15 timer i døgnet, og derfor har indeklimaet i vores hjem stor betydning for vores ve og vel. Et dårligt indeklima kan bl.a. medføre træthed, hovedpine og irritation af slimhinder i næse, øjne, svælg og luftveje – og det kan også være årsag til eller forværre alvorlige sygdomme. Der er heldigvis flere ting, man kan gøre for at skabe et sundere indeklima – og noget af det kan man sagtens gøre sammen som familie, nemlig rengøring.\nDer er nok andre ting, dine børn har mere lyst til at lave, end at hjælpe til med hovedrengøringen. Men det er vigtigt at lære sine børn, at det er vigtigt at holde hjemmet rent. Ikke bare fordi, at rengøring gør hjemmet pænere at se på – men også fordi, at det bliver sundere at være i. Så i stedet for at betragte rengøringen som en sur pligt, kan I prøve at gøre det til et sjovt projekt, hvor alle får tildelt opgaver. Sæt noget musik på anlægget, som I alle kan lide, og kom i sving. Som ekstra motivation kan I måske aftale, at I fejrer den færdige rengøring med en god middag eller en filmaften.\nLæs også: 6 tips til hovedrengøringen\nTip: Husk, at det også har sin charme at gå en tur, selv om det regner eller er koldt. Fx bliver naturen en fantastisk oplevelse for lugtesansen, når det regner, og børnene vil sikkert synes, at det er sjovt at se de mange snegle, der myldrer frem. Så tag fornuftigt tøj og gummistøvler på, og tag familien med ud i regnvejret.


Transportfirma har brugt finanskrisen til at opruste | DHL Danmark\nPressemeddelelse - 1 Maj 2012 15:00\nTransportfirma har brugt finanskrisen til at opruste\nVallensbæk d. 1. maj 2012: “Vi havde frygtet, at finanskrisen ville blive værre for os end det heldigvis har været tilfældet. Derfor har vi i stedet kunne koncentrere os om at styrke vores position yderligere til efter krisen. Det er der, markedet nu befinder sig efter vores opfattelse og vi ønsker at være virksomhedernes foretrukne kurer,” siger adm. direktør Claus Lassen fra DHL.\nI Danmark voksede DHL Express’ omsætning i 2011 med hele 9%. Derfor var det også muligt at investere i både en ny terminal i Kastrup lufthavn og i en Boing 757, der i dag flyver mellem Billund og Leipzig hver dag.\nDet er dog ikke kun i Danmark, at DHL Express har investeret millioner af kroner i infrastrukturen og den vigtige luftfart. DHL Express har netop etableret en ny flyrute, der forbinder hele verden. Ruten forbinder transportfirmaets strategiske hubs i Hong Kong, Los Angeles og Leipzig. Det betyder I mange tilfælde, at kunder i mange asiatiske storbyer kan sende varer til det vestlige USA og Canada én dag hurtigere end normalt. Det gavner dermed også danske virksomheders konkurrenceevne, fordi den nye direkte fragtrute fra Los Angeles til Leipzig og derfra til Danmark betyder hurtigere leverancer.\n“Når man én gang har prøvet at stå med en forsendelse i hånden, der blot et par dage før er sendt fra den anden side af jorden, så forstår man væsentligheden af en infrastruktur, hvor alt klapper,” siger Claus Lassen.\nMindre lagerbinding og hurtigere leverancer\nDHL Express investerer i år omkring 300 mill kroner i deres Americas hub i Cincinnati/Northern Kentucky lufthavnen, der samler nord- og latinamerikanske forsendelser for at sende dem videre ud i verden. Der bliver tale om en helt nyt sorteringsanlæg i en 18.000 m2 stor ny hal. De mere end 2.000 medarbejdere her håndterer alene to millioner internationale forsendelser hver eneste måned, hvoraf en stor del går til Europa.\nDHL Express’ investeringer i infrastrukturen sker på et tidspunkt, hvor kundernes behov har ændret sig som følge af finanskrisen.\n“Virksomhederne ønsker at blive endnu mere konkurrencedygtige her på bagkant af krisen. Jo hurtigere og billigere, de kan få varer fra udlandet, jo mindre lager behøver de. Dermed kan virksomhederne i større grad bruge deres kapital til at investere i markedsføring og salgsaktiviteter end i varer, der ligger på lageret,” siger Claus Lassen.\nLæs mere om DHL Express\nDHL er den globale markedsleder inden for logistik industrien og “The Logistics company for the world” . DHL tilbyder sin ekspertise inden for international ekspres, luft-og søfragt, vej-og jernbanetransport, kontrakt logistik og international post-tjenester til sine kunder. Et globalt netværk bestående af mere end 220 lande og territorier og omkring 275,000 ansatte verden over tilbyder kunderne enestående kvalitet og service samt lokal kendskab der opfylder kundernes krav til logistikleverandør. DHL accepterer dets sociale ansvar ved at støtte klimabeskyttelse, katastrofehåndtering og uddannelse.\nDHL er en del af Deutsche Post DHL. Koncernens omsætning var på mere end 53 milliarder euro i 2011.\nFor mere information: www.dp-dhl.com eller www.dhl.dk\nClaus Lassen - Tidligere administrerende direktør, DHL Express\nStørrelse: 4992 x 6666, 14,2 MB\nStørrelse: 4992 x 6666, 15,8 MB\nStørrelse: 6666 x 4992, 18,8 MB\nStørrelse: 6666 x 4992, 18,2 MB\nStørrelse: 4992 x 6666, 20,4 MB\nDHL - The International Specialists


Flere personer er onsdag aften kommet alvorligt til skade i en trafikulykke i Odense. Like animeclub.co på Facebook. To biler er kørt sammen i krydset ved. nov En årig mand fra Horsens egnen er blevet anholdt for voldtægter mod prostituerede i Århus og Nordjylland. okt En del thai-kvinder arbejder i dag som prostituerede i Danmark, og det er ikke usædvanligt, at en del af fortjenesten går til familien hjemme i.\nFinalen i Smart Parat Svar 2014/15\n: Prostituerede i Århus ulykke fyn\nProstituerede i Århus ulykke fyn Thai massage holstebro fetish\nRabat chateau egeskov scala bio København Se mine bryster fjer betydning\nSlang for penge pornostjerne søgning 308\nProstituerede i Århus ulykke fyn Eksplosion i våbendepot dræbte mindst 39 civile i Syrien. Kun så længe det er nødvendigt for at skaffe penge til min bror, siger hun. Menneskeafføring fra Mount Everest hober sig op - kan en særlig tank løse problemet? Men valget lader til at være mere velovervejet blandt kvinder, som debuterer sent. Et betydeligt antal prostituerede er helt oppe i års-alderen, når de sælger sig selv første gang. Pandora-formand kæmper på to fronter Premium.\nProstituerede i Århus ulykke fyn Legendarisk band forkælede publikums ører og øjne. Tyrkiske lira dykker 10 pct. Fra dødelig alvor til indtægtskilder: Til trods for det forliste ægteskab har hun ingen planer om at flytte tilbage til Thailand, som hun ikke har besøgt, siden hun forlod landet for fem år siden. Årets største stjerneskudsstorm rammer nattehimlen. Hun bedyrer, at udelukkende hun selv tjener på sin forretning, og at der ikke er nogen, hun skal dele overskuddet med. En del thai-kvinder arbejder i dag som prostituerede i Danmark, og det er ikke usædvanligt, at en del af fortjenesten går til familien hjemme i Thailand.\n6. jul Massage escort fyn luder i århus / Sumas esbjerg Thai Massage Ulykke bordel dk massage herning thai fyn sex esbjerg Tanken bag. AARHUS: Mand fremstilles i grundlovsforhør efter 'hate-crime' mod muslimer. En mandlig årig herboende rumænsk statsborger fremstilles lørdag i for vold og. 8. maj omkommet efter en ulykke på E45 Nordjyske Motorvej fra Randers mod Aarhus . På den nordlige og østlige del af Fyn kunne man se den særlige Piger tvinges til slavearbejde og prostitution: Og ofte bliver pigerne narret.\nprostituerede i Århus ulykke fyn 13.11.2015 13.11.2015 Danske piger med store bryster 0 Kommentare\n0 thoughts on “Prostituerede i Århus ulykke fyn”


Nyhed : Årets danske senior- og juniorsvømmetrænere 2007 kåret | Dansk Svømmeunion\nÅrets danske senior- og juniorsvømmetrænere 2007 kåret\nLørdag, den 22. september, i forbindelse med årets Aqua Clinic, blev Årets Danske Svømmetrænere traditionen tro kåret af Dansk Svømme Træner Sammenslutning (DSTS).\nÅrets Danske Senior Træner 2007\nEt krav for at komme i betragtning er, at træneren skal have leveret seniorresultater, der er målbare internationalt.\nÅrets Danske Senior Træner 2007 blev Flemming Poulsen – træner for startfællesskabet SIGMA Nordsjælland.\nSvømmeren Julie Hjorth Hansen er tilbage på toppen igen og har udviklet sig flot under Flemming Poulsens træning de seneste to år. Specielt kan fremhæves en flot <?xml:namespace prefix = st1 />200 m individuel medley og 400 m individuel medley ved Verdens Mesterskaberne i svømning i Australien, hvor det blev til en femteplads i 200 m individuel medley og flot dansk/nordisk rekord samt en ottendeplads i 400 m individuel medley og også her dansk/nordisk rekord. Ydermere præsterede Julie en flot 200 m brystsvømning ved DM i juli, der resulterede i ny dansk rekord.\nOgså Mathias Gydensen har opnået flotte resultater under Flemming Poulsen. Her skal nævnes den danske rekord, som Mathias satte ved DM i juli i 50 m rygsvømning, som var blot 1/10 sekunder fra den nordiske rekord på distancen.\nEndvidere har Sigma klaret sig flot generelt og har blandt andet vundet de danske holdmesterskaber.\nÅrets Danske Junior Træner 2007\nEt krav for at komme i betragtning er, at træneren skal have leveret juniorresultater, der er målbare internationalt.\nÅrets Danske Junior Træner 2007 blev Ricki Clausen – træner i Svømmeklubben KVIK Kastrup.\nSvømmeren Frederik Wørmer vandt to guldmedaljer ved de Nordiske Junior Mesterskaber i henholdsvis 50 og 100 m rygsvømning.\nOgså svømmeren Daniel Svendsen har stået for en særlig flot præstation i 200 m individuel medley, hvor det ved de Europæiske Junior Mesterskaber (EJM) blev til en flot dansk juniorrekord.\nEndelig skal også Pernille Jalsøe nævnes, som kvalificerede sig til EYOF/Ungdoms-OL.\nÅrets Danske Pop-Up Træner 2007\nÅrets Danske Pop-Up Træner 2007 blev Thomas Stub, der til daglig er træner i Swim Team Esbjerg.\nSvømmeren Katrine Holm Sørensen præsterede 400 m individuel medley EJM-kvalifikation og var tæt på dansk juniorrekord. Ydermere lykkedes det for svømmeren Nanna Christensen at kvalificere sig til EYOF/Ungdoms-OL.\nBestyrelsen i DSTS ønsker de nykårede trænere tillykke.\nFor yderligere information, kan formand i DSTS, Kim Dietrichsen, kontaktes på mobil: 2043 8633.\nPå vegne af DSTS bestyrelsen


Leder: Ligegyldighed over for farligt legetøj må stoppe | Ingeniøren\nLeder: Ligegyldighed over for farligt legetøj må stoppe\n23. feb 2018 kl. 07:02 3\nAt børn får de bedst mulige vilkår for at klare sig i en stadigt mere videnkrævende verden, er ikke bare et stærkt ønske, man kan have som forældre. Sunde, kvikke børn er helt nødvendige for vores konkurrenceevne og udviklingen af vores velfærdssamfund, og det at vokse op i sunde omgivelser er en basal menneskeret.\nDerfor er det ikke bare endnu en trist kemihistorie, men en egentlig katastrofe, at der trods et over ti år gammelt forbud netop er fundet phthalater i hvert femte stykke legetøj ifølge en ny undersøgelse fra Det Europæiske Kemikalieagentur.\nPhthalater er stærkt mistænkt for med deres hormonforstyrrende effekter at påvirke hjernens udvikling og have betydning for udvikling af eksempelvis diabetes og fedme. Og ifølge Det Økologiske Råd kan det også skade evnen til at få børn, eksempelvis i form af nedsat sædkvalitet, samt skade udviklingen af fostre under graviditeten.\nDet tog otte års kamp at få phthalater forbudt i legetøj i EU – en kamp, som Danmark stod i spidsen for, ligesom Danmark i dag fortsat kæmper for at få et generelt forbud mod phthalater.\nNetop fordi beviserne for de skadelige virkninger efterhånden er så mange, er det uansvarligt at lukke øjnene for det. At der ti år efter et forbud så stadig er phthalater i hvert femte stykke legetøj viser, at der desværre er alt for mange, der ikke har forstået alvoren. Intet kan være vigtigere end at beskytte børn mod varige skader som følge af påvirkning fra farlige kemiske stoffer.\nHøjst bemærkelsesværdigt er det, at hvis en legetøjsforretning sjusker med følsomme persondata om børn i en kundedatabase, så kan der falde store bøder. (Det følger af EU’s nye lovgivning – persondataforordningen – på området.) Men hvis samme legetøjsforretning er med til at skade børnenes helbred ved at sælge varer med ulovlig og helbredsskadelig kemi, så er risikoen for en sanktion ikke stor. Det hænger overhovedet ikke sammen.\nDanmark er heldigvis gået forrest i kampen om at få phthalaterne væk fra børnenes omgivelser med forbuddet i legetøj, men der har desværre også været tendens til at sætte industriens pengepung over børnenes sundhed. Således udsatte daværende miljøminister Connie Hedegaard i 2007 indførelsen af det nye hårdt tilkæmpede EU-forbud mod skadelige koncentrationer af kemien i legetøj i fire måneder, så branchen kunne nå at få solgt det allerede producerede legetøj til danske børn.\nMen nu må hensynet til industri og forhandlere, der skruppelløst skaber en forretning ved at producere eller importere farligt legetøj på vores børns bekostning, stoppe. En laissez faire-politik er ikke bare farlig for børnene, men også urimelig over for den regelrette industri, som bruger enorme summer på at dokumentere produktsikkerhed, og som sikrer, at de tusindvis af råvarer lever op til kravene.\nEn tilsvarende indsats for produktsikkerhed kan synes tung og dyr for virksomheder, der køber eller får produceret deres produkter i eksempelvis Asien. Men en sådan udfordring kan aldrig vægte større end vores børns – og dermed befolkningens – sundhed.\nDen danske miljøminister og de danske EU-parlamentsmedlemmer må rejse et krav i EU om, at der skal indføres hårde sanktioner over for legetøj, der skader vores børns fremtid. Og heldigvis har de skrappe sanktioner på persondataområdet vist, at EU godt kan slå hårdt ned på adfærd eller produkter, som man finder uønskede.\nEmner : Hormonforstyrrende stofferKemikalierSundhedsskadelige stoffer\nNy undersøgelse: Hvert femte stykke legetøj indeholder hormonforstyrrende stoffer 19. feb 2018\nPolitikere: Kontrol med hormonforstyrrende stoffer i legetøj skal skærpes 20. feb 2018\nDårlig kontrol gør det let at snyde med phthalater i legetøj 22. feb 2018\n#1 Gert Madsen 23. februar 2018 - 10:55\nSammenligning med Persondata.\nJeg er enig i lederens budskab. Men jeg forstår ikke sammenligningen med persondata. Der lægges op til store bøder iflg. den nye persondataforordning. Men indtil videre har vi ikke set nogen, og med de resourcer, som er tildelt datatilsynet, så synes jeg tværtimod at det tegner til mindre risiko for at blive taget i at svine med persondata, end at blive taget i at svine med kemi.\n#2 Jan C Damgaard 23. februar 2018 - 11:55\nRe: Sammenligning med Persondata.\nProblemet har været størst i offentlige virksomheder, men den nye lovgivning er møntet på at franarre bøder fra selvstændige og mindre virksomheder. Næste bliver vel tvungen hjernevask, hvis man formaster sig i at huske alt for godt. Det er en EU-kamp for anarki imod nordisk orden. Spørgsmålet er mere om myndighederne selv overholder det de kan udstede bøder om?\n#3 Bertel Johansen 3. marts 2018 - 17:45\nI hvilke produkter ?\nDet er jo kedeligt at et så alvorligt problem som phthalater i legetøj stadig ikke er løst. Og så endda i "hvert femte."\nNu er det jo næppe i "hvert femte" stykke af et givet produkt, men vel snarere i "hvert femte" produkt der sælges i EU, at disse phthalater findes.\nPå den baggrund skulle det vel være muligt at nævne bare nogle af disse, så artiklen fik et mere proaktivt indhold for læseren.\nOg måske kan der sættes oprindelsesland eller koncern på hvor disse produkter kommer fra ?


Vi har vundet! – Brdr Thybo\n– så nu går det løs med bæredygtighed og fællesskab!\nMidt i November afleverede vi sammen med Bofællesskabet Kløverbakken, tegnestuen Flæks og Jakobsen Huse vores tilbudsmateriale til en ny stor udstykning i Odder Kommune.\nI mandags blev de indkomne forslag fremlagt for byrådet, og der var stor opbakning til vores projekt! Det er derfor blevet offentliggjort, at vores bæredygtige forslag løb med sejren.\nProjektgruppen vil allerede fra i dag arbejde hårdt på, at det kommende Bofællesskab Kløverbakken bliver et nytænkende og bæredygtigt boligområde, med en gennemgribende vision om fællesskab. Et fællesskab, der både inkluderer beboerne, lokalsamfundet, Odder og det øvrige samfund.\nTegnestuen Flæks er i fuld gang med at tegne og udvikle husene; der både skal være i et og to plan – og i flere forskellige størrelser, så boligerne henvender sig til mange forskellige behov og livsfaser.\nStiftergruppen bag Bofællesskabet Kløverbakken er allerede klar med en hjemmeside, hvor interesserede kan læse mere og skrive sig på en interesseliste.\nSe mere her: www.kloeverbakken-odder.dk\nVi glæder os til at fortsætte det gode samarbejde med Odder Kommune og resten af Projektgruppen Kløverbakken 🙂