aktualności biomérieux - PDF\nDownload "aktualności biomérieux"\n1 aktualności biomérieux numer 43 grudzieƒ 2007 Warszawa diagnostyka êród em dobrego zdrowia\n2 z życia firmy Zapraszamy na internetowà stron biomérieux Polska, gdzie w Dziale WiadomoÊci zamieszczamy informacje o nowoêciach w ofercie firmy. Z przyjemnoêcià informujemy, e dotychczasowà ofert biomérieux Polska w zakresie produktów do diagnostyki zaka eƒ wirusem HIV, która obejmuje testy w systemie automatycznym VIDAS HIV Duo Quick, VIDAS HIV DUO Ultra, testy ELISA Vironostica HIV oraz testy biologii molekularnej NucliSens EasyQ HIV-1 uzupe nia obecnie szybki, atwy w wykonaniu test: VIKIA HIV (nr kat ) Spis treści Z ycia firmy Techniki biologii molekularnej w badaniach epidemiologicznych zaka eƒ szpitalnych Enterokoki oporne na wankomycyn (VRE) epidemiologia i metody wykrywania Ocena przydatnoêci pod o a chromid VRE firmy biomérieux w monitorowaniu zaka eƒ szpitalnych Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) wytwarzanych przez E. coli i Klebsiella spp. za pomocà testu potwierdzajàcego wg CLSI oraz kart AST N041 systemu VITEK 2 20 Identifying Resistance StandLab IQs pierwszy polski internetowy program kontroli jakoêci Nowe produkty w ofercie bia ek specyficznych (Konelab system reagent) 27 Z ycia firmy XVI Zjazd PTDL POLMEDLAB Wydawca: biomérieux Polska Sp. z o.o. Osoba odpowiedzialna: El bieta Wójcik Osoby bioràce udzia w przygotowaniu nr 43: Katarzyna Haltof Marcin Iszku o Miros aw Kachalik Ireneusz Pop awski Barbara Krawczyƒska Piotr Czajka Karolina Âwiderska Adres redakcji i wydawcy: biomérieux Polska Warszawa, ul. eromskiego 17 tel. (22) fax (22) Przygotowalnia i druk: PASSA Zak ad Poligraficzny Wojciech Bia kowski Konstancin-Jeziorna, ul. Lipowa 26 Jest to jakoêciowy test wykorzystujàcy technik immunochromatograficznà, umo liwiajàcy wykrywanie przeciwcia anty- HIV1 i anty-hiv2 w surowicy, osoczu oraz w pe nej krwi. Wychodzàc naprzeciw oczekiwaniom u ytkowników systemu VIDAS oraz Êrodowiska medycznego, firma biomérieux Polska ma przyjemnoêç poinformowaç o wprowadzeniu nowego testu: nr kat VIDAS NT-proBNP jest testem iloêciowym w automatycznym systemie VIDAS do oznaczania N-koƒcowych fragmentów peptydów natriuretycznych typu B w surowicy lub osoczu (heparyna litowa), przy u yciu techniki ELFA (metoda enzymoimmunofluorescencyjna). Oznaczenia NT-proBNP wykorzystywane sà do diagnozowania pacjentów z podejrzeniem niewydolnoêci lewej komory serca. Jest to szczególnie przydatne do odró nienia pomi dzy dusznoêcià sercowà i p ucnà. Do zobaczenia w sieci! Zapraszamy równie do zapoznania si z wiadomoêciami o dzia alnoêci firmy biomérieux, które zamieszczane sà w Dziale Informacje Prasowe. Na stronie prasowe znajdujà si wiadomoêci nt. wprowadzenia na rynek testu do diagnostyki i prognostyki niewydolnoêci serca VIDAS NT-proBNP. Na tej stronie znajdà Paƒstwo równie informacje nt. podsumowania dzia- alnoêci firmy biomérieux za szeêç miesi cy 2007 roku.\n3 80-lecie Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów Kraków, Âwiat cz owieka Êwiatem drobnoustrojów pod takim tytu em w dniach 31 sierpnia 1 wrzeênia 2007 roku, w Krakowie odby o si jubileuszowe sympozjum zorganizowane z okazji 80-lecia Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów (PTM). Towarzystwo powsta o w 1927 roku i nale y do najstarszych medycznych towarzystw naukowych w Polsce. Za o ycielami byli Roman Nitsch, Feliks Przesmycki i Zygmunt Szymanowski. Celem Towarzystwa jest propagowanie rozwoju nauk mikrobiologicznych i popularyzowanie osiàgni ç mikrobiologii wêród cz onków oraz szerokich kr gów spo eczeƒstwa. Z racji jubileuszu, wyk ad inauguracyjny zosta poêwi cony wielkim mikrobiologom. Program konferencji obejmowa ró norodnà problematyk, takà jak: nowe strategie walki z chorobami zakaênymi, nowe leki przeciwbakteryjne, implikacje kliniczne i terapeutyczne zaka eƒ Helicobacter pylori, metody genetyczne ró nicowania drobnoustrojów, zoonozy, zaka- enia pozaszpitalne, nowe metody post powania wobec H.influenzae, patogenez zaka eƒ C.difficile, leki przeciwwirusowe, szczepienia, grzyby dro d opodobne, badania mikrobiologiczne powietrza, a tak e wp yw drobnoustrojów na niszczenie zabytków oraz zarzàdzanie jakoêcià i akredytacj w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych. Oprócz wyk adów odby a si sesja plakatowa, a tak e wystawa firm diagnostycznych i farmaceutycznych. Firma biomérieux Polska prezentowa a na stoisku nast pujàce systemy: BacTAlert 3D 60 do wykrywania drobnoustrojów we krwi i innych p ynach ustrojowych, VITEK 2 compact do identyfikacji drobnoustrojów i okreêlania lekowra liwoêci oraz nowy system do genotypowania DiversiLab. Oprócz systemów automatycznych na stoisku mo na by o tak e zebraç informacje na temat nowych produktów w ofercie firmy, pod o y mikrobiologicznych, testów lateksowych oraz testu VIKIA HIV. Jubileusz by doskona à okazjà do spotkaƒ oraz wymiany doêwiadczeƒ pomi dzy mikrobiologami z ró nych oêrodków. èród o: materia y zjazdowe 3\n4 Pomorskie Spotkania z Mikrobiologią Gdańsk Sobieszewo, W dniach roku w Sobieszewie pod patronatem J. M. Prof. dr hab. Romana Kaliszana Rektora Akademii Medycznej w Gdaƒsku oraz Prof. dr hab. Walerii Hryniewicz Prezesa Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów odby a si konferencja Pomorskie Spotkania z Mikrobiologià. Program obejmowa : nowoczesne metody w diagnostyce mikrobiologicznej, zaka enia wywo ywane przez bakterie Staphylococcus aureus, diagnostyk i ró nicowanie toksoplazmozy wczesnej i przewlek ej, laboratoryjnà diagnostyk chorób paso ytniczych ze szczególnym uwzgl dnieniem badaƒ molekularnych, zastosowanie bakteriofagów w diagnostyce i terapii, epidemiologi, diagnostyk i profilaktyk inwazyjnej choroby meningokokowej, posocznice bakteryjne, aktualne problemy antybiotykoterapii, zastosowanie markerów molekularnych w diagnostyce bakteryjnych patogenów roêlin, wytwarzanie biofilmu przez szczepy Enterococcus faecalis izolowane z przewodu pokarmowego oraz z zaka eƒ i in. Prace z ró nych oêrodków woj. pomorskiego, zosta y wystawione podczas bardzo interesujàcej sesji plakatowej. Firma biomérieux prezentowa a na stoisku firmowym produkty stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej. Zakażenia szpitalne monitorowanie, rozpoznawanie i zapobieganie Warszawa, paêdziernika 2007 roku odby a si druga z cyklu corocznych konferencji, organizowanych przez firm biomérieux Polska. Podobnie jak poprzednio, tegoroczna konferencja zosta a zorganizowana w Hotelu Marriott i poêwi cona by a tematyce zaka eƒ szpitalnych. Przybyli na nià kierownicy zak adów mikrobiologii, laboratoriów mikrobiologicznych oraz epidemiolodzy i dyrektorzy placówek ochrony zdrowia. Program naukowy obejmowa nast pujàce wyk ady: monitorowanie opornoêci bakterii na terenie szpitala, rozpoznawanie i zapobieganie opornoêci, a tak e diagnostyk mikrobiologicznà w monitorowaniu zaka eƒ szpitalnych. 4 GoÊciliÊmy znakomitych wyk adowców w osobach Pani Profesor Walerii Hryniewicz, Pani Doktor Ma gorzaty Fleischer i Pana Doktora Tomasza Ozorowskiego. Konferencja by a okazjà do burzliwej dyskusji i wymiany doêwiadczeƒ na temat kontroli zaka eƒ szpitalnych i trudnoêci w s u bie zdrowia wynikajàcych z szerzenia si opornoêci drobnoustrojów.\n5 biologia molekularna Techniki biologii molekularnej w badaniach epidemiologicznych zakażeń szpitalnych dr Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska Epidemiologia jest dzia em medycyny zajmujàcym si badaniem przyczyn wyst powania i szerzenia si chorób zakaênych i niezakaênych w zbiorowiskach ludzi, opracowuje metody zapobiegania i zwalczania chorób wywo anych przez wirusy, bakterie, dro d aki i dermatofity. W obecnej dobie rozwoju medycyny, wprowadzanie nowych technik i leków do terapii, zwi ksza z jednej strony prze ywalnoêç pacjentów, z drugiej strony pojawia si problem zaka eƒ szpitalnych. Du y problem stanowià infekcje szpitalne wywo ane przez szczepy wielooporne, które atwo rozprzestrzeniajà si w Êrodowisku szpitalnym, a których leczenie jest problematyczne ze wzgl du na ograniczone mo liwoêci terapeutyczne. Problem zaka eƒ szpitalnych i epidemii wynika z selekcji szczepów opornych, powstawania nowych mechanizmów opornoêci czy rozprzestrzeniania si genów a nawet ca ych kaset genów odpowiedzialnych za opornoêç na antybiotyki i chemioterapeutyki. Problem ten jest istotny nie tylko z punktu widzenia medycyny, ale równie ma pod o e ekonomiczne i prawne, dlatego tak istotny staje si program kontroli zaka eƒ szpitalnych. Od roku 1970 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) w Atlancie w Stanach Zjednoczonych, jako pierwsze stworzy o program ciàg ego nadzoru nad zaka eniami (NNIS National Nosocomial Infections Surveilance System). CDC jest najwa niejszym na Êwiecie centrum badaƒ nad wyst powaniem i profilaktykà chorób, w tym równie zaka eƒ szpitalnych. W Europie decyzjà (nr 2119/98/EC) Parlamentu Europejskiego oraz Rady z dnia 24 wrzeênia 1998 roku powsta- a sieç nadzoru epidemiologicznego oraz kontrola chorób zakaênych we Wspólnocie Europejskiej (Dz. U. EW nr L 268, z ). Nadzór epidemiologiczny w Europie reguluje Unia Europejska, która wprowadzi a obowiàzek rejestracji wskazanych chorób zakaênych, zaka eƒ szczepami lekoopornymi oraz zaka eƒ szpitalnych. JednoczeÊnie powo ano europejskie centrum epidemiologiczne, European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Mikrobiologiczne zaka enia szpitalne dotyczà wszystkich szpitali niezale nie od stopnia wyspecjalizowania czy poziomu rozwoju kraju, w którym si znajdujà. Dlatego te sta a kontrola zaka eƒ szpitalnych oraz dà enie do ograniczenia ich liczby powinno nale eç do g ównych obowiàzków personelu medycznego szpitali. Badania epidemiologiczne wewnàtrz szpitali sà prowadzone g ównie w celu opracowania efektywnego programu kontroli zaka eƒ. W wielu przypadkach prosta identyfikacja gatunkowa i badanie antybiotykowra liwoêci wystarczà do okreêlenia epidemiologicznej zale noêci szczepów oraz Êledzenia drogi ich rozprzestrzeniania si w czasie. W przypadku, gdy infekcja jest spowodowana mikroorganizmem b dàcym sk adnikiem naturalnej flory bakteryjnej lub Êrodowiska (np. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis), to do okre- Êlenia epidemiologicznej zale noêci poszczególnych izolatów potrzebne jest wykonanie dodatkowych testów. Badania fenotypowe w dochodzeniach epidemiologicznych sà kosztowne i czasoch onne, a cz sto trudne i niejednoznaczne w interpretacji, np. w przypadku szczepów o charakterze endemicznym. OkreÊlenie pokrewieƒstwa pomi dzy szczepami tego samego gatunku i wykrycie klonów lub grup klonalnych wywo ujàcych zaka enia epidemiczne bàdê endemiczne, a tak e ustalenie êród a szerzenia si zaka- eƒ i drogi transmisji pomi dzy oddzia ami, szpitalami, a nawet krajami jest mo liwe dzi ki dobrze rozwini tej technologii kwasów nukleinowych. Specyfika badaƒ metodami molekularnymi opartymi na analizie DNA polega na dok adnym okreêleniu, czy szczepy izolowane od wielu pacjentów nale à do jednego klonu, który rozprzestrzenia si horyzontalnie na oddziale, czy te problem zaka eƒ dotyczy szczepów reprezentujàcych kilka grup klonalnych. Badania epidemiologiczne prowadzone przez d u szy okres czasu wymagajà monitoringu rozprzestrzeniania si i okreêlenia dominacji poszczególnych szczepów, co mo e byç przydatne w opracowaniu d ugoterminowych programów kontroli zaka eƒ. W badaniach epidemiologicznych typowanie szczepów przeprowadzane jest nie tylko w szpitalach, ale równie w ramach kontroli kontaminacji wody i ywnoêci drobnoustrojami oraz w mikrobiologii weterynaryjnej. Typowanie szczepów ma wiele aplikacji w badaniach naukowych i przemyêle spo ywczym np. do kontroli jakoêci ywnoêci. Szybkie metody typowania szczepów mogà znaczàco zredukowaç koszty zwiàzane z leczeniem, powstrzymaniem rozprzestrzeniania si epidemii i dekontaminacjà. Metody genotypowania coraz cz Êciej stajà si integralnà cz Êcià zarówno w klinicznych, jak i naukowych laboratoriach mikrobiologicznych. Szeroka wiedza na temat mechanizmów molekularnych oraz w aêciwoêci fizyko-chemicznych makroczàsteczek komórkowych pozwala tworzyç nowe, coraz bardziej dok adne techniki genotypowania. Techniki te w g ównej mierze opierajà si na analizie restrykcyjnej, hybrydyzacji oraz amplifikacji DNA in vitro przy zastosowaniu aƒcuchowej reakcji polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) oraz sekwencjonowaniu. Rozdzia powsta ych fragmentów DNA o ró nej 5\n6 6 d ugoêci, uzyskuje si przy pomocy technik elektroforetycznych. Otrzymany w ten sposób profil prà ków jest charakterystyczny zarówno dla wybranej metody jak i dla badanej próby. Ró nice we wzorach Êwiadczà o odmiennoêci genetycznej badanych organizmów. Generalnie metody genotypowe uwa a si za bardziej kompleksowe. Nie sà to jednak metody uniwersalne i w zale noêci od rodzaju metody charakteryzuje je ró ny potencja ró nicujàcy, czu oêç i powtarzalnoêç, koszt i stopieƒ trudnoêci wykonania. Zostanà omówione trzy grupy metod opartych na analizie zmiennoêci genomowej: 1. analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA po àczona z elektroforezà pulsowà (REA-PFGE); 2. techniki oparte o ligacj adaptorów oligonukleotydowych; 3. wykorzystanie sekwencji repetytywnych w genotypowaniu bakterii. Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA po àczona z elektroforezà pulsowà (REA-PFGE) Konwencjonalna elektroforeza agarozowa mo e byç stosowana tylko do rozdzia u DNA o wielkoêci do 20 kpz. Na migracj ma wp yw ró ny adunek pomi dzy fragmentami DNA, a rozdzia odbywa si na zasadzie sita molekularnego, utworzonego przez pory noênika. Fragmenty DNA migrujà jako sferyczne spirale, im mniejsza czàstka DNA, tym szybciej migruje przez pory w elu. Niestety dla czàstek DNA powy ej 20 kpz ruchliwoêç staje si coraz mniej zale na od rozmiarów czàsteczki i rozdzia ich klasycznymi metodami elektroforetycznymi staje si niemo liwy. W 1983 r. Schwatrz i Cantor wprowadzili elektroforez pulsowà (PFGE ang. Pulsed Field Gel Electrophoresis), która z biegiem czasu umo liwi a rozdzia w elu agarozowym DNA o d ugoêci od 20 50kpz do 2 10Mpz. Fragmenty wi ksze ni 20 kpz podczas migracji tworzà mocno rozciàgni tà spiral, która nie migruje na zasadzie sita molekularnego, tylko pe za jak wà (ang. snake like ). Fragmenty te nie b dà migrowa y ju zgodnie z efektem adunku. Technika PFGE polega na wymuszonej zmianie kierunku migracji czàsteczek DNA pod wp ywem okresowej zmiany orientacji pola elektrycznego. Zmiana kierunku pola elektrycznego wymusza zmian konformacji czàsteczki DNA i jej reorientacj w kierunku elektrody dodatniej. Czas potrzebny na reorientacj zale y od wielkoêci czàsteczki DNA i jest tym d u szy im czàsteczka jest wi ksza. Zatem wi ksze czàsteczki migrujà wolniej ni mniejsze, wi cej czasu zajmuje im przystosowanie si do nowego kierunku przep ywu pola elektrycznego. Ró nica w czasie reorientacji jest czynnikiem krytycznym, który decyduje o rozdziale fragmentów DNA o ró nej d ugo- Êci. Powsta o wiele odmian technik PFGE, które ró nià si sposobem rozmieszczenia elektrod tzn. kàtem, pod jakim zmienia si kierunek pola elektrycznego. Dzielimy je na dwie kategorie: techniki, w których kàt reorientacji wynosi 180 i techniki, dla których kàt reorientacji zawiera si w przedziale Pierwszà grup stanowi elektroforeza w odwracalnym polu elektrycznym FIGE (ang. Field Inversed Gel Electrophoresis) i polega na cyklicznej, okresowej zmianie polarnoêci jednorodnego pola elektrycznego pod kàtem 180. Czàsteczki DNA w zale noêci od polarnoêci ustawionych po obu stronach elu elektrod, poruszajà si raz w przód (F forward), raz w ty (R reverse). Ten typ elektroforezy PFGE jest stosowany g ównie do rozdzia u czàsteczek o wielkoêci kpz. Elektroforeza w polu elektrycznym o kàcie reorientacji zawierajàcym si w przedziale mo e ró niç si iloêcià i u o eniem stosowanych elektrod oraz kszta tem toru migracji czàstek. Elektroforeza w pulsowym polu PFG (ang. Pulsed Field Gel) i elektroforeza w zmiennym polu o kszta cie prostokàta OFAGE (ang. Orthogonal Field Alternation Gel Electrophoresis) umo liwiajà dobry rozdzia fragmentów DNA, jednak e zakrzywienie toru ruchu czàsteczek DNA utrudnia interpretacj, szczególnie przy fragmentach o bardzo podobnej d ugoêci. Proste tory migracji czàstek dajà: elektroforeza w rotacyjnym polu RGE (ang. Rotating Gel Electrophoresis), elektroforeza pionowa w zmiennym polu TAFE (ang. Transverse Field Electrophoresis), elektroforeza w jednorodnym polu o kszta cie prostokàta PHOGE (ang. Pulsed Homogenous Orthogonal Gel Electrophoresis) i elektroforeza w zmiennym, homogennym polu o kszta cie szeêciokàta foremnego CHEF (ang. Contour Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis). Dla CHEF uk ad 24 elektrod tworzy dwa jednorodne pola skierowane do siebie pod kàtem 120, co daje najwi ksze mo liwoêci do rozdzia u czàstek, nawet o wielkoêci oko- o 10 Mpz. Technika ta zosta a wykorzystana mi dzy innymi do stworzenia mapy fizycznej ludzkiego genomu. Analiza polimorfizmu d ugoêci fragmentów restrykcyjnych po àczona z elektroforezà pulsowà (REA-PFGE ang. Restriction Enzyme Analysis Pulsed Field Gel Electrophoresis) uznawana jest za z oty standard w typowaniu molekularnym bakterii. Metoda ta polega na trawieniu ca ego genomowego DNA enzymem (-ami) restrykcyjnym rzadko tnàcym. Liczba i wielkoêç otrzymanych fragmentów jest charakterystyczna dla danego organizmu i zale y od rozmieszczenia w genomie sekwencji rozpoznawanej przez stosowany enzym restrykcyjny. W wyniku trawienia otrzymuje si od 10 do 30 du ych fragmentów, o wielkoêci od ok. 0,5 kpz do 1000 kpz. Fragmenty restrykcyjne rozdziela si w pulsowej elektroforezie agarozowej. Metoda REA-PFGE mo e byç zastosowana dla dowolnego mikroorganizmu, z którego mo na wyizolowaç DNA (znajomoêç sekwencji nie jest wymagana). PFGE ze wzgl du na wysokà powtarzalnoêç wzoru i dobrà rozdzielczoêç dla wi kszoêci wspólnych enteropatogenów, w USA jest rutynowo stosowana w du ych laboratoriach, gdzie korzysta si z wystandaryzowanych protoko ów do typowania szczepów, a rezultaty zestawia si w centralnych bazach danych. Techniki oparte o ligacj adaptorów oligonukleotydowych (LM-PCR ang. Ligation Mediated PCR) Wiele obecnie stosowanych technik typowania molekularnego opiera si na analizie polimorfizmu genomowego DNA. Majà one na celu przypisanie konkretnemu szczepowi specyficznego profilu fragmentów DNA stanowiàcego jego tzw. odcisk palca (ang. fingerprint). Techniki fingerprinting, czyli techniki tzw. genomowego odcisku\n7 palca, wykorzystujà w g ównej mierze amplifikacj fragmentów DNA in vitro przy zastosowaniu aƒcuchowej reakcji polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR), bàdê analiz restrykcyjnà po àczonà z amplifikacjà PCR. Rozdzia powsta ych fragmentów DNA o ró nej d ugoêci uzyskuje si przy pomocy technik elektroforetycznych. Otrzymany w ten sposób profil prà ków jest charakterystyczny zarówno dla wybranej metody jak i dla badanej próby. Ró nice we wzorach Êwiadczà o odmiennoêci genetycznej badanych organizmów. Bardzo przyjaznà technikà do analizy DNA o nieznanej sekwencji jest grupa technik opartych o ligacj adaptorów oligonukleotydowych (LM-PCR ang. Ligation Mediated PCR). Do metod wykorzystujàcych adaptory w reakcji PCR nale à: AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism), ADSRRS (ang. Amplification of DNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites) oraz PCR MP (ang. PCR Melting Profiles). Ka da z tych metod oparta jest na selektywnej amplifikacji fragmentów restrykcyjnych uzyskanych w wyniku trawienia ca ego genomowego DNA endonukleazami (jednà lub dwoma), dajàcymi wiszàce koƒce 5 a nast pnie ligacji odpowiednio zaprojektowanych adaptorów oligonukleotydowych: oligonukleotydu pomocniczego, który zawiera sekwencj komplementarnà do sekwencji rozpoznawanej przez stosowany enzym restrykcyjny i umo liwia przez to hybrydyzacj adaptora do fragmentu restrykcyjnego oraz oligonukleotydu, który ulega w aêciwej ligacji i odpowiedzialny jest za wykreowanie miejsca wiàzania startera w reakcji PCR. Oba oligonukleotydy nie sà ufosforylowane na koƒcach 5, dzi ki czemu nie zachodzi pomi dzy nimi reakcja polimeryzacji podczas reakcji ligacji. Po ligacji adaptora do DNA otrzymuje si dwuniciowe fragmenty o znanej nam na koƒcach sekwencji, które mogà byç wykorzystane w amplifikacji. Reakcj PCR prowadzi si dwustopniowo. W pierwszym etapie (pre-pcr) przeprowadza si wst pnà denaturacj w wyniku, której oddysocjowuje niezligowany oligonukleotyd pomocniczy. Nast pnie zachodzi wype nianie koƒców 3 na matrycy oligonukleotydu ligowanego. W drugim etapie reakcji PCR przeprowadza si w aêciwà amplifikacj przy zastosowaniu startera o identycznej sekwencji jak oligonukleotyd ligowany, cz sto wyd u ony o sekwencj wiszàcego koƒca 5 miejsca restrykcyjnego. Metody LM PCR ró nià si mi dzy sobà g ównie sposobem selekcji amplifikowanych w reakcji PCR fragmentów DNA. W przypadku techniki AFLP w reakcji PCR stosuje si startery o sekwencji identycznej z sekwencjà oligonukleotydu ligowanego adaptora, wyd u onej na koƒcu 3 o sekwencj miejsca restrykcyjnego oraz o 2 4 dowolnych nukleotydów. Amplifikacja fragmentu DNA zachodzi jedynie w przypadku pe nej komplementarnoêci startera na koƒcu 3. Cz stoêç rozpoznawania specyficznego miejsca przez starter selekcyjny wynosi 1/4 n (n liczba zasad selekcyjnych). Dla techniki ADSRRS do ograniczenia iloêci amplifikowanych fragmentów wykorzystuje si zjawisko supresji (SSH, ang. Suppression Subtractive Hybridisation) reakcji PCR. Supresja, zwana inaczej wewnàtrzczàsteczkowà hybrydyzacjà fragmentów homologicznych mo e zajêç w przypadku, gdy jednoniciowe fragmenty DNA posiadajà na obu koƒcach komplementarne wzgl dem siebie sekwencje (w tym przypadku adaptory). Krawczyk i wsp. (2002, 2003, 2004) zastosowali ADSRRS-fingerprinting do typowania szczepów Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens i Acinetobacter baumannii w badaniach epidemiologicznych zaka eƒ szpitalnych. W metodzie PCR MP (ang. PCR Melting Profiles) ograniczenie iloêci amplifikowanych fragmentów uzyskuje si poprzez zastosowanie ni szej ni w standardowej metodzie LM PCR temperatury denaturacji DNA. W reakcji PCR selektywnoêç i potencja ró nicujàcy metody mo na regulowaç poprzez dobór odpowiedniego enzymu restrykcyjnego oraz temperatury denaturacji w reakcji PCR. Niewàtpliwà zaletà techniki PCR MP jest mo liwoêç ró nicowania fragmentów DNA o identycznej d ugoêci, ale ró nym sk adzie zasad, co znaczàco odró nia jà od pozosta ych technik LM PCR. Technika PCR MP zosta a wykorzystana przez Krawczyk i wsp. (2006, 2007) do ró nicowania klinicznych szczepów bakteryjnych E. coli, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus oraz dro d aków z rodzaju Candida. Szczególne zainteresowanie i dynamiczny rozwój techniki LM PCR zawdzi czajà: uniwersalnoêci nie wymagajà znajomoêci analizowanej sekwencji DNA; opierajà si na analizie ca ego genomu bakteryjnego czy grzybowego jest to korzystne ze wzgl du na fakt, i interpretacja i u ytecznoêç danych opartych na analizie genów lub operonów wyst pujàcych pojedynczo w genomie w wielu przypadkach jest niewystarczajàca; prostocie wykonania (w porównaniu np. z PFGE) przy zachowaniu wysokiego potencja u ró nicujàcego; wymagajà do przeprowadzenia pe nej analizy niewielkich iloêci DNA (warunkiem jest pozyskanie DNA z czystych kultur bakteryjnych); sà powtarzalne, charakteryzujà si wysokim stopniem dyskryminacji badanych organizmów; pozwalajà na wzgl dnie szybkà analiz bez potrzeby inwestowania w wysoko wyspecjalizowany sprz t, nie wymagajà du ych nak adów finansowych, dzi ki czemu metody LM PCR mogà byç stosowane w rutynowych laboratoriach diagnostycznych. Wykorzystanie sekwencji repetytywnych Sekwencjonowanie genomów ujawni o, e du y procent genomowego DNA mikroorganizmów wyst puje w postaci powtórzonych (repetytywnych) sekwencji (ang. DNA repeats). Powtórzenia ró nià si wielkoêcià, lokalizacjà, stopniem z o onoêci oraz rodzajem (ang. repeat mode). Powtórzenia mogà byç rozproszone na genomie, bàdê zlokalizowane w jednym miejscu. Sekwencje repetytywne oprócz du ego zakonserwowania ewolucyjnego, wykazujà równie wystarczajàcà zmiennoêç, która mo e byç wykorzystana do ró nicowania szczepów bakteryjnych. Powtórzone jednostki mogà byç identyczne (homogenne powtórzenia), bàdê mogà ró niç si nieznacznie wskutek mutacji punktowych (heterogenne powtórzenia). Zosta y wprowadzone ró ne podzia y sekwencji repetytywnych np. powtórzenia proste 7\n8 8 (ang. direct repeats), powtórzenia podwójne (ang. dyad repeats), powtórzenia odwrócone (ang. inverted repeats). W Êwiecie bakterii zosta zaproponowany podzia na dwie klasy powtórzeƒ na genomie: 1. powtórzenia proste, z o one z krótkich oligonukleotydów (zwykle 1 5 nukleotydów), powtórzone wielokrotnie obok siebie w konfiguracji g owa-do-ogona (ang. head-to-tail), 2. d ugie powtórzenia (np. elementy insercyjne IS, transpozony Tn i powtórzenia rozdzielone (ang. spaced repeats). Istniej równie podzia na sekwencje rozproszone na genomie oraz skupione tzw. sàsiadujàce. Poni- ej przedstawiono krótki opis niektórych sekwencji repetytywnych i ich wykorzystanie w typowaniu mikroorganizmów. Rozproszone powtórzenia w genomie prokariotycznym Rozproszone repetytywne motywy znaleziono u du ej liczby gatunków bakterii. Opisano je w pracy przeglàdowej Lupski i Winstock (1992). Wi kszoêç tych elementów rozrzucona na genomie jest krótsza ni 200 par zasad (pz), sk ada si z sekwencji niekodujàcej, po o onej mi dzycistronowo. Do powtórzeƒ rozproszonych nale à sekwencje charakterystyczne dla bakterii Gram-ujemnych nale àcych do Enterobacteriaceae: ERIC (ang. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o d ugoêci pz, i REP (ang. Repetitive Extragenic Palindrome) o d ugoêci 38 pz. ERIC-PCR jest metodà fingerprinting opartà na amplifikacji genomowego DNA po o onego pomi dzy elementami ERIC lub pomi dzy elementami ERIC i innymi repetytywnymi sekwencjami DNA. Pomimo, e sekwencje te zosta y opisane dla bakterii z rodzaju Enterobacteriaceae z powodzeniem technika ta mo e byç wykorzystana do typowania równie innych bakterii. Elementy repetytywne w systemie PCR zosta y wykorzystane do badania zwiàzków pomi dzy patogenami szpitalnymi np. dla E. coli, S. aureus ienterokoków. Analogiczne sekwencje by y wykryte u innych gatunków mikroorganizmów, takich jak: cyjanobakterie czy bakterie glebowe Rhizobium meliloti. We wczesnych latach dziewi çdziesiàtych zidentyfikowano inny motyw rozproszonego powtórzenia u Streptococcus pneumoniae, zwany powtórzeniem BOX, odmienny od powtórzeƒ ERIC czy REP. Te powtórzenia tworzà stabilne drugorz dowe struktury i sà w niektórych przypadkach transkrybowane. Ich funkcja jest prawdopodobnie zwiàzana z regulacjà ekspresji genów, poniewa spotyka si je w bliskim sàsiedztwie genów np. odpowiedzialnych za wirulencj. Od czasu wykrycia elementów BOX sà one wykorzystywane w typowaniu molekularnym. Wszystkie te prokariotyczne motywy reprezentujàce repetytywne DNA nie sà zorganizowane w tandemowe powtórzenia, ale sà rozrzucone wewnàtrz genomu mikroorganizmów. Powtórzenia sàsiadujàce (stykajàce si ) W okreêlonych fragmentach genomu spotykane sà krótkie powtórzone sekwencje (powtórzone jednostki liczà od 1 do 25 nukleotydów) nazywane: SSRs (ang. Short Sequences Repeats), bàdê krótkie tandemowe powtórzenia STRs (ang. Short Tandem Repeats). Bogate w tego typu repetytywne regiony sà m.in. geny kodujàce trna na genomie bakteryjnym. Stanowià je ró nej d ugoêci krótkie powtórzone jednostki. Jest kilka takich eubakteryjnych loci bogatych w SSR, np. dla Hemophilus influenzae geny lic1 lic3 zawierajà motyw powtórzony CAAT, w genomie Neisseria meningitidis wykryto domeny (CTA)9, podczas gdy domeny (CTA)11 i (CTT)21 by y odkryte odpowiednio w sekwencjach u Mycoplasma genitalium i Mycobacterium leprae. Takie SSR loci mogà byç wykorzystane jako markery w identyfikacji i rozprzestrzenianiu si szczepów bakteryjnych. Typowanie bakterii oparte na tandemowych powtórzeniach (ang. tandem repeats) Powtórzenia tandemowe majà istotne znaczenie w typowaniu bakterii, sà definiowane jako sekwencje monomeryczne, o zmiennej d ugoêci, nawet do kilkuset nukleotydów, powtórzone periotycznie o konfiguracji g owa-do-ogona. Sekwencje powtórzone tandemowo o okreêlonej konfiguracji monomerów mogà byç po o one w pojedynczym locus (geny jednokopijne), bàdê w kilku miejscach genomu. Równie do wykrywania polimorfizmu krótkich tandemowych powtórzeƒ mo na wykorzystaç technik PCR. Tandemowe powtórzenia DNA pos u- y y jako cel molekularny do opracowania metod genotypowych ró nicowania m.in. takich bakterii patogennych jak: Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Mycobacterium tuberculosis, M. avium, M. bovis, M. leprae, Leptospira interrogans sensu stricto, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, S. typhi, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli O157, Borrelia spp., Bordetella pertusis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis. Regiony, w których wyst pujà ró nice w liczbie powtórzonych jednostek zwane sà domenami o zró nicowanej liczbie tandemowych powtórzeƒ (ang. Variable Number Tandem Repeat). Klasa VNTR u organizmów prokariotycznych dotyczy pojedynczego locus. Kombinacja polimorficznej natury VNTRs i zastosowanie techniki PCR sta o si podstawà opracowania nowej metody ró nicowania drobnoustrojów opartej na analizie zró nicowanej liczby tandemowych powtórzeƒ wielu loci MLVA (ang. multiple-locus variable number tandem repeats analysis). Funkcjonuje ona jako genetyczny fingerprint. Zró nicowana liczba tandemowych powtórzeƒ wielu loci (MLVA) mo e byç odpowiednim podejêciem do ró nicowania genetycznego wysoko monomorficznych gatunków takich jak Bacillus anthracis i Yersinia pestis. MLVA wykorzystano równie do ró nicowania szczepów Staphylococcus aureus w uk adzie MP-PCR (ang. Multiplex PCR). Amplifikacji poddawano wiele polimorficznych loci charakteryzujàcych si powtórzeniami tandemowymi: clfa, clfb, sdr, spa, sspa. W roku 1991 opublikowano wykorzystanie tandemowych powtórzeƒ typu DR (ang. Direct Repeats) do identyfikacji Mycobacterium tuberculosis. Powtórzenia DR po o one sà w obr bie flankujàcych sekwencji elementów insercyjnych IS i charakteryzujà si polimorfizmem pod wzgl dem rozmiaru i kompozycji wêród szczepów M. tuberculosis complex. Motyw DR sk ada si z krótkich powtórzonych sekwencji o d ugoêci 36 par zasad, rozdzielonych unikalnymi obszarami\n9 sekwencji rozdzielajàcej (ang. spacer element ) o d ugoêci od 35 do 41 nukleotydów. Metoda okreêlona jako spoligotyping oparta jest na amplifikacji PCR obszarów rozdzielajàcych sekwencje DR, ich znakowaniu i hybrydyzacji do oligonukleotydów (zakonserwowane powtórzenia) zwiàzanych z membranà nylonowà. Metod spoligotyping stosuje si do wst pnej analizy epidemiologicznej gruêlicy. Obecnie bardzo przydatna jest metoda oparta o analiz MIRU-VNTR. MIRU (ang. Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) sà to homologiczne nukleotydowe rozproszone sekwencje wykazujàce strukturalne podobieƒstwo do MSY1 ludzkich minisatelitów (zwane sà one równie przez to sekwencjami mikrosatelitarnymi). SpoÊród 41 sekwencji MIRU wykorzystuje si 12, o d ugoêci od 52 do 77 nukleotydów. Ka da z 12 sekwencji mo e wyst powaç na genomie w kilku lub kilkunastu powtórzeniach w zale noêci od szczepów. Metoda MIRU-VNTR oparta jest na niezale nej amplifikacji 12 loci przy wykorzystaniu sekwencji starterowych komplementarnych do regionów sàsiadujàcych z sekwencjami MIRU. Liczb powtórzeƒ sekwencji MIRU u poszczególnych loci obrazuje si jako uk ad liczb. System typowania MIRU- VNTR zosta równie zautomatyzowany i wykorzystuje uk ad multiplex-pcr, wyznakowane fluorescencyjnie startery i rozdzia na automatycznym sekwenatorze. Dzi ki technice PCR uleg a zwi kszeniu czu oêç i specyficznoêç badaƒ diagnostycznych. Wprowadzenie do diagnostyki medycznej techniki PCR uproêci o równie procedury badawcze umo liwiajàc ich automatyzacj i powstanie szeregu handlowo dost pnych testów. Komercyjny, zautomatyzowany system DiversiLab do typowania drobnoustrojów w oparciu o technik rep-pcr Tylko jeden system molekularnego typowania szczepów jest komercyjnie dost pny w postaci wystandaryzowanego kitu automatyczny system DiversiLab, który wykorzystuje rep-pcr do ró nicowania izolatów bakteryjnych i grzybowych oraz identyfikuje niektóre grzyby do poziomu gatunku. Po ekstrakcji DNA z wyizolowanych kultur, przeprowadzana jest reakcja amplifikacji w oparciu uk ad rep-pcr z wykorzystaniem starterów, dobranych odpowiednio do repetytywnych sekwencji, które sà rozdzielone sekwencjami genomu (stosujemy odpowiedni zestaw zwierajàcy w swoim sk adzie wszystkie komponenty potrzebne do przeprowadzenia reakcji PCR DiversiLab DNA Fingerprinting Kit). Amplifikacji ulegajà fragmenty pomi dzy sekwencjami repetytywnymi (startery dobrane do zewn trznych sekwencji powtórzenia i skierowane naprzeciw siebie amplifikujà region pomi dzy elementami repetytywnymi w przeciwieƒstwie do starterów skierowanych do wn trza sekwencji repetytywnej, które amplifikujà elementy repetytywne jak w przypadku zró nicowanej liczby tandemowych powtórzeƒ VNTR). Wiele amplikonów DNA o ró nej wielkoêci i iloêci (oraz intensywnoêci) jest wytwarzana podczas PCR. Manualna metoda nastawiona jest na klasyfikacj drobnoustroju do podgatunku oraz na ró nicowanie szczepów bakteryjnych. Automatyczna metoda rep-pcr zawiera trzy komponenty: 1. odczynniki do rep-pcr w formie kitu; 2. bioanalizator, który s u y do rozdzia u amplifikowanych fragmentów na zintegrowanym, p ytkowym mikrosystemie cieczowym (ang. microfluidic chip) i detekcji opartej na pomiarze intensywno- Êci fluorescencji i czasie migracji 3. oprogramowanie do analizy wyników (jest to analiza w czasie rzeczywistym), które okreêla podobieƒstwo pomi dzy wszystkimi analizowanymi próbkami i raport wygenerowny przez DiversiLab System. Wyniki przedstawione sà w postaci dendrogramów (ilustrujà hierarchiczne relacje pomi dzy izolatami) i wykresów graficznych, mo na uzyskaç równie obraz naêladujàcy elektroforegram. Komercyjnie dost pne kity, automatyzacja, prostota wykonania, szybkoêç (do ok. 4 godzin), przyjazny raport czyni DiversiLab System atrakcyjnym i dost pnym dla wszystkich laboratoriów mikrobiologicznych. DiversiLab System zosta wystandaryzowany dla wielu bakterii, dro d aków i dermatofitów. Ca y szereg prac naukowych donosi o du ej powtarzalno- Êci wewnàtrz- i mi dzylaboratoryjnej. Brano pod uwag ró ne warunki hodowli drobnoustrojów, st enie i jakoêç matrycy do reakcji rep-pcr, badano powtarzalnoêç w wielu laboratoriach z udzia em ró nego personelu i sprz tu laboratoryjnego. Manualny rep-pcr jest u yteczny w typowaniu szczepów, ale podwa any jest przez niskà powtarzalnoêç mi dzylaboratoryjnà, jest bardziej czasoch onny oraz wymaga rozdzia u i detekcji amplikonów na elu agarozowym. ReprodukcyjnoÊç metod genotypowania jest punktem krytycznym w d ugoterminowych badaniach epidemiologicznych i dla porównania archiwizowanych wzorów fingerprint. Wykazano, e rep-pcr fingerprinting jest stabilny po wielu pasa ach bakterii, powtarzalny w obr bie szczepu i odleg y pomi dzy szczepami. Zadowalajàcy potencja ró nicujàcy i powtarzalnoêç wzorów fingerprint dla rep-pcr Êwiadczy o przydatnoêci tej metody do porównania d ugoterminowych badaƒ i studiów epidemiologicznych. Podsumowanie Wybór metody molekularnej nale y dostosowaç do problemu, który chcemy rozwiàzaç: wykrywanie, identyfikacja, ró nicowanie, badania taksonomiczne. Nie bez znaczenia istotne sà tu równie aspekty techniczne tj. stopieƒ trudno- Êci wykonania (doêwiadczenie personelu), zaplecze badawcze (sprz t, którym dysponujemy), atwoêç interpretacji wyników, czas wymagany do analizy, ca kowite koszty stosowanej metody, oraz koszty pojedynczej próbki. W diagnostyce mikrobiologicznej system genotypowania drobnoustrojów powinien byç równie tak dobrany, aby metoda by a wystarczajàco czu a, powtarzalna, odtwarzalna i powinna mieç du y potencja ró nicujàcy. 9\n12 mikrobiologia Enterokoki oporne na wankomycynę (VRE) epidemiologia i metody wykrywania dr Alicja Kuch Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Instytutu Leków w Warszawie 12 Enterokoki sà wzgl dnie beztlenowymi Gram-dodatnimi ziarenkowcami. Wyodr bnienie Enterococcus jako jednostki taksonomicznej nowego rodzaju wêród bakterii Gram-dodatnich, nastàpi o po roku 1980, co wiàza o si z wynikami badaƒ przeprowadzonych z wykorzystaniem nowych technik molekularnych uprzednio bakterie te zaliczano do paciorkowców grupy D. Do dziê opisano ponad 30 gatunków Enterococccus spp. (1). W praktyce klinicznej najcz Êciej wykrywa si i izoluje: Enterococcus faecalis (80 95%) i Enterococcus faecium (5 15%). W ostatnich latach E. faecium staje si jednak patogenem coraz powszechniejszym, co t umaczy si jego wi kszà opornoêcià na antybiotyki. Infekcje wywo ane przez pozosta e gatunki rodzaju Enterococcus sà sporadyczne. Enterokoki sà szeroko rozpowszechnione w Êrodowisku: wyst pujà zarówno w wodzie, jak i w glebie, spotkaç je mo na powszechnie w Êwiecie roêlin i zwierzàt. U ludzi wchodzà w sk ad mikroflory jelitowej, choç mogà równie kolonizowaç skór, cewk moczowà i eƒskie drogi rodne (2). Enterokoki nale y traktowaç jako drobnoustroje oportunistyczne powodujàce infekcje u osób z obni- onà odpornoêcià, hospitalizowanych, cierpiàcych na choroby przewlek e oraz poddawanych d ugotrwa ej antybiotykoterapii, zw aszcza cefalosporynami i glikopeptydami. Enterokoki powodujà zaka enia uk adu moczowego, zapalenie wsierdzia, posocznic, zaka enia w obr bie jamy brzusznej oraz infekcje mieszane ran oparzeniowych i chirurgicznych. Sporadycznie izolowane sà z zapaleƒ opon mózgowo-rdzeniowych i uogólnionych zaka- eƒ noworodkowych. Enterokoki nie posiadajà wielu spoêród czynników zjadliwoêci charakterystycznych dla innych Gram-dodatnich bakterii chorobotwórczych. Wytwarzajà jednak czynniki u atwiajàce ich adhezj do komórek gospodarza (adhezyna bia ko wià àce kolagen), czynniki modulujàce odpornoêç organizmu (bia ka wià àce domen Fc przeciwcia, peroksydaz, dysmutaz nadtlenkowà, feromony p ciowe) oraz czynniki wywo ujàce zmiany patologiczne takie jak: cytolizynya (hemolizyna), proteinazy, hialuronidaza (3,4). Po pa eczkach z rodziny Enterobacteriacae i Staphylococcus aureus enterokoki zajmujà trzecie miejsce wêród patogenów szpitalnych w USA i Europie (6,23). Do zaka eƒ szpitalnych mo e dochodziç zarówno na drodze endogennej jak i egzogennej, w tym ostatnim przypadku zw aszcza przez r ce personelu medycznego. Przyczynà utrzymywania si enterokoków w Êrodowisku szpitalnym jest ich opornoêç na czynniki fizyko-chemiczne, niskie wymagania od ywcze oraz naturalna i nabyta opornoêç na wiele antybiotyków i chemioterapeutyków. Dla rozpowszechniania wyst powania tej bakterii nie bez znaczenia jest równie wzrost liczby osób z niedoborami uk adu immunologicznego. Enterokoki nale à do najbardziej opornych na wysokie temperatury spoêród wszystkich bakterii nieprzetrwalnikujàcych. Wzrastajà w temperaturze C, w Êrodowisku 9,6% NaCl, przy ph 9,6 i prze ywajà ogrzewanie w 60 C przez 30 minut (2,7). Naturalna opornoêç, b dàca w aêciwo- Êcià rodzaju, dotyczy penicylin izoksazolilowych, niskich st eƒ antybiotyków aminoglikozydowych, kotrimoksazolu, cefalosporyn, linkozamidów oraz niskich st eƒ glikopeptydów u gatunków E. casseliflavus i E. gallinarum (fenotyp VanC). OpornoÊç nabyta jest nowà cechà szczepów, wynikajàcà ze zmian w materiale genetycznym. Z klinicznego punktu widzenia najistotniejsze znaczenie ma opornoêç na wysokie st - enie aminoglikozydów (HLAR) oraz opornoêç na wankomycyn (VRE). OpornoÊç ta stanowi powa ne niebezpieczeƒstwo, poniewa glikopeptydy sà antybiotykami z wyboru w terapii powa nych zaka eƒ wieloopornymi szczepami enterokoków oraz opornych na metycylin gronkowców (MRSA). Ponadto enterokoki mogà przekazywaç geny kodujàce opornoêç na glikopeptydy innym drobnoustrojom, np. Staphylococcus aureus (8). Szczepy E. faecium i E. faecalis HLAR i VRE w àczono na list szpitalnych patogenów alarmowych (5). Wankomycyna jest glikopeptydem o z o onej budowie chemicznej wywierajàcym dzia anie bakteriobójcze na bakterie Gram-dodatnie poprzez hamowanie syntezy g ównego sk adnika Êciany komórkowej bakterii, peptydoglikanu. Tworzy kompleks z D-alanylo-D-alaninà w czàsteczce prekursora mureiny hamujàc polimeryzacj i transpeptydacj peptydoglikanu. Mechanizm opornoêci na wankomycyn polega na wytwarzaniu przez bakterie zmienionych czàsteczek dipeptydów: D-alanino- D-mleczanu oraz D-alanino-D-seryny o niskim powinowactwie do wankomycyny, które w àczane sà zamiast D-alanylo-D-alaniny w aƒcuch prekursora. Wówczas wankomycyna nie jest ju w stanie zablokowaç syntez peptydoglikanu (9). Opisano dotychczas 6 fenotypów opornoêci na wankomycyn : VanA (10), VanB (11), VanC (12), VanD (13,14), VanE (15) i VanG (16) (Tabela 1). Fenotypy te ró nià si mi dzy sobà lokalizacjà genów warunkujàcych opornoêç (w tym zdolnoêcià do ich horyzontalnego rozprzestrzeniania), poziomem ekspresji, zakresem opornoêci i znaczeniem klinicznym. SpoÊród nabytych i rozprzestrzeniajàcych si horyzontalnie fenotypów najlepiej scharakteryzowane i najbardziej powszechne sà VanA i VanB. Fenotyp VanA zdefiniowany jest poprzez indukowalnà opornoêç na wysoki poziom wankomycyny i teikoplaniny. Fenotyp VanB cechuje indukowalna opornoêç wobec wankomycyny na ró nym poziomie i wra liwoêç na teikoplanin. OpornoÊç VanA i VanB jest przekazywana mi dzy drobnoustrojami za pomocà ru-\n13 chomych elementów genetycznych takich jak plazmidy i transpozony. Fenotyp VanC jest zwiàzany z konstytutywnym, niskim stopniem oporno- Êci na wankomycyn i wra liwoêcià na teikoplanin. Fenotyp VanD przypomina VanB i charakteryzuje si konstytutywnà opornoêcià na wankomycyn i niskà opornoêcià na teikoplanin. Szczepy o fenotypie VanE wykazujà niski stopieƒ opornoêci na wankomycyn i wra liwoêç na teikoplanin. Szczep E. faecalis, zaklasyfikowany jako VanG, wykazuje wra liwoêç na glikopeptydy podobnà do enterokoków o fenotypie VanE, ale zespó genów warunkujàcych t opornoêç (vang) posiada odmiennà organizacj ni pozosta e znane loci dla van (16). Enterokoki oporne na wankomycyn VRE (ang. vancomycin-resistant enterococcus) wykryto po raz pierwszy w Europie w 1986 r. (17,18), a w 1988 r. opisano je w Stanach Zjednoczonych (19). W Polsce szczepy oporne na wankomycyn zarejestrowano po raz pierwszy w grudniu 1996 roku na oddziale hematologicznym Szpitala Klinicznego w Gdaƒsku (20). Od momentu pojawienia si szczepów VRE na Êwiecie obserwujemy systematyczny wzrost liczby infekcji wywo anych tymi szczepami. W USA liczba szpitalnych zaka eƒ VRE wzros a drastycznie w okresie z 0,3% do 25,2%, co zwiàzane jest z masowym wykorzystaniem wankomycyny w terapii zaka eƒ szczepami MRSA i biegunki poantybiotykowej wywo anej przez Clostridium difficile (6). W USA szczepy VRE izoluje si g ównie wêród pacjentów oddzia ów intensywnej opieki medycznej, nie stwierdzono natomiast pozaszpitalnych rezerwuarów VRE (21,22). Wg danych European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) w Europie liczba zaka eƒ szpitalnych VRE jest znacznie ni sza, pomimo obserwowanej tendencji wzrostowej z 3,3% w roku 2001 do 7,8% w roku 2004 (23). Najbardziej istotny statystycznie wzrost liczby szpitalnych zaka eƒ VRE w ciàgu ostatnich pi ciu lat odnotowano w pi ciu krajach: Grecja, W ochy, Anglia, Irlandia oraz Portugalia. Wi kszoêç epidemii szpitalnych VRE dotyczy oddzia ów hematologicznych i nefrologicznych i zwiàzana jest z rozprzestrzenianiem si wieloopornego, epidemicznego, szpitalnego kompleksu klonalnego 17 (CC 17) szczepów E. faecium (23, 24). W Europie, w przeciwieƒstwie do Stanów, opisano pozaszpitalne rezerwuary szczepów VRE wêród zdrowych ludzi (bezobjawowych nosicieli) i zwierzàt hodowlanych. Prawdopodobnym êród em pozaszpitalnych szczepów VRE by y zwierz ta, karmione paszà wzbogaconà innym antybiotykiem glikopeptydowym awoparcynà (25). Szczepy zwierz ce via aƒcuch pokarmowy uleg y przeniesieniu na ludzi a ich geny opornoêci przeniesieniu na szczepy pochodzenia ludzkiego za pomocà ruchomych elementów genetycznych (transpozony) (22). Kolonizacja dotyczy g ównie przewodu pokarmowego, rzadziej ujêcia cewki moczowej. Kolonizacja VRE zdrowych ludzi mo e trwaç od kilku tygodni do kilku lat (22) i stanowiç êród o infekcji VRE dla osób z grupy ryzyka (d ugotrwa a hospitalizacja, d ugotrwa a antybiotykoterapia, pobyt na oddziale intensywnej terapii, hematologicznym lub onkologicznym) (21). Dlatego wyhodowanie VRE od osoby z personelu medycznego wià e si z koniecznoêcià odsuni cia jej, do czasu ustania nosicielstwa, od opieki nad pacjentami VRE ujemnymi (21,26). Pacjenci skolonizowani lub zaka eni VRE powinni podlegaç procedurom opracowanym przez Zespó ds. Kontroli Zaka eƒ w celu zapobiegania i kontroli rozprzestrzeniania si zaka- eƒ VRE. W ostatnich latach prowadzi si badania z u yciem doustnych antybiotyków nad eradykacjà kolonizacji, co umo liwi kontrol rozprzestrzeniania si i zmniejszenie cz stoêci infekcji VRE (27). Identyfikacja Enterokoków Ziarniaki Gram-dodatnie katalazoujemne rodzaju Enterococcus w preparatach barwionych uk adajà si pojedynczo, parami lub w krótkie aƒcuszki. Schemat diagnostyczny enterokoków obejmuje ich izolacj na pod o u agarowym (Columbia, TSA, Schaedler) wzbogaconym krwià, identyfikacj fenotypowà do rodzaju i gatunku, oraz oznaczenie wra liwo- Êci na antybiotyki i chemioterapeutyki (antybiogram) zgodnie z rekomendacjami CLSI i KORDL obejmujàce: badanie w kierunku opornoêci na wysokie st enia aminoglikozydów (tzw. fenotyp HLAR) i opornoêci na wankomycyn (w przypadku VRE z oznaczeniem minimalnego st enia hamujàcego, MIC, wankomycyny i teikoplaniny). Szybka i precyzyjna identyfikacja do poziomu gatunku, szczególnie w przypadku ci kich zaka eƒ enterokokowych (zapalenie wsierdzia, posocznica), stanowi wa nà wskazówk terapeutycznà do momentu oznaczenia lekowra liwo- Êci badanego szczepu. Identyfikacja E. casseliflavus i E. gallinarum, które sà naturalnie oporne na wankomycyn (obecnoêç genu vanc), pozwala z góry uniknàç stosowania wankomycyny w terapii zaka eƒ wywo anych przez te gatunki. KoniecznoÊcià wydaje si obecnie rozró nienie gatunków E. faecalis i E. faecium ze wzgl du na ich znaczenie kliniczno-epidemiologiczne i gatunkowo-specyficzne mechanizmy opornoêci na leki (naturalna opornoêç E. faecalis na chinupristin / dalfopristin ) (28). Na pod o ach wzbogaconych krwià enterokoki rosnà w postaci kolonii szaro-bia ych, g adkich i okràg ych z hemolizà lub bez. Szczepy E. faecalis wytwarzajàce cytolizyn (hemolizyn ) na pod o ach agarowych z krwià króliczà, ludzkà lub koƒskà wykazujà hemoliz typu beta. Natomiast na pod o u agarowym z dodatkiem krwi baraniej szczepy te mogà dawaç hemoliz alfa lub gamma (brak hemolizy). Inne gatunki sà zazwyczaj alfa-hemolizujàce. Powszechnie stosowane pod o a wybiórczo-ró nicujàce dla enterokoków zawierajà ó ç, eskulin i cytrynian elaza oraz azydek sodu. Na tych pod o ach wokó kolonii enterokokowych pojawia si bràzowo-czarne zabarwienie wskutek hydrolizy eskuliny do eskuletiny, która reaguje z cytrynianem elaza dajàc barwny kompleks. Dodatek cytrynianu i azydku sodu warunkuje wybiórczoêç pod o a w stosunku do bakterii Gram-ujemnych i innych ni enterokoki Gram-dodatnich. Identyfikacja i zró nicowanie enterokoków do rodzaju obejmuje: wyglàd kolonii i typ hemolizy na pod- o u agarowym wzbogaconym krwià baranià, wyglàd drobnoustrojów w preparacie barwionym metodà Grama, 13\n14 14 zdolnoêç do wytwarzania katalazy, zdolnoêç wzrostu w zakresie temperatur C, zdolnoêç wzrostu w bulionie o ph 9,6 oraz w bulionie z dodatkiem 6,5% NaCl, zdolnoêç hydrolizy eskuliny w obecnoêci 40% ó ci, zdolnoêç do hydrolizy L-pyrrolidonylo-β-naftylamidu (test PYR) i L-leucynoβ-naftyloamidu (test LAP). ZdolnoÊç hydrolizy PYR posiada ponad 96% enterokoków i wszystkie rozk adajà LAP. Wyjàtek stanowià gatunki o niewielkim znaczeniu klinicznym: E. cecorum, E. columbae i E. saccharolyticus, które nie posiadajà zdolnoêci hydrolizowania PYR (29,30), okreêlenie przynale noêci do grupy serologicznej D wg Lancefield (antygen D wyst puje u oko o 80% szczepów enterokoków). W celu identyfikacji enterokoków do poziomu gatunki wykorzystuje si g ównie ich cechy biochemiczne zgodnie ze schematem zaproponowanym przez Facklama (31,29): fermentacja cukrów i alkoholi (rafinoza, sacharoza, mannitol, sorbitol), hydroliza argininy, wykorzystanie pirogronianu z wytworzeniem acetoiny. W identyfikacji gatunku pomocne jest równie : obserwowanie ruchu umo liwiajàce odró nienie E. casseliflavus i E. gallinarum (gatunki ruchliwe) od E. faecalis i E. faecium (gatunki nie wykazujàce ruchu), wytwarzanie ó tego barwnika na pod o u agarowym przez E. casselifavus, E. mundtii i E. sulfurens, redukacja tellurynu potasu podczas wzrostu na pod o u agarowym z dodatkiem 0,04% tellurynu. Do ca kowitej redukcji tellurynu zdolny jest jedynie gatunek E. faecalis, po owicznà reakcj wykazujà natomiast gatunki ruchliwe: E. casseliflavus i E. gallinarum. Pozosta e istotne kliniczne gatunki enterokoków (E. faecium, E. durans, E. avium, E. hirae) wykazujà wynik ujemny w tym teêcie (31,32). E. faecalis wzrasta na pod- o u z dodatkiem 0,04% tellurynu potasu w postaci czarnych koloni w wyniku inkrustacji komórek bakteryjnych per owo-czarnymi kryszta ami zredukowanego do metalicznego telluru tellurynu potasu. Zaproponowany przez Facklama (31) schemat identyfikacji fenotypowej enterokoków do poziomu gatunku sta si podstawà do opracowania komercyjnych testów identyfikacyjnych o charakterze automatycznym i pó automatycznym wykorzystywanych rutynowo w laboratoriach mikrobiologicznych (33,34). Oznaczanie opornoêci na wankomycyn Rutynowo stosowanà w laboratoriach mikrobiologicznych metodà wykrywania VRE jest metoda dyfuzyjno-krà kowa z u yciem krà ków o zawartoêci wankomycyny 30 µg i teikoplaniny 30 µg (35,36). Nale y pami taç o koniecznoêci 24 godzinnej inkubacji. Odczyt przeprowadzaç nale y w Êwietle przechodzàcym. Izolat uznajemy za oporny równie w przypadku wzrostu mg awicowego i obecnoêci kolonii w strefie zahamowania wzrostu. Dla szczepów wykazujàcych stref Êredniej wra liwoêci nale y oznaczyç MIC lub oznaczyç wra liwoêç na glikopeptydy metodà przeglàdowà rekomendowanà przez CLSI. Na pod o e BHIA (Brain Heart Infusion Agar) o zawartoêci 6 µg/ml wankomycyny nale y nanieêç 10 µl zawiesiny bakteryjnej o g stoêci 0,5 McFarlanda, a nast pnie inkubowaç 24 godziny w temp. 35 C w warunkach tlenowych. Izolat uznaje si za oporny w przypadku uzyskania jego wzrostu na pod o u w postaci co najmniej jednej kolonii. Do okreêlenia fenotypu opornoêci badanego izolatu nale y wówczas okreêliç MIC oraz potwierdziç identyfikacj do gatunku. Konieczne jest wykonanie testu na ruch oraz wytwarzanie barwnika w celu rozró nienia czy nie mamy do czynienia z gatunkami o naturalnej oporno- Êci na wankomycyn (E. gallinarum i E. casseliflavus), które cz sto rosnà na pod o u z 6 µg/ml wankomycynà (35,36). Problem diagnostyczny stanowiç mogà E. gallinarum i E. casseliflavus nie wykazujàce ruchu, wówczas przydatny jest test na zakwaszenie metylo-d-glukopiranozydu (MGP). E. gallinarum i E. casseliflavus zakwaszajà MGP, natomiast E. faecium i E. faecalis nie wykazujà tej reakcji (37). Do badaƒ przesiewowych w kierunku VRE wykorzystywane sà równie pod- o a mikrobiologiczne zawierajàce obok wankomycyny substancje hamujàce wzrost innych drobnoustrojów ni szczepy wankomycynooporne (np. azydek sodu) oraz substancje wskaênikowe dla enterokoków (eskulina, 40% ó ç). Coraz cz Êciej do pod o y dodawane sà wskaêniki chromogenne. Ró ne systemy automatyczne stosowane w laboratoriach mikrobiologicznych dysponujà panelami antybiotykowymi umo liwiajàcymi wykrycie i zró nicowanie fenotypów VRE na VanA, VanB i VanC. Sà to testy szybkie, wiarygodne i odznaczajàce si wysokà czu oêcià (38,33,34). Referencyjnà metodà wykrywania VRE jest analiza molekularna z wykorzystaniem techniki PCR, za pomocà której precyzyjne okreêla si system opornoêci obecny w danym szczepie (39). PCR z regu y wykorzystywany jest w celu potwierdzenia klasycznych, fenotypowych oznaczeƒ lekowra liwoêci. Gwa towny wzrost liczby zaka eƒ enterokokowych, szczególnie w Êrodowisku szpitalnym, powoduje koniecznoêç wykonania badaƒ epidemiologicznych, w tym typowania fenotypowego i genotypowego, jako elementu systemu kontroli zaka eƒ. Typowanie, czyli ró nicowanie wewnàtrzgatunkowe polega na badaniu pokrewieƒstwa pomi dzy izolatami poddanymi analizie. Prowadzi ono do identyfikacji ogniska epidemicznego, ustalenia êród a i dróg transmisji szczepów epidemicznych (40). Metody fenotypowe wewnàtrzgatunkowego ró nicowania izolatów opierajà si na porównaniu np. cech biochemicznych, serologicznych, czy wzorów lekowra liwoêci, natomiast metody genotypowe (genetyczne, molekularne) polegajàce na analizie ró nic zawartoêci DNA chromosomalnego i pozachromosomalnego oraz ró nic okreêlonych sekwencji DNA pomi dzy poszczególnymi izolatami (41). Metoda referencyjna, wysoce ró nicujàca, stosowana w genotypowaniu enterokoków to analiza fragmentów restrykcyjnych chromosomalnego DNA w elektroforezie w zmiennym polu elektrycznym- RFLP-PFGE (Restriction Fragment Length Polimorphism Pulsed-Field Gel Electrophoresis) (42). Szybkà i atwà metodà typowania jest analiza liczby tandemowych\n15 powtórzeƒ MLVA (Multilocus variable-number tandem repeat analysis) (43). Technika ta opiera si na analizie tandemowo powtarzajàcych si sekwencji par zasad (minisatelitarny DNA) równoczeênie dla kilku wybranych loci. Liczba powtórzeƒ jest zró nicowana wêród ró nych szczepów tego samego gatunku, co jest spowodowane licznymi zdarzeniami rekombinacyjnymi. Ostatnio coraz cz Êciej wykorzystywanà metodà w ocenie pokrewieƒstwa szczepów bakteryjnych w badaniach populacyjnych i analizie epidemiologicznej jest technika MLST (Multilocus Sequence Typing). Polega ona na sekwencjonowaniu okre- Êlonych fragmentów kilku genów kodujàcych enzymy metabolizmu podstawowego (w przypadku enterokoków 7 genów) odznaczajàcych si pewnym stopniem polimorfizmu. Metoda ta odznacza si wysokà czu- oêcià i powtarzalnoêcià. Umo liwia identyfikacj drobnoustrojów i analiz porównawczà profili allelicznych z wykorzystaniem internetowej bazy danych ( (44). Podsumowanie Wankomycycnooporne szczepy enetrokoków nale à do szpitalnych patogenów alarmowych i stanowià coraz cz stsze êród o epidemii szpitalnych dlatego znajomoêç mechanizmów opornoêci, szybka i precyzyjna diagnostyka, równie do poziomu gatunku, pozwala uniknàç powa nych b dów terapeutycznych i selekcji szczepów opornych. Coraz wi ksza dost pnoêç ró norodnych pod o y diagnostycznych, testów automatycznych i biochemicznych pozwala na skrócenie czasu identyfikacji patogenu. Rozwój i dost pnoêç nowych technik molekularnych umo liwi, nie tylko precyzyjna identyfikacj patogenu, czy mechanizmu opornoêci ale równie Êledzenie rozprzestrzeniania si fenotypów opornoêci, opracowywanie ognisk epidemicznych oraz porównywanie izolatów wyst pujàcych na ca ym Êwiecie. PiÊmiennictwo u Autora Tabela 1. Charakterystyka fenotypów VRE (5,21) Fenotyp opornoêci VanA VanB Vanc VanD VanE VanG Gatunki E. faecium E. faecium E. gallinarum E. faecium E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. casseliflavus E. faecalis E. gallinarum E. casseliflavus E. avium E. durans E. mundtii E. raffinosus OpornoÊç na Wankomycyna Wankomycyna Wankomycyna antybiotyk Teikoplanina Teikoplanina Wankomycyna Wankomycyna Wankomycyna MIC (mg/l) Wankomycyny MIC (mg/l) Teikoplaniny ,5 1 0, ,5 0,5 15 Poziom opornoêci wysoki zró nicowany niski Êredni niski niski Znaczenie kliniczne du e du e Êrednie nieznane nieznane nieznane Typ opornoêci nabyta nabyta naturalna nabyta nabyta nabyta Przenoszenie Tn1546 na plazmidzie Tn1547 na plazmidzie chromosomalnie chromosomalnie chromosomalnie chromosomalnie Syntetyzowany dipeptyd D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Ser Regulacja indukowalna indukowalna indukowalna konstytutywna konstytutywna indukowalna indukowalna\n16 BADANIA PRZESIEWOWE BAKTERII WIELOOPORNYCH chromid VRE Podłoże chromogenne do badań przesiewowych E. faecium i E. faecalis wykazujących nabytą oporność na wankomycynę (VRE) Izolacja enterokoków opornych na wankomycynę VRE i Decyzja o Izolacji Pacjenta\n17 ocena produktu Ocena przydatności podłoża chromid VRE firmy biomérieux w monitorowaniu zakażeń szpitalnych dr Elżbieta Stefaniuk, dr Alicja Kuch Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie Zaka enia wywo ywane wankomycynoopornymi enterokokami (VRE, ang. vancomycin resistant enterococci) stanowià problem na ca ym Êwiecie, w tym tak e i w naszym kraju. Pierwsze udowodnione epidemiologicznie zaka enie VRE w Polsce, mia- o miejsce ju w roku 1997 i od tego czasu obserwowaç mo na nasilenie tego zjawiska w skali ca ego kraju. Zaka enia Enterococcus spp. dotyczà w du ej mierze osób z dysfunkcjà uk adu immunologicznego, zw aszcza chorych onkologicznych, hematologicznych, zarówno pacjentów w wieku dzieci cym, jak i w wieku dojrza ym. Zaka enia enterokokowe mogà mieç charakter endogenny, jak równie, egzogenny stwarzajàcy istotne problemy epidemiologiczne, przenoszony z pacjenta na pacjenta. Do najcz stszych zaka eƒ enterokokowych nale à wywo ywane przez szczepy Enterococcus faecalis oraz E. faecium Wysi ki mikrobiologów zmierzajà w kierunku szybkiego i wiarygodnego stwierdzenia zaka enia, kolonizacji czy te nosicielstwa Enterococcus spp. oraz okreêlenia ich lekowra liwoêci z jednoczesnà identyfikacjà mechanizmów oporno- Êci, takich jak opornoêç wysokiego stopnia na aminoglikozydy tzw. HLAR (ang. high level aminoglicoside resistance), czy opornoêç na leki glikopeptydowe (wankomycyn, teikoplanin ). Zgodnie z zasadami monitorowania zaka eƒ szpitalnych, coraz wi cej szpitali wykonuje badania przesiewowe w kierunku patogenów charakteryzujàcych si groênymi mechanizmami opornoêci. Cel pracy W Zak adzie Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie przeprowadzono badanie walidacyjne pod o y chromogennych chromid VRE firmy biomérieux przeznaczonych do badaƒ przesiewowych, pozwalajàcych wykryç w badanym materiale szczepy enterokoków opornych na wankomycyn, z jednoczesnym rozró nieniem na podstawie ró nego zabarwienia kolonii szczepów E. faecalis (kolor niebiesko-zielony) i E. faecium (kolor fioletowy). Celem badania by a ocena przydatnoêci pod- o a chromid VRE firmy biomérieux do pracy rutynowej w monitorowaniu zaka eƒ VRE. Materia i metody Badanie przeprowadzono dwutorowo: a. z wykorzystaniem 70 izolatów klinicznych E. faecium (n=30), E. faecalis (n=30) i E. gallinarum (n=10) pochodzàcych z materia ów klinicznych od pacjentów hospitalizowanych w polskich szpitalach i znajdujàcych si w kolekcji NIL. Szczepy te charakteryzowa y si ró nà wra liwo- Êcià na leki glikopeptydowe: szczepy wankomycynowra liwe (n=20) oraz z obecnoêcià mechanizmów VanA (n=20), VanB (n=20) i VanC (n=10), b. z wykorzystaniem materia ów klinicznych (wymazy z odbytu) od siedmiu chorych hematologicznych. Materia kliniczny opracowywano równolegle wg rutynowej procedury z wykorzystaniem pod o y wzrostowych i ró nicujàcych w kierunku enterokoków. Wszystkie u yte do badania izolaty zosta y dobrze scharakteryzowane w Zak adzie Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej NIL, dzi ki zastosowaniu ró nych technik identyfikacyjnych (metody konwencjonalne i automatyczne), metod oznaczania lekowra liwosci (metoda mikrorozcienczeƒ w bulionie wg zaleceƒ CLSI, metoda E-test wg zaleceƒ AB Biodisk), technik biologii molekularnej metody PCR do wykrywania genów oporno- Êci vana, vanb i vanc. Wyniki uzyskane tymi metodami stanowi y wyniki odniesienia w prowadzonej ocenie. Kontrol jakoêci przeprowadzono z u yciem szczepów wzorcowych z kolekcji ATCC oraz kolekcji MIKROBANK. Badane izolaty w postaci hodowli na pod o u Columbia Agar z 5% krwi baraniej oraz materia y posiewano metodà redukcyjnà na pod o e chromid VRE firmy biomérieux w dwojaki sposób: bezpoêrednio na pod o e chromogenne oraz po wcze- Êniejszej godzinnej inkubacji w temp. 37 C w bulionie mózgowosercowym (Brain-Heart broth) z krà kiem antybiogramowym zawierajàcym 30 µg wankomycyny. Posiane w ten sposób pod o a inkubowano 24 godz. w 37 C w warunkach tlenowych. Nast pnie obserwowano charakter wzrostu oraz zabarwienie kolonii poszczególnych izolatów. W przypadku bezpoêredniego posiewu na pod o- e chromogenne, w sytuacji skàpego wzrostu lub braku wzrostu, inkubacj przed u ano o kolejne 24 godziny, zgodnie z zaleceniami producenta pod o a. Ocenie poddawano wzrost lub jego brak oraz zabarwienie kolonii poszczególnych izolatów bakteryjnych u ytych do badania, wyniki porównywano do wyników metod odniesienia. W przypadku posiewów materia ów klinicznych obserwowano charakter wzrostu drobnoustrojów, oceniano stopieƒ trudnoêci interpretacji uzyskanego obrazu tak e w odniesieniu do wyników uzyskanych metodami konwencjonalnymi. Wyniki I. Izolaty bakteryjne E. faecalis, E. faecium i E. gallinarum B. wyniki posiewu bezpoêredniego na pod o e chromid VRE Po 24-godzinnej inkubacji w 37 C w warunkach tlenowych uzyskano wyraêny wzrost, w postaci drobnych 17\n18 18 kolonii szczepów E. faecalis i E. faecium, u których wykryto metodami odniesienia mechanizmy VanA i VanB. Kolonie E. faecalis wykazywa y zabarwienie od zielonego, poprzez turkusowy, a do niebieskiego. Kolonie szczepów E. faecium zabarwione by y na kolor fioletowy o ró nej intensywnoêci. Po przed u eniu czasu inkubacji o kolejne 24 godziny w warunkach j.w. uzyskano wzrost badanych szczepów w postaci du ych, intensywnie zabarwionych kolonii. Uzyskany obraz nie stwarza problemów identyfikacyjnych. Po 24-godzinnej inkubacji w 37 C w warunkach tlenowych, w przypadku wankomycynowra liwych szczepów E. faecalis i E. faecium oraz szczepów nale àcych do gatunku E. gallinarum uzyskano delikatny, smu àcy wzrost na linii pierwszego posiewu wyraênie ró niàcy si od wzrostu szczepów wankomycynoopornych. Nie obserwowano wzrostu na ca ej powierzchni posiewu. Obraz nie ulega zmianie po kolejnej dobie inkubacji. B. wyniki posiewu badanych szczepów z zastosowaniem etapu namna ania W posiewie na pod o e chromid VRE, poprzedzonym etapem namna- ania badanych szczepów E. faecalis, E. faecium oraz E. gallinarum w bulionie mózgowo-sercowym (Brain- Heart broth) w obecnoêci krà ka antybiogramowego z 30 µg wankomycyny, uzyskano wzrost wy àcznie wankomycynoopornych szczepów E. faecalis i E. faecium w postaci du- ych intensywnie zabarwionych kolonii pozwalajàcych odró niç mi dzy sobà te dwa gatunki drobnoustroju. W miejscu posiewu szczepów E. faecalis i E. faecium wankomycynowra liwych i szczepów E. gallinarum nie uzyskano adnego wzrostu. kolonie zabarwione na fioletowo bàdê turkusowo, których izolacja i identyfikacja potwierdzi y przynale noêç do rodzaju Enterococcus. Drobnoustroje towarzyszàce rosnà na pod o u w postaci kolonii bezbarwnych. B. wyniki posiewu wymazów z odbytu z zastosowaniem etapu namna ania Po zastosowaniu wczeêniejszego etapu namna ania, na pod o u chromid VRE uzyskano wzrost mniej liczny ni w przypadku tych samych materia ów z posiewu bezpoêredniego. ObecnoÊç pojedynczych kolonii oraz intensywniejsze zabarwienie u atwia o interpretacj otrzymanego obrazu, kolonie o zabarwieniu fioletowym by y du e, w odró nieniu od kolonii turkusowych, których wzrost okreêlono jako s aby, a intensywnoêç zabarwienia jako Êrednià. Kolonie o zabarwieniu fioletowym i turkusowym poddawano dalszej identyfikacji: w preparacie mikroskopowym barwionym metodà Grama widoczne by y komórki ziarniaków Gram-dodatnich, po uzyskaniu wzrostu na pod o u agarowym z krwià wykonano identyfikacj biochemicznà testem rapid ID 32 Strep. Wyniki identyfikacji wskaza y w jednym przypadku Enterococcus faecalis, w pozosta ych E. faecium. Otrzymane wyniki by y zgodne z uzyskanymi metodami odniesienia. III. Sposób wykonania posiewu na pod o u chromid VRE Posiew redukcyjny zarówno materia ów klinicznych jak i szczepów bakteryjnych pozwoli uzyskaç wzrost pojedynczych kolonii badanych drobnoustrojów, co w po àczeniu z zabarwieniem kolonii umo liwi o wst pnà interpretacj oraz przeprowadzenie dalszych badaƒ diagnostycznych. dzi ki wytwarzaniu β-galaktozydazy, E. faecalis kolor niebiesko-zielony dzi ki wytwarzaniu α-glukozydazy. Przeprowadzona analiza z u yciem 70 ró nych pod wzgl dem wra liwo- Êci na leki glikopeptydowe i mechanizmów opornoêci izolatów klinicznych E. faecalis, E. faecium oraz E. gallinarum w pe ni potwierdza to stwierdzenie. Pod o e chromid VRE firmy biomérieux hamuje wzrost szczepów enterokoków, które nie wykazujà ekspresji nabytej opornoêci na wankomycyn, gatunków enterokoków o fenotypie VanC, wi kszoêci bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich oraz grzybów. Przeprowadzone badania wskazujà na koniecznoêç wykonywania posiewu badanego materia u metodà redukcyjnà oraz stosowanie etapu namna ania w bulionie mózgowo-sercowym. Stosowanie tych zaleceƒ umo liwia i u atwia interpretacj wyniku posiewu. Interpretacja wyników posiewu zarówno wyizolowanych izolatów bakteryjnych, jak i materia ów klinicznych powinna byç wykonywana przez do- Êwiadczonego mikrobiologa. Wiedza i doêwiadczenie stanowià gwarancj uzyskania wiarygodnego wyniku. Wybiórcze pod o e chromogenne chromid VRE firmy biomérieux jest pod o em przydatnym do wykrywania wankomycynoopornych szczepów E. faecium i E. faecalis u pacjentów z grup ryzyka. Nale y pami taç, e jest to pod o e do badaƒ przesiewowych i nie zast puje rutynowych metod oznaczania lekowra liwoêci. II. Wymazy z odbytu od pacjentów oddzia u hematologicznego A. wyniki posiewu bezpoêredniego na pod o e chromid VRE Po 24-godzinnej inkubacji w 37 C w warunkach tlenowych p ytek z bezpoêrednim posiewem wymazów z odbytu na pod o e chromid VRE uzyskano wzrost zwartej masy drobnoustrojów charakteryzujàcych si ró nym wyglàdem kolonii pod wzgl dem wielkoêci i zabarwienia. WÊród wyros ych kolonii widoczne sà Wnioski Pod o e chromogenne chromid VRE firmy biomérieux, dzi ki zawartoêci dwóch chromogennych substratów oraz 8 µg/l wankomycyny, pozwala w sposób szybki i wiarygodny wykryç szczepy E. faecalis i E. faecium oporne na wankomycyn. BezpoÊrednie wykrycie E. faecium i E. faecalis mo liwe jest dzi ki charakterystycznemu zabarwieniu kolonii: E. faecium przyjmuje fioletowy kolor\n19 mikrobiologia Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) wytwarzanych przez E. coli i Klebsiella spp. za pomocą testu potwierdzającego wg CLSI oraz kart AST N041 systemu VITEK 2 Łukasz Golec, dr Krzysztof Golec Zakład Mikrobiologii Szpital Wojewódzki nr 2 w Rzeszowie Wprowadzenie Beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) sà grupà enzymów majàcych zdolnoêç hydrolizy nawet trzeciej generacji cefalosporyn. Zaka enia wywo ane bakteriami posiadajàcymi ten mechanizm opornoêci w znacznym stopniu ograniczajà opcje terapeutyczne zaka eƒ wywo- anych przez te szczepy. Z tego powodu szybkie i dok adne wykrywanie bakterii wytwarzajàcych ESBL jest bardzo wa ne w rutynowej pracy ka dego laboratorium mikrobiologii klinicznej, umo liwiajàc nie tylko prawid owà terapi, ale wa ne jest równie w zapobieganiu szerzenia si tego mechanizmu opornoêci w Êrodowisku. Cel pracy Celem niniejszej pracy by o porównanie wykrywania β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym u Escherichia coli i Klebsiella spp. przez system Vitek 2 z zastosowaniem kart AST N041 w porównaniu z testem potwierdzajàcym wg CLSI (5). Materia y i metody Materia badany niniejszej pracy stanowi y izolaty bakterii E. coli i Klebsiella spp., uzyskane z materia ów klinicznych dostarczanych do Zak adu Mikrobiologii Szpitala Wojewódzkiego Nr 2 w Rzeszowie w okresie od 01. marca do 31. lipca 2007 r. Analizie poddano 187 szczepów bakteryjnych, z których 139 pochodzi o z materia ów od chorych hospitalizowanych i 48 z materia- ów pozaszpitalnych (specjalistyczne przychodnie przyszpitalne, poradnie POZ, laboratoria prywatne) (Ryc. 1.). Identyfikacj do gatunku wykonano przy pomocy kart GN systemu VITEK 2, Tab. 1. Rodzaje materia ów, z których uzyskano izolaty Rodzaj materia u IloÊç izolatów Wymaz z górnych dróg oddechowych (gard o, nos) 50 Wymaz z dróg rodnych 44 Wymaz z rany, ropy 42 Mocz 25 Krew, PMR 12 Materia y z dolnych dróg oddechowych (plwocina, BAL) 9 ó ç 5 natomiast oznaczenie obecnoêci ESBL z u yciem kart AST-N041 tego systemu oraz testem potwierdzajàcym wg CLSI (5). 1. Test potwierdzajàcy wg CLSI Na pod o e Mueller-Hinton (biomérieux) nanoszono zawiesin badanego szczepu (o g stoêci 0,5 McFarlanda). Do oznaczeƒ u yto krà ków firmy BectonDickinson wysycanych nast pujàcymi antybiotykami: ceftazydym (CAZ 30 µg), ceftazydym + kwas klawulanowy (CAZ/CLA 30/10 µg), cefotaksym (CIX 30 µg), cefotaksym+kwas klawulanowy (CTX/CLA 30/10 µg). Krà ki umieszczano na p ytce o Êrednicy 90 mm w maksymalnych odleg oêciach od siebie, pozwalajàcej na dok adne zmierzenie stref zahamowania wzrostu. P ytki inkubowano przez 18 h w 37 C i mierzono strefy zahamowania wzrostu. Za dodatni wynik testu uznawano taki w którym, strefa zahamowania wzrostu wokó krà ka zawierajàcego antybiotyk + inhibitor by a wi ksza lub równa 5mm, w porównaniu za strefà wzrostu wokó krà ka z samym antybiotykiem. 2. System VITEK 2 Metoda ta wykorzystuje karty ze studzienkami wype nionymi odpowiednimi antybiotykami. Do badaƒ u yto kart AST-N041 umo liwiajàcych wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym. W sk ad testu ESBL wchodzi szeêç studzienek: zawierajàce sam cefotaksym (CTX) i ceftazydym (CAZ) w st eniach 0,5 µg /ml oraz cefepim (FEP) w st eniu 1µg/ml, oraz studzienki zawierajàce antybiotyk w po àczeniu z kwasem klawulanowym (CTX/CAZ+CLA) w st eniu 0,5/4 µg /ml oraz (FEP + CLA) w st eniu 1/10. Badania wykonywano zgodnie z procedurà zalecanà przez producenta. Wynik testu przedstawiany jest jako: ESBL POS ESBL dodatni: wysokie prawdopodobieƒstwo, e drobnoustrój wytwarza ESBL. ESBL NEG - ESBL ujemny: bardzo niskie prawdopodobieƒstwo, e drobnoustrój wytwarza ESBL. Jako szczepów kontrolnych dla wymienionych metod u yto szczepów: E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, K. pneumoniae ATCC Wyniki i ich omówienie WÊród zbadanych 187 szczepów 144 (77%) nale a o do gatunku E. coli, 36 (19%) Klebsiella pneumoniae, a 7 do gatunku Klebsiella oxytoca, co stanowi o niespe na 4% wszystkich badanych szczepów (Ryc. 2.). W 48 izolatach wyhodowanych z materia ów pozaszpitalnych nie stwierdzono w adnej z metod, szczepów produkujàcych β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym. 19\n20 Ryc. 1. Rozk ad procentowy badanych szczepów pod wzgl dem pochodzenia 25,70% szczepy szpitalne ,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 8,40% àcznie E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 111 Ryc. 2. Badane szczepy E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 5,40% 74,30% szczepy pozaszpitalne Ryc. 3. Liczba izolatów szpitalnych Ryc. 4. Odsetek szczepów ESBL+ w obr bie gatunku E. coli i K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae 3 28% Ryc. 5. Produkcja ró nych typów ESBL 7 Nie stwierdzono równie, szczepów ESBL dodatnich w gatunku Klebsiella oxytoca. Wszystkie szczepy produkujàce ESBL obejmowa y gatunki K. pneumoniae i E. coli oraz pochodzi y wy àcznie z materia ów nades anych od chorych hospitalizowanych. Testem potwierdzajàcym wg CLSI stwierdzono12 szczepów ESBL dodatnich, natomiast przy pomocy systemu VITEK 2 z u yciem kart AST-N041 stwierdzono 13 takich szczepów. Ogó em uzyskano blisko 100% (99,5%) zgodnoêç pomi dzy testami, w tym 100% zgodnoêci uzyskano dla rodzaju Klebsiella sp. i 99,3% dla gatunku E. coli. Wyniki nasze okaza y si zgodne z innymi badaniami, w których stwierdzano równie wysokà zgodnoêç (80 100%), wykrywania enzymów ESBL u tych gatunków bakterii, przy pomocy kart AST-N041 systemu VITEK 2 z innymi metodami rutynowo stosowanymi w klinicznych laboratoriach mikrobiologicznych (3,4). W naszych badaniach, niezgodnoêç dotyczy a jednego szczepu E. coli w którym VITEK 2 wskaza na obecnoêç enzymu, przy bardzo niskich wartoêciach MIC dla Ceftazydymu i Cefotaxymu wynoszàcym <=1 µg/ml, natomiast test wg CLSI uznano za ujemny, gdy ró nica, pomi dzy krà kami dla Ceftazydymu i jego po- àczenia z kwasem klawulanowym, wynosi a tylko 3 mm przy takich samych strefach dla Cefotaxymu oraz jego po àczeniem z klawulanianem. Fot. 1. àcznie w izolatach od chorych hospitalizowanych, uzyskano dwoma metodami 13 szczepów ESBL dodatnich, z czego 6 nale a o do gatunku E. coli i 7 do gatunku K. pneumoniae. Odsetek szczepów ESBL dodatnich dla tych gatunków przedstawia Ryc. 4. Te wycinkowe, obejmujàce okres 5 miesi cy, wskazujà równie na stabilnà iloêç szczepów ESBL dodatnich w szpitalu w stosunku do lat wczeêniejszych, gdzie odsetek tych szczepów w latach by zbli ony dla tych obydwu gatunków. (1) Ocenie poddano równie preferencje substratowe analizowanych szczepów ESBL dodatnich. Tylko jeden szczep Klebsiella pneumoniae produkowa enzymy rozk adajàce wy àcznie cefotaxym, w pozosta ych przypadkach hydrolizowane by y dwie badane cefalosporyny (Ryc. 5.). W 139 izolatach od chorych hospitalizowanych, szczepy ESBL+ pochodzi y z nast pujàcych materia ów: mocz 6, górne drogi oddechowe 3, rana 3, dolne drogi oddechowe 1. Jak wynika z Ryc. 6. blisko po owa szczepów ESBL dodatnich pochodzi a z moczu, co stanowi o 24% wszystkich izolatów z tego materia u. Wnioski 1. System Vitek 2 z dostosowanymi do wykrywania ESBL kartami AST- N041 jest czu ym testem wykrywania tych enzymów u gatunków E. coli i Klebsiella pneumoniae mocz 91,60% górne drogi oddechowe rana ceftazydymaza+ cefotaksymaza+ ceftazydymazacefotaksymaza+ Ryc. 6. Liczbowa zawartoêç szczepów ESBL+ w poszczególnych materia ach szpitalnych dolne drogi oddechowe 23 mm 26 mm Z 139 materia ów nades anych od chorych hospitalizowanych izolaty E. coli stanowi y 111 szczepów natomiast izolaty Klebsiella pneumoniae 25 oraz 3 szczepy K. oxytoca (Ryc. 3.). 2. Metoda wykrywania ESBL przez system Vitek 2 z zastosowaniem kart AST-N041 okaza a si w blisko 100% zgodna z metodà krà kowà wg CLSI i mo e byç z nià stosowana zamiennie. 3. IloÊç szczepów ESBL dodatnich w Szpitalu Wojewódzkim 2 w Rzeszowie, w obr bie gatunków E. coli i K. pneumoniae od 2004 roku jest na stabilnym i stosunkowo niskim poziomie. PiÊmiennictwo u Autorów


W jaki sposób sobie ułatwić życie - kupowanie elektroniki z gazetką promocyjną - jet-pc.com\nW jaki sposób sobie ułatwić życie - kupowanie elektroniki z gazetką promocyjną\nDzisiaj nie wyobrażamy sobie niemalże życia bez elektroniki. Jeżeli masz w planach dla przykładu zakupy nowego telewizora, niewątpliwie często przeglądasz różne strony, na których zamieszczane są informacje o najlepszych promocjach. Jest to niewątpliwie wielce dobry sposób, bo dzięki temu można łatwo upolować interesującą obniżkę na wybrany sprzęt elektroniczny. Obecnie elektronika jest stosunkowo droga – w związku z tym wiele osób decyduje się na kupno telewizora czy laptopa na raty. Jeżeli jednak nie musisz kupować telewizora czy laptopa od razu, wtedy bez wątpliwości powinieneś nieco odczekać.\nKiedy będziesz odpowiednio wytrwały, wówczas na pewno uda Ci się oszukać naprawdę ciekawą promocję. Oczywiście kiedy masz upatrzony konkretny model telewizora i chcesz kupić tylko ten model, wówczas musiałbyś mieć naprawdę spore szczęście, aby zakupić go w promocji. Kiedy jednakże masz wybranych parę różnych modeli, wówczas bez wątpienia któryś z nich uda Ci się znaleźć w promocji. Przede wszystkim z pewnością powinieneś przeglądać portale internetowe firm trudniących się sprzedażą elektroniki. Liczne akcje rabatowe niejednokrotnie organizują sami producenci telewizorów. Jeśli jednak nie mają żadnego sprzętu w promocji, wtedy możesz znaleźć ciekawe promocje na portalach internetowych sporych sklepów z elektroniką.\nfirma HP od dawna jest zaliczana do największych producentów sprzętu komputerowego. Jej oferta obejmuje wiele różnych segmentów rynku, nie tylko komputery stacjonarne i laptopy, ale też mocne serwery i urządzenia do drukowania.\nJeśli chcesz mieć dostęp do najlepszych rabatów, wtedy z pewnością powinieneś udać się do takiego sporego sklepu i zabrać ze sobą gazetkę promocyjną (albo spojrzeć na ten odnośnik: ). W nich zamieszczonych jest mnóstwo rabatów – dzięki takim gazetkom promocyjnym każdy z pewnością będzie w stanie wybrać coś odpowiedniego dla siebie. Kiedy nie wiesz, na jaki konkretnie model się zdecydować, wówczas bez wątpienia powinieneś udać się osobiście do sklepu, a nie dokonywać zakupów przez internet. Dzisiaj każdy wielki sklep z elektroniką zatrudnia jedynie osoby, które się na tym znają, dlatego któraś z nich na pewno będzie w stanie udzielić Ci dobrej porady.\nObecnie każda spółka musi dbać o spokój swojej firmy. Nie jest prosto dbać o wszystko ludziom. Nawet ludzie z ochrony nie pomogą. Trzeba inwestować w sprzęt, który nam pomoże.


W dzisiejszych czasach bardzo ważne jest by oprócz własnej wygody dbać również o to, aby nasze działania nie wpływały negatywnie na środowisko. Jest wiele sposobów aby wykorzystywać w zasadzie nieograniczone źródło jakim jes\nt energia odnawialna. W przypadku domów szczególnie popularne są kolektory słoneczne dzięki którym możliwe jest zbieranie energii słonecznej przy wykorzystaniu specjalnych paneli. Innym sposobem na pozyskiwanie energii ze słońca jest fotowoltaika. Zarówno kolektory słoneczne jak i fotowoltaika cieszą się coraz większą popularnością wśród osób które decydują się na budowę własnego domu. Wiąże się to zarówno z chęcią wykorzystywania tak zwanej czystej energii, ale także z bardziej przyziemnym powodem - oszczędnościami. Dobrze wykonane panele potrafią zapewnić zasilanie dla całego domu, szczególnie w słonecznych miesiącach. Dzięki temu nasze rachunki będą zauważalnie niższe, a w niektórych przypadkach możliwe jest przejście na zasilanie wyłącznie przy wykorzystaniu promieni słonecznych.\nOto Jak uruchomić fotowoltaikę Aby Wszyscy Dookoła Byli W SzokuJak fajnie zarobić na panelach słonecznych?Czy są zmiany jak skorzystać z kolektorów słonecznych?Czy jest nowe prawo jak zainstalować panele słoneczne?Czy można zamówić kolektory słoneczne po godzinach?Kto potrzebuje zainwestować w fotowoltaikę?Jak zyskać na fotowoltaice - zmiany w 2020Skorzystać z fotowoltaiki? Tak czy nie?Szukam 7 Osób, Którym Przekażę Rozwiązanie Jak zrobić panele słoneczneJak długo musisz zarobić na panelach słonecznych?Jak bez problemu zainwestować w fotowoltaikęTylko w tym wpisie dowiesz się jak profesjonalnie skorzystać z fotowoltaikiPrzeczytaj ten wpis a dowiesz się jak zrobić panele słoneczne4 Niepodważalnych Dowodów, Faktów I Liczb, Które Pokazują Jak zrobić panele słoneczneWartość tego jak skorzystać z fotowoltaikiGdzie taniej korzystać z kolektorów słonecznych?Czy warto zyskać na fotowoltaice? Koszty i cenyCzy jest nowe prawo jak zainstalować panele słoneczne?Czy są nowe przepisy jak zarobić na panelach słonecznych?9 Wypowiedzi Ekspertów Na To Jak Zamontować fotowoltaikęJak zainwestować w panele słoneczne - nowości w 2020Jak można w 2020 korzystać z paneli słonecznych?Jak skorzystać z kolektorów słonecznych Od RękiCzy skorzystać z kolektorów słonecznych jest trudno?A Co Jeśli Mógłbyś zamówić fotowoltaikę Już Za 7 Dni?Tylko u Nas jak zamówić fotowoltaikę w 11 dni!Jak zyskać na fotowoltaice - odkrycie 2020!Krok Po Kroku Instrukcja Aby skorzystać z kolektorów słonecznychKrok Po Kroku Instrukcja Aby skorzystać z kolektorów słonecznychCzy można Zamontować fotowoltaikę w sobotę?


"Rain Man" - film zestawia postacie rzutkiego, robiącego karierę Charlie'go (Tom Cruise) i jego autystycznego brata Ray'a (Dustin Hoffman). Autyzm Ray'a oznacza zamknięcie na innych ludzi, trudność z wyrażaniem uczuć. Podobne problemy ma jego przebojowy brat - oziębły emocjonalnie, zdystansowany wobec innych. Obaj tak naprawdę gubią się w sieci relacji międzyludzkich, obaj nie wiedzą jak pokierować własnym życiem, swoimi zachowaniami i emocjami. Ich wspólna podróż owocuje jednak zbliżeniem, są w stanie nauczyć się czegoś od siebie nawzajem, zbudować wartościową relację. Stopniowo Charlie'mu jednak zaczyna bardziej zależeć na samej osobie swojego brata, niż na racjonalnym wyjaśnieniu jego dziwactw i nietypowych zachowań.\nData aktualizacji: 2007-06-04


Tu jesteś:Home»Pozostałe»Apple musi zapłacić aż 13 miliardów euro! To rekord w historii Unii Europejskiej\nBy appleworld 30 sierpnia 2016 1 komentarz\nKomisja Europejska po blisko dwóch latach dochodzenia stwierdziła, że firma Apple unikała w Unii Europejskiej płacenia podatków od sprzedaży. Decyzją KE, na Apple nałożono największą w historii karę finansową w wysokości aż 13 miliardów euro.\nWszystko zaczęło się od negocjacji pomiędzy Apple i władzami Irlandii, które najpierw w 1991 roku, a później w 2007 roku zgodziły się przyznać koncernowi z USA specjalnych korzyści, dzięki którym możliwe było omijanie systemów podatkowych krajów Unii Europejskiej. Na mocy decyzji Komisji Europejskiej, władze Irlandii teraz będą musiały odzyskać od Apple’a 13 miliardów euro dotychczas niezapłaconych podatków w latach 2003 ~ 2014. Do tej kwoty naliczone mają być odsetki.\nWładze Irlandii, podobnie jak sama firma Apple, nie zgadzają się z decyzją KE i zapowiadają odwołanie się od niej do sądu. Irlandia przez wiele lat dla wielu firm była swoistym rajem podatkowych, na czym kraj ten skrupulatnie korzystał. Wiele firm z branży IT, choć oczywiście nie tylko, rejestrowały swoją działalność gospodarczą właśnie w Irlandii i tylko tam, pomimo iż sprzedawały swoje produkty na obszarze całej UE, wykazywały zyski. Niektóre z nich uzyskały specjalne traktowanie ze strony irlandzkich władz, którym zależało na przyciąganiu inwestorów.\nIrlandia teraz obawia się, że zakręcenie kurka raju podatkowego może odstraszyć inwestorów, który potencjalnie mogli by zacząć uciekać do innych krajów, spoza Unii Europejskiej. Minister finansów Irlandii, Michael Noonan, stwierdził wręcz, że firma Apple nie korzystała ze wsparcia instytucji państwowych i płaciła należne podatki. Komisja Europejska jednak wydając swoją decyzję powołuje się na specjalne interpretacje prawa podatkowego Irlandii z 1991 i 2007 roku. Interpretacje te miały w sztuczny sposób zaniżać wielkość podatku odprowadzanego przez Apple w Irlandii.\nMargrethe Vestager, unijna komisarz ds. konkurencji powiedziała, że „od każdego miliona euro zysków firma płaciła 500 euro podatków”. Efektem wspomnianych wcześniej negocjacji było to, że w 2003 roku firma Apple od zysków wypracowywanych w krajach Unii Europejskiej płaciła tylko 1%, a do 2014 roku wartość ta spadła do zaledwie 0,005%. W jaki sposób Apple uniało płacenia podatków w innych krajach UE? Wszystko polegało na tym, że dzięki wewnętrznym transferom firma wyprowadzała zyski z wielu krajów Unii Europejskiej do spółek zarejestrowanych w Irlandii – Apple Sales International oraz Apple Operations Europe. Negocjacje z Irlandczykami doprowadziły do tego, że niemal wszystkie dochody ze sprzedaży, notowane przez te dwie spółki, na obszarze Irlandii przypisywane były tzw. siedzibom głównym. Sęk w tym, że jak dowiodła Komisja Europejska, istniały one jedynie na papierze.\nPoprzedni artykułApple udostępnia siódmą wersję beta MacOS Sierra dla publicznych beta testerów\nNastępny artykuł iPhone 7 może mieć piąty kolor – „błyszczący czarny” przypominający kolor Maca Pro\nApple wygrywa poparcie Sądu UE w sprawie zapłaty podatku w wysokości ponad 13 miliardów Euro\n[…] Unii Europejskiej uchylił dziś orzeczenie Komisji Europejskiej stwierdzające, że Apple powinien zapłacić rządowi Irlandii 13 miliardów euro (14,5 miliarda […]


Mieszkanie Sprzedaż, Bydgoszcz, Bartodzieje, 78.00 m2, 550000 zł\n550 000 zł 7 051,28 zł/m2 Oblicz ratę kredytu\ncena za m2 7 051,28 zł/m²\nPiękne mieszkanie położone na Bartodziejach, blisko sklepy ( biedronka, lidl, galeria pomorska, aldi, castorama itp) oraz szkoła, przedszkole!!\nMieszkanie idealne dla rodzin z dziećmi. Jest duże przestronne, ŚWIEŻO PO REMONCIE!!\nNa podłogach panele oraz płytki w kuchni i łazience. Na ścianach gładzie. Salon duży z 6 osobowym narożnikiem, małym stolikiem oraz dużym stołem do posiłków. Korytarz jest szeroki i długi. Prowadzą od niego nowe antywłamaniowe drzwi wejściowe. Kuchnia umeblowana, zostaje lodówka, zmywarka, piekarnik elektryczny oraz płyta gazowa na które jest gwarancja jeszcze roczna. Nad blatami ściana jest ozdobiona szkłem ozdobnym, które się bardzo łatwo czyści. Następnym pomieszczeniem jest sypialnia w którym stoi duże łóżko, szafa 3-drzwiowa przesuwna, duża toaletka. Obok jest łazienka z dużym prysznicem, toaletą, pralką która zostaje i jest na gwarancji i komodą nad którą jest ładna ściana z szkła. Pokoje 2 pozostałe są pokojami dziecięcymi. Są zadbane bez uszkodzeń. Całe mieszkanie jest jasne wieczorami dzięki energooszczędnemu oświetleniu LED. Okna salonu oraz sypialni wychodzą na zachód. Sufit ma elementy podwieszane co dodaje mieszkaniu nowoczesny wygląd. Piwnica ok 4 m2 należąca do jednej księgi wieczystej.\nPolecam gorąco i zapraszam do kontaktu.\nWłaściciel chcę się dogadać cenowo w zależności czy wszystkie meble zostają czy coś ma zostać zabrane.\nSymbol oferty POL-MS-96584\nOpłaty w czynszu administracja, fundusz remontowy, ogrzewanie, sprzątanie, woda ciepła, woda/ryczałt na wodę, wywóz nieczystości, zaliczka na fundusz remontowy


"Never never" to kolejna książka Coollen Hoover - autorki wielu bestsellerowych powieści z gatunku New Adult i romansów - oraz Tarryn Fisher - autorki bestsellerowych powieści dla kobiet. Opowiada ona o losach dwojga młodych ludzi, którzy zadarli z przeznaczeniem.\nCharlie i Silas są jak czyste karty. Budzą się w trakcie lekcji nie pamiętając niczego. Nie mają wspomnień. Nie znają swoich imion, rodzin, szkoły, przyjaciół. Pamiętają słowa piosenek, wiedzą czym jest Google i jak odpalić samochód, a nie mają pojęcia kim są, gdzie mieszkają, co robili w poprzednich dniach. Gdy dowiadują się, że mają ten sam problem, razem próbują rozwiązać zagadkę zapomnienia. Co jest przyczyną ich amnezji? Jakie tajemnice skrywają wspomnienia? Aby zakończyć koszmar muszą odbudować swoje uczucia. Czy to im się uda? Czy można rozkochać w sobie kogoś od nowa?\n"Never never" to powieść, w której się zakochałam. Lekko się ją czyta, zaskakuje fabułą i zwrotami akcji. Pochłania czytelnika i naprawdę ciężko się od niej oderwać. Tę książkę pokocha wielu czytelników, szczególnie uwielbiających romanse i powieści dla nastolatków. Polecam ją wszystkim książkoholikom, ponieważ naprawdę warto przeczytać tę książkę.\nMam jedynie jedną przestrogę: nie zaczynajcie czytać tej powieści wieczorem przed ciężkim dniem w pracy lub w szkole - nieprzespana noc gwarantowana!\nMoja ocena - 10/10❤\nEtykiety: Coollen Hoover książka książki Never never recenzja romansidło Tarryn Fisher zapomnienie\n,,Harry Potter i Przeklęte Dziecko" - J.K. Rowling...


Firmy wywożące śmieci - czy warto skorzystać z ich usług? - przemysł-pl.com\nFirmy wywożące śmieci – czy warto skorzystać z ich usług?\nJednym z największych problemów z jakimi mierzą się organizatorzy imprez i kierownicy placów budowy jest pozbycie się ogromnej ilości śmieci po skończonej pracy. Często stanowią one niemały problem, a usunięcie ich jest trudniejsze, niż mogłoby się to wydawać. Dlatego coraz częściej w takich sytuacjach stawia się na firmy wywożące śmieci.\nFirma wywożąca śmieci – zalety zlecenia wywózki\nWywiezienie śmieci przez profesjonalną firmę to przede wszystkim ogromna wygoda, pozwalająca zarówno na oszczędzenie czasu i sił, a także na zapobiegnięcie stresowi związanemu z zalegającymi odpadami.Taka usługa zwykle przebiega szybciej i dokładniej niż w przypadku własnoręcznego usuwania śmieci, a profesjonalny sprzęt, jaki posiada każda Firma wywożąca śmieci znacznie ułatwia ich wywózkę i segregację.\nNie można pominąć też faktu, iż firmy wywożące śmieci bardzo często oferują klientom wypożyczanie kontenerów na śmieci. Ich użycie pozwala na łatwiejszą segregację śmieci i wygodne opróżnianie śmietników. Można w nich również tymczasowo przechować odpady wartościowe, takie jak metale nadające się do sprzedaży w skupie złomu. Dzięki szerokiemu wyborowi kontenerów w ofertach takowych firm każdy klient może dopasować je do swoich potrzeb.\nCeny wywózki śmieci\nWiele osób obawia się tego, że wynajem firmy wywożącej śmieci będzie kosztować ich małą fortunę. Nic bardziej mylnego, mimo pełnego profesjonalizmu wykonywanych usług firmy wywożące śmieci są bardzo tanie.Skorzystanie z takiej usługi zwykle wiąże się z wydatkiem od stu do tysiąca złotych, zależnie od tego ile śmieci trzeba wywieźć i jakie konkretne usługi będzie świadczyć firma wywożąca. Zwykle zapomina się też, że wynajmując tego typu firmę można zaoszczędzić na paliwie, które normalnie zużyłoby się podczas wywózki dużej ilości odpadów.\n25 sierpnia, 2021 25 sierpnia, 2021 adminŚrodowisko\nPrevious Post Gdzie najlepiej kupować artykuły dla elektroników?\nNext Post Stal kwasoodporna – właściwości, cena, zakup


Melodia na dziś;) - Olga Szomańska\nMelodia na dziś;)\nWysłany: Śro 11:08, 15 Sie 2007 Temat postu: Melodia na dziś;)\nTemat troszkę skopiowany z innego forum, ale mi się spodobał Co proponujecie na dziś?;> Mój typ to Frontside- "Wspomnienia jak relikwie"\nNa dziś... na dziś wieczór tylko Cool Kids Of Death - "Na wszystkie cztery strony" Leci tak:\n"Gdy nie mozesz spac w nocy, nie rob nic, zamknij oczy\nNa wszystkie cztery strony, ten swiat popierdolony! 4x\nNa wszystkie cztery strony, ten swiat popierdolony! 4x"\nNa dzisiaj wieczór... "Niewydana Płyta", czyli NORMALSI\nWysłany: Sob 10:52, 18 Sie 2007 Temat postu:\nZdecydowanie 50 cent & Justin Timberlake - she wants it (ayo technology)\nWysłany: Pon 0:35, 20 Sie 2007 Temat postu:\nmelodia na dzis...hmmm.. spiew slowika? nie no, zartuje. Polecam Jimiego Hendrixa przed snem. Rano obudzicie sie nacpani:D\nMelodia na wieczór? hmm na wieczór najlepsza by była jedna z piosenek Enyi np a niech będzie A Day Without Rain lub Flora's Secret. I jeszcze z Ery Flowers of the sea. Cudne melodie. Zwłaszcza Enya ma wspaniałe pieśni.\nWysłany: Śro 13:30, 14 Maj 2008 Temat postu:\nMelodia na dziś - Damian Marley - One loaf of bread. enjoy it\nWysłany: Pią 19:36, 15 Sie 2008 Temat postu:\nDzisiaj polecam dwa cudowne utwory Daabu:\n"W moim ogrodzie" i "Fala ludzkich serc"\nWysłany: Sob 1:15, 16 Sie 2008 Temat postu:\nJa właśnie za Daabem nie przepadam. A dzisiaj słuchałam z koleżanką takiego fajnego kolesia. Ale już nie pamiętam jak się nazywał. Jak sobie przypomnę, to napiszę, bo świetnie śpiewa.\nJa Daab bardzo lubię\nA na takie dni polecam Norah Jones płytę Come away with me\nWysłany: Sob 13:51, 16 Sie 2008 Temat postu:\nJuż wiem jak się nazywa-James Morrison. A u mnie aktualnie "You give me something" w jego własnie wykonaniu\nWysłany: Sob 15:21, 16 Sie 2008 Temat postu:\nNorah Jones... Kiedyś dawno temu miałem z Nią tapetę na pulpicie. Co do muzyki, to ma fajny głęboki głos, ale jakoś melodie mnie zbytnio nie ruszają... Niektóre są fajne, ale jedna lub dwie na płycie, to jednak za mało... Oto jedna z tych fajniejszych (dodatkowo okraszona rozbrajającym śmiechem):\nWysłany: Sob 16:12, 16 Sie 2008 Temat postu:\nwidze ze ktoś podziela moje zdanie..też lubię może z dwie jej piosenki..nie wiem czemu ale nie mogę sie do niej przekonać...przegrałam sobie od Moni jej płyte ale chyba tylko raz ją przesłuchałam i tyle...\nJa to jak słyszę smooth jazz to od razu sie wczuwam ... To cos dla mnie!\nNorah niby gra podobnie jak Katie, ale ta druga zdaje się mieć bardziej masowy odbiór, bo łączy smooth jazz z popem. A Norah idzie bardziej do źródła, nie rezygnując z indywidualizmu. Co jest bardzo ważne Jazz to specyficzny gatunek, którego w sumei nie da się zamknąć do jednej szuflady. Kiedyś okropnie mnie irytował\nNorah Jones zalicza sie do tych artystów których uwielbiam po prostu słuchać ! Akurat nie interesuje mnie ich pogląd na świat czy tam ile maja lat, liczy się muzyka.\nNo, ale już się nie będę rozdrabniać\nA trochę z innej beczki :\nNa taką pogodę idealna Przynajmniej dla mnie. Ketil Bjornstad, tworzy muzykę niezwykle harmonijna. Dźwięki przenikają się i idealnie ze sobą wspógrają.\nA ja na ten wieczór polecam 30 second to mars, muchy i kawałek kulki . Rockowe brzmienia na mocną, burzową noc.....


Sprzedam działkę 1 158 m² Struga\n92 640 zł 1 158 m² 80 zł/m²\nCena: 92 640 zł (80 zł/m²)\nnumer ogłoszenia: GS-17850\nOferuję do sprzedaży kształtną działkę z pięknymi widokami i świetną komunikacją w Strudze. Działka usytuowana przy drodze gminnej. Kanalizacja planowana na rok 2020 do tego czasu rozwiązaniem ma być budowa szamba lub przydomowej oczyszczalni ścieków. Energia elektryczna oraz woda miejska będzie doprowadzona na działkę w cenie nieruchomości. Serdecznie polecam i zapraszam na prezentację. (...)\n:LINK DO STRONY =offer&id=18523&lng=1045\nInteresuje mnie ogłoszenie: Działka na sprzedaż 1 158 m, Struga. Proszę o kontakt.


pokoje do wynajęcia – Wieliczka – Mieszkanie | Gumtree\nMieszkanie | pokoje do wynajęcia | Wieliczka\ndo wynajęcia pokój jednoosobowy ul. Lipska - 850 zł bez dodatkowych opłat\nOferuję do wynajęcia jednoosobowy pokój w 4-pokojowym mieszkaniu dwupoziomowym przy ul. Lipskiej w Krakowie. Na piętrze 3 pokoje + łazienka, na parterze 1 pokój, kuchnia i wc. Mieszkanie usytuowane w bardzo dobrym punkcie komunikacyjnym z doskonałym połączeniem do centrum (10 do 15 min do Centrum), Spokojna dzielnica, dobry dojazd, 100 m od pętli tramwajowej i autobus. W pobliżu Krakowskiej Akade ...\nWynajmę dwuosobowy pokój w bardzo ładnym 70 m mieszkaniu przy ul. Bobrzyńskiego na Ruczaju. Mieszkanie składa się z 3 pokoi, osobnej kuchni, łazienki oraz WC. Docelowo w mieszkaniu ma mieszkać 5 osób. Mieszkanie położone na 3 piętrze urządzone w wysokim standardzie, nowoczesna kuchnia w pełni wyposażona (lodówka, piekarnik, duża płyta indukcyjna) w łazience nowa pralka. W bloku winda. ...\nPokój do wynajęcia od 1 Lutego.\nDo wynajęcia samodzielny umeblowany pokój 17 m z balkonem. Mieszkanie mieści się w bloku na II piętrze z windą na os. Kościuszkowskim.Składa się z dwóch oddzielnych pokoi, kuchni, łazienki (w pełni umeblowanych) oraz przedpokoju z szafą. Drugi pokój zamieszkiwany jest przez lokatorkę pracującą spokojną dbającą o porządek.Pokój dostępny od 1 Lutego. Cena najmu 550 zł +media (czynsz,prąd, gaz razem ...\nPokoj do wynajęcia od zaraz osobą pracującym\nWynajmę przytulny pokój w mieszkaniu 2-u pokojowym na Mistrzejowicach. Mieszkanie znajduje sie na 1 piętrze, przed klatka bezplatny parking. Do dyspozycji kuchnia, łazienka sprzęty codziennego użytku. Blisko do centrum szybkimi liniami autobusowymi. Zapraszam do oglądania pokoju, w razie pytań smiało dzwonić. Tel: 790 723 071. Dorota.\nPrzytulny pokój w doskonałej lokalizacji ( Grzegórzki/Hala Targowa)\nMam do wynajęcia przytulny pokój ( 14 m2 ) dla spokojnej osoby, studentki(ta) lub osoby pracującej w mieszkaniu ze współlokatorem. Mieszkanie jest zlokalizowane na 1p. w bloku ( stare budownictwo z cegły ) przy al. Daszyńskiego. Świetna lokalizacja, 10 min. pieszo na Kazimierz, Rynek Główny, bulwary wiślane i dworzec główny. W najbliższej okolicy Galeria Kazimierz i Hala Targowa. Bardzo dobre poł ...\nSamodzielny pokój 1-2 os. ul. Radzikowskiego\nDo wynajęcia samodzielny pokój w dwupoziomowym mieszkaniu na ul. Radzikowskiego (w okolicy skrzyżowania z ul. Rydla). Stan mieszkania bardzo dobry. W mieszkaniu są 3 odrębne pokoje oraz wspólny salon z otwartą kuchnią, dwie łazienki. Pełne wyposażenie AGD (lodówko-zamrażarka, płyta indukcyjna, zmywarka, piekarnik, mikrofala, okap, meble, pralka, odkurzacz, żelazko, deska do prasowania). Do mi ...\nJednoosobowy pokój do wynajęcia, Czyżyny\nDo wynajęcia niezależny pokój w 3-pokojowym mieszkaniu o powierzchni 50m² (ul. Sołtysowska, osiedle Fajny Dom)Dostępny od 1/02/2019 W pokoju znajduje się łóżko, szafa, komoda, krzesło i biurko (można zmienić meble na swoje). Do wspólnego użytku służy przedpokój, kuchnia, łazienka. W dwóch pokojach mieszkają dwie sympatyczne studentki UEK i UJ.Mieszkanie posiada lodówkę, płytę indukcyjną, pralkę or ...\nPokój jednoosobowy, ul. Myśliwska\nKraków – Płaszów – ul. Myśliwska799 zł ze wszystkim!!Pokój jednoosobowy na wynajem. Przytulne mieszkanie przy ul. Myśliwskiej w dzielnicy Płaszów, która jest doskonałe skomunikowana z całym Krakowem. W pobliżu Akademia im. Andrzeja Frycza Modrzewskiego i kompleksy biurowe.Mieszkanie znajduje się na parterze w czteropiętrowym budynku z 1998 roku.- pokój w pełni umeblowany,- osobna jasna kuchnia, ...\nŚLICZNY POKÓJ 1 OS na poddaszu, Ruczaj ul. Strąkowa\nDo wynajęcia komfortowy pokój na poddaszu!!! Mieszkanie w świetnej lokalizacji w niedawno wyremontowanym domu na Ruczaju - ul. Strąkowa (w pobliżu ulicy Kobierzyńskiej, Miłkowskiego). W skład mieszkania wchodzą 4 pokoje 1 os., łazienka i wyposażona w niezbędne sprzęty kuchnia. Pokoje klimatyczne - z lekkim ukosem, umeblowane są w wygodne łóżko, pojemną szafę, komodę na drobiazgi oraz biurko z krze ...\nPokój 2 os. 5 min do centrum - al. 29 listopada obok UR\nPOKÓJ dla 2 lub 3 osób do wynajęcia od zaraz - 450zł/os (przy 3 osobach), przy 2 osobach 600zł/os z dużym balkonem! okolice 29-listopada, ul. Wiśniowa Bardzo dobry dojazd do centrum (1,7 km), uczelni oraz do dworca głównego ok 7 minut. Najbliższe przystanki ok. 100 m od mieszkania. Mieszkanie po generalnym remoncie jasne, czyste, ciepłe i w pełni umeblowane. Wokół jest dużo terenów zielon ...


Kościół św. Filipa i Jakuba Starszego w Rogowie Opolskim - Gmina Krapkowice\nrogów opolski_kościół Kościół parafialny w Rogowie Opolskim pod wezwaniem świętych Filipa i Jakuba Starszego został wybudowany w 1300 roku. Najstarsza wzmianka o nim pochodzi z 1335 roku. W końcu XVI wieku został przebudowany i powiększony o kwadratową wieżę i kaplicę. W okresie wojny trzydziestoletniej (1618-1648) był kościołem protestanckim. Jest to kościół wczesnogotycki, z widocznymi elementami renesansowymi. Murowany z cegły, otynkowany.\nDo najcenniejszych zabytków należą barokowy ołtarz główny z II połowy XVII wieku z rzeźbami świętych i aniołów oraz ambona z około 1700 roku z płaskorzeźbami ewangelistów. W kościele znajduje się także kamienna, romańska chrzcielnica z XVI wieku. Na chrzcielnicy można zauważyć nieczytelny napis. Zabytkowymi w kościele są również krucyfiksy, monstrancja z II połowy XVIII wieku ufundowana przez Fryderyka Rogoyskiego oraz kielich do kielich z II połowy XVII wieku.\nZobacz: Rogów Opolski»\nData publikacji: 28-08-2008 13:20


W poszukiwaniu Kopciuszka. Scenariusz przedstawienia - Antosiak Aneta | Ebook Sklep EMPIK.COM\nW poszukiwaniu Kopciuszka. Scenariusz przedstawienia (ebook)\nTreść przedstawienia: Kopciuszek nie dotarła na bal i Książę wraz z Wróżką udają się na poszukiwania. Angażują do pomocy Krasnoludków, które przeczesują całą Bajkolandię, spotykając różne postacie z baśni. Ostatecznie okazuje się, że Kopciuszek trafiła do miasta ludzi.\nTytuł: W poszukiwaniu Kopciuszka. Scenariusz przedstawienia\nWłaśnie zrecenzowałem W poszukiwaniu Kopciuszka. Scenariusz przedstawienia\nTreść przedstawienia: Kopciuszek nie dotarła na bal i Książę wraz z Wróżką udają się na poszukiwania. Angażują do pomocy Krasnoludków, które przeczesują całą Bajkolandię, spotykając różne postacie z ...


Strusina - mięso XXI wieku Strusina - mięso XXI wieku\n20 lipca, 2018 17:16\nFot. PAP © 2018 / ANDRZEJ GRYGIE\nPiotr „Timi” Piotrowski, szef kuchni warszawskiego lokalu SteakHouse Evil, strusinę podaje na gorącym kamieniu. „Kamień rozgrzewamy do bardzo wysokiej temperatury i przynosimy do stołu razem z zamówieniem. Podajemy steki o średnim wysmażeniu, ale klient ma możliwość dodatkowego dosmażenia mięsa za pomocą rozgrzanego kamienia. Kamień wulkaniczny długo utrzymuje ciepło, dzięki czemu mięso jest niezwykle soczyste do ostatniego kęsa” – mówi PAP Life.\nBiałoruś chce wykorzystać mięso bobra w gastronomii\nFNTT zatrzymała milionerów – bezrobotnych, którzy sprowadzali mięso z Polski