Transkrypcja i tłumaczenie operonów prokariotycznych - Informacja - 2022\nTranskrypcja i tłumaczenie operonów prokariotycznych\nBiorę kurs genetyki molekularnej i obecnie omawiamy operony prokariotyczne. Operon lacZ często pojawiał się dla mnie na studiach jako przykład do nauczania kontroli regulacyjnej transkrypcji i zawsze skupiałem się na ustaleniu, czy operon został przepisany w określonych warunkach (mutacje, składniki odżywcze itp.). Nie pamiętam wiele dyskusji o tym, co dzieje się po transkrypcji. Dziś jednak zauważyłem coś, czego nigdy wcześniej nie widziałem: trzy geny w operonie lacZ są transkrybowane jednocześnie na tym samym transkrypcie – nie wiem, jak wcześniej to przegapiłem!\nMoje pytanie brzmi, co dzieje się po transkrypcji. Oczywiście istnieją 3 produkty białkowe. Jak te produkty pochodzą z transkryptu? Czy transkrypt jest podzielony na 3 części, czy też pojedynczy rybosom transluje wszystkie 3 białka z pojedynczego substratu transkryptu, czy też rybosomy translują pojedyncze białko z pojedynczego substratu transkryptu na raz? Gdzie mogę znaleźć odpowiednią literaturę wyjaśniającą proces tłumaczenia?\nJak zauważyłeś, gen represora lacI jest transkrybowany jako jeden mRNA, a trzy geny strukturalne: lacZ, lacY i lacA są transkrybowane w pojedynczy policistronowy mRNA. Dwa mRNA podlegają translacji niezależnie od siebie.\nPolicisronowe mRNA nie jest rozbijane na kawałki. Jest raczej tłumaczony przez rybosomy (co najmniej trzy, wyjaśnienie poniżej), dając początek trzem indywidualnym białkom.\nJak z jednego mRNA tłumaczone są trzy produkty białkowe? Policistronowe DNA składa się z promotora (Plac), który zapewnia rozpoczęcie transkrypcji, oraz trzech otwartych ramek odczytu (ORF) dla lacZ, lacY i lacA. Przed każdą z ORF znajdują się miejsca wiązania rybosomu (RBS). Translacja jest inicjowana przez wiązanie rybosomu z kodonem RBS i start. W ten sposób wiele rybosomów może wiązać się przed trzema ORF, tworząc w ten sposób trzy białka.\nLiteratura na temat translacji policistronowego RNA u prokariotów nie jest zbyt dokładna, głównie dlatego, że warunkiem koniecznym do translacji jest RBS i nie ma nic specyficznego dla translacji policistronowej. Krótkie omówienie tematu można znaleźć w kilku miejscach, polecam następujące:\nRalston, A. (2008) Operony i regulacja genów prokariotycznych. Edukacja przyrodnicza\nOd genów do genomów: koncepcje i zastosowania technologii DNA\nBiologia komórki molekularnej\nAnaliza genów i genomów\nMechanizm transkrypcji u prokariontów | Genetyka\nW tym artykule omówimy:- 1. Znaczenie transkrypcji u prokariontów 2. Mechanizm transkrypcji u prokariontów 3. Odwrotna transkrypcja 4. Transkrypcja prokariotyczna kontra eukariotyczna 5. Wykrycie.\nZnaczenie transkrypcji u prokariontów:\nTranskrypcja to proces, w którym sekwencja DNA jest enzymatycznie kopiowana przez polimerazę RNA w celu wytworzenia komplementarnego RNA. Synteza RNA z pojedynczej nici cząsteczki DNA w obecności enzymu polimerazy RNA nazywana jest transkrypcją.\nInnymi słowy, jest to proces tworzenia cząsteczki informacyjnego RNA przy użyciu cząsteczki DNA. Wiele pionierskich prac nad transkrypcją przeprowadzono na prokariontach, w szczególności na bakterii E. coli. Badania te położyły podwaliny pod prace, które później przeprowadzono na bardziej złożonych eukariontach.\nSynteza RNA przez polimerazę RNA została opracowana in vitro przez kilka laboratoriów do 1965 roku, jednak RNA zsyntetyzowany przez te enzymy miał właściwości sugerujące istnienie dodatkowego czynnika potrzebnego do prawidłowej terminacji transkrypcji.\nW 1972 roku Walter Fiers jako pierwszy udowodnił istnienie enzymu kończącego. W 2006 roku Roger D. Kornberg otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii “za badania nad molekularnymi podstawami transkrypcji eukariotycznej.”\nPoniżej wymieniono główne punkty związane z transkrypcją:\nRNA jest syntetyzowany z matrycy DNA. RNA jest przetwarzany na informacyjny RNA [mRNA], który jest następnie wykorzystywany do syntezy białka. Tak zsyntetyzowane RNA nazywa się informacyjnym RNA (mRNA), ponieważ przenosi wiadomość genetyczną z DNA do maszynerii komórki, która syntetyzuje białka.\nGłówną różnicą między sekwencją RNA i DNA jest obecność U lub uracylu w RNA zamiast T, czyli tyminy DNA.\nRNA jest syntetyzowany z pojedynczej matrycy [nici] cząsteczki DNA. Odcinek DNA, który ulega transkrypcji do cząsteczki RNA, nazywany jest jednostką transkrypcyjną. Jednostka transkrypcyjna koduje sekwencję, która jest tłumaczona na białko. Kieruje również i reguluje syntezę białek.\nNić DNA, która jest używana w syntezie RNA, nazywana jest nicią matrycową, ponieważ zapewnia matrycę do uporządkowania sekwencji nukleotydów w transkrypcie RNA. Nić DNA, która nie bierze udziału w syntezie DNA, nazywana jest nicią kodującą, ponieważ jej sekwencja nukleotydowa jest taka sama jak nowo utworzonego transkryptu RNA.\nEnzym, który przeprowadza transkrypcję nazywa się polimerazą RNA i składa się z czterech rodzajów polipeptydów, oznaczonych jako α, β, β’ i σ, które są połączone razem w kompleks zwany holoenzymem.\n4. Skopiowane informacje genetyczne:\nW tym procesie informacja genetyczna zakodowana w DNA jest kopiowana do cząsteczki RNA. Informacja genetyczna jest transkrybowana lub kopiowana z DNA na RNA.\nEkspresja genu składa się z dwóch głównych etapów, a mianowicie transkrypcji i translacji. Zatem transkrypcja jest pierwszym krokiem w procesie regulacji genów lub syntezy białek.\n6. Kierunek syntezy:\nPodobnie jak w replikacji DNA, RNA jest syntetyzowany w kierunku 5′ —> 3′. Matrycowa nić DNA jest odczytywana 3′ —>5′ przez polimerazę RNA, a nowa nić RNA jest syntetyzowana w kierunku 5’—>3′. Polimeraza RNA wiąże się z końcem 3′ genu (promotora) na nici matrycowej DNA i przemieszcza się w kierunku końca 5′.\nMechanizm transkrypcji u prokariontów:\nMechanizm transkrypcji składa się z trzech głównych faz lub etapów, a mianowicie:\nSą one krótko omówione w następujący sposób:\nU bakterii transkrypcja rozpoczyna się od wiązania polimerazy RNA z promotorem w DNA. Polimeraza RNA jest głównym enzymem składającym się z pięciu podjednostek: 2 podjednostek α, 1 podjednostki β, 1 podjednostki β’ i 1 podjednostki σ. Na początku inicjacji, rdzeń enzymu jest związany z czynnikiem sigma (numer 70), który pomaga w znalezieniu odpowiednich par zasad -35 i – 10 poniżej sekwencji promotora.\nInicjacja składa się z następujących kroków:\n(i) polimeraza RNA (RNAP) wiąże się z jednym z kilku czynników specyficzności, tworząc holoenzym. W tej formie może rozpoznawać i wiązać się ze specyficznymi regionami promotora w DNA. Na tym etapie DNA jest dwuniciowy (“zamknięty”). Ta struktura holoenzymu/rany-DNA jest określana jako zamknięty kompleks.\n(ii) DNA jest rozwijany i staje się jednoniciowy (“open”) w pobliżu miejsca inicjacji (zdefiniowany jako + 1). Ta struktura holoenzymu/odwiniętego DNA nazywana jest otwartym kompleksem.\n(iii) Polimeraza RNA dokonuje transkrypcji DNA, ale wytwarza około 10 nieudanych (krótkich, nieproduktywnych) transkryptów, które nie są w stanie opuścić polimerazy RNA, ponieważ kanał wyjściowy jest zablokowany przez czynnik cr.\n(iv) Czynnik a ostatecznie dysocjuje od holoenzymu i postępuje elongacja. Większość transkryptów pochodzi z adenozyno-5′-trifosforanu (ATP) i w mniejszym stopniu z guanozyno-5′-trifosforanu (GTP) (trifosforany nukleozydów purynowych) w miejscu +1. Urydyno-5′-trifosforan (UTP) i cytydyno-5′-trifosforan (CTP) (trifosforany pirymidynonukleozydów) są niekorzystne w miejscu inicjacji.\nW transkrypcji tylko jedna nić DNA [zwana nicią matrycową lub nicią niekodującą] bierze udział jako matryca. W miarę postępu transkrypcji polimeraza RNA przechodzi przez nić matrycy i wykorzystuje komplementarność parowania zasad z matrycą DNA, aby utworzyć kopię RNA.\nChociaż polimeraza RNA przechodzi przez nić matrycową od 3′ —>5′, nić kodująca (nie-matrycowa) jest zwykle używana jako punkt odniesienia, więc mówi się, że transkrypcja przebiega od 5′ -> 3′.\nDaje to cząsteczkę RNA z 5′ 3′, dokładną kopię nici kodującej (z wyjątkiem tego, że tyminy są zastąpione uracylami, a nukleotydy składają się z cukru rybozy (5-węglowego), gdzie DNA ma dezoksyrybozę (jeden mniej atom tlenu) w jego szkielecie cukrowo-fosforanowym).\nU prokariotów wydłużenie zaczyna się od “nieudany cykl inicjacji”. Podczas tego cyklu polimeraza RNA będzie syntetyzować fragmenty mRNA o długości 2-12 nukleotydów. Dzieje się tak, dopóki czynnik σ nie zmieni się, co skutkuje powstaniem kompleksu elongacji transkrypcji (co daje ruchomą stopę o wielkości 35 pz). Czynnik a jest uwalniany przed syntezą 80 nukleotydów mRNA.\nU prokariontów istnieją dwa różne sposoby terminacji transkrypcji, a mianowicie:\n(ii) Zależne od Rho są dobrze znane.\n(i) Zakończenie niezależne od Rho:\nJest również znany jako terminacja wewnętrzna transkrypcji. Obejmuje sekwencje terminatora w RNA, które sygnalizują zatrzymanie polimerazy RNA. Sekwencja terminatora to zwykle sekwencja palindromiczna, która tworzy strukturę spinki do włosów typu szpilka do włosów, która prowadzi do dysocjacji RNAP z matrycy DNA.\nW terminacji transkrypcji niezależnej od Rho, transkrypcja RNA zatrzymuje się, gdy nowo zsyntetyzowana cząsteczka RNA tworzy bogatą w G-C pętlę spinki do włosów, po której następuje przebieg U’s, co powoduje odłączenie matrycy DNA.\n(ii) Zakończenie zależne od Rho:\nw “zależne od Rho” rodzaj zakończenia, czynnik białkowy zwany “Rho” [Współczynnik P] służy do zatrzymania syntezy RNA w określonych miejscach. Białko to wiąże się w miejscu wykorzystania Rho na powstającej nici RNA i biegnie wzdłuż mRNA w kierunku polimerazy RNA.\nKiedy czynnik p dociera do RNAP, powoduje oddzielenie RNAP od DNA, kończąc transkrypcję. Innymi słowy, destabilizuje interakcję między matrycą a mRNA, uwalniając w ten sposób nowo zsyntetyzowane mRNA z kompleksu elongacyjnego.\nOdwrotna transkrypcja u prokariontów:\nSynteza DNA z cząsteczki RNA w obecności enzymu odwrotnej transkryptazy nazywana jest odwrotną transkrypcją. Odwrotna transkrypcja została po raz pierwszy zgłoszona przez Temina i Baltimore w 1970 roku, za co otrzymali Nagrodę Nobla w 1975 roku.\nOdwrotna transkrypcja jest również znana jako teminizm. Niektóre wirusy (takie jak HIV, przyczyna AIDS) mają zdolność transkrypcji RNA do DNA. HIV ma genom RNA, który jest zduplikowany w DNA.\nPowstały DNA można połączyć z genomem DNA komórki gospodarza. Głównym enzymem odpowiedzialnym za syntezę DNA z matrycy RNA jest odwrotna transkryptaza. W przypadku HIV odwrotna transkryptaza odpowiada za syntezę komplementarnej nici DNA (cDNA) do genomu wirusowego RNA.\nPowiązany enzym, rybonukleaza H, trawi nić RNA, a odwrotna transkryptaza syntetyzuje komplementarną nić DNA, tworząc strukturę podwójnej helisy DNA. Ten cDNA jest zintegrowany z genomem komórki gospodarza za pośrednictwem innego enzymu (integrazy), powodując, że komórka gospodarza wytwarza białka wirusowe, które ponownie składają się na nowe cząstki wirusa. Następnie komórka gospodarza podlega zaprogramowanej śmierci komórki (apoptozie).\nTranskrypcja prokariotyczna kontra eukariotyczna:\nProces transkrypcji jest taki sam zarówno u eukariontów, jak i prokariontów w kilku aspektach. Istnieją jednak pewne różnice w transkrypcji tych dwóch grup, jak podkreślono poniżej.\n1. Proces jest znacznie bardziej skomplikowany u eukariontów niż u prokariontów.\n2. U eukariontów transkrypcja i translacja zachodzą oddzielnie odpowiednio w jądrze i cytoplazmie, podczas gdy u prokariontów oba procesy zachodzą jednocześnie w cytoplazmie.\n3. Eukariotyczne mRNA zawiera introny i dlatego wymaga modyfikacji przed wzięciem udziału w syntezie białek. U prokariontów mRNA nie wymaga modyfikacji.\n4. Eukarionty mają DNA w jądrze, podczas gdy u prokariontów DNA znajduje się w cytoplazmie.\nWykrywanie transkrypcji u prokariontów:\nTranskrypcję można mierzyć i wykrywać na wiele sposobów.\nPoniżej podano powszechnie stosowane metody wykrywania transkrypcji:\n1. Test Nuclear Run-on, mierzy względną obfitość nowo utworzonych transkryptów.\n2. Test ochrony RNAzy i ChlP-Chip RNAP, wykrywają aktywne miejsca transkrypcji.\n3. RT-PCR, mierzy bezwzględną obfitość całkowitych lub jądrowych poziomów RNA, które mogą jednak różnić się od szybkości transkrypcji.\n4. Mikromacierze DNA mierzą względną obfitość globalnych całkowitych lub jądrowych poziomów RNA, które mogą jednak różnić się od szybkości transkrypcji.\nTranskrypcja i tłumaczenie operonów prokariotycznych - Biologia\nRycina 1: Obraz z mikroskopu elektronowego jednoczesnej transkrypcji i translacji. Obraz przedstawia bakteryjne DNA i związane z nim transkrypty mRNA, z których każdy jest zajęty przez rybosomy. (Na podstawie O.L. Miller i in., Science 169:392, 1970.)\nTranskrypcja, synteza mRNA z DNA i translacja, synteza białka z mRNA, to główne filary centralnego dogmatu biologii molekularnej. Jak wypada porównanie szybkości tych dwóch procesów? To pytanie stało się jeszcze bardziej interesujące w wyniku obserwacji podobnych do tych pokazanych na rycinie 1, a mianowicie istnienia pięknych struktur „choinek” zaobserwowanych u E. coli za pomocą mikroskopii elektronowej. Te stereotypowe struktury odzwierciedlają jednoczesną transkrypcję i translację tego samego genu i rodzą pytanie o porównanie względnych szybkości tych dwóch procesów, umożliwiając taką synchronizację tych dwóch odmiennych procesów.\nRysunek 2: Obliczenia z tyłu koperty porównujące współczynniki transkrypcji i translacji pokazujące, że są one faktycznie bardzo podobne. nt oznacza nukleotydy, czyli zasady.\nTranskrypcja RNA w E. coli zarówno mRNA, jak i stabilnego rRNA i tRNA, jest przeprowadzana przez ~1000-10000 cząsteczek polimerazy RNA (BNID 101440) przebiegających z maksymalną prędkością około 40-80 nt/s, jak pokazano w Tabeli 1. (BNID 104900, 104902, 108488). Translacja białek w E. coli jest przeprowadzana przez ~10 000-100 000 rybosomów (BNID 101441) i przebiega z maksymalną szybkością około 20 aa/s, jak pokazano w Tabeli 2 (BNID 100059, 105067, 108490). Co ciekawe, ponieważ każde 3 pary zasad kodują jeden aminokwas, szybkości tych dwóch procesów są prawie identyczne, jak pokazano schematycznie na Figurze 2 (patrz także BNID 108487). Gdyby translacja była szybsza niż transkrypcja, spowodowałaby „zderzenie” rybosomu z polimerazą RNA u prokariotów, gdzie te dwa procesy mogą zachodzić jednocześnie. Taka kotranskrypcyjna translacja stała się materiałem podręcznikowym dzięki obrazom takim jak Rycina 1. Jednak ostatnia mikroskopia pojedynczych cząsteczek pokazuje, że zdarza się to stosunkowo rzadko i większość translacji nie jest połączona z transkrypcją w E. coli (S. Bakshi i wsp., Mol Microbiol. 85:21, 2012). Większość translacji zachodzi raczej na mRNA, które już dyfundowało z bogatego w DNA regionu nukleoidowego do bogatych w rybosomy regionów cytoplazmatycznych. Rozkład rybosomów w komórkach jest dalej pokazany w winiecie „Ile rybosomów znajduje się w komórce?”. W kolejnym zakręcie centralnego dogmatu wykazano, że rybosomy mogą być ważne dla szybkiej transkrypcji u bakterii (S. Proshkin i in., Science 328:504, 2010). Wydaje się, że rybosomy powstrzymują polimerazę RNA przed cofaniem się i przerwami, które w innym przypadku mogą być dość powszechne w przypadku tych maszyn, tworząc w ten sposób uderzające sprzężenie zwrotne między translacją a transkrypcją.\nTabela 1. Wskaźnik transkrypcji mierzony wśród organizmów i warunków. Wszystkie wartości mierzone w 37°C z wyjątkiem D. melanogaster mierzone w 22°C.\nTabela 2: Szybkość translacji mierzona między organizmami i warunkami. Wszystkie wartości mierzone w 37°C z wyjątkiem S. cerevisiae i N. crassa mierzone w 30°C.\nCo oznaczają względne szybkości transkrypcji i translacji dla całkowitego czasu od inicjacji transkrypcji do zsyntetyzowanego białka dla danego genu? U bakterii gen o długości jednego kb powinien przy maksymalnej szybkości transkrypcji wynosić około 1000 nt/80 nt/s ≈ 10 s, a wydłużenie translacji przy maksymalnej szybkości mniej więcej tyle samo. Zauważamy, że całkowita skala czasu jest sumą czasu wydłużenia jak powyżej i czasu inicjacji, który w niektórych przypadkach może być dłuższy. Ostatnio zaobserwowano, że zwiększenie szybkości translacji przez zastąpienie kodonów wahliwych kodonami doskonale dopasowanymi powoduje błędy w fałdowaniu (P.S. Spencer i in., J. Mol. Biol., 422:328, 2012). Sugeruje to kompromis, w którym szybkość translacji jest ograniczona przez czas potrzebny do umożliwienia prawidłowego fałdowania domen w powstającym białku.\nRysunek 3: Wpływ rifampiny na inicjację transkrypcji. Mikrografy elektronowe operonów rRNA E. coli: (A) przed dodaniem rifampiny, (B) 40 s po dodaniu rifampiny i (C) 70 s po ekspozycji. Po leczeniu farmakologicznym żadne nowe transkrypty nie są inicjowane, ale te już rozpoczęte ulegają wydłużeniu. W częściach (A) i (B) strzałka wskazuje miejsce, w którym RNaza III tnie powstającą cząsteczkę RNA, wytwarzając podjednostki rybosomalne 16S i 23S. Cząsteczki polimerazy RNA, na które antybiotyk nie wpłynął, zaznaczono strzałkami w części (C). (Na podstawie L.S. Gotta i in., J. Bacteriol. 20:6647, 1991.)\nJak mierzone są wskaźniki tych kluczowych procesów centralnego dogmatu? To ciekawe wyzwanie nawet przy dzisiejszych zaawansowanych technologiach. Zastanówmy się, jak możemy zaatakować ten problem. Jednym z niejasnych pomysłów może być: „wyraźmy GFP i zmierzmy czas do jego pojawienia się”. Aby zobaczyć wady takiego podejścia, sprawdź winietę na temat „Jaki jest czas dojrzewania białek fluorescencyjnych?” (krótka odpowiedź – minut do godziny), co pokazuje niedopasowanie skal czasowych między procesami będącymi przedmiotem zainteresowania a procesami przypuszczalnego odczytu. Arsenał eksperymentalny dostępny w latach 70., kiedy po raz pierwszy uzyskano przekonujące odpowiedzi, był znacznie bardziej ograniczony. Jednak w serii sprytnych eksperymentów, przy użyciu mikroskopii elektronowej i znakowania radioaktywnego, wskaźniki te zostały dokładnie określone (Miller i in., Science 169:392, 1970 RY Young i H. Bremer, Biochem. J., 152:243, 1975). . Jak zostanie pokazane poniżej, polegali oni na subtelnej analizie ilościowej w celu wydobycia stawek.\nPomiary szybkości transkrypcji oparto na sztuczce, w której inicjacja transkrypcji została zatrzymana przez użycie leku rifampiny.Chociaż żadne nowe zdarzenia transkrypcyjne nie mogą się rozpocząć, te, które już trwają, nie słabną, tj. ryfampicyna hamuje inicjację transkrypcji, ale nie wydłużanie transkryptów RNA. W rezultacie to leczenie farmakologiczne skutecznie rozpoczyna działanie stopera, który odmierza czas od rozpoczęcia ostatniego procesu transkrypcji. Dzięki utrwaleniu komórek i zatrzymaniu procesu transkrypcji w różnych momentach po leczeniu lekiem, a następnie wykonaniu mikroskopii elektronowej, w wyniku czego otrzymano obrazy takie jak na rysunku 3, można było zmierzyć długość DNA wolnego od polimerazy RNA. Biorąc pod uwagę czas, jaki upłynął od leczenia lekiem, wywnioskowano szybkość, z jaką te polimerazy poruszają się.\nRysunek 4: Dynamika transkrypcji w zarodku muchy. (A) Schemat eksperymentu pokazujący, jak pętla w powstającej cząsteczce RNA służy jako miejsce wiązania białka wirusowego, które zostało połączone z GFP. (B) W zależności od tego, czy pętle RNA są umieszczone na końcu 5' czy 3' cząsteczki mRNA, czas potrzebny na rozpoczęcie widzenia GFP puncta będzie inny. Czas opóźnienia jest równy długości transkrybowanego regionu podzielonej przez prędkość polimerazy. (C) Obrazy mikroskopowe przedstawiające pojawienie się punktów punkcikowych związanych z procesem transkrypcji dla obu konstruktów przedstawionych na (B). (D) Rozkład czasów pierwszego pojawienia się dwóch konstruktów dający czas opóźnienia 2,2 minuty, z którego wywnioskowano szybkość transkrypcji 25 nt/s. Pomiary wykonane w temperaturze pokojowej 22OC. (na podstawie H.G. Garcia i in., Current Biology, 23, 2140–2145, 2013.)\nPodobnie pomiar szybkości translacji zależał od znalezienia odpowiedniego stopera, ale tym razem dla procesu syntezy białek. Sedno metody jest następujące: rozpocznij dodawanie znakowanego aminokwasu w czasie zero i podążaj za frakcją znakowanego białka o masie m, jak określono, patrząc na konkretny prążek na żelu. Zaraz po impulsie znakowanych aminokwasów zaczyna się widzieć białka o masie m z radioaktywnie znakowanymi aminokwasami na końcach. Z czasem ułamek znakowanej masy danego białka będzie się zwiększał, ponieważ łańcuchy będą miały większą część znakowanej długości. Po czasie τm, w zależności od długości transkryptu, znakowany będzie cały łańcuch, ponieważ są to białka, które rozpoczęły translację w czasie zero, gdy dodano znacznik. W tym czasie obserwuje się zmianę w dynamice akumulacji (przy odpowiedniej normalizacji do ogólnego znakowania w komórce). Od czasu, który upłynął, τm, oraz wiedząc, ile aminokwasów znajduje się w łańcuchu polipeptydowym o masie m, możliwe jest oszacowanie szybkości translacji. Istnieje niepewność związana z wykonaniem tego, które można zminimalizować wykonując to dla różnych mas białka, m i obliczając linię regresji dla wszystkich uzyskanych wartości. Aby w pełni zrozumieć metodę, czytelnik skorzysta z oryginalnego badania przeprowadzonego przez Young & Bremer, Biochem. J., 160:185, 1976. Jest to wiarygodna wartość dla szybkości translacji E. coli do dnia dzisiejszego. Nie znamy nowszych metod, które dają lepsze efekty.\nFigura 5: Rozkład zmierzonych szybkości wydłużenia transkrypcji wywnioskowanych na podstawie łagodzenia inhibicji transkrypcji i sekwencjonowania wszystkich transkryptów w późniejszych punktach czasowych. (Na podstawie G. Fuchs i in., Genome Bio., 15:5, 2014.)\nJakie są odpowiednie współczynniki u eukariontów? Jak pokazano w Tabelach 1 i 2, transkrypcja w komórkach ssaków składa się z wydłużania z szybkością podobną do szybkości mierzonej w E. coli (50-100 nt/s, BNID 105566, 105113, 100662). Sugeruje się, że te odcinki szybkiej transkrypcji są przeplatane przerwami prowadzącymi do średniego tempa, które jest o rząd wielkości wolniejsze (~6 nt/s, 100661), ale w niektórych doniesieniach nie obserwuje się takiego spowolnienia (BNID 105565). Ostatnie pomiary in vivo na zarodkach much dostarczyły pięknego obrazu procesu transkrypcji w czasie rzeczywistym dzięki wykorzystaniu fluorescencji do obserwacji pierwszego pojawienia się mRNA, jak pokazano na rycinie 4. Ostatnio inne podejście wykorzystujące moc sekwencjonowania wywnioskowało rozkład wydłużenia transkrypcji szybkości w linii komórkowej HeLa, jak pokazano na Figurze 5, pokazując zakres 30-100 nt/s z medianą szybkości 60 nt/s (BNID 111027). Pamiętaj, że u eukariontów transkrypcja i translacja są rozdzielone przestrzennie, przy czym transkrypcja zachodzi w jądrze, a translacja w cytoplazmie. Introny są wycinane z transkryptów przed translacją, co zajmuje średnio około 5-10 minut dla tego procesu splicingu mRNA (BNID 105568). Chociaż skupiliśmy się tutaj na wydłużaniu transkrypcji, w niektórych przypadkach wydaje się, że procesem ograniczania szybkości jest inicjacja transkrypcji. Jest to proces, w którym składa się kompleks polimerazy RNA, a dwie nici DNA są rozdzielane, tworząc bańkę umożliwiającą transkrypcję.\nRysunek 6: Wnioskowanie szybkości translacji przez rybosom w mysich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu profilowania rybosomów. (A) Hamowanie inicjacji translacji, a następnie hamowanie elongacji tworzy wzorzec zatrzymywania rybosomów zależny od różnic czasowych i szybkości translacji. Przy użyciu nowoczesnych technik sekwencjonowania można to określić ilościowo w całym genomie i dokładnie zmierzyć szybkość translacji dla każdego transkryptu. (B) Pomiar szybkości translacji za pomocą metodologii wskazanej schematycznie w części (A). (Na podstawie N. Ingolia i in., Celi, 146:789, 2011.\nA co z szybkością tłumaczenia u eukariontów? W pączkujących drożdżach tempo jest około 2 razy wolniejsze niż u bakterii (3-10 aa/s, BNID 107871), ale należy zauważyć, że „fizjologiczna” temperatura, w której jest mierzona, wynosi 30ºC, podczas gdy w przypadku E. coli pomiary są w 37ºC. Jak omówiono w winiecie „W jaki sposób temperatura wpływa na szybkości i powinowactwo?”, wolniejsze tempo jest tym, czego można by się spodziewać na podstawie ogólnej zależności współczynnika 2-3 na 10ºC (wartość Q10, BNID 100919). Stosując metodę profilowania rybosomów opartą na wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu i schematycznie zobrazowaną na Ryc. 6, zbadano szybkość translacji w mysich embrionalnych komórkach macierzystych dla wielu różnych transkryptów. Stwierdzono, że szybkość ta jest dość stała we wszystkich białkach i wynosi około 6 aminokwasów na sekundę (BNID 107952). Po kilkudziesięciu latach intensywnych badań i coraz bardziej wymyślnych technik, jakimi dysponujemy, wydaje się, że dotarliśmy do punktu, w którym można zintegrować ilościowy opis różnych etapów centralnego dogmatu, aby ujawnić jego zawiłe zależności czasowe.\nCaenorhabditis elegans: genetyka molekularna i rozwój\nJ. Jason Morton , Thomas Blumenthal , w Methods in Cell Biology , 2011\n6 Jak powszechne są operony?\nChociaż operony w metazoan zostały po raz pierwszy odkryte w C. elegans, nie są one w żaden sposób unikalne dla tej grupy nicieni, a nawet dla gromady nicieni. Są również obecne w C. briggsae, a także kilka innych gatunków z grupy rabditów. Istnieją dowody na istnienie operonów dla dalej spokrewnionych nicieni, w tym Brugia malajska oraz Ascaris suum ( Guiliano i Blaxter, 2006 Liu i inni., 2010 ). Chociaż operony nie zostały jeszcze zidentyfikowane u gatunków nicieni najdalej spokrewnionych z C. elegans, Jak na przykład Trichinella spiralis, obecność splecionego lidera u tego gatunku umożliwia ich istnienie (Pettitt i in., 2008 ). Rozsądnie jest przypuszczać, że operony wyewoluowały wkrótce po pojawieniu się trans-splicingu i są uniwersalne wśród nicieni. Raz utworzone operony są z konieczności niezwykle trudne do stracenia ewolucyjnie. Ponieważ dalsze geny są teraz oddzielone od swoich promotorów, ich duplikacja lub transpozycja z mniejszym prawdopodobieństwem doprowadzi do powstania funkcjonalnego genu (Qian i Zhang, 2008). Dodatkowo, ponieważ przetwarzanie policistronowego RNA powstałego z operonów wymaga trans-splicingu, kodony startowe poza ramką mogą ewoluować w sekwencjach DNA powyżej miejsca trans-splicingu (Blumenthal, 2005). Z tego powodu badania wykazały, że raz uformowane operony nie są łatwo gubione w wyniku ewolucji. Jednak nawet u blisko spokrewnionych gatunków, takich jak C. elegans oraz C. briggsae, oddzielone około 100 milionami lat ewolucji, zawartość i układ operonów są wyraźnie różne (Qian i Zhang, 2008). Kiedy zbadano również dalej spokrewnione nicienie, autorzy ci udokumentowali liczne dodatkowe przypadki utraty i rearanżacji operonu.\nPoza gromadą nicieni operony zostały odnotowane w kilku dodatkowych gromadach. Wydaje się, że we wszystkich tych przypadkach trans-splicing powstał niezależnie (z cis-splicingu), a następnie w genomie pojawiły się operony. W co najmniej dwóch przypadkach, stawonogów i strunowców, wydaje się, że trans-splicing i prawdopodobnie operony powstały stosunkowo niedawno, ponieważ większość gałęzi tych typów nie ma tych cech ( Douris i in., 2010 ).\nU prokariontów geny kodujące enzymy niektórych szlaków metabolicznych są często kontrolowane jako grupa, przy czym geny kodujące białka szlaku znajdują się blisko siebie i znajdują się pod kontrolą wspólnego promotora. Taka grupa genów nazywa się an operon. Zazwyczaj te geny nie są przepisywane przez cały czas. Produkcja tych białek może być raczej wywołana obecnością odpowiedniej substancji zwanej an induktor. Zjawisko to nazywa się wprowadzenie. Szczególnie dobrze zbadanym przykładem białka indukowalnego jest enzym β−galaktozydaza in E coli.\nDisacharyd laktoza (β-galaktozyd) jest substratem β-galaktozydazy. Enzym hydrolizuje wiązanie glikozydowe między galaktozą a glukozą, monosacharydami będącymi składnikami laktozy. E coli może przetrwać z laktozą jako jedynym źródłem węgla. W tym celu bakteria potrzebuje β-galaktozydazy, która katalizuje pierwszy etap rozkładu laktozy.\nProdukcja β-galaktozydazy odbywa się tylko w obecności laktozy, a nie w obecności innych źródeł węgla, takich jak glukoza. Metabolit laktozy, allolaktoza, jest faktycznym induktorem, a β-galaktozydaza jest indukowalny enzym.\nβ-galaktozydaza jest kodowana przez agen strukturalny(lacZ) (Rysunek 11.10). Geny strukturalne kodują produkty genów, które biorą udział w biochemicznej ścieżce operonu. W skład operonu wchodzą dwa inne geny strukturalne. Jeden jest koronkowy, który koduje enzym permeazę laktozy, która umożliwia wnikanie laktozy do komórki. Drugi to lacA, który koduje enzym zwany trans-acetylazą. Cel tego ostatniego enzymu nie jest znany, ale niektórzy stawiają hipotezę, że jego rolą jest inaktywacja niektórych antybiotyków, które mogą przedostać się do komórki przez\npermeaza laktozy. Ekspresja tych genów strukturalnych jest z kolei pod kontrolą a gen regulacyjny (lacI ), a sposób działania genu regulatorowego jest najważniejszą częścią gumilaka mechanizm operonu. Gen regulacyjny jest odpowiedzialny za produkcję białka, represor. Jak sama nazwa wskazuje, represor hamuje ekspresję genów strukturalnych. W obecności induktora hamowanie to jest usuwane. To jest przykład negatywna regulacja ponieważgumilakaoperon jest włączony, chyba że coś jest obecne, aby go wyłączyć, co w tym przypadku jest represorem.\nTranskrypcja jest inaczej regulowana u prokariontów i eukariontów. Ogólnie rzecz biorąc, regulacja prokariotyczna jest prostsza niż regulacja eukariotyczna.\nRegulacja transkrypcji u prokariontów zazwyczaj obejmuje operony. jakiś operon to region DNA, który składa się z jednego lub więcej genów kodujących białka potrzebne do określonej funkcji. W skład operonu wchodzi również promotor i operator. ten operator to region operonu, w którym wiążą się białka regulatorowe. Znajduje się w pobliżu promotor i pomaga regulować transkrypcję genów operonu.\nDobrze znany przykład regulacji operonu obejmuje: operon lac w E coli bakterie (patrz Postać poniżej i wideo pod linkiem poniżej). Operon lac składa się z promotora, operatora i trzech genów kodujących enzymy potrzebne do trawienia laktozy, cukru znajdującego się w mleku. Operon lac jest regulowany przez laktozę w środowisku. ten Gumilaka Operon Film na http://www.youtube.com/watch?v=oBwtxdI1zvk wyjaśnia bardziej szczegółowo operon.\nGdy laktoza jest nieobecna, a represor białko wiąże się z operatorem. Operator znajduje się pomiędzy promotorem a trzema genami operonu lac. Białko blokuje wiązanie polimerazy RNA z promotorem. W rezultacie geny lac nie ulegają ekspresji.\nGdy obecna jest laktoza, białko represora nie wiąże się z operatorem. Pozwala to polimerazie RNA na związanie się z promotorem i rozpoczęcie transkrypcji. W rezultacie geny lac ulegają ekspresji, a laktoza jest trawiona.\nDlaczego ekspresja genów może być korzystna tylko wtedy, gdy są potrzebne? (Wskazówka: synteza białek wymaga energii i materiałów.)\nTrzy geny operonu lac to lacZ, lacY i lacA. Kodują białka potrzebne do trawienia laktozy. Geny ulegają ekspresji tylko w obecności laktozy.\nPodsumowanie: trp vs. operon lac\nPodobieństwa między tymi dwoma operonami są bardziej fundamentalne niż różnice:\nOba wytwarzają policistronowe mRNA, które kodują wiele białek. Każdy policistronowy mRNA koduje zestaw białek, które współpracują ze sobą w szlaku biochemicznym.\nOba stosują negatywną regulację genu za pomocą białka represorowego. Kiedy białko represora wiąże się z DNA operatora, polimeraza RNA jest blokowana przed wiązaniem się z promotorem, co powoduje zahamowanie transkrypcji. Zatem oba operony są regulowane przez kontrolowanie inicjacji transkrypcji.\nRóżnice między tymi dwoma operonami są związane z funkcjami zaangażowanych szlaków biochemicznych:\nOperon trp koduje białka tworzące szlak anaboliczny. Komórka kontynuuje produkcję tryptofanu, aż jest wystarczająco dużo. W tym momencie tryptofan działa jako ko-represor, allosterycznie aktywując białko represora. Białko represorowe samo w sobie jest nieaktywne, dopóki nie zostanie aktywowane allosterycznie.\nOperon lac koduje białka tworzące szlak kataboliczny. Komórka wytwarza te enzymy tylko wtedy, gdy jest obecna laktoza do katabolizacji. Białko represorowe jest aktywne samo w sobie, dopóki nie zostanie allosterycznie aktywowane przez laktozę. Ponadto silna regulacja w górę tego operonu występuje tylko wtedy, gdy w komórce brakuje glukozy jako alternatywy.\nZapamiętywanie szczegółów tych operonów może być trudne, ale o wiele łatwiej jest zacząć od pytania, dlaczego używają one innych mechanizmów.\nDlaczego te dwa operony pojawiają się w każdym podręczniku do biologii?\nSą dwa powody: po pierwsze, te dwa operony są przykładem regulacji enzymów na szlakach katabolicznych i anabolicznych, które razem odpowiadają za całą biochemię. W genomach bakterii znajduje się wiele innych operonów, które przypominają operon trp (szlaki anaboliczne) lub operon lac (szlaki kataboliczne). Po drugie, te dwa operony reprezentują klasyczne odkrycia w historii biologii. Kiedy mechanizmy operonu lac z E coli zostały po raz pierwszy opisane przez Francoisa Jacoba, Jacquesa Monoda i Andre Lwoffa, począwszy od lat pięćdziesiątych, po raz pierwszy ktokolwiek zorientował się, w jaki sposób ekspresja genów jest kontrolowana w jakimkolwiek organizmie.\nPorównanie operonów bakteryjnych z genami eukariotycznymi\nPodobnie jak operony bakteryjne, twoje własne geny są często regulowane przez kontrolowanie inicjacji transkrypcji. Jednak chromosomy eukariotyczne są znacznie bardziej złożone niż chromosomy E coli. Eukariotyczne DNA jest silnie skompleksowane z histonami i innymi białkami, co pozwala na dodatkowe mechanizmy regulacji genów, w tym mechanizmy epigenetyczne. Ponadto eukarionty szeroko wykorzystują mechanizmy regulacji genów, które występują po transkrypcji, takie jak edycja RNA. Wreszcie, większość genów eukariotycznych nie jest policistronowych.\nW tym kwartale poznasz mechanizmy regulacji genów eukariotycznych.\nRegulacja genów prokariotycznych\nW bakteriach i archeony, białka strukturalne o pokrewnych funkcjach są zwykle kodowane razem w genomie w bloku zwanym an operon i są transkrybowane razem pod kontrolą jednego promotor, w wyniku czego powstaje policistronowy transkrypt (Figura 1). W ten sposób regulacja transkrypcji wszystkich genów strukturalnych kodujących enzymy katalizujące wiele etapów w jednym szlaku biochemicznym może być kontrolowana jednocześnie, ponieważ albo wszystkie będą potrzebne w tym samym czasie, albo żadne nie będą potrzebne. Na przykład w E coli, wszystkie geny strukturalne, które kodują enzymy potrzebne do wykorzystania laktozy jako źródła energii, leżą obok siebie w laktozie (lub gumilaka) operon pod kontrolą jednego promotora, gumilaka promotor. Francuscy naukowcy François Jakub (1920-2013) i Jacques Monod w Instytucie Pasteura jako pierwsi wykazali organizację genów bakterii w operony, poprzez swoje badania nad gumilaka operon z E coli. Za tę pracę zdobyli Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 1965 roku. Chociaż geny eukariotyczne nie są zorganizowane w operony, operony prokariotyczne są doskonałymi modelami do ogólnego uczenia się regulacji genów. Istnieje kilka klastrów genów u eukariontów, które działają podobnie do operonów. Wiele zasad można zastosować do systemów eukariotycznych i przyczynić się do zrozumienia zmian w ekspresji genów u eukariotów, które mogą powodować zmiany patologiczne, takie jak rak.\nRysunek 1. U prokariontów geny strukturalne o pokrewnych funkcjach są często organizowane razem w genomie i podlegają wspólnej transkrypcji pod kontrolą pojedynczego promotora. Region regulacyjny operonu obejmuje zarówno promotor, jak i operator. Jeśli represor zwiąże się z operatorem, geny strukturalne nie zostaną przepisane. Alternatywnie, aktywatory mogą wiązać się z regionem regulatorowym, wzmacniając transkrypcję.\nKażdy operon zawiera sekwencje DNA, które wpływają na jego własną transkrypcję. Są one zlokalizowane w regionie zwanym regionem regulatorowym. Region regulatorowy obejmuje promotor i region otaczający promotor, do którego czynniki transkrypcyjne, białka kodowane przez geny regulatorowe mogą się wiązać. Czynniki transkrypcyjne wpływają na wiązanie polimeraza RNA do promotora i umożliwienia jego progresji transkrypcji genów strukturalnych. A represor jest czynnikiem transkrypcyjnym, który hamuje transkrypcję genu w odpowiedzi na bodziec zewnętrzny poprzez wiązanie się z sekwencją DNA w regionie regulatorowym zwanym operator, który znajduje się pomiędzy miejscem wiązania polimerazy RNA promotora a miejscem startu transkrypcji pierwszego genu strukturalnego. Wiązanie represora fizycznie blokuje polimerazę RNA przed transkrypcją genów strukturalnych. I odwrotnie, an aktywator jest czynnikiem transkrypcyjnym, który zwiększa transkrypcję genu w odpowiedzi na bodziec zewnętrzny, ułatwiając wiązanie polimerazy RNA z promotorem. jakiś induktor, trzeci typ cząsteczki regulatorowej, to mała cząsteczka, która aktywuje lub hamuje transkrypcję poprzez oddziaływanie z represorem lub aktywatorem.\nU prokariontów istnieją przykłady operonów, których produkty genowe są raczej konsekwentnie wymagane, a zatem ich ekspresja jest nieregulowana. Takie operony są konstytutywnie wyrażone, co oznacza, że są one stale transkrybowane i translowane, aby zapewnić komórce stałe pośrednie poziomy produktów białkowych. Takie geny kodują enzymy zaangażowane w funkcje porządkowe niezbędne do utrzymania komórek, w tym replikację, naprawę i ekspresję DNA, a także enzymy biorące udział w metabolizmie rdzenia. W przeciwieństwie do tego, istnieją inne operony prokariotyczne, które ulegają ekspresji tylko w razie potrzeby i są regulowane przez represory, aktywatory i induktory.\nJakie są części sekwencji DNA operonu?\nJakie są rodzaje cząsteczek regulatorowych?\nMechanizmy potencjalnie umożliwiające UTT\nBiorąc pod uwagę dowody przedstawione w części The CTT Dogma has Been Challenge: Towards Uncoupled Transscription-Translation, prawdopodobne jest, że CTT może nie być tak uniwersalna, jak zakładano przez wiele lat. Innymi słowy, transkrypcja może zachodzić niezależnie od translacji, a mRNA mogą podlegać transkrypcji i translacji w separacji czasoprzestrzennej. Jednak, aby doszło do UTT, bakterie musiałyby stawić czoła trzem głównym wyzwaniom: (1) Zapobiegać powiązaniu między wiodącym rybosomem a powstającym mRNA, gdy sekwencja SD wyłoni się z RNAP. (2) Chroń transkrypt wolny od rybosomów przed rozpadem rybonukleolitycznym w cytoplazmie. (3) Przeprowadzić transkrypcję niezwiązaną z translacją bez przerywania przez terminatory wewnętrzne i zależne od Rho.\nDynamika wydłużania transkrypcji w 5'-proksymalnych sekwencjach kodujących ma szczególne znaczenie dla UTT. w E coliRNAP wykazuje wyraźną pauzę transkrypcyjną w miejscach nakładających się na sekwencje SD i kodony start (Larson i wsp., 2014), otwierając w ten sposób okno czasowe do regulacji nagich 5'-UTR przez białka wiążące RNA (RBP) lub zdarzenia fałdowania RNA przed powiązaniem rybosomu z transkryptem. Co więcej, oczekuje się, że transkrypcja 5'-proksymalnych sekwencji kodujących zachodzi niezależnie od translacji (patrz rozdział Architektura molekularna CTT), więc dlaczego ten rodzaj regulacji nie może być nadal wywierany na transkrypt nagiego rybosomu przed rozpoczęciem translacji?\nPoniżej opisujemy kilka molekularnych czynników i mechanizmów, które działając we współpracy, potencjalnie promują UTT w taki sposób, że trzy wymienione powyżej wyzwania zostałyby rozwiązane w zadowalający sposób (Rysunek 5). Przedstawiono dowody potwierdzające zdolność tych czynników i mechanizmów do kotranskrypcyjnego oddziaływania na powstające mRNA. Ponadto pokrótce omówiono tworzenie biomolekularnych kondensatów przez LLPS i ich domniemane implikacje w promowaniu UTT.\nRysunek 5. Mechanizmy potencjalnie umożliwiające UTT. Zdarzenia kotranskrypcyjne, takie jak asocjacja z RBP lub sRNA, a także tworzenie ryboprzełączników, zapobiegają terminacji transkrypcji przez Rho i asocjacji z wiodącym rybosomem. Kiedy transkrypty wolne od rybosomów są uwalniane do cytoplazmy, te zdarzenia chroniące transkrypty przeciwdziałają aktywności rybonukleaz. Warto zauważyć, że chociaż narysowane liniowo, transkrypty podobno nabywają złożone drugorzędowe i trzeciorzędowe struktury, które zapewniają dalszą ochronę. Ta ochrona zapobiega również translacji mRNA, dopóki nie dotrą do miejsca docelowego.\nBiałka wiążące RNA\nRBP zyskały duże zainteresowanie w konsekwencji ich zdolności do regulowania losu transkryptów poprzez wpływ na translację i stabilność mRNA (Holmqvist i Vogel, 2018 Richards i Belasco, 2019), a pojawiające się dowody sugerują, że mogą promować UTT. Na przykład, Synechocystis RBPs Rbp2 i Rbp3 są wymagane do niezależnej od translacji lokalizacji błony tylakoidowej transkryptów kodujących białka fotosystemu (Mahbub i wsp., 2020), co oznacza, że działają kotranskrypcyjnie na celowanie mRNA przed rozpoczęciem translacji. Podobnie eksperymenty Grad-seq wykonywane w Salmonella oraz E coli wykazali, że kilka analizowanych tutaj RBP współosadza się z RNAP (Smirnov i wsp., 2016 Hör i wsp., 2020), co może wskazywać na kotranskrypcyjny związek RBP z powstającymi RNA. Biorąc pod uwagę ich aktywność determinującą los transkrypcji, te RBP pojawiają się jako potencjalni kandydaci do promowania UTT.\nBiałka szoku zimnego\nBiałka szoku zimnego (CSP) należą do ewolucyjnie rozpowszechnionej rodziny małych, kwaśnych białek, które pierwotnie odkryto jako mediatory odpowiedzi na szok zimny, ale obecnie wiadomo, że ich funkcja wykracza poza przystosowanie do zimna (przegląd w: Ermolenko i Machatadze, 2002 Horn i in. in., 2007 Budkina i in., 2020). Warto zauważyć, że obecność co najmniej jednego csp gen w komórce jest niezbędny dla żywotności w B. subtilis (Graumann i in., 1997). ten E coli genom koduje dziewięć różnych genów CSP, z których tylko cztery, CspA, CspB, CspG i CspI, są indukowane przez szok zimny (Etchegaray i Inouye, 1999 Wang i wsp., 1999), a dwa, CspC i CspE, ulegają konstytutywnej ekspresji w 37°C (Yamanaka i wsp., 1994 Bae i wsp., 1999). Warto zauważyć, że domena szoku zimna (CSD) w CSP nadaje zdolność do wiązania jednoniciowych kwasów nukleinowych (Jiang i wsp., 1997 Lopez i wsp., 1999 Phadtare i Inouye, 1999) i topienia w nich struktur drugorzędowych (Phadtare et al., 2002a Phadtare i Severinov, 2005 Rennella et al., 2017). W związku z tym, oprócz pośredniczenia w UTT, jak opisano poniżej, CSP mogą wspomagać CTT poprzez zapewnienie przeniesienia niezfałdowanego mRNA z nukleoidu do rybosomów (El-Sharoud i Graumann, 2007).\nBadania bioinformatyczne ujawniły uprzedzenia na poziomie sekwencji w kierunku bogactwa U w transkryptach kodujących integralne białka błonowe w E coli (Prilusky i Bibi, 2009) oraz Lactococcus lactis (van Gijtenbeek i in., 2016). Informacje opublikowane przez nasze laboratorium potwierdziły, że bogactwo U w domenach przechodzących przez błony jest ważne dla ich lokalizacji w błonie, jak przewidywano bioinformatycznie (Kannaiah i in., 2019). Co ciekawe, E coli CspC i CspE preferencyjnie wiążą sztuczne transkrypty bogate w U i endogenne mRNA błony (Benhalevy i wsp., 2015). Ponadto nadekspresja CspE powoduje akumulację transkryptów wolnych od rybosomów kodujących białka błonowe w cytoplazmie i pozytywnie wpływa na ich translację w błonie (Benhalevy i wsp., 2017). Sugeruje to, że przez Dzięki pośrednictwu CspE transkrypty te unikają CTT, dopóki nie dotrą do błony, gdzie ulegają lokalnej translacji.\nObecne dowody sugerują, że CSP promuje UTT poprzez ochronę powstających transkryptów przed RNazami. Na przykład nadekspresja CspC i CspE zwiększa stabilność transkryptów kodujących białka odpowiedzi na stres RpoS i UspA (Phadtare i Inouye, 2001). Podczas gdy poziomy CspE pozostają stałe w różnych fazach wzrostu, poziomy CspC wzrastają po wejściu w fazę stacjonarną, co powoduje stabilizację rpoS transkrypcje (Shenhar i in., 2012). Te zdolności stabilizowania transkryptu można wyjaśnić tendencją CspE do wiązania sekwencji poli(A), przeciwdziałając aktywności rybonukleolitycznej PNPazy i RNazy E (Feng i wsp., 2001). Biorąc pod uwagę, że większość transkryptów ulega poliadenylacji (Mohanty i Kushner, 2006), CspE może działać jako globalna tarcza molekularna przeciwko skoordynowanemu, zależnemu od poli(A) działaniu egzorybonukleolitycznemu PNPazy na końcu 3' i endonukleolitycznemu atakowi RNazy E w miejsca cięcia powstających transkryptów. Nutowy, cspE mRNA jest regulowane w dół przy braku PNPazy (Polissi i wsp., 2003), co sugeruje, że mechanizm regulacyjny równoważy aktywność rybonukleolityczną PNPazy i ochronę anty-RNazową przez CspE.\nAby te działania promowały UTT, dostawcy CSP powinni uzyskać dostęp do powstających transkryptów, gdy tylko wyjdą z RNAP. Rzeczywiście, CspE wiąże powstające RNA i działa jako antyterminator poprzez topienie drugorzędowych struktur terminatorów wewnętrznych (Hanna i Liu, 1998 Bae i wsp., 2000 Phadtare i wsp., 2002a, b Phadtare i Severinov, 2005). Podsumowując, te dowody wskazują, że CSP mogą promować rozprzęganie transkrypcji i translacji poprzez przeciwdziałanie aktywności RNazy w stosunku do transkryptów i promowanie niezależnej od transkrypcji transkrypcji w stosunku do terminatorów wewnętrznych.\nBiałka szoku zimna wykazują aktywność promującą UTT u innych gatunków. w Salmonella, CspC i CspE wiążą około 20% transkryptomu z ważnymi implikacjami regulacyjnymi dla jego patogenności (Michaux i wsp., 2017). Na przykład ecnB mRNA, który jest wiązany przez te CSP, wykazuje niższe poziomy transkrypcji i stabilność w 㥌spCE tło. Poziomy i stabilność tego transkryptu zostały przywrócone w 㥌spCE komórki eksprymujące wrażliwe na temperaturę mutanta RNazy E w temperaturze restrykcyjnej. W ten sposób dostawcy usług internetowych chronią ecnB transkrypty z rozpadu za pośrednictwem RNazy E (Michaux i wsp., 2017). Podobnie CspE wiąże i stabilizuje yciF transkrypcje, konferowanie Salmonella zwiększona odporność na sole kwasów żółciowych poprzez nieprzepuszczalność błony komórkowej (Ray i wsp., 2019b). Także w B. subtilis, CspB wykazuje lokalizację pozajądrową w sposób zależny od transkrypcji (Mascarenhas i wsp., 2001 Weber i wsp., 2001), co sugeruje, że CspB wiąże transkrypty po wejściu do cytoplazmy.\nPodsumowując, CSP pojawiły się jako RBP odgrywające ważną rolę w regulacji genów i potencjalnie promowaniu UTT. Ich funkcja przypomina FRGY2, białko zawierające CSD, które wiąże mRNA w jądrze oocytów żaby i chroni transkrypty przed degradacją i translacją w cytoplazmie, dopóki nie zostaną uwolnione w sposób regulowany podczas rozwoju oocytu (Bouvet i Wolffe, 1994). Ich wieloaspektowe funkcje jako antyterminatorów transkrypcji i tarcz antyrybonukleolitycznych sprawiają, że CSP są obiecującymi tematami do przyszłych badań dotyczących ich przypuszczalnej roli jako czynników ułatwiających UTT.\nOprócz wielu interakcji z rRNA w rybosomie, białka rybosomalne (RP) pełnią funkcje pozarybosomalnego oświetlenia księżyca jako wolne RBP, często zaangażowane w regulację genów (przegląd w Bhavsar i wsp., 2010 Aseev i Boni, 2011). Kilka RP wiąże swoje pokrewne mRNA w celu negatywnej autoregulacji ich translacji i utrzymania homeostazy RP. W innych przypadkach RP odtwarzają funkcje, które mogą włączyć UTT.\nJednym z przykładów jest S1 RP w E coli, który wiąże jednoniciowe sekwencje bogate w AU zlokalizowane powyżej sekwencji SD w obrębie 5'-UTR (Boni i wsp., 1991 Mogridge i Greenblatt, 1998 Komarova i wsp., 2002), aktywność, która zwiększa stabilność lacZ mRNA (Komarova i wsp., 2005), najprawdopodobniej z powodu nakładania się miejsc wiązania S1 i miejsc cięcia RNazy E (Kaberdin i B1äsi, 2006). Zgodnie z tą hipotezą S1 wiąże cspE oraz rpsO transkrypty i chroni je przed atakiem RNazy E (Delvillani i wsp., 2011). Wykazano ponadto, że S1 przeciwdziała rozpadowi mRNA za pośrednictwem PNPazy (Briani i wsp., 2008). W przypadku nadekspresji S1 wiąże kilka mRNA, w tym pnp mRNA i zwiększa ich stabilność wobec rozpadu za pośrednictwem PNPazy. Zgodnie z tymi wynikami, wyczerpanie S1 prowadzi do destabilizacji tych transkryptów in vivo (Briani i in., 2008). Podobnie jak CspE, S1 wiąże sekwencje poli(A) (Kalapos i wsp., 1997), ale to wiązanie nie chroni transkryptów przed degradacją PNPazy in vitro (Feng i in., 2001). Czy S1 przeciwdziała PNPazie? in vivo poprzez promowanie ochrony transkryptu zależnej od CspE (patrz powyżej) lub poprzez alternatywny mechanizm pozostaje nieznany. Dodatkowo wykazano, że S1 zwiększa wydzielanie białka, w którym pośredniczy peptyd sygnałowy hemolizyny, czemu towarzyszyła stabilizacja odpowiednich transkryptów (Khosa i wsp., 2018). Jeśli S1 może promować UTT, te działania chroniące RNA powinny zostać wdrożone, gdy tylko powstający transkrypt wyjdzie z RNAP. Pod tym względem S1 łączy się z RNAP i promuje jego procesywność transkrypcyjną (Sukhodolets i Garges, 2003 Sukhodolets i in., 2006). Dodatkowo S1 wiąże RNAP pośrednio tworząc rybonukleoproteinę (RNP) z IsrA sRNA (van Nues i wsp., 2015). Jest zatem prawdopodobne, że S1 wiąże powstające transkrypty kotranskrypcyjnie i chroni je przed atakiem rybonukleolitycznym, sprzyjając w ten sposób występowaniu UTT.\nInnym przykładem jest S4 RP, który negatywnie autoreguluje swoją translację poprzez wiązanie swojego pokrewnego cistronu w operonie α i tworzenie pseudowęzła, który prowadzi do uwięzienia nieaktywnego kompleksu inicjacji translacji (Spedding i Draper, 1993 Schlax et al., 2001). Ta autoregulacja hamuje również translację kilku innych RP współtranskrybowanych w ramach tego samego operonu. Jednak regulacja rpoA gen, który koduje podjednostkę α RNAP i jest również współtranskrybowany w obrębie operonu α, nie podlega tej negatywnej regulacji (Thomas i wsp., 1987). Chociaż mechanizm tego wykluczenia pozostaje nieznany, oznacza to, że operon α może być poddany częściowemu zakłóceniu CTT, tj. podczas gdy podjednostka α RNAP podlega transkrypcji kotranskrypcyjnej, geny kodujące białka rybosomalne są kotranskrybowane, ale translacyjne represjonowany przez S4. Aby wywołać takie zakłócenie CTT, S4 musiałby działać kotranskrypcyjnie. Rzeczywiście, S4 może wiązać RNAP i antyterminatory zależne od Rho (Torres i wsp., 2001), chroniąc w ten sposób wolne od rybosomów powstające transkrypty przed PTT. Dlatego S4 odgrywa podwójną rolę w promowaniu UTT: przerwanie sprzężenia transkrypcja-translacja w operonie α i zapobieganie za pośrednictwem Rho terminacji TEC, które nie są fizycznie sprzężone z translującym rybosomem.\nL4 RP pokazuje również wiele działań, które mogłyby promować UTT. L4 wiąże regulatorową CTD RNazy E i hamuje jej aktywność, prowadząc do stabilizacji podzbioru transkryptów związanych ze stresem, kluczowych dla przeżycia komórki (Singh et al., 2009). Złagodzenie presji rybonukleolitycznej na te mRNA może pozwolić na mniej ścisły reżim CTT dla tych transkryptów. Wśród transkryptów stabilizowanych przez L4 jest ten z tryptofanazy (tna) operon, który podlega dodatkowej, niezależnej od degradosomu warstwie regulacji przez L4. W szczególności nadekspresja L4 zwiększa stabilność tnaCAB transkryptu, ale powoduje represję translacyjną białka TnaA poprzez wiązanie się z łącznikiem między tnaC- tnaA (Singh i in., 2020). Mogłoby to prowadzić do częściowego zakłócenia CTT w tym operonie, tj. tnaC można wyrazić za pomocą CTT, natomiast tnaA translacja jest hamowana pomimo wzrostu jej poziomów mRNA. Co ciekawe, ta translacyjna represja tnaA ma miejsce we wczesnej fazie stacjonarnej, aby zapobiec degradacji tryptofanu, która jest wymagana do długotrwałego przeżycia w głębokiej fazie stacjonarnej (Singh i wsp., 2020), podkreślając, że zakłócenia CTT mogą mieć ważne implikacje fizjologiczne. Co ważne, L4 wiąże swój pokrewny transkrypt, aby osłabić transkrypcję (Lindahl i wsp., 1983). Zatem L4 może działać kotranskrypcyjnie jako czynnik antytranslacyjny również wobec innych powstających transkryptów. Dalsze badanie pozarybosomalnych funkcji RP powinno doprowadzić do lepszego zrozumienia tych działań, które są potencjalnie zaangażowane w UTT.\nOprócz swojej dokładnie przebadanej roli jako swatka sRNA-mRNA (patrz poniżej), Hfq wywiera posttranskrypcyjną regulację w E coli poprzez bezpośrednie wiązanie się z transkryptami i wpływanie na ich los (przegląd w Kavita et al., 2018). Wykazano, że Hfq wiąże 5'-UTR swojego pokrewnego transkryptu (Veპrek i wsp., 2005) i cirA (Salvail i in., 2013) oraz mutS mRNA (Chen i Gottesman, 2017), a także miejsce wiązania rybosomu (RBS) mRNA transpozazy Tn10 (Ellis i wsp., 2015). We wszystkich tych przypadkach wiązanie Hfq prowadzi do represji translacyjnej docelowych transkryptów. Czynności te można wytłumaczyć obserwacją, że w przypadku krwotoku jelitowego E coli, Hfq wykazuje preferencję do wiązania trypletów ARN zlokalizowanych w pobliżu RBS (Tree i wsp., 2014), co może wykluczyć inicjację translacji. Podobnie represja translacyjna przez Hfq odgrywa kluczową rolę w katabolicznej represji patogenu oportunistycznego Pseudomonas aeruginosa. Z pomocą białka Crc kontroli katabolicznej represji, Hfq wiąże specyficzne sekwencje bogate w A w pobliżu regionów inicjacji translacji, aby zahamować translację genów represjonowanych katabolicznie (Sonnleitner i B1äsi, 2014 Pei i wsp., 2019).\nWykazano również, że Hfq preferencyjnie wiąże wewnętrzne sekwencje terminatora w Salmonella (Holmqvist i in., 2016). Odpowiednio, Hfq wiąże PAP I i promuje syntezę ogonów poli(A) na wewnętrznych terminatorach w E coli (Hajnsdorf i Régnier, 2000 Le Derout i in., 2003 Mohanty i in., 2004). Analogicznie do CspE (patrz powyżej), Hfq wiąże się z sekwencjami poli(A) zachodzącymi na miejsca cięcia RNazy E i zapewnia ochronę przed rozpadem egzorybonukleolitycznym przez PNPazę i RNazę II (Folichon i wsp., 2003 Moll i wsp., 2003 Zhang i wsp.). , 2003). Łącznie dowody te wskazują, że Hfq wiąże wewnętrzne miejsca terminacji w celu promowania poliadenylacji i, wiążąc się z tymi sekwencjami poli(A), chroni 3'-UTR i sekwencje znajdujące się powyżej przed rozpadem rybonukleolitycznym.\nCo ważne, Hfq oddziałuje z RNAP, promując transkrypcję (Sukhodolets i Garges, 2003). Co więcej, Hfq ma podobieństwa topologiczne z YaeO, jedynym do tej pory odkrytym białkiem, które wiąże i hamuje Rho w E coli (Pichoff i in., 1998 Gutiérrez i in., 2007) oraz Vibrio cholerae (Pal i in., 2019). W związku z tym Hfq hamuje terminację zależną od Rho poprzez jednoczesne wiązanie sekwencji bogatych w Rho i AU znajdujących się powyżej rykowisko miejsca (Rabhi i in., 2011). Ostatnio wykazano, że Hfq wszechstronnie wiąże powstające transkrypty w E coli (Persson i in., 2013 Sedlyarova i in., 2016) oraz P. aeruginosa (Kambara i in., 2018 Gebhardt i in., 2020). Helisowata lokalizacja Hfq obserwowana w E coli w pewnych warunkach wzrostu (Taghbalout et al., 2014 Malabirade et al., 2017 Kannaiah et al., 2019) przypomina spiralno-elipsoidalną konformację nukleoidu (Fisher et al., 2013), wzmacniając ideę, że Hfq może pośrednio kojarzyć z chromosomem poprzez wiązanie powstających transkryptów. Podobnie do S1, Hfq tworzy RNP z IsrA sRNA, który łączy się z RNAP (van Nues i wsp., 2015). Dlatego Hfq pojawia się jako potencjalny czynnik promujący UTT poprzez antyterminację transkrypcji wolnej od rybosomów, która w przeciwnym razie mogłaby być terminowana przez Rho. Fakt, że Hfq może wchodzić w interakcje z powstającymi transkryptami, sugeruje, że opisane tutaj role Hfq antytranslacyjne i antyrybonukleazowe mogą odgrywać rolę kotranskrypcyjną, aby zakłócić CTT i chronić powstające mRNA przed RNazami.\nChociaż początkowo odkryto go jako regulator biosyntezy glikogenu po wejściu w fazę stacjonarną (Romeo i wsp., 1993), CsrA wyłonił się jako globalny regulator posttranskrypcyjny związany z wieloma funkcjami komórkowymi (przegląd w Vakulskas i wsp., 2015 Romeo i Babitzke , 2018). Wykazano, że CsrA wiąże setki transkryptów w E coli (Edwards i in., 2011 Potts i in., 2017), Campylobacter (Dugar i in., 2016), Salmonella (Holmqvist i in., 2016) oraz Legionella (Sahr i in., 2017) wpływając na ich los po transkrypcji i potencjalnie promując UTT.\nGłówną działalnością regulacyjną CsrA jest: przez represje translacyjne (Dugar i in., 2016 Potts i in., 2017). Na przykład CsrA wiąże sekwencję SD hfq mRNA i hamuje jego translację (Baker i wsp., 2007). Podobnie CsrA wiąże się w dwóch miejscach w 5'-UTR, w tym w sekwencji SD, transkryptów kodujących regulator transkrypcji NhaR, który reaguje na wysokie stężenia sodu i zasadowe pH (Pannuri i wsp., 2012). Podobnie CsrA hamuje translację magazynowania żelaza dsp mRNA poprzez wiązanie regionu 5'-UTR transkryptu (Potts i wsp., 2017 Pourciau i wsp., 2019). W enteropatogennym E coli (EPEC), CsrA hamuje translację efektora wirulencji NleA (Katsowich et al., 2017). Po kontakcie z gospodarzem EPEC wstrzykuje efektory do komórki gospodarza przez układ wydzielniczy typu III z pomocą związanego z efektorem CesT opiekuńczego. Po uwolnieniu efektora wolny CesT wiąże się i hamuje CsrA, prowadząc do derepresji NleA i jego późniejszej translacji i translokacji do komórki gospodarza (Katsowich i wsp., 2017). Homolog CsrA RsmA wiąże 5'-UTR z psl mRNA odpowiedzialny za biosyntezę strukturalnego polisacharydu w P. aeruginosa biofilmy i hamują jego translację poprzez ponowne fałdowanie struktury transkryptu, tak że sekwencja SD nie jest dostępna dla rybosomów (Irie i wsp., 2010). We wszystkich omawianych tu przykładach hamowaniu translacji nie towarzyszyła zmniejszona stabilność transkryptu. W konsekwencji może to prowadzić do akumulacji transkryptów wolnych od rybosomów w cytoplazmie, przypominając zjawisko obserwowane przy nadekspresji CspE i S1 (patrz powyżej). Co ciekawe, omawiane tutaj transkrypty regulowane przez CsrA/RsmA kodują białka odpowiadające na bodźce środowiskowe. Tak więc, kuszące jest spekulowanie, że CsrA/RsmA promują UTT i akumulację nieulegających translacji puli mRNA, których ekspresja może być szybko osłabiona pod wpływem wyzwań środowiskowych bez opóźnienia transkrypcji.\nCo więcej, CsrA może również działać jako tarcza anty-RNazowa (Esquerré i in., 2016 Potts i in., 2017). Na przykład wykazano, że CsrA ma kluczowe znaczenie dla: E coli ruchliwość poprzez regulację fhl operon, główny operon biosyntezy wici, poprzez zwiększenie stabilności fhlDC transkrypty (Wei i wsp., 2001), a osiąga się to poprzez ochronę tych mRNA przed rozszczepieniem przez RNazę E (Yakhnin i wsp., 2013). Podobnie CsrA stabilizuje Legionella regulator pobierania żelaza futro mRNA poprzez wiązanie specyficznego miejsca w pobliżu potencjalnego miejsca RNazy E (Sahr et al., 2017). Wykazano również, że CsrA i RsmA zwiększają stabilność transkryptu STM3611 w Salmonella (Jonas i in., 2010) oraz hrpG transkrypt, główny regulator genów T3SS w Xantomonas, odpowiednio (Andrade i in., 2014).\nCsrA wykazuje również aktywności związane z transkrypcją, np. wiązanie z Luka transkrypcja operonu w języku Legionella kotranskrypcyjnie, aby przeciwdziałać terminacji transkrypcji zależnej od Rho (Sahr i wsp., 2017) oraz RNAP jako RNP z IsrA sRNA w E coli (van Nues i in., 2015). Ponadto w P. aeruginosaWykazano, że RsmA wiąże kotranskrypcyjnie ponad 500 powstających transkryptów (Gebhardt i wsp., 2020). Łącznie publikacje te wskazują, że CsrA/RsmA są głównymi regulatorami genów, które działają na powstających transkryptach. Jest zatem prawdopodobne, że aktywności antytranslacyjne, anty-RNazowe i antyterminacyjne CsrA/RsmA sprzyjają występowaniu UTT. Dalsze badanie działań kotranskrypcyjnych CsrA/RsmA powinno rzucić światło na szczegółowe zaangażowanie CsrA/RsmA w promowanie UTT.\nProQ, białko z domeną FinO, które działa jako swatka sRNA-mRNA (Smirnov et al., 2017 Westermann et al., 2019 Melamed et al., 2020), pojawiło się ostatnio jako ważne RBP, które wiąże znaczną część ten E coli oraz Salmonella transkryptomy (Smirnov et al., 2016 Holmqvist et al., 2018), sugerujące, że może on być zaangażowany w implementację UTT.\nProQ rozpoznaje cechy strukturalne obecne w sRNA i 3'-UTR mRNA i zwiększa ich stabilność po wiązaniu (Smirnov et al., 2016 Holmqvist et al., 2018 Bauriedl et al., 2020 Stein et al., 2020). W szczególności wykazano, że ProQ się stabilizuje cspE mRNA poprzez wiązanie jego 3'-UTR i zapobieganie atakowi egzorybonukleolitycznemu, w którym pośredniczy RNaza II (Holmqvist i wsp., 2018). Stabilność cspC, cspD, oraz ompD została również zmniejszona w ΔproQ (Holmqvist i wsp., 2018), ale to, czy ProQ stabilizuje te transkrypty przez ochronę antyrybonukleazową, czeka na potwierdzenie eksperymentalne. Co więcej, około jedna trzecia zdarzeń wiązania ProQ ma miejsce w miejscach nakładających się na miejsca cięcia RNazy E (Chao i wsp., 2017 Holmqvist i wsp., 2018). Łącznie, te aktywności anty-RNazy przypominają te, które wykazuje FinO, który rozpoznaje i wiąże podobną cechę strukturalną swojego jedynego docelowego antysensownego RNA FinP i wywiera ochronę anty-RNazy E (Jerome i wsp., 1999 Arthur i wsp., 2011). Co ważne, ProQ wiąże się z RNAP przez RNP utworzony z IsrA sRNA (van Nues i wsp., 2015). Jest zatem prawdopodobne, że ProQ uzyskuje dostęp do powstających transkryptów i wiąże je kotranskrypcyjnie, promując UTT poprzez ochronę nieulegających translacji transkryptów przed rozpadem rybonukleolitycznym.\nCzynniki Nus regulują wydłużenie transkrypcji, wpływając na pauzę RNAP i promując terminację/antyterminację transkrypcji (Santangelo i Artsimovitch, 2011 Sen i wsp., 2014). NusA jest niezbędnym składnikiem kompleksu antyterminacyjnego, który wraz z NusB, NusE, NusG i kilkoma białkami rybosomalnymi zwiększa szybkość transkrypcji rRNA (Squires i Zaporojets, 2000 Paul i wsp., 2004). Poza tym NusA sprzyja pauzowaniu RNAP, co sprzyja tworzeniu, stabilności i wydajności wewnętrznych terminatorów (Farnham i wsp., 1982 Schmidt i Chamberlin, 1987 Toulokhonov i wsp., 2001). Jak omówiono w rozdziale Koordynacja CTT, NusA pośredniczy również w terminacji transkrypcji przez Rho (Epshtein i wsp., 2010 Hao i wsp., 2020 Said i wsp., 2020). Jednak NusA może w niektórych przypadkach przeciwdziałać terminacji zależnej od Rho. W szczególności mutanty NusA o zwiększonym powinowactwie do wiązania wykorzystania NusA (orzech) miejsca zmniejszyły zakończenie zależne od Rho w szczególnych przypadkach, gdy orzech oraz rykowisko miejsca nakładają się (Qayyum i in., 2016). Tak więc, w odniesieniu do UTT, NusA może ułatwić niezależną od translacji transkrypcję mRNA poprzez zakłócanie pewnych zależnych od Rho zdarzeń terminacji powstających transkryptów wolnych od rybosomów.\nInne czynniki Nus są zaangażowane w mechanizmy procesywnej antyterminacji (PA). W przeciwieństwie do dedykowanych antyterminatorów, czynniki PA wiążą się z TEC i modyfikują je, aby promować odczyt transkrypcyjny nad wieloma terminatorami transkrypcji położonymi dystalnie w operonach podlegających ich regulacji (Goodson i Winkler, 2018). Na przykład LoaP paralogu NusG reguluje transkrypcję poprzez miejsca terminacji zlokalizowane w obrębie dwóch operonów biosyntezy antybiotyków w Firmicutes, Promieniowce, oraz Spirochaetes (Goodson i in., 2017). Usunięcie LoP doprowadziło do zmniejszenia poziomu transkrypcji regulonów LoaP. Uważa się, że LoaP procesowo antyterminuje terminatory wewnętrzne, aktywność, która wymaga sekwencji liderowej 5' transkryptów pod jego regulacją (Goodson i wsp., 2017). Podsumowując, aktywność PA takich paralogów Nus na ich określonych operonach docelowych może sprzyjać UTT poprzez łagodzenie potrzeby translacyjnie sprzężonego rybosomu do przeciwdziałania terminatorom wewnętrznym i zależnym od Rho.\nCis-działające elementy RNA\nRyboprzełączniki to elementy regulatorowe zlokalizowane w 5'-UTR mRNA, które składają się z dwóch modułów: strukturalnie złożonego aptameru wiążącego ligand oraz platformy ekspresyjnej regulowanej przez strukturalne fałdowanie aptameru. Wiązanie liganda powoduje strukturalne ponowne fałdowanie aptameru, co wpływa na ekspresję dalszej platformy ekspresyjnej w sposób ON/OFF (Sherwood i Henkin, 2016). Niektóre ryboprzełączniki działają poprzez translacyjne tłumienie ORF zgodnie z ich regulacjami (Breaker, 2018). Na przykład w ryboprzełącznikach kobalaminy sekwencja SD jest sekwestrowana w strukturze aptameru (Johnson et al., 2012), która staje się dostępna dla rybosomów dopiero po związaniu liganda. Z drugiej strony, w ryboprzełącznikach pirofosforanu tiaminy sekwencja anty-SD w obrębie struktury aptameru przyłącza się i fałduje względem sekwencji SD zlokalizowanej na platformie ekspresyjnej i hamuje inicjację translacji (Winkler i wsp., 2002). Ponownie, wiązanie ligandu powoduje ponowne fałdowanie aptameru i uwalnia sekwencję SD do wiązania rybosomu. Podobnie jak ryboprzełączniki, termometry RNA są elementami 5'-UTR, które podlegają ponownemu fałdowaniu strukturalnemu i wpływają na ekspresję genów w dół, ale ich ponowne fałdowanie jest spowodowane raczej zmianami temperatury niż wiązaniem ligandu (Kortmann i Narberhaus, 2012). Na przykład transkrypcja wywołanego zimnem cspA gen zachodzi we wszystkich temperaturach, ale cspA transkrypt jest wysoce niestabilny w 37°C z powodu rozpadu za pośrednictwem RNazy E (Fang i wsp., 1997). Po zimnym szoku cspA transkrypt ulega znacznemu ponownemu fałdowaniu i jest stabilizowany w fałdowaniu bardziej odpornym na RNazy, co umożliwia translację białka (Giuliodori et al., 2010). Wręcz przeciwnie, tłumaczenie rpoH transkrypt, kodujący czynnik sigma szoku cieplnego, jest represjonowany w temperaturach fizjologicznych przez strukturę drugorzędową, która sekwestruje sekwencję SD. Po przesunięciu temperatury w górę, struktura ta ponownie fałduje się w sposób, który eksponuje sekwencję SD na inicjację translacji (Morita i wsp., 1999). Podobnie, kilka czynników wirulencji jest regulowanych przez termometry RNA, które umożliwiają translację w temperaturze 37°C po wejściu do stałocieplnych ssaczych gospodarzy (Johansson, 2009). Co ważne, struktury ryboprzełączników są sfałdowane kotranskrypcyjnie (Mironov et al., 2002 Frieda i Block, 2012 Watters et al., 2016 Uhm et al., 2017 Ray et al., 2019a). Biorąc pod uwagę, że RNAP zatrzymuje się na sekwencjach SD i kodonach start (Larson et al., 2014), prawdopodobne jest, że regulacja ryboprzełączników zacznie działać wkrótce po ich wyjściu z RNAP i przed inicjacją translacji. Dlatego uzasadnione jest twierdzenie, że ryboprzełączniki i termometry RNA mogą kotranskrypcyjnie blokować translację i chronić transkrypty przed atakiem rybonukleolitycznym, który promowałby UTT. Takie obojętne transkrypty byłyby aktywowane po zmianach środowiskowych, które indukują ich translację.\nPodobnie, cis-działające elementy RNA działają jako represory translacyjne systemów toksyna-antytoksyna typu I (TA) (Masachis i Darfeuille, 2018). W wielu systemach TA typu I pierwotny transkrypt toksyny jest obojętny pod względem translacji i jest to osiągane przez sekwestrację sekwencji SD w drugorzędowej strukturze utworzonej z sekwencją anty-SD zlokalizowaną powyżej transkryptu (Gultyaev i in., 1997 Darfeuille i in. , 2007 Shokeen i in., 2008 Kristiansen i in., 2016 Wen i in., 2017). W innych przypadkach translacja toksyny jest hamowana przez struktury utworzone przez oddziaływania między końcami 5' i 3' mRNA o pełnej długości (Thisted i wsp., 1995 Franch i Gerdes, 1996 Gultyaev i wsp., 1997 ). Uważa się również, że wysoka strukturalna złożoność mRNA toksyny zapobiega interakcji powstającego transkryptu toksyny z matrycowym DNA, co zapobiega tworzeniu się szkodliwych pętli R i nadaje zwiększoną odporność na antyrybonukleazy (Masachis i Darfeuille, 2018). Zatem cechy strukturalne toksyn mRNA zapewniają ich transkrypcję obojętną transkrypcję i ochronę przed RNazami do czasu, aż późniejsze zdarzenia aktywacji wywołają transkrypcję potranskrypcyjną tych transkryptów.\nTrochę cis-działające elementy RNA mogą ułatwić UTT w bardziej pośredni sposób. Na przykład, hamujące aptamery RNA (iRAP) oddziałują z RNAP i ułatwiają terminację zależną od Rho (Sedlyarova i wsp., 2017). Co ciekawe, wiele iRAP mapuje się na nić antysensowną i ogranicza transkrypcję antysensowną, co zmniejsza zakłócenia transkrypcji i sprzyja transkrypcji sensownej (Sedlyarova i wsp., 2017 Magán i wsp., 2019). Biorąc pod uwagę, że TEC niezależne od translacji rzadziej inicjują transkrypcję po zderzeniu z antysensownym TEC (Hoffmann i wsp., 2019), zmniejszenie transkrypcji antysensownej przez antysensowne iRAP może złagodzić wymóg wiodącego rybosomu, który wspiera transkrypcję sensowną TEC.\nInne cis-działające elementy RNA nie tylko mają potencjał do atenuacji CTT, ale także wymuszają jego rozerwanie. Na przykład Salmonella zjadliwość mgtCBR operon posiada region lidera, który działa jako element RNA antagonizujący Rho (RHO) i a rykowisko miejsce niezbędne do terminacji transkrypcji tego operonu za pośrednictwem Rho (Sevostyanova i Groisman, 2015). RARE przeciwdziała terminacji poprzez uwięzienie Rho w konformacji pozbawionej terminacji. Co ważne, tłumaczenie mgtCBR transkrypt sekwestruje RARE w pętli macierzystej (Sevostyanova i Groisman, 2015). Tak więc jedynym sposobem ekspresji tego operonu jest UTT, w taki sposób, że RARE hamuje terminację za pośrednictwem Rho i umożliwia transkrypcję niesprzężoną z translacją pełnego mRNA, który byłby poddany translacji potranskrypcyjnej. ten korA operon Salmonella podlega bardzo podobnej regulacji, a jego region liderowy jest wysoce konserwatywny u enterobakterii (Kriner i Groisman, 2015), więc taka ściśle zależna od UTT ekspresja genów może być stosunkowo rozpowszechniona u tych gatunków. Wreszcie, poza elementami, które działają przeciwko poszczególnym miejscom terminacji , inny cis-działające sekwencje RNA są zaangażowane w PA (patrz wyżej Goodson i Winkler, 2018). Na przykład w B. subtilis ten EPS operon, kodujący białka biosyntezy egzopolisacharydów, jest regulowany przez EPS-skojarzona sekwencja RNA (EAR), zlokalizowana w regionie międzygenowym między drugim a trzecim genem operonu (Irnov i Winkler, 2010). Sekwencja EAR jest niezbędna do transkrypcji całego operonu, ponieważ antyterminuje kilka wewnętrznych terminatorów zlokalizowanych w dystalnych miejscach operonu. Sekwencja EAR jest również zdolna do antyterminacji terminatorów heterologicznych, potwierdzając hipotezę, że działa jako PA (Irnov i Winkler, 2010). Taki cis-działające elementy RNA z aktywnościami PA mogłyby promować UTT w operonach, które regulują, ponieważ łagodziłyby konieczność kotranskrypcji sprzężonego rybosomu w celu przeciwdziałania terminatorom.\nTrans-działające elementy RNA\nsRNA są archetypowym przykładem trans-działające RNA w regulacji genów bakterii. Są to zazwyczaj transkrypty o długości 50� nt, które określają los transkryptu przez niedoskonałe parowanie zasad z docelowymi mRNA (Wagner i Romby, 2015). Proces ten jest często ułatwiany przez kojarzące mRNA-sRNA Hfq (Updegrove i wsp., 2016) i ProQ (Holmqvist i wsp., 2020). Niedawno zgłoszono aktywność kojarzeń w przypadku CsrA (Müller i in., 2019). sRNA mogą wpływać pozytywnie lub negatywnie na stabilność i/lub translację docelowych mRNA, a te aktywności mogą potencjalnie promować UTT.\nw Salmonella, reagujący na glukozę sRNA SgrS stabilizuje pdlB-yigL transkrypt bicistronowy poprzez zapobieganie cięciu za pośrednictwem RNazy E (Papenfort et al., 2013). Podobnie pary zasad RydC sRNA z 5'-UTR cfa mRNA i stabilizuje dłuższą izoformę tego transkryptu poprzez przeciwdziałanie atakowi RNazy E (Fröhlich et al., 2013). w B. subtilis, sRNA RoxS wiąże 5'-koniec yflS mRNA i zapobiega rozpadowi egzorybonukleolitycznemu przez RNazę J1 (Durand i wsp., 2017). Oprócz ochrony anty-RNaz, B. subtilis sRNA SR1 blokuje translację wiązania w 5'-UTR swojego celu ahrC mRNA i blokuje jego translację (Heidrich i wsp., 2006, 2007). Podobnie, w Legionella pneumophilaoperon kompetencji jest translacyjny represjonowany przez sRNA RocR (Attaiech et al., 2016). sRNA mogą dalej promować represję translacyjną poprzez rekrutację Hfq do miejsc wiążących, które zapobiegają asocjacji rybosomów z sekwencjami SD ich docelowych mRNA (Desnoyers i Massé, 2012 Azam i Vanderpool, 2018).\nPonieważ sRNA są stosunkowo krótkie i nie podlegają translacji przez rybosomy, mogą przenikać przez siatkę nukleoidów (Sheng et al., 2017) i przypuszczalnie angażować się w procesy kotranskrypcyjne. Rzeczywiście, niedawno odkryto, że sRNA DsrA, ArcZ i RprA, chociaż indukowane przez różne stresy, wiążą 5'-UTR powstającego rpoS transkrypty tłumiące terminację zależną od Rho i umożliwiające ekspresję czynnika sigma fazy stacjonarnej (Sedlyarova et al., 2016). Ekspresja samego Rho podlega podobnej regulacji, jak pary zasad sRNA SraL z 5'-UTR rho transkrypt w celu antyterminacji jego transkrypcji (Silva i wsp., 2019). Zatem sRNA mogą promować UTT poprzez przeciwdziałanie wszechobecnej antyterminacji transkrypcji za pośrednictwem Rho mRNA wolnych od rybosomów. Kotranskrypcyjne powiązanie sRNA z mRNA sugeruje również, że mogą one wywierać antytranslacyjną i antyrybonukleolityczną regulację na powstających transkryptach, ułatwiając występowanie UTT.\nCo ciekawe, E coli sRNA IsrA wiąże się z RNAP i tworzy RNP wraz z ważnymi białkami determinującymi los transkrypcji Hfq, S1, CsrA, ProQ i PNPazą (van Nues et al., 2015). Powiązanie tych RNP z RNAP i odpowiadającymi im wyjściami regulatorowymi czeka na dalszą charakterystykę.Jednak oprócz bezpośredniego działania jako czynniki indukujące UTT, sRNA mogą promować UTT, służąc jako platformy lądowania i integracji, aby umożliwić kotranskrypcyjne działanie białek o funkcjach antytranslacyjnych, anty-RNazowych i antyterminacyjnych.\nBakteryjne ciała RNP\nKondensaty biomolekularne powstające w wyniku wielowartościowych oddziaływań między białkami i kwasami nukleinowymi zyskały ostatnio szczególne zainteresowanie. Kondensaty te gromadzą się i rozpuszczają zgodnie z zasadami LLPS i biorą udział w ważnych funkcjach komórkowych, w tym metabolizmie RNA (Banani i wsp., 2017). Na przykład, wykazano, że ciała przetwarzające (ciała P) i granulki naprężeń sekwestrują słabo przetłumaczone transkrypty w celu rozpadu lub przechowywania w organizmach eukariotycznych (Decker i Parker, 2012 Khong i Parker, 2020).\nKondensaty biomolekularne wykazują selektywną przepuszczalność i koncentrują biomolekuły i procesy w odrębnych regionach subkomórkowych (Banani et al., 2017). W związku z tym są atrakcyjnymi narzędziami dla prokariontów, aby uzyskać złożoność przestrzenną w swoich cytoplazmach, które są na ogół pozbawione organelli związanych z błoną. Rzeczywiście, niedawno doniesiono o istnieniu bakteryjnych ciał RNP (ciała BR) w bakteriach (Al-Husini i wsp., 2018 Muthunayake i wsp., 2020). w C. crescentus, RNaza E łączy się w ciała BR wraz ze składnikami degradosomów i RNA o słabej translacji, tworząc kondensaty podobne do ciała P zaangażowane w degradację RNA (Al-Husini i wsp., 2018, 2020). Te kondensaty RNazy E wiążą się z C. crescentus nukleoid w pobliżu loci rDNA (Bayas et al., 2018). Co ciekawe, E coli RNaza E, która w przeciwieństwie do in C. crescentus lokalizuje się na błonie wewnętrznej wraz z innymi składnikami degradosomów, tworzy klastry, które wykazują składanie i dynamikę zależną od RNA (Strahl et al., 2015), przypominające C. crescentus BR-ciała, co sugeruje, że E coli degradosomy mogą tworzyć kondensaty przez LLPS w błonie wewnętrznej. Uważa się, że atak endorybonukleolityczny przez RNazę E jest początkowym i ograniczającym tempo etapem degradacji RNA, więc uzasadnione jest twierdzenie, że bliskość tych kondensatów RNazy E może zwiększać prawdopodobieństwo rozpadu transkryptu. W zgodzie z tym, E coli Transkrypty lokalizujące błony wykazują niższą średnią stabilność, a sztuczne kierowanie cytoplazmatycznych mRNA do błony zwiększa szybkość ich degradacji (Moffitt et al., 2016). Dodatkowo, odłączenie RNazy E od sensybilizowanych przez błonę transkryptów cytoplazmatycznych wolnych od rybosomów (Hadjeras i wsp., 2019). Podsumowując, dowody te wskazują, że aktywność RNazy jest silnie zlokalizowana w komórkach bakteryjnych za pośrednictwem ciał BR, a regiony odległe od kondensatów rozkładających RNA mogą nie być poddawane intensywnemu ciśnieniu rybonukleolitycznemu. To z pewnością wspierałoby UTT, zwłaszcza w tych organizmach, w których rdzeń maszynerii rybonukleolitycznej znajduje się w błonie, ponieważ powstające transkrypty wolne od rybosomów nie byłyby osiągalne dla degradosomów, a zatem nie byłaby wymagana znaczna ochrona antyrybonukleolityczna.\nPonadto cytoplazma bakteryjna wykazuje właściwości szkliste, a jej płynność zmienia się w zależności od stanu fizjologicznego komórki, gdzie wyższa aktywność metaboliczna koreluje z większą płynnością cytoplazmy i odwrotnie (Parry et al., 2014). Te właściwości biofizyczne mogą wpływać na funkcję kondensatów biomolekularnych, tj. bardziej płynne, podobne do cieczy kondensaty umożliwiają większy ruch i aktywność enzymatyczną, podczas gdy bardziej stałe, podobne do agregatów jednostki specjalizują się w przechowywaniu (Banani i in., 2017). Bakterie ulegają znacznemu spowolnieniu metabolicznemu po wejściu w fazę stacjonarną lub stres. Prowadzi to do zeszklenia cytoplazmy (Parry i wsp., 2014), co może przekształcić ciała BR w kondensaty magazynujące RNA, a nie ciała przetwarzające RNA (Muthunayake i wsp., 2020). Takie ciała BR przechowujące RNA mogą dodatkowo wspierać UTT poprzez gromadzenie i ochronę niepodlegających translacji transkryptów, dopóki sprzyjające warunki nie pozwolą na ponowne zainicjowanie translacji.\nArkusz transkrypcji i tłumaczenia Klucz odpowiedzi: A C C C C T C T.\nRodzaje wiązań chemicznych w arkuszach roboczych Klucz odpowiedzi. Ćwiczenie 2 KLUCZ – Arkusz transkrypcji i tłumaczenia …\nMożesz podzielić się swoją opinią z nami i naszymi czytelnikami w polu komentarzy w ostatniej części strony, możesz to powiedzieć. Karta pracy z transkrypcją i tłumaczeniem Klucz odpowiedzi\nCo oznaczają poniższe terminy? Arkusz odpowiedzi na temat DNA Rna i syntezy białek | Dzieci …\nJeśli chodzi o transkrypcję i tłumaczenie, czasami cały proces może wydawać się kłopotliwy. Karta pracy z transkrypcją i tłumaczeniem Klucz odpowiedzi\nArkusz transkrypcji i tłumaczenia DNA Ćwiczenie DNA z arkusza transkrypcji i tłumaczenia Klucz odpowiedzi , źródło: hasshe.com wszystko, co musisz zrobić po przybyciu na ich stronę, która jest najważniejsza, to wybrać jeden z kilku szablonów, które podają, lub zacząć od nowa. Ćwiczenie 2 KLUCZ – Arkusz transkrypcji i tłumaczenia …\nOdpowiedzi na ćwiczenia z transkrypcji i tłumaczenia. 16 najlepszych obrazów 13 1 RNA Arkusz odpowiedzi Klucz – Rozdział …\nJeśli poświęcisz kilka minut na skontaktowanie się z klientami, przekonasz się, że chętniej wracają, aby wykonać z Tobą więcej pracy, co w efekcie daje lepsze wyniki. Arkusz kolorowania wyjaśniający transkrypcję i …\nOdpowiedzi na ćwiczenia z transkrypcji i tłumaczenia. Klucz identyfikacyjny diagramu mitozy | Mychaume.com\nMamy marzenie o tym arkuszu tłumaczenia transkrypcji Klucz odpowiedzi Galeria zdjęć może być dla Ciebie wskazówką, dostarczyć więcej pomysłów i najważniejsze: Arkusz transkrypcji i tłumaczenia Klucz odpowiedzi\nT g t transkrypcja mrna: Best of Biology Corner Kolorowanie DNA Transkrypcja i …\nCo oznaczają poniższe terminy? transkrypcja-i-tłumaczenie-arkusz-odpowiedzi-klucz-biologia …\nJeśli poświęcisz kilka minut na skontaktowanie się z klientami, przekonasz się, że chętniej wracają, aby wykonać z Tobą więcej pracy, co w efekcie daje lepsze wyniki. Arkusz ćwiczeń transkrypcji i tłumaczenia Odpowiedź …\nObejrzyj wideo: Wywiad z Biurem Tłumaczeń ArcusLink (Styczeń 2022).\nCopyright 2022 \_ Transkrypcja i tłumaczenie operonów prokariotycznych...


Dzięki nowoczesnym technologiom stosowanym w piłce nożnej dziś praktycznie każdy kibic ma dostęp do ogromnej ilości statystyk. Dotyczą one nie tylko gry całej drużyny, ale także pojedynczych zawodników.\nTe cenne informacje można wykorzystać od teraz w najnowszej propozycji od Betfan, czyli Player BETS.\nStatystki indywidualne są dzisiaj niezwykle istotne i dopełniają one wskaźniki drużynowe, stanowiąc dla wielu graczy kompletną podstawę do analizy i typowania zakładów bukmacherskich. Doskonale pokazuje to przykład Roberta Lewandowskiego i Bayernu. Inna będzie ocena gry drużyny, a zupełnie inna polskiego supersnajpera, prawda?\nWiesz, że strzeli dwa gole? A może częściej asystuje?\nU legalnych bukmacherów dużą popularnością cieszą się zakłady na strzelca gola, ilość bramek w meczu itd. Betfan wprowadził unikalną ofertę, pozwalającą obstawiać indywidualne występy zawodników podczas meczów – liczba strzelonych goli, wykonanych asyst czy podań. Player BETS to ponad 300 zakładów na spotkania takich rozgrywek, jak: Premier League, La Liga, Serie A czy Bundesliga, a także Liga Mistrzów.\nBetfan i jego nowości\nPrzedstawiciele Betfan zapowiadają, że w ciągu 3-4 lat legalny bukmacher ma znaleźć się w gronie pięciu największych firm na polskim rynku. Widać, że śmiało kroczy w tym kierunku, co chwilę wprowadzając do swojej oferty zakładów ciekawe propozycje.\nZaczyna się już od Pakietu Pudziana, czyli bonusu powitalnego dla nowych graczy. Dzięki niemu można zyskać nawet 3000 zł, a po wpisaniu specjalnego kodu promocyjnego także zakład bez ryzyka o wartości 100 zł!\nBetfan jako pierwszy bukmacher w Polsce wprowadził niedawno do swojej oferty Playtech Virtual Sports, czyli ultrarealistyczne gry wirtualne w najpopularniejszych dyscyplinach sportowych, jak piłka nożna, koszykówka, czy tenis. Uznanie wśród graczy zdobywają również zakłady na rozrywkę dostępne w Betfan.\nWidać, że Betfan robi naprawdę dużo, by przyciągnąć nowych klientów. Player BETS wydają się być kolejną ciekawą propozycją tego bukmachera. Dzisiaj kibice dużo wiedzą o swoich ulubionych piłkarzach, a taka oferta pozwala tę często bogatą wiedzę wykorzystać.\nA jakie jest Twoje zdanie na temat Player BETS? Będziesz stawiał zakłady na dokonania pojedynczych zawodników czy wolisz tradycyjne zakłady na osiągnięcia drużynowe?\nUtworzono dnia 10.12.2019 , ostatnia aktualizacja dnia 19.06.2020 , autor Portal Bukmacherski Spryciarz.


Reporter Poland agencja fotograficzna - Spektakl ''Orlando Bloombsbury '' w Starym Teatrze w Krakowie, strona 1\nSpektakl ''Orlando Bloombsbury '' w Starym... (16)\n21.06.2022 Krakow Narodowy Stary Teatr im. Heleny Modrzejewskiej . Proba spektaklu " Orlando Bloomsbury " w rez. Katarzyny Minkowskiej N/z Paulina Kondrak fot. Beata Zawrzel/REPORTER\n21.06.2022 Krakow Narodowy Stary Teatr im. Heleny Modrzejewskiej . Proba spektaklu " Orlando Bloomsbury " w rez. Katarzyny Minkowskiej N/z Paulina Kondrak , Radoslaw Krzyzowski fot. Beata Zawrzel/REPORTER\n21.06.2022 Krakow Narodowy Stary Teatr im. Heleny Modrzejewskiej . Proba spektaklu " Orlando Bloomsbury " w rez. Katarzyny Minkowskiej N/z Radoslaw Krzyzowski fot. Beata Zawrzel/REPORTER\n21.06.2022 Krakow Narodowy Stary Teatr im. Heleny Modrzejewskiej . Proba spektaklu " Orlando Bloomsbury " w rez. Katarzyny Minkowskiej fot. Beata Zawrzel/REPORTER


Apartament na pięknym osiedlu La Recoleta, Punta Prima IBERMAXX ®\n169.000 EURO Apartament na pięknym osiedlu La Recoleta, Punta Prima\nNumer ref.: IBSE2099\nApartament o orientacji południowej, położony na 2 piętrze w budynku z windą na pięknym osiedlu La Recoleta na Punta Prima. Składa się z 2 sypialni, łazienki, otwartej kuchni, przestronnego salonu/jadalni oraz dużego tarasu o powierzchni 14m2. Do nieruchomości przynależy miejsce parkingowe oraz pomieszczenie gospodarcze w garażu podziemnym. Na osiedlu znajdują się 3 baseny wspólne dla wszystkich mieszkańców.\npodatek katastralny – 294 euro/rok\nczynsz – 80 euro/miesiąc\nApartament na Punta Prima, Torrevieja\nApartament z widokiem na morze w Torrevieja-Punta Prima\nDolar amerykański 1.1075 187 167,50 USD\nFunt szterling 0.8420 142 298,00 GBP\nZłotówka polska 4.2837 723 945,30 PLN\nFrank szwajcarski 1.0959 185 207,10 CHF\nKorona norweska 10.1238 1 710 922,20 NOK\nRubel rosyjski 70.5731 11 926 853,90 RUB\npolecamy Apartament na parterze z 1 sypialnią w La Mata/Torrevieja.


Olej rybny, aby zwiększyć biust - Jak nosić sukienkę jeśli małe piersi\nOlejek powiększający biust - Gotowy zestaw do własnoręcznego sporządzenia Mam małe piersi, dziewczyna\nNie mam klatki piersiowej t wzrost Jak zwiększyć swoje piersi z ćwiczeń, Netto jodu do powiększania piersi Jeśli małe piersi myślą o tym człowieku. 100 wzrost biustu powiększenie piersi masaż, Koszt powiększania piersi w Charkowie ile jest operacja na powiększenie piersi.\nPaulina Krupińska zdradza naturalną receptę na... powiększenie biustu! Bandeau strój kąpielowy małe piersi\nJak zwiększyć samej piersi jeśli człowiek wzrosła piersi, daje małą pokarmu powiększenie piersi, jak życie się zmieniło. Skrzynia małe ziarna, ale najlepszy chirurg w Ukrainie na plastiku piersiowej, kosztować powiększania piersi Lipetsk z której możemy zwiększyć piersi.\nJak powiększyć biust ? Tani sposób na duże piersi. silikonowe piersi po śmierci olej rybny, aby zwiększyć biust\nZwiększenie piersi odpowiada na pytania książka powiększania piersi, biustonosze na małe piersi Milavitsa Recepta powiększenie piersi. Porno małe cycki niskiego wzrostu silikonowe piersi czuje, silikonowe piersi porno online za darmo Co jeść, aby zwiększyć swoje piersi.\n10 TRIKÓW NA OPTYCZNIE WIĘKSZY BIUST - SANVLOG jak zwiększyć piersi ylang-ylang\nTop 10 gwiazd z małymi piersiami Metody instalowania plusy i minusy implantów piersi, ceny powiększania piersi w Rostowie małe piersi z sutkami zgrabnych. Bluzki małe piersi nietypowe sposoby na powiększenie piersi, powiększenie piersi wynik operacji szyszki chmielowe może zwiększyć piersi.\nPowiększenie i ujędrnienie biustu - domowe sposoby 💪BIC&CYC❤ powiększenie piersi wizualny olej rybny, aby zwiększyć biust\nWoronin nie wiara wzrosła piersi Krem piersi, co jest lepsze, korzeń prawoślazu do powiększania piersi chmiel zwiększyć biust przepis. 300 ml powiększenie piersi pierś po nieudanej tworzyw sztucznych, powiększania piersi działanie Ukraina Czy możliwe jest powiększenie piersi bez operacji.\nJak trenować by powiększyć biust łatwy krzywe symulator do powiększania piersi\nKiedy implant będzie się układać w klatce piersiowej Kati moje małe piersi, mężczyźni lubią małe piersi jak zwiększyć piersi jeść kapustę. Dziewczyny z małymi piersiami w VC ile operacja powiększania piersi Moskwa, Jestem 16 i mam małe piersi mąż przeciw powiększaniu piersi.\nĆwiczenia na jędrny biust jak dbać o blizny po powiększaniu piersi\nPierś po operacji uszczelniania plastyczne biustu twarz, małe dziecko bierze piersi Tajemnice powiększania piersi. Gołe czarne z małymi piersiami Magia zwiększyć biust, Krem na powiększenie piersi kupić inthenso Krem piersi kupić Evelyn.\nKawa zmniejsza piersi Nasiona kopru do powiększania piersi olej rybny, aby zwiększyć biust\nBardzo małe cycki włochate bluzka dla małej klatce piersiowej, powiększania piersi 1 2 rozmiary hipnoza powiększenie piersi. Sutek ból wzrost jednej piersi małe piersi jak pieszczota, stanik dla małych piersi Forum o kremów do powiększania piersi.\nJAK PODKREŚLAĆ DUŻY BIUST? CO NOSIĆ, A CZEGO UNIKAĆ? wstawić implanty piersi, czy nie\nMałe piersi jałówki co zrobić, jeśli małej klatce piersiowej, zazwyczaj małe piersi stokrotka powiększyć piersi. Zwiększyć trochę pierś Forum kremy powiększenie piersi, Operacja powiększania piersi w Ufie powiększania piersi Nicole Kidman.\n7 DNI DLA PIĘKNYCH PIERSI - PODEJMIJ WYZWANIE! szyszki chmielowe zwiększa opinie piersi\nMasaże, aby zwiększyć biust Koszt chirurgia piersi, Czy rozszerzenie masaż piersi Alijew plastikowa klatka piersiowa. Powiększenie piersi implantami okrągłymi 275 dlaczego moje małe piersi, małe piersi pieścił Dziewczyny mała pierś z góry.\nSkutki silikonowych piersi


Rocznice literackie w lutym | Gmina Kamionka\nJesteś na: Kultura › Biblioteka › Rocznice literackie w lutym\nRocznice literackie w lutym\nLUTY - rocznice literackie\n02.02.1919 urodził się ZBIGNIEW LENGREN, grafik, ilustrator, rysownik, karykaturzysta, twórca plakatów i scenografii oraz ilustracji do wielu książek dla dzieci i młodzieży. 95 rocznica urodzin\n03.02.1874 urodziła się GERTRUDA STEIN, pisarka amerykańska. 140 rocznica urodzin\n07.02.1909 urodziła się ANNA ŚWIRSZCZYŃSKA, poetka, prozaik, dramatopisarka, autorka książek dla dzieci i młodzieży głównie o tematyce historycznej i legendarnej. 105 rocznica urodzin, 30 rocznica śmierci (zm. 30 IX 1984 r.)\n13.02.1769 urodził się IWAN ANDRIEJEWICZ KRYŁOW, poeta, bajkopisarz, dramaturg i publicysta rosyjski, autor ponad 200 bajek o tematyce obyczajowej i historycznej, wzorowanych częściowo na bajkach Ezopa. 245 rocznica urodzin, 170 rocznica śmierci (zm. 21.XI.1844 r.)\n14.02.1909 urodziła się ANNA MILSKA, prozaik, publicystka, tłumaczka, autorka licznych adaptacji baśni H.Ch. Andersena oraz baśni i legend różnych narodów świata. 105 rocznica urodzin\n16.02.1919 urodziła się NATALIA ROLLECZEK, prozaik, dramatopisarka, powieści satyryczno-obyczajowych dla dziewcząt. 95 rocznica urodzin\n20.02.1894 urodził się JAROSŁAW IWASZKIEWICZ, poeta, prozaik, tłumacz, autor sztuk teatralnych, scenicznych, krytyk muzyczny. 120 rocznica urodzin\n23.02.1899 urodził się ERICH KÄSTNER, pseud. Robert Neuer i in., poeta i prozaik niemiecki, satyryk, scenarzysta, krytyk teatralny, autor popularnych książek dla dzieci zaliczanych do światowego kanonu literatury dziecięcej.115 rocznica urodzin, 40 rocznica śmierci (zm. 27 VII 1974 r.)


Depilacja w Krakowie | Zadbaj o siebie | Depilacja Kraków\nHome Depilacja w Krakowie\nDepilacja woskiem najlepsza jest w Krakowie. Kraków nie tylko przyciąga ludzi młodych, wręcz zapewnia im odpowiednie warunki do edukacji czy w aspekcie swoistej przedsiębiorczości, co zresztą potrafią oni doskonale wykorzystać. Przecież po skończonym kursie można na przykład założyć salon depilacji.\nW ostatnich latach mówiło się o kryzysie gospodarczym jaki zapanował w całym kraju, Kraków jako jedne z nielicznych miast dosyć szybko uporał się z nim można iść o krok dalej i powiedzieć, że takowego tutaj nigdy nie było.\nObawiasz się, iż w Krakowie nie ma już miejsca na stworzenie firmy czy perspektyw na to, by jej egzystencja jak i funkcjonowanie miało jak najbardziej uzasadniony sens? Bez przesady, jeśli masz konkretny zawód, jak na przykład depilacja, to nie będziesz miał się o co martwić. Zatem wiedz, iż takie podejście jest błędne jak wspomniano powyżej to miasto o stabilnej sytuacji gospodarczej, w ostatnich latach powstało wiele nowych firm jak i setki miejsc pracy, stawia się również na edukację poprzez wdrażanie nowych kierunków kształcenia.\nUczelnie w Krakowie do tego się przystosowują i na przykład uczą kierunków praktycznych i przyszłościowych, jak kosmetologia i depilacja. Dzięki czemu nie brakuje na lokalnym rynku fachowców czy też specjalistów, jacy niejednokrotnie wiążą się z samym Krakowem na stałe. Jest to jeden z wielu argumentów dla których warto to miasto odwiedzić, a niekiedy także powiązać z nim swoją przyszłość, stworzone zostały również idealne warunki dla przedsiębiorców. Bez względu na rozmiar naszej firmy czy działalności jaką prowadzimy, wszyscy są tutaj traktowani w odpowiedni do tego sposób, rozumie się na czym polega potencjał gospodarczy.


CH Carrefour Łódź Bałuty | Oferty, sklepy i godziny otwarcia\nCH Carrefour Łódź Bałuty w Łodzi - Oferty, promocje i sklepy\nNiestety, nie znaleźliśmy żadnych ofert dla «CH Carrefour Łódź Bałuty».\nCentrum handlowe CH Carrefour Łódź Bałuty\nCH Carrefour Łódź Bałuty znajduje się przy ulicy Szparagowej, niedaleko trasy wylotowej z miasta. Do centrum handlowego dojeżdża bezpłatny autobus, którego rozkład jazdy sprawdzić można online. Klienci preferujący dojazd samochodem, skorzystać mogą z parkingu przed budynkiem.\nSklepy w CH Carrefour Łódź Bałuty\nCH Carrefour Łódź Bałuty\nOferta CH Carrefour Łódź Bałuty to przede wszystkim świetnie zaopatrzony hipermarket Carrefour, gdzie codziennie kupić można świeże artykuły spożywcze, sprzęt gospodarstwa domowego i wiele innych produktów, które spełnią oczekiwania nawet najbardziej wymagających klientów. Znajdują się tutaj także: kwiaciarnia, apteka, pralnia i szewc.\nPrzyjemna atmosfera, atrakcyjna oferta i dostępne w CH Carrefour Łódź Bałuty promocje sprawiają, że klienci chętnie robią tutaj zakupy i spędzają czas. Godziny otwarcia sklepów dostosowane są do trybu życia mieszkańców.\nInformacje o ciekawych ofertach w Carrefour Łódź Bałuty znaleźć można w gazetkach promocyjnych.\nCH Carrefour Łódź Bałuty online\nChcesz otrzymywać informacje o promocjach sklepów CH Carrefour Łódź Bałuty mailem?\nCH Carrefour Łódź Bałuty - Łódź