Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin… (Translated to French) | JoVE Video\n* These authors contributed equally Related JoVE Videos\tSalut-C: une méthode d'étude de'architecture tridimensionnelle des génomes.…\nUne stratégie pour identifier des mutations denovo dans les troubles courants comme l'autisme et la schizophrénie…\nCite this Article: Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement\nAbstract: Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement\nLes génomes sont organisés en structures tridimensionnelles, l'adoption d'un ordre supérieur conformations à l'intérieur des espaces de taille micronique nucléaires 7, 2, 12. De telles architectures ne sont pas aléatoires et font intervenir des interactions entre les promoteurs des gènes et des éléments régulateurs 13. La liaison des facteurs de transcription à des séquences régulatrices spécifiques provoque un réseau de régulation de la transcription et la coordination 1, 14. Analyse de l'interaction de la chromatine par Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) a été développé pour identifier ces structures chromatiniennes d'ordre supérieur 5,6. Les cellules sont fixées et en interaction locus sont capturés par covalentes ADN-protéine liaisons transversales. Pour minimiser la non-spécifique du bruit et de réduire la complexité, ainsi que d'augmenter la spécificité de l'analyse de l'interaction de la chromatine, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est utilisé contre les facteurs protéiques spécifiques pour enrichir des fragments de chromatine d'intérêt avant la ligature de proximité. La ligature impliquant demi-linkers fait suite liaisons covalentes entre des paires de fragments d'ADN attachés ensemble au sein de complexes chromatiniens individuels. Les sites d'accompagnement MmeI enzymes de restriction dans les linkers demi-permettre l'extraction de paires de balise de fin-linker-tag constructions (PET) sur la digestion MmeI. Comme les linkers sont des demi-biotinylé, ces constructions en PET sont purifiés en utilisant la streptavidine-billes magnétiques. Les PET purifiés sont ligués avec des adaptateurs de séquençage de nouvelle génération et un catalogue des fragments d'interaction est généré par l'intermédiaire de la prochaine génération des séquenceurs tels que l'analyseur de Génome Illumina. Cartographie et analyse bioinformatique est ensuite réalisée afin d'identifier ChIP-enrichi sites de liaison et de ChIP-enrichis interactions chromatine 8. Nous avons produit une vidéo pour démontrer les aspects critiques du protocole de Chia-PET, en particulier la préparation de la puce comme la qualité de ChIP joue un rôle majeur dans l'issue d'une bibliothèque Chia-PET. Comme les protocoles sonttrès longtemps, seules les étapes critiques sont montrées dans la vidéo. Protocol: Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement\nA. immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) (voir Figure 1) 1. Réticulation double de la chromatine protéines liées et récolte des cellules (À 02:10 de la vidéo) Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est la première étape critique impliqué dans la construction d'une bibliothèque Chia-PET. Cette étape est importante pour réduire le niveau de bruit de fond de la complexité, et d'ajouter une spécificité. La préparation de ChIP devra être optimisé pour le type de cellule et le facteur d'intérêt. Ce protocole est basé sur l'ARN polymérase II Chia-PET bibliothèque préparée à partir de cellules MCF-7 9 construits dans notre laboratoire. Pour veiller à ce que la bibliothèque qui en résulte est d'une complexité suffisante, nous vous recommandons d'utiliser 1 x 10 8 cellules pour préparer le matériel ChIP. En fonction de la ligne de cible et la cellule, le rendement obtenu peut être comprise entre 100 ng à 300 ng. Nous recommandons que un minimum de 100 ng ChIP devrait être utilisé pour construct une bibliothèque Chia-PET avec des cycles de PCR de moins de 20 pour réduire la redondance au cours de séquençage. Des quantités plus élevées de matériel puce permettra de nouvelles réductions dans la redondance, l'amélioration de la qualité des bibliothèques. Laver 1 x 10 8 cellules MCF-7 (l'équivalent de cinq à 500 cm 2 plaques carrées de 2 x 10 7 cellules) à deux reprises avec tampon phosphate salin (PBS) pré-chauffé à 37 ° C. Crosslink cellules MCF-7 avec 1,5 mM fraîchement préparée éthylglycol bis (succinimidylsuccinate) (EGS)) pendant 45 minutes à température ambiante (22 ° C) avec la rotation dans une hotte. Ajouter le formaldéhyde 37% à une concentration finale de 1% pendant 20 minutes à température ambiante (22 ° C) avec la rotation dans une hotte. Étancher les agents de réticulation en ajoutant 2 M de glycine à une concentration finale de 200 mM. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante(22 ° C) avec la rotation. Jeter réticulants trempés dans un flacon de déchets et laver les cellules deux fois avec du PBS froid. Jeter PBS et les cellules de récolte par grattage. Gardez cellules récoltées sur la glace. Rincer la plaque avec 5ml de PBS (les inhibiteurs de protéase ("+ PI") a été ajouté selon les instructions du fabricant) pour maximiser la collecte de cellules. Pellet les cellules à 1800 xg (3000 tours par minute) pendant 10 minutes à 4 ° C. Rejeter le surnageant et procéder à la lyse cellulaire. Sinon, stocker le culot à -80 ° C. 2. Lyse cellulaire (À 04:15 de la vidéo) Resuspendre le culot dans 15 ml de tampon de lyse SDS à 0,1% (50 mM HEPES pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100, le désoxycholate de sodium 0,1%, 0,1% SDS + PI) à fond par pipetage. Tourner pendant 15 minutes à 4 ° C. Pellet lysées cellules de 800 xg (2,000 rpm) pendant 10 minutes à 4 ° C. Rejeter le surnageant et répéter la lyse des cellules une fois comme pour l'étape 2.1 et 2.2. Le nucléaire isolée culot est prêt pour la lyse nucléaire. Alternativement, silo à granulés à -80 ° C. 3. Lysis nucléaire (À 05:00 de la vidéo) Lyse nucléaire est effectuée pour libérer la chromatine réticulé avant fragmentation de la chromatine. En l'absence de membrane nucléaire, la chromatine réticulé peut être traité par ultrasons en utilisant douces conditions. Parfois, la force sonication peut-être pas suffisante pour briser la membrane nucléaire et dans ce cas, moins la chromatine sera obtenue parce que le noyaux intacts seront jetés après centrifugation. Cependant, différents types de cellules peuvent exiger des conditions différentes. Resuspendre noyaux isolés culot dans 15 ml 1% de SDS Lysis Buffer (50 mM pH 7,5 HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% de Triton X-100, de sodium 0,1% Deoxycholate, 1% SDS + PI). Transfert de suspension noyaux à une haute vitesse-tube à centrifuger (tubes Oak Ridge Centrifugeuse (polypropylène)) et faire tourner pendant 15 minutes à 4 ° C. Pellet lysées noyaux de bouletage à 47810 xg (20.000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C. Décanter le surnageant et pause culot avec une pipette P1000. Laver culot avec 30 ml 0,1% SDS Lysis Buffer (+ PI). Tourner pendant 15 minutes à 4 ° C. Pellet chromatine au 47810 xg (20.000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C. Rejeter le surnageant et répéter laver une fois comme pour l'étape 3.4 à 3.6 avant de procéder à fragmentation de la chromatine. Alternativement, magasin de chromatine culot à -80 ° C. 4. La fragmentation de la chromatine (À 07:03 de la vidéo) Transfert chromatine granulés à un tube en polystyrène ronde essai de 14 ml à fond. Ajouter 1 ml SDS à 0,1% Lysis Buffer (+ PI) à la chromatine pellet. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans le mélange, car cela affecterait l'efficacité sonication. Cisaillement chromatine-ADN à une taille de 200 à 600 paires de bases avec un Branson numérique Sonifer Disrupter mobile (35% d'amplitude, 9 minutes (30 secondes sur, 30 secondes réduite)) et conserver des échantillons à froid, à tout moment pour empêcher la surchauffe en effectuant l' sonication dans une chambre froide (voir Figure 2). Reverse-réticuler une partie aliquote de la chromatine et vérifier l'efficacité de la fragmentation avec les étapes suivantes. (Les étapes suivantes ne sont pas montrées dans la vidéo). Aliquote de 10 pl de la chromatine après sonication. Centrifugeuse soniqué chromatine au 16110 xg (13.200 tpm) pendant 5 minutes à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et ajouter 2 pi de solution de protéinase K. Incuber pendant 30 minutes à 50 ° C. Résoudre inverser réticulé chromatine sur un gel d'agarose 1,5%. REPEAsonication t si les tailles de l'ADN sont plus importantes que prévu. Centrifuger lysat restant à 16110 xg (13.200 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C et le transfert de la chromatine soniquée (surnageant) dans un nouveau tube avant précontrôle avec des billes magnétiques. Alternativement, magasin soniqué chromatine à -80 ° C jusqu'à ce que la chromatine est suffisante pour commencer à recueillir une puce. 5. Lavage, précontrôle et de revêtements de l'anticorps à Perles (À 08:17 de la vidéo) Précontrôle de la chromatine Utilisez 300 pi de billes magnétiques aux protéines G pour une adresse IP. Laver trois fois avec 5 perles Perles ml du tampon de lavage (PBS, 0,1% de Triton X-100). Cette lavages et futurs impliquant magnétiques protéines G perles comprend les étapes suivantes. Assurez-billes magnétiques ne se dessèchent pas. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques. Discard surnageant. Remettre en suspension des perles avec un tampon. Tournez pendant 5 minutes à 4 ° C. Centrifuger à 129 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques. Rejeter le surnageant. Combinez la chromatine soniqué avec des perles prélavées, pour enlever la liaison de fond de la chromatine à des billes. Gardez 10 pl de la chromatine soniqué comme "entrée" pour le contrôle de l'enrichissement ultérieur par PCR quantitative (qPCR). Conserver à 4 ° C. Tourner la nuit à 4 ° C. Centrifugeuse soniqué chromatine à 129 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C. Placer le tube sur le concentrateur de particules magnétiques. Anticorps revêtement à des billes magnétiques Aliquoter 300 pi de billes magnétiques aux protéines G dans un nouveau tube. Laver trois fois avec des perles de tampon de lavage 5ml Perles (PBS, 0,1% de Triton X-100). Ajouter un volume équivalent (comme à l'étape 5.1.3) de solution de lavage Perles tampon. Ajouter 35 pg de l'ARN polymérase II (8WG16) anticorps monoclonal. Tourner la nuit à 4 ° C. Laver recouvertes d'anticorps perles deux fois avec 5 ml de tampon de lavage Perles. Récupérer l'anticorps billes revêtues à l'aide d'un concentrateur de particules magnétiques. 6. Immunoprécipitation de la chromatine (À 10:03 de la vidéo) Pour réduire le niveau de complexité et de bruit de fond, des anticorps contre les facteurs protéiques spécifiques sont utilisées pour enrichir des fragments de chromatine spécifiques d'intérêt avant le 6 ligature de proximité. Ici, nous avons utilisé une souris ARN polymérase II monoclonalAnticorps (8WG16) qui reconnaît la forme d'initiation de la protéine. Par fragments d'ADN enrichissantes qui sont associés à l'ARN polymérase II, la spécificité de la bibliothèque peut être augmentée, permettant l'identification des interactions à longue portée chromatine entre les promoteurs actifs et de leurs correspondants des régions régulatrices 9. Supprimer le tampon de lavage de l'anticorps de billes revêtues à l'aide d'un concentrateur de particules magnétiques. Transfert soniqué chromatine (surnageant de l'étape 5.1.6) à l'aide du concentrateur de particules magnétiques recouvertes d'anticorps à billes (à partir de l'étape 5.2.7). Tourner la nuit à 4 ° C. 7. Lavage et élution de l'ADN immunoprécipités complexes protéine- (À 11:13 de la vidéo) Laver la chromatine immunoprécipitées perles trois fois avec 5 ml de tampon de lyse SDS à 0,1%. Laver perles fois avec 5 ml de sel tampon de lavage haute (50 mM HEPES pH 7,5, 350 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, de 1% Triton X-100, désoxycholate de sodium 0,1%, 0,1% de SDS). Laver une fois avec 5 perles ml de tampon de lavage Lithium Chlorure (10 mM Tris pH 8,0, 250 mM LiCl, EDTA 1 mM, 0,5% de Nonidet P-40, le désoxycholate de sodium 0,5%). Jeter le tampon de lavage et remettre en suspension billes lavées avec 1 ml de tampon TE. Tournez pendant 5 minutes à 4 ° C. L'échantillon est prêt pour la quantification et la vérification d'enrichissement ChIP. Une fois que les copeaux suffisante a été recueilli, l'échantillon est prêt à être construit dans une bibliothèque Chia-PET. Cette étape est essentielle, et doit être fait pour assurer le succès de la construction de bibliothèques Chia-PET. ChIP-enrichis perles peuvent être stockés pour un maximum de 2 semaines à 4 ° C tout en subissant la quantification, le contrôle d'enrichissement ChIP, et l'accumulation de suffisamment de matériel. Eluer et inverse-réticulation "entrée" de l'ADN et de ChIP-enrichis de perles avec les étapes suivantes. (Les étapes suivantes ne sont pas montrées dans la vidéo.) Éluer 20% de ChIP-enrichis avec 200 billes tampon ChIP élution ul (50 mM Tris pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 1%). Tourner pendant 30 minutes à 37 ° C. Centrifuger perles éluées à 6100 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C. Transfert éluées complexes puce (surnageant) dans un nouveau tube à l'aide du concentrateur de particules magnétiques. Complexes ChIP Reverse-réticulation "entrée" et éluée avec 2 pi Protéinase K (concentration finale de 0,2 g / ml) pendant 2 heures à 50 ° C. Transfert inverse réticulé "entrée" de l'ADN et l'ADN ChIP éluée dans un 2 ml à haute densité MaXtract (respectivement). Ajouter 200 ul 25:24:1 pH alcool au phénol-chloroforme-Isoamyl 7,9 à des tubes dans une hotte et inverser pour bien mélanger. Faites tourner les tubes pendant 5 minutes à 16110 xg (13.200 rpm) à température ambiante. Transfert supérieure phase aqueuse dans un nouveau tube et précipiter l'ADN d'inverser l'esprit réticuléh 20 pi 3 M pH acétate de sodium 5.5, 200 ul d'isopropanol et 1 pi 15 mg / ml Glycoblue. Incuber à -80 ° C pendant 30 minutes et le culot d'ADN pendant 30 minutes à 16110 xg (13.200 rpm) à 4 ° C. Après la centrifugation d'ADN précipité l'isopropanol, laver culot d'ADN avec 75% éthanol glacé à deux reprises et remettre en suspension dans 20 culot d'ADN tampon TE ul. Quantifier "entrée" d'ADN (de l'étape 5.1.3) et de l'ADN par ChIP PicoGreen dosage 10. Effectuer un contrôle d'enrichissement par l'intermédiaire PCR qualitative (qPCR). B. Analyse Interaction chromatine en utilisant Tag Paired-End de séquençage (Chia-PET) La seconde moitié de la vidéo mettra en évidence les principales étapes de la construction d'une bibliothèque Chia-PET. 1. Fin-émoussement de fragments d'ADN ChIP Ce chapitre de la vidéo met en évidence deux mpoints de Ain, une procédure étape par étape de lavage de billes magnétiques pour enlever les enzymes et sel tampon de la réaction précédente (étape 1.1, 12:22-12:54 de la vidéo) et la procédure de mise en place de réactions enzymatiques impliquant des billes magnétiques dans le mélange réactionnel (étape 1.2, 12h54-13h25 de la vidéo). Lavez-ChIP enrichis perles une fois avec du tampon glacé TE. Cette lavages et futurs impliquant des billes magnétiques se composent des étapes suivantes. Centrifuger à 6100 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques. Rejeter le surnageant. Ajouter un tampon à billes. Mélanger perles avec un tampon en tapotant l'action. Centrifuger à 6100 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques. Rejeter le surnageant. Pour combler en soniqué overhaNGS, préparer un Master-Mix avec 70 pi x 10 tampon pour l'ADN polymérase T4, 7 pi 10 mM de dNTPs et 615,8 pi d'eau sans nucléase. Mélanger soigneusement et remettre en suspension billes lavées avec le maître-mix. Ajouter 7,2 ul 9,7 U / ul ADN polymérase T4 pour un volume final de 700 pl. Mélanger et laisser incuber pendant 40 minutes à 37 ° C avec rotation (en utilisant Palico Biotech Intelli-Mixer RM-2L, F8, 30 tours par minute, U = 50, u = 60). Effectuer toutes les réactions ultérieures enzymatiques avec les étapes suivantes. Diluer tampons de réaction avec une eau sans nucléase. Ajouter tous les autres réactifs (à l'exception des enzymes) à la mémoire tampon dilué. Mélanger soigneusement. Remettre en suspension billes / pellets avec un mélange de réaction. Ajouter enzyme billes en suspension / Pellet (Gardez enzymes sur glacière de table à tout moment pour assurer le maximum de l'activité enzymatique). Scellez le tube avec du parafilm. Veiller à ce que les perles sont bien mélangés dans le incubatio ensemblen. Jeter mélange réactionnel et laver sels tampons résiduels et des enzymes trois fois avec du tampon de lavage glacé (10 mM Tris-Cl pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM). 2. La ligature de biotinylés demi-Linkers à l'ADN ChIP Ce chapitre de la vidéo met en évidence les caractéristiques des oligonucléotides demi-éditeur de liens utilisées dans la construction de Chia-PET et de l'utilisation de la composition nucléotidique code à barres de distinguer entre les produits de ligature non-spécifiques et spécifiques (13h28-14h24) de la vidéo). Le chapitre présente également la procédure étape par étape de la mise en place une réaction de ligature demi-linker (étape 2.2, 14h24-15h54 de la vidéo). Deux types de biotinylés demi-linkers sont introduits dans ce protocole et sont conçus avec un code à barres interne de quatre nucléotides (TAAG ou ATGT) et un site de reconnaissance pour le type IIS enzyme de restriction MmeI (TCCAAC). Après ChIP enrichirment, soniqué fragments de chromatine sont également réparties en deux aliquotes sont d'abord et ligaturé avec un excès de l'une des demi-lieur A ou B demi-lieur 5,9. Diviser ChIP-enrichis perles en deux aliquotes pour l'ADN demi-lieur ligature par biotinylés demi-lieurs A ou demi-linkers B respectivement. Ces deux demi-linkers ont les mêmes séquences de nucléotides, à l'exception de quatre nucléotides dans le milieu qui servent (demi-lieur A avec TAAG; demi-lieur B avec ATGT) que les codes à barres de nucléotides. Lorsqu'il est combiné pendant la ligature de proximité, aléatoire et non-spécifiques ligatures entre les deux complexes puce différente peuvent être identifiés à partir de la population de séquences avec des linkers AB hétérodimère, par rapport à la ligature des particuliers qui peuvent être identifiés de la population de séquences avec homodimère AA ou BB linkers . Ligate ChIP-enrichis perles avec 140 pi 5 x ADN ligase T4 avec un tampon PEG, 3,5 pl 200 ng / ul biotinylés demi-lieurs A ou B, 553,5 ul-nucléaseeau libre et 3 pi 30 U / ul ADN ligase T4 (Gardez l'ADN ligase T4 sur une glacière de table en tout temps comme ligases sont instables, même sur de la glace). Scellez le tube avec du parafilm et incuber une nuit à 16 ° C avec une rotation. 3. Élution et ligature proximité de fragments d'ADN ChIP Ce chapitre de la vidéo explique le rôle de tampon EB, le SDS et le Triton X-100 au cours de l'élution de complexes chromatiniens de perles et montre également la procédure étape par étape de la mise en place d'une réaction de circularisation (Étape 3.9, 15:54 à 17:10 de la vidéo). Après la ligature des linkers demi-aux fragments de chromatine, les deux fractions sont réunies et élue au large des perles. Des fragments d'ADN qui interagissent ensuite être relié par une séquence complète de liaison pendant la ligature de proximité. Utilisation de la composition nucléotidique code à barres, les séquences peuvent être classés en trois catégories, à savoir des séquences wie hétérodimère linkers AB (code à barres ATGT / TAAG) et des séquences avec homodimère AA ou BB linkers (code à barres TAAG / TAAG ou ATGT / ATGT) pour distinguer les produits de ligature non-spécifiques et spécifiques respectivement 9. Par conséquent, l'utilisation de deux demi-linkers avec différents codes à barres nucléotidiques permet de spécifier différentes expériences ou de répétitions, ainsi que de la surveillance de la non-spécifique taux de ligature chimérique entre les complexes de puces différentes 5. Laver demi-linker-ligaturés perles trois fois avec le tampon de lavage glacé (10 mM Tris-Cl pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM). Combiner les deux tubes de demi-lieur-ligaturés billes de la manière suivante. Récupérer un des tubes de demi-lieur-ligaturés billes utilisant un concentrateur de particules magnétiques ("tube A"). Maintenir le tube d'autre demi-lieur-ligaturés billes sur la glace ("tube B"). Jeter le tampon de lavage (de l'étape 3.2.1) fTube rom A et transférer la moitié-linker-ligaturés perles (de l'étape 3.2.2) du tube B dans le tube A. tandis que le tube A est toujours sur le collecteur de particules magnétiques Ajouter 700 pi de tampon de lavage glacé à B Tube pour collecter les résidus demi-linker-ligaturés perles et s'assurer que les deux tubes de demi-linker-ligaturés perles sont combinés correctement. Transférer le tampon de lavage dans A. Tube Jeter le tube vide B. Phosphorylent demi-linker-ligaturés perles avec 70 pi 10 x T4 ADN ligase tampon (ONÉ), 616 ul d'eau sans nucléase et 14 pl 10 U / l de l'ADN T4 polynucléotide kinase. Incuber pendant 50 minutes à 37 ° C avec une rotation. Reclaim phosphorylées demi-linker-ligaturés perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et jeter mélange réactionnel. Éluer demi-linker-ligaturé chromatine complexe ADN avec 200 ul tampon d'élution fraîchement préparé (TE Buffer, 1% SDS). Incuber pendant 30 minutes à température ambiante (22 °C) avec la rotation. Transfert éluat dans un nouveau tube et rincez perles avec 900 pi de tampon EB. Transférer le surnageant dans le même tube de combiner les élutions. Transfert éluat recueilli les tasses filtres de deux filtres à tube à centrifuger et centrifuger à 16 110 xg (13.200 rpm) pendant 1 minute à température ambiante (22 ° C). Séquestrer le SDS en ajoutant 90 pi à 20% de Triton X-100 et inverser pour bien mélanger. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Circularisation est réalisée sous des conditions extrêmement diluée afin de favoriser les événements au sein de la ligature des individuels complexes chromatiniens réticulés, tout en minimisant les événements de ligature entre les complexes de chromatine différentes qui donnent lieu à des molécules d'ADN chimériques indésirables. De travail sur la glace, de transférer éluat trempé dans un tube Falcon de 50 ml et ajouter 7776 ul d'eau sans nucléase, 1000 pi 10 x T4 ADN ligase tampon (ONE) et 33,33 pi 30 U / ul ADN ligase de T4. Incuber une nuit à 16° C 4. Reverse-réticulation et de l'ADN Purification Ce chapitre de la vidéo montre la procédure étape par étape de phénol: extraction au chloroforme (Étape 4.3, 17h11-17h59) et le close-up de l'ADN granulés après centrifugation à l'étape 4.4. Reverse-réticulation et des protéines se dégradent par l'ajout de 100 ul de 20 mg / ml de protéinase K solution. Incuber pendant 2 heures à 50 ° C. Transfert ADN de la chromatine dans un 50 ml haute densité MaXtract et ajouter 9ml sans nucléase l'eau pour obtenir un volume final de 19 ml. Ajouter 19 ml d'alcool 25:24:1 pH au phénol-chloroforme-Isoamyl 7,9 à le tube dans une hotte et inverser pour bien mélanger. Faites tourner les tubes pendant 5 minutes à 1800 xg (3.000 rpm) à température ambiante. Transfert supérieure phase aqueuse à un des tubes de 50 ml à centrifuger Oak Ridge (Téflon FEP) et de l'ADN précipité la chromatine avec 1,9 ml pH 3 M acétate de sodium 5,5, 19 ml isopropanol et 5 Glycoblue ul. Glycoblue est ajouté pour améliorer la visibilité de la pastille. Incuber à 80 ° C pendant au moins une heure. Laisser la solution congelée à décongeler avant centrifugation à 38720 xg (18.000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C. Après la centrifugation d'ADN précipité l'isopropanol, laver culot d'ADN avec 75% éthanol glacé à deux reprises et remettre en suspension dans 34 culot d'ADN EB pi de tampon. Transférer le mélange d'ADN dans un tube de 1,7 ml d'ADN LoBind. Resuspendre culot d'ADN dans 34 pi de tampon EB. (Traitement à la RNase est facultatif en ce lavage ultérieur et des étapes de purification dans le protocole Chia-PET servent à éliminer la contamination de l'ARN et des inspections manuelles des séquences Chia-PET à partir de nos propres bibliothèques ont affiché aucune trace de contaminant l'ARN). Effectuer digestion par la RNase par addition de 10 pl RNase ONE 10 x tampon de réaction, 55 pl d'eau sans nucléase et 1 pi 10 U / ul RNase ONE ribonucléase. Incuber à 37° C pendant une heure. Transfert ADN de la chromatine dans un 2 ml à haute densité MaXtract. Ajouter 100 ul 25:24:1 pH alcool au phénol-chloroforme-Isoamyl 7,9 à le tube dans une hotte et inverser pour bien mélanger. Spin le tube pendant 5 minutes à 16110 xg (13.200 rpm) à température ambiante (22 ° C). Transfert supérieure phase aqueuse dans un nouveau tube et précipité inverse réticulé ADN avec 10 pi 3 M pH 5,5 acétate de sodium et 100 ml d'isopropanol. Incuber à -80 ° C pendant 30 minutes et le culot d'ADN pendant 30 minutes à 16110 xg (13.200 rpm) à 4 ° C. Après la centrifugation d'ADN précipité l'isopropanol, laver le culot d'ADN avec 75% éthanol glacé à deux reprises et remettre en suspension dans 34 culot d'ADN EB pi de tampon. 5. Immobilisation de Chia-PET ADN pour des billes de streptavidine L'introduction de cette chapitre traite de la présencedu site de reconnaissance et le MmeI T biotinylé présent dans les oligonucléotides demi-lieur de faciliter l'extraction de mot-clé-lieur-tag constructions ("PET", 18:02-19:10 de la vidéo). En outre, ce chapitre de la vidéo donne également une vue générale rapide de l'étape 5.2, la procédure étape par étape de la mise en place d'une réaction PCR (étape 6.1, 19h10-20h00 de la vidéo) et exciser un succès Chia-PET ADN (étape 6.9, 20h00-20h30). Demi-lieurs A et B contiennent des sites de reconnaissance d'accompagnement MmeI, permettant à cette enzyme de restriction de type IIS pour couper paires de bases 18/20 en aval de leurs sites cibles contraignantes pour générer à court de "tags" du fragment de la chromatine, la production de paires de tag-linker-tag constructions («PET»). Pour permettre la purification de constructions PET par revêtues de streptavidine des billes magnétiques, des deux demi-lieur A et B sont modifiés avec de la biotine, permettant la capture et la purification des constructions chia-PET. Communiqué captured Chia-PET ADN en ajoutant 5 pi 10 x NEBuffer 4, 5 pi fraîchement préparé 500 um (10 x) S-adénosylméthionine (SAM) et 1 pi 2 U / ul MmeI à l'ADN remis en suspension. Quench MmeI excès en ajoutant 5 pi non-biotinylés demi-linkers de mélange réactionnel pour MmeI peut être auto-inhibitrice en excès. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C. Pour capturer libérés Chia-PET 50 pi d'ADN de transfert, de remises en suspension des billes de streptavidine M-280 à un tube LoBind ADN. Laver deux fois avec des perles 2 x de reliure et de tampon de lavage (2 x B & W: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 1 mM, 2 M de NaCl). Remettre les billes dans 50 pl 2 x B & W Buffer et transférer 50 ul du mélange de digestion (de l'étape 5.1) dans le même tube. Bien mélanger et incuber pendant 45 minutes à température ambiante avec une rotation. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et éliminer le surnageant. Laver deux fois avec 150 perles ul 1 x tampon de lavage de reliure et de (1 x B & W: 5 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 0,5 mM, NaCl 1 M). Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et éliminer le surnageant. Laver trois fois avec des perles 150 pi 1 x B & W Buffer. Nick traduire Chia-PET ADN avec 5 pi 10 x NEBuffer 2, 2,5 pi 10 mM de dNTPs, 38,5 pi d'eau sans nucléase et 4 pi 10 U / ul Escherichia coli ADN polymérase I. Incuber une nuit àla température ambiante (22 ° C) avec la rotation. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et éliminer le surnageant. Laver trois fois avec des perles 150 pi 1 x B & W Buffer. Remettre en suspension avec 50 perles EB pi de tampon. 6. L'amplification de l'ADN Chia-PET Mettre en place des réactions de PCR avec 2 perles de suspension ul, 21 ul nucléase eau gratuites, 1 pl 10 pM Illumina 1-454 amorces, 1 pl 10 pM Illumina 2-454 amorces et 25 Phusion ul High Fidelity Master Mix. Pour déterminer le nombre de cycles nécessaires pour générer suffisamment de produits de PCR pour le séquençage, mis en place trois tests réactions de PCR avec des cycles de 16, 18 et 20. Ne pas dépasser 20 cycles que nous avons constaté que faire des résultats afin de la complexité de bibliothèque très faible. Etape initiale 30 secondes 98 ° C (Dénaturation) 18 à 25 cycles 10 secondes 98 ° C (Dénaturation) 30 secondes 65 ° C (Recuit) 30 secondes 72 ° C (Extension) Étape finale 5 minutes 72 ° C (Extension finale) Déterminer le nombre le plus bas possible du cycle en cours d'exécution par les réactions de PCR sur un gel TBE gradient 4-20% et coloration au SYBR Green I, assurer la présence d'une bande de 223 paires de bases, qui est la longueur de l'ADN chia-PET. Amplifier le reste des perles Chia-PET streptavidine liée à l'ADN dans un PCR à grande échelle avec aussi peu de cycles de PCR que possible tout en obtenant un rendement suffisant pour le séquençage. Réperles de demande de toutes les réactions PCR en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et une piscine surnageant à deux tubes LoBind frais d'ADN. Précipiter chaque tube de surnageant en ajoutant 60 pl acétate de sodium 3 M, 2 GlycoBlue ul et 600 ul d'isopropanol à des réactions mises en commun. Incuber à -80 ° C pendant 30 minutes. Centrifuger à 16110 xg (13.200 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C. Après la centrifugation d'ADN précipité l'isopropanol, de lavage culot d'ADN avec 75% éthanol glacé à deux reprises et remettre en suspension l'ADN extrait concentré dans 100 pi de tampon TE et 5 pi 6 x colorant de charge. Distribuer des produits de PCR uniformément dans les puits d'un gel TBE 6%. Exécutez le gel dans 1 x tampon TBE à 200 V pendant 35 minutes et la tache avec SYBR Green I. Visualisez le gel avec un lecteur Transilluminateur foncé. Soigneusement d'accise de 223 pb bande à partir du gel et d'effectuer "l'écrasement de gel" protocole d'extraction d'ADN comme suit: Placez fragments de gel excisées dans 0,6 ml MicroCTubes entrifuge qui ont été percées au fond avec une aiguille G 21-. Placer chaque tube intérieur d'un tube de 1,5 ml bouchon à vis et centrifuger à 16 110 xg (13.200 tpm) pendant 5 minutes à 4 ° C. Ajouter 200 ul de tampon TE pH 8,0 à chaque tube et s'assurer que les morceaux de gel sont totalement immergés dans la mémoire tampon. Congeler à -80 ° C pendant une heure et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Transfert des morceaux de gel avec le tampon dans chaque tube pour la Coupe du filtre d'un filtre tube à centrifuger et centrifuger à 16 110 xg (13.200 tpm) pendant 10 minutes à 4 ° C. Rincer chaque tube de 1,5 ml avec 200 ul de tampon TE pH 8,0 et de transfert de tampon de rinçage à chaque unité de filtre à la fin de la première rotation. Piscine filtre à travers et précipité avec de l'isopropanol. Resuspendre culot d'ADN avec 15 pi de tampon TE. 7. Qualité Vérifier unAmplification d de Chia-PET ADN Procéder à la vérification de la qualité en utilisant DNA 1000 Assay Agilent Agilent ou test ADN de haut de sensibilité sur Agilent Bioanalyzer 2100. L'électrophorégramme du test ADN Agilent devrait afficher un seul pic avec une base plane avant de procéder à Illumina Genome Analyzer IIx séquençage. Avant de séquençage Illumina Genome Analyzer IIx, Chia-PET ADN devraient idéalement avoir une concentration minimale de 10 nM. Effectuer un 4-point de la PCR quantitative en fonction de Illumina qPCR Guide du protocole de quantification afin de déterminer la quantité d'échantillon à charger sur la cellule de flux. Sinon, effectuer un point de la PCR quantitative comme suit: Diluer le modèle de contrôle à 100 pM, 22 heures et 13 heures. Comme décrit dans le protocole de quantification du Illumina qPCR, un modèle de contrôle est défini comme n'importe quelle bibliothèque préparée pour le séquençage sur la plate-forme Illumina et il devrait être aussi proche que possible en termes detaille du modèle, la teneur en GC et le type de bibliothèque. Diluer l'ADN Chia-PET à 22 heures. Mettre en place PCR triplicata de chaque dilution de 0,1 Primer qPCR ul 1.1, 0.1 Primer qPCR ul 2.1, 5 pi LightCycler480 ADN SYBR Green I Master Mix, 3,8 pi d'eau sans nucléase et 1 ul de modèle avec Roche Applied Sciences LightCycler 480 Real-Time Système PCR. Inclure deux contrôles négatifs en utilisant 1 pl de l'eau sans nucléase en tant que modèle. Dénaturation initiale 95 ° C à 5 minutes 4,8 ° C / s Amplification 95 ° C 10 secondes 4,8 ° C / s 60 ° C une minute à 2,5 ° C / s 72 ° C 30 secondes 4,8 ° C/ S Courbe de fusion 95 ° C 5 secondes 4,8 ° C / s 65 ° C une minute à 2,5 ° C / s 95 ° C 5 ° C par des acquisitions Refroidissement 40 ° C de 10 secondes 2,0 ° C / s Veiller à ce que les contrôles négatifs ne montrent aucune amplification et que l'écart type pour les valeurs de Ct est inférieure à 0,1 avant de calculer la concentration des modèles de bibliothèque sur la base de la courbe standard générée à partir des dilutions modèle de contrôle. Générer des grappes sur la surface de cellules d'écoulement Illumina en chargeant int 13:05o Système de Génération Illumina cbot Cluster conformément aux instructions affichées à l'écran. Passez à la séquence de Chia-PET ADN sur Illumina Genome Analyzer IIx en utilisant une amorce de séquençage Illumina Illumina 3-454 et l'amorce de séquençage 4-454 sur une seule voie pour voir la qualité de la bibliothèque. Stocker en restant Chia-PET ADN à -20 ° C. Si la bibliothèque a de bonnes données, préparation de l'échantillon pour des tirages supplémentaires de 4 à 8 voies en fonction des besoins sur la base des résultats de voies d'échantillons afin d'obtenir de 18 à 20.000.000 lectures unique. Le montant de Chia-PET ADN chargé sur les cellules d'écoulement dépend fortement de la version du logiciel d'analyse des données de séquençage, Studio Illumina contrôle de séquençage. Pour la version 2.9, les plages de concentration de chargement d'un tiers à la moitié de la capacité maximale de chaque carreau, ce qui équivaut à environ 21 millions filtré passe lit avec environ 9,5 millions de lectures de la vie privée. Charge réduite est nécessaire pour assurer une bonne base d'appel fou les séquences de codes à barres des lieurs. Cette erreur se produit quand un grand nombre de nucléotides similaires sont séquencées, comme c'est le cas si le linker est séquencé, pour obtenir des informations codes à barres. Si le codage à barres de l'information n'est pas désiré, et les linkers ne sont pas lus, alors la concentration en pleine charge peuvent être utilisés. Les fichiers convertis qSeq par l'appelant de base hors ligne peuvent être analysés plus en utilisant l'outil Chia-PET, selon le manuel Chia-PET outil d'installation (Version 4.1) 8. C. Représentant Chia-PET Résultats Nous avons réussi à construire Chia-PET bibliothèques utilisant l'ARN polymérase II d'anticorps (8WG16) en cellules MCF-7 (CHM160 et CHM163) 9 672 ng en utilisant du matériel ChIP comme décrit plus haut. Le gel diagnostic initial de fonctionner de cette bibliothèque amplifié par PCR, tel que mentionné à l'étape 6.2 du protocole Chia-PET, affiché une bande brillante et bien définie àla taille attendue de 223 paires de bases pour tous les vélo PCR utilisé (voir Figure 4). 16 cycles de PCR a été utilisée pour amplifier la bibliothèque Chia-PET et un rendement total de 17,1 ng a été obtenu. Un seul, le pic électrophérogramme intense a été observée à la taille attendue de 223 paires de bases par l'intermédiaire d'Agilent DNA 1000 analyse tel que mentionné à l'étape 7.1 du Protocole de Chia-PET (voir Figure 5). Figure 1. Aperçu ChIP. Cellules MCF-7 sont à double réticulés avec éthylglycol bis (succinimidylsuccinate (EGS) et le formaldéhyde séquentiellement, ce qui entraîne des liaisons covalentes entre chromatine spatialement adjacentes. Le chromatine réticulé a été obtenue à partir des fixes cellules MCF-7 par lyse cellulaire et la lyse nucléaire. La chromatine a ensuite été soumis à une fragmentation à une gamme de taille de 200-600 paires de bases. Après une pré-compensation de la chromatine soniqué avec Protein perles G magnétique pour éliminer non spécifique d'ADN, la chromatine pré-autorisé a été immunoprécipité nuit avec un anticorps de billes revêtues de capturer la chromatine d'intérêt. Figure 2. L'analyse sur gel des fragments de chromatine soniqués. Une échelle de 100 bp est montré dans la voie première et la dernière à titre de référence de taille. La chromatine soniqué affiché une forte intensité entre 200 et 600 pb qui est idéal pour saisir les interactions à longue portée chromatine. Figure 3. Chia-PET aperçu. Fragments de chromatine sont fragmentés en fin émoussé et ligaturé à biotinylés demi-linkers contenant des sites de restriction flanquant MmeI. Complexes chromatiniens intacts sont ensuite éluées hors des perles et soumis à la ligature de proximité dans des conditions extrêmement diluée conditions, de telle sorte que des fragments d'ADN qui interagissent sont preferentially ligaturé à l'autre. Après réticulation inverse pour éliminer l'ADN protéines associées, la digestion est effectuée MmeI pour libérer balise-lieur-tag (PET) constructions, qui sont ensuite purifiés par liaison sélective à billes de streptavidine. Les constructions en PET sont ligués avec des adaptateurs pour séquençage à haut débit. Figure 4. Analyse Gel de Chia-PET après amplification par PCR. Une échelle 25 bp est montré dans le couloir 1 et 5 pour référence de taille. Les pistes 2 à 4 sont des produits de PCR générés après le 16, 18 et 20 cycles d'amplification PCR à partir de 2 pi de modèle de perles immobilisé, respectivement. Il s'agit d'une bibliothèque de succès, comme indiqué par les chambres lumineuses et bien définies des bandes à la taille attendue de 223 pb. Le frottis non spécifique est généré lorsque le nombre de cycles de PCR est augmenté tandis que le plus bas de chaque bande de réaction PCR est constitué de dimères d'amorces. Figure 5. Agilent 2100 Bioanalyzer analyse des purifié Illumina-454 adaptateur ligaturé Chia-PET. Capture d'écran de électrophérogrammes Agilent Bioanalyzer 2100 profilage d'une bibliothèque de succès, avec un seul pic intense à la taille attendue de 223 pb. Notez que le test Agilent Bioanalyzer rapporte habituellement une taille légèrement plus élevé que prévu, dans ce cas, le pic souhaité est affiché à 237 pb au lieu de 223 pb. Ceci est dans la plage d'erreur 10% du dosage Agilent. Discussion: Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement\nChia-PET est une méthode mise au point pour identifier les interactions à longue portée dans régulation de la transcription. Un des facteurs critiques qui déterminent la qualité d'une bibliothèque Chia-PET est la qualité du matériel ChIP. Le protocole présenté dans la vidéo incorpore l'utilisation de biens et services environnementaux et de formaldéhyde pour réticuler les cellules. L'utilisation du formaldéhyde combiné avec un deuxième réactif de réticulation portant un bras espaceur plus peut aider à la fixation de protéines qui ne pouvaient pas être liés par le formaldéhyde seul 3,11,15. Nous avons construit des bibliothèques avec cette méthode, qui ont démontré de solides sites de liaison et à long terme des interactions 9. Toutefois, la réticulation et les conditions de puce devrait être optimisé pour chaque facteur d'intérêt, et il est important de ne pas trop réticulation comme trop réticulation se traduira par des difficultés dans la fragmentation par ultrasons, et peut éventuellement mener à des interactions parasites chromatine . Interactions chromatineidentifié par Chia-PET doit être validé par une méthode différente, telles que la fluorescence par hybridation in situ 4. Nous recommandons un minimum de 100 ng de matériel chromatine. Alors que nous avons construit des bibliothèques de bonne qualité à partir de 50 ng de matériel chromatine, nous avons observé que de grandes quantités de matériau de départ a permis la construction de Chia-PET bibliothèques avec des cycles de PCR de moins de 16, réduisant ainsi au minimum amplicons et la redondance de chaque bibliothèque. Cette baisse de la redondance en corrélation avec plus uniques balises cartographiés et également un pourcentage élevé de données utilisables, ce qui permet une carte plus complète chromatine interaction avec moins de voies de séquençage. Le volume final emballé de perles dans chaque tube devrait être de 50 pi et 100 pi de billes magnétiques et Sépharose respectivement. Si le volume emballé perle est inférieure à celle indiquée, mettre le volume au minimum emballé avec même pré-autorisé vierges billes magnétiques ou Sepharose pour minimiser la perte de l'ADN porteur de billess dans les étapes ultérieures. À canon scié de conseil ou grand-core des conseils devraient être utilisés pour le pipetage des billes de Sépharose. Les modifications suivantes ont été intégrées à la suite du déjà publié Chia-PET protocole 5. Tout d'abord, billes magnétiques G ont été utilisés pour minimiser la perte de l'échantillon pendant les lavages. En outre, nous avons identifié bandes non spécifiques avec la taille approximative de 100 pb et 138 pb pour être amplicons de l'auto-ligaturés demi-linkers ou / et des adaptateurs. Par conséquent, nous avons réduit la concentration de biotinylés demi-linkers et 454 GS20 adaptateurs pour minimiser bandes non spécifiques lors de l'amplification PCR. Le volume ligature de proximité a été réduit de 50 ml à 10 ml pour minimiser la perte d'échantillon au cours des étapes ultérieures de purification et aussi économiser sur les coûts des réactifs. Nous avons également augmenté le temps d'incubation pour immobiliser Chia-PET ADN à des billes pour assurer la capture maximale de Chia-PET ADN sur les billes de streptavidine. Au cours de l'étape de ligation de proximité, la ligature des chimères that ne représentent pas vrai dans les interactions in vivo chromatine sont inévitablement générés d'une manière non-spécifique et aléatoire. Par conséquent, pour évaluer la qualité des données provenant de n'importe quelle expérience Chia-PET, le taux de chimérisme est estimée à partir de l'utilisation de deux différents demi-linkers avec nucléotidique spécifique TAAG codes à barres et ATGT 5. Après séquençage à haut débit, les séquences Chia-PET sont d'abord analysés pour leur composition code-barres de liaison et des séquences dérivées de produits de ligature et des produits spécifiques ligature non-spécifiques peuvent être distinguées 8. Le pourcentage de chimères connus (c.-à-hétérodimères linkers AB) présents dans notre propre MCF-7 ARN polymérase II Chia-PET bibliothèques est inférieure à 15%. Chia-PET séquences sont ensuite classées en deux catégories, à savoir l'auto-ligature animaux de compagnie et inter-ligature ANIMAUX DE COMPAGNIE. Auto-ligature PET sont obtenues à partir d'auto-circularisation ligature des fragments de chromatine tandis entre ligature PET sont dérivées à partir de inter-ligature entre deux fragments d'ADN différents. Ce dernier est alors sous-divisé en trois catégories différentes en fonction de la distance génomique de chaque étiquette sur le même chromosome (intrachromosomiques inter-ligature PET) ou que les deux balises sont mappées à deux chromosomes différents (interchromosomiques inter-ligature PET). Nous avons développé un package Chia-PET outil logiciel pour trier les différentes catégories 8. Ce sera basé sur des fragments d'ADN qui sont dans la bibliothèque. En règle générale, des fragments plus petits ChIP donnera une résolution plus élevée et la couper pour ces ARN polymérase II Chia-PET bibliothèques est d'environ 4 ko. En outre, les interactions réelles chromatine peuvent être distingués du bruit aléatoire en comptant le nombre d'inter-ligature vie privée dans un cluster interaction; en d'autres termes, un groupe de comptage PET haute est dit d'avoir une plus grande probabilité d'être une interaction réelle chromatine 8 . Pour filtrer nos faux positifs unepassera de points d'ancrage hautement enrichi qui peuvent former des inter-ligature vie privée par hasard, un cadre d'analyse statistique a également été formulées pour tenir compte de la formation aléatoire de toute vie privée inter-ligature entre deux ancres 8. En conclusion, la technique de Chia-PET permet de cartographier les réseaux d'interaction chromatine à l'échelle mondiale. La mise en œuvre de la puce en Chia-PET permet la réduction de la complexité de bibliothèque et le bruit de fond. En outre, ajoute-t-ChIP spécificité des interactions chromatine, permettant l'examen des interactions spécifiques associés à la chromatine facteurs de transcription particuliers 5. Disclosures: Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement\nPas de conflits d'intérêt déclarés. Acknowledgements: Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement\nLes auteurs sont pris en charge par A * STAR de Singapour. En outre, MJF est soutenu par une bourse d'études A * STAR National Science, un Oréal For Women in Science National Fellowship et un Lee Kuan Yew de postdoctorat. YR est soutenu par le NIH ENCODE subventions (R01-01 et HG004456 R01 HG003521-01). Les auteurs remercient également l'équipe de la vidéographie de Productions Pixels 8, Singapour, en particulier Issey M. Kelvin, M. Chang Kai Xiang et M. Sherwin Gan pour le tournage des scènes, Mme Siti Rahim pour le montage vidéo et de Mme Michelle Teo pour le voice-over. References: Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement\nAsk the Author: Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement


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Au retour, la même navette vous conduira jusqu’au parking pour récupérer votre voiture. Ce sont des transferts gratuits. La fréquence des transferts est d'environ 20min. Elle vous dépose en face du terminal.\nSécurité: La sécurité de votre véhicule est notre priorité. Il est de notre devoir de vous garantir une place surveillée. Nous inspectons nous même tous les parkings avec lesquels nous collaborons, afin de nous assurer qu’ils respectent nos hauts standards de sécurité.\nCalculez votre itinéraire: Avant votre départ à parking aéroport Barcelone, nous vous conseillons de surveiller le trafic, les travaux et les accidents (via la radio ou autre moyen d’informations). Il est important de bien calculez votre itinéraire afin de ne pas vous mettre en retard. La plupart de nos collaborateurs de places de stationnement sont ouverts 24h24.\nÀ partir de € 67,50 par semaine\nÀ partir de € 45,80 par semaine\nVoulez-vous vous garer à l'aéroport de Barcelone, mais avez-vous des questions sur le fonctionnement des... En savoir plus\nIl y a plusieurs façons de se garer à l'aéroport de Barcelone, et l'option de... En savoir plus\nPour vous garer à l'aéroport de Barcelone , nous vous conseillons d'être présent au moins... En savoir plus\nPour plus d'informations sur le parking, cliquez le 'P'. Calculez votre itinéraire vers Barcelone


Le bien des enfants avant tout - ZENIT - Francais\nnovembre 18, 2015 15:00ZENIT StaffAudience Générale\n« C’est le devoir de tous de protéger les enfants et de faire passer leur bien avant tout », déclare le pape François.\nA l’avant-veille de la Journée mondiale de l’enfance, le pape François a voulu lancer cet appel à l’audience de ce mercredi 18 novembre, place Saint-Pierre.\n« Après-demain, a dit le pape, nous célèbrerons la Journée mondiale des droits de l’enfance. C’est le devoir de tous de protéger les enfants et de faire passer leur bien avant tout autre critère, afin qu’ils ne soient jamais soumis à des formes de servitude et de mauvais traitements, ni à des formes d’exploitation. Je souhaite que la Communauté internationale puisse surveiller avec attention les conditions de vie des enfants, en particulier là où ils sont exposés à se faire enrôler par des groupes armés ; et qu’elle puisse aussi aider les familles à garantir à tout enfant, garçon ou fille, le droit à l’école et à l’éducation. »\nEn 1954, l’Assemblée générale de l’ONU a recommandé [résolution 836 (IX)] à tous les pays d’instituer une Journée mondiale de l’enfance, qui serait une journée de fraternité mondiale et de compréhension entre les enfants, et d’activités favorisant le bien-être des enfants du monde entier. Elle a proposé aux gouvernements que cette Journée soit célébrée à la date qui leur semblait la plus appropriée. Le 20 novembre marque le jour de l’adoption par l’Assemblée de la Déclaration des droits de l’enfant [A/RES/1386(XIV)] en 1959, et de la Convention relative aux droits de l’enfant, signée en 1989.\nCette Convention, qui est le traité international le plus ratifié en matière de droits de l’homme, définit une liste de droits de l’enfant comprenant le droit à la vie, à la santé, à l’éducation et le droit de jouer, ainsi que le droit à une vie de famille, à être protégé de la violence et de la discrimination, et à faire entendre sa voix.\nSur la base de cette Convention et des efforts conjoints de l’ensemble des pays et régions, soutenons et célébrons le droit des enfants lors de la Journée mondiale de l’enfance. Par le dialogue et l’action, bâtissons un monde où les enfants peuvent s’épanouir librement.\nnovembre 18, 2015 15:00Audience Générale\nVos maisons, des temples de l’amour !


Le Pakistan proteste contre un trekking indien - I-Trekkings\nVous êtes ici >> Accueil/Actualités randonnées, trekkings et équipement du randonneur/Le Pakistan proteste contre un trekking indien\nRédigé le 21/09/2007 - Lu 1800 fois\nLe Pakistan a convoqué récemment un diplomate indien pour protester contre l’idée d’ouvrir à des touristes le glacier de Siachen, objet d’un vieux litige territorial entre les deux pays.\nL’armée indienne compte emmener un groupe de randonneurs sur le glacier de l’Himalaya où les forces indiennes et pakistanaises se font face depuis 1984, sur le “plus haut champ de bataille du monde”, à 5 500 mètres d’altitude. “Le vice-haut commissaire de l’Inde a été informé que le projet indien d’ouvrir le territoire disputé à des fins touristiques suscitait de graves préoccupations au Pakistan”, a déclaré la porte-parole du ministère des Affaires étrangères. “La région demeure une zone de conflit et (le projet) pourrait aggraver la situation avec de graves conséquences qui pourraient vicier l’atmosphère dans le processus de paix en cours”, a-t-elle ajouté. L’Inde et le Pakistan ont lancé un processus de paix au début 2004 après avoir, en 2002, failli se lancer dans leur quatrième guerre depuis l’indépendance et la partition de 1947. Les discussions ont permis d’améliorer les liens diplomatiques entre les deux pays ainsi que les échanges sportifs ou les liaisons de transports. Mais rien n’a avancé sur l’avenir de la région divisée du Cachemire, le principal sujet de conflit entre les deux puissances.\n**        ***   **  **     **  **    **  ***   ***\n**        ****  **  **     **  **        **** ****\n******    ** ** **  **     **   ******   ** *** **\n**        **  ****  **     **        **  **     **


True Temper arrête sa production pour le cycle | VéloArtisanal\nL’info semble avoir fait le buzz dernièrement aux USA: True Temper arrête la fabrication de tubes pour vélo. Raison: pas rentable. Ils se recentre sur la fabrication de clubs de golf…\nJ’ai été étonné d’apprendre cela. De chez nous, la fabrication artisanal américaine semble abondante, avec pleins de constructeurs artisanaux…Alors est ce que c’ètait juste une autre “bulle” qui vient d’éclater?\nTou cela fait réfléchir à la pérénité en Europe de Reynolds et Colombus…Est ce qu’on a des chiffres sur la production/ ventes de tubes? Déjà qu’en Angleterre la majorité des entreprises industrielles ont fermées boutiques, je m’étonne toujours que Reynolds soit toujours là…souhaitons que cela continue ainsi…\nnous en avions discuté avec Christo,\nje pense que c’est illusoire de penser que la fabrication artisanale américaine est abondante.\nIl y a quelques gros voire très gros (steve potts, 44bikes et j’en passe), mais ils ne produisent pas et vendent pas 10000 cadres pas mois. C’est une production unitaire vendue très chère. Et beaucoup d’autres artisans vivottent mais la quantité de vélos fabriquée est je pense négligeable.Et ca, ca n’arrange pas du tout des sociétés comme True Tremper. Bien sur, je pense qu’ils doivent augmenter leur marge en fonction du produit vendu. mais ce type d’industrie et très lourd et je suppose que pour rentrer dans les coûts, la production minimum doit être assez élevée (les coûts fixes étant aussi élevés).\nA cela s’ajoute la montée en puissance du carbone depuis plusieurs années…\nEt enfin la compétence assez importante de reynolds et columbus qui me semblent historiquement mieux implantés…\nD’ailleurs javais vu que Columbus faisait aussi du carbone maintenant, c’est un signe\nSelon mois le plus gros fabricant sur mesure c’est Seven Cycles (1600-1800/an) mais ils ont un processus en béton basé sur la méthode Toyota.\nIl y a moots avec environ 1500/an mais que titane cette fois.\nLes artisans travaillant seul je pense pas qu’ils puissent atteindre la barre des 100.\nPar contre je vois pas pourquoi ça ne pourrait pas arriver aussi en Europe, Reynolds ne travail pas que pour l’industrie du cycle et Colombus on récemment eu des gros délais de livraison. Festka on attendu plus de 3 mois leur sets de tubes et on parle d’une bonne centaine de vélo par an pour eux.\nEn alternative il y a le tube d’aero genre ULM Technologie ou Sandelving mais c’est sur que pour le “route” c’est pas le même poids.


Comment acheter Ethereum (ETH) - La deuxième cryptomonnaie la plus utilisée au monde\nAchetez des ethers auprès des meilleurs courtiers\n➡ Les courtiers sont la solution la plus simple, la plus rapide et la plus sûre pour commencer à utiliser des cryptodevises. Nous vous expliquons comment et où acheter vos premiers ethers, en quatre étapes seulement. Vous verrez, c’est facile !\n4. Achetez et utilisez facilement l'Ethereum\nObtenez vos premiers ETH ! Vous pouvez également investir dans bien d’autres cryptodevises\nLe réseau qui héberge la deuxième cryptomonnaie la plus utilisée au monde, derrière le bitcoin\nEthereum est la blockchain open source, descentralisée et publique qui héberge l’ether (ETH), l’une des cryptodevises les plus importantes au monde. Ce protocole permet non seulement d’échanger des ethers, mais aussi d’exécuter des dapps ou applications décentralisées dans son réseau, telles que les smart contracts ou contrats intelligents. Pour en savoir plus sur l’Ethereum, consultez notre page Qu’est ce que l’Ethereum.


Détails du dispositif Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable - ManualsBase.com - résolvez votre problème\nRenseignements et instructions d'utilisation concernant le dispositif Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable\nVous avez perdu l'instruction d'utilisation du dispositif Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable? Ou vous avez un autre problème avec celui-ci? Vous êtes bien tombé!\nIl arive souvent que les premiers problèmes avec le dispositif Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable se manifestent seulement après plusieurs semaines ou mois après l'achat. Après un tel temps, beaucoup de gens ont le problème à retrouver le dossier reçu lors de l'achat (de tel que l'instruction d'utilisation) - il est déjà rejeté ou il est perdu d'une telle manière qu'il est impossible de le retrouver. Vous trouverez ci-dessous la liste des documents Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable que vous pouvez télécharger directement de nos serveurs. Dès ce moment vous n'êtes plus obligés de prendre soin du dossier de l'équipement. Il suffit d'analyser notre base et de télécharger l'instruction d'utilisation de même que Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable.\nDocuments joints à Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable\nInstruction d'utilisation Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable\nVous pouvez ajouter le document suivant pour le dispositif Toshiba Tecra M10 Ordinateur portable. Lorsque vous pensez que vous disposez d'une version plus nouvelle ou meilleure de l'instruction, partagez-la avec nous. Vous pouvez aussi nous contacter si l'instruction n'est pas satisfaisante ou de trop mauvaise qualité. Nous chercherons à obtenir un document convenable pour vous. Si vous avez des problèmes avec l'affichage ou le téléchargement du manuel, contactez-nous aussi.


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Cliquez ici pour toutes demandes de créditFinance />Cliquez ici pour toutes demandes de crédit />Cliquez ici pour toutes demandes de crédit />PTZ 2018 : ce qu’il faut savoir sur la nouvelle version du dispositif - Actualités - Cliquez ici pour toutes demandes de crédit Cliquez ici pour toutes demandes de crédit"/>\nZonage, revenus et composition du foyer : les principaux critères d’éligibilité du PTZ 2018\nPour rappel, l’obtention d’un prêt à taux zéro ainsi que son montant et ses modalités de remboursement dépendent de plusieurs critères dont la zone géographique, les revenus et la composition du foyer.\nDe ce fait, pour pouvoir prétendre au prêt à taux zéro, le demandeur ne doit pas dépasser un certain plafond de revenus. Ce plafond varie selon la zone géographique et le nombre de personnes que compose le foyer. A savoir que, plus la zone où est situé le bien est considérée comme « tendue » plus les plafonds de ressources sont importants et plus le montant du projet est élevé.\nNombre de personnes destinées à vivre dans le logement\nPour le calcul des plafonds de ressources, sont pris en compte le revenu fiscal de référence de l’année N-2 du demandeur du prêt, auquel il faut ajouter les revenus fiscaux de référence des personnes destinées à vivre dans le logement et ne faisant pas partie du même foyer fiscal. Ainsi, pour le PTZ 2018, les revenus fiscaux à prendre en compte sont ceux de l’année 2016. Voici les plafonds de ressources du PTZ 2018.\nPour rappel, ce dispositif est un financement conventionné pouvant être accordé pour financer l’acquisition ou la construction d’une première résidence principale. C’est-à-dire qu’il n’est destiné qu’au primo-accédants et aux ménages n’ayant pas été propriétaires de leur résidence principale durant les deux dernières années. Ce financement aidé peut aussi être contracté pour financer l’achat d’un bien ancien sous conditions de réaliser des travaux présentant un tiers du montant de l’opération.\nDans la version précédente du PTZ, les zones éligibles ne prenaient pas assez en compte les spécificités des territoires, mais avec la nouvelle version, ces spécificités ont été particulièrement considérées. Ainsi, certains estiment que le nouveau zonage répond mieux aux besoins des marchés immobiliers locaux.\nSelon les dispositifs de la loi de la finance pour 2018, le prêt à taux zéro peut toujours permettre d’acquérir un logement neuf, mais cette possibilité est désormais réduite aux seules zones A, A Bis et B1 pendant une période de 4 ans, soit jusqu’au 31 décembre 2021.\nPour la zone B1, l’obtention d’un PTZ dans neuf restera possible pendant encore deux ans, soit jusqu’au 31 décembre 2019, mais son montant maximum sera divisé par deux. En d’autres termes, le prêt à taux zéro dans le neuf sera encore disponible en 2018 dans la zone B1, mais avec une enveloppe bien limitée, à seulement 20 % du montant maximal de l’opération, contre 40 % auparavant.\nQuant ’à la zone C, le PTZ devait être abandonné selon le plan initial du gouvernement. Mais le 6 octobre 2017, le président de la république a déclaré que le dispositif sera maintenu dans le neuf jusqu’à 31 décembre 2019, mais que son montant maximum sera aussi divisé par deux comme en zone B1.\nNéanmoins, depuis le 1er janvier 2018, le prêt à taux zéro pour financer l’achat d’un logement ancien avec travaux est exclusivement réservé aux zones moins tendues (B2 et C) jusqu’au 31 décembre 2021.\nPTZ 2018 : le nouveau zonage\nPour offrir plus de visibilité aux acteurs du logement, le gouvernement a donc déCliquez ici pour toutes demandes de crédité de maintenir le PTZ pour une durée de 4 ans, mais avec un dispositif principalement destiné qu’à certains territoires appelés « les zones tendues ».\nDe ce fait, il n’y aura plus de prêt à taux zéro dans le neuf dans les zones B2 et C à partir du 1er janvier 2020. Les zones A, A bis et B1 ne seront plus éligibles au prêt à taux zéro dans l’ancien avec travaux. Ainsi, le dispositif du PTZ dans l’ancien ne sera disponible que dans les zones B2 et C. Si ce recentrage pourrait offrir plus de visibilité aux professionnels de l’habitat, selon le gouvernement, il faut savoir qu’il pourrait également écarter certains profils du dispositif.\nPar ailleurs, il faut savoir que ce nouveau recentrage est défini en fonction de la tension du marché immobilier. Les plus tendues sont les zones A et A bis, tandis que la moins tendue est la C. Le gouvernement défini les zones comme suit :\nZone A bis : Paris et ses proches banlieues (Yvelines, Hauts-de-Seine, Seine-Saint-Denis, Val-de-Marne, Val-d’Oise).\nZone A : d’autres agglomérations de Paris, la Côte d’Azur et les communes où les loyers et les prix du mètre carré sont très élevés.\nZone B1 : les grandes villes françaises, supérieures à 250 000 habitants, certaines villes du littoral, la Corse et les DOM.\nZone B2 : villes allant de 50 000 habitants à 250 000 habitants, grande couronne autour de Paris (non située en zone A et B1), certaines communes de Corse non situées en zone A et B1.


Météo Hillsview Heure par Heure ☀ Prévisions Meteo Aujourd'hui Australie-Méridionale Australie - M6 météo\nActuellement: Météo Hillsview\nMétéo Hillsview Ville , Australie-Méridionale , Australie\nQuel temps fait-il aujourd'hui à Hillsview (Australie-Méridionale, Australie) ?\nAujourd'hui, le temps observé à Hillsview est Dégagé .\nLa température de l'air à Hillsview est comprise entre 11°C/29°C.\nMétéo du ciel heure par heure à Hillsview\nQuelle est la météo pour aujourd'hui à Hillsview ? Quel temps fait-il aujourd'hui à Hillsview, Australie ? Faut-il prendre votre parapluie dans l'heure qui vient pour aller au travail ou pour sortir ? Le ciel est-il couvert de nuages ? Consultez nos prévisions météo heure par heure et détaillées du ciel pour Hillsview pour connaitre les différences de températures dans les quatre périodes de la journée : ce matin, cet après-midi, ce soir et cette nuit. Nos prévisions englobent les risques de pluie et d'orage heure par heure. Les données sur la force et la direction du vent à Hillsview demain vous aideront à rester vigilents et à prendre vos précautions en cas d'intempéries.\nRecevez la météo de Hillsview par e-mail chaque matin !\nLivres et guides touristiques sur Hillsview\nVoici quelques idées de guides touristiques sur Hillsview à acheter. Ces ouvrages vous aideront à passer un bon séjour dans la ville et ses alentours ou simplement à mieux connaitre l'histoire de la ville.\nVilles à proximité de Hillsview


Nabilla et Thomas Vergara ont accueilli leur premier enfant - Cosmopolitan.fr\nFélicitations au jeune couple ! Après 7 ans de relation, Nabilla a accouché de son premier enfant : un petit garçon appelé Milann. Sur les réseaux sociaux, ils ont partagé la belle nouvelle.\nBelle nouvelle pour le couple le plus populaire de la télé-réalité française ! Nabilla Benattia et Thomas Vergara sont devenus les parents d'un heureux petit garçon. C'est sur les réseaux sociaux qu'ils ont tenu à partager la nouvelle. Une annonce très attendue par leurs followers !\nNabilla a accouché d'un petit garçon\nL'influenceuse de 27 ans a donc donné naissance à un petit garçon le 11 octobre 2019. Nabilla avait choisi de faire deviner le prénom de son bébé avant sa naissance à ses followers, et une internaute l'avait découvert : "Milann".\nSur Instagram elle a commenté : "Je viens de vivre le plus beau jour de toute ma vie ... Ce que je ressens aujourd’hui est inexplicable. Mon mari et moi sommes à présent parents. Milann, le fruit de notre amour, est né hier après-midi le 11/10/2019 à 13h06 , un merveilleux petit ange de 3kg620. Il se porte à merveille et notre bonheur est infini Je ne trouve pas les mots pour décrire notre joie. Nous sommes comblés d’amour. Merci à mon mari qui a été exemplaire du début jusqu’à a la fin. Tu es toute ma vie, je t’aime tellement".\nMaintenant que le petit garçon est né, le couple devrait emménager, comme il l'avait annoncé, à Dubaï ! En effet, si Nabilla a passé sa grossesse entre Londres et la France, c'est finalement sur Dubaï que le couple a jeté son dévolu pour faire grandir son enfant. La sécurité et le niveau scolaire ont convaincu le couple. Là-bas, ils pourront rejoindre d'autres candidats de télé-réalité qui sont de jeunes parents, comme Jessica Thivenin et Thibault Garcia, ou Jazz et Laurent.\nThomas et Nabilla se sont rencontrés à 26 et 20 ans, il y a 7 ans, sur le tournage des Anges de la téléréalité 5 en Floride. Depuis, rien ne semble pouvoir les séparer : ni la sur-médiatisation, ni le temps qui passe, ni la prison. La grossesse de Nabilla a également été une épreuve, puisqu'elle a partagé ses difficultés sur Instagram avec ses followers. En story, très émue, elle avait à la fois partagé ses problèmes de peau, ses contractions, sa fatigue mais aussi son impatience à l'idée de rencontrer son fils.\nElle pourra désormais partager son nouveau quotidien sur les réseaux sociaux !


LG V40 ThinQ avec trois caméras arrière dévoilées, lancement le 3 octobre - Onglets Mobiles\nLG V40 ThinQ avec trois caméras arrière dévoilées, lancement le 3 octobre\nLG a révélé quelques détails et à quoi ressemblera le nouveau LG V40 ThinQ sur son site Web officiel de la salle de presse coréenne.\nLe LG V40 ThinQ sera disponible en trois couleurs : gris platine, rouge carmin et bleu marocain.\nLG a dévoilé des images et quelques détails sur son smartphone LG V40 ThinQ, que la société lancera le 3 octobre en Corée du Sud. Le nouveau LG V40 ThinQ arborera cinq caméras, trois à l'arrière et deux à l'avant. LG a publié un teaser vidéo et quelques images de l'appareil sur son site Web coréen.\nLe LG V40 ThinQ sera disponible en trois couleurs : gris platine, rouge carmin et bleu marocain. Il arborera un écran de 6,4 pouces légèrement plus grand que l'écran de 6 pouces du LG V30. L'appareil arborera une configuration à trois caméras à l'arrière avec un capteur d'éclairage de 2 à 3 mm et un capteur laser à côté de la configuration de la caméra.\nSur le devant, il comportera une configuration à double caméra. La société n'a pas encore révélé les détails concernant la taille des capteurs de la caméra.\nSelon des rapports antérieurs, le LG V40 ThinQ arborera un écran cranté QHD+ pOLED FullVision de 6,4 pouces avec un rapport hauteur/largeur de 19,5:9. Il sera alimenté par le processeur Qualcomm Snapdragon 845 associé au GPU Adreno 845. L'appareil sera livré avec 6 Go de RAM couplés à 64 Go de stockage interne et 128 Go de stockage interne. Il comportera également un Quad DAC et une Boombox de haut-parleur stéréo. Tout cela sera soutenu par une batterie non amovible de 3 300 mAh.\nLa configuration de l'appareil photo du LG V40 ThinQ à l'arrière comprendra un capteur 12MP avec ouverture f/1,5, un capteur grand angle 16MP avec ouverture f/1,9 et un capteur de zoom optique 12MP avec ouverture f/2,4. À l'avant, il comportera une configuration à double caméra comprenant un capteur principal de 8 MP associé à un capteur secondaire de 5 MP.\nNe manquez pas la conjonction Vénus-Mars Lune ce soir\nApple iPhone X ne coûte que 357 $ à fabriquer, mais le taux d'adoption est supérieur à celui de l'iPhone 8\nLes utilisateurs d'iPad pourront bientôt jouer à des jeux à l'aide du clavier et de la souris\nApple iOS 15.0.2, iPadOS 15.0.2 publié : pourquoi vous devez installer cette mise à jour immédiatement\n5 astuces pour prolonger la durée de vie de la batterie de votre téléphone Android\nWaymo livrera du fret aux centres de données de Google à Atlanta lors de tests de camions sans conducteur\nMicrosoft Surface Pro 5 n'arrive pas de sitôt : rapport\nOnePlus 7 Pro et sa triple caméra : pourquoi Netflix et National Geographic sont impressionnés\nEnchères 700Mhz : l'autre côté du spectre\nInde vs Australie 1er match T20: Comment regarder le match sur Hotstar, Airtel TV et Jio TV\napplication de médias sociaux clubhouse\nappel des niveaux de service\njouer à peste inc gratuit


Pour nous contacter, écrivez nous! En ce qui concerne les flics ça se passait comment? Quelles sont les orgas qui sont venues vous recruter? Espaces de noms Article Discussion. Il y avait une tension dans le cortège qui était palpable. Suivre son activité 5 abonnés Lire ses critiques. En savoir plus sur le film Star , sortie en VOD le 3 avril.\nMais les embrouilles entre mecs de différents quartiers ont toujours existé. Au dernier étage on avait aménagé une salle pour les cours de Boxe, de Boxe-Thaï. Il a fait de la prison à cause de ça. Espaces de noms Article Discussion. Ces basketteurs géants qui font du cinéma Breaking Bad: EnSerge Ayoub a réalisé avec la collaboration d’autres anciens ajtifa d’extrême droite, puis diffusé sur les sites d’hébergement de vidéos, un film en réponse intitulé Sur les pavés [ 4 ]. En savoir plus sur le film Starsortie en VOD le 3 avril.\nEn plus je me baladais avec un teddy vert-pomme, bonjour la discrétion! Un document rare rythmé par des entretiens exclusifs.\nLe PT cherchait des cadres. Pour être tenu au courant Inscrivez-vous.\nAprès l’indispensable Writers visible icifilm sur l’émergence du graffiti à Paris réalisé envoici Antifa, chasseurs de skinsun autre documentaire éclairant de Marc-Aurèle Vecchione sur ces bandes qui ont combattu le racisme dans les rues de Paris, au milieu des années Ce sont principalement les skinheads nationalistes qui vont antifz la chronique pour la décennie à venir, à coup de provocations et de crimes racistes.\nChacun de son côté repérait des objectifs, on préparait la descente et on tombait sur les fafs. En plus, ce tenais un discours qui était pas forcement celui du parti. Suivre son activité 47 abonnés Lire sa critique. Nouvelle publication de la Horde. Comment êtes-vous entrés en contact avec la scène des années ?\nDeux des voltigeurs ont été arrêtés et ils ont dû juste recevoir un blâme. Le documentaire replace les choses dans leur contexte et établie une bonne chronologie des faits, ce qui permet de mieux suivre et apprécier les évolutions.\nVous pouvez nous parler des Red Warriors?\nIl a fait de la prison à cause de ça. Né à Fontenay, je suis parti en colo à Fontenay, puis je suis devenu animateur à Fontenay pour ensuite finir directeur de colo à Fontenay. Antifa, chasseurs de skins. Suivre son activité 8 abonnés Lire ses critiques. Il y a eu une nana qui traînait avec nous, il y a même eu une bande de nanas, Princesse et ses copines, qui lattaient les mecs à coups de batte de base-ball.\nEt dans le même temps, est-ce que vous continuez à garder des contacts avec la scène musicale? Parmi les bandes les plus connues, on trouve dans ce programme les Red Warriors. Votre avis sur Antifa, chasseurs de skins? A cette période-là, je ne traînais déjà plus aux Halles. Comme le dit le journaliste une fois, certains skinhead antifascisme ont également suivi le mouvement antifa.\nMais les embrouilles entre mecs de différents quartiers ont toujours existé. Événements à venir Oct. Il y avait des liens avec les groupes politiques comme le Scalp? Documentaire superbe, a l’habitude du réalisateur, très explicatif. On est tous en contact plus ou moins.\nComment vous-êtes vous politisés? Très bon documentaire sur la période skin et anti-faf, un milieu et une période bien souvent trop peu connu par les générations de nos jours. Il y avait un collectif résident, et les gens de passage.\nLes visages de Daft Punk dévoilés dans un film Vidéo: Cet acte de résistance de la part de ceux[ La mairie communiste de Montreuil a fait murer le squat, après que les musiciens ont fait les balances. Ma politisation, elle a commencé en prison, par des rencontres.\nJe me considérais déjà comme redskinhead.


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France: La ministre de la Justice Christiane Taubira démissionne du gouvernement | World Vision\n« Six policiers américains renvoyés pour avoir tué deux Noirs non armés\nLa France revoit sa copie sur la déchéance de la nationalité »\nFrance: La ministre de la Justice Christiane Taubira démissionne du gouvernement\nLa ministre de la Justice, Christiane Taubira, a démissionné du gouvernement. afp.com/MARTIN BUREAU\nDans un communiqué publié ce mercredi, l’Elysée annonce que Christiane Taubira a remis sa démission à François Hollande. La ministre de la Justice justifie sa décision par « fidélité » à ses valeurs. Le député Jean-Jacques Urvoas la remplace.\nElle n’aura donc pas attendu la fin du quinquennat. Donnée maintes fois sur le départ ces dernières mois, Christiane Taubira a finalement quitté le gouvernement ce mercredi. Dans un communiqué, l’Elysée précise que la ministre de la Justice a remis sa lettre de démission à François Hollande, qui l’a acceptée. « Ils ont convenu de la nécessité de mettre fin à ses fonctions au moment où le débat sur la révision constitutionnelle s’ouvre à l’Assemblée nationale », écrit le texte.\nChristiane Taubira a en effet maintes fois exprimé son opposition à la déchéance de nationalité, mesure qui doit être inscrite dans cette loi. L’Elysée précise qu’elle est remplacée par le député PS du Finistère Jean-Jacques Urvoas, jusqu’ici président de la commission des lois. « Il portera, aux côtés du Premier Ministre, la révision constitutionnelle et préparera le projet de loi renforçant la lutte contre le crime organisé et la réforme de la procédure pénale », conclut le communiqué.\n« Résister, c’est partir »\nSur Twitter, Christiane Taubira justifie sa décision par un souci de cohérence avec ses valeurs, dans une envolée lyrique bien à elle. « Parfois résister c’est rester, parfois résister c’est partir. Par fidélité à soi, à nous. Pour le dernier mot à l’éthique et au droit », écrit-elle.\nÉtiquettes : christiane taubira, Démission, FRANCE, Gouvernement, Jean-Jacques Urvoas\nThis entry was posted on janvier 27, 2016 at 9:08 and is filed under International, Justice, Opinion, Politique, Société.\tYou can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. You can leave a response, or trackback from your own site.


Leave a Comment / Pilotes / By admin / juin 3, 2020\nLe modèle correspondant sera le fichier User. Les utilisateurs devront s’inscrire pour utiliser ce service, en complétant les informations nécessaires nom, prénom, adresse, ville, téléphone, courriel et mot de passe Les utilisateurs possédant un véhicule pourront proposer des trajets soit quotidien, soit exceptionnel. A chaque table de la base de données correspondra: Créer un sous-dossier Users , dans ce sous-dossier créer le fichier index. De plus la richesse des blogs de développeurs, tutoriels sur le web et autres centres de développement d’applications offre une source d’information très appréciable.\nUn article de Wikipédia, l’encyclopédie libre. A chaque table de la base de données correspondra: Reprenons un exemple que nous avions déjà parcouru pendant l’étude des MCD: J’aimerais utiliser maintenant la derniere version de CAKEPHP et repartir de zero, c’est qui m’inquiete, car j’ai un temps limiter pour faire ma tâche. Attention, alors que les noms de modèle sont au singulier, les noms issues des tables pour les contrôleurs sont eux au pluriel avec majuscule:. Changer le valeur du ‘Security.


Les présentes conditions de vente sont conclues d’une part par la société jouets-a-gogo. au capital de ………… euros dont le siège social est à …………, immatriculée au registre du commerce et des sociétés de ………… sous le numéro ………… ci-après dénommée « jouets-a-gogo » et d’autre part, par toute personne physique ou morale souhaitant procéder à un achat via le site Internet de « jouets-a-gogo » dénommée ci-après « l’acheteur ».\nLes présentes conditions de vente visent à définir les relations contractuelles entre jouets-a-gogo et l’acheteur et les conditions applicables à tout achat effectué par le biais du site marchand de jouets-a-gogo, que l’acheteur soit professionnel ou consommateur. L’acquisition d’un bien ou d’un service à travers le présent site implique une acceptation sans réserve par l’acheteur des présentes conditions de vente.\nCes conditions de vente prévaudront sur toutes autres conditions générales ou particulières non expressément agréées par jouets-a-gogo. jouets-a-gogo se réserve de pouvoir modifier ses conditions de vente à tout moment. Dans ce cas, les conditions applicables seront celles en vigueur à la date de la commande par l’acheteur.\nLes produits et services offerts sont ceux qui figurent dans le catalogue publié dans le site de jouets-a-gogo Ces produits et services sont offerts dans la limite des stocks disponibles. Chaque produit est accompagné d’un descriptif établi par le fournisseur; pour certains d’entre eux, portant la mention DF, l’acheteur peut avoir accès à la documentation du fournisseur.\nLes prix figurant dans le catalogue sont des prix TTC en euros tenant compte de la TVA applicable au jour de la commande; tout changement du taux pourra être répercuté sur le prix des produits ou des services. jouets-a-gogo se réserve de modifier ses prix à tout moment, étant toutefois entendu que le prix figurant au catalogue le jour de la commande sera le seul applicable à l’acheteur. Les prix indiqués comprennent [ou ne comprennent pas] les frais de traitement de commandes, de transport et de livraison pour autant qu’elles aient lieu dans les zones géographiques prévues ci-après.\nLes livraisons sont faites à l’adresse indiquée dans le bon de commande qui ne peut être que dans la zone géographique convenue. Les risques sont à la charge de l’acquéreur à compter du moment où les produits ont quitté les locaux de jouets-a-gogo\nLe vendeur, dans le processus de vente en ligne, n’est tenu que par une obligation de moyens; sa responsabilité ne pourra être engagée pour un dommage résultant de l’utilisation du réseau Internet tel que perte de données, intrusion, virus, rupture du service, ou autres problèmes involontaires. Propriété intellectuelle Tous les éléments du site de jouets-a-gogo sont et restent la propriété intellectuelle et exclusive de jouets-a-gogo\nPersonne n’est autorisé à reproduire, exploiter, rediffuser, ou utiliser à quelque titre que ce soit, même partiellement, des éléments du site qu’ils soient logiciels, visuels ou sonores. Tout lien simple ou par hypertexte est strictement interdit sans un accord écrit exprès de jouets-a-gogo\nConformément à la loi relative à l’informatique, aux fichiers et aux libertés du 6 janvier 1978, les informations à caractère nominatif relatives aux acheteurs pourront faire l’objet d’un traitement automatisé. jouets-a-gogo se réserve le droit de collecter des informations sur les acheteurs y compris en utilisant des cookies, et, s’il le souhaite, de transmettre à des partenaires commerciaux les informations collectées.\nLes acheteurs peuvent s’opposer à la divulgation de leurs coordonnées en le signalant à jouets-a-gogo De même, les utilisateurs disposent d’un droit d’accès et de rectification des données les concernant, conformément à la loi du 6 janvier 1978. Le traitement automatisé d’informations, y compris la gestion des adresses e-mail des utilisateurs du site a fait l’objet d’une déclaration à la CNIL le ………… enregistrée sous le numéro …………\njouets-a-gogo archivera les bons de commandes et les factures sur un support fiable et durable constituant une copie fidèle conformément aux dispositions de l’article 1348 du Code civil. Les registres informatisés de jouets-a-gogo seront considérés par les parties comme preuve des communications, commandes, paiements et transactions intervenus entre les parties.


AIRG-Suisse, association d'informations sur les maladies rénales\nL’AIRG-Suisse a été fondée en 2004 par des néphrologues et pédiatres du CHUV ainsi que des patients. Elle s’est donnée pour missions d’informer sur les différents aspects des maladies rénales génétiques, de soutenir financièrement des projets de recherche, d’accompagner les familles touchées par cette problématique.\nLors de sa création, ce sont surtout les médecins qui mettaient en relation leurs patients et l’association. Mais dans sa volonté de participer activement à ce travail d’information et de recherche, l’AIRG a décidé de revoir ses documents de promotion.\nNous avons réalisé pour eux: cartes de visite, dépliant institutionnel, affiches diverses pour leurs événements, mais également leur site web et une animation vidéo pour compléter les dépliants.\nLe matériel de communication de l’AIRG se résumait surtout à leur logo lorsqu’ils nous ont approché pour les aider à développer leur communication. Nous leur avons proposé un visuel simple mais clair dans la ligne médical de l’association et amené une refonte totale de leur dépliant, principal document de communication. Nous nous sommes également occupé de leur donner un site web simple mais clair qui permet une communication efficace avec les membres et les personnes désireuses de connaître l’association.\nAvant notre intervention, l’AIRG-Suisse ne possédait qu’un document sommaire avec des textes parfois indigestes sachant que ce dépliant s’adresse avant tout aux malades et leur famille. Nous avons commencé par réduire la quantité de texte au profit de pictogrammes, plus ludiques et vivants et réagencer l’information pour plus de clarté. De leur logotype existant, nous avons tiré les couleurs dominantes qui habille le dépliant. Les pictogrammes, fait main, amènent un aspect humain bienvenu.\nL’AIRG-Suisse a fêté ses 15 ans en 2019 et a, pour l’occasion, organisé un symposium au CHUV. Conférences, témoignagnes, table ronde, intervenants d’Europe et de Suisse.\nPour mettre en valeur les principales missions et buts de l’association, nous avons créé un visuel rempli de dessins évoquant toutes leurs facettes.