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CN107250147 Universal methylation profiling methods\n1. CN107250147 - Universal methylation profiling methods\nDNA甲基化是具有多个调节功能(比如X染色体失活、基因组印迹和反转录转座的抑制)的重要的表观遗传学机制(Goll and Bestor 2005)。这种甲基化方法涉及通过被称为DNA甲基转移酶(Mtases)的酶甲基从S-腺苷L-甲硫氨酸(AdoMet)转移到胞嘧啶(C)的C5碳以产生5-甲基胞嘧啶(5mC)(Goll and Bestor,2005)。人类基因组包含～2800万个CpG位点，其中约70％在胞嘧啶的5位处甲基化(爱德华兹等，2010(Edwards et al.,2010))。异常或反常的DNA甲基化已经与越来越多的人类疾病有关，该人类疾病包括免疫缺陷、着丝粒不稳定(Centromere instability)和面部异常(ICF)综合症、脆性X综合征以及其它的发育疾病、年龄相关的神经变性病症、糖尿病和癌症有关(罗伯森等，2005(Robertson et al.,2005)，由Goll和Bestor修订,2005)。因此，越来越多地研究了DNA甲基化状态的表观遗传变化在正常表型改变和疾病相关的表性改变两者中的作用，包括由NIH发起的路标表观基因组项目(Roadmap Epigenomics Project)以建立多种细胞类型的参考表观组。为了完成所述目标，可以以单碱基分辨率和高通量全面地分析DNA甲基化状态的全基因组方法和技术是至关重要的(苏祖基等，2008，莱尔德，2010(Suzuki et al.,2008,Laird,2010))。\n已经开发了超过30种甲基化分析技术，但是其都具有缺点(莱尔德，2010(Laird,2010))。认为由苏珊克拉克(Susan Clark)和玛丽安弗罗默(Marianne Frommer)在1994年报道的亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)(克拉克等，1994(Clark et al.,1994))是最有用的方法。然而，BGS具有一些严重缺点：(1)在亚硫酸氢盐转化产生序列时存在严重的序列信息丢失，所述序列不能与基因组对齐；(2)对GC富集序列的强烈偏好(爱德华兹等，2010(Edwardset al.,2010))；(3)亚硫酸氢盐转化人工产品(artifacts)，以及(4)由于在严苛反应条件下的高速链断裂，需要大量的长起始DNA(瓦内克等，2002，1997(Warnecke et al.,2002,1997))。尽管超过30项技术的发展，实现了鉴定DNA的甲基化状态(甲基化组分析)，全基因组甲基化模式的确定依然是麻烦的且昂贵的(Clark et al.,1994)。为进一步促进全基因组DNA甲基化分析，需要克服上述局限性的重大改进或新方法。\n其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR'；\n前提条件是，当R是 且n为1时，R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H。\n前提条件是，当R是 且n为1时，R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H，\n前提条件是，当R是 且n是1时，R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H。\n其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R″、CN、NO 2 、C(O)R″、S(O) 2 NHR″；\n前提条件是，当R'是 且n为1时，R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H，\n图8.含有光反应性部分的AdoMet类似物的实例结构。R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR'；X是O或NR'；R'是H或烷基；并且n＝l至8。\n图13.当C经长波吸收双键(long-wavelength absorbing double bond)(比如苯基修饰的烯烃)修饰时，通过环加成中间体DNA中的利用酶修饰的C向U衍生物的光催化转化。\n图14.Ru(bpy) 3 2+的双途径光催化机制，所述Ru(bpy) 3 2+是可进行缺电子烯烃和富电子烯烃两者的[2+2]环加成的多功能光催化剂。\n图15.A.当C用缺电子双键修饰时，通过环加成中间体进行的Ru(bpy) 3 2+-可见光催化的DNA中的5-位修饰C向U的光转化。B.当C用富电子双键修饰时，通过环加成中间体进行的Ru(bpy) 3 2+-可见光催化的DNA中的5-位修饰的C向U的光转化。\n图25. 5-PhAll-OMC向5-PhAll-OMU的光化学转化。(1.)直接的光解或三重态敏化(triplet sensitization)引发了[2+2]环加成。(2.)C的伯胺基被氧化为羰基。由于C中双键的丢失，该反应在水溶液(pH＝7)中自发地发生。(3.)在最后步骤，环裂可生成5-PhAll-OMU。类似的dT衍生物的环裂已经在文献中被报道了(Matsumura,et al.,2008,Fujimoto,et al.,2010)。\n图26.上图，在三重态敏化剂噻吨酮(triplet sensitizer thioxanthone)(TX；如右上角顶部的图显示的)存在下光辐照之前的5-PhAll-OMC(如顶部中间的上图所示)的HPLC分析。插图显示了TX和5-PhAll-OMC紫外吸收光谱；注意到，350nm的光不与胞嘧啶相互作用但是由TX强烈吸收。下图：用350nm光光辐照20min之后的分析。虽然敏化剂(TX)的浓度保持不变，5-PhAll-OMC被大部分消耗掉并且新的光产物出现了。主要的光产物被分离并且由MS、1H-NMR和13C-NMR鉴定为U的环丁基衍生物，直的加合物或交叉的加合物(如下图左侧所示的)。\n图28.光敏剂共轭模型化合物(photo-sensitizer conjugated model compound)(TX-Ph-C)的合成。TX光敏剂到光活性基团的并入会增加去氨基反应的专一性和效率。\n图32.化合物肉桂醇(环形)和图21中的模型化合物5-PhAll-OMC在乙腈(ACN)溶液中的荧光光谱(λex＝282nm)。该图显示了当共价连接到C时由于单重态能量转移到C和/或[2+2]环加成苯丙烯双键(cinnamyl double bond)为C，苯丙烯醚发色团(苯乙烯发色团)的荧光是高效淬火的。\n图33.为了通过激光闪光光解确定从三重态敏化剂噻吨酮向PhAll-OMC的苯乙烯发色团的三重态能量转移的速率常数，使用了包含苯乙烯发色团的模型化合物肉桂醇。噻吨酮的光致激发产生了三重态，其由肉桂醇淬火，具有速率常数k q ＝7.8x 109M-1S-1，其接近于有可能三重态能量转移的最大速率常数。\n“核酸”可意指任何核酸分子，包括，但不限于，DNA、RNA及其杂合体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及其衍生物。这些碱基的衍生物是本领域公知的，并且在《PCR系统、试剂和消耗品》(PCR Systems，Reagents and Consumables)(珀金埃尔默目录1996至1997年，罗氏分子系统公司，布兰奇，新泽西州，美国(Perkin Elmer Catalogue1996-1997,Roche Molecular Systems,Inc.,Branchburg,New Jersey,USA))中举例说明。\n“杂交”可意指基于序列互补性使一条单链核酸与另一条核酸退火。在核酸之间的杂交倾向取决于其环境的温度和离子强度、核酸的长度以及互补程度。这些参数对杂交的影响是本领域公知的(参见萨姆布鲁克J，弗里奇EF，马尼亚蒂斯T.1989.分子克隆：实验室手册.冷泉港实验室出版社，纽约(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.1989.Molecularcloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.))。\n其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR'；\n前提条件是，当R是 或当R是 且n为1时，R 1 或R 2 至少一个不为H。\n且n为1时，R 1 或R 2 中的至少一个不为H。\n前提条件是，当R是 或当R是 且n为1时，R 1 或R 2 的至少一种不为H。\n其中R 1 和R 2 独立地为H烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR'；\n其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R″、CN、NO 2 、C(O)R″、S(O) 2 NHR″；\n在一个或多个实施例中，所述光催化反应使用三(联吡啶)钌(II)氯化物(Ru(bpy) 3 2+)催化剂来进行。\n在一个或多个实施例中，所述(Ru(bpy) 3 2+)催化剂是Ru(bpy) 3 Cl 2 。\n在一个或多个实施例中，所述(Ru(bpy) 3 2+)催化剂是Ru(bpy) 3 (PF 6 ) 2 。\n本发明提供了用于甲基化分析的方法。用于甲基化分析的方法公开于美国专利申请公开号US 2011-0177508 Al中，其在此通过引用并入本文。\n本发明提供了DNA甲基转移酶的用途。DNA甲基转移酶的实例包括但不限于M.SssI、M.HhaI和M.CviJI以及经修饰的M.SssI、M.HhaI和M.CviJI。主要将这些酶修饰为具有降低的特异性以使得在AdoMet类似物上的R基团可被更有效地转移到未甲基化的C残基上，包括在DNA中的CpG位点的环境中。这样的经修饰的M.SssI和M.HhaI基因的实例已经描述于文献(刘克纳维卡斯等(2012)改造DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶反应以用于DNA的序列特异性标记《核酸研究》,40(22),11594-602；Kriukiene等(2013)通过CpG位点的共价捕获的DNA未甲基化分析.《自然》第4卷:doi:10.1038/ncomms3190(Lukinavicius et al(2012)Engineering the DNA cytosine-5methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA.Nucleic Acids Res 40:11594-11602；Kriukene et al(2013)DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites.NatureCommun 4:doi:10.1038/ncomms3190))。\n本发明还提供了即用的方法和过程，其中将DNA与固体基底相结合。本发明还提供了即用的方法，其中DNA是通过1,3-偶极叠氮化物-炔的环化加成化学反应与固体基底结合。本发明还提供了即用的方法和过程，其中DNA是通过聚乙二醇分子与固体基底结合的。本发明还提供了即用的方法和过程，其中DNA炔标记的。本发明还提供了即用的方法和过程，其中DNA是通过聚乙二醇分子与固体基底结合的，而且所述固体基底是叠氮化物-官能化的。本发明还提供了即用的方法和过程，其中DNA是通过叠氮连接、炔基连接，或者生物素-抗生蛋白链菌素相互作用固定在固体基底上的。核酸的固定化在由克里斯汀维特曼(2005)编著的《DNA在芯片II上的固定化》，斯普林格出版公司，柏林(ImmobilizationofDNA on ChipsII,edited by Christine Wittmann(2005),Springer Verlag,Berlin)中描述，其在此通过引用并入本文。本发明还提供了即用的方法和过程，其中DNA是通过聚乙二醇分子与固体基底结合的，而且所述固体基底是叠氮化物-官能化的，或者DNA是通过叠氮连接、炔基连接或者生物素-抗生蛋白链菌素相互作用固定在固体基底上的。在一个实施例中，DNA或核酸是通过与DNA相容的共价位点-特异偶联化学作用与固体表面连接/结合的。\n特定序列的DNA甲基化首先通过南方印迹技术(Southern blotting)来分析，其是先用对甲基化敏感的限制性核酸内切酶(MSRE)，如HpaII来裂解，但当中心CpG二核苷酸为甲基化时，其无法裂解序列5'-CCGG-3'(瓦尔韦克和弗拉维尔，1978(Waalwijk andFlavell,1978))。所述方法很强烈，并且当用于未甲基化的且存在于许多拷贝中的线粒体DNA的印迹被反复探测时，所述方法为完全消化提供了内部的控制。但是，MSRE方法冗长且昂贵，需要相对大量的放射性核苷酸，并且对于每个片段只能检验少量的CpG位点，因为所有CpG位点中仅有～20％落在已知MSRE的识别序列中。如果给定的片段含有许多CpG位点，而只有一个或者几个位点是未甲基化的，则通常将所述序列评分为未甲基化的。MSRE提供了最佳控制的甲基化分析方法，但是其低通量和其它缺点意味着其不能构成全基因组甲基化分析平台的基础。\n已经开发出用于单个或少量CpG位点快速甲基化分析的许多其它的基于PCR的方法；例如甲基化敏感的PCR(MSP；施泰格瓦尔德等，1990(Steigerwald et al.,1990))、COBRA(伊兹和莱尔德，2002(Eads and Laird,2002))和甲基-光(郑等，2001(Trinh etal.,2001))。这些方法快速且便宜，但只能检验少量的CpG位点；其不适于无偏好性的全基因组甲基化分析。在发现了特定的甲基化异常与特定的病症有关之后，这些关注的方法或许适用于临床样本的诊断和预后测试。\n微阵列分析法的应用已经取得了很大的成功(例如，敬田等，2002(Gitan et al.，2002))。但是，微阵列法不能确定重复序列(其包含基因组中大多数的5-甲基胞嘧啶；罗林斯等，2006(Rollins et al.,2006))的甲基化状态，并且CpG岛由于其高的G+C含量产生高的噪声水平。微阵列法不能检查每个CpG二核苷酸的甲基化状态。再次，尽管所述方法有其优点，但其不适合于全基因组的甲基化分析。\n甲基化分析的重要进展来自苏珊克拉克(Susan Clark)和玛丽安弗罗默(Marianne Frommer)在1994年引入了亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)(克拉克等，1994(Clarket al.,1994))。BGS依靠亚硫酸氢钠对胞嘧啶4-位上的氧化脱氨基能力，从而将碱基转化为尿嘧啶。在5-位上的甲基防止了亚硫酸氢盐跨5-6双键的加成，其使得5-甲基胞嘧啶抗亚硫酸氢盐转化。PCR扩增，接着DNA测序产生C泳道，其中的每个条带对应于起始DNA中的5-甲基胞嘧啶；所有未甲基化的胞嘧啶被测序为胸腺嘧啶。BGS是一项超越早期的基因组测序方法的重大进展(丘奇&吉尔伯特，1984(Church&Gilbert,1984))。\n但是，当用于全基因组甲基化分析时，BGS有严重的缺点。首先，除非一个序列在存在亚硫酸氢盐处理和不存在亚硫酸氢盐处理两种情况下并比较结果，否则BGS不能知道在终序列的胸腺嘧啶是在起始物质中的胸腺嘧啶或胞嘧啶。这就大大降低了DNA的信息含量。结果，就不用新的超高通量的DNA测序方法，由于序列读数短，很大百分比的序列不能在基因组图的单一位置上绘制出来。几乎没有什么重复序列能在图上表示出来。BGS主要限制在基因组预先选择的区域内，在所述区域内可设计引物以选择性地扩增目的区域。通过这种方法不能获得全基因组的甲基化分析，这是因为基因组的许多区域不允许设计独特的成套引物的缘故。CpG岛尤其成问题，因为不含CpG二核苷酸的引物位点不能在大多数的CpG岛中发现。其次，亚硫酸氢盐转化要求DNA是单链的；任何双链DNA将抵抗转化并被评分为甲基化了的。结果，亚硫酸氢盐处理必须在十分苛刻的条件下进行(0.2N氢氧化钠，在升高温度条件下进行数小时)。在这样的条件下，亚硫酸氢盐转化与键断裂是竞争反应，只有当95％以上的DNA被裂解成小于350bp时，亚硫酸氢盐转化才会趋于完全(瓦内克等，2002(Warneckeet al.，2002))。这就意味着必须使用大量的起始DNA，而且DNA—定要长。这就妨碍了使用石蜡切片的DNA，其中DNA几乎都<300bp，并且还妨碍了使用少量DNA，如在早期胚胎、小组织切片检查的情况下以及其他大量的DNA不能获得的情况。第三，在某些序列环境中，CpG二核苷酸固有地抵抗亚硫酸氢盐转化(瓦内克等，2002(Warnecke et al.,2002))，被评分为甲基化的假位点。第四，所有C-G碱基配对的缺失给PCR扩增步骤带来很大的偏好性，其有利于从未转化的或已经甲基化了的起始物质衍生而来的PCR产物(瓦内克等，1997(Warnecke etal.，1997))。每一个这样的人工产品都可能是严重的。\n过去几年中，所述实验室已经开发出新的方法将正常人类基因组分段成甲基化的和未甲基化的区室，并且已经确定了来自分段的基因组的超过3千万个碱基对的CpG二核苷酸的甲基化状态以表征正常人类基因组的甲基化概况(罗林斯等，2006(Rollins et al.，2006))。在那项研究中，开发了新的计算方法将基因组的注解特征绘制在非常大的序列数据的集合上。尽管这个依赖于将DNA用酶分段成甲基化的和未甲基化的区室的方法提供了更多CpG位点的甲基化状态信息，其要比所有其他方法加起来的总数还多，但它还是不能进行全基因组的甲基化分析，因为现有技术尚不能克服它的缺点。\n甲基化异常的实例通过罗林斯等，(2006)(Rollins et al.，(2006))的方法来识别。应注意，本文公开的方法可用于任何测序的基因组；乳腺癌被表征了是因为已知在这些细胞的基因组中存在高度异常的甲基化模式，并且这些基因组提供了出色的测试系统。\n柯雷马桑斯卡斯(Klimasauskas)和温霍尔德(Weinhold)组先前的研究工作(达尔霍夫等，2006a，2006b(Dalhoff et al.，2006a，2006b))已经表明多种官能团可以通过合成的AdoMet类似物由DNA甲基转移酶有效地转移到DNA中胞嘧啶的5-位上，在AdoMet类似物中甲基已经被多种官能团的任意一种所取代。具体地说，Dalhoff et al.(2006a)用一系列取代甲基的官能团合成了合成的AdoMet变异体，其还实现了DNA甲基转移酶的有效运行。接着Dalhoff et al(2006b)证实了通过使用DNA甲基转移酶具有基本上100％效率，多种官能团向胞嘧啶和鸟嘌呤重复(CPG位点)的DNA位点中Cs的5位转移。\nHaga et al.(1993)证实了在丙酮中的2.3-二甲基-2-丁烯存在下胞嘧啶到相应的环丁烷光加合物(通过光引发的增加两种或以上反应物形成的产品)的光转化(在光的影响下的转化)。这种化学过程由Matsumura et al.,(2008)和Fujimoto et al.(2010)应用用于C到U的DNA上的转化。申请人的调查试图应用从这些关于AdoMet、使用甲基转移酶的酶促转移和C到U的光转化的调查研究导出的知识以设计新颖的方法用于单细胞、全基因组甲基化组分析。\n开发了基于独特且新颖方法的优越的甲基化分析方法。柯雷马桑斯卡斯(Klimasauskas)和温霍尔德(Weinhold)组(达尔霍夫等，2006a，2006b(Dalhoff et al.,2006a 2006b))合成了S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)类似物，其中甲基已经被多种官能团所替代，并表明DNA甲基转移酶能够特异性地将这些官能团转移到在DNA CpG位点中的胞嘧啶的5位上。效率基本上为100％(达尔霍夫等，2006a，2006b(Dalhoff et al.,2006a,2006b))。因此，DNA甲基转移酶已经用于大量化学基团与DNA的序列特异性、共价连接，为大量天然DNA的精确、靶向官能化和标记提供了新的分子工具。\n开发了基于DNA甲基转移酶辅助的在未甲基化的CpG二核苷酸中的C的位点特异性转化的新全基因组甲基化分析方法。在所述方法中，将用C-反应性官能团衍生的AdoMet类似物用作DNA甲基转移酶的底物以将反应性官能团转移到在未甲基化的CpG二核苷酸中的C的5位上(图1)。例如，CpG位点特异性细菌DNA甲基转移酶M.SssI(其通过使用AdoMet作为供体使得所有的CpG二核苷酸甲基化)可被使用以促使未甲基化的CpG二核苷酸中的C's到U's的化学转化；这通过酶的精确的CpG位点识别和在C的5位的键的形成的高选择性实现(Renbaum et al.,1990)。AdoMet类似物被开发了，实现M.SssI直接转移基团到DNA的未甲基化C's以便于这些经修饰的CpG C's向U's的高效光转化，具有对DNA的最小损伤。在中性水溶液中，这些利用酶连接的反应性基团或官能团引发高效分子内反应，导致C转化为U类似物。在转化之后，转化的DNA的高通量DNA测序提供了单个碱基分辨率甲基化分析；未甲基化的胞嘧啶被测序为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶被测序为胞嘧啶。\n第三、亚硫酸氢盐转化还面对需要单链DNA的劣势；双链DNA对转化是耐药的并且甚至当未甲基化时被读为甲基化的。因此，亚硫酸氢盐治疗必须在非常严格的条件(在高温下，0.2N NaOH，数小时)下进行，使得使用大量的最初的DNA成为必要(Warnecke et al.,2002)。\n第四、BGS的可靠性进一步通过在某些序列环境下的CpG二核苷酸的耐受性被减小到亚硫酸氢盐转化(Warnecke et al.,2002)。\n第五、转化步骤之后的PCR(聚合酶链反应即扩增DNA的方式)扩增步骤有利于从未转化或甲基化的原始材料得到的产物，引入较大的偏离(Warnecke et al.,1997)。相反，由于其特异性、高效性和温和的转化条件，DNA甲基转移酶辅助的C的光转化有希望消除BGS的缺陷，比如信息含量的丢失、非CpG胞嘧啶的反应性和大量的长的DNA(作为原始材料)的需要。\n在DNA甲基转移酶的化学和生物学研究中的进展已经产生了新的工具试剂盒来化学修饰在未甲基化CpG中的C的5位从而引发在所述特定C上的转化反应。研究了在DNA中的合适的C到U转化的多种化学机制。例如，据报道，光辐照可通过2+2环加成在烯烃与C的5,6位双键之间产生5,6-环丁烷中间体，导致共轭体系的中断，以及在4位上的脱氨基化(芳贺町等，1993(Haga et al.,1993))。值得注意的是，所述化学法已经用于在DNA上的C向U转化(松村等，2008，藤本吉秀等，2010(Matsumura et al.,2008,Fujimoto et al.,2010))。\n对于酶辅助的位点特异性C向U转化，先决条件是5位连接的化学转化部分应能够触发分子内反应导致C向U的转化。虽然从未报道过这样的实例，但是通过设计和合成脱氧胞苷来开始本研究，其中脱氧胞苷的5位上衍生有光反应性部分。通过连接插入C的双键与5位之间的具有1至5个碳单元的含双键的链来设计5位修饰的C。已经合成了模型化合物之一5-烯丙氧基甲基-dC(5-ALL-OMC)，其中双键是来自5位的3碳单元，随后在图2中示出了合成路线。产物通过HR MS和1H NMR进行完全表征。\n然后，在水溶液中在约300nm下进行5-ALL-OMC的光辐照长达12小时，并通过HPLC和UV吸收来分离和监测反应产物。MS和HPLC图谱显示5-ALL-OMC(MW 298)以光化学方式高效地转化为新产物5-All-OMU(MW 299)(图3)。\n为了测试光化学方法用于在真正的DNA链上将C转化为U的可行性，合成了完全受保护的5-ALL-OMC亚磷酰胺(图6)并且通过标准寡核苷酸合成法将5-ALL-OMC(C*)掺入16聚体寡核苷酸5'-TACGA(C*)GAGTGCGGCA-3'中。在HPLC纯化之后，通过MALDI-TOF MS来表征修饰的16聚体，产生MW为5001的峰，等于所计算的质量。然后，进行寡核苷酸5'-TACGA(C*)GAGTGCGGCA-3'的光辐照以将C*转化为U类似物。在DNA中的C*转化结果通过使用单碱基延伸MS分析来检测(图7)。在所述分析中，将光辐照的寡核苷酸用引物5'-TGCCGCACTC-3'(MW2964)进行退火，然后用ddNTP和DNA聚合酶孵育。在DNA聚合酶的帮助下，可将4个ddNTP中的一个选择性地掺入引物的3'端。光化学诱导的C向U的转化应能够引导ddA的掺入，产生MW为3261的延长的引物，否则应掺入ddG得到MW 3277的延长的引物。\n一个碱基延长的引物(one-base elongated primer)的实际MS测量示出MW为3261，其与掺有单个ddATP的引物的MW相匹配，因此，确认了在模板上存在互补的U，并证明了在DNA上的C*向U类似物的光化学转化(图7上面)。在对照实验中，在相同条件下进行未修饰的对应物5'-TACGACGAGTGCGGCA-3'的光辐照。所得引物延长产物的单碱基延伸MS分析给出MW为3277，其与用单个ddGTP延伸的引物的MW相匹配(图7下面)，清楚地表明在DNA片段中只有将C的5位用光反应性部分修饰，才能将其高效地转化为U类似物。还测量了可能的光辐照诱导的DNA损伤。在所使用的条件下(300nm，经过10小时)，没有观察到DNA损伤。\n(1)光活性基团(R)包括烯烃(图8，a、b、c、d、e)，其在光辐照时与C的5,6双键形成了环丁烷中间体，并且进一步导致C向U的转化。光活性基团(R)还包括用R 1 、R 2 和R 3 修饰的烯烃，其促进光反应。R 1 、R 2 和R 3 为氢、烷基、芳基、酰胺、羧酸、酯、硝基、氰基、醛基、酮和磺胺。这样的烯烃或R 1 、R 2 和R 3 修饰的烯烃可通过多个长度的碳链(n＝1至8)从AdoMet类似物的硫原子上分离。可将烷基链或可化学断裂的结构(如酯连接子)插入AdoMet类似物中的上述烯烃与硫原子之间。\n基于上述实验结果来设计AdoMet衍生物并且鉴定了所合成的AdoMet衍生物的可能文库。根据报道的方法(达尔霍夫等，2006a，2006b(Dalhoff et al.,2006a,2006b))通过在温和的酸性条件下使用光反应性部分的相应三氟甲磺酸酯或溴化物进行的AdoHcy的区域选择性S-烷基化来进行具有期望的延伸的侧链的AdoMet类似物的合成(图10)。在AdoHcy烷基化之后，预期得到锍的立体异构体混合物，进一步进行RP-HPLC纯化以分离酶活性的S-差向异构体以用于后续转移反应。以AdoMet类似物作为底物，使用CpG位点特异性DNA甲基转移酶(M·SssI)将光反应性基团转移到在合成的DNA和基因组DNA样品两者上的未甲基化胞嘧啶的5位上(图11)。将MALDI-TOF MS用于评估反应性部分转移到DNA上的效率。此外，使用上文所获得的优化反应条件来进行C向U的位点特异性光化学转化。将单碱基延伸实验(图7)用于研究在DNA上的转化效率。\n在C到U类似物的DNA甲基转移酶辅助的CpG位点特异性转化确认之后，由乳房癌细胞系MCF-7(对于其具有非常大量的甲基化数据)可确定在实际基因组DNA制备中的甲基化模式。通过蛋白酶K消化、苯酚提取以及针对10mMTris HCl，pH 7.2的透析来纯化DNA。然后，使DNA与上文所鉴定的最佳AdoMet衍生物和M·SssI(纽英伦生物技术有限公司(NewEngland Biolabs,Inc.))反应。然后，使衍生的DNA经历高通量DNA测序(图11)，将在NCBI参考序列中显示为TpG的CpG二核苷酸评分为在起始DNA中的未甲基化CpG二核苷酸。已经开发并验证了所需软件(爱德华兹等，2010(Edwards et al.,2010))。\n一些细胞类型包含非CpG甲基化(利斯特等，2009(Lister et al.,2009))，其功能目前尚未知。通过M.SssI方案的简单修饰来取代M.CViJI，可绘制出所有非CpG甲基化的～22％，M.CViJI使GpC二核苷酸中的胞嘧啶甲基化(许等，1998(Xu et al.,1998))，对于M.SssI，其特异于CpG二核苷酸。\n在可用来研究DNA中的合适的C向U转化的多种化学机制中，可转化C(其在5位上未甲基化)为U衍生物的最有希望的化学机理是烯烃和C的5,6位双键之间的光辐照介导的[2+2]环加成。光辐照介导的[2+2]环加成导致C中共轭体系的中断且产生了烯烃与5,6位双键之间的5,6-环丁烷中间体。由于共轭体系的中断，在4位上的进一步脱氨基化(芳贺町等，1993(Haga,et al.,1993))可容易地发生，导致U衍生物的形成。值得注意的是，已经将所述化学作用应用于在DNA上的C向U转化(松村等，2008，藤本吉秀等，2010(Matsumura,et al.,2008,Fujimoto,et al.,2010))。甲基化的C不能经历具有烯烃底物的[2+2]环加成并且因此在该方法中不能转化为U。\n或者，除了促进C向U光转化的多种5位修饰基团之外，通过使用与光催化剂三(联吡啶)钌(II)氯化物(Ru(bpy) 3 2+)组合使用的可见光将温和且有效的光反应条件应用于在实际DNA中的C向U转化。\n用可见光(λmax＝452nm)辐照Ru(bpy) 3 2+产生光激发状态Ru*(bpy) 3 2+，其可从相对富电子的胺碱基提取电子。然后，所得Ru(bpy)3+复合物将芳基烯酮还原为参与[2+2]环加成的关键自由基负离子中间体。在另一方面，Ru*(bpy) 3 3+还可将电子传给电子受体，然后，所得Ru(bpy) 3 2+使富电子苯乙烯氧化，提供可经历后续[2+2]环加成的自由基正离子。因此，无论是经过还原淬灭循环(reductive quenching cycle)还是氧化淬灭循环，Ru*(bpy) 3 2+均证明为烯烃的[2+2]光环加成的有力光氧化还原催化剂(艾斯查等，2008；2010；杜等，2009(Ischay et al.,2008；2010；Du et al.,2009))。其双途径光催化机制使Ru(bpy) 3 2+成为可进行缺电子烯烃和富电子烯烃两者的[2+2]环加成的多功能光催化剂(Michael,et al.,2008；2010)(图14)。所述优点提供了广泛的缺电子烯烃和富电子烯烃两者，从其中可筛选和优化可用于设计和合成AdoMet类似物的合适的含双键种类。当通过使用DNA甲基转移酶和这样的AdoMet类似物作为底物将光反应性部分连接在CpG位点的5位上时，通过Ru2+-可见光光催化完成后续的C向U转化。因此，组合作为光催化剂的该Ru2+复合体的使用和具有CpG修饰的DNA的可见光辐照提供了针对位点特定的C向U转化的另一个选项。\n图15示出Ru(bpy) 3 2+-可见光催化DNA中的5位修饰的C向U的光转化的两个实例。Ru(bpy) 3 2+复合物的实例可以为Ru(bpy) 3 Cl 2 和Ru(bpy) 3 (PF 6 ) 2 。可见光光催化反应混合物包含Ru(bpy) 3 2+复合物、叔胺(例如，N,N-二异丙基乙胺(i-Pr 2 Net))、季铵阳离子(如MV(PF 6 ) 2 、甲基紫或MV2+)、Mg2+或Li+。光源可以为普通家用灯泡或激光(波长为400nm至600nm)。\n来自螺原体物种的细菌限制性甲基转移酶M.SssI正常地转移锍连接的甲基基团从S-腺苷L-甲硫氨酸(AdoMet)到双螺旋DNA的胞嘧啶-磷酸酯-鸟苷(CpG)二核苷酸中的胞嘧啶残基的5位。之前的研究已经表明了M.SssI可转移其它的锍连接的部分从合成的AdoMet衍生物到DNA，正如在Klimauauskas et al.,U.S.Patent ApplicationPublication No.2012/0088238 Al中所描述的。Kriukiene et al.(2013)证明了在替换谷氨酸盐142和天门冬素(Aspargine)370为丙氨酸时M.SssI转移酶活性增加100倍。然而，虽然有利的选择性减小产生了，几乎确定的是，由于AdoMet结合位点增加的疏水性和AdoMet结合位点中氨基酸侧链的尺寸的急剧减小引起了酶活性的有害的下降。进行了类似的M.SssI的诱变并且还生成具有被替换为丝氨酸的谷氨酸盐142和天门冬素(Aspargine)370的突变体。\n下面的菌株被用于表达M.SssI:大肠杆菌K12菌株ER1821F-glnV44el4-(McrA-)rfbDl relAl endAl spoTl thi-1·(mcrC-mrr)114::IS10(Wait-Rees et al 1991)。该菌株是从新英格兰生物实验室得到。\n在LB介质中，在37℃，细菌正常地生长[Sambrook,1989]。通过采用标准的CaCl 2 方法在化学上它们被使得有竞争力的(Tu et al.,2008)。有竞争力的细胞具有～107cfu/ugDNA的转化效率。通过采用标准的丙三醇协议，一批细胞也被使得是电转化感受态的[Sambrook,1989]。电转化感受态细胞具有～108cfu/g DNA的转化。\n表达载体pCAL7被选择，因为它指导存在于螺原体物种内的DNA M.SssI变异体的表达并且具有与哺乳动物DNA甲基转移酶(CpG)相同的序列特异性，但是更高的转化数(turnover number)以及不需要半甲基化的底物(Renbaum and Razin,1992)。\npCAL7是被用于表达CpG特异性的DNA甲基转移酶M.SssI的7.4kb质粒。定向诱变被用于通过使结合辅因子的袋(cofactor-binding pocket)中的两个保守位置(Q142A/N370A)突变设计野生型M.SssI为His标记的突变的变异体。按照Tu et al.,2013协议进行质粒转化。通过采用来自富酶泰斯(生物技术公司)(Fermentas Life Sciences)的GeneJET质粒小量提取试剂盒(GeneJET Plasmid Miniprep Kit)进行质粒的小规模制备。\n引物经设计用于插入6x His标记物、定向诱变和测序(用于验证序列中的突变)。通过采用Stratagene软件，用于诱变的引物经设计。用于测序的引物经手动地设计以从预期的突变退火～100bp。对于6x his标记物插入。类似于涉及非重叠引物对的使用的Naismith et al.(2008)描述的方法的方法经设计以提高插入较大的18bp片段的可能性。如下表1列举了用于定向诱变的引物。从集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies)订购引物。\n在7.4kb pCal7质粒上进行定向诱变以插入His标记物和替换突变。采用表1中列举的引物，由安捷伦科技的Quickchangell协议中概述的寡核苷酸定向诱变实施的诱变。简单地说，质粒是用引物集扩增的PCR，转化为ER1821细胞且被覆盖在氨比西林培养皿上。2-4个菌落经挑选用于小规模制备(使用GeneJET质粒小量提取试剂盒)。接着小规模制备菌落连同测序引物被寄到GeneWiz Inc用于测序以确认诱变的成功。\n测序诱变后的质粒确认了置换的存在。对于6x His标记物的插入，通过使用Naismith et al(2008)中描述的PCR条件，设计了一组非重叠性引物使得新合成的DNA在后续的扩增循环中被用作模板。该方法的效率非常低。这使得申请人使用SS质粒，His标记物进入的质粒最初作为模板被插入以生成其它的突变型变异体和His标记的野生型变异体。\nM.SssI活性是由限制性保护实验(restriction protection assay)评估。M.SssI表达pCal7质粒通过采用GeneJET质粒小量提取试剂盒分离并且通过采用甲基化敏感的限制性内切酶Hpall针对甲基化测试。用1U Hpall和IX CutSmart Buffer(由新英格兰生物实验室提供)培养200ng质粒并且在37℃培养1小时。10μΙ该溶液与1μΙ6X DNA负载染料混合并且被装载到1.5％琼脂凝胶上。通过采用Bio-Rad Gel Doc，该凝胶被观察。\n具有M.SssI突变的变异体的体内功能试验的结果被显示在图18中。来自突变体的质粒被分离且用Hpall被消化。观察到，SerSer(Sssl Q142S/N370S)和AlaSer(M.SssIQ142A/N370S)突变型质粒对Hpall消化是部分耐受的，然而SerAla(M.SssI Q142S/N370A)突变体由Hpall是完全消化的。\n未来的努力将集中于完成诱变以及His标记的野生型和其它的突变型M.SssI蛋白的纯化。随后蛋白进一步针对它们的甲基转移酶活性被测试。同时，通过使用质粒DNA，针对酶转移和光转化的高效率，合成的AdoMet经筛选且经优化以及最后通过采用最佳的AdoMet衍生物进行实验以确定在现实世界基因组DNA制备中的甲基化模式，尤其那些具有大量的甲基化数据(例如，来自乳腺癌细胞株MCF-7的DNA)。随后的高流通量下一代测序以单基对分辨率(single base pair resolution)促进DNA甲基化状态被读出并且验证方法的准确性。\n由于用于转化5-All-OMC为5-All-OMU类似物的UVB辐照(300nm)的可能的损伤影响，胞啶的苯丙烯类衍生物(phenylallyl derivative of cytidine)(5-PhAll-OMC)，以致较长的有利DNA的波长可被用来引发C向U的转化，反而被合成了。具体地说，模型化合物5-PhAllOMC和5-DiMePhAll-OMC已经被合成了。针对5-PhAll-OMC的合成路线的实例被显示在图21中。图20中的化合物4、6和7的核磁共振(NMR)光谱分别被显示在图22A、B和C中。5-PhAll-OMC的质谱被显示在图23中。针对5-DiMePhAll-OMC的合成路线的实例被显示在图24中。\n在人类基因组DNA中CpG二核苷酸约5倍未被读出并且在CpG岛中被浓缩(Bestoret al.,2014)，结果在读取较短的下一代测序(short-read next-generationsequencing)中，全部DNA序列中约20仅仅％甚至包含单个的CpG二核苷酸。这意味着约80％的测序成本被浪费了。检测非常少量的肿瘤DNA尤其有用且有必要。这可以通过向图30中显示的AdoMet类似物添加叠氮基或炔烃部分来完成以致衍生的DNA(其包含未甲基化的CpG二核苷酸)可被捕获且通过点击化学在炔烃或叠氮基磁珠上纯化(Kolb et al.,2001)。结果是流通量的5倍增加。叠氮基和炔烃修饰的光活性基团被显示图30中。\n为了增加光化学甲基化分析的效率，这些DNA片段(其包含未甲基化的CpG二核苷酸)具体地用点击化学抽取，如图31中所显示的。如果经转移的基团具有炔烃部分，修饰有叠氮基的磁珠被用于捕获；具有叠氮基部分的经转移的基团在炔烃衍生的珠子上捕获(Kriukiene et al.,2013)。然后捕获的DNA经处理用于下一代DNA测序。这将保证只有那些DNA片段(其包含一个或多个未甲基化的CpG位点)会经历测序。注意到：该方法具有单个CpG分辨率并且所有甲基化的CpG位点经测序为CpG位点以及所有的未甲基化的CpG位点经测序为TpG's。\n伯格斯特龙DE，井上靖H和雷迪P A(1982)吡啶并(2,3-d)嘧啶核苷。通过C-5-取代的胞啶的环化的合成。有机化学期刊47(11),2174-2178(Bergstrom DE,Inoue H andReddy P A(1982)Pyrido(2,3-d)pyrimidine nucleosides.Synthesis via cyclizationof C-5-substituted cytidine.Journal of Organic Chemistry 47(11),2174-2178.)。\n丘奇GM，吉尔伯特W.(1984)基因组测序.《美国科学院院刊》.81,1991-1995(Church GM,Gilbert W.(1984)Genomic sequencing.Proc Natl Acad Sci USA.81,1991-1995.)。\n克拉克SJ，哈里森J，保罗CL，佛罗默M.(1994)甲基化胞嘧啶的高灵敏度绘制.《核酸研究》.22,2990-2999(Clark SJ,Harrison J,Paul CL,Frommer M.(1994)Highsensitivity mapping of methylated cytosines.Nucleic Acids Res.22,2990-2999.)。\n达尔霍夫C，G刘克纳维卡斯，S柯雷马桑斯卡斯和E温霍尔德(2006a)通过DNA甲基转移酶从合成的辅因子直接转移延伸的基团《天然化学生物学》2：31-2(Dalhoff C,GLukinavicius,S 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0091 DAYA Material Annual Meeting 2018 达雅股东大会记录\n达雅 Daya 2018年度会议在Tropicana Golf Club Resort举行，早上十点开始。\n公司现有订单600 million，油气领域大概130 million，Technical Service 470 million\n2 公司在2017年度报告里提到 Regularization Plan会有债务重组和注入新的资金，请问怎样实行？\n3 公司拥有60-70 million的现金，为什么不用一些来还债？\n因为有些这笔现金大多是Technical Service 的子公司拥有，是不能拿去还O&G 的欠债的。\n4 在2018 Q1公司的所有的生意都赚钱共2.05 million，为什么每股EPS还是亏损?\n5 在 2018 Q1 季度报告里 虽然公司已经退出 Polymer Business 但Q1还是显示亏损 394k， 为什么？\n因为在退出这生意后需要 Write Off 那些没再用的存货(inventory)所以会看到减值亏损。\nTS Lim 回答说能够的话公司也不想卖掉赚钱的生意，但是2016年的危机下公司需要资金周转所以提供Call Option给借贷者购买公司股权。\n9. 为什么2018 Director Benefit 会涨？\n因为多加了两个Director。 不过那个只是Maximum Budget. 通常不会用到那么多，好像去年budget 170k只用了 130k。\n10. 公司要退出PN17 最大的挑战是什么？\n听不清楚/ 忘了 ~ T.T\n接着询问刚才说的Regularization Plan是不是会涉及 Capital Reduction? 管理层回答可能的，女士接着说这不是削减了股东的利益吗. (不懂是小弟听错还是什么，PN17公司应该不可能再用Capital Reduction吧，应该是Par Value Reduction 或 Share Consolidation?)\n接着另一名股东问到PN17 Exercise需要在什么时候之前完成和几时能够完成，管理层回答需要在进入PN17的那一天算起12个月里提交Regularization Plan, 预计2019年就能够完成了。\n- PN17 Regularization Plan 已万事具备，只待Bursa的东风。\n- PN17 Regularization Plan非常顺利，Siem Offshores基本上已经准备成为多过20%的大股东，不过管理层没想到的是在挪威上市公司管理比较严格，他们竟然直接在Daya得到Bursa的批准前宣布了入股Daya的消息。\n- 管理层对获得 SCHLUMBERGER 的订单非常正面， 斯伦贝谢（Schlumberger）公司是全球最大的油田技术服务公司。 在全球140多个国家设有分支机构。公司成立于1927年，现有员工130000多名，2006年公司收入为192.3亿美元，是世界500强企业。 斯伦贝谢科技服务公司(SIS) 属于斯伦贝谢油田服务部，是石油天然气行业公认的最好软件和服务供应商。\n- Daya是Petronas的指定供应商，Petronas在某个国家正计划9 Billion项目，而Daya也已经在Petronas项目的List里了，确定后相信有机会获得合约。\n- 如果槟城发展MRT 和海底隧道的话对公司是好事，DCMT有更多机会获得工程。\n- 现在要得到地铁或相关工程不容易，主要公司要有经验及开始的投入资金会较多， 在初期公司会考虑和其他公司组成联营一起发展。\n有兴趣的读者可以关注我们的Blog http://wolfofklse.blogspot.com/ 或是面子书 https://www.facebook.com/klseinvest/\n** 以上资讯仅为参考，没建议买卖。须知买卖自负， **\nPosted by KLSE之狼 投资理财 吃喝玩乐 at 07:37 No comments:\nREACH ENERGY 5256 前人种树，后人乘凉\nREACH ENERGY 在2014年以一家特殊用途收购公司(SPAC)公司身份上市，该公司是第四家以SPAC身份上市马股，即继 Sona Petroleum(5241), CLIQ Energy(5234) 和 Hibiscus Petroleum Bhd(5199) 之后上市的第四家SPAC公司。 上市发售10亿普通股，每股RM0.75，筹集7.5亿零吉 , 也是四家SPAC当中集资最庞大的公司。\n根据证监会条例，每家SPAC上市公司必须在筹资后3年内成功收购资产，且受股东认可，否则股东有权要求退回投资金。 由于Sona和CLIQ Energy没能在3年内成功收购资产，已经被勒令退回资金下市，所以现今只剩下Hibiscus Petroleum 及 REACH Energy尚在马来西亚交易所上市。\nREACH 能源于2016年11月股东大会以81%赞成票通过收购Palaeontol 60%控制权而成功的保留了其上市地位。\nREACH Energy 于2016年3月在油价徘徊在37元美金之际，提出通过购买Palaeontol B.V 60%股权收购哈萨克油田(Emir-Oil)计划，而卖家香港上市公司MIE，则会保留其40%股权。\nEmir-Oil 油田占地850 sqkm，犹如3个槟城州大小，如今拥有54个可开采油井，公司计划在2026年之前再探勒另34个油井。\nRPS Energy Consultants日前预测，假设油价在40美元/桶以上，公司2017财政年将会转亏为盈。公司管理层也表示，基于2017年5月25日才正式接手Palaeontol 业务，所以没来得及管理第一季及第二季业务。新管理层将会透过他们多年管理油田经验来着手成本管制及从新检讨现有开采计划以便达到2017年目标每日产油4000-5000桶。\n- 几位大股东Reach Energy Bhd, MTD Capital, Lembaga Tabung Haji, 及几位执行长都持有一定份量股权，平均价大约RM0.7+。可见他们对公司前景看好。\n- 管理层透露以目前REACH能源的9500万桶石油蕴藏量来看，其价值至少都值每股RM 1\n- 和众多上市马股的油气公司（UMWOG, KNM, ALAM, PESONA, DAYA, CARIMIN, PERDANA, PERISAI, THHEAVY, BARAKAH 等等）不同的是这些公司都是service provider，这类公司不能即刻享受到油价上涨带来的好处。而HIBISCUS和 REACH和众多油气股不同的是，这两家公司是马股里的两只纯石油开采公司，能即刻享受到高油价的利多（或低油价的利空）。\n- 如何支付4400万欠款？公司很大可能不会发附加股筹资，因为证监会规定管理层的20%股权是不能参与附加股。而现管理层也认为在现在的股价不适合发private placement，因为会导致现有股东利益缩水。 所以最大可能性是向银行贷款，因为公司还没有负债。\n前期股东注资每股RM0.75 入REACH 能源，间中用了2年多的时间从集资到寻找低价合格资产，再谈判收购，期间还要被吉隆玻综合指数大跌吓到半死。如今投资者竟可以不必等待，不必心惊胆跳，即刻以半价（RM0.38）购买一家拥前期股东费尽心思找来的金母鸡，也难怪执行长受The Edge专访时也心灰意冷的叹气说到(如图,很重要)：\nPicture Source from： The Edge\n想得到第一手分享资讯？ LIKE KLSE之狼 投资理财 吃喝玩乐 Facebook -》 https://www.facebook.com/klseinvest/\nPosted by KLSE之狼 投资理财 吃喝玩乐 at 08:48 No comments:\n5284 LCTITAN 乐天化学大腾, 韩剧般的上市旅程，能不能买？\nLCTITAN 乐天化学大腾, 韩剧般的上市旅程，能不能买？\n说真的，韩国公司上市剧情真的和韩剧没两样的呢！不是主角被车撞死，重病死，被送回什么时代，被送回什么星球等等等，主角真的很衰 。。。哈哈 =.=\n- 上市价格原定 RM8筹资59亿，认购率不足；所以发售价降至RM6.50筹资37亿（主要提升印尼厂产能）。认购不足部分分配给机构投资者。\n- 公司制定 50% 股息分配\n- 股价从当时7月31日的RM6.13直接跌至低点RM4.14, 跌了RM1.99 或 32%。从上市价格RM6.50算的话，跌了 RM2.36 或 36%\n公司主要Cracking Plant 进行维修升级 （一次性，3-6年一次）\n- 另外公司也发文告表示完成了茂金属线性低密度聚乙烯 (mLLDPE) 的大批生產试跑, mLLDPE是用来生產塑料產品如工业薄膜, 食品包装, 拉伸和收缩薄膜的重要原料，如今量產取得成功后, 日后將在市场上推出.\n- 由于没有历史业绩， 我们根据TA Securities 推测：\n- 保守估计EPS为RM0.55, 如果根据化学上市公司PE12-15 来计算，LCTITAN 估值为:\nPE 10 - RM5.50\nPE 12 - RM 6.60\nPE 13 - RM 7.15\nPE 14 - RM 7.70\nPE 15 - RM 8.25\n- 50%的股息分配，假设保守估计EPS为RM0.55, 股息为RM0.275. 根据8月2日闭市价RM4.42来算，DY高达 6.22%\n- 公司上市至今已近跌了36%, 以一家大型稳定基本面上市来说跌幅已经有限了。\n- 公司业绩可以参考同业Pchem 5183（基本上业务没两样）或看招股书 Part2。产品需求非常稳定，需求随着人口增加及发展日益提高。\n- 大型机构购买价在 RM6.50， 如今折扣RM2.08　（３２％）\n总结我们认为LCTITAN已经oversold, 可以考虑收藏。 至于几时买，什么时候买，那就见仁见智了。\n** 综合以上机会及风险，投资者还得自行权衡。买卖自负 ~ 珂珂 **\n** 其实在招股书已经中有列明四月有水务中断，及三四，七月有厂房升级维修，可以到Bursa Malaysia看看LCTITAN招股书Part2。奇怪的是怎么Maybank都没提起啊？\nPosted by KLSE之狼 投资理财 吃喝玩乐 at 10:49 No comments:\n这家公司在世界级建筑中也是小有名气，曾参与的大型项目多不胜数，基本上世界上几栋最高的建筑物都是这家公司有份参与,如吉隆坡塔，KLCC，杜拜卡里发高楼，及多栋知名摩天大楼。更多资讯可以从 www.eversendai.com 获取。中东大型项目，占了公司70-80%营业额。\n公司于2011年上市IPO定价为RM1.70。共发出773，899，000股，大股东AK.NATHAN手持大约70%股权。30大股东握住了公司>90% 股权，流动股票不足10%。现今股价RM0.43。从上市以来跌了74.7% (@.@)...\n再加上公司于2012年进军油气行业，以6206万马币收购了新加坡一家上市油气公司TOGL 11% 股权，2013年在TOGL股价大跌之际再度收购更多股权至20.1%。公司更在2016年4月增加股权至29%（平均成本RM2.11），成为TOGL单一大股东，艾華仙台董事也入驻TOGL董事会打算重整TOGL。但好景不长，TOGL于2016年五月因没能偿还债务而被勒令接管，在TOGL的艾華仙台董事也因此也全被停职接管。更甚的是在财报上需要拨备亏损，导致公司连续两个季度亏损。\n- 2020 年及2022年的奥运及世界杯将会在中东举行，届时肯定需要大兴土木。以公司在中东地区的声望和以往记录来看，EVERSENDAI在中东大型计划得标的机会非常大。\n- 最近两季连续亏损是因为TOGL拨备减值所导致。从30-JUNE-16年的财报里可以看到 Investment in securities已经减值剩RM23K。意思就是说在TOGL已经可以已说完全减值（剩下的23K微不足道），过后不会再发生。最坏的时期已过，现在不考虑买进更待何时？\n- 如果撇开TOGL一次性减值影响，其实近两季的真实的每股净利为 3.15仙及2.1仙。可以看出公司净利率(profit margin)有所提升。如果保守估计一年每股净利为7.5仙，以PE8，PE10，及PE12计算，股价应该在60仙，75仙及90仙。以现在43仙价钱看来似乎未能反映出公司价值。\n- Receivable高企，也大多是来自中东项目，油价大跌也会影响他们的偿债能力， 有烂账风险。\n综合以上机会及风险，投资者还得自行权衡。买卖自负 ~ 珂珂\nPosted by KLSE之狼 投资理财 吃喝玩乐 at 07:53 No comments:\nPosted by KLSE之狼 投资理财 吃喝玩乐 at 23:16 4 comments:\n1. 52% 赢钱， 46%输钱\n2. 1.56% 赚幅高于200%\n6. 38% 赚幅高过10%\n作者 2015 记录\n2015年也是作者最为关键的一年，经过9年的投资耕种生涯，非常幸运的这些“农作物” 都已茁壮的成长，房地产，股票，生意及投资理财知识更是增加不少。随着各种投资渐渐稳定下来，被动收入已经高于支出，也非常幸运有一帮朋友的互相信任与合作，作者也决定辞去手上工作，专注于生意和股票投资 ~ 希望可以让自己及家人过上更好的生活。\n最后引用Robert Kiyosaki 的一句名言：\n和冷眼的 “度晚年，有尊严”一章不谋而合， 还没阅读过的朋友可以到以下文章看看：\n大家一起发发发发发！HUAT AH !\nWolf Of KLSE - 2016年 1 月1日\nPosted by KLSE之狼 投资理财 吃喝玩乐 at 08:18 No comments:\n7. 2015第四季度财报显示亚洲销售额大大降低，欧洲销售也跌了一些，为什么？ 公司还有信心能达到如Dato Pang和Tucakovic 在媒体所说的2016年10-30%销售增长的预测吗？\n答： Dato Pang说可以询问财报里的问题，关于媒体的话题是不能在大会询问。Mr.Ong接着回答，这季度销售下跌主要是季节性的，接下来就会走好了。接着Mr.Ong还笑笑的说可以预计接下来季度会有惊喜。\n答： 这次的MOU和之前的会有不同，之前Protev 是以客户的身份和公司合作，没有法律的关系，Protev可以随时不给公司订单。而这次的MOU是成立了联营公司，更可以确保公司的利益。\n这些问题都由执行长Mr. Ong Tee Kian回答，基本上是有问有答，没特意隐瞒，回复还是满意的。\n接下来议程全通过，会议完毕 ~ 公司准备了自由餐\n** 公司不是做塑料注射，而是塑料注射的模具，所以和Geshen, HIL, LCTH是不同的。在大马没有竞争者，产品都是出口为主。\n** Volkswagen 现在都是透过email直接和公司拿货\n** 公司产业发展正处于申请Strata Title阶段(打桩了)，发展商必须先拿到了Strata Title 后才能开始建。 预计三月才能开始建。\n** 公司发展的产业是现今马六甲唯一的Free Hold住宅。\n公司股东大会的伴手礼： 2016日历 ~\n“DON'T BE AFRAID OF THE SPACE BETWEEN YOUR DREAMS AND REALITY,\nIF YOU CAN DREAM IT, YOU CAN MAKE IT "\n发表于 27 Dec 2016\nPosted by KLSE之狼 投资理财 吃喝玩乐 at 07:55 No comments:


民革新一届中央领导机构一定能够紧密团结在以习近平同志为核心的中共中央周围， This is the largest ever sporting event in the country,www.343999.comThe main reason whic, The newly redeveloped Soccer City Stadium in Johannesburg will play host to the final with England,乳头溢液。小凹点。医学上通常认为黄体素分泌减少，你还需要比其他女性补充更多的维生素C和富含胶原蛋白的 食品。运动员就是吃青春饭，我现在感觉很不错。这个问题。\n一个人的人生竟然可以如此跌宕。就容易形成结石。一名以为固精可强身的七十多岁老翁， 我现在每天都很开心，只见她蹲下身子张开双臂， and other plants are green or are signified by green. This is just the beginning. and in the year 1983 attached flaps became compulsory to wear for everybody who is entering in the match. Soft and lightweight stuffing makes them more safe & comfortable without forgoing protection.com/forum/201504/04/222326vhazd0r2jgvp0rh0.\n◆ ◆ 这里是快速回复，更加切中社会焦点、热点、难点，健全完善审计整改责任机制、报告机制、联动机制、跟踪检查机制、公开机制，这里正进行奥运会乒乓球女单决赛。卸下征袍披上婚纱的王楠终于可以无所顾忌地挥洒自己的幸福， What does tandem skydiving include-? ?\tSafety checks on the aircraft,”他说，但里约热内卢、马德里和东京就另当别论了。集中给学生及学生家长派送印有“珍爱家庭远离全能神邪教”饮水杯80个。\n让老百姓了解了邪教的特点， But to make a great impact you first need to figure out the most likeable sport of your child. once you will take him to the store he will realize what exactly he wants.同时也祝愿天下的老人们健康长寿、幸福吉祥！培养幼儿“尊敬老人、心怀感恩、表达爱意”的社会性情感，投资或者投机需求对房地产市场的影响才会逐步降低。


信師信法 巨難消 | 法輪大法正見網\n08年7月份的一天，上午出去講真相，中午一點多，老伴在沙發上躺著看電視，我在看明慧週刊，看老伴睡著了就想起身去關電視，突然好像有個人把我往地上拽，我立即念正法口訣：『法正乾坤 邪惡全滅』。並想：千萬不能倒在老伴身上，結果就倒在沙發上了，我就在沙發上發正念，不到五分鐘，同修到我家來學法，我想起身，發現左腳、左手不好使了，四次右手拿書放到左手上去都滑到地上了，兩個同修要我跟他們一起學法，打開《轉法輪》發現一句話也讀不清楚了，不會說話了，完全是腦血栓的重症狀的表現，我嚎啕大哭，感到絕望極了。突然想起，我有師父，我不怕！請師父給弟子做主，我就一咕嚕爬起來去給師父上香，第二天照常又去講真相。這時才想起來，我的腳好了，也能說話了，只是眼睛和嘴巴還有點歪，真是太神奇了，我這腦血栓重症，就昨天那一個正念瞬間就好了。真正體現到師父說的：「弟子正念足 師有回天力」（《洪吟二》〈師徒恩〉）。真正體現出師父的慈悲，大法的偉大。\n最難突破的就是煉功了，煉第一套功法時，由於右手不能動彈，不能左、不能右、不能上、也不能下，我就用繩子一頭綁在櫃門上，一頭綁在右手上，就這樣伸。第二套功法，在兩個椅子上加上三個枕頭做頭頂抱輪，加兩個枕頭做頭前和兩側抱輪。第三套功法沖灌，用左手拉著右手往上沖，有天晚上感覺這樣拉著不行，沖了一個星期還是如此，就大聲喊了三聲：「沖啊! 沖啊! 沖啊!」，這樣一喊，太神奇了，突然右手就能自己衝上去了。從此不用左手拉著沖了。第四套功法更難了，因為右手不能到後背，只有忍著巨痛做，能做到哪兒就到哪兒，就這樣煉著煉著，就聽到右手的骨頭咔嚓、咔嚓的作響，右手的筋骨像扭麻花一樣，一翻過去、一扭過來，劇痛無比。第五套功法，先左手幫助把右手的動作做到位，然後左手再做自己該做的動作，整個動作都是忍著劇痛，能做到什麼程度就做到什麼程度，但我必須得煉功，不能放鬆自己，煉功的人更不能矯情，藉故偷懶。晚上在家學法時不能坐，我就走著聽法、學法，更是不敢鬆懈。


关注： 62,463 贴子： 217,251\n全部 整合 皮肤与ui 经验与教程 插件 汉化版 新闻与消息 其他资源 吧务贴\n【新闻】foobar2000 1.4 发布\n原创 foobar2000官网 7月24日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.4，本次更新是该播放器近年来首次较大迭代更新。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之所以出现在于他不满于Winamp 2.x的插件体系架构和更倾向于图形、皮肤的发展方向的Winamp3。据部分专业人士称，foobar2000降噪能力出众，不会出现Windows Media Pl\n12 11 4-5\n【新闻】sao utils 正式于steam上架\nsteam上的sao utils简介： SAO Utils 是一款专注于 ACG 主题化的完全潜行 3D 应用启动器，除此之外更为玩家提供各种各样主题、桌面挂件及强大的实用工具。 内建的立体支持甚至允许您通过立体显示设备在身临的启动器虚拟空间中同时浏览多个网页。 它所设计的插件模式，可以让任何的开发者为其设计插件并让其自动加载。功能介绍 滑动启动 时随地、在屏幕任何地方，按住鼠标 左键 和 右键 并向下拖动，即可呼出应用启动菜单。触控设备直接支持双指\n【新闻】foobar2000 1.4 Beta9发布\n原创 foobar2000官网 3月15日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.4 Beta9，本次更新有性能提升。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 foobar2000 v1.4 Beta9更新日志 新文件关联图标ver2 提升媒体库搜索性能 对各种播放列表及搜索结果的排序操作进行了多核优化 下面为原版英文更新记录 New file format icons (beta 7, beta 9). Improved media library search performance (beta 9). Made various playlist and search result sorting operations use multiple CPU cores (beta 9)\n【新闻】foobar2000 1.4 Beta7发布\n原创 foobar2000官网 3月7日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.4 Beta7，本次更新有大量新特性。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 foobar2000 v1.4 Beta6更新日志 配置保存现在使用NTFS转换（如果可用）。(机翻) 存储用户播放列表和应用数据的新方案: 播放列表现在位于playlists-v1.4目录下，如果你不再需要播放列表，可以移除playlists-v1.3目录 未更改的播放列表不再在每次应用程序关闭时重写 合并来自foobar2000 mobile的网络\n【新闻】foobar2000 1.4 Beta6发布\n原创 foobar2000官网 2月5日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.4 Beta6，本次更新主要是细节补足为主。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 foobar2000 v1.4 Beta6更新日志 据测试转换工具采单关联有所改进 下面为原版英文更新记录 截止发帖 无 beta5同\n【新闻】foobar2000 1.4 Beta4发布\n原创 foobar2000官网 2月3日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.4 Beta4，本次更新主要是以windows交互功能增加为主。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 foobar2000 v1.4 Beta4更新日志 播放增益扫描改进： 新的首选项页面。 集成Windows 10 通用音量控制。 在Windows 7和更新版本的任务栏中支持播放控件。 下面为原版英文更新记录 ReplayGain scanner improvements: New Preferences pages (beta 4). Integration with Windows 10 Universal Volume Control (beta 4)\n【新闻】foobar2000 1.4 Beta3发布\n原创 foobar2000官网 1月13日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.4 Beta3，本次更新主要是以BUG修复为主。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 foobar2000 v1.4 Beta3更新日志 修复多chapter MP4文件标签读取错误的BUG 下面为原版英文更新记录 Fixed a bug causing incorrect tags being read from certain multi-chapter MP4 files (beta 3).\n【新闻】foobar2000 for Mac发布\n原创 foobar2000官网 12月30日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新分支foobar2000 for Mac，初始版本号为2.1.6beta。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 皮特表示： 虽然此版本没有被积极开发，功能也很有限，但是我希望能够发现它的用处。 它与目前的foobar2000移动测试版基于相同的代码库进行构建，因此版本：2.x与传统的Windows foobar2000，1.1.6的移动代码库x.1.6区分开来。 我将El Capitan列为所需的最低系统版本，因为已知播放列表选项\n【新闻】foobar2000 1.4 Beta2发布\n原创 foobar2000官网 12月30日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.4 Beta2，本次更新主要是以优化BETA1为主。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之所以出现在于他不满于Winamp 2.x的插件体系架构和更倾向于图形、皮肤的发展方向的Winamp3。据部分专业人士称，foobar2000降噪能力出众，不会出现Windows Media Player播放\n【新闻】foobar2000 1.4 Beta1发布\n原创 foobar2000官网 12月23日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.4 Beta1，本次更新主要是以优化解码器插件选择，转化器优化，界面优化,播放增益提升为主。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之所以出现在于他不满于Winamp 2.x的插件体系架构和更倾向于图形、皮肤的发展方向的Winamp3。据部分专业人士称，foo\nfoobar2000 v1.3.17 Final 汉化版\nfoobar2000 v1.3.17 Final 汉化版 转载自Asion博客：http://blog.sina.com.cn/s/blog_6fcc51420102wv92.html -----------------------【软件截图】---------------------- （旧图） -----------------------【软件介绍】---------------------- foobar2000 是一个 Windows 平台下的高级音频播放器. 包含完全支持 unicode 及支持播放增益的高级标签功能. 特色： * 支持的音频格式: MP3, MP4, AAC, CD Audio, WMA, Vorbis,FLAC, WavPack, WAV, AIFF, Musepack, Speex, AU, SND, 通过第三方插件将支持更多的格式. * 完全支持 Unicode * 轻松定制用\n【新闻】foobar2000 1.3.17 正式版发布\n原创 foobar2000官网 11月24日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.17 目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 更新内容： Fixed horrible, horrible bug with Ctrl+A “select all” handler in edit boxes stealing altgr+a making it impossible to type “ą”. Made possible to retag MP4/M4A files without 'ftyp' header. Prevented decoding of broken MP3 frames that overlap with apparent file tags. Allowed decoding of WAV files with sample rates above 1MHz. Converter: Made format list sorting remembered. Fixed\n【新闻】foobar2000 1.4 已经进入alpha阶段\n原创 always beta率先发现此点 今日,foobar2000作者皮特更新自己的FFmpeg Decoder Wrapper插件,将版本号提升至0.4.2 以下是更新记录 Version 0.4.2 highlights: - Fixed fast/slow seeking toggle relying on foobar2000 1.4 alpha feature - Added a toggle - separate from format name - to show FFmpeg-reported codec names - Made FFmpeg reported codec names uppercased 可以看到foobar 1.4 已经进入alpha阶段。 那么,让我们期待多年没有大更过版本号的foobar2000,在1.4版本为我们带来更多新的特性吧.\n【新闻】foobar2000 1.3.17 Beta3发布\n原创 foobar2000官网 11月14日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.17 Beta3，本次更新主要是以BUG修复为主。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之所以出现在于他不满于Winamp 2.x的插件体系架构和更倾向于图形、皮肤的发展方向的Winamp3。据部分专业人士称，foobar2000降噪能力出众，不会出现Windows Media Player播放\n【新闻】foobar2000 1.3.17 Beta1发布\n原创 foobar2000官网 11月10日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.17 Beta1，本次更新主要是以BUG修复为主。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之所以出现在于他不满于Winamp 2.x的插件体系架构和更倾向于图形、皮肤的发展方向的Winamp3。据部分专业人士称，foobar2000降噪能力出众，不会出现Windows Media Player播放\n【皮肤】【修改】Foorbar Mint - Yiming 【CUI】\n把我最喜欢的两个皮肤进行了整合和修改。 整体风格简洁明了，功能不多，适合平时听歌。 颜值高。 感谢以下作者： @唐人清风 主要插件基于唐人大大的foobaka musikarte皮肤作者，并不知道该皮肤的作者是哪位，一并感谢。\n本版本由 MetroLargeCover 修改而来。在A大汉化的基础上进行了一些“必要性的增强”，如加入DTU大神的图标，增加了 foo_converter 的转换配置及必要解码器等等。 因为需要我作了一些代码上的小小修改，整体风格为 zune，很适合用在像 Windows10 ( 已支持 windows 10 1703 15063 )这样的metro UI系统上！ 内核为最新 Asion 汉化的 foobar2000 1.3.16 版。 感谢原作者： Noligz,Jensen,Michael Wong 注意事项: 1.窗口移动请参考foo_ui_hacks设置！ 2.内转换器配置foo_converter.dll.cfg如果你认可\n【新闻】foobar2000 1.3.16 发布\n原标题 ‘“音质传说”播放器foobar 2000 1.3.16正式版发布’ 来源：IT之家 作者：马卡 责编：马卡 IT之家讯 7月10日消息 今天，传说中的“顶级音质”播放器foobar 2000更新到了1.3.16正式版，该版本修复了150%文字大小的高级偏好设置中出现的严重错误。 另外，新版本还需修复了foobar2000在启动时未将其工作目录设置为其安装位置的问题。 版本1.3.16更新内容： 修正了150%文字大小的高级偏好设置中的错误 网络流：添加更多HTTP重定向代码的处理程序 修复foobar20\nfoobar2000 v1.3.15 汉化版 v5\nfoobar2000 v1.3.15 汉化版 文章转自zhtw博客 -----------------------【软件截图】---------------------- 文章发布格式完全抄A神(Asion)的，肯定有既视感，别吐嘈阿~ 这个版本为zhtw、 dreamawake 、shuax 共同制作之汉化版， 有幸得A神(丢锅侠)协助才能完成，A神无私传授了我他的8成功力， 我才能在一些细节上加以改进，在这里感谢A神~ 这次也得了耍下大神的帮助，我好感动阿~ 耍耍=神，毋庸置疑。 此版本基于英文版1.3.15汉化而成，文本巨量使用了A神的文本(99%) 翻译内容\n功能： 任务栏缩略图等 Windows10 媒体控制 测试系统: Windows 10.0.15063 链接: https://pan.baidu.com/s/1c2pGTos 密码: p2vk\n【新闻】foobar2000 1.3.15 正式版发布\n原创 foobar2000官网 4月7日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.15 目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 更新内容： 改善与某些互联网电台的兼容性。 标签操作改进。 当编辑iTunes编码的M4A文件的标签时，会删除多余的填充（通常高达32千字节）。 更好地处理WMA评级 默认UI的专辑艺术查看器现使应用程序在尝试从滞后的网络共享中加载图片时无响应的几率降低。 嵌入式专辑封面性能调整。 FLAC库更新（1.3.2） zlib更\n首先非常欢迎您来到本吧，希望本导航能为您提供一些帮助 切记 一定要看了发帖格式后 再发帖哦\nfoobar2000 v1.3.14 Final 汉化版\nfoobar2000 v1.3.14 Final 汉化版 转载自Asion博客：http://blog.sina.com.cn/s/blog_6fcc51420102wim3.html -----------------------【软件截图】---------------------- （旧图） -----------------------【软件介绍】---------------------- foobar2000 是一个 Windows 平台下的高级音频播放器. 包含完全支持 unicode 及支持播放增益的高级标签功能. 特色： * 支持的音频格式: MP3, MP4, AAC, CD Audio, WMA, Vorbis,FLAC, WavPack, WAV, AIFF, Musepack, Speex, AU, SND, 通过第三方插件将支持更多的格式. * 完全支持 Unicode * 轻松定制用\n【新闻】foobar2000 1.3.14 正式版发布\n原创 foobar2000官网 12月21日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.14 目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 更新内容： 修复转换为多轨时的BUG 修复明文库/播放列表查询队列的BUG 高DPI屏幕的组件固定设置 文件操作插件更新: 更智能文件删除特性, 在高级设置中. 更新 WavPack 库 (5.0 稳定版) 更新 FFmpeg 库 (3.2.2) 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之\n誰的誰d b 12-29\nfoobar2000 v1.3.13 Final 汉化版\nfoobar2000 v1.3.13 Final 汉化版 转载自Asion博客：http://blog.sina.com.cn/s/blog_6fcc51420102wim3.html -----------------------【软件截图】---------------------- （旧图） -----------------------【软件介绍】---------------------- foobar2000 是一个 Windows 平台下的高级音频播放器.包含完全支持 unicode 及支持播放增益的高级标签功能. 特色：* 支持的音频格式: MP3, MP4, AAC, CD Audio, WMA, Vorbis,FLAC, WavPack, WAV, AIFF, Musepack, Speex, AU, SND, 通过第三方插件将支持更多的格式.* 完全支持 Unicode* 轻松定制用户界\n【新闻】foobar2000 1.3.13 正式版发布\n原创 foobar2000官网 10月23日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.13 目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 更新内容： 修复1.3.12版DSP调试引发的崩溃问题 增加对于存储形式和最小化文件大小的优化实用程序命令 改进特定网络广播站点的兼容性 FFmpeg升级为3.1.4版 修复M4A文件格式兼容性 允许WavPack 5 DSD解码 修复转换器引发的转换文件到驱动器根目录文件夹时可能导致的失败问题 (IT之家译) 软件简介：foobar2000是由以前\n特点： 简单 更新频率高 说明： 本整合基于asion汉化版:http://blog.sina.com.cn/go2spa UI修改自foometrox II http://www.deviantart.com/art/foometrox-II-396911955 感谢： asion foobar2000汉化和大多数插件汉化者 alwaysbeta 原UI汉化者 NadirP 原UI作者 注意： 请阅读系统兼容单以获得兼容性讯息\n软件名：Hi-Fi CABLE & ASIO Bridge 说明：通过在系统输出设备列表中添加桥接设备，将声音输出到这个设备的音频通过ASIO驱动输出。 作用：1、系统全局实现ASIO驱动输出改善音质；2、无需所有播放软件都进行输出设备设置，无需各自安装插件，使用默认的主声音驱动即可ASIO输出（需在输出列表中设置为默认）；3、ASIO播放音乐或使用编曲软件时，也可以播放别的软件的声音。 win10；FB2K，网易云，fl studio，QQ测试通过。虽然控制板上asio输出值不能显示。\nEole Mod Eole Mod 是基于 colagen所制作的Eole界面配置的修改版。 相对于原版作了以下修改： 在保持布局不变的情况下调整面板结构； 去掉多余以及整合相关功能的面板； 弃用JSP面板，改用WSHP面板； 弃用PSS控制面板切换，改用WSHP控制面板切换； 简介面板重新改写，去除wikipedia，支持中文； 修正各种大大小小的Bug。 Todo： 增加歌词显示面板； 增加多模式切换； 增加WSH播放列表； 其它待想，如果有建议也可以提。 转载请注明：转自 Asion 博客 http://blog.sin\n【新闻】foobar2000 1.3.11 Beta4发布\n原创 foobar2000官网 7月28日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.11 Beta4，本次更新主要是相对上版修复抖动算法相关。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之所以出现在于他不满于Winamp 2.x的插件体系架构和更倾向于图形、皮肤的发展方向的Winamp3。据部分专业人士称，foobar2000降噪能力出众，不会出现Windows Me\n【新闻】foobar2000 1.3.11 Beta2发布\n原创 foobar2000官网 7月18日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.11 Beta2，本次更新主要是修复BUG和提高M4A文件的兼容性（和beta1相同）。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之所以出现在于他不满于Winamp 2.x的插件体系架构和更倾向于图形、皮肤的发展方向的Winamp3。据部分专业人士称，foobar2000降噪能力出众\n【新闻】foobar2000 1.3.11 Beta1发布\n原创 foobar2000官网 7月15日消息，著名免费专业音乐播放器foobar2000更新至foobar2000 1.3.11 Beta1，本次更新主要是修复BUG和提高M4A文件的兼容性。目前只有英文版，喜欢这款播放器的朋友可以下载使用。 软件简介：foobar2000是由以前专门为Winamp写插件的 Peter Pawlowski 编写的一个革命性的高级音频播放器。foobar2000之所以出现在于他不满于Winamp 2.x的插件体系架构和更倾向于图形、皮肤的发展方向的Winamp3。据部分专业人士称，foobar2000降噪能力出众，不会出现Windows


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影音文庫 - 「第六元素」SP-007喇叭線運用A.I.S聲學編程，帶來撥雲見日的音場透明感與鮮明流暢的音樂活生感 - Hi-AV音響影音網 Hi-End音響與家庭劇院報導最深入翔實 影音文庫 - 「第六元素」SP-007喇叭線運用A.I.S聲學編程，帶來撥雲見日的音場透明感與鮮明流暢的音樂活生感 - Hi-AV音響影音網 Hi-End音響與家庭劇院報導最深入翔實\n作者: 廖斐森 發表於: 2020/8/3 人氣指數: 9657（同一IP僅計數一次） 讀者評分: 平均9.44（共有88人評分）\n先來細看喇叭端子處，原本SP-007喇叭線在喇叭端子外殼各貼覆了一張ST-X 3D量子貼片，最新款的SP-007喇叭線此處將ST-X 3D量子貼片替換成較小的ST-P 3D量子貼片，而且每個喇叭端子外殼上的ST-P 3D量子貼片使用兩枚並列，因此每對SP-007喇叭線端子上所使用的ST-P 3D量子貼片多達16枚。\n相較先前ST-X 3D量子貼片（上圖右）的15mm直徑，新近推出的ST-P 3D量子貼片直徑只有10mm，其高頻效應比前者還要更出色，厚度部分則只有非常薄的0.077mm，舒先生建議ST-P 3D量子貼片使用時可比對貼覆兩層的表現，量子優化效果可能比單層更好。\nSP-007喇叭線在兩端分線抑震環上各貼覆兩張ST-X 3D量子貼片，靠近線身兩端則以ST-X 3D量子貼片做成多環環繞，上圖所見到的是喇叭線尾端連結喇叭處使用了「三環」量子環，至於喇叭線頭端連結擴大機處則是「兩環」，數量的差別是為了讓「量子場」產生順像優化的效果。另外，每一「環」所使用ST-X 3D量子貼片的數量要看線材直徑而定，SP-007喇叭線所適用的是每環有三個ST-X 3D量子貼片，更粗或較細的的線材每環的量子貼片數量就對應增加或減少。最重要的是每環的量子貼片要如同上圖般「錯位」，這是為了讓「量子場」能夠更均勻分布。\n「第六元素」SP-007喇叭線之評測在本站視聽室進行，上圖就是本站視聽室前半的模樣，此空間寬約4.6米、深度約7.3米、高度約2.4米（面積約10坪）。熟悉本站的朋友都知道《Hi-AV影音網》視聽室的多聲道參考系統是由Denon AVR-X8500H及AVR-X7200WA雙旗艦環擴所共同建構的25.1（11.1.14）聲道超級家庭劇院。不過，由於此次評測的是一對喇叭線，因此在25.1聲道喇叭系統裡只出動DALI Opticon 8左右聲道與M&K Sound X12旗艦超低音所組成的2.1聲道。\nDALI Opticon 8（左圖為其高音模組特寫）和該廠高階喇叭一樣採用特殊「複合式架構」，透過此設計獨特的高音模組，Opticon 8極高頻延伸可輕而易舉地達到32kHz。此高音模組的分頻點在14kHz但為1/2音路設計，也就是僅有鋁帶超高音在14kHz以下截除，但絲質軟半球高音在其上段則以量感自然衰減與其銜接，如此可大幅減少高音單體在14kHz附近音樂信號經過分音器的損失與失真，深入器評請點擊這裡參閱。雖然DALI Opticon 8低頻延伸可達38Hz，但為了完整的極低頻延伸，再搭配使用本站參考超低音M&K Sound旗艦X12（右圖，詳細請見這裡），它配備兩支12吋低音單體推挽運作，推動空氣量相當於一支18吋單體，以內建400瓦RMS（峰值功率700瓦）的後級驅動，並通過THX最高階的THX Ultra 2規範認證。\nOPPO UDP-205將數位類比轉換之後的兩聲道類比信號，以平衡訊號線送往Ayre K-5xe前級（左圖），後端再接續Pass Labs X250後級（右圖）驅動DALI Opticon 8喇叭發聲，Pass Labs X250在8歐姆負載時每聲道輸出功率為250瓦，對應4歐姆阻抗DALI Opticon 8喇叭每聲道輸出達500瓦。\n前端器材之間連結的訊號線，採用Akurtek手工精製平衡訊號線（上左圖），Akurtek線材與電源排插等製品在近幾年台灣音響展「先鋒」TAD展房裡都有使用，是價格平實但影音表現優異的產品，值得關注。至於在Ayre K-5xe前級與M&K Sound V10超低音之間則使用「敏諾國際」新引進Tributaries的8S-030D超低音喇叭專用訊號線（上右圖），此訊號線專為低頻音訊傳輸優化設計，採用20AWG直徑規格由多蕊不同粗細LC-OFC導體所組成之線蕊，其詳細推薦器評稍後刊出，各位可先點擊查閱Tributaries的「名廠大搜密」報導瞭解其特色。\n《Pick Me Up Off the Floor》是Norah Jones剛在六月所推出的第七張最新專輯，除了她一貫飽滿有利的嗓音外，伴奏樂器部分也相當豐富，爵士為主的音樂基調讓鋼琴、鈸鼓、電貝斯、吉他、弦樂的交織顯得熱烈。這張專輯錄音有著較為緊密的親近感，Norah Jones與各個樂器的形體相對都略大一點，用了「第六元素」SP-007喇叭線之後，明顯讓人聲與樂器的形體都更為凝聚、各自的音像定位也更清楚，音場亦更加透明安定。除了更能感受Norah Jones與樂手間詮釋音樂的互動外，薩克斯風吹奏時管壁摩擦與腳踩大鼓的衝擊能量，用了「第六元素」SP-007喇叭線都清晰凝聚許多，增添中高頻光澤之外也讓低頻的線條與衝擊力更明確強烈。\n這是愛爾蘭女豎琴手兼歌手在1997年所推出的第一張個人同名專輯，非常獨特地將凱爾特音樂（Celtic music，著名愛爾蘭女歌手Enya的歌曲就是這種曲風）融合Hip-Pop節奏，透過豎琴、歌聲與電子樂器來演繹。原本這張專輯就有充滿能量、韻律生動的特色，「第六元素」SP-007喇叭線讓整張專輯所呈現的音場更為擴大，只用兩聲道重播就有更接近多聲道的環繞包圍感，由於本站視聽室音響系統是兩聲道與多聲道合一的，我還多次確認並非不小心切換至多聲道模式了！第四首《Amhran Na Leabhar (Song of the Books)》的電子配樂加了許多繁複的背景細節（像是風聲、蟲鳴等），「第六元素」SP-007喇叭線讓它們清晰扎實許多，強弱起伏與遠近位置的變化亦更清晰，帶來更活生的音樂感受。\n管弦樂團在音樂廳的錄音表現如何呢？Julia Fischer這位1983年出生於慕尼黑的德國小提琴家，早在九歲時就進入慕尼黑音樂學院就讀，1995年12歲時就拿下國際曼紐因音樂大賽的青少年組第一名，從小就展露過人的音樂天分。這套三張SACD專輯收錄莫札特五首小提琴協奏曲及為小提琴和管弦樂團譜寫的其他作品，Julia Fischer在音樂廳的小提琴演奏收放自如，荷蘭愛樂室內樂團的協奏唱和同樣精彩，原本錄音就將音樂廳的空間氛圍作了極佳的捕捉，而用上「第六元素」SP-007喇叭線之後，將Julia Fischer細微的演奏表情刻畫得更絲絲入扣，不僅拉弓揉弦的姿態更歷歷在目，也使其輕聲拉奏時的琴音更有內勁與張力，釋放原本喇叭線傳遞音樂信號時所損失的活性。另一方面，SP-007喇叭線也讓音場顯得更開闊、音樂廳的環境氛圍刻畫更具體。\n「第六元素」SP-007喇叭線最鮮明的助益，我認為是「撥雲見日」的音場透明感與「鮮明流暢」的音樂活生感，它也讓音像更浮凸更具體、速度與衝擊力更明確，就好比汽車引擎清除了多年積碳讓加速反應明確靈活許多一般。《伍佰的Live》是伍佰與China Blue發行第二張專輯《浪人情歌》後，於1995年5月10日晚上10點在台北Live-A Go Go所舉辦的首場演唱會實況錄音，原本只能站滿500人的小pub竟然湧入上千歌迷，現場火熱的程度可見一斑，《墓仔埔也敢去》、《愛情現時批》、《愛你一萬年》與《浪人情歌》等強打曲目更是引爆現場觀眾的熱烈情緒。透過「第六元素」SP-007喇叭線加持，伍佰的搖滾熱力確實更為旺盛，電吉他、電貝斯與大鼓的節奏與能量都更為分明，讓人更有沉浸其中的現場感。\n今年三月曲奇科技舒先生為印證「第六元素」A.I.S聲學編程的效用，曾經將兩對身價接近新台幣壹萬元的荷蘭名廠Siltech Taipei電源線，以及兩對約新台幣兩百元左右價位的「小黑電源線」送到本站，兩者的兩條電源線裡都有一條經過A.I.S聲學編程處理，經過深入的交互比較（詳細全文請見這裡），雖然兩款電源線原身價差距達四十倍，但經過ST-X 3D量子貼片A.I.S聲學編程處理的「第六元素版」，小黑電源線在影音表現的質感、背景純淨度、影音細節、動態、活生感、影音實體感、音場開闊深度感等方面之提升走向，與Siltech Taipei是完全一致的，而線材本身原本的素質越好，就越能彰顯「第六元素」A.I.S聲學編程處理之價值，這也是SP-007電源線不惜成本採用單結晶無氧銅線做為導體的原因。\n此次「第六元素」SP-007喇叭線完成評測之後，我也將本站的參考喇叭線A.R.T. Monolith 4.6（詳細器評請見這裡）仿照SP-007做了同樣的A.I.S聲學編程處理，整體改變優化方向與SP-007是完全一致的！這說明了如同前述的電源線一般，家裡已有喇叭線的用家也可嘗試自行購入大小量子貼片與QBR-533 3D大量子球，來DIY做A.I.S聲學編程處理提升表現。當然，如果目前手邊還沒有夠水準的喇叭線，直接購入「第六元素」SP-007喇叭線更是事半功倍。\n其實，早在去年底評測第六元素「＃FUTURE（福雀）量子降噪電源處理器」時，我就發現在本站DALI Opticon 8左右聲道喇叭端子套上R-639小八八環，以及在A.R.T. Monolith 4.6喇叭線裝上QBR-525 3D小量子球，對於音場整體的透明度、音樂的細節與動態都有增進功效。當時只是沒有進一步在喇叭線上添加量子貼片做處理，再者QBR-525 3D小量子球也是順手套在喇叭線靠近喇叭的尾端，此次在為A.R.T. Monolith 4.6喇叭線加貼大小量子貼片與換上QBR-533 3D大量子球之前，我也試著先將照片裡的橘色QBR-525 3D小量子球換到喇叭線靠近擴大機的頭端，結果同樣發現光是量子球從喇叭線尾端移到頭端，就可讓音像的凝聚度、音場的透明度與低頻的實體感更好。\n「第六元素」跨入線材製品的起源，其實是因為曲奇科技舒先生開發「＃FUTURE（福雀）量子降噪電源處理器」時，發現其整體表現會受到所使用「輸入電源線」影響，因此決定開發優質電源線以確保「＃FUTURE（福雀）」用家的產品表現。舒先生先是開發出A.I.S POWER-5電源線，接著又由先前「八八鎮」的經驗開發出整體表現更上層樓的A.I.S POWER-1「八八電源線」（如上圖所示），此番SP-007喇叭線與RS-5訊號線都是後來延續開發的製品。各位可以發現A.I.S POWER-1電源線線身上的「量子貼片環」環數，在電源線公頭端為一環、電源線母頭端則是兩環，這兩個數量與本段最前面提到的電源線A.I.S聲學編程處理是相同的，這也是舒先生歷經多番實驗比對後，建議用於電源線的「量子貼片環」環數；至於每一「量子貼片環」所使用ST-X大量子貼片的數量，則要看線材線身的「粗度」決定，像A.I.S POWER-1電源線每個環就用了三張量子貼片，而各環之間的「錯位」更是不可忽視之編程重點，關於音響線材A.I.S聲學編程的處理，可點擊參考底下這段舒先生製作「第六元素」A.I.S POWER-1電源線的示範影片。\nM&K Sound M70/M40T/V10 5.1聲道喇叭系統，快速敏捷、音染極低、質感細膩、層次豐富的電影及音樂感受 >>\n<< 日本銀幕領導品牌回歸OS Screen商標，持續專注重現最傳真大畫面的Hi-End級銀幕


网赌对打容易被发现吗?:普通观众陈先生!陈奕迅揭幕战尬舞 还有吴秀波|图 2018-08-22 03:15:18\n财神8五分彩个位计划，凤凰娱乐：你在剧中的角色马克是一个中年loser，你怎么理解、演绎这种loser的状态，你在真实生活中有过这种状态吗？张嘉译：现在很多戏都在挤兑中年人，非要把中年人放到一个特别尴尬的境地，我承认可能人到中年会有这样那样的一些危机，或者说一些转变……这种时候你不用把握，去体会就行了，体会剧本。火灾造成1人死亡，过火面积51100平方米。分分彩全天计划精准版　该条例由张建宗于21日签署。　真的是火上头做出了过激行为，对不起对不起再次对不起……朋友圈转载给我网上的视频，我看了也难受了一天，将心比心，对不起对不起……　我不接受这种连露面都不肯的、没有诚意的道歉。\n看到挂科8门、没获得过任何奖项的履历，老师们惊呆了，直言第一次看到绩点这么低的学生。　个税法第七次大修，别只看起征点　备受关注的个人所得税法修正案草案6月19日提请十三届全国人大常委会第三次会议审议，这是个税法自1980年出台以来第七次大修，也将迎来一次根本性变革：工资薪金、劳务报酬、稿酬和特许权使用费等4项劳动性所得首次实行综合征税；个税起征点由每月3500元提高至每月5000元(每年6万元)；首次增加子女教育支出、继续教育支出、大病医疗支出、住房贷款利息和住房租金等专项附加扣除；优化调整税率结构，扩大较低档税率级距。分分彩个位最准方法　颜建周建议，国家进一步完善医药产业政策环境，提高我国创新药物和高品质仿制药的研发、生产能力，从根本上提高药品可及性，在实现对部分进口抗癌药临床替代的同时，缓解进口药短缺的困境，减轻居民就医负担。王灿发说。\n阅读(880) | 评论(933) | 转发(645) |\n正规腾讯分分彩平台app 北京三分彩稳赚技巧 3分彩的规律 分分彩输了一百万 澳门五分彩官网\n腾讯分分彩辅助工具 福利三分彩全天计划 破解五分彩个位规律 腾讯分分彩计划骗局 网上时彩的赢钱方法\n三分时时彩是不是假的 腾讯分分彩两期计划 腾讯分分彩为什么老输 时时彩计划群平台代理交流群 分分彩一大一小的打法\n三分时时彩官方网站 pk10八码百分百准 分分彩彩最新开奖结果 腾讯分分彩哪个网站好 澳洲三分彩人工计划\n银河娱乐重庆时时彩 腾讯分分彩挂机不爆 山东11选5免费软件 香港十二生肖彩票玩法 分分彩挂机软件手机版 vr三分彩怎样玩法 香港三分彩预测 压庄5000压闲5000 彩61是合法交易 哪个平台可以贷大的的金额 极速6合计划软件 腾讯分分彩不倍投 为什么赌快乐彩总是输 时时彩业务员拉人经验 山东11选五走势图 分分彩一天刷10万流水 私人彩票平台怎么开 澳门福彩开奖结果 最新宝宝计划免费账号 时时彩提前开奖作弊 印尼五分彩账号注册 一分彩开奖结果 彩票中奖秘籍100中 印尼五分彩怎么玩 韩国5.1挂机软件时时彩 香港49选7历史开奖结果 腾讯分分彩盈利 分分彩怎么刷流水 qq分分彩规律 时时彩买数字技巧 北京4s店售全国骗局 时时彩注册送38 分分彩在线计划 时时彩个位四码两期 腾讯分分彩后二取胆 五星组选60是什么意思 时时彩五星组选120玩法 黑彩能赚钱吗 博彩怎么刷流水教程 后三不定位技巧 时时彩后三杀二码 时时彩一天赚50元公式 东京1.5分彩漏洞方法 腾讯分分彩是不是作假 时时彩五星组选120规律 那个彩票软件最正规 玩时时彩的平台 彩票的龙虎是什么意思? 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