Compartilhando sinais detectando o quorum e o papel das comunidades interespecíficas em uma doença bacteriana de plantas - o jornal isme | ISME 2021 | Sublimis\nSinais de compartilhamento detectando o quorum e o papel das comunidades interspecíficas em uma doença bacteriana de plantas\n, sinal de célula\ninteragir não apenas com o organismo de host, mas também provavelmente com a flora microbiana residente. Na doença dos nós de oliveira (Olea Europaea), o agente envolvido é a bactéria Pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV). Duas espécies bacterianas, nomeadamente pantoea aglomerans e Erwinia Toletana, que não são patógenos e que são epifytes e endophytes da oliveira, foram muitas vezes associados ao nó da oliveira. Identificamos os sinais químicos produzidos pelas cepas das três espécies isoladas do nó de oliva e descobriram que pertenciam à família dos sinais do QS da lactona N-ayl-homosserina. Os genes da família Luxi / R responsável pela produção e resposta a esses sinais nas três espécies bacterianas foram identificadas e caracterizadas. A mutagênese por inativação genômica e experiências em plantas mostraram que a virulência do PSV depende criticamente do QS; No entanto, a falta de produção de sinal pode ser completada por E. Toletana ou P. Agglomerans de tipo selvagem. Parece também que a doença causada pela VGV é agravada pela presença das outras duas espécies bacterianas. Neste artigo, discutimos o papel potencial do sistema de controle de qualidade no estabelecimento de um consórcio estável que leva a uma doença poliactial.\nAs doenças bacterianas resultam da capacidade dos patógenos para colonizar e regular a expressão de genes em resposta ao ambiente anfitrião. Como resultado, a maioria dos estudos até a data foi centrada nas interações moleculares entre o hospedeiro e as bactérias. Existem interações entre o patógeno e outras bactérias que ocupam o mesmo nicho (“residentes”)? Por exemplo, Sibley et al. (2008) demonstrou recentemente que havia interações bacterianas interspecíficas entre os residentes bacterianos indígenas e não-patogênicos não-patogênicos de Pseudomonas Aeruginosa, presentes no anfitrião (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). Com este trabalho, pretendemos iniciar um estudo sistemático do papel da sinalização interspecífica na patogênese bacteriana das plantas usando como modelo a doença do nó oliva causado pelo patógeno bacteriano Pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV).\np. Savastanoi está intimamente relacionado a Pseudomonas Syringae, um fitopatógeno capaz de provocar muitos sintomas em diferentes plantas (Hirano e superior, 2000, Hofte e Your, 2006). Nos últimos anos, a compreensão dos mecanismos de virulência de P. Syringee em plantas herbáceas aumentou consideravelmente e várias cepas também foram sequenciadas (Feil et al., 2005, Joardar et al., 2005). Por outro lado, progresso na compreensão P. Savastanoi patogenicidade em plantas lenhosas eram muito lentas. As estirpes de P. Savastanoi podem infectar várias espécies hospedeiras lenhosas, como oliveira, cinzas e oleandre, muitas vezes provocando um crescimento de tecidos infectados, causando nós, chances e crescimento semelhantes às verrugas (Hirano e superior., Kennelly et al., 2000, 1997). 2007). Diferentes pathos são distinguidos nesta espécie, incluindo o PV. Savastanoi, PV. Fraxini e PV. Nerii causando nós e Gales em membros da família de Oléaceae e Laurels Roses (Gardan et al., 1992, Vivian and Mansfield, 1993).\nO PSV é o agente responsável pela doença do nó de azeite No Olivier (Olea Europaea L.) (Gardan et al., 1992, Vivian e Mansfield, 1993, Hirano e Upper, 2000). Surpreendentemente, muito poucos estudos moleculares sobre os determinantes da viulência da VGV foram realizados até agora. Esses estudos iniciais determinaram que um sistema de secreção tipo III e fitohormônios, ácido indole-3-acético (IAA) e citocininas estão envolvidos no desenvolvimento do nó. (Suico et al., 1985, vidro e Kosuge, 1988, Sisto et al., 2004, Rodriguez-Moreno et al., 2008).\nCuriosamente, além do PSV, duas outras espécies bacterianas Ter frequentemente associado ao nó da azeitona, nomeadamente pantoea agglomerans (Gavini et al., 1989, Fernandes e Marcelo, 2002, Marchi et al., 2006) e Erwinia Toletana. (Rojas et al., 2004).Até o momento, poucas coisas são conhecidas sobre os possíveis efeitos sinérgicos e comunitários destes enterobacteriaceae sobre o desenvolvimento de nós. P. Agglomerans é generalizada em muitos habitats naturais e agrícolas; Em particular, está associado a muitas plantas como epifyte e endophyte (Lindow e Brandl, 2003). Pode restringir o crescimento do VGV em oliveiras provavelmente pela produção de antibióticos, ou em alguns casos também aumentam o tamanho dos nós (Marchi et al., 2006). Sua freqüente presença e isolamento do mesmo ambiente, onde coexistem como residentes comuns de endófitas dos nós da azeitona, sugerem que as interações, a formação de comunidades e sinergias poderiam ocorrer. A comunidade bacteriana do nó oliva é, portanto, um nicho especial para estudar o papel da comunicação intersecífica e a interação da comunidade entre o patógeno e a bactéria residente no desenvolvimento da doença.\numa célula-célula Mecanismo de sinalização, conhecido por desempenhar um papel importante na virulência de bactérias fitopatogênicas, é o quorum sensor de sistema de comunicação intercelular (QS) (von Bodman et al., 2003). O QS regula a expressão de genes em resposta à densidade celular através da produção e detecção de moléculas de sinal (para revistas, ver referências de Basser (2002) e Fuqua e Greenberg (2002)). Em bactérias gram negativas, as moléculas de sinal mais comuns são lactonas de homosserinas N-acil (AHL), que são produzidas por uma lactona sintase acil Lousin na maioria dos casos para a família de proteína Luxi. Um regulador de transcrição / transcrição pertencente à família Luxr, em seguida, forma um complexo com os AHLs relacionados a concentrações de limiar (“quorum”) afetando assim a transcrição dos genes alvo (Fuqua et al., 2001). As bactérias na natureza crescem principalmente na forma de consórcios poli-microbianos, o que provavelmente envolve sinalização interespecífica pela ação de moléculas de sinal difusíveis (Ryan e Dow, 2008, Duan et al., 2009). Compreender a sinalização contínua em comunidades poli-bacterianas será um desafio para estudos futuros, pois a maioria das pesquisas QS se concentraram até agora nas configurações de monocultura.\nO papel dos AHLs em sinalização interspecífica e o treinamento de comunidades não é claro E, pelo menos em nossa opinião, não foi suficientemente estudado. Este trabalho deve constituir o início de um estudo sistemático desta questão usando a comunidade de nós de oliveira entre a PSV, P. Agglomerans e E. Toletana como um sistema de modelo. As três espécies produzem sinais AHL e participam na sinalização entre espécies? Até agora, o AHL QS é considerado específico para cada espécie / tensão, mas não está claro se AHL QS tem um papel importante a desempenhar em nichos envolvendo uma cooperação estável entre diferentes membros bacterianos. Os resultados mostraram que as três espécies têm sistemas AHL QS produzindo AHL semelhantes e em dois casos, produzindo os mesmos AHLs. Ahl QS foi mostrado aqui pela primeira vez como essencial para a patogenicidade do PSV, porque a virulência dos mutantes AHL QS-Knockout é bastante reduzida. Os co-inoculantes em pares da oliveira com residentes do tipo selvagem e mutantes PSV AHL sintase restaurar a plena virulência do PSV. Isso mostra que diferentes espécies podem formar consórcios microbianos estáveis em que AHL QS desempenha um papel importante. Nos estudos de co-inoculação da Planta demonstraram também que as sinergias entre as diferentes espécies bacterianas ocorrem, indicando que os nós da oliveira podem ser causados por uma doença poliactial.\nCepas bacterianas, plasmídeos e fundos\ncepas de PSV, P. Agglomerans e E. Toletana e plasmídeos utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1. As cepas bacterianas foram cultivadas a 28 ° C em um ambiente mínimo M9 adição de glicose (Sambrook et al., 1989), no meio B do rei (King et al., 1954) ou em Luria – Bertani. Seis Biossensores Bacterianos AHL foram utilizados para a detecção de AHL: Tensão CVO26 de ViOaceum Chromobacterium (McClean et al., 1997), Agrobacterium tumefaciens NTL4 / PZLR4 (Shaw et al., 1997), Escherichia Coli MT102 / PJBA132 (Andersen et al., 2001). Pseudomonas Putida F117 / PASC8 e P. PUTIDA F117 / PKRC12 (Riedel et al., 2001). As cepas de detector de cromobacterium, agrobacterium e pseudomonas foram cultivadas a 30 ° C, conforme recomendado, enquanto as estirpes de detector de E. coli foram cultivadas a 37 ° C.Os antibióticos nas seguintes concentrações finais foram adicionados conforme necessário: ampicilina, 100 μg mL -1; Estreptomicina, 100 μg ml -1; tetraciclina, 15 μg ml -1 (E. coli) ou 40 μg mL -1 (pseudomonas); gentamicina, 10 μg ml -1 (E. coli), 30 μg mL -1 (agrobacterium) e 40 μg ml -1 (pseudomonas); Kanamycin, 50 μg ml -1 (E. coli e C. vioaceum) ou 100 μg mL -1 (pseudomonas, pantoea e erwinia); Nitrofurantoin, 50 μg ml -1.\nTécnicas de DNA recombinante, incluindo digestão ao auxílio para enzimas de restrição, agarose gel Eletroforese, purificação de fragmentos de DNA, ligação com ligase T4, enchimento final usando a enzima Klenow e transformação de E. Coli foram realizados como descrito por Sambrook et al. (1989). Os plasmídeos foram purificados usando colunas de Jet Star (genomed, Löhne, Alemanha); O DNA total de PSV, P. Agglomerans e E. Toletana foi isolado pela Lyse Sarkosyl-Pronase, como descrito anteriormente por Better et al. (1983). Acoplamentos tripáticos entre E. coli e PSV, P. Agglomerans ou E. Toletana foram feitos usando a cepa auxiliar E. coli dh5 (PRK2013). As buscas de homologia de sequência de DNA foram realizadas usando o banco de dados National Biotechnology Center Blast Blast.\nClonagem e Inactivation de QS Genes em P. Savastanoi, P. Agglomerans e E. Toletana\npara PSV Dapp- PG 722 e E. Toletana Dapp-pg 735, dois bancos cosmid foram construídos usando o Cosmide Plauf3 (Staskawicz et al., 1987) como vetor. As inserções de DNA foram preparadas por digestão parcial pela ECORI dos dois DNAs genómicos, cada uma foi ligada no local correspondente em PLAF3. A DNA de ligadura foi então embalada em cabeças de phage usando o Extracto de Pacote Gigapack III Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, Estados Unidos) e partículas de fagos foram transduzidas em E. coli HB101, conforme recomendado pelo fornecedor. Os dois conjuntos de E. coli HB101, cada um abriga uma biblioteca cósmida, eram conjugados em massa no Biossensor AHL, C. Violaceum CVO26, como receptor. Cada conjugação resultou em um transconjetante: o Cosmide Pth100 do banco Cosmid E. Toletana DAPP-PG 735 e o Cosmid PJD100 do PSV Dapp-PG 722, que permitiu a cepa CVO26 de produzir arroxeado e se tornar violeta. O sistema AHL QS de E. Toletana DAPP-PG 735 foi chamado de EtOI / R e está localizado em um fragmento de 8 kb hindiii que foi clonado em PBBRMCS-1, produzindo pbbrtolir. O sistema AHL QS do PSV DAPP-PG 722 foi chamado PSI / R e está localizado em um fragmento NRU I 5800 PB, que foi clonado em PMOSSSIR produzindo PMOSBLUE.\nDiferentes mutantes genômicos zero têm Foi criado no sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722, P. Agglomerans DAPP-PG 734 e E. Toletana DAPP-PG 735 da seguinte forma. Para a PSV (I), um fragmento interno de 246 pb de PSSI foi amplificado a partir do DNA genómico da tensão DAPP-PG 728 utilizando o PSI para e PSI Rev (Tabela 1), e (ii) um fragmento de 518 pb de O PSSR foi amplificado usando os primers PSSR e PSSR REV (Tabela 1). Da mesma forma, (i) um fragmento interno de 387 PB do PAGI foi amplificado a partir do DNA genômico da cepa DAPP-PG 734 usando o Pagi para e o Pagi Rev (Tabela 1), projetado para ajuda. Genes publicados de Pagi / R de P. Agglomerans. PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009), e (ii) um fragmento de 561 PB de Pragt foi amplificado utilizando PraGRA e PRAGR REV (Tabela 1). Para E. Toletana (I), um fragmento interno de 350 BP de Toli foi amplificado a partir do DNA genômico da cepa DAPP-PG 735 utilizando os primers Toli e Toli Rev (Tabela 1) e (ii) um fragmento de 474 PB de Etor. amplificado utilizando os primers Tolr e Tolr Rev (Tabela 1). Todos os produtos de PCR mencionados acima foram clonados em pkknock-km digeridos usando eco rv, gerando pknock-psi, pknock-pssr, pknock-pagi, pknock-prag, pknock-etoi e pknock-eter (Tabela 1). Estes plasmídeos foram então utilizados como um sistema de administração suicida para criar mutantes de inativação da tensão do PSV DAPP-PG 722, P. agglomerans dapp-pg 734 e E. Toletana Dapp-pg 735 por recombinação homóloga como descrito anteriormente por Alexeyev (1999). Estas experiências permitiram a criação dos seguintes mutantes genómicos: DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 734pagi, DAPP-PG 734pag, DAPP-PG 735EO e DAPP-PG 735ETOR (Tabela 1). Todos os mutantes foram verificados por PCR usando iniciadores específicos do vetor de pknock-km e sequências de DNA genômico a montante e a jusante dos genes alvo.\nExtração, visualização e quantificação AHL\nas cepas de PSV, P.Agglomerans e E. Toletana foram testados pela primeira vez para a produção de AHL usando uma análise “T-Trail” em um meio sólido como descrito anteriormente por Piper et al. (1993), usando biossensores AHL (todos revisados por Steindler e Venturi, 2007). A. TUMEFACIENS NTL4 (PZLR4), C. ViOaceum Cvo26, E. Coli MT102 (PJBA132), Pseudomonas F117 (PKRC12) e Pseudomonas F117 (PASC8) em Placas Gelado de Luria – Bertani.\nOs AHLs foram purificado a partir do sobrenadante esgotado e separado, utilizando uma placa de cromatografia de camada fina (CCM) para cromatografia de fase reversa em C18, conforme descrito anteriormente por Shaw et al. (1997). Para a visualização no CCM, a placa foi coberta com uma fina camada de cima de cima AB Gelled com A. TOMEFACIENS NTL4 (PZLR4) na presença de 100 μg de ML – 1 de X-Gal como anteriormente descrito por Shaw et al. (1997) ou com o ágar de Luria Superior – Bertani semeado com C. Vicaceu CVO26 (McClean et al., 1997).\nDetecção de AHL e identificação por cromatografia de fase líquida de alto desempenho e MS\nOs AHLs produzidos pela PSV, E. Toletana e P. Agglomerans foram identificados por LC / MS / espectrometria de massa (MS) em uma experiência de monitoramento multi-reação como descrito anteriormente por Gould et al. (2006). A vigilância foi realizada na transição do íon pai para os picos dos grupos acilo e lactona. Os picos foram comparados a padrões conhecidos e também avaliados pela análise do tempo de retenção cromatográfica. Um volume de 200 ml de sobrenadantes de cultura acelular foi extraído utilizando o mesmo volume de acetato de etilo, após a adição de 0, 1% de ácido acético. As fases orgânicas foram separadas e secas sob um capô químico. As amostras extraídas para LC / MS / MS foram ressuspensas em 100 μl de acetonitrilo, filtradas em um filtro de 0, 2 μm (Millex LCR4, Millipore, Billerica, Ma, EUA) e diluído a 300 μl com água de milho contendo 0, 1 % ácido trifluoroacético. Um volume de 100 μl desta solução foi injetado em um GEMINI C 18 de 2, 0 mm por 150 mm (fenomenex, torrance, ca, EUA) operando a uma taxa de 200 μl min -1, o efluente. Fluindo diretamente para o espectrômetro de massa. O solvente foi composto de água contendo 0,05% de ácido trifluoroacético e solvente B incluiu acetonitrilo contendo 0, 05% de ácido trifluoroacético. A coluna foi equilibrada em 20% B durante 15 min, a amostra injetada e a coluna foram lavadas por mais de 15 minutos. Uma eluição de gradiente de 20% B a 95% B em 40 minutos foi então usada para a separação de AHLs e a coluna foi finalmente lavada a 95% B durante 10 minutos antes do reequilíbrio.\nTestes de motilidade, treinamento de biofilme , PRODUÇÃO DE EPS, IAA e Stoelophores, Lipase e Protease Atividades\nAtividades proteolíticas e lipolíticas, enxame e natação foram determinadas como previamente indicado Huber et al. (2001). O método utilizado para detectar os senophores foi adaptado da dosagem de ágar de ágar de ágar crómio-Azurol-S (Schwyn e Neiland, 1987), anteriormente descrito por Caballero-Mellado et al. (2007). A produção de IAA por bactérias foi medida utilizando uma dosagem cor como anteriormente descrita por Gordon e Weber (1951) e Vasantthakumar e McManus (2004).\nA análise da produção de exoploysaccaride (EPS) de P. Agglomerans e E. Toletana foi testado em um reis médio (b), enquanto o PSV foi testado em um médio de manitol sólido mínimo (mm) (0) (0), 2% extrato de levedura, 2% de manitol, 1, 5, %). % agar). Cepas bacterianas foram cultivadas em caixas de Luria – Bertani, riscadas para dar colônias individuais e cultivadas a 28 ° C durante 24 horas. As colônias simples foram então estriadas em KB ou MM Agar e cultivados por 48 horas a 28 ° C. Colônias que produzem EPs têm uma aparência de mucoide fluida, enquanto aquelas com um EPS deficiente têm uma morfologia não-mucoidal separada. E cremoso.\nExperimentos em Planta\nTodos nos experimentos da Planta foram realizados em plantas oliveiras (CV. Frantoio) envelhecido um ano. Para preparar as inoculos, as bactérias foram cultivadas em NA (agar de nutrientes) a 28 ° C durante 48 horas, suspensas em água desionizada estéril e ajustadas por espectrofotometria a cerca de 2 x 10 8 CFU ML -1. Para inoculações, 10 μl da suspensão bacteriana contendo 10 CFU mL -1 ou água (para plantas de controle) foram colocadas em feridas (3 a 5 por planta) feitas na casca de azeitona com um bisturi estéreiro anteriormente por Moretti et al. (2008).As feridas de plantas e testemunhas inoculares foram protegidas com parafilm m (American National Can, Chicago, IL, EUA). As plantas foram realizadas em caixas transparentes de policarbonato para atingir alta umidade relativa (90-100%) e mantidas em uma câmara de crescimento a 22-24 ° C, com uma iluminação de 70 μE M -2 s. -1 e um período de luz de 12 h.\nNo primeiro experimento na Planta, foi verificado se o sistema PSI / R AHL foi envolvido em patogenicidade e virulência. A tensão dos pais do PSP DAPP-PG 722 e os mutantes de ponta de PPSI e PPSR foram inoculados em oliveiras e a gravidade da doença foi avaliada após 60 dias medindo a profundidade de proliferação de tecidos usando a proliferação de tecidos usando “uma cena vernier.\nNo segundo experimento, o efeito da co-inoculação de oliveiras com VGV ou os respectivos mutantes de AHL QS e E. Toletana ou P. Agglomerans foram avaliados, bem como seus respectivos mutantes de AHL Qs, sobre a gravidade da doença e crescimento bacteriano nas plantas. após a inoculação. Para co-inoculação, as duas suspensões bacterianas foram mistas (proporção 1: 1) para obter uma concentração final de 10 CFU ML -1. A gravidade da doença foi registrada determinando o volume dos nós, calculados medindo o comprimento, a largura e a profundidade (subtraindo o diâmetro da haste medidos acima do nó daquele medido abaixo do nó) do nó para l Ajuda com um venier (Moretti et al., 2008). Para a determinação do crescimento bacteriano, o tecido correspondente ao local de inoculação foi extirpado e homogeneizado pela ruptura mecânica. As diluições seriais das suspensões bacterianas resultantes foram disseminadas sobre as placas de NA e incubadas a 27 ± 1 ° C. As contagens de colônias foram realizadas após 24 e 48 horas de incubação. As colônias de VGV foram facilmente distinguidas daquelas de E. Toletana e P. Agglomerans. As colônias do VGV, cujo crescimento era mais lento do que o de E. Toletana e P. Agglomerans, eram pequenos, brancos, com um centro ligeiramente elevado e uma borda plana e ondulada transparente. As colônias de E. Toletana eram não-pigmentadas, circulares, convexas, zumbidos inteiros, fluidos translúcidos e muito mucoides (apenas tipo selvagem). As colônias de P. Agglomerans eram amarelas, circulares, ligeiramente convexas, com borda irregular, com superfície mais ou menos enrugada, fluido translúcido e muito mucoide (apenas tipo selvagem).\nna terceira e quarta experiências, O efeito da co-inoculação de azeitona com VGV e E. Toletana no crescimento bacteriano foi avaliado 3, 8, 15, 30 e 60 dias após a inoculação (IPR), conforme descrito na segunda experiência. Três plantas replicadas para cada nível de tratamento ((1) PSV, (2) E. Toletana, (3) PSV + E. Toletana) foram incluídos em cada experimento. Para cada planta, as inoculos foram colocadas em três feridas feitas em três posições diferentes: basal (cerca de 20 cm acima do solo), intermediário e apical.\nos dados de O primeiro e o segundo em experimentos da Planta foram submetidos a uma análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de multi-praias Duncan, usando o software Dsaastat V. 1.1 (ONOFRI, 2007).\nOs dados do terceiro e quarto em experimentos da UNTA foram transformados em logaritmos básicos (para corrigir heteroestasticidade) e foram usados para definir um modelo misto linear (Garrett et al. , 2004, Onofri, 2010) descrevendo a relação entre o número de células bacterianas e a raíze quadrada do tempo (para cada estirpe / grupo) por meio de funções polinomiais da segunda ordem. Análises preliminares mostraram que o efeito da posição de inoculação (basal, intermediário e apical) não foi significativo e, portanto, a posição da planta e inoculação na planta foi adicionada ao modelo como efeitos aleatórios, a fim de ter em conta o dados. A estimativa dos parâmetros foi feita pela máxima probabilidade, conforme implementado no pacote NLME no ambiente estatístico R (Venables e Ripley, 2002). Diferenças entre cepas / grupos em termos de crescimento cinética foram avaliadas usando testes de verossimilhança.\nNúmeros de acesso de sequência de DNA e nucleotídeos\nTodas as seqüências de DNA foram realizadas no Centro de CRIBI (universidade de Pádua, Itália) ou macrógeno (www.macrogen.com) e sequências nucleotídicas foram depositadas no Genbank / Embl / DDBJ. O Locus EtOI / R QS de E. Toletana DAPP-PG 735 é depositado sob o número de acesso FN870373, enquanto o Locus PSI / R PSV é depositado sob o número de acesso FN870374.\nAHL Sistemas de produção e QS de cepas P. Savastanoi, P. Agglomerans e E. Toletana\nprimeiro, foi interessante determinar se os residentes do patógeno do PSV e a azeitona produziu Moléculas de sinalização AHL QS. Todas as cepas que testamos (Tabela 1) produziram compostos AHL, como inicialmente detectados por teste de placa em forma de T em C. vioaceum CV026 e A. TOMEFACIENS NTL4 (PZLR4) e E. coli MT102 (PJBA132), biossensores. Por análise CCM, inicialmente atribuímos o tipo de AHLs produzidos pela PSV, P. Agglomerans e E. Toletana (Figura 1 e Tabela 2). Os resultados mostraram que todas as cepas VGV e E. Toletana produziram duas moléculas AHL identificadas por provisoriamente como sendo C6-3-Oxo-HSL e C8-3OXO-HSL (Figura 1). P. Agglomerans, por outro lado, provavelmente produziu o C4-HSL e o C6-HSL. A fim de confirmar inequivocamente os AHLs produzidos pelos três corantes, utilizamos a cromatografia líquida de alto desempenho na fase reversa C 18 e a espectrometria de massa, e conseguimos verificar a produção de 3-Oxo-C6-HSL e 3 -OXO -C8. -HSL por PSV e E. Toletana, e C6-HSL e C4-HSL por P. agglomerans (Figura 1 adicional).\nPSV AHL Produção isolada dos nós de azeitona e louro-cor-de-rosa, E. Toletana e P. Agglomerans. (a) CCM analisa os padrões sintéticos AHL usando o Biossensor PNTL4 de Tumefaciens como uma camada de recuperação. (b) Análise de TLC do AHL produzido por sete cepas do PSV usando Biossensor de A. TOMEFACIENS PNTL4 como uma camada de recuperação. LANES: (1) tensão lmg 2209 t; (2) DAPP-pg 536; (3) DAPP-pg 722; (4) DAPP-pg 723; (5) DAPP-PG 725; (6) DAPP-pg 726; (7) DAPP-PG 728. (c) Análise CCM da AHL produzida por duas cepas E. Toletana usando Biossensor de PNTL4 TOMEFACIENS como camada de recuperação. LANES: (8) Stem CFBP 6631 T; (9) DAPP-PG 735. (d) Análise TLC de padrões sintéticos AHL usando o Biosensor C. ViOaceum CV026 como uma camada de recuperação. (e) Análise do CCM de AHLs produzidas por P. Agglomerans DAPP-PG 734 (Strip 1) usando o Biosensor C. ViOaceum CV026 como uma camada de recuperação. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; CCM, cromatografia de camada fina.\nO sistema AHL QS do PSV DAPP-PG 722 foi identificado e clonado, como Explicado em materiais e métodos, consistindo de um pares Luxi chamado PSI e um homólogo luxr chamado PSSR (Figura 2A). O sistema PSI / R tem um grau muito alto de homologia (mais de 90%) com o sistema AHLI / R AHL QS de P. Syringae, que responde ao C6-3-Oxo-HSL e está envolvido na virulência (Quinones ET al., 2005). Da mesma forma, identificamos e clonamos o sistema AHL QS de E. TOLETANA DAPP-PG 735 (veja a seção Material e Métodos) que consiste em um ponto designado por Luxi designado (Figura 2A). O sistema ETOI / R tem uma homologia significativa (cerca de 60%) com o sistema Erwinia Chrysanthemi PV EXPI / R. zeae (= dickeya zeae), que não é apenas responsável pela produção de C6-3-Oxo-HSL, mas também de sua resposta (Nasser et al., 1998, Hussa, 2008). Foi estabelecido por PCR, clonagem e sequenciamento que o sistema AHL QS de P. Agglomerans da cepa DAPP-PG 734 foi ortólogo (identidade de mais de 95%) em relação ao sistema PAGI / R de P. Agglomerans PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009).\nAHL cartões genéticos e produção por mutantes AHL QS-Knockout Azeite Isolados aninhados no PSV, E. Toletana e P. Agglomerans. (A) Mapas genólicos de PPSI / R e ETOI / R Locais clonados de PSV e E. Toletana, respectivamente. Ao ver o sistema PPSI / R, é mostrado que os genes são ortoólogos do gene PSV sequenciado NCPPB 3335. De fato, a região sequenciada aqui na tensão do DAPP-PG 722 é ortólogo daquela na tensão 3335 do NCPPB (( B) (a) Análise do CCM de padrões sintéticos AHL usando o Biossensor PNTL4 de Tumefaciens como uma camada de recuperação. (b) Análise do CCM dos AHLs produzidos pela PSV PSV DAPP-PG 722 e derivados mutantes usando A. Biossensor PNTL4 de Tumefaciens como uma camada de recuperação. psi – é dopp-pg 722ssii; PSSR – é o DAPP-PG 722SSII. c) Análise do CCM de AHLs produzidas pela estirpe matriz E. Toletana Dapp-pg 735 e derivados mutantes utilizando a Biossensor de PNTL4 TOMEFACIENS como uma camada de recuperação. TOLI- é DAPP-PG 735TOLI; TOLR- é DAPP-PG 735TOLR. d) Análise TLC de normas sintéticas AHL utilizando Biosensor CV026 de C.Vioaceum como uma camada de recuperação. (e) Análise do CCM de AHLs produzidas pela estirpe materna de P. agglomerans DAPP-PG 734 e derivados mutantes usando o Biosensor C. ViOaceum CV026 como uma camada de recuperação. Pagi – é dopp-pg 734pagi; PAGRA – é o DAPP-PG 734PAGR. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; Qs, detecção de quórum; Savastanoi; CCM, cromatografia de camada fina.\nOs mutantes de knvout de PSV, P. Agglomerans e E. Toletana foram gerados tanto nos genes QS Luxi – quanto Luxr – como descrito na seção Material e Métodos. Nenhum dos mutantes da família luxífera das três espécies (DAPP-PG 722SSI, DAPP-pg 734pagi e DAPP-PG 738ETOI; Tabela 1) produziu níveis detectáveis de AHL quando foi purificado de sobrenadantes gastos (Figura 2B). Este resultado indica que as três espécies provavelmente têm apenas um sistema AHL QS; Para a VGV, esta conclusão é corroborada pelo fato de que apenas um par da família Luxi / R está presente em seu genoma, que foi recentemente sequenciado (Rodriguez-Palenzuela et al., 2010). Os mutantes da família Luxr, por outro lado (DAPP-PG 722PSR, DAPP-PG 734pag e DAPP-PG 738ETOR; Tabela 1) produziram quantidades de AHL semelhantes às produzidas pelo tipo selvagem (Figura 2B), Indica em três sistemas, não houve loop de amplificação de sinal através da regulamentação do gene da família Luxi. Estas conclusões são baseadas na análise CCM de extratos de sobrenadantes esgotados de quantidades iguais de cultura na mesma fase crescente. Esta é uma indicação muito boa, mas as medições realizadas em toda a fase de crescimento provavelmente confirmariam essa conclusão mais.\n$ config, não encontrado\nQs no PSV regula a virulência em plantas\npara examinar Se o sistema PSV PSA / R AHL está envolvido em patogenicidade e virulência, os mutantes da PSV DAPP-PG 722 e os mutantes derivados de PPSI e PPSR foram avaliados, e a gravidade da doença foi avaliada. Depois de 60 dias. Os resultados mostrados claramente que as mutações no PSI e PSSR reduzem significativamente o tamanho dos nós e, portanto, a virulência dos mutantes (Figura 3a). A profundidade dos nós foi significativamente reduzida (p = 0, 01) nas hastes inoculadas com os mutantes DAPP-PG 722SSSSS e DAPP-PG 722PSRS em relação aos inoculados com o tipo selvagem mostrando respectivas reduções de cerca de 80% e 88% (Figura 3B). ) Foi importante, por conseguinte, foi concluído, ao nosso conhecimento, que tinha sido encontrado que, pela primeira vez, a AHL QS desempenhou um papel central na virulência do PSV.\nPapel do QS AHL na formação de nós de oliveira induzidos pelo PSV. (a) as hastes de oliveiras envelhecidas em um ano (cv. fritoio) foram inoculadas com 108 mutantes derivados da CFU ML- 1 PSV DAPP-PG 722 (tipo selvagem: WT), PSSI – e PSSR – e com plantas de controle. Os sintomas da doença foram observados 60 dias após a inoculação. Grandes nós elevados foram observados nas hastes inoculadas com DAPP-PG 722 (tipo selvagem). Os mutantes do déficit na AHL QS PSI – e a PSSR – induziu apenas a proliferação celular limitada, que permaneceu limitada às bordas da ferida. (b) O tamanho dos nós foi estimado medindo a profundidade de proliferação tecidual em cinco plantas para cada tratamento e para três nós por planta. Diferenças estatisticamente significantes nos nós entre o tipo selvagem e os mutantes QS foram determinados pela análise de variância. Cada valor é a média de cinco repetições ± desvio padrão. As médias não são significativamente diferentes (p = 0, 01), dependendo do múltiplo teste de Duncan. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; Qs, detecção de quórum; Savastanoi.\nPSV AHL Sinthase mutantes pode ser salvo pela presença de E. Toletana e parcialmente por P. agglomerans\na presença de . Toletana e P. Agglomerans nos nós da oliveira podem resultar na formação de uma comunidade poli-microbiana com o patógeno do PSV. Desde E. Toletana e P. Agglomerans produzem AHLs e que os mutantes de PSV de AHL negativo têm uma virulência muito baixa (ver acima), isso permite que uma configuração elegante estabeleça se os sinais da AHL são compartilhados e se as comunidades intersecídicas forem formadas no Nó Olivier. .\nComo E. Toletana produz estruturalmente o mesmo AHL como PSV (veja acima), uma co-inoculação na Planta foi inicialmente colocada no lugar. O mutante PSI AHL sintase foi utilizado para a co-infecção de plantas de oliveira com E. Toletana Damp-.Tensão do tipo selvagem PG 735. Esta co-inoculação permitiu que o mutante PPSI do PSV induza a formação de nós, bem como a tensão do tipo selvagem (Figura 4). Isso pode ser atribuído às duas cepas formando um consórcio, onde E. Toletana fornece aos AHLs no DAPP-PG 722SSIS, que é então capaz de induzir a expressão do gene alvo do AHL QS resultando na formação de nós. D ‘olive. As inoculações semelhantes em pares também foram realizadas com o tipo selvagem DAPP-PG 734 de P. Agglomerans e, neste caso, uma restauração parcial da formação de nós foi observada (Figura 4). Isso pode ser devido ao fato de que P. agglomerans produz diferentes AHLs de PSV, ao qual o sistema PSI / R provavelmente respondeu com menos eficiência. Importância, emparelhamento em inoculações da Planta com a E. Toletana ou a P. Agglomerans AHL Sinthase Mutant, EtOi Gold Pagi, respenutivamente, não restaurou o treinamento de oliveiro. Isso é claramente índices que a comunicação interspecial através da partilha de AHLs foi fundamental nas experiências de co-inoculação anteriores, onde os mutantes do PSV AHL Sinthase foram co-inoculados de forma independente com as duas cepas do tipo selvagem (Figura 4).\nEfeito da co-inoculação de plantas de oliveira (CV. Fritoio) com PSV e E. Toletana, P. Agglomerans e os respectivos mutantes AHL QS. PSV: As colunas indicam efeito sobre a gravidade da doença, expressa como volume de nó (60 dias após a inoculação), de inoculação do PSV WT (colunas chocadas), de mutantes com deficiência de QS de PSV (colunas brancas representam PSI Mutant e colunas pretas PSSR Mutantes) sozinho ouro em combinação com P. agglomerans (pag) ou E. Toletana (e) e relativos mutantes qs-ímpares, pagi, Prag, Etoi e Etor. As plantas de controle de azeitona foram inoculadas com a água Distille (coluna cinza). Cada valor é a média de cinco replicações ± sexo seguido pelas mesmas letras não são estatisticamente diferentes em p = 0,05 (teste de vários intervalos de Duncan). AHL, lactona de homosserina acilo; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, sensor de quorum.\nImagem em tamanho normal\nO pss PSSR mutante coud não ser concluído para o treinamento de nó de azeitona por E. Toletana e P. Agglomerans; A razão mais provável é que o Mutante PPSR PSV não pode responder aos AHLs. Estes resultados também indicam que E. Toletana e P. AGGLOMERS TIPOS selvagens não podem causar doenças sozinhas na ausência de PSV do tipo selvagem. Importa, em todas as experiências de co-inoculação, quantidades comparáveis de unidades de formação de colônias do PSV (CFU) estavam presentes no local de inoculação (Figura 5).\nEfeito sobre os níveis de co-inoculação de usinas de oliveira (CV. Frantoio) com PSV e E. Toletana, P. Agglomerans e os respectivos mutantes AHL QS. PSV: As colunas negras indicam efeito sobre o crescimento bacteriano na Planta (60 dias após a inoculação) de inoculação dos mutantes prejudicados QS da PSV da mesma bactéria psi (colunas brancas) ouro PSSR (colunas chocadas) sozinho ouro em combinação com p . Agglomerans (pag) ou E. Toletana (e) e relativos Mutantes qs-ímpares, pagi, Prag, ETI e ETR. Cada valor é a média de cinco replicações ± sexo seguido pelas mesmas letras não são estatisticamente diferentes em p = 0,05 (teste de vários intervalos de Duncan). PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi.\nConcluiu-se que ambos E. Toletana e P. Agglomerans podem formar comunidades de interspecias estáveis com a VGV e que a comunicação através da partilha de sinais da AHL estava ocorrendo em Planta.\nPapel do interspecial de sinalização e consórcios em pares na doença de oliva\ncomo evidente a partir dos resultados descritos acima, a PSV forma comunidades bacterianas com E. Toletana e P. Agglomerans. A fim de começar a compreender o papel e o resultado das possendas entre estas três espécies bacterianas, a virulência da VGV na presença das outras bactérias de Olive Knot-Knot foi testada na Planta. As plantas oliveiras de um ano foram inoculadas para cada tensão bacteriana com 10 μl de uma suspensão bacteriana 10 8 CFU ML -1. Como mostrado na Figura 4, a melhoria significativa da virulência da PSV na presença de E. Toletana foi observada como indicado por um aumento considerável (quase 30%) do volume de nó. Isso indica que E. Toletana contribui para a patogenicidade do PSV; O aumento da virulência não foi devido a mudanças nos níveis de PSV na co-inoculação como costa foi diferença significativa na carga bacteriana (Figura 5). A mesma contribuição para a virulência do PSV foi observada quando co-inocular com a sintase mutante de E. toletana AHL; Não se pode exclusivo, no entanto, que os sinais do PSV AHL são percebidos por E. Toletana. Nenhum aumento na virulência, por outro lado, foi observado quando P.Agglomerans foi co-inoculado com a VGV e, de fato, uma ligeira diminuição do volume do nó era observar. Quando co-inocular com o p. AGLOMERANS AHL sintase mutante, no entanto, tem um aumento significativo na formação de volume do nó foi detectada, o que significa que Qs regula algum fator (s) em P. agglomerans, que limitam o crescimento do PSV e / ou expressão gênica.\nApós os resultados óbvios na natureza poli-bacteriana da doença e na partilha de sinais AHL entre o PSV e E. Toletana, foi interessante entender melhor essa comunidade bacteriana. O impacto da co-inoculação sobre a dinâmica de crescimento dessas bactérias tem sido determinado em dois experimentos distintos. Como os resultados desses experimentos são semelhantes, somente os dados de um dos experimentos foram relatados. Por conseguinte, a co-inoculação foram realizadas e as populações bacterianas foram determinadas até 60 dpi. Quando o PSV DAPP-PG 722 foi inoculado sozinho, um aumento de 10 vezes poderia ser detectado na população bacteriana isolada de 8 dpi tecido inoculado (cerca de 10 7 CFU por site) (Figura 6A, círculos vazios). A população PSV aumentou gradualmente para cerca de 1, 5 × 10 8 CFU por site a 60 dpi. Quando foi realizada uma inoculação mista com E. Toletana DAPP-PG 735 (Figura 6A, Círculo Completo), o crescimento do VGV foi significativamente aumentado (teste da razão de verossimilhança com p < 0 0001), enquanto quando E. Toletana foi inoculado sozinho no tamanho de suas populações (Figura 6b, triângulo aberto). Por outro lado, o crescimento de E. Toletana não poderia ser adequadamente descrito usando um modelo polinomial de segunda ordem, mas tem sido estimulado significativamente para 30 dpi (o erro de diferença padrão foi de 0, 018) na presença de PSV (Figura 1). 6b, triângulo completo), e após 60 dpi, o tamanho da população resultante da infecção mista foi de cerca de 103 vezes maior do que o obtido por simples inoculações. Estes resultados são uma indicação adicional da relação íntima e mútua entre a VGV e E. Toletana no nó oliva, resultando em um agravamento de sintomas de doenças, a partilha de sinais AHL QS e um aumento do crescimento bacteriano. De ambas as espécies.\nAs populações de pessoas dinâmicas do DAPP-PG 722 e E. Toletana Dapp-pg 735 inoculado em hastes oliveiras (CV. Fritoio), sozinho ou em combinação. (a) Crescimento do PSV sozinho (linha contínua e círculo aberto) ou em combinação com E. Toletana (linha pontilhada e círculo preenchido). (b) Crescimento de E. Toletana sozinho (linha completa e triângulo aberto) ou em combinação com VGV (pontilhada e triângulo total). Os símbolos indicam as contas observadas e as linhas indicam o ajuste do modelo misto linear. O erro típico de uma média foi 0, 013.\nTeste de regulamento dependente AHL de vários fenótipos em P. Savastanoi, p. Agglomerans e E. Toletana\nPara estabelecer o papel possível dos sistemas AHL QS em bactérias associadas a nós de oliveira, vários fenótipos importantes foram testados para a regulamentação do AHL Qs nas três espécies. Uma lista de todos os fenótipos testados para o regulamento AHL QS é resumida na Tabela 2.\nCuriosamente, decidimos que P. Agglomerans Dapp-Pg 734 e E. Toletana Dapp-pg 735 também produzem IAA. Testamos os tipos selvagens PSV (DAPP-PG 722), P. Agglomerans (DAPP-PG 734), E. Toletana (DAPP-PG 735) e seus mutantes derivativos (DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 722SSR, DAPPP 734Pagi, DAPP-PG 734PAGR, DAPP-PG 735ETO e DAPP-PG 735ET) para a produção de IAA. Da mesma forma, nós verificamos se AHL QS estivesse envolvido na produção de senopapores, a produção de EPS, as atividades proteolíticas e lipolíticas secretadas e a motilidade por natação e enxame. Os resultados dessas investigações são resumidos na Tabela 2. Surpreendentemente, na maioria dos testes, não foram observadas diferenças significativas entre as cepas de motores e seus derivados QS mutantes nas condições testadas. A produção de PES foi testada qualitativamente em um teste de placa em todas as cepas selvagens e mutantes. Os dois mutantes AHL Qs da tensão PSV DAPP-PG 722 apresentaram uma clara redução na produção de PES em relação ao tipo selvagem (dados não apresentados); A produção de PES foi restaurada quando o Mutant DAPP-PG 722PSI foi cultivado na presença de C6-3-OXO ou C8-3OXO-HSL (não renome). Da mesma forma, para P.Agglomerans, a inativação do pagi resultou em uma redução na produção de PES; No entanto, nenhuma redução foi observada no Mutant PraGR em relação ao tipo selvagem. A produção de EPS foi restaurada quando o mutante DAPP-PG 734PAGI foi cultivado na presença de C4-HSL ou C6-HSL (dados não apresentados). A produção de EPS também foi reduzida no mutante E. Toletana Dapp-pg 735eto em relação à do tipo selvagem, e a complementação por adição exógena C6-3-Oxo-HSL ou C8-3OXO-HSL restaurou a produção de EPS . No entanto, na E. Toletana, a inativação da etch aumentou consideravelmente a produção de PES (dados não apresentados).\naté à data, muitos estudos mostraram que o As doenças das plantas resultaram de interações complexas entre o patógeno e o anfitrião. A interação do patógeno com a flora bacteriana residente é muito menos estudada e compreendida. As bactérias fitopatogênicas formam comunidades bacterianas estáveis com outras bactérias residentes não patogênicas? Essas redes de associação são na origem de uma infecção multi-microbiana? A sinalização intercelular tem um papel a desempenhar no estabelecimento desses consórcios bacterianos? Estas são as perguntas que começamos a abordar aqui usando a comunidade bacteriana presente na doença do nó de oliva. Este nicho é criado pelo patógeno do PSV; No entanto, várias outras espécies bacterianas residentes não patogênicas foram isoladas nesse ambiente, na maioria das vezes E. Toletana (Rojas et al., 2004) e P. Agglomerans (Marchi et al., 2006). As principais conclusões deste trabalho são que (i) as três espécies isoladas do nó Olivier produzem sinais de AHL e têm um sistema AHL QS; Em particular, E. Toletana e PSV produzem os mesmos AHLs, (ii) AHL Qs em PSV é essencial para a virulência, porque os mutantes de eliminação são fundamentalmente não virulentos, (iii) PSV Os mutantes da AHL Sintase podem ser salvos por e. Toletana e Parcialmente por P. Agglomerans, destacando a partilha de sinais de AHL e a formação de comunidades bacterianas estáveis, e (iv) E. Toletana forma comunidades na fábrica, atuando como patógeno associado em sinergia com o patógeno principal do PSV, aumentando as co-inoculações o número de bactérias de ambas as espécies e a gravidade da doença. Todos os mutantes bacterianos construídos neste estudo foram produzidos durante eventos homólogos de recombinação e também envolvem inserções plasmídeas. Portanto, é possível que nossos experimentos realizados em plantas sem seleção de antibióticos levem a um retorno de mutantes para o tipo selvagem. Como todas as experiências de supervisão de nosso estudo não levaram ao comportamento do tipo selvagem, concluímos que nenhum feedback significativo ocorreu.\nAtualmente, os únicos determinantes moleculares conhecidos pelo desenvolvimento do desenvolvimento do nó em O PSV é o sistema de secreção do tipo III (Sisto et al., 2004) e phytohormones de citocinina e IAA (Suico et al., 1985, vidro e Kosuge, 1988, Rodriguez-Moreno et al., 2008). Ahl Qs agora pode ser adicionado a esta lista e, ao nosso conhecimento, é o primeiro sistema regulatório ligado à viulência do PSV. Ahl Qs provavelmente não afetará a colonização inicial, mas sim a expressão genética da virulência associada a altas densidades populacionais. Seria agora relevante determinar se a AHL QS está envolvida na regulação dos três determinantes da virulência identificada até à data. Muito provavelmente, ahl Qs também regula muitos outros fatores de virulência. O recente sequenciamento do genoma do PSV destacou a presença de muitos loci que podem ser envolvidos na virulência, incluindo cinco sistemas de secreção diferentes, efeitos do tipo III, compostos fenólicos, quimiotaxis, motilidade, l de adesão e genes de toxina (Rodriguez-Palenzuela). et al., 2010). Nós relatamos que a produção de PES é regulada pelo sistema PSV PSC / R; No entanto, não está claro se o EPS está envolvido no processo da doença. O SPE, por exemplo, é um fator de virulência e é regulado pelo AHL QS. Está intimamente relacionado a P. Syringee (Quinones et al., 2005).\nA vida de bactérias dentro do nó é desconhecida no sentido amplo. Um estudo recente, no entanto, mostrou que a VGV cria o nó formando agregados bacterianos, micococonia e biofilmes multicamadas (Rodriguez-Moreno et al., 2009, Perez-Martinez et al., 2010). Sabemos pouco sobre os efeitos de P. agglomerans e E.Toletana sobre o desenvolvimento de nós e a possível formação e estabilidade de consórcios bacterianos multipecíficos formados no nó de oliva. P. Agglomerans é generalizada em muitos habitats naturais e agrícolas; Em particular, está associado a muitas plantas como epifyte e endophyte (Lindow e Brandl, 2003). Além disso, a P. Agglomerans pode ser convertida em um patógeno tumorigênico específico do hospedeiro, uma bactéria comensal e epífita associada a muitas plantas, adquirindo uma ilha de patogenicidade transmitida por um plasmídeo (Barash e Manulis-Sasson, 2007).\nOs AHLs produzidos por E. Toletana (C6-3-Oxo-HSL e C8-3OXO-HSL) são os mesmos que os produzidos pela PSV. Esta é a prova de que pode haver sinalização intersecífica através do AHL entre as duas espécies quando ocupam o mesmo nicho. P. Agglomerans, por outro lado, produz C4-HSL e C6-HSL; Não podemos excluir que o PSSR e / ou o Etor são capazes de responder a esses AHLs. Da mesma forma, não sabemos se Pragg também pode responder a AHLs produzidos por E. Toletana e PSV. Nossos estudos envolvendo co-inoculação binária na Planta mostraram que E. Toletana pode salvar os mutantes PSV AHL sintase para sua capacidade de induzir nós de oliveira. Como os sintomas colocam pelo menos 25 a 30 dias para crescer, esse resultado sugere isso. Toletana e PSV são capazes de formar um consórcio estável, onde as duas espécies sofrem sinalização interspecífica e um AHL de compartilhamento. P. Agglomerans também pode economizar, em parte, o Mutant PPSI do PSV; A razão para este resgate parcial é que os AHLs produzidos por P. agglomerans não são bem reconhecidos pelo PSSR, ou que o consórcio não é tão estável quanto para E. Toletana. É possível que nesse nicho, que permita que tal consórcio cresça, incentivar a aparência de treches bacterianos de fraude (por exemplo, os trechos cegos do sinal, que não respondem aos sinais AHL), que não contribuem para A comunidade pode se beneficiar de “fatores” ou “bens públicos” produzidos pelos cooperadores QS (Diggle et al., 2007, Venturi et al., 2010). Muitos outros isolados bacterianos devem ser isolados desse nicho para determinar essa possibilidade.\nA capacidade do PSV para induzir a formação de nós de oliveira é baseada em sua capacidade de regular a expressão dos genes em resposta. Para o Ambiente do Host. Também começamos a nos perguntar se a microflora avorentulenta aborígene contribui para a doença causada pelo PSV. A co-inoculação de E. Toletana com VGV resultou em um aumento significativo no volume de nós de oliveira, indicando que esse consórcio é provavelmente muito estável e que a PSV se beneficia da presença de E. Toletana e talvez até o inverso. Também é importante notar que os estudos de co-inoculação determinaram que E. Toletana e vice-versa estimularam significativamente o crescimento do PSV no nó oliva, que indica uma associação estreita entre o metabolismo, nutrientes e sinal. Entre as duas espécies bacterianas. Este efeito sinérgico de E. Toletana com P. Savastanoi indica claramente uma vantagem mútua para ambas as espécies se crescerem e compartilhar o mesmo nicho. Compreender os mecanismos de cooperação e comunicação dessas duas bactérias iluminarão o processo de comunicação interspecífica. E. Toletana não é patogênica quando é inoculado com o Mutant PSSR do AHL QS PSV, mas pode servir como um patógeno acessório quando é consórcio com PSV do tipo selvagem. É possível que a expressão dos genes do PSV possa ser influenciada pela presença de residentes bacterianos ou o consórcio microbiano estabiliza o PSV metabolicamente. A co-inoculação de P. agglomerans com VGV, por outro lado, resultou em uma redução no volume do nó, que aumentou quando o co-inoculante era o pagi do Mutant AHL Synthase. P. Aglomerans é mais provável que produza e AHL QS regula o fator, que afeta a VGV, e quando a produção é reduzida, P. agglomerans também pode atuar como um patógeno acessório.\nHá muito. Poucos relatórios sobre a contribuição / papel da flora microbiana aborígene residente do hospedeiro na ação de um patógeno recebido. É interessante notar que, em 1998, foi relatado que na rizosfera do trigo, há uma interagência de espécies bacterianas que possivelmente podem compartilhar moléculas de AHL (Pierson et al., 1998). Dois estudos recentes mostraram que a microflora indígena teve influência sobre a virulência de P. aeruginosa e que também afeta os perfis de expressão genética dos fatores associados à virulência (Duan et al., 2003, 2003). .Atualmente não está claro se há compartilhamento de sinal entre essas bactérias; Observou-se que o sinal da AI (Autoinutor) -2 produz tanto as bactérias do grama positivo quanto o Gram negativo podem ser um sinal intersecífico nesta comunidade (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). É interessante notar que Dulla e Lindow (2009) relataram muito recentemente que as bactérias epifíticas indígenas produzem a mesma p. syringae p. Syringae pode excluir e interferir no processo causando a doença. Este trabalho destacou um diálogo cruzado na fitafera da fábrica através da AHL, que resultou em mudanças no comportamento (principalmente motilidade, o que significa menos invasão) e, portanto, a virulência de P. Syringee PV. Syringae. A ocorrência da doença durante a co-inoculação com bactérias epífitas produtoras de AHL foi reduzida em 50%. Acredita-se que isso se deve à indução prematura e prematura de AHL Qs afetando a expressão dos fatores associados à virulência. Este exemplo mostra que a comunicação interspecífica com flora bacteriana indígena também pode ter consequências negativas para agentes fitopatogênicos.\nOs dados apresentados aqui reforçam ainda mais a aparente complexidade de infecções poli-microbiais; Nossos resultados indicam um papel de compartilhar a AHL e a sinalização interspecífica, que fornece um excelente modelo de trabalho para aprofundar as interações entre as comunidades bacterianas. Este estudo concentra-se nas interações medidas por AHL em habitats naturais; Até agora, o papel do QS nas bactérias associados a plantas foi estudado quase exclusivamente com cepas únicas, apesar da possibilidade de sinalização interspecífica que pode ser mediada pelo compartilhamento de moléculas de sinal AHL em comunidades misturadas microbianos. As interações entre as bactérias do ambiente natural são complicadas por vários fatores, incluindo a resposta do hospedeiro, os parâmetros ambientais e a composição específica da comunidade. Sugere-se que estudos futuros precisarem desenvolver sistemas in vitro para uma compreensão prática e detalhada das interações de espécies. Acabamos de começar a desenvolver ferramentas para estudar interações microbianas no ambiente natural.\nNossos estudos futuros se concentrarão na estabilidade e do papel desempenhado por cada espécie neste consórcio microbiano. O PSV pode ser considerado como o nicho criador ou o líder deste consórcio, enquanto P. agglomerans e E. Toletana são ocupantes ou moradores de nicho, que podem, no entanto, se tornarem patógenos auxiliares na presença de um nicho do fabricante. Atualmente, não está claro se esses consórcios patogênicos têm uma razão comum. Assumimos que o consórcio dos nós de oliveira evoluiu para se tornar estável e cooperativo porque o aumento do grupo genético e o repertório metabólico combinado aumentam as chances de sobrevivência dos participantes em várias condições (Venturi et al., 2010). Este trabalho sugere que os processos de comunicação complexos entre espécies podem ser necessários para a formação desses consórcios.\nPrevious Post - Previous post: Bem-vindo ao ' inferno … O paraíso dos livros proíbe\nNext Post - Next post: Culturas e flexículas. Para uma abordagem de dicionário de cultura compartilhada – Perseu


Repetidor: dicas de como instalar para ampliar sua rede Wi-Fi\n14 de abril de 2020\t/ Amanda Vergueiro\t/ Hardware\nConfira dicas para instalar um repetidor de sinal e ter Wi-Fi na casa toda\nConheça algumas medidas que podem fazer seu repetidor ter um melhor desempenho\nRepetidores de sinal são uma boa alternativa para quem precisa aumentar o alcance do sinal Wi-Fi. Marcas como TP-Link, D-Link e Multilaser fornecem aparelhos do tipo no mercado nacional por preços a partir de R$ 45. Esses dispositivos prometem ser uma alternativa mais barata do que roteadores potentes e sistemas Mesh, porém precisam ser instalados da maneira correta para funcionar bem. Confira a seguir algumas dicas para usar um repetidor e melhorar sua rede sem fio pagando menos.\nEstabelecer o tipo de uso\nO primeiro passo é estabelecer qual a principal função do repetidor em sua rede. Isso porque os dispositivos podem ser usados não só para expandir o alcance do roteador, porém também para criar um tipo de Wi-Fi auxiliar, como uma rede de convidados ou um sinal para um dispositivo ou cômodo específico. Portanto, é importante verificar os recursos que o dispositivo proporciona antes de comprar, porque alguns modelos oferecem configurações mais avançadas que outros. Isso torna possível fazer diferentes tipos de uso desses repetidores, além de apenas replicar a rede.\nConfigurar um repetidor não é tão difícil quanto parece, até porque quando o modelo traz função WPS, existente também em alguns roteadores. Dessa maneira, o usuário pode parear ambos apertando o botão em nos dois dispositivos ao mesmo tempo. Alguns repetidores oferecem ainda a possibilidade de configuração por meio de aplicativos para smartphone, o que deve facilitar bastante instalação e ajustes em uma interface mais simplificada.\nExistem várias formas de melhorar a qualidade do Wi-Fi. Uma delas é deixar os roteadores em locais mais altos na casa, o que favorece à propagação do sinal pela casa e também evita que as ondas encontrem muitas barreiras. Como os repetidores funcionam ligados diretamente em uma tomada, a decisão de onde será lugar ideal pode ser um pouco problemática. Logo, a dica é escolher o lugar mais alto possível – desde que o sinal principal chegue até lá e o dispositivo consiga cobrir a área desejada.\nLonge do roteador (mas não tanto)\nComo o repetidor expande um sinal primário, o aparelho não pode ser instalado tão longe do roteador. Por isso, é essencial posicionar o repetidor a uma distância do roteador suficiente para que ele receba o sinal do aparelho principal e também tenha uma conexão estável.\nAntes de instalar o repetidor, use um celular ou notebook para verificar a intensidade do sinal no local escolhido. Existem diversos sites e apps que podem ajudar os usuários a entender qual a melhor posição, mostrando de maneira clara a qualidade e intensidade do sinal pela casa.\nComo também acontece com os roteadores, os repetidores precisam ser posicionados de uma maneira adequada para fornecer uma rede com bom desempenho e boa qualidade de transmissão. Dê preferencia, posicione o equipamento em locais que tenham uma quantidade menor de obstáculos, tanto em relação ao roteador quanto à área que precisa receber o sinal.\nA maior parte dos repetidores disponíveis têm luzes que sinalizam a intensidade do sinal recebido, o que auxilia na hora da instalação. Além disso, é importante observar se há objetos por perto que podem dificultar a distribuição das ondas, evitando posicionar o repetidor em lugares próximos.\nDistância suficiente para ligar o cabo\nAlguns modelos de repetidor não só permitem que o alcance do Wi-Fi seja ampliado, mas também oferecem conexão via cabo. Dessa maneira, o usuário também pode conectar dispositivos mais afastados e que não tenham suporte a conexões sem fio, como desktops, impressoras ou até televisões mais antigas. Para isso, é necessário que o dispositivo Wi-Fi esteja em uma tomada com distância adequada para ligar um cabo Ethernet, sem atrapalhar a movimentação pelo local.\nPublicação Anterior 5 aplicativos que vão te ajudar a se exercitar em casa\nPróxima publicação iPhone SE 2 chegando: confira o que esperar da ficha técnica


Wiki marido de melissa schuman: 5 fatos para saber sobre brandon\nQuem é Brandon Henschel?\nBrandon Henschel é coreógrafo formado em balé clássico, hip hop, jazz, contemporâneo, Broadway e muitas outras formas de dança. Henschel treinou muitas celebridades para seus papéis na dança, incluindo Toby McGuire para o Homem Aranha 3 e Brad Pitt e Angelina Jolie para Sr. e Sra. Smith. Henschel também coreografou muitos grandes projetos industriais para varejistas de marcas como Nike e Reebok. Ele também é coreógrafo de destaque em muitos programas e filmes de Dance Television. Brandon Henschel é um dos coreógrafos mais versáteis do setor e não existe nenhum estilo ou tipo de projeto que ele não tenha feito ou visto. Brandon Henschel foi o ex-dançarino de apoio de Britney Spears. Ele é casado com a cantora e atriz Melissa Schuman desde março de 2006. Eles têm um filho chamado Elin Elijah, nascido em julho de 2010. Brandon Henschel apareceu em um programa de TV, 'The Wayne Brady Show'. 'The Wayne Brady Show' é uma comédia de 30 minutos estrelada por Wayne Brady, Brandon Henschel e Brooke Dillman. A série estreou em 08 de agosto de 2001 na ABC. O comediante versátil Wayne Brady é o apresentador e estrela desse show de comédia / variedade onde ele se apresentou, fez esquetes e números musicais. Brandon Henschel apareceu no filme de fantasia e aventura, 'The Jungle Book' em 2016. 'The Jungle Book' é sobre um garoto chamado Mowgli que é criado na selva por um bando de lobos. Quando Sher Khan, o tigre, ameaça matá-lo, uma pantera e um urso o ajudam a escapar. O bonito Henschel também apareceu em um filme de fantasia romântica, '13 Going on 30 'lançado em 2004. '13 Going on 30' era sobre uma jovem garota chamada Jenna Rink que faz um desejo incomum em seu aniversário. Milagrosamente, seu desejo se torna realidade e Jenna, 13 anos, acorda no dia seguinte como uma mulher de 30 anos. Henschel também apareceu como dançarino de fundo no filme de comédia adolescente 'From Justin to Kelly' lançado em 2003. 'From Justin to Kelly' teve críticas mistas.\nMelissa Schuman em poucas palavras\nMelissa Amber Schuman é uma cantora e atriz americana. Ela é mais conhecida por seu papel na banda de garotas adolescentes, 'Dream'. A banda 'Dream' teve dois grandes sucessos de platina, 'He Loves U Not' e 'This is Me'. Schuman também ganhou reconhecimento ao atuar em filmes como 'Love Don't Cost a Thing', 'The Hollow' e 'Silent Scream'. Schuman também apareceu no The Tonight Show com Jay Leno e já recebeu o TRL. Em novembro de 2010, a música 'Don't', que deveria ser o single de estréia de seu álbum solo inédito, foi lançada no iTunes. Schuman se casou com o dançarino Brandon Henschel em 2006 no Prado no Balboa Park em San Diego, Califórnia. Eles passaram a lua de mel no Havaí. Schuman anunciou no Twitter em fevereiro de 2010, que ela e o marido estavam esperando o primeiro filho. Em 18 de julho de 2010, os Henschels anunciaram o nascimento de seu bebê, Elin Elijah Henschel. Embora tenha havido uma grande tempestade de acusações de má conduta sexual em Hollywood no ano passado, Schuman também afirmou que foi estuprada pelo cantor Nick Carter em 2002. Ela revelou isso em novembro de 2017. Nick Carter negou a alegação. Ela alegou que Carter a convidou para o apartamento dele e fez sexo oral antes de estuprá-la quando ela se recusou a retribuir. Ela se recusou a falar sobre o incidente naquela época, temendo que Nick Carter tivesse uma equipe jurídica muito forte na época e que ela perderia o caso, resultando no final de sua carreira. Ela falou este ano quando leu sobre uma história semelhante de uma mulher que foi agredida por Carter no mês passado. É preciso coragem para compartilhar esses incidentes na mídia e ela é definitivamente uma mulher forte. Brandon Henschel também estava com sua esposa.\nFortuna de Melissa e seu marido Brandon Henschel\nO patrimônio líquido de Melissa Schuman é de US $ 900.000. O patrimônio líquido de seu marido Brandon Henschel é estimado em cerca de US $ 100.000.\nCinco fatos interessantes sobre Brandon Henschel\nExistem alguns fatos interessantes e menos conhecidos sobre Brandon Henschel: 1. Brandon Henschel nasceu em janeiro de 1981 em Lakeside, Califórnia. 2. Ele é conhecido por ser um dançarino de apoio e coreógrafo e fez um trabalho notável com Britney Spears. 3. Henschel apareceu em filmes como 'Flintstones in Viva Rock Vegas', 'Bring It On', 'The Country Bears', 'Gigli', 'Starsky and Hutch' ', '13 Going 30', 'Behind the Candelabra'. e 'Ted 2'. 4. Brandon Henschel também apareceu em séries de TV como 'True Blood', 'Viva Laughlin', '7th Heaven', 'Nikki', 'Days of Our Lives', 'Mulaney' e 'Lip Sync Battle'. 5. Ele deu um nó na esposa, Melissa, em 7 de junho de 2006, no Prado, no Balboa Park, em Cali.\nvantagens de cara alto e garota curta\nBrandon Henschel está ativo no Instagram @thebrandonhenschel. Ele carrega muitas de suas fotos pessoais em sua página do Instagram. Ele tem sua própria página como bhbookings.com, onde é possível obter atualizações sobre sua coreografia mais recente, seus estilos e também pode agendá-lo para seus eventos.\nModa E Beleza 25 Penteados Updo fáceis lindos para cabelos longos\nOs 8 melhores lugares para viajar com os amigos em 2019


Estou na final do concurso e gostaria de pedir a ajuda de vocês. Estou disputando a final com mais um guitarrista e a votação deve ser feita no orkut na parte de enquetes.\nÉ só entrar na comu, e na parte de enquetes da comunidade (e não no tópico criado, o tópico criado é apenas para ver os videos enviados) e votar em mim (Rodrigo Carone)\nPara quem quiser ver o video que eu enviei:\nObrigado a todos que puderem fazer isso por mim ^^\nVou votar la\nedit: empatei lá, haha\nQual é o prêmio, cara?\nMuito obrigado cara!!! Valeu pela força.\nJa votei em você !!, vamo ganhar GH !!, tu merece. =)\nAe Tapping!!! Muito obrigado velhão.\nValeu irmão, muito obrigado mesmo pela força\nTá lá meu voto!\nMuito obrigado mesmo brother!!\nJa esta feito!!!!\nParabéns cara toca muito!\nOpa valeu cara! Eu vi lá, mas você votou no tópico, é nas enquetes manja? La embaixo!! Se não for pedir demais e você puder arrumar lá :P\nMas mesmo assim muito obrigado pela força brother.\nVOtei em vc cara, e não foi por ser teu compadre não; é pq o video do outro cara ficou ruim pra caraio o/ AEUHAEUAEhueaae\nboa sorte ae man! \_m/\nQual é o prêmio desse concurso?\nhuauhauhauhauh valeu mesmo brother!!! O cara mandou o video errado mesmo, eu fui ver no canal do youtube dele ele toca pra caramba sim hehehe. Ele já tem uns patrocinios e tal, inclusive um video cover dele foi mencionado no site oficial do Dragon Force, o cara é fera sim hehehe!\nShredderzinho, vai gravar um video intitulado "slow hand", aí senta na maionese mesmo =X o/ uhAEHUAEHEAUAUHAEAEH Qual é o prêmio desse concurso?\nPode chamar de burro que eu aceito. huahuahuahua\nAgora sim ta feito!\nO vencedor de cada categoria terá um contrato de endorsement com a Ka Luthieria, válido por 6 meses renováveis. Os direitos do contrato de endorsement são a liberação do custo de mão-de-obra nos serviços prestados pela Ka Luthieria, além da divulgação no site, Twitter e outros meios de comunicação da Ka Luthieria.\nOs ganhadores autorizam, desde já, como consequência da conquista dos prêmios, a publicação de seus vídeos inscritos no concurso, autorizando também a utilização pela Ka Luthieria de seus nomes, imagens, sons e composições, em qualquer um dos meios escolhidos pela Ka Luthieria para divulgação desse concurso, por prazo indeterminado.\nBom, resumindo um endorsement com eles!!\nAe valeu cara ^^\nÉ nada, uns amigos meus confundiram também, eles não deixaram claro que a votação era feita nas enquetes e tem gente que votou por lá então confunde mesmo hehehe\nNão tenho Orkut, senão votaria em vc. Mas te desejo boa sorte!\nNão tenho Orkut, senão votaria em vc. \nBoa sorte, apesar de eu achar que voce nao precisa!\nGrande coisa, kkk, não seria novidade você ganhar. Já toca bem mesmo. Mas o ruim de ser no orkut que o outro cara pode pedir pra alguem que tem um monte de fake ficar votando nele. Eu sei como funciona isso, em menos de 30 minutos você tem uns 40 fakes. Imagina, 40 votos a cada 30 minutos. Poderiam ter feito em outro site.\nVotado cara! Tu merece, toca muito!\nBoa sorte cara! o/\nta votado cara.\nja votei!!!vc merece ta nessa final...\nFalei que ia ganhar.. xD\nparabéns velhinho ^^\npessoal, alguem sabe o que esse Everson Choma faz no final do vídeo ? aquele efeito q parece um harmonico\nMan, agora vai ter que mandar a guitarra de todos que votaram em você pra regular na KA, brinqs. Mas olha, é assim mesmo que começa, no começo vira endorser de algo não tão grande, depois vira endorser de algo maior, depois quando você mal se der conta você vai ser endorser da Ibanez.\no efeito que o cara faz aos 0:57\nsou teu fã cara, to votando la ja ;D\nEu sei, mas eu respondi HA. HA é Harmônico Artificial, não tava perguntando porque não entendi =].\nVotei em vc cara\ne um patrocínio não é coisa que se despreze\no cara põe a mão lá embaixo, nem tem como ter sido HA deve ter algum esquema true lá na guitarra dele...


“Quais concepções filosóficas estariam presentes nas práticas humanas atualmente, e, em especial, nas práticas... - Provas de Concursos - 567 Palavras\nPágina Inicial Ensaios “Quais concepções...\nPáginas: 3 (567 palavras) Publicado: 28 de agosto de 2012\nTempos Modernos, Serviço Social e Assistência Social no Brasil\nOs primórdios da industrialização coincidem, não por acaso, com aintensificação do processo de urbanização, de sorte que, em todo o mundo, fábricas e cidades andam de mãos dadas.\nO filme “Tempos Modernos” retrata, com humor e poesia, os anos iniciais pós- revoluçãoindustrial, enfatizando tanto as mazelas associadas à exagerada mecanização da produção fabril, quanto aquelas decorrentes do crescimento desordenado das urbes ainda em formação.\nDe um lado, a lógicacapitalista incipiente impunha que o excesso de mão-de-obra fosse uma constante, de forma que trabalhadores pudessem ser, além de mal remunerados, substituídos a qualquer momento, sem que a produçãoindustrial necessitasse ser, por qualquer motivo, interrompida.\nDe outo, as cidades industrializadas exerciam inegável atração aos trabalhadores rurais, que vivenciavam severas condições de trabalhono campo e nenhuma perspectiva de ascensão social.\nEstava montado, portanto, o cenário que iria balizar o desenvolvimento do Ocidente até os dias atuais, com todos os seus aspectos positivos enegativos.\nOcorre que as longas jornadas de trabalho nas fábricas não eram menos duras do que o trabalho agrário, mas eram, certamente, alienantes, na medida em que cada trabalhador, individualmente,desconhecia todo o processo de transformação da matéria prima bruta em produto final. Diferente, pois, do trabalho artesanal ao qual os trabalhadores, mesmo aqueles já então vivendo nas cidades(sapateiros, ferreiros, ourives etc.), estavam habituados, uma vez que estes dominavam integralmente seus ofícios. A fragmentação do processo produtivo, ou o denominado “trabalho em migalhas” é talvez o aspectomais emblemático da revolução industrial.\nAs precárias condições sanitárias e habitacionais vigentes nas cidades, por seu turno, contribuíam, expressivamente, para que a classe trabalhadora...\n“Quais concepções filosóficas estariam presentes nas práticas humanas atualmente, e, em especial, nas práticas sociais? que...\n...de governo proletário Vitor Amorim de Angelo* Especial para a Página 3 Pedagogia & Comunicação Na imagem de André-Adolphe-Eugène Disdéri (1819- 1889), a praça Vendôme destruída Comuna de Paris é o nome dado à primeira experiência histórica de um governo proletário, ocorrida entre março e maio de 1871, na França. O movimento que levou à formação da comuna, entretanto, contou com a participação de outros extratos e segmentos político-sociais, como a pequena...\n“Quais concepções filosóficas estariam presentes nas práticas humanas atualmente, e, em especial, nas práticas...\n...Todas as formas de violências contra as mulheres, crianças e adolescentes são violações dos direitos humanos fundamentais, tais como previstos em vários dispositivos legais. Ainda assim, mulheres e crianças são as principais vítimas da violência familiar e doméstica. O termo violência tem sua origem no latim: “violentia, ato de violentar,...\nQuais concepções filosóficas estariam presentes nas praticas humanas atualmente, e, em especial, nas praticas...\n...Educação Fernando Haddad Secretário Executivo José Henrique Paim Fernandes Secretária de Educação Especial Claudia Pereira Dutra ministério da educação Secretaria de Educação Especial Saberes e práticas da inclusão Desenvolvendo competências para o atendimento às necessidades educacionais especiais de alunos cegos e de alunos com baixa visão Brasília − 2006 Série: SABERES E PRÁTICAS DA INCLUSÃO...\n...música nos deixa claro também que algumas poucas décadas atrás o país passava por alguma crise política em que os políticos achavam que o necessário e essencial para viver era ter uma alimentação mesmo sendo básica, e que assim seria possível resolver todas as outras questões, tais como, inflação nas alturas, o custo de vida muito alto e com isso dificuldades financeiras para as famílias provocando assim a desigualdade e diminuição da qualidade de vida de quase todos. Onde...\n...A área de assistente social exerce o papel de traçar estratégias para implantação de uma política de prevenção e combate à violência de modo geral. Em termos concretos, todavia, somente como exceção essas questões colocam como objeto de intervenção para o Assistente Social. Tendência que tem tido como principal consequência a não identificação dessas “problemáticas” enquanto relacionadas às relações de gênero de caso específico, na invisibilização...\n...PROTEÇÃO SOCIAL ESPECIAL: O ENFRENTAMENTO A VIOLÊNCIA CONTRA A MULHER Dayane Aparecida Lacerda Oliveira1 Juliene Aglio de Oliveira2 RESUMO: Este artigo visa apresentar uma discussão acerca da proteção social especial, um dos eixos da política de assistência social, tratando especificamente das formas de enfrentamento a violência...\n...Advíncula Mariana Albino Monalisa Couto Renata Ferreira Sândila Matos Verônica Barbosa Jéssica Fonseca VIOLÊNCIA CONTRA MULHER,CRIANÇA E ADOLESCENTE CURSO DE ENFERMAGEM – Unileste IPATINGA – MG 1º/2013 CENTRO UNIVERSITÁRIO DO LESTE DE MINAS GERAIS CURSO DE ENFERMAGEM VIOLÊNCIA CONTRA...\n...Convenção Sobre a Eliminação de todas as formas de discriminação contra a Mulher e Convenção para Prevenir, Punir e Erradicar a Violência contra a Mulher Helena Omena Lopes de Faria* Mônica de Melo** * Procuradora do Estado Chefe da Procuradoria de Assistência Judiciária Criminal , membro do Grupo de Trabalho de Direitos Humanos da Procuradoria Geral do Estado de São Paulo e membro do...


Receita libera consulta à restituição - PB AGORA\nReceita libera consulta à restituição\nPublicado em 9 de agosto de 2009 às 09h21\nA Receita Federal deve liberar na próxima segunda-feira (10) a consulta a mais um lote de restituições do IRPF (Imposto de Renda Pessoa Física) de 2009 (ano-base 2008).\nNa mesma data, será liberado também mais um lote da malha fina do IR de 2008.\nPelo cronograma da Receita, o dinheiro estará disponível para saque no dia 17 e terá correção pela taxa básica de juros.\nNos dois primeiros lotes do IR de 2009, pagos em junho e julho, foram liberadas restituições no valor total de R$ 3,3 bilhões, para mais de 2,7 milhões de pessoas. Cerca de 40% desses contribuintes foram priorizados com base no Estatuto do Idoso.\nO calendário da Receita também prevê a liberação de mais quatro lotes de restituições ainda neste ano. Nos meses de setembro, outubro e dezembro, o pagamento será feito no dia 15 do respectivo mês, e as consultas são liberadas uma semana antes. Em novembro, o pagamento será no dia 16.


Visão geral do Painel de tarefas do SAJ6 – Softplan\nVersão: 20.1.0-0 | Publicação: 20/12/2019\nO Painel de atividades é a página inicial do Sistema de Automação da Justiça, o SAJ. É a partir dele que o usuário logado, conforme configuração do perfil cadastrado, executará todas as suas tarefas. Para facilitar a visualização, o painel é dividido em algumas áreas, acompanhe o detalhamento a seguir:\n1. Menu do sistema: para acessar o menu do sistema, clique no ícone . A partir dele é possível retornar ao Painel de Tarefas e acessar algumas funcionalidades importantes, como a consulta de processos e a gestão de modelos. Para fechar o menu, clique no ícone .\n2. Menu lateral de navegação: Por meio do menu lateral é possível consultar as atividades já realizadas no dia, criar etiquetas e visualizar as pendências nas opções de Tarefas, Prazos e Audiências. Clique no botão Recolher menu(1) para recolher o menu. Para expandi-lo novamente, basta clicar sobre a faixa lateral cinza, indicado com a seta .\n3. Usuario: no canto superior direito está localizada a área de identificação do usuário, exibindo o seu nome, a sua função e a sua lotação(1). Também permite alterar a lotação do usuário(2) e sair do sistema(3). Para expandir esta área, clique sobre o círculo contendo as iniciais do usuário logado(4) e para recolhê-la, clique sobre o ícone (5).\n4. Pesquisa do processo: por meio do painel, também é possível realizar a consulta de processos de duas maneiras distintas: uma busca simples e uma busca avançada. Na simples, o campo Buscar por el numero del proceso permite que o usuário digite um número de identificação e realize consultas rápidas de um processo com tarefas pendentes. Para isso, basta digitar o número do processo e pressionar a tecla Enter ou clicar na lupa .\nPara realizar a busca avançada, clique nos três pontos. O sistema abrirá uma janela contendo várias opções de parâmetros para efetuar a consulta.\n5. Card do processo: os cards estão localizados na parte central da tela e cada card corresponde a um processo, ele é composto por três áreas distintas:\nÁrea das tarefas(1): nesta área são realizadas as atividades relacionadas ao processo. Mostra a localização do processo, para quem está alocado e apresenta o menu de atividades e as tarefas pendentes;\nÁrea de visão(2): por meio desta área é possível abrir os autos do processo e atribuir e remover etiquetas, além de mostrar as que já estão vinculadas ao processo;\nÁrea de informações(3): nesta área são exibidas algumas informações básicas do processo, como, as partes, o número de identificação, a vara, a competência, a pessoa responsável pelo processo e os processos relacionados. Além disso, essa área permite ao usuário acessar, por meio do menu do processo, algumas funcionalidades, desde que ele possua acesso a elas.\n6. Grupo de filtros: no canto superior direito do painel, estão disponíveis duas opções de filtros para os cards dos processos:\nAtuação do magistrado: esta opção possibilita ao magistrado filtrar os processos de acordo com a sua área de atuação: titular, cooperador e substituto. Essa opção depende de permissão para ser visualizada;\nOrdenar proceso: localizado no canto superior direito, esta opção permite ao usuário realizar a ordenação cronológica dos processos por mais tempo e menos tempo.\n7. Novo processo: localizado no canto superior direito, o botão Novo processo permite ao usuário realizar o cadastro de novos processos.\nPronto! Agora você já conhece a estrutura do painel de atividades do SAJ, é por meio dele que todas as funcionalidades e informações do sistema estão acessíveis.\nComo consulto um processo por meio de uma etiqueta no SAJ6?\nComo desvinculo etiquetas ao processo no SAJ PG6 Tribunais?


Financiamento de franquias é alternativa, mas pede planejamento - Pequenas Empresas Grandes Negócios | Franquias\nFinanciamento de franquias é alternativa, mas pede planejamento\nO franqueado deve incluir parcelas do investimento e as taxas de juros no seu plano financeiro\n16 Jun 2016 - 10h58 Atualizado em 16 Jun 2016 - 10h59\nAlguns bancos já oferecem linhas de financiamento diferenciadas para franqueados (Foto: Marcos Santos/USP Imagens)\nDe acordo com a Associação Brasileira de Franchising (ABF), o Brasil registrou mais de 138 mil unidades franqueadas em 2015. As franquias são uma alternativa para quem quer empreender, mas, em geral, exigem altos valores de investimento. Para realizar o sonho do negócio próprio, muitas vezes, não é necessário ter todo o capital de imediato. Quem deseja se tornar um franqueado pode recorrer a um financiamento.\nÉ o caso do franqueado Danilo de Freitas Magalhães, da Gigatron Franchising, em Brasília (DF). Ele buscou o programa BB Franquia, do Banco do Brasil e conseguiu ajuda para o investimento inicial e a compra dos equipamentos. “Foram 34 parcelas e três meses de carência para começar a pagar o financiamento. O valor dos juros ficou em torno de apenas 0,6% ao mês”, conta Magalhães. Apesar de facilitar o acesso às franquias, o financiamento exige cuidados.\n4 dicas para quem busca financiamento de franquias\nAtualmente, alguns bancos já oferecem linhas de financiamento diferenciadas para franqueados e o ideal é buscar este tipo de crédito específico. “Já existe um entendimento por parte dos bancos de que esse tipo de negócio possui uma mortalidade mais baixa e a chance do negócio dar errado é menor”, afirma José Fugice, sócio-fundador da Goakira.\nEm geral, para conseguir o crédito para investir em franquias o empreendedor deve ter a marca já escolhida. Os bancos firmam acordos com as franqueadoras e oferecem condições especiais para redes cadastradas. “A instituição financeira recebe um aval de confiança por parte da rede cadastrada, que assume um risco para a abertura da nova unidade”, diz Cláudia Bittencourt, diretora-geral do Grupo Bittencourt.\nMesmo com esse recurso facilitador na hora de empreender, o franqueado deve levar em conta alguns aspectos que podem prejudicá-lo. De acordo com Cláudia, é preciso analisar com cuidado a planilha financeira apresentada pela franqueadora. “O franqueado deve ficar atento se essa expectativa de ganho supre não só as parcelas do financiamento, mas também as suas necessidades pessoais. Se ele, logo de início, está contando com o rendimento da franquia para a subsistência dele pode se decepcionar”, afirma.\nVale lembrar que a aquisição do financiamento pode retardar o retorno do capital. Por isso, fazer contas é ainda mais importante. Os especialistas recomendam que o franqueado tenha ao menos 70% do investimento inicial para obter o crédito. Mais do que isso pode afetar sua rentabilidade. Para aqueles que têm dificuldade em lidar com números, Cláudia fala que o franqueado não deve hesitar na hora de buscar ajuda. "Não dá para embarcar no financiamento sem saber o que está fazendo", diz.\nPara Fugice, o empreendedor deve se preocupar com a forma que vai tocar o negócio, pois isso também é essencial para lidar com as parcelas do financiamento. “Os dois pilares principais estão ligados a gestão e disciplina. Não gaste mais do que se deve, assuma o compromisso que estava previsto inicialmente, não misture despesas de pessoa física com jurídica e não se perca no planejamento financeiro”, diz


Salazar, os monumentos e o betão armado | PÚBLICO\n21 de Agosto de 2015, 0:00\nNo caso de Lisboa, o actual Padrão dos Descobrimentos resulta da adaptação de um projecto bastante anterior no tempo. Instalado em 1960, a assinalar o 5.º centenário da morte do infante D. Henrique, o Padrão é a reprodução, agora em material duradouro (betão, pedra rosal e calcário), da escultura efémera que Leopoldo de Almeida realizou, a convite de Cottinelli Telmo, para a Exposição do Mundo Português de 1940. Mas esta foi uma escolha política, não estética. Tratou-se - por decisão directa de Salazar - da "trasladação" para Lisboa do projecto de imortalizar a figura do infante no promontório de Sagres inicialmente lançado no final da década de 1920.\nFoi em 1933 que o Governo lançou o primeiro concurso para a realização do monumento naquele lugar mítico, e que viria a ser ganho pelo arquitecto Rebelo de Andrade e pelo escultor Rui Gameiro. Salazar considerou-o "um formidável desastre artístico" e, três anos depois, um novo concurso foi promovido. O arquitecto Carlos Ramos, o pintor Almada Negreiros e o escultor Leopoldo de Almeida (com uma estátua monumental do infante) foram os vencedores, mas o resultado foi igualmente ignorado.\nUm terceiro concurso - desta vez internacional - foi lançado em 1954, de que saiu vencedor o projecto Mar Novo (João Andresen /Júlio Resende/ Barata Feyo). Salazar voltou a não gostar - e José-Augusto França, citado pela historiadora de arte Lúcia Almeida Matos, no seu livro Escultura em Portugal no Século XX, 1910-1969, lamentava, em 1957, ter-se perdido "a primeira oportunidade de haver em Portugal uma amostra de arquitectura viva, honrada e actual".\nO líder do Estado Novo decidiu então que o monumento seria feito em Lisboa, com a reconstrução - anacrónica - do monumento da Exposição de 1940, que entretanto tinha sido destruído por uma tempestade.\nNo Porto, aconteceu algo parecido. Igualmente com o pretexto do 5.º centenário da morte do infante, a Escola de Belas Artes lançou em 1959 um concurso para um monumento no Largo do Ouro, um dos cais históricos da cidade. O concurso foi ganho pelo projecto conjunto do escultor Lagoa Henriques, do arquitecto então recém-formado Alcino Soutinho e de dois estudantes da escola, Augusto Amaral e... Álvaro Siza. Tratava-se de uma espécie de passeio público, com árvores feitas de betão e uma escultura de bronze. "O nosso projecto era interessante, porque era um arranjo da marginal, uma intervenção urbana, mais do que apenas uma escultura", recordou Soutinho (ver revista O Tripeiro, de Outubro de 2013). "Trabalhámos com verdadeiro espírito de equipa, evitando, não sem esforço, qualquer preconceito à volta do que seja "a integração das artes"", acrescentou Siza, citado por Lúcia Almeida Matos.\nSem que estejam documentadas as razões, o projecto haveria de avançar apenas com a assinatura de Lagoa Henriques. Soutinho atribuiu a decisão de novo à intervenção de Salazar, "que não gostava do betão". E o escultor que depois haveria de fazer o Fernando Pessoa para a esplanada d"A Brasileira, em Lisboa, acabou mesmo por concretizar o seu projecto no Porto, no actual Largo de António Calém. Com o título A Conquista de Ceuta, este monumento manteve algo do projecto colectivo original de criar um novo espaço público, demarcado por uma parede-cenário em granito com o mapa-múndi dos Descobrimentos Portugueses e citações de textos da época, e um grupo escultórico ao centro simbolizando o trabalho e o envolvimento dos portuenses na preparação da armada que saiu desta cidade liderada pelo infante D. Henrique.


Frigideira em aço Inox 26 cm Hive - Oxford\nà vista R$ 515,90\nPanelas de alto desempenho para preparos incríveis! As panelas CookingPro da Oxford possuem uma estrutura tripla que conduz o calor de maneira uniforme e rápida. O revestimento antiaderente presente na linha CookingPro permite a utilização de o mínimo de óleo durante o preparo dos alimentos, maior controle da temperatura para cocção e fritura, além de possuir a inovadora tecnologia de micromalha 100% de aço inox, em formato de colmeia, que protege o próprio antiaderente e garante o efeito Antirrisco, oferecendo excelente resistência aos arranhões ocasionados por utensílios de cozinha. A limpeza das peças é fácil e muito eficiente por conta do revestimento antiaderente, combinado com a tecnologia super-resistente em aço inox 100% com micromalha padrão colmeia. A linha CookingPro é livre de PFOA, substância química presente no teflon utilizado em panelas comuns. As peças possuem design inovador com cabos ergonômicos, bordas e pegadores em inox, além de tampa de vidro temperado super-resistente com saída para vapor. São 6 opções de panelas disponíveis na decoração Hive. Versáteis, elas podem ser utilizadas em fogão de indução, elétrico, de cerâmica, a gás, de hidrogênio e infravermelho. Além disso, as peças podem ser levadas ao forno convencional com temperaturas de até 250 °C, sem a tampa. Com a tampa, a temperatura não pode ser maior que 150 °C. O uso em máquinas de lavar louças também é permitido. A frigideira possui 26 cm de diâmetro e 4,8 cm de altura, e todo o material usado na fabricação é inteiramente reciclável. Mais uma novidade para você arrasar no preparo de receitas e momentos incríveis!


Pasión por la Pesca - Dourados de Puerto Rzepecki - 3º temporada - Episódio 10 | Fish TV\nPasión por la Pesca: 3ª temporada - Episódio 10\nEm Puerto Rzepecki, na Província de Corrientes, Javier Enrique faz uma pesca de dourados com tuvira, nas águas do rio Paraná. Amparados pela Posada La Regina, nosso pescador pode vivenciar fortes emoções nesta pescaria.\nVara de 30 libras, que é mais adequada para esse tipo de pescaria,\nUsei um multifilamento de 40 libras, com um fluorocarbon de 0,62 e três chumbos de 10 gramas.\nCarretilha de perfil baixo. Maravilhosa para essa pescaria!\nUtilizei isca de tuvira. Uma iguaria que sempre é muito eficiente para a pesca de dourado, com um anzol circular.\nEm Puerto Rzepecki, na Província de Corrientes, eu fiz uma bela pescaria de dourados, com isca de tuvira. Essa iguaria é sempre muito atraente e garantia de boas fisgadas. Amparados pela Posada La Regina, que nos proporcionou uma excelente experiência de pesca, pude viver momentos incríveis, com grandes dourados e saltos emocionantes. O tempo estava firme, e além do dourado um mangaruyú, ou também jáu como alguns chamam, apareceu na minha linha.\nPasión por la Pesca - EP 10 - Dourados de Puerto Rzepecki


Valentines Day by orchid para Android baixar grátis. O papel de parede animado Dia dos namorados de Android.\nO papel de parede animado Valentines Day by orchid para Android. Baixar o papel de parede animado gratuito Dia dos namorados no tablet Android ou telefone.\nDia dos namorados (Valentines Day by orchid)\nPara baixar o Valentines Day by orchid para Android degraça, nós recomendamos que você escolha o modelo do dispositivo, e nosso sistema irá escolher para você os arquivos do papel de parede animado mais adequados. Baixar o papel de parede animado Dia dos namorados gratuitamente no tablet é muito simples: selecione o arquivo e clique em "Baixar Valentines Day by orchid para Android" em seguida, selecione uma das maneiras para baixar e papel de parede animado está no seu telemóvel! Baixar Valentines Day by orchid para Android nunca foi tão fácil!\nDescrição do papel de parede animado: Valentines Day by orchid (Dia dos namorados):\nBaixar papel de parede animado grátis Valentines Day by orchid (Dia dos namorados)\nPopularidade: 2 726\nPopularidade: 3 406\nBaixar Valentines Day by orchid grátis. Dia dos namorados versão completa.\nVocê pode baixar o papel de parede animado Valentines Day by orchid para Android telefones absolutamente gratuito neste site. Com este papel de parede animado você não vai se entediar no transporte, na escola ou no trabalho. Sevocê instalar Valentines Day by orchid, você vai jogar durante horas e não consegue romper o papel de parede animado. Sevocê quiser um papel de parede animado interessante no tablet - Valentines Day by orchid será uma boa escolha. Gráficos bonitos e papel de parede animado interessante vai mantê-lo por horas. Você pode baixar Dia dos namorados para Android agora mesmo! Em nosso site você vai encontrar muitos outros papéis de parede animados de diferentes gêneros: corridas, lutasbem como papéis de parede animados de mesa lógicas. E não se esqueça, Valentines Day by orchid pode baixar no tablet Android sem registro e sms!


Confira o Drone em forma de bracelete – Marcus Pessoa\n14 de outubro de 2014 em Curiosidades\nJá pensou se você pudesse ter um fotógrafo particular onde quer que fosse?\nO Nixie é um conceito ambicioso que une as ideias de câmera fotográfica, drone e bracelete. Um dos finalistas do projeto Make It Wearable (“Torne vestível”, em português), realizado pela Intel. O drone possui hélices flexíveis, que podem ser presas ao pulso. No centro, uma câmera está pronta para tirar fotos em alta definição, e sincronizá-las com o smartphone, assim que o gadget se soltar e voar. No ar, imagens são capturadas dos mais inusitados ângulos, rendendo resultados incríveis e, ao finalizar as fotos, o drone volta como um bumerangue, prendendo-se novamente ao pulso.\nAinda em desenvolvimento, o Nixie é o foco de um time de especialistas em engenharia, física e ciência da computação, que pode revolucionar a ideia de tirar fotos.\nFotografia Fotografia Criativa Fotos Inovação Instagram Invenções Criativas Selfie Vídeos\nAnterior: Artista faz pintura no próprio rosto e faz sucesso nas redes sociais\nPróximo: Saiba como usar stickers e figurinhas em comentários no Facebook\n23 de novembro de 2014 às 04:08


Sete anos depois... ~ Papo de Budega\nInicio » Diversos » Sete anos depois...\nPor Sandra Monte9:44:00 AM8 Comentario\nParabéns pelo esforço, perseverança e sinceridade. Continue assim!\nParabéns pelos sete anos do seu blog.E muito mais sucesso a você!\nFlávia Luz disse...\nGosto muito do blog e acho que vc tem tudo para crescer ainda mais. Sei que muitas vezes não é tudo como queremos mas as coisas vão melhorando.\nMuito sucesso e conquistas\nAliás 7 é um número muito bonito, tomará que você chegue a 16, 25, 34... enquanto você pode digitar xD\nMeus Parabéns Sandra, pelos 7 anos de vida do site. Parabéns também pelo novo visual, que ficou mais light e de fácil visualização e "manuseio".\nEu, como os de cima, também parabenizo pelo seu blog. Te desejo esse parabéns atrasado, atualmente tem sido complicado conciliar as visitas ao seu blog e até mesmo atualizar o meu. Mas sempre me esforço pra estar aqui, pois aqui na Net tenho pessoas que eu estimo.


O que é intervalo intrajornada e como deve ser concedido? - Âmbito Jurídico - Educação jurídica gratuita e de qualidade\nEm 22 de dezembro de 2021 - às 14:05\nNo direito do trabalho, a jornada de trabalho representa o período diário em que o trabalhador fica à disposição do empregador e todo trabalhador que se encontra em uma relação de emprego deve ter sua jornada estipulada no contrato de trabalho.\nA Constituição Federal inclui em seu artigo 7º, nos incisos XIII e XIV, entre os direitos dos trabalhadores, a duração do trabalho normal não superior a oito horas diárias e quarenta e quatro semanais e a jornada de seis horas para o trabalho realizado em turnos ininterruptos de revezamento.\nO empregador possui o dever de conceder ao trabalhador um período de descanso, seja durante a jornada de trabalho ou entre uma jornada de trabalho e outra. Quando o período de descanso ocorre durante a jornada de trabalho chama-se de intervalo intrajornada e quando ocorre entre uma jornada e outra chama-se de intervalo interjornada.\nO intervalo constitui um dos mais importantes direitos do trabalho, pois garante medidas de proteção à saúde, higiene e segurança do trabalhador, tendo a finalidade de evitar o cansaço mental e físico, diminuindo inclusive a possibilidade de acidentes de trabalho.\nO intervalo intrajornada representa o tempo regular em que o trabalhador deverá interromper a prestação de seus serviços, seja para descansar ou para se alimentar. O tempo referente ao intervalo intrajornada não é computado na duração da jornada de trabalho, pois ocorre uma paralisação dos serviços prestados e portanto, não há de se falar em remuneração.\nDe acordo com a Consolidação das Leis do Trabalho (CLT), nas jornadas de trabalho de até quatro horas não há obrigatoriedade de concessão do intervalo intrajornada, salvo disposição específica de lei ou norma coletiva de trabalho.\nJá nas jornadas de trabalho que ultrapassem quatro horas e não excedam seis horas, é obrigatória a concessão de quinze minutos de pausa e naquelas jornadas de trabalho que ultrapassem seis horas de duração, é obrigatória a concessão de uma pausa de no mínimo uma hora e no máximo duas horas.\nDe acordo com a CLT: “Art. 71 – Em qualquer trabalho contínuo, cuja duração exceda de 6 (seis) horas, é obrigatória a concessão de um intervalo para repouso ou alimentação, o qual será, no mínimo, de 1 (uma) hora e, salvo acordo escrito ou contrato coletivo em contrário, não poderá exceder de 2 (duas) horas. § 1º Não excedendo de 6 (seis) horas o trabalho, será, entretanto, obrigatório um intervalo de 15 (quinze) minutos quando a duração ultrapassar 4 (quatro) horas”.\nAlém disso, segundo o parágrafo 3º do mesmo artigo, o limite mínimo de uma hora para o intervalo intrajornada poderá ser reduzido por ato do Ministro do Trabalho, Indústria e Comércio, quando ouvido o Departamento Nacional de Higiene e Segurança do Trabalho.\nEssa redução somente será autorizada se o estabelecimento atender integralmente às exigências concernentes à organização dos refeitórios e quando os respectivos empregados não estiverem sob regime de trabalho prorrogado a horas suplementares.\nNo entanto, em 2017, com a implementação da Reforma Trabalhista, determinou-se que a convenção coletiva e o acordo coletivo de trabalho têm prevalência sobre a lei quando dispuserem sobre o intervalo intrajornada, respeitado o limite mínimo de trinta minutos para jornadas superiores a seis horas, nos termos do artigo 611-A, inciso III da CLT.\nAssim sendo, está prevista a possibilidade de se estipular um intervalo mínimo de trinta minutos para as jornadas que ultrapassam seis horas de trabalho, através de convenção ou acordo coletivo, sem a necessidade de interferência do Ministério do Trabalho.\nAlém disso, a prestação de horas extras também deve ser considerada para análise dos intervalos intrajornada, pois se a jornada de trabalho pré-estabelecida é de cinco horas o trabalhador terá direito a apenas quinze minutos de intervalo, porém, se ele prestar horas extras por uma hora e meia ele passará a ter direito a no mínimo uma hora de intervalo, visto que considera-se todo o tempo que o trabalhador fica à disposição do empregador.\nVale ressaltar que o intervalo intrajornada não pode ser concedido no início da jornada, pois ainda não se iniciou o trabalho e portanto, não convém uma pausa para repouso. A concessão do intervalo intrajornada no início da jornada de trabalho equivale à não concessão do intervalo, pois não concorda com o objetivo da norma prevista no artigo 71 da CLT, que é o de restabelecer as forças do empregado e manter sua saúde física e mental, depois de um considerável tempo de trabalho ininterrupto.\nDa mesma forma, o intervalo intrajornada não pode ser concedido no final da jornada, pois não proporciona um momento para que o trabalhador possa descansar e se alimentar no decorrer de seu período de trabalho.\nO intervalo não poderá também ser dividido em diversas vezes durante o dia, visto que períodos fracionados contrariam as regras presentes no artigo 71 da CLT. O fracionamento é permitido apenas para motoristas, cobradores, fiscalização de campo e afins nos serviços de operação de veículos rodoviários, empregados no setor de transporte coletivo de passageiros, para os quais são concedidos intervalos para descanso menores ao final de cada viagem.\nTal regra está prevista no parágrafo quinto do artigo 71, o qual estabelece que o intervalo expresso no caput poderá ser reduzido e/ou fracionado, e aquele estabelecido no parágrafo primeiro poderá ser fracionado, quando compreendidos entre o término da primeira hora trabalhada e o início da última hora trabalhada, desde que previsto em convenção ou acordo coletivo de trabalho.\nAdemais, ressalta-se que algumas profissões possuem regras específicas para o intervalo intrajornada. Para o trabalhador rural, a Lei nº 5.889/73, em seu artigo 5º, define que para qualquer trabalho contínuo de duração superior a seis horas, será obrigatória a concessão de um intervalo, observados os usos e costumes da região, não se computando este intervalo na duração do trabalho.\nJá nos serviços permanentes de mecanografia (datilografia, escrituração ou cálculo), a cada período de noventa minutos de trabalho consecutivo corresponderá um repouso de dez minutos não deduzidos da duração normal de trabalho, é o chamado intervalo intrajornada remunerado, conforme o artigo 72 da CLT.\nPara os trabalhadores de minas de subsolo, em cada período de três horas consecutivas de trabalho, será obrigatória uma pausa de quinze minutos para repouso, a qual será computada na duração normal de trabalho efetivo, conforme o artigo 298 da CLT.\nOs trabalhadores de serviço ferroviário, nas estações de tráfego intenso, não podem trabalhar mais do que oito horas, que devem ser divididas em dois turnos com intervalo intrajornada não inferior a uma hora, conforme o artigo 245 da CLT.\nPara os trabalhadores que exercem suas funções no interior de câmaras frigoríficas e para os que movimentam mercadorias do ambiente quente ou normal para o frio e vice-versa, depois de uma hora e quarenta minutos de trabalho contínuo, será assegurado um período de vinte minutos de repouso, computado esse intervalo como de trabalho efetivo, conforme o artigo 253 da CLT.\nPor fim, as mulheres em período de amamentação, inclusive na hipótese de adoção, possuem o direito a dois descansos especiais de meia hora cada um, até que o filho complete seis meses de idade, não havendo prejuízo dos intervalos intrajornada gerais, conforme o artigo 396 da CLT.\nAo empregador que não concede ou concede parcialmente o intervalo intrajornada mínimo, implica o pagamento, de natureza indenizatória apenas do período suprimido, com acréscimo de 50% sobre o valor da remuneração da hora normal de trabalho.\nTal previsão está presente no parágrafo quarto do artigo 71 da CLT, o qual foi inserido por força da Lei nº 8.923/94 e alterado pela Lei nº 13.467/2017. Antes de 1994, a não concessão do intervalo intrajornada implicava apenas em multa administrativa e até a entrada em vigor da Reforma Trabalhista em 2017, o empregador deveria remunerar o trabalhador no valor da hora integral a que o mesmo tinha direito, com um acréscimo de 50%.\nLogo, a nova regra estabelece que será devido o pagamento somente do período de intervalo não usufruído e não mais do valor da hora integral a que tinha direito antes o trabalhador. Nesse sentido, no caso do trabalhador que tem direito a uma hora de intervalo, mas vem a usufruir de apenas 20 minutos, cabe ao empregador remunerar os 40 minutos que foram suprimidos, somados de 50% do valor da hora normal de trabalho.