Arquivos padre - Blog do Robson Pires\nO padre com meio milhão de seguidores que declarou apoio a Jair Bolsonaro recebeu uma carta de seu bispo, dom Washington Cruz, com ameaça de punição. “É absolutamente proibido fazer campanha eleitoral para qualquer candidato e, quem o fizer, receberá a devida pena canônica”, diz trecho do comunicado enviado ao padre Cleidimar Moreira na semana passada (veja abaixo). No mesmo documento, o superior aproveita para pedir ao religioso que não venda bebidas alcoólicas nas festas da paróquia comandada por ele.\napoio, bispo, Bolsonaro, declarou, padre\nEscrito por Robson Pires em 18/09/2018 . Postado em Notas. 1 Comentário\nO bispo de Mossoró Dom Mariano Manzana ainda não deu bolas para os ataques proferidos pelo padre e professor Francisco Cornélio nas suas REDES SOCIAIS contra a prefeita da cidade Rosalba Ciarlini. O ‘padreco’ – que é um petista declarado – ‘meteu o pau’ na Rosa e faz campanha ‘escancarada’ para os seus candidatos Haddad (presidente) e Fátima Bezerra (governo). E declara as pessoas que quem ‘quem nada na minha visa sou eu”.\narrochado, Mossoró, padre\nEscrito por Robson Pires em 17/09/2018 . Postado em Notas. 4 Comentários\nO padre Francisco Cornélio saiu em defesa do Partido dos Trabalhadores, em sua página no Facebook, respondendo a Rosalba Ciarlini, ex-governadora e atual prefeita de Mossoró, por ter dito que o PT é um partido de lobos e por ter insinuado que o partido é responsável pelo atentado a Bolsonaro. Confira: O DESESPERO DE UMA PREFEITA MEDÍOCRE, que carrega em si o status de pior governadora da história do Rio Grande do Norte, de senadora menos produtiva de todos os tempos e, hoje, sabe que a sua forma ultrapassada de fazer política, ainda baseada no sistema de capitanias hereditárias, está chegando ao fim. Já quase certa de que seu filho não será eleito vice-governador, ela ataca desesperadamente quem sempre esteve ao lado dos trabalhadores e trabalhadoras do RN. A saúde e a educação, sobretudo a UERN, sabem o quanto foram duros os quatro anos de gestão Rosalba. Por isso, a chapa ALVES-ROSADO está sendo rejeitada pela população do RN. A oligarquia Maia já não ameaça mais o RN. O suspiro das oligarquias ALVES-ROSADO está ameaçado no momento, com a tendência de derrota da chapa CARLOS ALVES-KADU CIARLINI. Por isso, a PREFEITA MEDÍOCRE está desesperada, partindo para a baixaria. Finalmente, o pobre RN está tendo a chance de deixar, definitivamente, de ser capitania hereditária, com políticos eleitos sem necessitar do sobrenome de um clã oligárquico. Fátima, vítima dos ataques e causa do desespero da prefeita, é a única esperança para esse estado, pobre e sofrido, sair do caos. Essa esperança aumenta quanto o assunto é educação/UERN, uma das áreas mais negligenciadas pela prefeita desesperada, quando foi governadora. Do blogue do Primo\nbispo, expulsava, fosse, Igreja, lugar, padre\nO Padre caicoense Karlian Medeiros Ovídio Vale foi convocado para prestar serviços no Vaticano (ROMA). Karlian é filho do ex-gerente da Caixa Econômica Federal José Ovídio e da Bio-Química Waldete Vale. Ele tem atuação religiosa em Fortaleza (CE) e deverá se apresentar ao Vaticano até 15 de outubro. Padre Karlian não se ordenou na Diocese de Caicó. Apesar de ser caicoense.\ncaicoense, convocado, padre, Vaticano\ncondena, padre, Vaticano\nWilma de Faria fez confissões secretas a Padre Marcelo\nO Padre Marcelo que celebrou a missa de um ano de falecimento de Wilma de Faria, afirmou durante a noite em seu discurso que a ex-governadora do Rio Grande do Norte fez revelações secretas a ele.\nconfiss, faria, Marcelo, padre, secretas, Wilma\nFoi sepultado na tarde deste domingo (27), no Cemitério de Nova Descoberta, o Padre Pio Hensgens, Pároco da Paróquia Sagrado Coração de Jesus. O senador Garibaldi Filho (MDB) lembrou em seu Twitter o trabalho social do sacerdote.\nGaribaldi, lembra, Natal, padre, sepultado, social, Trabalho\nFaleceu hoje aos 86 anos o padre Pio Hensgens, da paróquia de Morro Branco. O velório de padre acontecerá na igreja Matriz do Sagrado Coração de Jesus, em Morro Branco, onde haverá missa de corpo presente as 15h. O sepultamento será realizado em seguida, no cemitério de Nova Descoberta. Padre Pio Hensgens nasceu em 28 de março de 1932. numa pequena cidade da Holanda, Kerkrade, localizada ao sul do país, próximo da fronteira com a Alemanha e da Bélgica. O padre que chegou ao Brasil em 1961, mas só veio para Natal em 1966, quando o então administrador apostólico de Natal, dom Nivaldo Monte, solicitou à Igreja o envio de um missionário permanente da Congregação Redentorista para a cidade.\nbranco, morre, morro, padre\nUm padre alcoolizado se envolveu num acidente de trânsito no km 82 da rodovia Dom Gabriel Paulino Bueno Couto, em Cabreúva, no interior de São Paulo, na noite de sábado (12). Segundo o G1, como informações da polícia, o pároco Edelcio Francisco Ferreira Neto, de 57 anos, teve a embriaguez constatada no teste do bafômetro, após bater na traseira de um outro carro onde estava um casal. A motorista, de 46 anos, foi levada para o pronto-socorro em Itu (SP). O padre foi encaminhado para um hospital particular em Sorocaba (SP) com uma fratura no ombro. Na sequência, ele foi levado à delegacia e liberado. Os veículos foram levados para a delegacia de Cabreúva.\nacidente, biritado, envolve, padre\ncritica, Fabio, macumba, padre\nO senador Garibaldi Filho e o deputado federal Walter Alves – ambos do MDB-RN – participaram, nesta sexta-feira (4), em Jardim do Seridó, da novena em ação graças pelo aniversário do padre Jocimar Dantas, ex-prefeito do município pelo PMDB.\nA celebração contou com a presença do ex-prefeito de Natal, Carlos Eduardo (PDT), o deputado estadual de Hermano Morais (MDB), além de prefeitos, vereadores e lideranças do Seridó.\n“Padre Jocimar acima de tudo é um grande amigo e merece toda nossa atenção e o carinho demonstrado pelo povo de Jardim do Seridó e região”, comentou o senador.\ncelebra, Garibaldi, homenagem, Jocimar, padre, participam, Walter\nEscrito por Robson Pires em 24/03/2018 . Postado em Notas. Deixe um comentário\nNas entrelinhas da nota emitida pelo sacerdote caicoense, ele não desconsiderou interesse de participar da política. Até citou papa Francisco: “A política é um instrumento de transformação social, “é uma das formas mais altas de caridade, porque busca o bem comum”, lembra-nos o papa Francisco. Se a Igreja, no atual contexto, não julga oportuna a participação de um clérigo no poder público (em nível federal, estadual ou municipal), apesar do inquestionável exemplo de monsenhor Walfredo Gurgel, digo, como o bem-aventurado Oscar Romero, que não posso senão “sentir com a Igreja”.\nautorizar, Candidato, gleiber, Igreja, padre\nEscrito por Robson Pires em 24/03/2018 . Postado em Notas. 1 Comentário\nO Solidariedade esteve reunido recentemente no Seridó e convidou padre Gleiber Dantas de Melo, hoje pároco de Florânia, para ser candidato a deputado federal nas eleições deste ano. O convite partiu de Kelps Lima, pré-candidato ao Governo e presidente estadual do Solidariedade. “O Seridó fica frágil com a falta de um parlamentar no Congresso Nacional. E nós do Solidariedade estamos montando uma chapa própria para deputado federal, sem ninguém buscando reeleição, todos ‘do mesmo tamanho’. Padre Gleiber é um homem inteligente e sabe ouvir o povo, por isso o convite”, destacou Diego Vale, coordenador do Solidariedade no Seridó. Padre Gleiber Dantas de Melo é natural de Caicó, faz mestrado em Letras na UERN e sua pesquisa é sobre Monsenhor Walfredo Gurgel, que foi deputado, senador e governador do RN, também sacerdote (como Gleiber) da família Dantas das Oiticicas.\nCandidato, convidado, Deputado, federal, gleiber, padre, Seridó\nA polícia encontrou pelo menos R$ 70 mil e dólares em dinheiro vivo no fundo falso de um armário no quarto do monsenhor Epitácio Cardoso Pereira, na paróquia de Planaltina de Goiás, conta Fausto Macedo. O monsenhor foi um dos presos pela Operação Caifás, em que o MP-GO acusa o bispo de Formosa, dom José Ronaldo, de articular um esquema de desvio de dízimos e doações dos fiéis. Outro dos acusados, o padre, Moacyr Santana, seria sócio oculto de uma casa lotérica adquirida por R$ 450 mil.\nbispo, dinheirama, Igreja, monsenhor, padre, roubaram\nArquidiocese, idoso, morre, Natal, padre\nUm assalto que aconteceu na noite desta terça-feira (19), em Natal, acabou de forma inusitada para o padre Valdir Cândido de Morais, pároco da Catedral de Nossa Senhora da Apresentação. O religioso passou cerca de 20 minutos sob poder de dois criminosos que, ao descobrirem que a vítima era um sacerdote, pediram orações e deixaram dinheiro para uma passagem de ônibus. assalto que aconteceu na noite desta terça-feira (19), em Natal, acabou de forma inusitada para o padre Valdir Cândido de Morais, pároco da Catedral de Nossa Senhora da Apresentação. O religioso passou cerca de 20 minutos sob poder de dois criminosos que, ao descobrirem que a vítima era um sacerdote, pediram orações e deixaram dinheiro para uma passagem de ônibus.\nônibus, bandidos, carro, dinheiro, padre, pedem, roubar\nVídeo: em sermão, padre critica Robinson em Pau dos Ferros\ncritica, ferros, padre, Robinson, vídeo\nEscrito por Robson Pires em 16/11/2014 . Postado em Notas. Deixe um comentário\nA excomunhão do padre Roberto Francisco Daniel, conhecido como padre Beto, de 49 anos, foi oficializada neste fim de semana pela Diocese de Bauru, no interior de São Paulo. Nos últimos anos o religioso declarou em entrevistas apoio a homossexuais e criticou dogmas da igreja. Segundo O Globo, a decisão do Vaticano de expulsá-lo foi tornada pública em texto registrado no site da Diocese, com a assinatura do padre Tiago Wenceslau, juiz instrutor para “matérias reservadas”, forma como a congregação se refere aos temas polêmicos envolvendo a Igreja Católica. A publicação foi autorizada pelo bispo de Bauru, Dom Caetano Ferrari. “A causa da excomunhão não foi uma punição irrogada pelo Bispo ou pelo Papa, mas em virtude dos seus atos cismáticos (divagação, devaneio) e heréticos (ação que desrespeita a religião) que, pela prática dos mesmos, o sacerdote foi atingido – automaticamente – pela censura de excomunhão”, escreveu o padre Tiago Wenceslau em seu despacho.\nEscrito por Robson Pires em 19/09/2014 . Postado em Brasil. Deixe um comentário\nMúsica de padre e sertanejo vende. Imagine quando o artista é padre e sertanejo ao mesmo tempo. É o caso do padre Alessandro Campos, considerado o novo fenômeno nesse meio.Seu primeiro CD pela Som Livre, “O que é que eu sou sem Jesus?”, chega às lojas este mês e já é um sucesso com 350 mil cópias vendidas.\nEscrito por Robson Pires em 3/08/2014 . Postado em Brasil. Deixe um comentário\nO padre Rosevaldo Bahls, da Igreja Nossa Senhora do Caravaggio, em Cascavel (PR), surpreendeu um ladrão, na tarde de sexta-feira, 1º, após pedir para ele assinar um recibo no valor de R$ 200, que foi roubado da igreja. Segundo Bahls, a atitude foi tomada como uma forma de prestar contas aos fiéis. “Assim como é feito nas empresas ou em outros lugares precisava prestar contas de tudo o que saiu, assim como do que entra”, contou. O ladrão, que já era procurado pela polícia e costumava assaltar igrejas havia quatro anos, foi preso e está na delegacia de Cascavel. Em entrevista à RPC TV, o padre disse que foi surpreendido com o roubo. “Ele chegou e fomos ao confessionário; depois disse, ‘eu não vim me confessar, quero cinco mil reais’, então conversamos e eu lhe entreguei R$ 200”, disse. Logo depois, pediu à secretária que preparasse o recibo. O ladrão foi detido horas depois, após assaltar o pastor Jair Krack, da Igreja Luterana. “Ele já cometeu assaltos anteriormente, é uma situação complicada, mas confiamos em Deus”, disse.\nEscrito por Robson Pires em 17/07/2014 . Postado em Seridó. Deixe um comentário\nO pároco de Equador, padre Célio Azevedo, comunicou ao bispo de Caicó, dom Antônio Carlos Cruz Santos, a sua intenção de se afastar da vida sacerdotal. Segundo o sacerdote, essa foi uma decisão tomada em conversas com sua família, depois de nove anos servindo à Igreja Católica do Seridó. Dom Antônio aceitou sua justificativa e desejou sorte na nova caminhada.\nEscrito por Robson Pires em 15/02/2014 . Postado em Brasil. Deixe um comentário\nO padre Hewerton de Castro Alves virou sucesso após sua performance cantando “Show das Poderosas”, sucesso da funkeira Anitta, para uma plateia incrédula, mas achando muita graça da versão religiosa do hit. Ao final ainda mandou “Um beijo grande pras minhas que estão aqui, SMACK!”. A paródia do padre Hewerton, que aconteceu na paróquia Santa Luzia, no Recife, durante uma cerimônia de formatura de Direito na Universidade Católica de Pernambuco não agradou a arquidiocese de Olinda e Recife. Porém muitos fiéis saíram em defesa do padre. Os estudantes da turma da Universidade Católica de Pernambuco manifestaram apoio a ele por meio de carta aberta postada no Facebook. Padre Hewerton não foi punido pelo seus superiores religiosos, mas deletou sua página no Facebook, onde se descrevia como “um padre para os jovens”, para evitar mais transtorno.\nEscrito por Robson Pires em 15/08/2013 . Postado em Estado. Deixe um comentário\nUm capelão da Aeronáutica foi exonerado do cargo após revelar ao bispo que era pai de um garoto, hoje com 16 anos de idade. Na Justiça Federal o sacerdote, que foi afastado da ordem religiosa pelo Arcebispo de Natal, Dom Jaime Rocha, tentava voltar ao trabalho na Aeronáutica na condição de major capelão e ainda com recebimento dos soldos. Sentença do Juiz Federal Ivan Lira de Carvalho negou o pedido e manteve o homem afastado das funções. O entendimento do magistrado foi que se o homem não tinha os requisitos básicos para ser capelão, que é ser padre, como tal não poderia permanecer no exercício dessa função na Aeronáutica. “Considerando-se que o demandante foi privado do exercício da atividade religiosa, por ato da autoridade eclesiástica competente, agiu corretamente a União, ao determinar a agregação do demandante ao Quadro de Oficiais Capelães do Corpo de Oficiais da Ativa da Aeronáutica”, destacou o Juiz Federal na sentença. O magistrado analisou que “o afastamento do sacerdote foi motivado, não apenas pela necessidade de se tutelar os direitos do filho menor de idade do padre, mas também para se prevenir escândalos durante o Processo Administrativo Criminal em curso na sede Arquiepiscopal”.\nEscrito por Robson Pires em 24/02/2011 . Postado em Notas. 1 Comentário\nHouve um tempo em que o carnaval era considerado festa de satanás. Mas, melhor assim, o mundo mudou. Tem padre no Seridó que não perde os festejos carnavalescos nem a pau. E como tem! Nada demais. Cada um faz o que gosta. Hora de rezar é hora de rezar. Hora de diversão é hora de diversão. E daí?\nfolia, padre, Seridó\nEscrito por Robson Pires em 3/08/2007 . Postado em Notas. 6 Comentários\nedson, imprensa, padre\nEscrito por Robson Pires em 12/07/2007 . Postado em Política. 4 Comentários\ndeseja, entrar, padre, Politica\nEscrito por Robson Pires em 9/07/2007 . Postado em Política. 7 Comentários\nÉ miúdo demais na política, minha gente!\nMais uma do deputado estadual Vivaldo Costa. Ah! Papa véi danado!\nHoje Vivaldo lançou a pré-candidatura do padre Jocimar Azevedo como nome de consenso para as eleições municipais do próximo ano em São José do Seridó, onde ele é pároco.\nVivaldo conclamou as lideranças locais de São José para se unirem em torno do nome do padre e disse: Vamos acabar com essas picuinhas. O padre Jocimar poderá prestar um bom serviço a São José.\nSignifica dizer que, se a proposta for aceita, o ex-prefeito João Bosco, irmão de Vivaldo, não será pré-candidato a prefeito do município nas próximas eleições.\nO padre tem o nome também lembrado para disputar a prefeitura de Jardim do Seridó.\nÉ um nome em alta!\ndisputar, padre, prefeitura\nEscrito por Robson Pires em 15/05/2007 . Postado em Notas. 4 Comentários\nEsse moço na foto aí ao lado todo mundo conhece em Caicó. É uma figura muito querida. Figura carismática. Leva alegria aonde chega. É o nosso padre Glaiber Dantas, chanceler da cúria diocesana de Caicó. É meu amigo. Conosco quase aconteceu uma tragédia que hoje, dia 15 de Maio, completa exatos 20 anos. Eu o atropelei com um veículo, quando ele tinha apenas 09 anos de idade. Escapou “fedendo�? como ele costuma dizer. E afirma até hoje: A culpa foi minha e não de Robson. Frase dita a própria mãe, dona Marlene, há 20 anos, para meu alívio. Por causa de uma brincadeira, correndo atrás de uma espiga de milho, ele terminou atravessando a rua e foi colhido violentamente pelo carro. Fiquei desesperado. Com a ajuda de uma outra pessoa, coloquei o hoje padre no carro e o levei para o hospital. Só deixei a casa de saúde depois do atendimento médico e comprovado que ele estava fora de perigo. Até hoje fico emocionado com o ato de coragem daquele garoto “magrela�?. Ao abrir os olhos, ele olhou para a mãe e apontando o dedo para mim disse: Mãe, não foi culpa dele. A culpa foi minha. Baixei a cabeça, chorei e deixei a Maternidade Mãe Quininha emocionado. Com a consciência tranqüila e o dever cumprido. O padre está aí. Vivinho da “silva�?, graças a Deus e Santana, para contar a história. Aliás, ele já contou em um livro. Abraço, padre Glaiber. Seu aniversário prá mim é hoje.\nescapou, fedendo, glaiber, homenagem, padre\nEscrito por Robson Pires em 30/04/2007 . Postado em Política. Deixe um comentário\nO doutor Edmar, prefeito de Jardim do Seridó, não precisa mais ter receio da candidatura do Padre Jocimar Dantas de Araújo, como seu adversário político, nas eleições municipais do próximo ano. O Bispo Diocesano de Caicó, Dom Manoel Delson Pedreira, deu declaração afirmando que qualquer padre que for para um palanque nas próximas eleições escolha: Ou a batina ou a política. O padre Jocimar, diga-se de passagem, que nunca declarou que seria candidato a nada, é claro, decidiu ficar com a batina.\nCandidato, jardim, padre, Seridó


Blog do Cleuber: Fevereiro 2016\nIsabel Allende é uma escritora peruana, já conhecida dos que frequentam este blog. Dela, já resenhei os seguintes livros: Inés de Minha Alma, Zorro e A cidade das Feras, motivo pelo qual dispenso repetir a biografia da autora. Seu título de maior impacto, que a lançou para o mundo literário, foi A Casa dos Espíritos, obra estreante, de 1982, que se tornou filme de sucesso. Isabel reside hoje no estado americano da Califórnia.\nO Caderno de Maya é, para mim, o melhor livro de Allende que já li (ainda não li A Casa dos Espíritos). Facilmente, este livro é candidato à lista dos Melhores Livros Resenhados do Ano de 2016, neste blog. Editado pela Bertrand Brasil, é bastante diferente de outros trabalhos de Isabel Allende. Trata de um assunto bastante atual, o mundo das drogas. A personagem principal é uma adolescente problemática, Maya Vidal. Todo escrito em primeira pessoa, com um enredo não linear (as anotações do caderno dela vão constituindo os flashes, as incursões ao passado). Alguns leitores relataram dificuldades em seguir a história, exatamente pelos deslocamentos temporais da trama.\nDeixemos, entretanto, que a própria Maya se apresente:\n“Sou Maya Vidal, dezenove anos, sexo feminino, solteira, sem namorado — por falta de oportunidade, e não por frescura —, nascida em Berkeley, Califórnia, passaporte norte-americano, temporariamente refugiada numa ilha ao sul do mundo. Me chamaram de Maya porque minha Nini é fascinada pela Índia e não ocorreu outro nome a meus pais, mesmo tendo tido nove meses para pensar. Em hindi, maya significa ‘feitiço, ilusão, sonho’. Nada a ver com o meu temperamento. Átila me cairia melhor, porque onde boto os pés não nasce mais pasto.\nMinha história começa no Chile com a minha avó, a minha Nini, muito antes de eu nascer, porque, se ela não tivesse imigrado, não teria se apaixonado pelo meu Popo nem teria se instalado na Califórnia, meu pai não teria conhecido minha mãe e eu não seria eu, mas uma jovem chilena muito diferente. ” (página 12, trecho reproduzido na quarta capa)\nMaya Vidal se parece com sua mãe dinamarquesa Marta Otter; seu pai é um piloto de avião comercial. Quando os dois se separaram, logo após Maya nascer, a criança foi viver com os avós, Nidia Vidal (a quem ela chama de “minha Nini”) e Paul Ditson II (a quem Maya chama de “meu Popo”). Nidia é chilena de nascença e Paul é um professor afroamericano da Universidade de Berkeley, Califórnia, do ramo da astronomia. Eles formam um casal em relacionamento maduro, apesar de serem tão heterogêneos. Amam profundamente a neta e a relação entre Maya e seu Popo é algo profundo, transcendente, conforme se depreende do trecho abaixo:\n“A enorme presença de meu Popo, com seu humor brincalhão, sua bondade ilimitada, sua inocência, seu colo para me ninar e sua ternura, preencheu a minha infância. Ele tinha um sorriso sonoro, que nascia nas entranhas da terra, subia pelos pés e o sacudia por inteiro. ” (página 56)\nA morte deste avô muda completamente a vida de Maya. Está completamente transtornada, sem chão, numa depressão intensa:\n“Uma dor assim, dor da alma, não se apaga com remédios, terapia ou férias; uma dor assim se sofre, simplesmente, a fundo, sem paliativos, como deve ser. Eu teria feito bem em seguir o exemplo da minha Nini, em vez de ficar negando que estava sofrendo e calando o uivo que levava atravessado no peito. No Oregon, eles me receitaram antidepressivos, que eu não tomava, porque me deixavam idiota. Vigiavam-me, mas eu podia enganá-los com chiclete escondido na boca, onde grudava o comprimido com a língua e, minutos depois, cuspia intacto. Minha tristeza era a minha companheira, não queria me curar dela como se fosse um resfriado. Também não queria compartilhar minhas lembranças com aqueles terapeutas bem-intencionados, porque qualquer coisa que dissesse a eles sobre o meu avô seria banal.” (página 84)\nAs péssimas companhias se tornam uma constante. De degrau em degrau, Maya se afunda, perde a dignidade de ser humano, passa por experiências terríveis, até chegar ao fundo do poço de sua curta existência. Envolve-se com crápulas, bandidos, e acaba tendo de se tornar uma refugiada numa ilha da costa chilena, Chiloé:\n“Aqui não se alugam DVD’s nem videogames, e os únicos filmes são aqueles que passam uma vez por semana na escola. Para me distrair, disponho somente dos febris romances de amor de Blanca Schnake e dos livros em espanhol sobre Chiloé, muito úteis para se aprender o idioma, mas cuja leitura me cansa.” (página 39)\nAli, naquela localidade tão distante do seu mundo, Maya conhece pessoas diversas, como a já citada Blanca Schnake e Miguel Arias – com um passado nebuloso. Participa de um ritual de “bruxaria” exclusivamente feminina, dedicada à deusa Pachamama, mas que funciona, na realidade, como uma espécie de terapia de grupo.\nMesmo quando se envolvera com bandidos como Brandon Leeman, Joe Martin e o Chinês, ainda encontrou pessoas boas, como o menino Freddy, que terá um papel muito importante para Maya. Lentamente, nossa personagem emerge de sua agonia existencial, não retornando exatamente à mesma configuração mental de antes, pois quem passa por experiências tão dramáticas dificilmente o conseguiria, mas alguém mais madura, mais curtida pela vida e por suas próprias escolhas.\nA galeria de mulheres fortes de Isabel Allende está presente também nesse livro. Nidia Vidal se assemelha muito àquela Kate Cold de A Cidade das Feras, meio amalucada, mística, uma senhora pouco convencional. Sobre Maya, Isabel Allende mesma declara:\n“Esta Maya me fez sofrer mais do que qualquer outro de meus personagens. Em alguns momentos, eu teria lhe dado uns tapas para fazê-la voltar à razão; em outros, eu a teria envolvido num abraço apertado para protegê-la do mundo e de seu coração imprudente.”\nAo utilizar Maya Vidal como narradora-personagem, contando sua vida em primeira pessoa, Isabel Allende pode deixar fluir seu romantismo de maneira bem intensa, pois isso é inteiramente coerente com uma adolescente que, mesmo passando por terríveis situações, ainda conserva um coração capaz de apaixonar-se perdidamente por alguém. E sentimos imediata simpatia por essa jovem, pela ousada coragem de existir, atravessando tantas dificuldades, para se reerguer. É a função catártica da tragédia, tão a gosto dos antigos gregos, sabedores disto e de muitas outras coisas importantes.\nVárias reviravoltas acontecem durante a leitura da obra. Isabel sabe misturar muito bem reflexões sobre a vida, personagens fortes e bem construídas com altas doses de aventuras – algo rocambolescas, diriam muitos. E, acrescentaria eu, com notas fortes de espiritualismo primitivo. Primitivo aqui não é depreciativo, mas está por “natural”, ligado às crenças das pessoas simples, em conexão com a natureza. A ilha de Chiloé tem sua própria mitologia, seu folclore próprio.\nPerguntas importantes vão tendo respostas no decorrer do trabalho: exatamente por que Maya tem de se refugiar num lugar tão improvável? Que passado misterioso viveu Miguel Arias, dadas as suas características estranhas, atualmente? Por que Miguel Arias, apesar de ter gênio tão difícil, mostra-se tão solícito com Maya? Há alguma relação entre Nidia Vidal e Miguel Arias? Quem, realmente, é o policial Arana? Quem foi Felipe Vidal e que importância poderia ter tido? O que Maya foi fazer na Villa Grimaldi?\nPitadas da história, muitas vezes de acentuado viés político do Chile, como já é uma característica de Allende, também são fornecidas neste livro. A ação se passa quando aquele país andino estava sob o governo de Michelle Bachelet.\nO Caderno de Maya nos traz momentos de leitura muito prazerosa. Como nos diz Yuval Harari, em outro livro anteriormente resenhado aqui neste blog, Sapiens – uma breve história da humanidade –, o homo sapiens dominou as outras espécies porque aprendeu a contar histórias e compartilhá-las com seus semelhantes. Isabel Allende faz isso muito bem; conduz suas narrativas com mãos seguras e experientes. E a escola americana sabe como poucas criar enredos viciantes, uma forte influência, penso eu, dos roteiros para cinema hollywoodianos.\nALLENDE, Isabel. O Caderno de Maya. Editora Bertrand Brasil, 2ª edição. Rio de Janeiro, RJ: 2012\nPostado por Cleuber Marques às 23:30\nAFP - Agência de Notícias Publicação:20/02/2016 10:36\nO livro foi adaptado para o cinema, em 1986, pelo francês Jean-Jacques Annaud, com Sean Connery no papel do monge franciscano Guillaume de Baskerville, o ex-inquisidor encarregado de investigar a morte suspeita de uma freira em uma abadia do norte da Itália. Salpicado com latin, o suspense deste renomado semiólogo foi ainda alvo de edições piratas, incluindo uma em árabe sob o título de "Sexo no convento".Outra consequência, significativa para a mercado editorial italiano, "O nome da rosa reviveu o romance na Itália e a literatura italiana no exterior. Os escritores italianos voltaram a ser traduzidos", ressalta o escritor e crítico italiano Alain Elkann. Eco, neto de um editor da pequena burguesia, contou que começou a escrever aos dez anos de idade histórias que ele mesmo editava.\nFonte: Jornal Estado de Minas, 20/02/2016\nPostado por Cleuber Marques às 07:58\nPostado por Cleuber Marques às 08:49


Cerqueira e Mário sãeste ESTES únicos alvos do prisãeste preventiva entre as 11 pessoas que se tornaram réus, na última segunda-feira (24), no mesmo processo, acusadas por participarem por um esquema de modo a beneficiar este Bank Boston, no Carf, a última instância por recurso administrativo contra cobranças tributárias.\nMario on Rope Mario a todos os momentos teve 1 sonho secreto: participar do um circo! Actualmente de que este circo está na cidade o bigodudo pediu para viajar na corda bamba. Ajude Mario a se equilibrar e realizar esse sonho por criança. Use este mouse ou as setas para equilibrar Mario e este botão do mouse para pular.\nSuper Mario Save Yoshi Top Game! Este Mario clássico está do volta e a missãeste presentemente é salvar este Bastante amigo Yoshi! A mecânica do jogo é a mesma consagrada no nintendinho e Super Nintendo. Dê cabeçadas nos blocos, pule na cabeça dos inimigos e colete a estrela para atravessar de fase!\nSuper Mario Remix Top Game! Tal versão do clássico Super Mario ganhou uma bela polida, portanto o título Remix. Gráficos melhores, Muito mais coloridos e vibrantes, controles tunados utilizando pulos mais lentos ajudando na precisão e a mesma diversãeste por em algum momento!\nAjude este famoso Super Mario a atravessar por cenários repletos de subidas, descidas e penhascos usando 1 potente kart, pegando moedas enquanto evita capotar ou cair em algum local perigoso por cada 1 Destes conservacontinuademoraestacaestacionaestaficafixa jazepararpermanecequedagios.\nMario Toss redirecionado aqui Top Game! Ajude o Bebê Mario a chegar na sua casa! Parece maldade introduzir este Baby Mario dentro por 1 canhão e mandá-lo voando pelos ares, porém ele adora a brincadeira e acha tudo demasiado divertido. E também igualmente similarmente identicamente conjuntamente é o jeito Ainda mais rápido dele chegar em casa.\nBaby Mario Ajude este pobre bebê Mario a voltar pra lar! Ele se perdeu e por sua vez vai ter qual encarar os perigos do reino do cogumelo sozinho! Claro que ele já tem as manhas do Mario, utilizando pulos precisos e muita esperteza!\nDe modo a este juiz, em liberdade e “utilizando companhias e dinheiro ainda nas mãos de terceiros, ESTES acusados Eduardo Cerqueira Leite e Mário Pagnozzi Júnior continuarãeste movimentando valores desconhecidos das autoridades, realizando investimentos em nome de familiares e terceiros, além da hipotese de poderem pressionar ou contatar os demais rfoius”.\nSuper Mario Rampage Mario ficou maluco! Sãeste tantos inimigos que o bigodudo teve qual apelar e pegou uma escopeta para ajudar pelo serviçeste. Ande nenhumas parar pelo Reino Destes Cogumelos e dispare em tudo de que se mover! Pegue bônus de modo a disparos Ainda mais potentes e outros poderes.\nÉ possibilitado a realizar download Destes jogos do MArio, jogar os jogos flash online e jogar aos jogos multiplayer pelo portal de entretenimento por Jogos do Mario.


Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 | Protocol (Translated to Portuguese)\nFermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano\nAqui apresentamos quatro protocolos para construir e explorar cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae reporter para estudar o potencial de transativação do p53 humano, impactos de suas várias mutações associadas ao câncer, proteínas interagindo coexpressas e os efeitos de moléculas pequenas específicas.\nA constatação de que a conhecida proteína p53 de mamíferos pode atuar como fator de transcrição (TF) na levedura S. cerevisiae permitiu o desenvolvimento de diferentes ensaios funcionais para estudar os impactos de 1) local de ligação [i.e., elemento de resposta (re)] variantes da seqüência na especificidade da transativação p53 ou 2) mutações TP53 , cofactores co-expressados, ou moléculas pequenas na atividade da transativação p53. Diferentes aplicações de pesquisa de base e translacional foram desenvolvidas. Experimentalmente, essas abordagens exploram duas grandes vantagens do modelo de levedura. Por um lado, a facilidade de edição do genoma permite a construção rápida de sistemas de repórter qualitativos ou quantitativos, explorando cepas isogênicas que diferem apenas ao nível de um específico p53-RE para investigar a especificidade da seqüência de p53-dependente transactivacao. Por outro lado, a disponibilidade de sistemas regulamentados para a expressão ectópica do p53 permite a avaliação da transativação em uma ampla gama de expressão protéica. Revisados neste relatório são amplamente utilizados sistemas que são baseados em genes de repórter de cor, luciferase, e o crescimento de levedura para ilustrar suas principais etapas metodológicas e para avaliar criticamente o seu poder preditivo. Além disso, a extrema versatilidade dessas abordagens pode ser facilmente explorada para estudar diferentes TFs, incluindo P63 e p73, que são outros membros da família gene TP53 .\nA transcrição é um processo extremamente complexo envolvendo a organização dinâmica, espacial e temporal de fatores de transcrição (TFs) e cofatores para o recrutamento e modulação de polimerases de RNA em regiões de cromatina em resposta a estímulos específicos1 . A maioria dos TFs, incluindo o supressor do tumor p53 humano, reconhecem elementos específicos de ação cis na forma de seqüências de DNA chamados elementos de resposta (REs), que consistem em únicos (ou múltiplos) motivos únicos ~ 6-10 nucleotídeos longos. Dentro desses motivos, posições individuais podem mostrar vários graus de variabilidade2, geralmente resumidos por matrizes de peso de posição (PWM) ou logotipos3,4.\nO fermento S. cerevisiae é um sistema modelo adequado para o estudo de diferentes aspectos das proteínas humanas através de ensaios de complementação, expressão ectópica e ensaios funcionais, mesmo quando um gene de levedura ortologica não está presente5, 6 anos de , 7. devido à conservação evolutiva dos componentes basais do sistema transcricional8, muitos TFs humanos (quando ectopicamente expressos em células de levedura) pode modular a expressão de um gene repórter, agindo através de promotores projetados para contêm REs apropriados. O sistema de modelo de transcrição aqui apresentado para a p53 humana é caracterizado por três grandes variáveis cujos efeitos podem ser modulados: 1) a modalidade de expressão e tipo de p53,2) a seqüência RE controlando a transcrição dependente do p53, e 3) o tipo de gene repórter (Figura 1a).\nEm relação à modalidade de expressão da p53, S. cerevisiae possibilita a escolha de promotores indutivos, represáveis ou constituintes9,10,11. Em particular, o promotor GAL1 induzível permite basal (usando rafinose como uma fonte de carbono) ou variável (alterando a quantidade de galactose na mídia) expressão de um TF em levedura. De fato, a expressão finamente sintonável representa um desenvolvimento crítico para estudar não apenas o p53 propriamente dito, mas também outras proteínas da família p5312,13.\nEm relação ao tipo de REs que controla a expressão dependente do p53, S. cerevisiae permite a construção de diferentes cepas de repórter possuindo diferenças únicas no re de interesse em um fundo isogênico de outra forma. Esse objetivo é atingido por meio de uma adaptação de uma abordagem de edição de genoma particularmente versátil desenvolvida em S. cerevisiae, denominada Delitto Perfetto12,14,15,16.\nAlém disso, diferentes genes de repórter (i.e., URA3, HIS3 e ADE2) podem ser usados para avaliar qualitativamente e quantitativamente as atividades transcricional do TFs humano em S. cerevisiae, cada uma com características específicas que podem ser adaptados às necessidades experimentais17,18,19,20,21. A expressão destes genes do repórter confere o uracil, o histidine, e o prototrophy do adenina, respectivamente. O URA3 reporter não permite o crescimento de células na presença de 5-Foa também, e, portanto, pode ser contraselecionado. O sistema ADE2 reporter tem a vantagem de que, além da seleção nutricional, permite a identificação de células de levedura que expressam Wild-Type (ou seja, funcional na expressão ADE2 ) ou mutante (ou seja,não funcional em ADE2 ) P53 da cor da colônia.\nPor exemplo, as células de levedura que expressam o gene ADE2 geram colônias brancas normalmente dimensionadas em placas contendo quantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), enquanto aquelas que mal ou não transtranscriam aparecem na mesma placa que o vermelho menor (ou rosa) Colônias. Isto é devido ao acúmulo de um intermediário na via de adenina biossintética (i.e., P-ribosylamino-imidazol, que tem sido anteriormente chamado de amino-imidazol aminoimidazole ou ar), que é convertido para formar um pigmento vermelho. A cor qualitativa baseada ADE2 gene do repórter foi substituída já com o Firefly quantitativo Photinus Tânia (LUC1)12,22. Mais recentemente, o repórter ADE2 foi combinado com o repórter de lacZ em um fácil-à-contagem, semi-quantitativo, ensaio dobro do repórter que pode ser explorado para subclassificar os mutantes p53 de acordo com seu nível residual de funcionalidade a 23.\nOs repórteres fluorescentes tais como EGFP (proteína fluorescente verde aumentada) ou dsred (proteína fluorescente vermelha de discosoma SP.) foram usados igualmente para a avaliação quantitativa da atividade do transactivacao associada com todas as mutações missense possíveis no TP53 seqüência de codificação24. Por fim, a chance de combinar promotores sintonáveis para a expressão do alelo p53 com cepas de levedura isogênicas diferindo para o gene RE e/ou repórter levou ao desenvolvimento de uma matriz de dados que gera uma classificação refinada de câncer associado e germline alelos p53 do mutante25,26,27.\nAs abordagens descritas acima são usadas para medir a atividade transcricional da proteína p53. No entanto, a expressão de p53 do tipo Wild no fermento S. cerevisiae28 e Schizosaccharomyces pombe29 pode causar retardo de crescimento, que tem sido associado à parada do ciclo celular28,30 ou morte celular31. Em ambos os casos, a inibição do crescimento do fermento é desencadeada pela expressão p53 elevada e foi correlacionada com a modulação transcricional potencial de genes endógenos do fermento envolvidos no crescimento da pilha. Suportando esta hipótese, o mutante da perda--função p53 R273H não interferiu com crescimento da pilha do fermento quando expressado em níveis similares como selvagem-tipo p5332. Inversamente, a expressão no fermento do mutante tóxico p53 V122A (sabido para uma atividade transcricional mais elevada comparada ao selvagem-tipo p53) causou um efeito inibitório do crescimento mais forte do que o selvagem-tipo p5332.\nAdicionalmente, demonstrou-se que a MDM2 humana foi capaz de inibir a atividade transcricional p53 humana em levedura, promovendo sua ubiquitinação e subsequente degradação33. Conformemente, a habilidade do Mdm2 humano e do MDMX de inibir a inibição p53-induzida do crescimento do fermento foi demonstrada32,34. Em um estudo adicional, estabeleceu-se uma correlação entre a atividade transcricional p53 e os níveis de expressão de actina, com a identificação de uma putativa p53 RE upstream no gene Act1 em levedura32. Consistentemente, a expressão do actínio foi aumentada pelo selvagem-tipo p53 e ainda mais por p53 V122A, mas não pelo mutante p53 R273H. Inversamente, a expressão do actina pelo p53 diminuiu na copresença de inibidores p53 Mdm2, MDMX, ou pifithrin-α (um inibidor da pequeno-molécula da atividade transcricional p53), consistente com os resultados baseados no ensaio do fermento-crescimento. É importante ressaltar que esses resultados estabeleceram uma correlação entre a inibição do crescimento induzida pela p53 e o grau de sua atividade na levedura, que também foi explorada para identificar e estudar pequenas moléculas modulando as funções p5328,34 , 35.\n1. construção de cepas de levedura ADE2 ou LUC1 repórter contendo um re específico (Yafm-re ou ylfm-re)\nRaia uma estirpe yafm-iCore ou ylfm-iCore12,14 (iCore = i, ISCe-i endonuclease GAL1 promotor; CO = contador selecionável URA3; RE = repórter KanMX4 conferindo resistência à kanamicina; Tabela 1) de um estoque de glicerol a 15% armazenado em-80 ° c em uma placa de agar YPDA (tabela 2). Deixe crescer por 2-3 dias a 30 ° c.\nTomar uma colônia de levedura a partir da placa fresca (não mais de 3 semanas de idade) e colocá-lo em um pequeno frasco contendo 5 mL de YPDA (tabela 2). Incubar a 30 ° c durante a noite, agitando em 150-200 rpm.\nNo dia seguinte, para remover todos os vestígios de dextrose, pellet as células por 2 min em 3.000 x g e descartar o sobrenadante por inversão do tubo.\nNota: realize todas as centrifugações neste protocolo à temperatura ambiente (RT).\nRessuscite a pelota da pilha em 30-50 mL de CM pre-aquecido (meios completos) que contêm o galactose (tabela 2) e incubar para 4 h em 30 ° c, agitando em 150-200 rpm (necessário para a indução de I-SCEI).\nCentrifugue as células durante 2 min a 3.000 x g e descarte o sobrenadante por inversão do tubo.\nResuspend a pelota da pilha em 30-50 mL da água estéril. Repita o passo 1,5.\nRessuscitem o pellet celular em 10 mL de água estéril. Repita o passo 1,5.\nRessuscitar o pellet celular em 5 mL de LiAcTE estéril (tabela 3), uma solução iónica que favorece a captação de DNA. Repita o passo 1,5.\nRessuscitar o pellet celular em 250 μL de LiAcTE estéril e transferir as células para um tubo de 1,5 mL. Repita o passo 1,5 e ressuscite o pellet celular em 300-500 μL de Liacta estéril.\nDurante as lavas, desnaturam uma solução de 10 mg/mL de portador de DNA de esperma de salmão por 10 min a 100 ° c e resfrie imediatamente no gelo para mantê-lo como DNA de uma única fita.\nNum tubo separado de 1,5 mL, adicione 500 picomoles do oligonucleotídeo pretendido (tabela 3), 5 ΜL do ADN do portador de esperma de salmão cozido, 300 ΜL de Peg LiAcTE estéril (tabela 3) e 50 μL da suspensão da célula de levedura (a partir do passo 1,9).\nVórtice dos tubos para 10 s para misturar e incubar por 30 min a 30 ° c, agitando a 150-200 rpm. Coloque os tubos de 1,5 mL no lado para favorecer a agitação.\nChoque térmico as células de levedura para 15 min a 42 ° c em um bloco de aquecimento, em seguida, Centrifugar as células para 20 s em 10.000 x g. Retire o sobrenadante e ressuscitem as células em 1 mL de água estéril.\nDistribuir 100 μL da suspensão da célula na placa de agar YPDA e incubar (de cabeça para baixo) durante 1 dia a 30 ° c. Para garantir colônias bem separadas são obtidos, também espalhar 100 μL de uma diluição 1:10.\nNo dia seguinte, placa de réplica usando veludos estéreis na placa de agar CM contendo dextrose e 5-FOA (tabela 2). Considere uma segunda placa da réplica em uma placa nova se muitas pilhas são transferidas (isto é, algum crescimento de URA3 pilhas).\nTrês dias depois, placa de réplica em YPDA não seletivo e YPDA contendo placas de ágar G418 (um antibiótico aminoglicídeo semelhante ao canamicina) (tabela 2), marcando cada placa para facilitar sua comparação subsequente. Incubar as placas durante a noite a 30 ° c.\nNo dia seguinte, identifique as cepas de repórter candidatas de colônias que são G418 sensíveis, mas crescem em placas YPDA (por exemplo, colônias de yLFM ou yAFM-RE). Raia as colônias identificadas (3-6 colônias) em uma nova placa YPDA para obter isolados de colônia única e deixá-los crescer por 2 dias a 30 ° c.\nRemendo únicas colônias do fermento em uma placa de YPDA para isolar as colônias para umas análises mais adicionais. Após 24 h a 30 ° c, teste-os pelo chapeamento da réplica em uma placa de agar YPGA (tabela 2) que impedem o crescimento de mutantes Petite (isto é, mutantes respiratório-deficientes). Ao mesmo tempo, placa da réplica em uma placa nova do agar de YPDA.\nTeste os remendos corretos (isto é, crescimento em placas do agar de YPDA e de YPGA; 1-3 colônias) da etapa 1,18 para a presença de integração correta do oligonucleotide pelo PCR da colônia. Monte uma mistura de reacção adicionando 5 μL de tampão de 10x PCR (1,5 mM MgCl2), 2 μL de 10 primers de picomoles/ΜL (tabela 3), 4 μL de dntps de 2,5 mm, 0,25 μL de 5 U/μL de polimerase de Taq e água até um volume final de 50 μL. Multiplique a mistura de reação para o número de colônias de levedura que precisam ser rastreadas e alíquota 50 μL em cada tubo de PCR. Usando uma pipeta, adicione uma quantidade muito pequena de células de levedura da placa de agar YPDA em uma única mistura de reação de PCR.\nRealize a reação de PCR com o seguinte programa: 94 ° c por 8 min seguidos por 35 ciclos de desnaturação por 1 min a 94 ° c, primers recozimento por 1 min a 55 ° c e extensão por 2 min a 72 ° c.\nDepois que a reação é terminada, carregue uma alíquota da reação do PCR (aproximadamente um décimo do volume) em um gel do agarose para verific o tamanho correto (~ 500 BP).\nSequencia o produto do PCR após a purificação com um jogo comercial para confirmar a integração da seqüência desejada do RE usando os mesmos primers da etapa 1,19.\nApós a validação da seqüência correta, faça um estoque de glicerol de 15% da cultura de estirpe yAFM-RE ou yLFM-RE (em YPDA) e armazene-o em-80 ° c.\n2. avaliação da capacidade de transativação da proteína p53 usando o ensaio de levedura ADE2 com base em cores qualitativa\nRepita os passos 1,1 e 1,2 utilizando a estirpe yAFM-RE (tabela 1).\nNo dia a seguir, diluir a cultura celular (1:10) em 30-50 mL de YPDA pré-aquecido e continuar a incubar a 30 ° c agitando até que o OD600Nm atinja 0,8-1,0 (~ 2 h).\nRepita os passos 1.5-1.10.\nEm um tubo separado de 1,5 mL, adicione 300-500 ng de vetor de expressão de levedura p53 (ou controle) (tabela 4), 5 μl do portador de DNA de esperma de salmão cozido, 300 ΜL de Peg LiAcTE estéril e 50 μL de suspensão de células de levedura.\nRepita os passos 1,12 e 1,13, mas ressuscitem o pellet celular em 300 μL de água estéril.\nEspalhe 100 μL da suspensão celular em placas seletivas sintéticas (para a expressão ou controle do p53) contendo dextrose como fonte de carbono e alta quantidade de adenina (tabela 2), em seguida, incubar (de cabeça para baixo) a 30 ° c por 2-3 dias.\nStreak única levedura transformante colônias (2-6 estrias por placa) em uma nova placa seletiva e deixá-los crescer durante a noite a 30 ° c.\nO dia após, usando a placa estéril da réplica dos veludos em placas seletivas novas que permitem a avaliação do phenotype da cor (isto é, as placas que contêm a dextrose como a fonte do carbono mas limitando a quantidade de adenina; Tabela 2). Incubar as chapas de cabeça para baixo a 30 ° c durante 3 dias. Opcionalmente, para avaliar a sensibilidade à temperatura da proteína p53, incubar em três temperaturas diferentes por 3 dias: 24 ° c, 30 ° c e 37 ° c.\nNota: a mesma raia pode ser revestida de réplica várias vezes.\nPara avaliar a habilidade da transativação da proteína p53, verific o phenotype cor-baseado de colônias do fermento e compare o phenotype da proteína p53 com respeito ao selvagem-tipo p53 e aos phenotypes vazios do vetor.\n3. avaliação da capacidade de transativação da proteína p53 utilizando a luminescência quantitativa baseada no ensaio de levedura LUC1\nTransforme células de levedura com vetores de expressão p53 (ou controle) (tabela 4) usando o método baseado em Liac descrito no protocolo 2. Use a estirpe de yLFM-RE (tabela 1).\nRemende únicos transformantes em uma placa seletiva nova com a quantidade elevada de adenina que contem a glicose como a fonte do carbono e deixe-as crescer em 30 ° c durante a noite. Para cada tipo de transformação, faça 5-7 patches diferentes.\nApós o crescimento durante a noite, ressuscitem uma pequena quantidade de células de levedura usando uma ponta de palito ou pipeta estéril da placa em meio seletivo sintético contendo dextrose ou rafinose como a fonte de carbono (200 μL de volume final em uma placa de poço transparente 96, com uma rodada ou fundo plano). Se o experimento necessitar de expressão p53 induzível, acrescente galactose ao meio de rafinose para modular o nível de indução (tabela 2).\nNota: estas suspensões da pilha devem ter um OD600Nm de aproximadamente 0,4 e não mais altamente do que 1.\nMeça a absorvência de cada poço em OD600Nm após a expressão p53 induzível (4-8 h em 30 ° c com agitação de 150-200 rpm) usando um leitor de placa Multilabel. Certifique-se de que as suspensões celulares são homogêneas misturando cada poço com uma pipeta multicanal.\nTransferir 10-20 μL de suspensão celular da placa de poço transparente 96 para uma placa branca de 384 (ou 96) e misturar com um volume igual (10-20 μL) de tampão de Lise. Incubar por 10-15 min em RT em uma coqueteleira (150-200 rpm) para atingir a permeabilização da célula ao substrato da luciferase.\nAdicionar 10-20 μL de substrato de luciferase de Firefly e medir as unidades de luz (LU) por um leitor de placas com vários rótulos.\nPara determinar a capacidade da transativação da proteína p53, normalizar os Lus de cada poço ao OD correspondente600Nm (unidade clara relativa, RLU). Calcule a média de RLU e desvio padrão de 3-4 patches de colônias transformante levedura.\nComparar os dados de transativação da proteína p53 com relação ao tipo selvagem p53 e vetor vazio, subtraindo os valores obtidos com o vetor vazio ou dividindo-se pelos valores obtidos com o vetor vazio (i.e., dobra computacional de indução).\nNota: a atividade de transativação do p53 também pode ser avaliada usando a mesma set-up experimental na presença de proteínas que interagem com p53 (i.e., MDM2 e MDMX) e/ou incluindo tratamento medicamentoso.\n4. avaliação da inibição do crescimento da proteína p53 utilizando o ensaio fenotípico de levedura\nTransforme células de levedura com vetores de expressão p53/MDM2/MDMX (ou controle) (tabela 4) usando o método baseado em Liac descrito na seção 2. Use a cepa CG379 (tabela 1) e espalhe os transformantes de levedura em placas seletivas mínimas (tabela 2).\nCresça pilhas transformadas no meio seletivo mínimo (tabela 2) a aproximadamente 1 OD600Nm.\nDiluir as células de levedura para 0, 5 OD600Nm no meio de indução seletiva (tabela 2) e, opcionalmente, adicionar uma pequena molécula escolhida à concentração apropriada (ou somente solvente) para testar sua eficácia na reativação do mutante p53 ou na inibição da Mdm2- /MDMX-P53 interações.\nIncubar as células a 30 ° c agitação orbital contínua (200 rpm) por aproximadamente 42 h (tempo exigido pela levedura de controle negativo para atingir a fase mid-log, cerca de 0,45 OD600Nm).\nSpot 100 μL de alíquotas de culturas de células de levedura em placas seletivas mínimas (tabela 2).\nIncubar durante 2 dias a 30 ° c.\nMeça o crescimento do fermento contando o número de colônias obtidas nas gotas da cultura 100 μL (unidade de formação de colônia, contagens de CFU). Por exemplo, calcule o efeito de reativação mutante de compostos Considerando o crescimento do tipo selvagem p53 expressando levedura como o efeito máximo possível (definido para 100%), enquanto o crescimento de células que expressam o mutante p53 (mas expostos ao controle de solvente) representa o nível zero de reativação.\nConstrução de ADE2 ou LUC1 cepas de levedura repórter\nODelitto perfettoapproach12,14,15,16 foi adaptado para possibilitar a construção de cepas de levedura de repórter p53 (Figura 1b). O método emprega oligonucleotídeos single-ou duplo-encalhado que contem, em ambas as extremidades, pelo menos 30 nucleotídeos homólogo ao Locus escolhido da integração. Especificamente, o homologia corresponde às seqüências que flanqueam o local da integração da gaveta dobro do marcador iCore, contendo o KlURA3 e o kanMX4 (gene do repórter que fornece a resistência ao Geneticin, G418) posicionado previamente em o local de destino desejado15,16. Esta gaveta igualmente contem a seqüência da codificação do endonuclease do I-SCEI do fermento, o promotor GAL1 induzível e seu local cognato do alvo. Conseqüentemente, um interruptor no direito Médio decontenção-contendo antes da transformação de pilhas de fermento com a seqüência desejada conduz à expressão I-SceI e à geração conseqüente de uma única ruptura da dobro-Costa (DSB) no local da integração de ICORE. A presença de um DSB estimula altamente a frequência de eventos de segmentação, com mais de 1.000 substituições obtidas com uma única transformação.\nNo final do processo de segmentação e seleção com base na resistência adquirida a 5-FOA e sensibilidade a G418, os clones candidatos são confirmados por PCR de colônia baseada na amplificação do locus modificado e sequenciamento de Sanger para verificar a correta integração do p53 desejado (Figura 1C). No final do protocolo de construção de estirpes, que pode ser concluído em cerca de uma semana, um painel de cepas de levedura de repórter isogênica são obtidos que podem ser usados para avaliar como as diferenças na seqüência de REs influenciam a capacidade de transativação da p53 Proteína.\nMutante funcionalmente heterogêneo P53s\nEm tumores humanos, o gene TP53 é afetado principalmente por únicas mutações missense que envolvem geralmente seis resíduos principais do hotspot (R175, G245, R248, R249, R273, e R282) situados no domínio DNA-obrigatório central (DBD) da proteína p53. No entanto, mais de 2.000 substituições de aminoácidos p53 únicas foram registradas, incluindo algumas que são raramente observadas27. O mutante P53s pode ser classificado como contato de DNA ou mutantes estruturais, dependendo dos efeitos da substituição do aminoácido no contato DNA-proteico (por exemplo, R273H) ou estrutura proteica (por exemplo, R175H)36. As únicas mutações missense TP53 impactam as funções p53, gerando uma escala larga da diversidade funcional, que possa influenciar características clínicas importantes tais como a agressividade do tumor, a quimio-resistência, e o potencial metastático37, 38 , 39.\nO conceito de que os mutantes p53 são funcionalmente heterogêneos claramente emergiu nos últimos 15 anos através de uma grande quantidade de dados experimentais disponíveis em bancos de dados de mutação TP53 (por exemplo, < p53. Free. fr//>)27. Foram desenvolvidos diferentes ensaios funcionais baseados em sistemas de levedura e/ou de repórter de mamíferos, destacando-se as diferentes propriedades dos mutantes P53s (i.e., transativação, sensibilidade à temperatura, potencial dominante-negativo, interferência com o Membros da família p53 e interações com outros TFs)13,24,40,41,42,43,44. O estudo funcional mais abrangente examinou mais de 2.300 mutantes em um ensaio à base de levedura, caracterizando sua atividade de transativação em direção a oito diferentes p53 REs24.\nOs dados confirmaram que quase todos os P53s do mutante que envolvem resíduos do hotspot são perda--função (isto é, perderam completamente a atividade do transactivacao). Inversamente, o mutante P53s que bateu outras posições da proteína p53 e é encontrado geralmente em moderado-à-baixa freqüência no cancer45 é Mutants da função parcial, que mantêm algum nível de atividade do transactivacao em p53 res13, 17. um exemplo de utilização do ensaio ADE2 para estudar a heterogeneidade funcional das proteínas p53 descritas é apresentado na Figura 2a. Na verdade, enquanto R175H é uma perda de função mutante produzindo colônias vermelhas em todas as condições testadas, R282W mostrou sensibilidade à temperatura que era mais evidente usando a expressão p53 galactose-dependente (i.e., o setor vermelho a 37 ° c na cepa P21-5 ' RE no placa contendo galactose inferior, que se torna rosa na placa de galactose superior). A Figura 2b apresenta um resumo dos resultados de um painel ampliado de mutantes p53 e cepas de repórter.\nA existência desta heterogeneidade funcional p53 alertou a exploração de se tal heterogeneidade paralelizou a heterogeneidade observada a nível clínico nos assuntos com mutações do germline TP53 . As mutações do germline TP53 fundamentam a base molecular de um grupo de desordens da predisposição do cancro, incluindo as síndromes mais severas de Li-Fraumeni (LFS) e de Li-Fraumeni-like (LFL), e as predisposições não-syndromic menos severas com (FH) ou sem (sem FH) história da família46.\nO protocolo destacou as correlações genótipo-fenótipo combinando as habilidades de transativação com base no ensaio de levedura de todos os alelos mutantes de TP53 germline com dados clínicos correspondentes do banco de dados iarc < http://www-p53.IARC.fr/germline.html >. Mutantes da perda--função p53 foram encontrados em umas síndromes mais severas do propensão do cancro, quando os mutantes parciais da função p53 forem encontrados em condições menos severas do propensão do cancro. Isto indica que a habilidade residual da transativação p53 influencia o phenotype clínico nos pacientes que herdaram mutações TP53 e desenvolveram o cancro25,26.\nVariações de sequências de nucleotídeo dentro de res regem p53 potencial de transativação\nHumano p53 é um tetramérica (dímero de dímeros) TF. Cada dímero p53 reconhece um RE constituído por 10 nucleotídeos (RRRCWWGYYY, R = A ou G; W = A ou T; Y = C ou T)47,48. Dois tais meios-locais podem ser adjacentes ou espaçados distante por até 13-20 nucleotides, constituindo um p53 funcional RE. No entanto, as res p53 com espaçador são caracterizadas por menor afinidade p53 e transativação do que p53 res sem espaçador49,50, em diferentes ensaios funcionais de vários sistemas.\nDemonstrou-se recentemente que metade-locais podem recrutar tetrâmeros p53 que são encadernados hemispecificamente51, junto com ensaios funcionais e estudos da imunoprecipitação da cromatina, estes resultados indicam que p53 pode igualmente actuar em res não-canônicos, Compreendendo Half-sites e sites de três quartos48,52. Além disso, o fato de que o motivo completo do consenso p53 re é muito degenerado (rrrcwwgyyy)2 prefigura a possibilidade que os res individuais podem substancialmente diferir na seqüência e na afinidade obrigatória. Considerando que centenas de genes alvo p53 foram identificados no genoma humano41,48, virtualmente todas as res p53 mostraram seqüência não idêntica entre si. Além disso, foi supor que os res com uma afinidade de ligação do ADN distinta são selecionados nos promotores de genes p53 do alvo envolvidos na apreensão do ciclo celular ou no apoptose53.\nA análise no fermento de muitas variações do re p53 em uma posição genomic constante estabeleceu o impacto das variações do nucleotide, do espaçador e da organização de Half-sites do re na capacidade do transactivacao49. Conduziu mesmo à descoberta de res polimórficos de p53 com os dois alelos que diferem marcada na compreensibilidade de um promotor associado a p5314,54,55. Recentemente, as informações derivadas das características da sequência p53 RE e do potencial de transativação à base de levedura foram codificadas no p53 Retriever, um algoritmo de busca de padrões que é capaz de localizar e classificar REs canônicos e não canônicos, de acordo com seus potenciais de transativação previstos em todo o genoma humano52.\nComo exemplo do uso do ensaio para o estudo do potencial de transativação p53 específico à seqüência, aqui apresentado é uma comparação entre o tipo selvagem p53 humano e a proteína p53 evolutiva distante de elegans de Caenorhabditis (Figura 3). Estes resultados são um seguimento de um estudo recente em que a divergência evolutiva da especificidade da transativação entre as proteínas p53 foi explorada56. As estirpes isogénicas do repórter de yLFM-RE foram desenvolvidas como descrito no protocolo. Especificamente, o CEP-1 p53 RE derivado do gene ced13 57, e quatro variantes (v1-v4) foram comparados (Figura 3a). As variantes do re foram construídas para examinar o impacto de variar o comprimento do espaçador que separa os dois motivos decameric (que em ced13, é de 28 nucleotídeos) e para examinar as mudanças nos nucleotídeos que flanqueiam o motivo do núcleo de cwwg (que em ced13, são ricos de A/T; enquanto na mais alta afinidade humana p53 REs, são G/C rico)58. Os resultados mostram claramente como a Cep1 e a p53 humana divergem em termos de especificidade da transativação. De fato, enquanto a transativação mediada pelo p53 humana é fortemente inibida pela presença de um espaçador (Figura 3B), a atividade do CEP-1 é inibida pela remoção do espaçador (Figura 3C). Além disso, a transativação mediada pelo CEP-1 é abolida quando a RE é modificada de a/T-em G/C-Rich. Nem p53 humano nem CEP-1 podem transacionar de um único decâmeros derivado do ced13 re.\nÀ procura de pequenos disruptores de moléculas de interações p53-MDM2/MDMX e reativadores da atividade p53 mutante\nA correlação estabelecida entre o efeito inibitório de crescimento do p53 humano e o grau de sua atividade na levedura levou a um ensaio de triagem simplificado com base em medidas de crescimento de células de levedura para analisar o impacto de fatores interferentes na atividade da p53 (Figura 4 ). A eficácia do ensaio fenotípico de levedura para a tela para potenciais agentes anticâncer foi demonstrada em várias obras. Usando células de levedura coexpressando p53 e seus inibidores MDM2 e/ou MDMX, novos disruptores dessas interações foram identificados por sua capacidade de inibir o efeito negativo de MDMs na p53, reestabelecendo assim a inibição do crescimento de levedura induzida pelo tipo selvagem p53 ( Figura 4a). Em particular, este ensaio conduziu à descoberta de 1) pyranoxanthone 1 como o primeiro inibidor da interação p53-MDM2 com um andaime de xanthone34 e 2) nervos inibidores de oxazoloisoindolinone da interação p53-Mdm259. Adicionalmente, com este ensaio, o α-Mangostin e o ácido fruto foram descritos para a primeira vez como os nervos inibidores potenciais da interação p53-Mdm230.\nMais tarde, o mesmo ensaio demonstrou que o Prenilação dos chalconas realçou sua habilidade de interromper a interação p53-Mdm260. Curiosamente, este ensaio de levedura também levou à descoberta de dois inibidores das interações p53-MDM2/MDMX: o oxazolopiperidona OXAZ-161 derivado de triptphanol e oxazoloisoindolinona derivado de TRIPTPHANOL DIMP53-162.\nO impacto reduzido da perda de função do mutante p53 no crescimento de células de levedura também tem sido explorado para a tela de drogas de reativação do mutante p53, caracterizada pela capacidade de restaurar a atividade inibitória do crescimento tipo selvagem para o mutante p53 (Figura 4B). Com este ensaio do fermento, um Reativador do mutante p53 R280K, o enantiopure tryptophanol-derivado oxazoloisoindolinone SLMP53-163, foi identificado. A Figura 4C,D mostra resultados representativos obtidos em leveduras com a expressão de p53 ou tratamentos com o inibidor da interação p53-Mdm2 nutlin-3A ou com o Reativador do mutante p53 Y220C PhiKan083.\nValidação do mecanismo molecular de ação desses compostos como agentes ativadores da p53, bem como sua atividade antitumoral, tanto em linhagens celulares tumorais humanas34,60,61,62,63 e os modelos animais62,63, atesta ao grande potencial do ensaio fenotípico da levedura na descoberta da droga.\nFigura 1 : Características de leveduras baseadas em ensaios de transativação p53 e fluxo de trabalho para a construção de cepas de levedura de repórter p53. (A) a facilidade de manipulação do genoma e a expressão gênica ectópica controlada tornam o fermento semelhante a um "tubo de ensaio in vivo", no qual várias variáveis relevantes para examinar as funções de Transativação do p53 são rigorosamente exploradas. Essas variáveis incluem os níveis de expressão de uma proteína p53 de tipo selvagem ou mutante, a sequência do RE, e o tipo de gene repórter [qualitativo/semiquantitativo (por exemplo, ADE2 e lacZ) ou quantitativo (por exemplo, LUC1)]. A sequência de RE de consenso é altamente degenerada (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = Purina; W = A/T; Y = pirimidina; CWWG = seqüência CORE, n = 0-13 bps espaçador). Os números de desencontros em relação ao consenso, a sequência CORE e o número de espaçadores de pares de base influenciarão a atividade de transativação. Este painel foi modificado de uma publicação anterior64. (B) esquema da aproximação do Perfetto do Delitto para introduzir um p53 desejado re a montante do promotor mínimo que conduz a expressão do gene do repórter de ADE2 ou de LUC1 . O protocolo foi adaptado de publicações anteriores12,15,16. (C) exemplo dos resultados da amplificação do PCR da colônia da levedura da região que circunda o local da integração de oligo re. A imagem da electroforese apresenta o resultado da amplificação de duas colônias positivas putativo (URA3 menos e G418 sensíveis) com o controle correspondente do negativo do PCR ao lado da escada do ADN de 1 KB (Promega). A faixa de ~ 500 NT esperada usando primers descritos na tabela 3 pode ser seqüenciada para confirmar a edição correta do promotor, como mostrado no electropherogram. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.\nFigura 2 : As proteínas p53 mostram potencial de transativação re-specific e sensível à temperatura. O selvagem-tipo p53 e as mutações missense TP53 indicadas foram testadas usando o ensaio de cor-baseado qualitativo do repórter no fermento e explorando as tensões do repórter que abrigam diferentes res p53 que controlam a expressão de gene ADE2 . (A) um exemplo do phenotype da cor da colônia para o selvagem-tipo p53, o R175H, e o R282W com o puma (BBC3) e o P21-5 ' res em 30 ° c e 37 ° c são mostrados. Moderada (0, 8% galactose) e alta (0,12% galactose) p53 expressão é comparada. (B) resultados obtidos com um conjunto prolongado de mutantes p53 e cepas de repórter de levedura examinadas para o fenótipo de cor da colônia dependente de p53 em três temperaturas (24 ° c, 30 ° c e 37 ° c). Os resultados exemplificam a heterogeneidade funcional dos alelos do mutante p53 e são resumidos em um formato de tabela. Por exemplo, R175H é uma perda de função mutante, enquanto G199H é selvagem-tipo p53-like. K139E e R282W mantêm a função parcial e exibem a sensibilidade fria e a sensibilidade ao calor, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.\nFigura 3 : O humano p53 e o ortólogo creditado CEP-1 exibem a especificidade altamente divergida do transactivacao. (A) seqüências do: seqüência de consenso humano de p53 re, CEP-1 p53 re derivado do gene ced13 , e quatro variantes (v1-v4) que foram testadas nos ensaios funcionais. (B) a transativação foi mensurada após indução da expressão p53 humana por 8 h, utilizando três diferentes fontes de carbono para atingir expressão baixa, moderada e alta (0, 8%, 0, 32%, 0,12% de galactose adicionada ao meio seletivo contendo 2% de raffinose). Os resultados são expressos como unidades de luz relativa média (RLU) e erro padrão de quatro repetições. A atividade do repórter para a pilha transformada com vetor vazio da expressão foi subtraída para fora. (C) especificidade da transativação de Cep1, medida em (B). Para ambas as proteínas, os níveis de transativação foram proporcionais à quantidade de galactose. As unidades luminosas mais elevadas medidas quando o p53 humano é expressado podem ser dependentes dos níveis diferentes de quantidades da proteína produzidas, devido à diferença no comprimento da proteína e potencial também no uso do Codon. As duas proteínas são caracterizadas pela especificidade diferente do transactivacao para os res diferentes testados e esta propriedade não é afetada por diferenças possíveis na quantidade relativa da proteína. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.\nFigura 4 : Ativadores pequenos da molécula de p53 identificados usando o ensaio fenotípico da levedura. (A) as pilhas de levedura que coexpressam o selvagem-tipo humano p53 e Mdm2 ou MDMX foram usadas para procurarar por nervos inibidores das interações p53-Mdm2 e p53-MDMX. Neste sistema, os inibidores da interação restauram a inibição p53-induzida do crescimento do fermento em pilhas de fermento que coexpressam p53 e MDM2 ou MDMX. Esta abordagem permitiu a identificação de inibidores da interação p53-MDM2 e identificação de inibidores duplos das interações p53-MDM2 e p53-MDMX. (B) as células de levedura que expressam o mutante humano p53 têm sido usadas para procurar reativadores do mutante p53 e são capazes de restaurar a inibição do crescimento de levedura induzida pelo tipo selvagem p53 no mutante p53-expressando células de levedura. (C) imagens representativas do ensaio de mancha de placa mostrando o impacto do tipo selvagem p53 ou mutante Y220C no crescimento da colônia de levedura em comparação com o vetor vazio (ver etapa 4,5). (D) resultados quantitativos do ensaio de crescimento: 10 ΜM nutlin-3a restaura a inibição do crescimento de levedura induzida por p53 em células coexpressando Mdm2; 50 μM PhiKan083 restaura a inibição do crescimento de levedura induzida pelo tipo selvagem p53 para o mutante p53 Y220C. Ambos os efeitos são plotados em relação ao efeito inibitório do crescimento do fermento do selvagem-tipo p53, que foi ajustado como um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.\nNome da estirpe e genótipo Uso específico Número do protocolo\nYafm-ICORE: mata leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2 É utilizado para a construção da cepa Yafm-re (mata leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2) que é explorado no ensaio qualitativo, baseado em cor ADE2. Protocolos 1, 2\nYlfm-ICORE: mata leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: LUC1 É utilizado para a construção da cepa Ylfm-re (mata leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; RE::p Cyc1:: LUC1) que é explorado no ensaio quantitativo de LUC1 baseado em luminescência. Protocolos 1, 3\nCG379: mata, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] É utilizado para o ensaio de crescimento fenotípico. Protocolo n º 4\nTabela 1: Cepas de levedura.\nNome da mídia e receita Uso específico Número do protocolo\nYpda (2% extrato de levedura, 2% peptona, 2% dextrose, 200 mg/L adenina) + 2% de agar YPDA sem agar é esterilizado preferencialmente por filtração. YPDA + agar é esterilizado por autoclavagem; é possível omitir a dextrose da receita e adicionar dextrose de um filtro de 20% solução esterilizada em água antes de derramar as placas. Protocolos 1-4\nCm [0,17% levedura base de nitrogênio sem AA e sulfato de amônio, 0,5% sulfato de amônio, 5% (volume/volume, v/v) solução de aminoácidos não essenciais, 20 mg/l de histidina, 20 mg/l de triptofano, 20 mg/l de uracil, 30 mg/l de lisina, 100 mg/l de leucina, 200 mg/l de adenina] + 2% de galactose A mídia é esterilizada por filtragem. As seguintes soluções de ações estéreis são preparadas em água (com exceção do uracil, que é dissolvido em NaOH 0,1 M) por filtração: solução de aminoácidos não essenciais (0, 4% arginina, 0, 4% metionina, 0, 6% isoleucina, 0,1% fenilalanina, 0,2% glutâmico ácido, 0,2% ácido aspático, 0,3% valina, 0,4% treonina, 0,8% serina), 1% histidina, 1% triptofano, 1% uracil, 1% lisina, 1% leucina, 0,5% adenina, 20% galactose. A solução conservada em estoque de Adenine não deve ser armazenada no refrigerador devido à formação e à sedimentação dos cristais. A solução de triptofano deve ser armazenada no escuro. Protocolo n º 1\nCm (veja acima) + 2% dextrose + 1G/L 5-Foa + 2% Agar A mídia (contendo base de nitrogênio de levedura sem AA e sulfato de amônio, sulfato de amônio e Agar) é esterilizada por autoclavagem. Os outros componentes são adicionados após autoclavagem para preservar os ingredientes calor-lábeis; o pó de 5 FOA pode ser adicionado diretamente na mídia, uma vez que esfriou para cerca de 55 ° c. Protocolo n º 1\nYpda + 400 μg/ml G418 + 2% Agar G418 deve ser adicionado após o autoclavagem uma vez que a mídia esfriou para cerca de 55 ° c. Se a partir do pó, uma solução de 50 mg/mL G418 pode ser preparada em água e esterilizada por filtração. Protocolo n º 1\nYPGA [2% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicerol (v/v), 200 mg/L adenina] + 2% de agar A mídia é esterilizada por autoclavagem. Protocolo n º 1\nPlaca seletiva sintética: [0,17% base de nitrogênio levedura sem AA e sulfato de amônio, 0,5% sulfato de amônio, 5% (v/v) solução de aminoácidos não essenciais (0, 4% arginina, 0, 4% metionina, 0, 6% isoleucina, 0,1% fenilalanina, 0,2% ácido glutâmico, 0,2% ácido aspático, 0,3% valina, 0,4% treonina, 0,8% serina), 20 mg/L de histidina, 20 mg/L de uracile, 20 mg/L de triptofano (dependendo do marcador de seleção vetorial), 30 mg/L de lisina, 100 mg/mL de leucina (dependendo do marcador de seleção vetorial), 5 mg/L ou 200 mg/L adenina] + 2% dextrose + 2% A mídia (contendo base de nitrogênio de levedura sem AA e sulfato de amônio, sulfato de amônio e Agar) é esterilizada por autoclavagem. Os outros componentes são adicionados após autoclavagem para preservar os ingredientes calor-lábeis. Ao usar vetores baseados em pLS e pLSG, prepare placas sem leucina. Ao usar os vetores baseados em pTS e pTSG, prepare placas sem triptofano. Protocolos 2-3\nMeios seletivos sintéticos: [0,17% base de nitrogênio levedura sem AA e sulfato de amônio, 0,5% sulfato de amônio, 5% (v/v) solução de aminoácidos não essenciais (0, 4% arginina, 0, 4% metionina, 0, 6% isoleucina, 0,1% fenilalanina, 0,2% ácido glutâmico, 0,2% ácido aspático, 0,3% valina, 0,4% treonina, 0,8% serina), 20 mg/l de histidina, 20 mg/l de uracile, 20 mg/l de triptofano (dependendo do marcador de seleção vetorial), 30 mg/l lisina, 100 mg/ml de leucina (dependendo do marcador de seleção vetorial), 200 mg/l adenina] + 2% dextrose ou rafinose + 0-2% galactose A mídia é esterilizada por filtração. Ao usar vetores baseados em pLS ou pTS no tratamento medicamentoso, prepare meios de comunicação sem leucina ou triptofano, respectivamente, mas contendo 2% de dextrose. Ao usar o vetor plsg-ou ptsg-baseado na expressão p53 induzível com ou sem tratamento da droga Prepare meios sem leucina ou triptofano, respectivamente mas contendo o rafinose de 2% e a quantidade variável de galactose para modular a expressão p53. A extensão da indução p53 também pode ser modulada variando o tempo de incubação. Protocolo n º 3\nPlacas seletivas mínimas: glicose de 2%, base do nitrogênio de fermento de 0,7% (sem aminoácidos e sulfato de amônio), 50 mg/l adenina, 50 mg/l uracil, 50 mg/l histidina, 50 mg/l triptofano (dependendo do marcador de seleção vetorial), 50 mg/l de leucina (dependendo marcador de seleção vetorial), 2% Agar O meio é esterilizado por autoclavagem. Ao usar vetores baseados em pLS89 preparar meio sem triptofano. Use o vetor pLS89-Empty (não expressando nenhuma proteína) como o controle negativo. Ao usar vetores pLS89-based e pGADT7-MDM2 (coexpressão de p53 e MDM2), prepare o meio sem leucina e triptofano. Use pLS89-Empty e pGADT7 (ambos não expressando nenhuma proteína) como controles negativos. Ao usar vetores baseados em pLS76 preparar meio sem leucina. Use o vetor pRS315 (não expressando nenhuma proteína) como o controle negativo. Protocolo n º 4\nMeio seletivo mínimo: como placas seletivas mínimas mas sem Agar O meio é esterilizado por filtração. Protocolo n º 4\nMeio seletivo da indução: como o meio seletivo mínimo mas que contem a galactose de 2% em vez da glicose O meio é esterilizado por filtração. Protocolo n º 4\nTabela 2: meios de levedura.\nNome da solução e receita ou nome e sequência da cartilha Características e uso específicos Número do protocolo\nLiac/te: 10 mm Tris-HCl, pH 8,0, com 1 mm de EDTA e 0,1 m de acetato de lítio As seguintes soluções de ações estéreis em água são preparadas por autoclavagem: 1M de acetato de lítio pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X). Protocolos 1-4\nPeg/LiAc/te: 40% polietileno glicol (PEG) em 10 mm Tris-HCl, pH 8,0, com 1 mm de EDTA e 0,1 M de acetato de lítio As seguintes soluções de ações estéreis em água são preparadas por autoclavagem: 1 M de acetato de lítio pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X), 50% PEG (peso molecular ~ 3350). Protocolos 1-4\nCaudas de homologia para o RE oligonucleotides:\n5 '-gcggaattgactttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3 ' Fornecido é a seqüência das caudas da homologia, correspondendo às seqüências cromossomáticas que flanqueam a gaveta integrada de ICORE; RE = sequência RE. Protocolo n º 1\nLuc1-RV: 5 '-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3 ' Para a estirpe yAFM-RE (PCR e sequenciamento) combine Ade2 FW com Ade2 RV primer. Para a estirpe de yLFM-RE (PCR e arranjar em seqüência) combine Ade2 FW com o primer Luc1-RV. Protocolo n º 1\nTabela 3: soluções e oligonucleotides.\nTipos de vetores Controles positivos e negativos Número do protocolo\nVetores p53 (ou controle).\npLS-ou plsg-baseou: expressão da proteína p53 o promotor constitutivo de ADH1 ou o promotor induzível GAL1 do galactose, respectivamente (LEU2 como o marcador da seleção).\npTS-ou ptsg-based: expressão da proteína p53 o promotor ADH1 constitutivo ou o promotor GAL1 induzível do galactose, respectivamente (TRP1 como o marcador da seleção) pLS-e pLSG-baseou: use como o controle positivo o pLS76 e os vetores de pLSG-p53 (expressando o tipo selvagem p53), respectivamente; usar como controle negativo pRS315 vector (não expressar qualquer proteína).\npTS-e pTSG-based: use como controle positivo o pTS76 e os vetores pTSG-p53 (expressando o tipo selvagem p53), respectivamente; usar como controle negativo pRS314 vector (não expressar qualquer proteína). Protocolo 2, 3\nVetores p53 e MDM2 (ou controle).\npLS89-based: expressão selvagem da proteína p53 do tipo o promotor induzível GAL1 do galactose (TRP1 como o marcador da seleção).\npLS76-based: expressão da proteína p53 do mutante o promotor ADH1 constitutivo (LEU2 como marcador de seleção).\npGADT7-based: MDM2 expressão protéica o promotor ADH1 constitutivo (LEU2 como marcador de seleção) pLS89-based: use como controle positivo o vetor pLS89-p53 (expressando o tipo selvagem p53); usar como controle negativo pLS89-Empty (não expressar qualquer proteína).\npLS76-based: use como controle positivo o vetor p53 do pLS76-mutante (expressando o mutante p53); usar como controle negativo pRS315 vector (não expressar qualquer proteína).\npGADT7-based: use como controle positivo o vetor pGADT7-MDM2 (expressando o tipo selvagem MDM2); usar como controle negativo pGADT7 vector (não expressar qualquer proteína). Protocolo n º 4\nTabela 4: vetores de expressão de levedura.\nOs ensaios baseados em leveduras provaram ser úteis para investigar vários aspectos das funções da proteína p53. Esses ensaios são particularmente sensíveis para avaliar o potencial de transativação do p53 em relação a variantes de sítios alvo de RE, incluindo a avaliação de polimorfismos funcionais. O uso de repórteres de cor, bem como a miniaturização do resultado do ensaio luciferase em ensaios de custo-benefício e relativamente escalável. Além disso, o teste de inibição do crescimento é potencialmente capaz de ser utilizado na triagem de bibliotecas químicas, automatizando a quantificação da viabilidade de células de levedura através da mensuração da absorvência. Quando a permeabilidade limitada devido à parede e à ação de pilha de transportadores do ABC for considerada uma limitação em usar o fermento para a seleção da droga, as modificações genéticas para melhorar a tomada foram desenvolvidas com sucesso22,65.\nEm comparação com os ensaios baseados em células de mamíferos, o ensaio p53 à base de levedura pode melhorar a identificação de acertos diretos, uma vez que a p53 é isolada da incrível complexidade de cofatores e sinalização de vias em cascata que modulam suas funções em eucariotas superiores. Os ensaios funcionais baseados em leveduras também têm sido parcialmente bem-sucedidos no monitoramento da interação da p53 com cofatores proteicos (ou seja, Mdm2 e MDMX22,32,33,34) e impacto de pequenas moléculas (como Nutlin-3a) nessas interações. No entanto, a sensibilidade e o poder preditivo de ensaios à base de levedura para investigar a conversa cruzada entre p53 e proteínas interagindo podem ser um pouco limitados, dependendo de como essas interações dependem in vivo de modificações pós-translacionais e cascatas de sinalização específicas de espécies.\nOs sistemas descritos aqui podem ser facilmente adaptados a outros TFs. De fato, os ensaios funcionais de levedura foram desenvolvidos para proteínas P63 e p73 relacionadas ao p5342,49 bem como membros da família NF-κB66,67 [ou mesmo para alguns homeobox e hélice-loop-hélice básica (bhlh) TFs68,69]. Receptores nucleares humanos também foram expressos em levedura e comprovada para trabalhar como ligand-dependente, seqüência específica TFs70. Um fator limitante foi identificado na fraca capacidade de algum domínio de transativação de mamíferos (TAD) para interagir com a maquinaria de transcrição basal de levedura8, uma lacuna que pode ser superada usando construções quiméricas, incluindo um ativo Tad heterólogo68,69.\nAgradecemos à União Europeia (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 através do programa operacional factores de competitividade-competir) e fundos nacionais (FCT/MEC, Fundação para a ciência e tecnologia e Ministério da educação e ciência) a Acordo de parceria PT2020 UID/QUI/50006/2019 e os projetos (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. Bolsas FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Este trabalho foi apoiado pela Compagnia S. Paolo, Turim, Itália (projeto 2017, 526) e Ministério da saúde, (projeto 5X1000, 2015 e 2016; pesquisa atual 2016). Agradecemos profundamente ao Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universidade de Trento, laboratórios de ensino de ciências experimentais) para assistência com gravação de vídeo.


Literaleitura: Resenha: A Viagem do Tigre\nPerigo. Desolação. Escolhas. A eternidade é tempo demais para esperar pelo verdadeiro amor?Em sua terceira busca, a jovem Kelsey Hayes e seus tigres precisam vencer desafios incríveis propostos por cinco dragões mítico. O elemento comum é a água, e o cenário de mar aberto obriga Kelsey a enfrentar seus piores temores.Dessa vez, sua missão é encontrar o Colar de Pérolas Negras de Durga e tentar libertar seu amado Ren tanto da maldição do tigre quanto de sua repentina amnésia. No entanto o irmão dele, Kishan, tem outros planos, e os dois competem por sua afeição, além de afastarem aqueles que planejam frustar seus objetivos.Em a Viagem do tigre, terceiro volume da série A maldição do tigre, Kelsey, Ren e Kishan retomam a jornada em direção ao seu verdadeiro destino numa história com muito suspense, criaturas encantadas, corações partidos e ação de primeira. [SKOOB]\nComo já não é novidade para essa saga, o livro continuou com o duplo sentimento. Por um lado estou apaixonada, por outro estou com muita raiva. A cada livro que passa esses dois sentimentos aumentam, mas simplesmente não consigo escolher um que fique mais forte.\nNeste livro, com Ren agora desmemoriado em relação apenas à Kelsey, para mim ficou claro que começaria o outro lado do romance, o com o Kishan, porém qual foi a minha surpresa em logo nos primeiros capítulos acontecer o oposto. Acho que me enchi de esperanças achando que não ia ter um triângulo amoroso por isso, porque realmente estava tudo caminhando para um livro que eu ia gostar, um romance "mela cueca" em meio a uma mitologia fascinante. Porém, errei. E como errei.\nDesta vez a minha raiva não ficou direcionada apenas a protagonista feminina, como vem acontecendo desde o primeiro livro. Desta vez Ren, o charmoso príncipe ganhou muito da minha raiva, mas ao contrário de Kelsey, ele conseguiu me conquistar de novo mais para o final do livro. Acho que tenho mais facilidade em perdoar personagens homens.\nEm todo o caso, acho que até o momento, mesmo com esse triângulo amoroso mais forte neste livro do que em qualquer outro até o momento, este foi o meu preferido da saga, pelo menos por enquanto. Simplesmente fiquei fascinada com as coisas que aconteceram em relação a aventura deles para quebrar a maldição do tigre. Apesar da mitiologia indiana estar fortemente presente, como sempre, há também uma mescla com a chinesa e outras mais, mostrando o quão rica a cultura indiana é. Sem dúvidas é um livro de tirar o fôlego se soubermos apreciar as coisas que eles nos apresenta.\nEntão, e Kishan? Neste livro, seguindo o anterior, ele está mais presente. Está ganhando o seu espaço não apenas no coração da protagonista como também nos nossos. Tudo o que penso durante o livro é que ele merece alguém bem melhor do que a Kelsey. Porque, primeiro ele se apaixona pela noiva do irmão e que conquistava-o a mando do pai. Ou seja, furada. Agora ele se apaixonou pela namorada do irmão que no fundo não consegue ser verdadeiramente apaixonada por ele. Ou seja, outra furada. E não vamos pensar que ele é o irmão mau. Não mesmo, para todos que leram fica claro que Kishan é muito bom (em todos os sentidos), ele apenas é um pouco mais... ativo do que o casal que, a meu ver, é o principal.\nEste livro terminou de uma forma que me fez querer muito saber o que ia acontecer e como as coisas caminhariam, pois não imaginei que algo do tipo pudesse acontecer tão logo. Assim, gastei um dinheiro que não podia comprando os livros que me faltavam. O que significa que eles são realmente viciantes, pois, de modo contrário, eu não faria isso. A todos que ainda se perguntam se devem ler, meu conselho é: se gosta de fantasia, mitologia, romance e não se importa em se irritar um pouco, então leia! Garanto que se for como eu, não vai se importar, pelo contrário. Vamos quebrar essa maldição juntos.\nPostado por Fernanda Barroso às 21:26\nLivros que li 3 de dezembro de 2015 23:08\nJá conheço a série e nunca me chamou a atenção para lê-los, não sei por que pois gosto de todos os ingredientes que citou "fantasia, mitologia, romance", talvez de uma chance a ele no próximo ano,


Tecnoblog: Android: como evitar que imagens do Gmail carreguem automaticamente\nRecentemente, a Google começou a utilizar um novo recurso na sua plataforma de emails, o Gmail. Assim como foi anunciado em dezembro do ano passado, as imagens anexadas às mensagens que você receber vão ser carregadas automaticamente — de forma reduzida, mostrando uma espécie de prévia do conteúdo mandado.\nA novidade sobre isso é o fato de que essa espécie de "ferramenta" chegou aos aparelhos mobile por meio da última atualização feita no aplicativo do Gmail. Para algumas pessoas, isso pode ser bem bacana, já que facilita a visualização de todo o email, mesmo sem ser necessário realizar o download propriamente dito das imagens.\nContudo, para alguns, essas pequenas fotografias podem ser um empecilho. Em primeiro lugar, uma quantidade considerável de dados é consumida para que elas sejam carregadas, o que pode esgotar o seu plano de internet móvel e fazer com que a sua conexão fique lenta.\nAlém disso, você pode apenas não gostar que as fotografias anexadas apareçam do nada.\nO que nem todo mundo sabe é que é possível impedir que isso aconteça através das configurações do app do Gmail. Dessa maneira, se você não quer que as imagens dos seus emails carreguem automaticamente, basta continuar lendo.\nAcabando com as imagens impertinentes\nEm primeiro lugar, estando com o aplicativo do Gmail atualizado, tudo o que você precisa fazer é abri-lo normalmente. Em seguida, acessa as configurações do seu aparelho — a maneira como isso deve ser feita varia de dispositivo para dispositivo.\nDiferente do que muita gente pode imaginar, na nova janela que aparecer, você não deve acessar as configurações gerais da plataforma de emails. No lugar disso, toque na alternativa que diz respeito ao seu email, como mostra a imagem abaixo.\nDepois de tudo isso, apenas role até a parte inferior da nova tela para achar a alternativa chamada “Imagens”. Como você vai pode conferir, vai estar configurado para que elas sempre sejam mostradas, mas você pode tocar nessa categoria e selecionar para que isso só aconteça quando você permitir.\nSeguindo todos os passos descritos acima, as fotografias que anexarem em emails para você não vão mais carregar automaticamente.\nLeia mais em: http://www.tecmundo.com.br/como-fazer/50063-android-como-evitar-que-imagens-do-gmail-carreguem-automaticamente.htm#ixzz2sa6V5zgB