Benedicta Chaplin Cipriano\n1 Universidade de Brasília Instituto de Ciências Exatas Departamento de Ciência da Computação Pipelines para transcritomas obtidos por sequenciadores de alto desempenho Paulo Antonio Alvarez Monografia apresentada como requisito parcial para conclusão do Bacharelado em Ciência da Computação Orientadora Prof. a Maria Emília Machado Telles Walter Brasília 2009\n2 Universidade de Brasília UnB Instituto de Ciências Exatas Departamento de Ciência da Computação Bacharelado em Ciência da Computação Coordenador: Prof. Marcus Vinicius Lamar Banca examinadora composta por: Prof. a Maria Emília Machado Telles Walter (Orientadora) CIC/UnB Prof. a Célia Ghedini Ralha CIC/UnB Prof. Marcelo de Macedo Brígido IB/UnB CIP Catalogação Internacional na Publicação Alvarez, Paulo Antonio. Pipelines para transcritomas obtidos por sequenciadores de alto desempenho / Paulo Antonio Alvarez. Brasília : UnB, p. : il. ; 29,5 cm. Monografia (Graduação) Universidade de Brasília, Brasília, Sequenciadores de alto desempenho, 2. Projetos Genoma, 3. Métodos Computacionais, 4. pipeline CDU 004 Endereço: Universidade de Brasília Campus Universitário Darcy Ribeiro Asa Norte CEP Brasília DF Brasil\n3 Universidade de Brasília Instituto de Ciências Exatas Departamento de Ciência da Computação Pipelines para transcritomas obtidos por sequenciadores de alto desempenho Paulo Antonio Alvarez Monografia apresentada como requisito parcial para conclusão do Bacharelado em Ciência da Computação Prof. a Maria Emília Machado Telles Walter (Orientadora) CIC/UnB Prof. a Célia Ghedini Ralha CIC/UnB Prof. Marcelo de Macedo Brígido IB/UnB Prof. Marcus Vinicius Lamar Coordenador do Bacharelado em Ciência da Computação Brasília, 14 de dezembro de 2009\n4 Dedicatória Dedico este trabalho aos meus pais e a minha família. 4\n5 Agradecimentos Agradeço a minha orientadora pelo apoio durante o desenvolvimento deste projeto. 5\n6 Resumo Neste trabalho propusemos e implementamos um protótipo de pipeline de software para projetos transcritoma utilizando dados provenientes de sequenciadores de alto desempenho. O pipeline foi desenvolvido utilizando a linguagem Java e o sistema gerenciador de banco de dados PostgreSQL, sendo executado através da linha de comando e configurado por meio da edição de arquivos de properties. O estudo de caso feito com o pipeline envolveu dados de Salmonella enterica obtidos por meio do sequenciador 454/Roche. O pipeline completo executou em menos de duas horas, com arquivos iniciais totalizando cerca de sequências. O filtro da montagem selecionou cerca de sequências agrupadas em cerca de grupos (contigs e singlets ). Foram anotados cerca de grupos utilizando BLAST com o banco de dados KOG. Palavras-chave: Sequenciadores de alto desempenho, Projetos Genoma, Métodos Computacionais,pipeline 6\n7 Abstract In this work we propose and implement a software pipeline prototipe for transcriptome projects using data from high throughput DNA sequencers. The pipeline was developed using the Java programming language and the database management system PostgreSQL, it runs through the command line and is configured by means of editing properties files. The test case was developed with data from Salmonella enterica obtained by the sequencer 454/Roche. The pipeline executed in less than two hours, with its inicial files providing about sequences. The assembly filter select around sequences, which originated around groups(singlets and contigs). Around groups were annotated using BLAST against the KOG database. Keywords: Next generation sequencers, Genome Projects, Computational Methods, pipeline 7\n8 Sumário Lista de Figuras 10 Lista de Tabelas 11 1 Introdução Contextualização Problema Hipóteses Objetivos Descrições dos Capítulos Conceitos Básicos em Biologia Molecular Vida Proteínas Ácidos nucléicos DNA RNA Genes e cromossomos Dogma central da Biologia Molecular Bioinformática Pipeline de um projeto de sequenciamento Pipeline para um projeto de sequenciamento Sanger Projetos transcritoma Sequenciadores Massivamente Paralelos FLX Roche Illumina Solexa Softwares e pipelines para Sequenciadores Massivamente Paralelos Softwares para submissão Software para submissão do sequenciador Software para submissão do sequenciador Illumina Softwares para mapeamento Softwares para montagem Softwares para anotação Pipelines para sequenciadores de alto desempenho\n9 5 Proposta de pipeline para o Sequenciador 454 e Estudo de Caso Estrutura geral do pipeline Subsistema de submissão Subsistema de mapeamento Subsistema de montagem Subsistema de anotação Detalhes técnicos A camada de persistência Armazenamento de informações Aplicação do pipeline com dados de Salmonella enterica Conclusões e Trabalhos Futuros 57 Referências 59 9\n10 Lista de Figuras 2.1 Estrutura geral dos aminoácidos Ligação peptídica entre dois aminoácidos Os diversos níveis estruturais de uma proteína, sendo mostradas em azul as seções correspondentes entre cada nível Estrutura dos 20 aminoácidos encontrados na natureza Representação esquemática da estrutura de um nucleotídeo, mostrando seus principais componentes: açúcar, fosfato e base Os açúcares encontrados nos ácidos nucléicos. São mostradas as numerações dos átomos de carbono e destacados os carbonos 3 e 5, através das quais uma orientação dos ácidos nucléicos pode ser obtida Estrutura espacial das moléculas de DNA e RNA, em conjunto com a estrutura química das bases nitrogenadas Associação entre trincas de bases (códons) e aminoácidos. Consulte a Figura 2.4 para a ligação entre o código de três letras e o nome e estrutura dos aminoácidos Processo de sequenciamento utilizado pelo sequenciador 454/Roche  Visão esquemática do processo de amplificação do DNA utilizado pelo sequenciador Illumina/Solexa  Processo de determinação de uma base do sequenciador Illumina/Solexa  Exemplo de grafos de de Bruijn e o relacionamento entre eles Pipeline de software para novos sequenciadores com a fase de mapeamento Pipeline de software para novos sequenciadores sem a fase de mapeamento Pipeline de software para novos sequenciadores com as fases de submissão, mapeamento e anotação Diagrama esquemático mostrando o fluxo das informações pelo pipeline e os programas utilizados em cada fase Hierarquia das classes básicas de comando utilizadas na camada de persistência Tabelas utilizadas no protótipo de pipeline desenvolvido\n11 Lista de Tabelas 4.1 Lista de programas de mapeamento e respectivos endereços web onde mais informações podem ser obtidas (Adaptado de ) Tabela com dados de montadores para sequenciadores massivamente paralelos Número de sequências tratadas em cada etapa do pipeline e tempo necessário para execução de cada etapa\n12 Capítulo 1 Introdução A descoberta da estrutura espacial da molécula de DNA por Watson e Crick  abriu novos horizontes para as ciências da vida, em especial no que tange ao entendimento das diversas características em nível molecular dos seres vivos no mundo. Como um repositório das informações necessárias à construção de proteínas de um dado organismo, o DNA assumiu um papel central em pesquisas biológicas, e propiciou o surgimento de diversas novas disciplinas, entre elas a Biologia Molecular. A Biologia Molecular busca explicar os fenômenos genéticos em termos das leis químicas e físicas conhecidas . 1.1 Contextualização A partir dos estudos feitos em Biologia Molecular, verificou-se que as informações necessárias à síntese de proteínas em um dado organismo estão armazenadas no seu DNA, e a passagem do DNA de geração a geração permite que as espécies se mantenham essencialmente inalteradas com o passar do tempo. Dessa forma, a determinação da informação contida no DNA tornou-se um importante meio no estudo das características dos seres vivos. Para descobrir a informação armazenada no DNA deve-se identificar a sua sequência de bases, o que é feito por meio de técnicas de sequenciamento. No entanto, o trabalho envolvido na determinação de tais bases é, em geral, muito grande. Assim, para a determinação das bases do DNA de um organismo são constituídos os projetos genoma, formados por equipes de diversas áreas com o objetivo comum de decodificar e analisar a informação presente no DNA. Atualmente, mais de 1000 projetos genoma foram concluídos e aproximadamente 6000 estão em andamento, o que mostra a grande importância do estudo das informações contidas no DNA . Entre os diversos projetos genoma já concluídos, podemos destacar o Projeto Genoma Humano (PGH), uma iniciativa no sentido de determinar todos os pares de bases do DNA humano. Após nove anos de trabalho envolvendo diversas organizações e países, em 2001 foi publicado um rascunho do genoma humano pelo Consórcio Genoma Humano  . Além de ter estimulado um grande desenvolvimento das técnicas de sequenciamento de DNA, o PGH impulsionou uma série de outros projetos genoma, com o objetivo de estudar organismos similares ao humano 12\n13 e/ou com características significativas dentro de uma determinada classificação taxonômica. No Brasil, o primeiro projeto genoma concluído com sucesso foi o sequenciamento do genoma completo da bactéria Xylella fastidiosa , causadora de uma doença em plantas conhecida como amarelinho com enormes prejuízos na cultura de laranja, cerca de 30% dos laranjais paulistas são afetados por essa doença. No caso específico da Região Centro-Oeste, um grande impulso foi dado com a implantação do projeto Rede Genoma Centro-Oeste. Este projeto foi submetido ao MCT/CNPq, tendo sido aprovado como uma das oito unidades regionais brasileiras para o sequenciamento de genomas. Foi iniciado em 2001 e concluído em 2004, tanto em relação aos experimentos realizados nos laboratórios de biologia molecular quanto no tocante ao desenvolvimento de um sistema computacional para armazenamento e tratamento das informações biológicas. Até recentemente, os projetos genoma utilizavam principalmente a técnica de sequenciamento Sanger, assim nomeada em homenagem a Frederick Sanger, criador da técnica . Nesta técnica, a molécula de DNA é primeiramente fragmentada em diversos pedaços. Após isso, são feitas diversas cópias dos fragmentos de DNA, seja por meio de reações químicas envolvendo diversas enzimas ou inserindo o fragmento desejado de DNA em vírus ou bactérias e utilizando a capacidade reprodutiva dos mesmos para a realização das diversas cópias necessárias . Após isso, uma técnica conhecida como gel eletroforese é utilizada para a determinação das bases de DNA. Esta última técnica é automatizada, permitindo a determinação das bases de maneira rápida e menos sujeita a erros. Uma vantagem do sequenciamento Sanger é o tamanho dos fragmentos que podem ser sequenciados de cada vez, que pode chegar a até 1000 bases. Durante décadas, esta foi praticamente a única técnica utilizada nestes projetos. Apesar de ser uma técnica relativamente barata, custando apenas US$ 0,001 para cada base sequenciada , este custo se torna proibitivo quando se tenta sequenciar genomas muito grandes, da ordem de bilhões de bases de DNA. Como em geral o sequenciamento de DNA é feito mais de uma vez, o custo desses projetos se torna muito alto para ser viável com sequenciamento Sanger. Assim, a comunidade científica percebeu a necessidade de um novo método mais barato de sequenciamento. Recentemente, novos sequenciadores de alto desempenho surgiram para atender a esta necessidade. Estes sequenciadores produzem uma quantidade imensa de dados, a uma fração do custo dos sequenciadores Sanger, por exemplo, laboratórios cobram US$ 0,0002 para cada base obtida com o sequenciador 454. Elas obtém tal desempenho ao realizar o sequenciamento de milhões de sequências de DNA em paralelo, utilizando uma série diversas de técnicas, tais como pirosequenciamento e sequenciamento por síntese. Como exemplos desses sequenciadores de alto desempenho podemos citar o 454-FLX da Roche, o Illumina da Solexa, e o Solid. Atualmente, o Brasil dispõe de quatro sequenciadores de alto desempenho, sendo um 454 em São Paulo, outro em Brasília e um último no LNCC(RJ), e um Illumina localizado em Brasília. Diversos projetos científicos estão sendo montados para fazer uso desta nova tecnologia e assim permitir o desenvolvimento de vacinas e remédios, aumento 13\n14 da produtividade na agricultura e pecuária e uma melhor compreensão sobre as características biológicas de diversos seres vivos de interesse. Nesse contexto, a criação de um pipeline para realizar o processamento de dados dos novos sequenciadores ajudaria tais projetos a obter resultados mais confiáveis em um espaço de tempo menor, melhorando assim o uso dos recursos. 1.2 Problema O uso dos novos sequenciadores abre diversas fronteiras para a pesquisa biológica derivada do sequenciamento de DNA. No entanto, os dados produzidos por tais sequenciadores possuem características muito diversas dos dados oriundos dos sequenciadores Sanger, tornando muito difícil a adaptação dos programas utilizados em análise computacional de dados de sequenciadores Sanger. Mesmo assim, o baixo custo e a grande quantidades de dados são motivos suficientemente fortes para o desenvolvimento de novos métodos para processamento desses dados, e de fato, diversos programas para tratamento de sequências dos novos sequenciadores já foram desenvolvidos. 1.3 Hipóteses Como os novos sequenciadores permitem um custo mais baixo de sequenciamento, espera-se um grande aumento na quantidade de dados a serem processados por sistemas de bioinformática. Com o sequenciamento paralelo, a quantidade de dados de sequenciamento produzida por unidade de tempo também tende a aumentar. Dadas essas considerações, é improvável um processamento eficaz deste enorme volume de dados gerados em um tempo menor, por meio de programas seriais ou sistemas baseados em processamento serial. De fato, assumimos como hipótese que nas diferentes fases de processamento das sequências biológicas produzidas deverão ser adotadas técnicas de processamento paralelo e/ou distribuído para a análise dos dados em tempo hábil. Além disso, o armazenamento e recuperação de dados nesse novo contexto deve ser repensado. 1.4 Objetivos Nesse contexto, nosso objetivo é a criação de um protótipo de pipeline de software para análise de transcritomas produzidos por sequenciadores de alto desempenho. Tal pipeline será aplicado nos dados produzidos pelos sequenciadores 454 e Illumina, recentemente adquiridos pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF). Após a conclusão de tal trabalho, objetivamos a escrita de um artigo cientifíco junto aos biológos da Universidade de Brasília (UnB) para estender o conhecimento científico neste novo ramo de pesquisas. 14\n15 1.5 Descrições dos Capítulos No Capítulo 2 apresentamos os diversos conceitos de Biologia Molecular necessários ao desenvolvimento do presente trabalho e expomos os principais aspectos da bioinformática, a disciplina específica onde este trabalho se encontra. Além disso detalhamos alguns tipos de projetos de sequenciamento onde este trabalho será aplicado. A seguir o Capítulo 3 mostra de forma resumida o funcionamento de alguns dos novos sequenciadores, apontando características específicas advindas do método utilizado por cada um. Para realizar a montagem do pipeline, é necessário utilizar ou adaptar softwares para realizar o processamento dos dados dos sequenciadores de alto desempenho. No Capítulo 4 analisamos os diversos softwares disponíveis na literatura. Além disso, apresentamos o método de pipeline a ser adotado no projeto de genomas baseado em sequenciadores de alto desempenho. O Capítulo 5 apresenta a estrutura do pipeline e sua aplicação em um estudo de caso feito a partir de sequências de Salmonella obtidas com o sequenciador 454. Por fim no Capítulo 6 apresentamos as conclusões e trabalhos futuros. 15\n16 Capítulo 2 Conceitos Básicos em Biologia Molecular Neste capítulo serão definidos os conceitos básicos de biologia molecular necessários ao entendimento deste trabalho. A Seção 2.1 discute de forma breve o conceito de vida e apresenta as motivações para o estudo dos conceitos expostos nas próximas seções. A Seção 2.2 apresenta os principais conceitos referentes às proteínas em um ser vivo, enfatizando o importante papel exercido pelas mesmas. Na Seção 2.3, são apresentados os conceitos importantes relativos a ácidos nucléicos e detalhados os dois principais ácidos encontrados nos seres vivos, o DNA e o RNA. A Seção 2.4, define genes e apresenta o código genético utilizado na tradução das bases do DNA em proteínas. Na Seção 2.5 é exposto o dogma central da biologia molecular, ou o processo através do qual as informações contidas no DNA são utilizadas para a síntese de proteínas. Finalmente, a Seção 2.6 detalha os conceitos relativos à Bioinformática, área onde este trabalho se insere. 2.1 Vida De acordo com pesquisas, a vida na Terra começou a cerca de 3,5 bilhões de anos. Desde então, os seres vivos vêm sofrendo constantes mutações devido a um processo chamado evolução, onde os mesmos tentam se adaptar às condições do ambiente . Mas o que é a vida, como podemos definí-la? De maneira muito simplista, neste trabalho diremos que todo ser que troca constantemente matéria e energia com o ambiente está vivo. Embora imperfeita, tal definição servirá a todos os nossos propósitos. Apesar das formas de vida variarem muito em tamanho e complexidade, todas possuem uma química molecular básica, ou bioquímica. Os principais componentes desta química são as proteínas e os ácidos nucléicos. As proteínas realizam diversas funções necessárias à manutenção da vida, como catalisação de reações e transporte de nutrientes, entre muitas outras. Já os ácidos nucléicos contém a informação necessária para a síntese de proteínas e a passagem dessa informação de geração para geração permite que as espécies permaneçam essencialmente inalteradas por longos períodos de tempo. A seguir discutiremos em mais detalhes esses componentes essenciais à vida. 16\n17 2.2 Proteínas As proteínas são polímeros (moléculas grandes formadas pelo encadeamento de moléculas mais simples) com uma gama muito vasta de funções nos seres vivos, variando desde o transporte de nutrientes e eliminação de resíduos tóxicos, até a construção de estruturas complexas. Além disso, proteínas chamadas enzimas são responsáveis por catalisar, ou acelerar, a ocorrência de reações químicas necessárias à vida. Sem essas enzimas, diversas reações importantes a manutenção da vida ocorreriam muito lentamente, encerrando-a completamente. Como se vê, as funções das proteínas são essenciais a manutenção de um ser vivo, compreendêlas significa também compreender o funcionamento de um dado organismo que sintetiza essas proteínas. Para melhor entendê-las é necessário, no entanto, um conhecimento básico sobre a estrutura das mesmas. As proteínas são formadas a partir do encadeamento de moléculas mais simples chamadas aminoácidos. A estrutura geral de um aminoácido é mostrada na Figura 2.1. Nessa figura são mostrados os principais elementos de um aminoácido, a saber: um carbono central, ou carbono alfa(c α ) onde se ligam um grupo amina, um grupo carboxila e uma cadeia lateral (denotada na figura como R). Figura 2.1: Estrutura geral dos aminoácidos Os aminoácidos diferem entre si pela estrutura da cadeia lateral, que varia desde um único átomo de hidrogênio até anéis carbônicos. Existem 20 aminoácidos diferentes na natureza e toda proteína, não importa sua complexidade, é formada a partir destes 20 aminoácidos básicos. A Figura 2.4 mostra a estrutura dos vinte aminoácidos, junto com os códigos de uma e três letras utilizados para designar os mesmos. 17\n18 Para formar uma proteína, os aminoácidos encadeiam-se através de ligações químicas chamadas ligações peptídicas. Nessa ligação, o carbono do grupo carboxila de um aminoácido liga-se ao átomo de nitrogênio do grupo amina de um outro aminoácido, liberando uma molécula de água no processo. Após essa ligação, o que resta é um resíduo dos aminoácidos originais, por causa disso falamos em uma proteína com 200 resíduos, e não 200 aminoácidos. A Figura 2.2 mostra esquematicamente a ligação peptídica entre dois aminoácidos quaisquer, os átomos em vermelho são os átomos perdidos pelas moléculas após a ligação, e em verde é mostrado o ponto onde a ligação molecular entre os aminoácidos é estabelecida. Assim, uma dada proteína é formada pela ligação peptídica entre seus diversos aminoácidos, podendo ser composta por um número muito grande desses. Dado que uma proteína é, sob certo ponto de vista, uma sequência de aminoácidos, toda proteína pode ser descrita e identificada de forma única pela sequência de aminoácidos que a compõem. Figura 2.2: Ligação peptídica entre dois aminoácidos. Embora uma proteína possa ser identificada univocamente pela sequência de aminoácidos que a forma, as proteínas não são cadeias lineares de aminoácidos. Forças moleculares atuando entre aminoácidos próximos e grupos de aminoácidos dão à uma proteína uma forma espacial bem definida. Essa forma espacial pode ser visualizada em diferentes níveis, assim falamos nos níveis estruturais de uma dada proteína, a saber: 1. O nível primário, formado apenas pela sequência linear de aminoácidos. 2. O nível secundário, onde existem arranjos espaciais de aminoácidos próximos na cadeia. 18\n19 3. O nível terciário, onde existem arranjos espaciais dos aminoácidos fisicamente distantes na cadeia (estrutura tri-dimensional). 4. O nível quartenário, a estrutura espacial formada pela união e interação entre diversas proteínas. A Figura 2.3 dá um exemplo de cada um desses níveis e mostra a relação entre os mesmos em uma proteína hipotética. Figura 2.3: Os diversos níveis estruturais de uma proteína, sendo mostradas em azul as seções correspondentes entre cada nível. A importância do estudo do formato tridimensional das proteínas reside na observação de uma íntima conexão entre o formato de uma proteína e a função exercida pela mesma. De fato, as diversas hélices e dobras formam uma estrutura única capaz de se ligar a um grupo de moléculas, podendo essas serem componentes de uma reação química ou ainda outras proteínas que formam estruturas mais complexas . Algumas ligações são tão específicas que é utilizado o termo ligação chave-fechadura para as mesmas. Dada a sua imensa importância, as proteínas são constantemente fabricadas pelos seres vivos, desde os procariotos mais simples até os eucariotos mais complexos. Entender o processo de síntese das mesmas é, portanto, essencial no sentido de auxiliar na identificação e descoberta das mesmas. Tal processo está intimamente ligado a moléculas conhecidas como ácidos nucléicos, explicados a seguir. 19\n20 Figura 2.4: Estrutura dos 20 aminoácidos encontrados na natureza. 20\n21 2.3 Ácidos nucléicos Assim como as proteínas, os ácidos nucléicos também são polímeros formados a partir de moléculas mais simples, os nucleotídeos. Um nucleotídeo é formado por um açúcar composto por cinco átomos de carbono (pentose), ligado a um grupo fosfato e uma base nitrogenada. ( Figura 2.5). Figura 2.5: Representação esquemática da estrutura de um nucleotídeo, mostrando seus principais componentes: açúcar, fosfato e base. As ligações entre diferentes nucleotídeos para a formação de ácidos nucléicos se dá através dos grupos fosfatos, por meio de uma ligação chamada ligação fosfodiéster. Nesse tipo de ligação o átomo de fósforo do grupo fosfato estabelece fortes ligações covalentes com os átomos de carbono da pentose dos nucleotídeos. Essa pentose tem os átomos numerados de 1 até 5, assim é possível identificar os átomos de carbono participantes nas ligações fosfodiéster. A Figura 2.6 mostra as duas principais pentoses encontradas nos seres vivos DNA O DNA é um ácido nucléico cuja principal função biológica é o armazenamento das informações necessárias a síntese das proteínas de um organismo. Esse ácido é formado por nucleotídeos com a pentose 2-desoxirribose (Figura 2.6 (a)) e as bases são quatro, a saber: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G). A molécula de DNA tem o formato espacial de duas fitas (ou cadeias) de ácidos nucléicos unidos pelas bases nitrogenadas formando uma espiral que gira no sentido da mão direita . A Figura 2.7 apresenta uma visão desse formato espacial, em conjunto com a estrutura das bases nitrogenadas do DNA. As fitas do DNA são ditas complementares, pois a cada base presente em uma fita corresponde uma base complementar na fita oposta. As bases adenina e timina são complementares entre si, o mesmo valendo para a citosina e a guanina. 21\n22 Figura 2.6: Os açúcares encontrados nos ácidos nucléicos. São mostradas as numerações dos átomos de carbono e destacados os carbonos 3 e 5, através das quais uma orientação dos ácidos nucléicos pode ser obtida. 22\n23 Figura 2.7: Estrutura espacial das moléculas de DNA e RNA, em conjunto com a estrutura química das bases nitrogenadas 23\n24 2.3.2 RNA O RNA é o outro ácido nucléico encontrado nos seres vivos. Em contraste com o DNA, a pentose presente em seus nucleotídeos é a ribose (Figura 2.6 (b)), outra diferença significativa é a presença da base nitrogenada uracila (U) em substituição à timina. A molécula de RNA tem uma única cadeia (fita) de nucleotídeos e não assume uma forma espacial bem definida, tendo diversos formatos de acordo com a função exercida por ela. Dessa forma, diversas classes de RNA são encontradas nas células dos seres vivos. A Figura 2.7 mostra uma possível disposição espacial de uma molécula de RNA. O RNA ribossômico (rrna) é responsável pela constituição de ribossomos, organelas celulares cujo propósito é a construção de proteínas. O RNA mensageiro (mrna) carrega as informações para a síntese de proteínas do DNA para os ribossomos. Finalmente, o RNA transportador (trna) é responsável por trazer ao ribossomo os aminoácidos necessários para formar uma proteína. 2.4 Genes e cromossomos Como visto, toda a informação necessária a produção das proteínas de um dado ser vivo está presente em seu DNA. Mais especificamente, essa informação está dispersa pela sequência de bases presentes nas fitas do DNA. Embora o DNA armazene as informações necessárias à produção de proteínas, nem todas as sequências de nucleotídeos do DNA codificam essa informação. Para cada proteína sintetizada por um organismo, existe uma porção de DNA correspondente onde estão presentes os dados para sua fabricação. A esta porção de DNA contendo a informação de uma proteína damos o nome de gene. Os genes são distribuídos através das grandes moléculas de DNA, chamadas de cromossomos. O número e o tamanho dos cromossomos varia de espécie para espécie, e não está diretamente ligado a complexidade da mesma. Então, os genes armazenam a informação necessária para síntese de uma proteína. Conforme visto na Seção 2.2, uma dada sequência de aminoácidos permite a identificação precisa de uma proteína. No caso dos genes, os aminoácidos são codificados por meio de trincas de nucleotídeos, conhecidas como códons. Cada trinca corresponde a um aminoácido. Como existem 4 bases nitrogenadas no DNA, é possível formar 64 trincas diferentes, no entanto existem apenas 20 aminoácidos na natureza. A consequência disso é que diversos aminoácidos são codificados por mais de um códon. Essa redundância permite diminuir o impacto das mutações, que são alterações na sequência de nucleotídeos do DNA. Assim a informação presente no DNA é conservada por um período maior de tempo. A Figura 2.8 mostra a associação entre códons e aminoácidos, na tabela do Código Genético. O STOP é um sinal especial utilizado para indicar o final do processo de síntese de uma proteína. Nessa figura, as bases mostradas não são bases do DNA, mas sim as bases do RNA. Isso ocorre pois o RNA transporta a informação contida num gene para o local onde as proteínas serão sintetizadas, processo que será detalhado a seguir. 24\n25 Figura 2.8: Associação entre trincas de bases (códons) e aminoácidos. Consulte a Figura 2.4 para a ligação entre o código de três letras e o nome e estrutura dos aminoácidos. 2.5 Dogma central da Biologia Molecular Nesta seção explicaremos como as informações presentes em uma dada molécula de DNA são utilizadas na célula para a síntese de uma proteína. O processo de síntese de uma proteína começa através do reconhecimento do início de um gene graças a uma pequena região do DNA sinalizando o início de um gene, chamada promotor. Tendo localizado o gene, a célula copia a informação do gene criando uma molécula de RNA complementar a uma das fitas de DNA. Esta molécula de RNA é chamada de RNA mensageiro ou mrna. Assim o mrna possui a mesma sequência de uma das fitas de DNA, mas tendo a base U no lugar da T. Este processo é chamado de transcrição. O processo de transcrição descrito acima é válido para seres chamados de procariotos, organismos sem núcleo celular e com o DNA flutuando livremente na célula. Já em organismos chamados eucariotos, seres onde o DNA está armazenado em um núcleo celular, o processo de transcrição é um pouco mais complexo. Os genes dos seres eucariotos são compostos de duas partes, os íntros e os éxons. Após a transcrição, os íntrons são removidos do mrna. Sendo assim, em um organismo eucarioto, nem todas as bases de um gene são utilizadas na transcrição. Ao DNA contendo todas as bases do gene denominamos DNA genômico, e às bases do DNA presentes no mrna após a remoção dos íntrons chamamos DNA codificador (cdna). Feita a transcrição, a proteína será sintetizada em estruturas celulares chamadas de ribossomos. Os ribossomos são estruturas compostas de proteínas e um tipo especial de RNA, chamado de RNA ribossômico e abreviado como rrna. Os ribos- 25\n26 somos funcionam como linhas de montagem de proteínas, lendo a informação para síntese do mrna e utilizando moléculas conhecidas como RNA transportadores (trna) para realizar a tradução dos códons para os aminoácidos correspondentes. Mecanismos celulares realizam a junção dos diversos aminoácidos. Mais detalhadamente, os RNAs são as moléculas responsáveis por efetuar a conexão entre os códons e os aminoácidos correspondentes, em um processo chamado tradução. Cada trna é composto de duas partes, uma delas possui afinidade química à um dado códon, enquanto a outra liga-se com facilidade ao aminoácido correspondente ao códon. Conforme a fita de mrna passa pelo ribossomo, um trna correspondente ao códon sendo lido pelo ribossomo liga-se ao códon em questão, trazendo consigo o aminoácido correspondente. Uma enzima então catalisa a ligação peptídica para adicionar o aminoácido em questão à proteína. A síntese prossegue assim, um aminoácido de cada vez, parando apenas quando um códon do tipo STOP é encontrado. Quando isso ocorre, a proteína desliga-se do ribossomo e é liberada na célula. O mrna é degradado para posterior reaproveitamento dos seus componentes. 2.6 Bioinformática A Bioinformática é um campo interdisciplinar envolvendo as áreas de Biologia Molecular, Estatística, Matemática e Ciência da Computação com o objetivo de realizar a análise de dados biológicos, entre eles sequências de bases de DNA e genes, e predizer a estrutura e função de diversas macromoléculas . Apesar de ampla, esta definição não deve ser confundida com Biologia Computacional. A Biologia Computacional preocupa-se com o desenvolvimento de algoritmos rápidos e eficientes para a resolução de diversos problemas biológicos possíveis de serem tratados por meio de técnicas computacionais. Um exemplo é problema do alinhamento de sequências de DNA, que tem entre suas diversas soluções o conhecido algoritmo de Smith-Waterman , em homenagem aos criadores do mesmo. Já a Bioinformática tem como foco principal o desenvolvimento de ferramentas para realizar o armazenamento e manipulação dos dados biológicos gerados durante um projeto de sequenciamento. Com o atual volume de dados produzidos pelos projetos de sequenciamento, a utilização de ferramentas computacionais traz grandes auxílios aos biólogos, ao permitir a recuperação rápida dos dados armazenados de um projeto genoma e apresentar os resultados de maneira a facilitar a análise dos mesmos e assim auxiliar na descoberta de funções para as sequências obtidas. Cabe notar que, apesar de serem disciplinas com objetivos distintos, ambas se complementam. Os algoritmos desenvolvidos pela Biologia Computacional são posteriormente incorporados pelas ferramentas de Bioinformática, sendo utilizados pelas últimas para realizar a análise dos dados de um projeto. Assim, Biologia Computacional e Bioinformática estão intimamente relacionadas, sendo difícil, as vezes, distinguí-las. Como vimos, até recentemente os principais projetos genomas utilizam quase exclusivamente a técnica de sequenciamento Sanger. Desta forma, muitas ferra- 26\n27 mentas de bioinformática disponíveis eram otimizadas para o trabalho com estes dados. Embora os dados produzidos pelos novos sequenciadores de alto desempenho tenham características diferentes dos dados obtidos com sequenciadores Sanger, o pipeline utilizado para processamento dos mesmos é conceitualmente muito parecido com o pipeline de projetos com sequenciamento Sanger. Dessa forma, o estudo de um pipeline conceitual é importante no sentido de fornecer uma base teórica em relação ao trabalho realizado Pipeline de um projeto de sequenciamento Em um projeto de sequenciament, temos em geral três fases importantes: submissão, montagem e anotação. A submissão consiste no recebimento dos dados resultantes do processo de sequenciamento e no armazenamento de tais dados em um formato adequado para posterior processamento computacional. Entre os vários dados obtidos nesta fase, destacam-se a sequência de bases obtidas, em geral armazenada como um arquivo texto contendo uma sequência de letras, e os valores de qualidade para cada base das sequências, utilizados em posteriores análises para discriminar o quão provável é o fato de a base obtida ser a verdadeira base do DNA do organismo. Após o recebimento de todas as sequências na fase de submissão, segue-se para a etapa de montagem. A montagem consiste no uso de um ou mais programas para tentar unir os diversos fragmentos de DNA obtidos durante o sequenciamento e assim tentar recriar as sequências de DNA originais. Em geral, tal processo não consegue remontar perfeitamente o DNA fragmentado. Sequências de DNA (consenso) obtidas pela união de dois ou mais fragmentos (chamadas contigs), e sequências não agrupadas com outras (chamadas singlets). Feita a montagem do DNA sequenciado, segue-se para a etapa de anotação. A fase de anotação constitui a última fase de um pipeline de sequenciamento. Nesta fase, o objetivo é descobrir as diversas funções biológicas do DNA sequenciado, bem como identificar genes ainda não descobertos, entre outras importantes funções. Para realizar essas tarefas, em geral dividimos a anotação em duas etapas distintas. A anotação automática é executada primeiro e consiste em tentar inferir as funções biológicas das sequências de DNA através de métodos computacionais. Não obstante, a técnica mais comumente empregada neste passo consiste no uso de programas para comparação das sequências obtidas com bancos de dados contendo sequências cujas funções já são conhecidas, tais como o BLAST . Apesar do primeiro genoma completo só ter sido completado em 1976 , atualmente esses bancos de dados contém um número imenso de sequências, e crescem diariamente. Feita a anotação automática, procede-se à anotação manual. Nesta etapa, os biológos verificam as inferências feitas durante a anotação automática e as utilizam como um guia para a análise das sequências. Os biológos podem confirmar, mudar ou recusar as sugestões das anotações automáticas. As sugestões também podem ser utilizadas para a realização de experimentos significativos ao trabalho de pesquisa do organismo. Embora o pipeline descrito aqui seja genérico e adaptável a uma série de projetos com diferentes objetivos e técnicas, cabe notar que em geral, o processamento 27\n28 realizado em cada etapa é dividido em uma série de programas de Biologia Computacional. A correta integração desses programas no pipeline e a exposição dos resultados significativos são uma preocupação da Bioinformática. A seguir, apresentamos um exemplo de pipeline aplicável em um projeto de sequenciamento baseado na técnica Sanger, apresentando exemplos de programas a serem utilizados em cada uma das fases do pipeline Pipeline para um projeto de sequenciamento Sanger Na fase de submissão de um projeto genoma utilizando sequenciadores Sanger, após a recepção dos arquivos contendo o resultado do sequenciamento, os mesmos são processados pelo programa Phred . Este programa traduz os dados presentes no arquivo em uma sequência de letras contendo as bases identificadas e a probalidade de erro associada a determinação de cada fase. Após isso, o programa Phd2Fasta cria para cada arquivo processado pelo Phred dois arquivos texto no formato FASTA, um contendo a sequência de bases nitrogenadas e outro contendo os valores das probabilidades de erro. As probabilidades de erro constituem valiosa informação pois permitem a remoção de sequências cujas bases contêm uma alta probabilidade de erro, podendo gerar resultados incorretos durante as próximas fases. Assim, embora várias sequências sejam recebidas durante a fase de submissão, nem todas são utilizadas nos próximos passos. Para tanto, a sequência deve possuir uma probabilidade de erro suficientemente baixa, determinada de acordo com cada projeto. Quanto menor essa probabilidade de erro, em geral menos sequências serão aceitas e maior o custo e confiabilidade dos dados do projeto. Como o sequenciamento Sanger envolve a cópia do DNA a ser sequenciado, muitas vezes, antes do sequenciamento propriamente dito, o DNA sequenciado pode conter sequências não pertencentes ao organismo sendo estudado. O programa Cross match identifica e retira vetores e contaminantes das sequências. Por fim, uma análise de redundância das sequências submetidas pode ser feita através do programa CAP3 , e os agrupamentos identificados por esse programa consistem em geral sequências redundantes. A montagem das sequências pode ser feita através de programas como o CAP3 ou o Phrap. Estes programas geram arquivos FASTA contendo as sequências de todos os singlets identificados, arquivos com dados sobre a composição e sequências dos contigs, e informações gerais sobre a montagem dos fragmentos de DNA. Por fim, o programa Glimmer  pode ser utilizado com o objetivo de identificar os possíveis genes presentes nos contigs e singlets obtidos durante a montagem. Este último passo nem sempre é feito, pois alguns projetos trabalham com cdnas de um dado organismo. Nesse caso, como as sequências de DNA já se constituem em genes, não há a necessidade de se utilizar o Glimmer para identificá-los. Por último, utiliza-se o programa BLAST para comparar as sequências identificadas com bancos de dados de sequências cujas funções já são conhecidas na fase de anotação automática. Os bancos utilizados variam de acordo com o projeto e o organismo sendo estudado. Feito isso, os biológos podem proceder a anotação manual das sequências de acordo com seus conhecimentos. 28\n29 Durante todas as etapas anteriormente descritas, são armazenadas estatísticas sobre o projeto em questão, tais como número de sequências aceitas e rejeitadas, número de contigs e singlets encontrados, entre muitos outras. Também são armazenadas as anotações manuais e automáticas feitas durante o processo, e em alguns projetos, as mesmas são armazenadas com o objetivo de verificar possíveis erros cometidos durante o processamento do pipeline Projetos transcritoma Como visto na Seção 2.5, a síntese de uma proteína ocorre através da transcrição das informações contidas no DNA em um RNA mensageiro e posterior tradução desta informação em aminoácidos. Dizemos então que o gene codificando a proteína em questão é expresso. O conjunto dos RNAs mensageiros de uma célula é chamado de transcritoma, e projetos de sequenciamento visando a obtenção desses RNAs mensageiros são conhecidos como projetos transcritoma. A obtenção de todos os transcritomas de todas as células de um dado organismo é uma tarefa complexa, pois nem todos os genes são expressos a todo momento. De fato, durante diferentes fases da vida de um organismo, diferentes genes são expressos em diferentes intensidades. Dessa forma, grande parte dos projetos transcritoma envolvem o sequenciamento dos RNAs mensageiros em um dado estado da vida do organismo de interesse, podendo este ser durante o desenvolvimento de uma planta, a metamorfose de um inseto ou mesmo a ocorrência de um câncer. Para a obtenção dos transcritomas, uma técnica muito utilizada consiste em capturar os RNAs mensageiros de uma célula exposta à dadas condições, e a partir da mesma gerar a sequência de DNA cuja transcrição originou o mrna. Conforme exposto na Seção 2.5, essa fita de mrna é complementar à sequência de DNA que a originou. Portanto, para obter a sequência de nucleotídeos efetivamente expressos durante a produção da proteína em questão, basta obter o complemento desta fita de RNA. A sequência de DNA obtida desta maneira, é conhecida como DNA codificador ou cdna. Para determinar os transcritomas, procede-se ao sequenciamento dos cdnas, seja através do método Sanger, ou por meio dos novos sequenciadores de alto desempenho. Uma das principais informações obtidas através dos transcritomas é o conjunto de proteínas expressas durante uma dada condição de um organismo, por exemplo, durante uma infecção. Estas sequências são chamadas de Expressed Sequence Tags(ESTs). Os ESTs tem um importante papel na anotação de genomas, pois expõem dados sobre as regiões codificadoras de um genoma e provêm uma primeira evidência experimental da existência de um gene predito por alguma ferramenta computacional. No entanto, como os ESTs contém as sequências de DNA efetivamente expressas em um dado momento, uma informação de interesse é a posição na molécula de DNA de onde os ESTs provêm. Em outras palavras, é interessante identificar a região do DNA cuja transcrição dá origem a um dado EST. Isso é feito por meio de uma fase chamada de mapeamento, na qual se busca alinhar os ESTs obtidos durante um projeto transcritoma a um genoma de referência, às vezes, o genoma do próprio organismo de onde os ESTs derivaram. No entanto, outros organismos 29\n30 podem ser utilizados. Um exemplo seria o mapeamento utilizando uma espécie próxima do organismo de interesse, com o objetivo de detectar quais proteínas são expressas por ambos os seres vivos, e quais proteínas são potencialmente exclusivas à somente um deles. Em um projeto transcritoma, a anotação apresenta certas diferenças em relação a projetos de sequenciamento de DNA. Um dos principais objetivos da fase de anotação de um projeto transcritoma é a identificação de RNAs não codificadores (ncrnas). Embora toda proteína seja obtida por meio da tradução de um RNA mensageiro, e em última instância por um RNA, nem todo RNA está diretamente ligado à produção de uma proteína. RNAs não diretamente ligados a síntese de proteínas são os ncrnas, e estão ligados à uma série de processos celulares importantes, como a degradação do mrna, replicação do DNA e inibição do processo de tradução entre outros. Para a identificação de ncrnas podem ser utilizadas, além da comparação de sequências, técnicas de Inteligência Artificial, em especial o aprendizado por máquina. Tal técnica consiste no processamento de uma massa de dados específica por um programa de computador, com o objetivo de fornecer parâmetros pelos quais o programa poderá buscar informações de interesse nos dados a serem analisados. Por exemplo, a busca de ncrnas em projetos transcritoma. Dois exemplos de técnicas utilizadas com esse propósito são o naive Bayes e o Support Vector Machines. Tais abordagens são utilizadas pois não só permitem uma nova perspectiva de análise, como também efetuam análises mais rápidas em comparação com ferramentas existentes, sem perda significativa de acurácia. A anotação de projetos transcritoma também usa métodos para comparação de sequências. Nesse caso, os bancos de dados de sequências são ESTs providas de outros projetos transcritoma depositadas em bancos de dados públicos. Alguns desses bancos podem ser obtidos gratuitamente através da internet, em geral através do uso do File Transfer Protocol (FTP). Além das diferentes bases de dados utilizadas na fase de anotação de projetos transcritoma, diferentes ferramentas são utilizadas para a comparação de sequências. Apesar de ferramentas como o BLAST em geral estarem presentes nestes projetos, ferramentas especializadas projetadas para a comparação de RNAs mensageiros e sequências genômicas também são muito utilizadas. Um exemplo deste último tipo é o comparador de sequências BLAT . 30\n31 Capítulo 3 Sequenciadores Massivamente Paralelos Embora o sequenciamento Sanger tenha sido a técnica de sequenciamento dominante durante os últimos anos, novas técnicas de sequenciamento massivamente paralelas atingiram o mercado e estão revolucionando a forma como se realiza o sequenciamento de DNA no mundo. Ao permitirem o sequenciamento de milhões de sequências a um custo muito baixo em comparação com o método Sanger, esses métodos tiveram um grande impacto nas áreas de pesquisa onde se realizam sequenciamentos de DNA, e abriram novas frentes de pesquisa, tais como o estudo de DNAs antigos, como mamutes, e a caracterização da diversidade ecológica por meio do sequenciamento de DNA de amostras ambientais . A fim de propor um pipeline para processamento das sequências geradas pelos sequenciadores massivos, devemos entender melhor o seu funcionamento, e quais os desafios enfrentados devido as técnicas de sequenciamento utilizadas por cada um. Na Seção 3.1 estudaremos o funcionamento do sequenciador 454-FLX da Roche. A Seção 3.2 expõe a técnica de sequenciamento utilizado pelo sequenciador Illumina da empresa Solexa FLX Roche Este sequenciador foi o primeiro a aparecer no mercado, em 2004, e utiliza uma técnica de sequenciamento conhecida como pirosequenciamento. No pirosequenciamento a incorporação de cada nucleotídeo a uma fita de DNA por meio da enzima DNA polimerase acarreta a liberação de pirofosfato. Esta molécula por sua vez, inicia uma série de reações químicas cujo produto final é a liberação de luz. A detecção da luz por um sensor permite a determinação das bases de uma sequência de DNA. Uma característica importante desta técnica é que, a cada vez que um mesmo nucleotídeo é incorporado a sequência, a intensidade da luz liberada aumenta. Se essa intensidade ultrapassar a capacidade do detector de luz, a leitura do número de bases iguais será incorreta. Este é o principal tipo de erro enfrentado por este tipo de sequenciador, a incorreta determinação do número de bases em um monômero (molécula formada pela repetição de uma mesma estrutura), tal como CCCCCCC. 31\n32 Agora descreveremos como o sequenciador 454/Roche efetua o sequenciamento. O primeiro passo no processo de sequenciamento consiste na amplificação do DNA a ser sequenciado. Isso é feito misturando-se os fragmentos de DNA com estruturas de agarose 1 contendo sequências de DNA complementares às sequências adaptadoras do 454 presentes nos fragmentos a serem sequenciados. Desta forma cada estrutura de agarose fica ligada a um único fragmento de DNA. A seguir, cada uma dessas estruturas contendo um fragmento de DNA é isolada em micélios óleo:água contendo reagentes para a enzima DNA polimerase. Através de um ciclo térmico, produzem-se um milhão de cópias do fragmento de DNA contidos na superfície da estrutura de agarose. Após a amplificação do DNA, realiza-se o sequenciamento propriamente dito. Cada estrutura de agarose é colocada em um recipiente de estrutura de silica capilar, contendo centenas de milhares de locais para inserção de uma estrutura de agarose. O objetivo destes recipientes é fornecer uma localização fixa para monitoramento das reações de sequenciamento. Em cada recipiente, enzimas que catalizam a reação de pirosequenciamento são adicionadas a cada recipiente e a mistura é centrifugada com o objetivo de cobrir as agaroses com as enzimas. A incorporação de cada nucleotídeo é feita em um passo de cada vez, e em cada passo um sensor CCD registra a luz emitida em cada recipiente, assim determinando a sequência de DNA, uma base por vez. No entanto, tal sensor não consegue interpretar corretamente a incorporação de um mesmo nucleotídeo várias vezes (mais de 6), o que significa que porções de DNA onde uma mesma base ocorre várias vezes podem acarretar erros. Caso o número de bases determinados pelo sequenciador, temos um erro de inserção, se for menor teremos um erro de remoção. O sequenciador 454 provê sequências de cerca de 250 bases de comprimento durante um processamento de 8 horas. Após um processamento para a remoção de sequências com baixa qualidade, obtemos cerca de 100 milhões de bases com boa qualidade em média. Apesar do tamanho das sequências obtidas com o sequenciador 454 ser muito menor em comparação com os sequenciadores Sanger, o mesmo foi utilizado com sucesso no sequenciamento de genomas virais e bacteriais com alta qualidade. A Figura 3.1 mostra esquematicamente o processo descrito nesta seção. 1 A agarose é um polímero composto de subunidades de galactose. Quando dissolvida em água quente e seguidamente arrefecida, a agarose toma uma consistência gelatinosa, este gel é muito utilizado em biologia molecular para atividades como sequenciamento. 32


como os animais evoluíram vivendo ao nosso lado - Quebra Cabeça Vegano\ncomo os animais evoluíram vivendo ao nosso lado\n25/06/2020 Marta Soares Dieta Vegana\nO neurobiólogo ensaísta Richard C. Francis, nos dá um livro verdadeiramente surpreendente que traça a história de domesticação de muitas espécies animais. De cachorro a gato, de camelo a cavalo, de renas a roedores, até macacos. Então, para concluir, surpreendentemente, até o próprio homem.\nPor outro lado, a domesticação de animais não é um tópico secundário, dada a importância que teve para o nosso destino. De fato, facilitou muito nossa existência e, é preciso dizer, inevitavelmente os condicionou.\n“Sem animais domésticos e plantas cultivadas, a civilização humana como a conhecemos não existiria. Ainda estaríamos vivendo em um nível de subsistência, praticando a caça e a coleta. ”\n2 A natureza não muda\nFoi exatamente o que a domesticação levou aos seres humanos que gerou a revolução neolítica o que levou às inovações que nos empurraram para o progresso relâmpago, elevando-nos de dez milhões para sete bilhões de indivíduos. Exagerado? Leia este livro e você mudará de idéia.\nDeve-se dizer, no entanto, que o esboço de como tudo isso aconteceu permanece incerto. Certamente havia docilidade natural de alguns animais no centro do fator seletivo. Uma docilidade que, com o tempo, resultou nos animais em questão numerosas alterações anatômicas e comportamental que muitas vezes se tornaram desvios reais da natureza. Francis, no entanto, traça a origem: “Os cientistas falam da síndrome da domesticação: uma espécie de” pacote com tudo incluído “a ser aceito em troca de uma refeição segura e um refúgio administrado por seres humanos”. Refeição e refúgio a um preço alto: o da submissão. “O homem substituiu a natureza ao assumir quase completamente o controle do destino evolutivo dessas espécies”.\nEntão aqui é onde os animais “domesticados” acabaram se tornando parte integrante da nossa sociedade, usado para alimentação, empregos e movimentos, empresa e até experimentação. Francisco, no entanto, não parece particularmente interessado em lado ético, prefere seguir o fio evolutivo para nos fazer entender como a seleção feita pelo homem estava totalizando. Especialmente no cachorro. “As mudanças evolutivas feitas pelos seres humanos se estendem a muitas características dos cães, a partir da cor dos cabelos e da estrutura do esqueleto. […] também afetou o comportamento significativamente. O aspecto mais curioso é que os cães domésticos desenvolveram a capacidade de ler as intenções humanas ”.\nLeia Também Vegetais assados no inverno com molho de 4 sabores\nNão há muitas mudanças, se você olhar para elas outros animais. “A influência do homem na evolução de outros animais domesticados é pouco menos impressionante. A plácida vaca friesiana, com seus úberes superdesenvolvidos, não se parece muito com os auroques imponentes, e a ovelha Merino tem muito pouco em comum com o muflão; contudo, em ambos os casos, a forma doméstica e a forma selvagem descendem de um ancestral comum apenas 10.000 anos atrás. É muita evolução em muito pouco tempo “.\nNo entanto, no final, a evolução tem um notável natureza conservadora. Por mais que o homem possa modificar os animais de acordo com seus interesses, ele não pode mudar o que a evolução estabeleceu anteriormente: “o pequinês é um lobo contundente, não um organismo projetado do zero a partir de seus ancestrais. “\ndomesticado é um livro importante que também analisa possíveis explicações para a ascensão dos humanos, deixou de ser um dos muitos elementos da fauna africana para os governantes do planeta com os efeitos que infelizmente todos conhecemos. No final, uma pergunta: paradoxalmente, aqui estamos autoaddomesitcati? É uma hipótese que está longe de ser clara.\nPrevious Post:um leitor tem dúvidas sobre o material\nNext Post:Sinais de desenvolvimento de diabetes adulto visto desde os 8 anos: Estudo


Clubes de Porto Alegre festejam o Carnaval com bailes tradicionais | hagah\nClubes de Porto Alegre festejam o Carnaval com bailes tradicionais\nPublicado por hagah em 06/02/2012\nVai ficar em Porto Alegre no Carnaval? Então, que tal cair na folia ou levar a criançada para festejar a data em um dos clubes da Capital? Confira alguns locais que abrem as portas para a festa mais brasileira do mundo!\nA tradicional Estação Folia, de parceria entre os clubes Caixeiros Viajantes, Farrapos e Lindóia Tênis Clube, já está com as datas de seus bailes definidas. No dia 17 de fevereiro, o Baile Dá Saudade, para a terceira idade, comça às 18h, no Clube Farrapos. Dia 18, o Lindóia T. C. abre as portas para a festa de Carnaval adulto, a partir das 23h. No dia 19, o Carnaval adulto acontece no Clube Farrapos, também às 23h. A comemoração do clube Caixeiros Viajantes acontece na segunda-feira, 20, no mesmo horário, com animação da Atração Banda Show. Sócios de qualquer um dos clubes com mensalidade em dia têm entrada franca em todos os bailes. Os não associados pagam R$ 25,00 por baile.\nOs bailes infantis acontecem no domingo, 19, a partir das 16h, nos três clubes. O Lindóia ainda festeja com as crianças dia 21, também às 16h. Crianças não-sócias pagam R$ 6,00 e seus acompanhantes R$ 12,00.\nNa terça-feira de Carnaval, 21 de fevereiro, acontece o tradicional baile infantil do clube Grêmio Náutico União. Diversas atrações animam os foliões mirins, com destaque para o concurso de fantasias. Podem participar crianças entre dois e 12 anos. As inscrições para o concurso serão feitas durante o evento, no Salão Nobre, das 16h30 às 17h30. Associados têm entrada gratuita. O baile acontece entre as 16h30 e as 20h30, no Salão de Festas, Salão Nobre, Auditório Azul e Espaço União Cooks da unidade Alto Teresópolis. A entrada é gratuita para associados e crianças de até 6 anos. Os não-sócios pagam R$ 35,00. Mais informações por telefone ou pelo e-mail fatima@gnu.com.br.\nEste ano, as riquezas do Brasil invadem o Salão Principal do Clube do Porfessor Gáucho. Os bailes acontecem nos dias 19 e 20 de fevereiro, sendo o infantil no dia 19, a partir das 15h, e o adulto no dia 20, às 23h. Associados têm entrada livre, mediante apresentação da carteirinha. Não-sócios pagam R$ 30,00 pelo baile adulto e R$ 15,00 para participar do baile infantil. Crianças com até 11 anos não pagam.\nA Sogipa promove um baile infantil de Carnaval na tarde de 18 de fevereiro, sábado, das 17h às 21h, no Salão de Festas do clube. A animação fica com a banda Tropical Latino. Outra atração é o concurso de fantasias, que apresenta as categorias luxo e originalidade. Associados não precisam comprar convite, basta apresentar, no dia, a carteira de sócio juntamente com um documento com foto. Para os não sócios, os convites estão à disposição na secretaria administrativa. Os valores são R$ 20,00 para crianças até 12 anos e R$ 30,00 para crianças acima de 13 anos. Acompanhantes das crianças não associadas ficam isentos do valor do convite. Lembrando que a idade máxima para ingressar no baile é de 15 anos. Neste ano, a Sogipa comercializa, ainda, um kit especial de carnaval para os foliões. Nele vai conter bola de sabão, confete, colar havaiano, máscara, óculos, pulseira de neon, serpentina e outros artigos de festa.\nNo Nonoai Tênis Clube, os adultos podem aquecer no pré-carnaval, que acontece dia 11, entre as 23h e 4h. Para os não sócios, o preço fica R$ 10,00 para as mulheres e R$ 15,00 para os homens. Quem já está na terceira idade cai na folia na sexta-feira de Carnaval, 18, das 16h às 22h. A entrada para não associados é R$ 8,00. O baile infantil acontece nos dias 19, 20 e 21, e o enterro dos ossos no dia 26. A festa ocorre entre as 16h e as 20h. Crianças com até dois anos não pagam, até 12 anos paga R$ 5,00, para aqueles acima de 12, inclusive acompanhantes, o ingresso custa R$ 7,00. Sócios com mensalidade em dia têm entrada franca.\n» Clubes em Porto Alegre\n» Lojas de fantasias em Porto Alegre\n» Como se associar a um clube? Descubra aqui


cathia ajuda para professores da ebd: Maio 2013\nComo fazer rosa em EVA termo formada para dia das mães aprenda fazer lindas rosas de EVA para lembrancinha do dia das mães, para decoração de ambientes e eventos e para fazer lindos arranjos.\nVeja como fazer rosas EVA passo a passo em vídeo aula aprendendo a técnica do EVA termoformado e faça rosas de EVA em quadros, decore porta retratos, faça buques de rosas em EVA, canetas flor de EVA, decoração de casamentos, decoração de festas infantis, decoração de igrejas, centro de mesa e vasinhos com flores.\nEva colorido liso eva verde\nchapinha de cabelo ou ferro de passar roupas\narame grosso para flor ou palito de churrasco\nMOLDES ROSAS EM EVA\nPASSO A PASSO DE ROSAS DE EVA\nAssista abaixo a vídeo aula de como fazer rosas em E.V.A. ensinada pela artesã Rosemary Ansante no programa Mulher.com:\nArte em E.V.A. rosa Parte 1:\nArte em E.V.A rosa Parte 2:\nFLOR EM EVA PORTA BOMBOM\nBaixe aqui os moldes do bombom de EVA\nMOLDE com PAP Porta Bombom Flor de EVA\nAtendendo a pedidos (rsrsrsrs) estou disponibilizando o molde e um PAP muito simples do Porta Bombom Flor de EVA... Espero que todas gostem!!!\nAinda dá tempo de fazer a sua versão e presentear a mamãe domingo...\nO tamanho do quadrado utilizado é de 9cm X 9cm.\nROSAS DE EVA PASSO A PASSO\nFerro de passar … Folha sulfite\nMOLDES DA ROSA\nCom objetos simples e que você não terá dificuldade em arrumar (pote de margarina, CDs antigos e palitos de sorvete), vamos ensinar como fazer um belo enfeite para colocar sobre sua mesinha de centro ou qualquer outro móvel. Separe tudo o que você vai precisar e vá para o passo a passo. Você vai adorar o resultado final.\nComo fazer um enfeite de bicicleta\nPote de margarina vazio (grande)\nTrês CDs velhos\nCola “Super Bonder”\n1º passo: pra começar, lave bem o pote de margarina para retirar possíveis restos do alimento. Espere secar bem para continuar.\n2º passo: em seguida, pegue a lixa (aquelas de parede mesmo) e lixe bem todo o pote de margarina. Depois, pinte-o de azul com a tinta acrílica e a ajuda do rolo.\n3º passo: pegue os três CDs, que você já não ouve mais, e pinte-os também de azul – ambos os lados.\n4º passo: pinte também os três palitos de sorvete.\n5º passo: quando tudo já estiver seco, cole dois CDs nas laterais do pote de margarina.\n6º passo: com o estilete, faça um pequeno furo na frente do pote de margarina – que não tem os CDs – e encaixe um palito de sorvete. Nele, cole outro palito e mais outro, formando o cano e o guidão da bicicleta.\n7º passo: cole no palito da frente mais um CD, a roda da frente da bicicleta.\n8º passo: nesse mesmo palito, cole o lacinho de cetim. Pronto! Seu enfeite de bicicleta já está pronto. Agora, é só pegar um pequeno vaso de flores e colocar dentro do pote de margarina para decorar ainda mais sua casa.\nessa rosa é bem fácil de fazer vale a pena dar uma olhada nesse vídeo\nArtesanato: Rosas de papel crepom para lembrancinhas e decoração.\nVamos fazer rosas com papel crepom? As rosas de papel são fáceis de fazer e ficam lindas no ambiente. O papel crepom é fácil de trabalhar e o resultado do artesanato vai te surpreender.\nNesse artesanato vamos aprender como fazer belas flores com bombom, botões de rosa para lembrancinhas e decoração de festas.\nSe inspire com mais esse artesanato, acompanhe o passo a passo de como fazer rosas de papel crepom para montar um belo buquê de flores.\nPasso a passo como fazer rosa de papel crepom com as imagens:\nCorte um retângulo para fazer a pétala\nDobrar o retângulo e cortar como mostra a imagem\nAgora nossas duas pétalas já estão prontas, esperando para montar o botão de rosa.\nO chocolate Ferrero Roche vai ser o miolo da flor, porém você poderá usar outro chocolate.\nAgora vamos enrolar com o papel dourado e amarrar com o cordão dourado nosso chocolate.\nVeja a imagem do passo a passo abaixo.\nAgora com o chocolate já embrulhado, vamos colocar na pétala, depois é só amarrar com o cordão dourado\nFeche as pétalas e amarre\nCorte o excesso do papel\nAgora vamos fazer a folha verde\nDepois de cortar como mostra o modelo abaixo, enrolar as pontinhas\nEmbrulhe a rosa com a folha verde\nCorte uma tira de papel crepom verde e cubra o talo\nColoque o talo no botão da rosa e faça o acabamento com a tira verde.\nPronto, agora temos um botão de rosa lindo para montar o buquê com as flores\nVocê poderá fazer apenas um botão de rosa para dar como lembrancinhas Dia das mães.\nOu montar um buquê para decoração de um casamento ou festa de 15 anos.\nFica a sugestão desse artesanato lindo “rosa de crepom”para fazer lembrança dia das Mães.\nPostado por cathia melo às 17:35 Um comentário:\nMarcadores: dia das mães, rosa de papel crepom\nPostado por cathia melo às 19:22 Nenhum comentário:\nSuporte de doces com garrafa PET\nPostado por cathia melo às 17:14 3 comentários:


Vasco massacra na estréia da Libertadores | Extra MT\nInício Esportes Vasco massacra na estréia da Libertadores\nVasco massacra na estréia da Libertadores\nNão poderia ser melhor a estreia do Vasco na primeira fase da Taça Libertadores. Em partida disputada na noite desta quarta-feira, no estádio Ester Roa Rebolledo, o time de São Januário goleou o Universidad Concepción, do Chile, por 4 a 0 e deu um passo gigantesco para chegar à segunda fase da competição. Os dois times voltam a se enfrentar na próxima semana, em São Januário, e o Vasco pode perder por até três gols de diferença para garantir a vaga.\nO resultado fez justiça ao melhor desempenho da equipe dirigida por Zé Ricardo que mostrou muita objetividade para aproveitar as oportunidades de gols construídas durante a partida. O time chileno fez um primeiro tempo ruim, melhorou na etapa final, mas desperdiçou algumas chances claras de gol e permitiu que o Vasco liquidasse a partida sem muita dificuldades. Os gols da equipe brasileira foram marcados por Evander, dois, Yago Pikachu e Rildo,\nLogo aos dois minutos, o Vasco marcou o primeiro gol. Após boa troca de passes que envolveu Rios, Wellington e Paulinho, a bola foi rolada para Evander que encheu o pé para colocar a bola nas redes.\nSurpreendida, a equipe chilena levou alguns minutos para se recuperar do choque causado pelo gol adversário.\nA vantagem deu mais tranquilidade ao time carioca que tocava a bola com calma, enquanto esperava que se abrissem espaços na defesa do Concepción.\nAos 15 minutos, o Vasco marcou o segundo gol. O goleiro Cristian Muñoz saiu jogando errado e a bola sobrou para Evander que, da intermediária, arriscou o chute e foi feliz, colocando a bola nas redes chilenas.\nSó aos 18 minutos é que o Universidad Concepción chegou na área brasileira em conclusão perigosa de Santiago Silva. O “Tanque” era o único atacante que dava trabalho à defesa cruz-maltina. Aos 18 minutos, ele cabeceou com muito perigo. Dois minutos depois, concluiu para boa defesa de Martín Silva que completou 200 jogos com a camisa do Vasco.\nO time dirigido por Zé Ricardo tentava controlar o jogo, trocando passes sem pressa e irritando a torcida chilena.\nAos 30 minutos, de la Fuente investiu pela esquerda e cruzou para a cabeçada perigosa de Santiago Silva que continuava dando muito trabalho aos zagueiros cruz-maltinos. Aos 38 minutos, após boa jogada de Droguett, Santiago Silva colocou a bola nas redes, mas a arbitragem marcou impedimento do atacante. Só aos 45 minutos é que o Vasco voltou à criar chance para marcar. Paulinho soltou a bomba, o goleiro Muñoz deu rebote e Evander desperdiçou a chance de marcar o terceiro, batendo por cima do travessão.\nO Universidad voltou mais agressivo , mas foi o Vasco que esteve perto de marcar o terceiro gol aos cinco minutos, quando Andrés Rios ficou livre diante do goleiro Cristian Muñoz, mas bateu para fora. A equipe chilena respondeu em cobrança de falta executada por Huentelaf. Martín Silva deu rebote e Portillo bateu por cima. Aos 13 minutos, novamente a equipe chilena esteve perto do gol. Huentelaf cruzou para a pequena área e Santiago Silva deixou a bola passar, perdendo uma grande oportunidade.\nTentando aumentar o poderio ofensivo da sua equipe, o técnico Zé Ricardo decidiu trocar o meia Wagner pelo atacante Rildo, mas o time de São Januário não conseguiu melhorar o rendimento e quase não conseguia organizar jogadas de ataque. Aos 22 minutos, depois de finalmente prender a bola no ataque, trocando mais de dez passes, o Vasco conseguiu envolver o adversário e a bola foi passada para a conclusão de Pikachu que não levou perigo.\nA equipe da casa desperdiçou mais uma chance para marcar o primeiro gol aos 26 minutos. Morales mandou a bomba, Martín Silva fez grande defesa, espalmando para o lado, mas o rebote ficou com de la Fuente que cruzou na cabeça de Santiago Silva. Livre na área, o atacante mergulhou e mandou para fora, perdendo mais uma oportunidade.\nO Vasco deu o ar da sua graça no ataque aos 31 minutos, em cabeçada de Riascos. E marcou o terceiro gol aos 33 minutos. Rildo investiu pela esquerda e cruzou rasteiro. O goleiro Cristian Muñoz tentou fazer a defesa e colocou a bola nos pés de Yago Pikachu que não teve o menor trabalho de tocar para as redes. Três minutos depois, o time carioca marcou o quarto gol. Rildo foi lançado pela esquerda e tocou na saída do goleiro Muñoz. Com a vitória assegurada, o time carioca apenas tocou a bola até o final.\nNotícia anteriorSão Paulo e Corinthians lucram com venda de Lucas\nPróxima notíciaLeitão assume liderança do PSDB na Câmara


Sacada Pizzaria cria pizza especial para Páscoa - Joana D'arc\nHome alimentos dicas Sacada Pizzaria cria pizza especial para Páscoa\nBlog Joana D'arc sexta-feira, março 31, 2017 alimentos, dicas,\nPizza salgada com doce combina? A Sacada oferece a experiência única de saborear uma redonda que traz o mix equilibrado e saboroso do recheio salgado e borda recheada doce.\nO Rodízio de Pizzas da Sacada tem mais de 30 sabores – entre salgadas e doces - funciona diariamente com preços bacanas: de segunda a quinta-feira R$ 29,90; sexta e domingo R$ 32,90 e sábados R$ 34,90. Além do cardápio a la carte e do sistema delivery. E as crianças até 5 anos não pagam e de 6 a 8 anos pagam só 50% do valor.


Desculpe-me, mas sou fã de…. – Revoltadinha\nDesculpe-me, mas sou fã de….\nOn 2 de dezembro de 2013 26 de setembro de 2015 por revoltadinhaem Divagações\nHá um tempo atrás, falei dos Guilty Pleasures, ao relembrar coisas que aprendemos a gostar na infância, mas que ainda curtimos e temos vergonha de admitir, mas hoje gostaria de falar do “olho torto” que os so called intelectuais te lançam quando você fala que gosta de algo que é muito popular, ou que acham um lixo, ou ambos.\nEntendam que uma coisa é sacanear um amigo ou colega por ela ler “50 tons de cinza” ou achar que Anitta é uma grande cantora. Outra coisa é você usar isso como argumento para subestimá-la. Todos nós, no fundo, fazemos isso; temos esses “pré-conceitos” (ô terminho pedante, mas encaixou aqui).\nAssistir a um reality show não torna uma pessoa burra. Assim como ler Guimarães Rosa não torna ninguém intelectual. Também tenho verdadeiro horror de quem fala que a mídia emburrece e manipula, justamente porque estes “intelectuais” pressupõem que a maioria é estúpida e incapaz de ter um senso crítico ao receber uma informação. Esse pensamento é tão retrógrado quanto a teoria hipodérmica. Segundo essa teoria da comunicação, muito resumidamente, a ideia é que o receptor responde aos estímulos (uma mensagem da mídia) passivamente, ou seja, quando há um estímulo, esta adentraria o indivíduo sem encontrar resistências, como uma agulha penetra a pele (também é conhecida como “Teoria da Bala Mágica”, já que a bala também não encontraria uma resistência ao atingir um corpo).\nQuem realmente pensa desta maneira, ao invés de falar tanta besteira infundada nas redes sociais, poderia ler um livro já que é tão culto, né? Isso que estou falando é tão óbvio, há tantas outras opções, que eu não entendo essa escolha em ser uma “patrulha do conhecimento”, do tipo “ó, BBB não vai te acrescentar em nada!”. JURA? Achei que fosse ficar mais culta! POXA!\nE o mais interessante é que tem pessoas que são fanáticas por futebol e reproduzem o mesmo discursinho. Responda-me, por favor, o que você aprende ao ver caras correndo atrás de uma bola mirando um gol? Provavelmente, o mesmo que aprenderia com os discursos do Bial no paredão…\nO único cuidado que devemos ter é o de não termos apenas esses interesses para não nos tornarmos pessoas limitadas. É essencial ter uma boa noção de tudo, por mais que achemos alguns assuntos chatos….\nAgora, me deem licença que vou ouvir Raça Negra enquanto leio “A Cabana”. (Fui irônica em apenas uma das opções)\nCoisas que me irritam – parte II\n2 comentários sobre “Desculpe-me, mas sou fã de….”\n'Assistir a um reality show não torna uma pessoa burra. Assim como ler Guimarães Rosa não torna ninguém intelectual.' essa máxima pode ser usada pra tantos, mas tantos conceitos errados e preguiçosos que essa maldita geração Y anda criando…\n2 de dezembro de 2013 às 17:35\t Responder\nEu posso gostar do que é “mainstream” e ainda assim ser inteligente, não é preciso ler livros desconhecidos e rebuscados pra mostrar isso hahahahaha\n5 de dezembro de 2013 às 14:51\t Responder


Início » Brasil “outlet”\nCom a desvalorização do real, o Brasil se tornou, na descrição de executivos do mercado financeiro, um imenso outlet, cheio de negócios atrativos para investidores do exterior. Pesquisa da consultoria PwC mostra que, embora o número de fusões e aquisições tenha caído 12% de janeiro a setembro em relação a 2014, a participação de estrangeiros aumentou.As informações são do EstadãoAo declarar, em Nova York, na semana passada, que “o Brasil está em liquidação”, o empresário Abilio Diniz tornou pública uma afirmação que, há meses, ronda os escritórios de bancos, fundos de investimento e empresas brasileiras. Na descrição de alguns executivos do mercado financeiro, é como se o País tivesse se tornado, com a desvalorização do real, um imenso outlet: com negócios atrativos, que ficam ainda mais interessantes, para os gringos, ao converterem as moedas.\nA pesquisa mensal da consultoria PwC sobre fusões e aquisições no País dá uma ideia desse movimento. Entre janeiro e setembro deste ano, embora o número de transações tenha caído 12% em relação ao mesmo período do ano passado, a participação de estrangeiros aumentou e, até o fim do ano, deve ultrapassar a de brasileiros em número de negócios. A diferença entre eles foi diminuindo ao longo do ano, até chegar, em setembro, a 50% de participação cada um. É a primeira vez que isso acontece desde que a consultoria começou a acompanhar as fusões e aquisições no Brasil, em 2002.\n“É uma nova onda de investimento estrangeiro chegando ao País”, diz Rogério Gollo, sócio da PwC. “O último grande movimento desse tipo aconteceu entre 2008 e 2010, com a perspectiva de crescimento da economia brasileira.”\nAgora, os investidores se aproveitam do que alguns empresários nacionais têm chamado de “tempestade perfeita”, do lado de cá: ao mesmo tempo em que a alta dos juros fez crescer a dívida das empresas, o desaquecimento da economia derrubou a demanda, fragilizando a operação de muitas companhias. Um recorte feito pelo banco de investimentos Greenhill faz esse retrato. Em 2010, num grupo de 35 transações, 26% delas envolviam a venda de empresas com índice de alavancagem superior a três vezes o Ebtida (indicador que mostra o potencial de geração de caixa). Neste ano, em um total de 54 transações analisadas, 55% estavam nessas condições. “Esse não é um nível de endividamento considerado saudável no mercado”, diz Daniel Wainstein, presidente do Greenhill no Brasil. “O aumento desses níveis reduz o poder de negociação dos vendedores.”\nNa semana passada, a venda da divisão de cosméticos da Hypermarcas para a multinacional Coty, por R$ 3,8 bilhões, foi emblemática. A empresa brasileira queria se desfazer do negócio para zerar seu endividamento bilionário e recuperar o fôlego para investir na venda de medicamentos. Fontes do setor ponderam, no entanto, que o preço de fechamento do negócio não foi uma barbada, já que a Coty pagou cerca de 20 vezes o Ebtida da divisão de consumo da Hypermarcas. “A entrada deles era considerada estratégica no País, que é um dos maiores consumidores de produtos de beleza do mundo, por isso pagaram um prêmio pelo negócio”, disse uma fonte próxima à transação.\nA Coty é apenas uma de várias multinacionais que voltaram a olhar com lupa o mercado brasileiro nos últimos meses. A mexicana Femsa, por exemplo, aproveitou o momento para fazer mais uma aquisição no País. A divisão de logística do grupo, que também é distribuidor da Coca-Cola, acabou de anunciar acordo para a compra da paranaense Atlas Transportes. O valor não foi divulgado, mas o Estado apurou que o negócio ficou em R$ 1,1 bilhão. Ao mesmo tempo, o grupo americano de educação Devry, que já tem universidades no Nordeste, é um dos favoritas para comprar uma fatia da escola de negócios Ibmec, em São Paulo. As empresas não comentam o assunto.\nNA CORDA BAMBA 6 anos atrás\t Reply\nSem dúvida alguma o Brasil se tornou um grande buraco e quem\ncaiu nele foram só os brasileiros. Que país é este onde a moeda\nvale quatro vezes menos do que a referencia em dólar e seis vezes\nmenos do que a libra !? Tornamos um grande outlet, porem a nossa\ncomida não se vende em outlet…\nOTIMISTA 6 anos atrás\t Reply\nPara muitos como eu que já vivi a ditadura, era Sarney e Collor,\nera PT e tantas outras, fica a angústia de ver que o Brasil mergu-\nlhou de novo nesta ciranda de rescessão e inflação galopante.\nNão faço parte desta turma de imbecis que colocaram esta genta-\nlha no governo mas estamos pagando o pato por um crime que não\ncometemos. Temos uma responsabilidade gigante pelos mais jovens\nque estão crescendo e ainda temos uma chance de consertarmos\nos estragos que os outros fizeram… VOTEM BEM !!!


Recuse o recebimento por qualquer encomenda que possua indícios de violação na embalagem. Contém todos os acessórios e manual, conforme inclusos originalmente pelo fornecedor.\nMiami é um desprovido-fim de programas para crianças, passei minhas fé especialmenterias por lá e tinha tanta opção qual poderia escrever 1 guia! O clima é maravilhoso e tudo convida o mundo infantil a se divertir, porém resolvi escolher ESTES programas mais tops de modo a umas férias de 1 somana!\nEsse foi este primeiro de 1 total por quatro pagamentos combinados entre Joesley e Afoicio, completando R$ 2 milhões. ESTES repasses das outras parcelas foram filmados pela Polícia Federal utilizando autorização judicial.\nEle é suspeito do ajudar a elaborar este tratado da empresa quando ainda era vinculado ao Ministfoirio Público Federal. Este nome da advogada aparece pelo diálogo gravado entre Joesley Batista e Ricardo Saud em que ambos discutem o entendimento feito com a PGR. Por causa dessa gravação, Janot pediu a rescisãeste da colaboraçãeste por ambos, e o ministro Edson Fachin, do STF (Supremo Tribunal Federal), decretou a prisão deles.\nProcurador da equipe de A Folha ouviu Madruga afirmar à advogada qual a nova gestão da PGR precisa construir outra relação usando a forçatarefa dos procuradores da Lava Jato em Curitiba, usando mais interlocução e controle do que a anterior. Ele chegou a criticar Janot por, em sua própria avaliaçãeste, deixar a forçatarefa bem solta. Na conversa, Madruga questionou o papel do Pelella, que na funçãeste de chefe do gabinete, teria trabalhado intensamente nas investigações e acordos da Lava Jato.\nOutros personagens graúdas no esquema identicamente conjuntamente estãeste sendo tratados por 1 código de que troca castigos exemplares por delações qual remetam a tubarões superiores. Tudo natural, talvez valha a pena. Mas, por enquanto, estamos pelo “talvez”.\nEm uma lista por registros do ligações apresentadas clique para ler mais de modo a a Procuradoria, duas foram realizadas por Joesley para Fernanda, ambas no POR DIA 23 do março, uma do 12 minutos e outra por 7 MOMENTOS. De tratado usando Janot, este primeiro contato para dar início a tratativas do tratado aconteceu por volta do POR DIA 27 de marçeste, ou mesmo que, quatro dias depois DE conversas.


Swoon: amor além do tempo - Nina Malkin - Livros, Bobagens e Guloseimas!\nCandice - ou melhor - Dice, é uma garota que possui um poder sensitivo muito forte, mas que foge totalmente ao seu controle. Suas visões são perturbadoras e depois que elas acontecem Dice sente uma verdadeira ressaca! Mas, apesar disso, ela tenta viver com esse ‘dom’ de uma forma que não atrapalhe muito a sua vida.\nPor decisão de seus pais Dice muda-se sozinha para Swoon, interior de Connecticut, a fim de recuperar-se de um grande trauma que sofreu. Para Dice, morar sozinha não seria problema, sua casa ficava bem em frente à casa de sua prima Pen e nos finais de semana seus pais viriam visitá-la. Ajudava também o fato da cidade ser muito tranqüila, que tipo de problemas era poderia encontrar em um lugar assim?\nMas o inesperado aconteceu em um dia de primavera. Dice e Pen estavam preguiçosamente debaixo de uma árvore fumando baseado, (eca!) quando Pen teve a infeliz ideia de curtir sua 'viagem' subindo na árvore. Pen percebeu que alguns garotos estavam observando a sua aventura e começou a fazer coisas para chamar atenção dos meninos, com isso perdeu o equilíbrio... foi quando tudo começou.\nDurante a rápida queda de Pen, Dice sentiu que algo estava acontecendo, algo que ela conhecia muito bem: enquanto Pen estava desacordada no chão, Dice era transportada por suas visões para uma Swoon de muitos anos atrás, onde ela presenciou algo que mudaria a vida de todas as pessoas da cidade.\nA partir desse acontecimento, coisas muito estranhas começaram a acontecer em Swoon, ou melhor, as pessoas começaram a se comportar de uma forma muito estranha, principalmente Pen. Para Dice não havia dúvidas de que essa brusca mudança de comportamento tinha a ver com os olhos negros que ela viu em Pen no momento que ela acordou da queda. Olhos que não eram os dela...\nUtilizando o seu ‘dom’, Dice descobre que no momento da queda sua prima foi possuída pela alma do jovem Sinclair Youngblood Powers - um garoto que foi morto injustamente há 250 anos atrás. Dice consegue falar e ver Sinclair exatamente da forma que ele era em vida. E ele é de tirar o fôlego! Dice fica encantada com a beleza e a educação de Sinclair, e acaba perdidamente apaixonada pelo dono dos lindos olhos negros!\nMas como não é certo permitir que Pen continue possuída e agindo de uma forma que nunca agiu, Dice decide convencer Sinclair a deixar o corpo de Pen, pois isso está trazendo muitos problemas para sua prima. Sin concorda com o exorcismo, mas durante o ritual alguma coisa dá errado e Sin se transforma em um garoto de carne e osso. Dice fica sabendo que Sin mentiu e que sua verdadeira intenção é colocar em prática seu plano de vingança, prometido a muitos anos atrás. Agora, todos os verdadeiros problemas de Dice – e Swoon – começam.\n- Aguarde, ó cidade de Swoon, ó grande colônia de Connecticut, pois eu serei vingado.\n(...) A violência de seu juramento me atingiu por dentro e se prendeu ao meu coração como uma vítima de naufrágio se agarra a uma boia.\n- Então avisem os filhos de seus filhos, e além! Avisem-nos bem!\nO que mais me chamou atenção nesse livro foi o slogan “O que fazer quando o garoto dos seus sonhos é mau demais para ser verdade?”. Confesso: Eu faço parte dos 99% das mulheres que amam um bom livro com um personagem Bad Boy. Mas gosto de bad boys que me fazem suspirar (suspiros!) e não daqueles que me tiram a paciência! Sinclair me tirou a paciência! Talvez nem por conta de suas atitudes, mas pela expectativa que criei com o título do livro, “Amor além do tempo”. Fiquei esperando que o romance acontecesse e Sinclair definitivamente – durante quase todo o livro - não correspondeu do jeito que eu esperava ao amor de Dice.\nMas vou dizer o que mais me incomodou nesse livro: Os personagens principais fumam maconha o tempo todo! Sem falar que durante a leitura ainda são citadas cocaina e ecstasy! Pode me chamar de careta ou do que quiser, não me importo! Sou careta, sim! E fala sério, precisava apelar tanto? Dice e Pen usam maconha desde as primeiras páginas! Aff... acho que Malkin podia muito bem ter escrito seu livro sem esse 'detalhe'!\nE no fim das contas, apesar disso tudo o livro não é ruim, é até gostosinho de ler, mas não é um livro imperdível ou marcante!\nTalvez se eu tivesse começado a leitura sem grandes expectativas teria sido bem melhor.\nMarcadores: Livros Nina Malkin\nJojo 30 de julho de 2010 20:11\ngostei do conceito do livro mas quando comecaste a falar em drogas que aparecem desde o princípio até fim, torci o nariz.\nNão sei se ele está editado cá em Portugal.\nDébora Lauton 30 de julho de 2010 20:35\nHum... acho que vou esperar... até agora não me empolguei com o livro...\nNão parece ser daqueles marcantes...\nJuliana 31 de julho de 2010 10:17\nih, miriam, tb não gosto de tantas referências a drogas!\nMe uno a vc no time das caretas!!\nEu não achei nem o enredo interessante.\nKézia Lôbo 31 de julho de 2010 13:10\nEu não acho que vc seja careta, acho pura realidade, pq querendo ou não esse tipo de coisa influencia as pessoas, que pena que o livro é assim. Adorei a resenha e a sinceridade.\nDaniela Tiemi 1 de agosto de 2010 09:11\nNossa, realmente não sabia das referências às drogas... Ecaaa! Tb sou careta e não gostei! Afff.. Eu comprei o livro, mas nem estou mto empolgada para ler..rs.\nѼ Michelle Ѽ 1 de agosto de 2010 14:07\nOlá Mirian! Achei seu blog sem querer mas adorei! Já estou seguindo.\nAcabei de postar uma resenha de Swoon no meu blog também. Apesar das fortes referências as drogas, eu até gostei desse livro. Achei legal o amor diferente - e louco - entre Dice e Sin.\nCláudia Charão 2 de agosto de 2010 19:15\nNão sabia bem sobre o que era esse e puxa não me identifiquei com a leitura, além das drogas ... a história parece um pouco fraca, acho que esse eu passo. Mas adorei o slogan que foi o que chamou a sua atenção -> “O que fazer quando o garoto dos seus sonhos é mau demais para ser verdade?”\nCelsina 3 de agosto de 2010 21:16\npode ter sido por ler algumas resenhas não muito estimulantes, não sei, mas não estou mesmo muito empolgada para ler esse livro.\nMas eu tenho um grande mal, quando um livro começa a ser muito falado, independente se bom ou ruim, eu me sinto na necessidade de conhecer. Então vou acabar lendo esse livro também.\nLariane 4 de agosto de 2010 10:08\nFumar maconha não dá, né?\nGiu Fernandes 4 de agosto de 2010 19:57\nMuito boa sua resenha - eu tb vi várias pessoas falando q estavam esperando mais desse livro! hahaha\nEu não sabia sobre esse negócio das drogas, e aff, dar muita ênfase nisso deve ser mesmo cansativo!! :s


♥ Argumento Poético ♥: Julho 2010\nSelinho "Este Blog merece um troféu" ... Recebido com enorme carinho de "Rascunhos D'Ítala" e desde já repassado...\nGanhei meu primeiro selo de Blog, um lindo Selinho do “Rascunhos DÍtala e\nTodos que visitam o blog e comentam, meu muito obrigada...\nAs regras para ganhar o selo é repassá-lo para dez pessoas.\n3 Cid Augusto: www.cidaugusto.com.br\n4 Cláudia Magalhães: www.teatroclaudiamagalhaes.blogspot.com\n6 Mário Rezende: www.mariorezendemeusescritos.blogspot.com\n7 Vale das Sombras: www.valedassombrasmemorte.blogspot.com\n8 Elton Neves: www.eltondasneves.blogspot.com\n9 Ronaldo Monte: www.memoriadofogo.blogspot.com\n10 Rick Waekmann: www.lapiscriativo.blogspot.com\nObs: Foi difícil a escolha, tive de deixar muitos de fora, haverá outras oportunidades!\nFeira de São Cristóvão, a famosa feira dos Paraíbas...Centro Luiz Gonzaga de Tradições Nordestinas no Rio de Janeiro\nNo Pavilhão São Cristóvão, a cultura nordestina é manifestada nas suas mais diversas formas, destacando-se a música e a culinária. Localiza-se na cidade do Rio de Janeiro, no Brasil.\nO prédio foi construído no final dos anos 50 e inaugurado em 1962, concebido como Exposição Internacional de Indústria e Comércio durante o governo Juscelino Kubitschek e foi empreendido pelo empresário Joaquim Rolla.\nÉ um local para apresentação de shows musicais de ritmos nordestinos, onde destaca-se o forró, com apresentação de diversos grupos distribuídos em dois grandes palcos, nos quais, além dos artistas locais, periodicamente se apresentam grandes nomes da música e cantores, conhecidos como repentistas, que utilizam o talento de improvisar versos para atrair ouvintes que freqüentam o local e contribuem voluntariamente em troca de algumas canções e versos, na sua maioria improvisados.\nPor Sulla Mino...A Dança\nO fogo no peito se acalma,\ntrava a ansiedade,\nOs braços dançam,\no corpo balança,\ndesata o nó guardado.\nO suor suporta mais um refrão,\no sorriso aguenta mais uma valsa miúda.\nQueimam pensamentos erradios por dentro.\nA pista de dança se torna larga e profunda.\nContos que conto...Na Casa\nOnde eu estava naquele momento não sabia, estava em um lugar onde nunca fui e se fui algum dia não lembrava mais. Acho que é uma casa, muito grande, muito bela.\nEu estava lá, vestida num traje branco e comprido, estava bonita e muito maquiada, mas nada era meu, nada era familiar, senti-me lindamente vestida e completamente nua. Teria eu invadido uma casa alheia? Eu me perguntava mentalmente.\nEu não era eu e nada me dizia nada, o desespero começou a fazer parte de mim, naquele silêncio estúpido, naquele turbilhão de vazio no ar.\nO gosto de fel se espalhava em minha boca, tentava cuspir e era inútil, eu tentava respirar fundo, tentava gritar, mesmo se fosse numa voz rouca e pouca, abafada e tudo era em vão. Estava louca varrida, trancada num cômodo qualquer.\nResolvi abrir a porta e ir além daquela prisão mental, tentar ir a lugar nenhum. A casa ainda era estranha, o corredor sombrio e velho. Meus passos eram incertos e rasteiros, eu não me dominava e não me entendia. Será um sonho? Um pesadelo na minha madrugada crua? Perguntas somente em minha mente doentia, meus passos curtos e vagarosos.\nA casa era uma mansão incrível, muitas portas e eu sem saber onde é a saída ou a entrada para me tirar dali, daquele labirinto cruel e torturante.\nEu já não tinha tanto medo, apenas um pequeno pavor por não senti meu corpo, por me sentir caindo num penhasco negro no meio de uma floresta. Nada lembrava meu passado ou presente. Eu somente ali tentando sair daquele hospício oco, eu era um nada na imensidão de um corredor.\nAbri desesperadamente meus olhos, nada havia diante de mim de concreto, apenas uma luz branca vinda de uma das portas. Estou aprisionada no meu desespero desmedido e incabível\nMeus passos já eram mais largos naquele momento, eu não aguentava mais me rastejar feito cobra no deserto. Eu queria um oásis, uma resposta. Acho que tentava sair de mim mesma ou simplesmente desta casa maldita.\nAvistei uma bela escadaria, com um corrimão enfeitado lindamente com flores campestres, fui descendo calmamente, degrau por degrau... Ouvi uma cantoria, uma melodiosa música, aquilo fazia bem aos meus ouvidos. Eu estava gelada e meu corpo já estava leve, eu me sentia plena, poderia voar, tive esta sensação ao ouvir aquela bela canção. Era um som de uma harpa acompanhada de um piano, fechei meus olhos, continuei caminhando no embalo daquelas notas, aquela canção eu conhecia, lembrei-me num instante quem eu era e onde eu estava.\nEu sou eu mesma e aquela era a minha casa...\nO clarão ofuscou meus olhos, em alguns segundos ele foi diminuindo e pude ver muitos convidados na sala, os homens de terno preto e as mulheres lindamente vestidas em seus trajes de gala. Caminhei entre eles e aproximei-me do caixão próximo a janela.\nEu estava sorrindo...\nPor Sulla Mino...Rumo a Recife\nCheguei! Foi minha exclamação quando me dei conta de que o ônibus já estava no centro da cidade em Mossoró, o carro já tinha passado pelo buraco enorme na pista, isto me fez reconhecer, não só a luz amarela no poste ou o cheiro forte da poeira, reconheci realmente, por sentir dentro de mim, que já estava praticamente em casa.\nNo começo da viagem, o meu pensamento era somente de chegar naquela bela pousada em Recife e no domingo, para comer ovo de páscoa, mas a coisa tomou um rumo diferente. Foi assim...Depois de termos feito vários reparos no carro, ele estava pronto para fazer uma viagem, prontíssimo para a estrada. Cmte Pimentel teve de fazer um voo, bate volta à Recife, no mesmo dia da nossa viagem, ele acordou 5 da manhã, ironicamente, partiu sem ter absolutamente certeza se voltaria no mesmo dia, voos são sempre imprevisíveis.\nQuando nos falamos ao telefone, confesso que fiquei um tanto preocupada, de não mais viajar, de não mais curtir um solzinho em “Boa Viagem”, afinal já eram meio dia e ele ainda estava lá e eu em casa, na tortura mental, com as bagagens prontas, na expectativa.\nRecebi um breve ok, Cmte já estava vindo pra casa. Farei a viagem.\nHenrique tinha de estar, de novo em Recife, na quinta-feira as 6 da manhã, mais especificamente no Hospital da Aeronáutica para exame anual. Bom, era quarta-feira, duas e meia da tarde quando ele dá as caras em casa, rapidamente arrumamos as malas na mala da Paraty, na verdade apertamos as coisas e tive de aproveitar o momento e tirar uma fotografia, esta proeza não é para qualquer um.\nPé na estrada! Resolvemos não levar lanche e fazer uma parada em Lajes, ganharíamos mais tempo, mais chão.\nUma hora e vinte mais ou menos de viagem, a gente já avistava o “Pico de Cabugi”, quando o carro resolve dar “pau”, acende no painel o “EPC” e ele “morre”, para nosso azar. “Corre amor, pegue o manual”, foi a frase que ouvi lentamente grave e rápida em meu ouvido e assim o fiz, meio desconsertada.\nLiga para o seguro, cai na secretária eletrônica, tenta falar com o corretor e o celular fora de área, tenta se comunicar com meu cunhado, com minha amiga Luana da oficina, um amigo, um vizinho, tentativas, tentativas, vontade de fazer “xixi”, o menino no banco de trás com sede, fome, medo do escuro que já estava lado de fora, Oh my God! É assim quando uma família quer viajar, tropeços, desventuras...Muito tempo depois fomos levados a um posto de gasolina para aguardar o reboque, conseguimos sair da pista, já estava escuro e era perigoso, fomos ajudados pelos policiais, muita sorte mesmo. O carro foi rebocado de volta à cidade e nós fomos, com a metade da bagagem e de táxi até a rodoviária de outra cidade, em Natal melhor dizer.\nChegando lá, não tinha mais ônibus, já eram mais de meia noite, todos com fome, o menino cansado.Conseguimos uma carona com uma amigo até o Aeroporto para lugar um carro e de lá seguir viagem para Recife, nem paramos em João Pessoa para descansar, como de “praxe”, fomos direto à Recife, meu filho já estava ansioso em brincar na piscina deliciosa da pousada e aproveitar um pouco de sol na praia de Boa Viagem.\nFomos parados em Blitz, o documento do carro alugado não estava em ordem, meu esposo já ficando atrasado para o exame médico, eram quatro e meia da manhã, esta foi exatamente a hora que chegamos. A piscina em obra, o sol resolveu não aparecer, Recife estava em chuva...Mas, daí já é outra parte da história.\nHomenagem ... O escritor Elton das Neves "Anjo das letras" me presenteou com este belo texto...Tu Vates Eris\nEu lhe quero menina inocente, cândida, terna e intensamente sorridente, mas depois vou lhe desejar mulher inteligente, culta, sensível, decidida e convicta no que objetivas.\nÉs uma Valquíria perfeita, serva de Odin, carregas em tua cabeça o elmo prateado da poesia, e em uma de tuas mãos a lança de ponta afiada da literatura, que tudo penetra e fere com a força de sua sabedoria.\nVoas garbosamente no cavalo alado da beleza integra de tua alma de artista, e levas com a velocidade de um relâmpago a mensagem dos teus escritos aos olhos e alma dos teus leitores, ávidos pela tua sabedoria literária feminina.\nA tua sensualidade ariana me fascina de tal forma que me transpassa o coração, como se ela fosse uma afiada espada, meus olhos ficam em festa ao contemplá-la em seu total esplendor. Nem Salomé em seus dias de glória em sua formosura física lhe é comparável oh musa dos escribas da imponente poesia.\nMesmo nos dias cinza da tristeza e do amargor não te deixastes abater, lutaste com toda a força que tens em teu interior de mulher, mesmo quando a escuridão quis rodeá-la, oh princesa das poetisas, clamaste pela indulgência de Calíope que ouvindo a voz de teu clamor, correu em teu auxilio cercando-te com o sol de tua musica, e com a inspiração de sua “poiesis” divina.\nApolo cheio de amor por essa mulher única que sóis tu, beija-te a boca profana de forma sagrada, e depois de afastar seus lábios dos seus, toca em tua testa quente proferindo sobre tua pessoa, a sua sentença divina: “Tu Vates Eris”!\n"Essa prosa poética é em homenagem há uma de minhas mais diletas musas, Sulla Mino a poeta-(foto acima)-, uma de minhas grandes irmãs nas artes das letras."\nPor Sulla Mino...Borboleta\nA liberdade se abre em mim,\ncomo uma borboleta na primavera.\nMinhas asas prendem nas\npresas do tempo.\nMinhas cores iguais,\no rosto transparente.\nRemorso - me em prender-me no colapso do quarto,\nenquanto as flores se abrem lá no jardim.


VEREADOR PAVÃO FILHO COBRA A IMPLANTAÇÃO DO VIVA CIDADÃO NA CIDADE OPERÁRIA\nDesde 2015 o vereador Pavão Filho vem solicitando ao Governador, Flávio Dino, a INSTALAÇÃO DE UMA UNIDADE DE ATENDIMENTO DO VIVA CIDADÃO, NO BAIRRO DA CIDADE OPERÁRIA, através das INDICAÇÕES apresentadas e aprovadas pela Câmara Municipal, Nº 261/15 em 2015, Nº 007/2016 em 2016 , Nº 029/2017 e Nº 466/2017 neste ano.\nA Cidade Operária é um dos bairros mais populosos de São Luís, e esse benefício vai atender mais de 40 bairros daquela regional, onde será de grande relevância assegurar uma prestação de serviços públicos próximo aos seus domicílios.\nO Vereador Pavão Filho é o representante no Parlamento Municipal da Cidade Operária e regional, tem solicitado vários benefícios para comunidade, tais como: a reforma completa do Mercado, a instalação da Agência da Caixa Econômica Federal, a instalação de uma Escola do Colégio Militar, pavimentação e asfaltamento de ruas e avenidas, implantação do Viva Cidadão dentre outras lutas.\nÉ de fundamental importância a implantação do Viva Cidadão, pois disponibiliza diversos serviços para a população como a emissão da carteira de identidade e a carteira de trabalho, o seguro desemprego, além de dispor da representação de diversos órgãos e entidades, todos reunidos em um só espaço físico.\nA instalação de uma Unidade de Atendimento do Viva Cidadão, no bairro Cidade Operária, fortalecerá o exercício da cidadania dessa comunidade, e facilitará o seu acesso às ações de qualidade na prestação de diversos serviços públicos, com um atendimento mais rápido e prático.\n#PavãoFilho #PavãoéPovão #OVereadordaEducação #VivaCidadão #CidadeOperária