Syngen Blood/Cell DNA Mini Kit - PDF\nDownload "Syngen Blood/Cell DNA Mini Kit"\n1 Syngen Blood/Cell DNA Mini Kit Zestaw do izolacji całkowitego DNA z próbek: - świeżej lub mrożonej krwi - kożuszka leukocytarnego - hodowli komórkowych - surowicy - osocza - wymazówek Instrukcja dla użytkownika, w Instrukcja dla użytkownika strona 1\n2 Spis treści Informacje wstępne 3 Ograniczenia 3 Zawartość zestawów 4 Przechowywanie 4 Sprzęt i odczynniki potrzebne do wykonania procedury, a niedostarczone z zestawem 5 Przygotowanie odczynników przed pierwszym użyciem 6 Materiał wyjściowy i wydajność DNA 7 Ogólne wytyczne dotyczące obsługi zestawów Syngen 9 Elucja DNA 10 Protokoły Protokół 1: Izolacja DNA ze świeżej krwi, surowicy, osocza, kożuszka leukocytarnego 12 Protokół 2: Izolacja DNA z hodowli komórkowych 15 Protokół 3: Izolacja DNA z wymazówek 17 Protokół 4: Izolacja DNA z mrożonej krwi 22 Protokół 5: Izolacja DNA z krwi zwierząt 24 Samodzielne rozwiązywanie problemów 26 Protokoły skrócone Protokół 1: krew, osocza, kożuszek 29 Protokół 2: komórki 30 Protokół 3: wymazówki 31 Instrukcja dla użytkownika strona 2\n3 Dziękujemy za wybór zestawu serii Syngen DNA i okazane nam zaufanie. Produkty serii Syngen DNA to wysokiej jakości zestawy odczynników do izolacji całkowitego DNA z szerokiej gamy próbek takich jak tkanki, komórki, krew, płyny ustrojowe i inne. Zastosowana technologia wykorzystuje technikę chromatografii na złożu krzemionkowym zamkniętym w membranie kolumienki. Uzyskany DNA odznacza się wysoką czystością, wymaganą do zastosowań między innymi w technikach real-time PCR i microarray. Niniejsza instrukcja dla użytkownika zawiera szczegółowe wytyczne dotyczące stosowania zestawu Syngen Blood/Cell DNA Mini. Rozdziały wstępne pomogą użytkownikowi przygotować się do wykonania procedur opisanych w dalszych rozdziałach. Zalecamy uważne przeczytanie całej instrukcji przed przystąpieniem do pracy. Przy użyciu produktu powinna być zachowana uwaga i ostrożność. Zalecamy użytkownikom stosowanie się do zasad GLP (Dobrej Praktyki Laboratoryjnej), a także do zasad prowadzenia eksperymentów z rekombinowanym DNA. Między innymi należy stosować fartuch laboratoryjny, rękawiczki jednorazowe i okulary ochronne. Aby uzyskać więcej informacji o substancjach niebezpiecznych, które mogą być zawarte w niektórych składnikach zestawów, prosimy przeczytać Karty Charakterystyki Substancji Niebezpiecznych (MSDS) dostępne u producenta. W przypadku pytań, pozostajemy do Państwa dyspozycji. Życzymy sukcesów w pracy z zestawami Syngen. Ograniczenia Zespół Syngen Biotech Zestawy serii Syngen DNA są przeznaczone wyłącznie do użytku laboratoryjnego. Nie będą uwzględniane żadne roszczenia wynikające z użycia zestawu do diagnozowania lub leczenia chorób. Instrukcja dla użytkownika strona 3\n4 Zawartość zestawu Syngen Blood/Cell DNA Mini Kit SY SY SY Liczba izolacji Kolumienki DK Probówki do elucji 1,5 ml Proteinaza K liofilizat 11 mg 2 x 11 mg 6 x 11 mg Bufor lizujący komórki DLK 15 ml 30 ml 70 ml Bufor płuczący DP1 koncentrat 22 ml 44 ml 124 ml Bufor płuczący DP2 koncentrat 10 ml 20 ml 50 ml Bufor elucyjny DE 15 ml 30 ml 3 x 30 ml Probówki do płukania 2 ml Przechowywanie Kolumienki DK, a także wszystkie roztwory poza rozpuszczoną proteinazą K, powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej (15-25 C), chyba że na butelce określono inaczej. Przechowywanie kolumienek DK w wyższej temperaturze jest zabronione. Proteinaza K po rozpuszczeniu powinna być przechowywana w 4 C. Instrukcja dla użytkownika strona 4\n5 Sprzęt i odczynniki potrzebne do wykonania procedury, a niedostarczone z zestawem Do wszystkich protokołów: Etanol (96-100%) Probówki 1.5 ml (eppendorfki) Statyw Sterylne końcówki do pipet (najlepiej z filtrem) Pipety automatyczne nastawne Mikrowirówka Worteks Łaźnia wodna, blok grzejny lub termomikser na 60 C PBS (w niektórych sytuacjach) RNaza 100 mg/ml (opcjonalnie) Nośnikowe DNA (opcjonalnie) Do izolacji DNA z mrożonej krwi: Łaźnia wodna, blok grzejny lub termomikser na 70 C Dodatkowa ilość Proteinazy K Do izolacji DNA z hodowli komórkowej: Trypsyna lub skrobak (do komórek rosnących w monowarstwie) Medium hodowlane PBS Przyrządy do liczenia komórek Do izolacji DNA z wymazówek: PBS Dodatkowa porcja buforu DLK Probówki 2 ml Nożyczki lub przecinak Do izolacji DNA z krwi zwierząt: PBS Instrukcja dla użytkownika strona 5\n6 Przygotowanie odczynników przed pierwszym użyciem Bufory płuczące Bufory płuczące DP1 i DP2 są dostarczane jako koncentraty. Przed pierwszym użyciem dodaj do nich odpowiednią ilość etanolu (96-100%) i starannie wymieszaj. Poniższa tabela przedstawia sposób przygotowania buforów płuczących. Syngen Blood/Cell DNA Mini SY SY SY Liczba próbek Objętość etanolu, jaką należy dodać do koncentratu buforu płuczącego DP1 Objętość etanolu, jaką należy dodać do koncentratu buforu płuczącego DP2 8 ml 16 ml 45 ml 40 ml 80 ml 200 ml Bufory DP1 i DP2 po dodaniu etanolu powinny być szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze pokojowej. Przed rozpoczęciem procedury zawsze wymieszaj rozpuszczone bufory przez obrócenie butelki kilka razy. Proteinaza K Proteinaza K jest dostarczana w postaci liofilizowanej. Aby przygotować porcję roztworu roboczego 10 mg/ml, probówkę zawierającą 11 mg liofilizatu proteinazy K należy krótko zwirować, dodać 1,1 ml wody destylowanej (czystości do PCR), zamknąć i dokładnie wymieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu roztwór roboczy proteinazy K należy przechowywać w temperaturze 4 C. Nośnikowe DNA Gdy dysponujemy bardzo małą ilością materiału wyjściowego i spodziewana ilość DNA po izolacji jest bardzo mała (poniżej Instrukcja dla użytkownika strona 6\n7 kopii genomu), zaleca się zastosowanie nośnikowego DNA (np. poli-da, poli-dt, poli-da:dt), które poprawia wiązanie izolowanego materiału do złoża w kolumience. Nośnikowe DNA dodaje się do buforu DLK użytego do lizy. Typowa ilość to 1 ul roztworu zawierającego 5-10 ug nośnikowego DNA na 200 ul buforu DLK. Materiał wyjściowy i wydajność DNA Zestaw Syngen Blood/Cell DNA Mini Kit służy do izolacji całkowitego DNA z szerokiej gamy próbek, takich jak świeża i mrożona krew, osocze, surowica, kożuszek leukocytarny, hodowle komórkowe, czy wymazówki. Poza DNA genomowym, izolat zawiera także frakcję mitochondrialną, jak również wirusowy DNA. Wyizolowaniu ulegają fragmenty o długości do pz, z przewagą fragmentów długości pz. Wyizolowany DNA ma wysoki stopień czystości, dzięki czemu może być użyty bezpośrednio do dalszych analiz, jak reakcje enzymatyczne z detekcją w czasie rzeczywistym, mikromacierze i inne procedury wymagające DNA wysokiej jakości. Prawidłowe dobranie ilości materiału wyjściowego jest kluczem do wydajnej izolacji. Poniższa tabela określa zalecane maksymalne ilości poszczególnych rodzajów próbek oraz typowe wydajności DNA. Materiał wyjściowy Maksymalna ilość na 1 izolację Typowa wydajność DNA Krew świeża 200 ul 5 ug (4-12 ug) (z antykoagulantem) Krew mrożona 200 ul 5 ug (4-12 ug) Kożuszek 200 ul ug leukocytarny Surowica 200 ul n/a Osocze 200 ul n/a Komórki 5 x 10 6 w 200 ul PBS ug Instrukcja dla użytkownika strona 7\n8 Próbki o objętości mniejszej niż 200 ul powinny zostać dopełnione przy użyciu PBS do objętości 200 ul. Próbki rozcieńczone, których objętość jest większa niż zalecana w danym protokole, ale nie przekraczające maksymalnej ilości komórek jądrzastych na 1 izolację, można również wykorzystać w całości. W tym celu należy proporcjonalnie zwiększyć objętość pozostałych używanych buforów i reagentów we wszystkich krokach, aż do etapu nakładania na kolumnę (etap zaznaczony czarną strzałką). Nakładanie na kolumnę lizatów o większej objętości należy wykonać w kilku porcjach, usuwając przesącz i nakładając kolejną porcję, aż do przesączenia przez kolumnę całej próbki. Próbki pełnej krwi podczas pobierania powinny zostać zabezpieczone przed koagulacją. W tym celu należy zastosować antykoagulant EDTA lub cytrynian. Heparyna jest również dozwolona, jednak nie zalecamy jej stosowania, gdyż nawet śladowe jej ilości po przedostaniu się do eluatu mogą stać się inhibitorem reakcji PCR. Kożuszek leukocytarny to potoczna nazwa białego osadu powstającego na granicy osocza i komórek opadających w stojącej nieruchomo probówce po pobraniu krwi. Frakcja ta jest bogata w WBC, głównie leukocyty. Zastosowanie do izolacji 200 ul kożuszka leukocytarnego zamiast 200 ul pełnej krwi zwiększa około 10-krotnie wydajność izolacji DNA. Aby przygotować kożuszek leukocytarny, 1-2 ml krwi pobranej na antykoagulant mieszamy z 5-krotnie większą objętością buforu RLE i inkubujemy przez 10 minut na lodzie mieszając co jakiś czas przez odwrócenie probówki. Następnie wirujemy z prędkością x g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej i usuwamy supernatant. Powstały biało-różowy osad WBC ma wystarczająca czystość do izolacji DNA. Zawieszamy go w 200 ul PBS i stosujemy jako próbkę. Wymaz z błon śluzowych należy wykonać poprzez kilkukrotne stanowcze potarcie wymazówką powierzchni błony śluzowej, po uprzednim usunięciu śluzu. Zbyt słaby nacisk lub niewystarczająca ilość potarć może ograniczyć ilość komórek błony śluzowej, które pozostaną Instrukcja dla użytkownika strona 8\n9 na wymazówce, co znacznie zmniejszy wydajność izolacji. Przed zamknięciem wymazówki w probówce ochronnej, należy ją wysuszyć. Komórki z hodowli przygotowuje się do izolacji poprzez zebranie i przemycie w PBS. Komórki rosnące w zawiesinie należy odwirować i zawiesić w PBS. Komórki rosnące w monowartstwie należy zebrać przy pomocy trypsyny lub zeskrobać z powierzchni, odwirować i zawiesić w PBS. W każdym przypadku zalecamy dokładne określenie ilości komórek. Przygotowanie komórek do izolacji opisano szczegółowo w protokołach. Ilość komórek rosnących w monowarstwie można określić na podstawie powierzchni hodowli. Należy przyjąć, że 1 cm 2 hodowli zawiera od 1x10 5 do 1,5x10 5 komórek. Przy pomocy zestawu Syngen Blood/Cell DNA Mini można wykonać izolację DNA z krwi zwierzęcej, o ile zostanie ona odpowiednio rozcieńczona PBS em. Krew o erytrocytach bezjądrzastych (większość ssaków) należy rozcieńczyć 4-krotnie (stosujemy 50 ul krwi z antykoagulantem ul PBS). Krew o erytrocytach jądrzastych (takich zwierząt jak ryby i ptaki) należy rozcieńczyć krotnie (stosujemy 5-10 ul krwi z antykoagulantem ul PBS). Ogólne wytyczne dotyczące obsługi zestawów Syngen DNA Kolumienki Mini pasują do większości probówek wirówkowych o pojemności 1.5 ml lub 2 ml (tzw. eppendorfek). Wszystkie wirowania wykonywane są z pełną prędkością (ok rpm lub x g), aczkolwiek możliwe jest zastosowanie niższych prędkości (8000 rpm lub 6000 x g), gdy użytkownik nie posiada szybszej wirówki lub przeszkadza mu hałas w takim przypadku należy proporcjonalnie wydłużyć wirowanie. Zaleca się jednak, aby przynajmniej wszystkie drugie kroki płukania, kroki dosuszania membrany oraz elucja odbywały się przy najwyższych obrotach wirówki. Wszystkie wirowania Instrukcja dla użytkownika strona 9\n10 należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej, chyba że w protokole zaznaczono inaczej. Podczas obsługi zestawów Syngen zalecamy, aby ograniczać dotykanie membran w kolumienkach końcówką pipety, przed wirowaniem zamykać wieczka kolumienek i probówek, a z wirówki kolumienki wyjmować razem z probówkami dopiero po ustawieniu w statywie można wyjąć kolumienkę z probówki. Ponadto, dla ograniczenia kontaminacji pomiędzy próbkami (cross-contamination), zalecamy aby utrzymywać w czystości rękawiczki ochronne, używać końcówek do pipet z filtrem i po każdym worteksowaniu lub mieszaniu zwirowywać probówki, aby usunąć krople ze spodu wieczek. Elucja DNA Typowa objętość elucji na zimno (15-25 C) wynosi 200 ul i jest wystarczająca dla zdecydowanej większości próbek. Elucja na ciepło najczęściej wykonywana jest objętością 100 ul. Elucję z kolumny można wykonywać dostarczonym buforem do elucji lub wodą destylowaną o ph= Woda o innym ph może znacznie ograniczyć wydajność elucji, lub nawet uniemożliwić ją. Nie należy eluować DNA zimnym buforem lub wodą. W przypadku elucji na zimno bufor do elucji (lub woda) powinien być doprowadzony co najmniej do temperatury pokojowej (15-25 C). Elucję na ciepło wykonuje się buforem ogrzanym do temperatury 70 C. Jeśli izolację wykonywano z materiału wyjątkowo bogatego w DNA (jak np. pełna porcja kożuszka leukocytarnego) i użytkownikowi zależy na odzyskaniu całego DNA z kolumny, zalecamy drugą elucję do oddzielnej probówki przy pomocy drugiej porcji 200 ul. W niektórych przypadkach pierwsza elucja pozwala na uzyskanie tylko 60% DNA, druga aż 40%. Drugim sposobem na odzyskanie większej ilości materiału z kolumny jest zastosowanie 100 ul buforu elucyjnego DE podgrzanego do 70 C i po Instrukcja dla użytkownika strona 10\n11 naniesieniu go na kolumnę, a przed wirowaniem elucyjnym inkubacja kolumny z buforem przez 5-10 minut w 37 C (np. w cieplarce hodowlanej). Dzięki temu więcej DNA związanego w kolumnie rozpuści się w buforze elucyjnym DE. W przypadku próbek ubogich w DNA, aby zatężyć otrzymany materiał, zalecamy elucję mniejszą objętością. Dla próbek o zawartości DNA < 3 ug zalecamy zastosowanie objętości 100 ul na zimno lub 50 ul na ciepło, dla próbek o zawartości DNA < 1 ug, zalecamy objętość buforu do elucji 50 ul na zimno lub 30 ul na ciepło. Objętość elucji za zimno powinna mieścić się w granicach od 50 do 200 ul. Objętość elucji na ciepło powinna mieścić się w granicach od 30 do 100 ul. Objętość eluatu uzyskanego w probówce może być mniejsza niż objętość Buforu do elucji (lub wody) naniesiona na kolumnę. Do przypadku przechowywania wyizolowanego DNA do 4 tygodni, wystarczą warunki chłodnicze 2-8 C. Do długoterminowego przechowywania wyizolowanego DNA zalecamy temperaturę -20 C. Instrukcja dla użytkownika strona 11\n12 Protokół 1 Izolacja DNA z próbek świeżej krwi, osocza, surowicy lub kożuszka leukocytarnego Zanim zaczniesz Jeżeli pierwszy raz używasz zestawu Syngen DNA Mini Kit, najpierw przeczytaj wszystkie rozdziały poprzedzające protokoły. Upewnij się, że przygotowałeś wszystkie potrzebne odczynniki i sprzęty opisane w rozdziale Sprzęt i odczynniki potrzebne do wykonania procedury, a niedostarczone z zestawem. Upewnij się, że bufory płuczące i proteinaza K zostały przygotowane zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale Przygotowanie odczynników przed pierwszym użyciem. Jeżeli w którymś buforze wytrącił się precypitat, rozpuść go inkubując w 37 C przez kilka minut i mieszając. Doprowadź wszystkie bufory do temperatury pokojowej (15-25 C). Nastaw łaźnię wodną, blok grzejny lub termomikser na 60 C. Doprowadź próbki do temperatury pokojowej (15-25 C) i dokładnie je wymieszaj. Procedura 1. Do eppendorfki (nie dostarczono) dodaj 200 ul próbki (pełnej krwi z antykoagulantem, surowicy, osocza lub kożuszka leukocytarnego). Próbki o objętości mniejszej niż 200 ul dopełnij przy użyciu PBS (nie dostarczono) i wymieszaj. Jeśli wymagane jest DNA wolne od RNA, dodaj 4 ul roztworu RNazy A o stężeniu 100 mg/ml (nie dostarczono), wymieszaj i inkubuj 2 minuty w temperaturze pokojowej. 2. Dodaj 20 ul roztworu proteinazy K oraz 200 ul buforu DLK, zamknij i wymieszaj na worteksie. Upewnij się, że roztwory zmieszały się całkowicie i zawartość probówki jest homogenna. Inkubuj w 60 C przez 15 minut, mieszając na worteksie co 3-5 minut, aż do całkowitej lizy komórek. Zwiruj krótko probówki, aby usunąć krople z wieczka. Nie wolno mieszać buforu DLK bezpośrednio z proteinazą K przed dodaniem do próbki. Instrukcja dla użytkownika strona 12\n13 3. Dodaj 200 ul etanolu (96-100%), zamknij i zmieszaj na worteksie przez 30 sekund. Upewnij się, że roztwory zmieszały się całkowicie i zawartość probówki jest homogenna. 4. Umieść kolumienkę w probówce 2 ml do płukania. Zwiruj krótko probówki z lizatem, aby usunąć krople z wieczka. Przenieś lizat na kolumienkę. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 5. Przenieś kolumienkę do nowej probówki 2 ml i wyrzuć przesącz razem ze starą probówką. Dodaj do kolumienki 500 ul buforu DP1. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. 6. Dodaj do kolumienki 750 ul buforu DP2. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. 7. Wiruj przez 3 minuty z maksymalną prędkością, aby wysuszyć membranę i pozbyć się z kolumienki resztek buforów zawierających etanol. Upewnij się, że w rogu kolumienki nie został żaden płyn. Ewentualnie usuń go pipetą i powtórz wirowanie. 8. Przenieś kolumienkę do probówki elucyjnej 1,5 ml i wyrzuć starą probówkę z resztkami buforu płuczącego. Ostrożnie, nie dotykając membrany, dodaj na sam środek membrany 200 ul buforu do elucji DE lub wody o ph=7,5-9,0. Zamknij wieczko i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aż bufor wsiąknie w membranę. Wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Objętość elucji i warunki inkubacji mogą być inne. Więcej na temat elucji znajdziesz w rozdziale Elucja DNA. Instrukcja dla użytkownika strona 13\n14 9. Ostrożnie wysuń kolumienkę i zamknij wieczko w probówce z wyizolowanym DNA. Nie wyrzucaj kolumienki do czasu określenia stężenia wyizolowanego DNA. Jak w przypadku każdej metody chromatograficznej, niewłaściwe ph wody użytej do elucji może wyraźnie zmniejszyć wydajność elucji, a nawet uniemożliwić ją, powodując pozostanie całego DNA na kolumience. Przy pomiarze stężenia DNA metodami spektrofotometrycznymi, stosuj bufor użyty do elucji jako próbę ślepą (blank). Wyizolowany DNA można przechowywać w temperaturze 2-8 C do 4 tygodni, lub w -20 C przez dłuższy czas. Instrukcja dla użytkownika strona 14\n15 Protokół 2 Izolacja DNA z hodowli komórkowych Zanim zaczniesz Jeżeli pierwszy raz używasz zestawu Syngen DNA Mini Kit, najpierw przeczytaj wszystkie rozdziały poprzedzające protokoły. Upewnij się, że przygotowałeś wszystkie potrzebne odczynniki i sprzęty opisane w rozdziale Sprzęt i odczynniki potrzebne do wykonania procedury, a niedostarczone z zestawem. Upewnij się, że bufory płuczące i proteinaza K zostały przygotowane zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale Przygotowanie odczynników przed pierwszym użyciem. Jeżeli w którymś buforze wytrącił się precypitat, rozpuść go inkubując w 37 C przez kilka minut i mieszając. Doprowadź wszystkie bufory do temperatury pokojowej (15-25 C). Nastaw łaźnię wodną, blok grzejny lub termomikser na 60 C. Nastaw łaźnię wodną, blok grzejny lub termomikser na 70 C. Do zebrania komórek rosnących na powierzchni przygotuj roztwór trypsyny lub skrobak oraz medium hodowlane. Można użyć medium zebranego z tej samej hodowli. Przygotuj narzędzie do liczenia komórek Procedura dla komórek rosnących z zawiesinie 1.1. Przenieś maksymalnie 5x10 6 komórek do probówki 1,5 ml (nie dostarczono). Wiruj przez 5 minut z prędkością 300 x g. Ostrożnie usuń cały supernatant, nie naruszając pelletu. Uwaga: Pellet komórek może być niewidoczny lub tworzyć nalot na ukośnej ściance wewnątrz probówki Dodaj 200 ul PBS i zawieś komórki można zastosować energiczne worteksowanie. Instrukcja dla użytkownika strona 15\n16 Procedura dla komórek rosnących na powierzchni trypsyna 1.1. Usuń medium, przemyj używając PBS, usuń PBS Dodaj 0,10-0,25% roztwór trypsyny. Gdy komórki zaczną się odrywać, dolej medium, aby zatrzymać działanie trypsyny i zawieś komórki przez pipetowanie Przenieś maksymalnie 5x10 6 komórek do probówki 1,5 ml (nie dostarczono). Wiruj przez 5 minut z prędkością 300 x g. Ostrożnie usuń cały supernatant, nie naruszając pelletu. Uwaga: Pellet komórek może być niewidoczny lub tworzyć nalot na ukośnej ściance wewnątrz probówki Dodaj 200 ul PBS i zawieś komórki można zastosować energiczne worteksowanie. Ciąg dalszy procedur: Jeśli wymagane jest DNA wolne od RNA, dodaj 4 ul roztworu RNazy A o stężeniu 100 mg/ml (nie dostarczono), wymieszaj i inkubuj 2 minuty w temperaturze pokojowej. 2. Dodaj 20 ul roztworu proteinazy K oraz 200 ul buforu DLK, zamknij i wymieszaj na worteksie. Upewnij się, że roztwory zmieszały się całkowicie i zawartość probówki jest homogenna. Inkubuj w 60 C przez 15 minut, mieszając na worteksie co 3-5 minut, aż do całkowitej lizy komórek. Zwiruj krótko probówki, aby usunąć krople z wieczka. Nie wolno mieszać buforu DLK bezpośrednio z proteinazą K przed dodaniem do próbki. 3. Dodaj 200 ul etanolu (96-100%), zamknij i zmieszaj na worteksie przez 30 sekund. Upewnij się, że roztwory zmieszały się całkowicie i zawartość probówki jest homogenna. Instrukcja dla użytkownika strona 16\n17 4. Umieść kolumienkę w probówce 2 ml do płukania. Zwiruj krótko probówki z lizatem, aby usunąć krople z wieczka. Przenieś lizat na kolumienkę. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 5. Przenieś kolumienkę do nowej probówki 2 ml i wyrzuć przesącz razem ze starą probówką. Dodaj do kolumienki 500 ul buforu DP1. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. 6. Dodaj do kolumienki 750 ul buforu DP2. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. 7. Wiruj przez 3 minuty z maksymalną prędkością, aby wysuszyć membranę i pozbyć się z kolumienki resztek buforów zawierających etanol. Upewnij się, że w rogu kolumienki nie został żaden płyn. Ewentualnie usuń go pipetą i powtórz wirowanie. 8. Przenieś kolumienkę do probówki elucyjnej 1,5 ml i wyrzuć starą probówkę z resztkami buforu płuczącego. Ostrożnie, nie dotykając membrany, dodaj na sam środek membrany 200 ul buforu do elucji DE lub wody o ph=7,5-9,0. Zamknij wieczko i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aż bufor wsiąknie w membranę. Wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Objętość elucji i warunki inkubacji mogą być inne. Więcej na temat elucji znajdziesz w rozdziale Elucja DNA. Instrukcja dla użytkownika strona 17\n18 9. Ostrożnie wysuń kolumienkę i zamknij wieczko w probówce z wyizolowanym DNA. Nie wyrzucaj kolumienki do czasu określenia stężenia wyizolowanego DNA. Jak w przypadku każdej metody chromatograficznej, niewłaściwe ph wody użytej do elucji może wyraźnie zmniejszyć wydajność elucji, a nawet uniemożliwić ją, powodując pozostanie całego DNA na kolumience. Przy pomiarze stężenia DNA metodami spektrofotometrycznymi, stosuj bufor użyty do elucji jako próbę ślepą (blank). Wyizolowany DNA można przechowywać w temperaturze 2-8 C do 4 tygodni, lub w -20 C przez dłuższy czas. Instrukcja dla użytkownika strona 18\n19 Protokół 3 Izolacja DNA z wymazówek Zanim zaczniesz Jeżeli pierwszy raz używasz zestawu Syngen DNA Mini Kit, najpierw przeczytaj wszystkie rozdziały poprzedzające protokoły. Upewnij się, że przygotowałeś wszystkie potrzebne odczynniki i sprzęty opisane w rozdziale Sprzęt i odczynniki potrzebne do wykonania procedury, a niedostarczone z zestawem. Upewnij się, że bufory płuczące i proteinaza K zostały przygotowane zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale Przygotowanie odczynników przed pierwszym użyciem. Jeżeli w którymś buforze wytrącił się precypitat, rozpuść go inkubując w 37 C przez kilka minut i mieszając. Doprowadź wszystkie bufory do temperatury pokojowej (15-25 C). Nastaw łaźnię wodną, blok grzejny lub termomikser na 60 C. Doprowadź próbki do temperatury pokojowej (15-25 C) i dokładnie je wymieszaj. Przygotuj dodatkową porcję buforu DLK. Przygotuj nożyczki lub obcinak. Procedura 1. Włóż wymazówkę z wymazem do 2 ml probówki (nie dostarczono) i obetnij krótko patyczek. Dodaj 600 ul PBS (nie dostarczono), zamknij i wymieszaj. Zwiruj krótko probówki, aby usunąć krople z wieczka. Jeśli wymagane jest DNA wolne od RNA, dodaj 4 ul roztworu RNazy A o stężeniu 100 mg/ml (nie dostarczono), wymieszaj i inkubuj 2 minuty w temperaturze pokojowej. 2. Dodaj 20 ul roztworu proteinazy K oraz 600 ul buforu DLK, zamknij i wymieszaj na worteksie. Upewnij się, że roztwory zmieszały się całkowicie i zawartość probówki jest homogenna. Inkubuj w 60 C przez 15 minut, mieszając na worteksie co 3-5 minut. Zwiruj krótko probówki, aby usunąć krople z wieczka. Nie wolno mieszać buforu DLK bezpośrednio z proteinazą K przed dodaniem do próbki. Instrukcja dla użytkownika strona 19\n20 3. Dodaj 600 ul etanolu (96-100%), zamknij i zmieszaj na worteksie przez 30 sekund. Upewnij się, że roztwory zmieszały się całkowicie i zawartość probówki jest homogenna. 4. Umieść kolumienkę w probówce 2 ml do płukania. Zwiruj krótko probówki z lizatem, aby usunąć krople z wieczka. Przenieś lizat na kolumienkę. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Jeśli objętość lizatu w punkcie 5 jest większa niż 700 ul, przenoś na kolumnę tylko 700 ul na raz, wiruj usuń przesącz (nie wyrzucaj probówki) i powtarzaj, aż do nałożenia całego lizatu na kolumnę. 5. Przenieś kolumienkę do nowej probówki 2 ml i wyrzuć przesącz razem ze starą probówką. Dodaj do kolumienki 500 ul buforu DP1. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. 6. Dodaj do kolumienki 750 ul buforu DP2. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. 7. Wiruj przez 3 minuty z maksymalną prędkością, aby wysuszyć membranę i pozbyć się z kolumienki resztek buforów zawierających etanol. Upewnij się, że w rogu kolumienki nie został żaden płyn. Ewentualnie usuń go pipetą i powtórz wirowanie. 8. Przenieś kolumienkę do probówki elucyjnej 1,5 ml i wyrzuć starą probówkę z resztkami buforu płuczącego. Ostrożnie, nie dotykając membrany, dodaj na sam środek membrany 200 ul buforu do elucji DE lub wody o ph=7,5-9,0. Zamknij wieczko i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aż bufor wsiąknie w membranę. Instrukcja dla użytkownika strona 20\n21 Wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Objętość elucji i warunki inkubacji mogą być inne. Więcej na temat elucji znajdziesz w rozdziale Elucja DNA. 9. Ostrożnie wysuń kolumienkę i zamknij wieczko w probówce z wyizolowanym DNA. Nie wyrzucaj kolumienki do czasu określenia stężenia wyizolowanego DNA. Jak w przypadku każdej metody chromatograficznej, niewłaściwe ph wody użytej do elucji może wyraźnie zmniejszyć wydajność elucji, a nawet uniemożliwić ją, powodując pozostanie całego DNA na kolumience. Przy pomiarze stężenia DNA metodami spektrofotometrycznymi, stosuj bufor użyty do elucji jako próbę ślepą (blank). Wyizolowany DNA można przechowywać w temperaturze 2-8 C do 4 tygodni, lub w -20 C przez dłuższy czas. Instrukcja dla użytkownika strona 21\n22 Protokół 4 Izolacja DNA z próbek mrożonej krwi Zanim zaczniesz Jeżeli pierwszy raz używasz zestawu Syngen DNA Mini Kit, najpierw przeczytaj wszystkie rozdziały poprzedzające protokoły. Upewnij się, że przygotowałeś wszystkie potrzebne odczynniki i sprzęty opisane w rozdziale Sprzęt i odczynniki potrzebne do wykonania procedury, a niedostarczone z zestawem. Upewnij się, że bufory płuczące i proteinaza K zostały przygotowane zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale Przygotowanie odczynników przed pierwszym użyciem. Jeżeli w którymś buforze wytrącił się precypitat, rozpuść go inkubując w 37 C przez kilka minut i mieszając. Doprowadź wszystkie bufory do temperatury pokojowej (15-25 C). Nastaw łaźnię wodną, blok grzejny lub termomikser na 60 C. Nastaw łaźnię wodną, blok grzejny lub termomikser na 70 C. Doprowadź próbki do temperatury pokojowej (15-25 C) i dokładnie je wymieszaj. Procedura 1. Do eppendorfki (nie dostarczono) dodaj 200 ul mrożonej krwi. Próbki o objętości mniejszej niż 200 ul dopełnij przy użyciu PBS (nie dostarczono) i wymieszaj. Jeśli wymagane jest DNA wolne od RNA, dodaj 4 ul roztworu RNazy A o stężeniu 100 mg/ml (nie dostarczono), wymieszaj i inkubuj 2 minuty w temperaturze pokojowej. 2. Dodaj 20 ul roztworu proteinazy K oraz 200 ul buforu DLK, zamknij i wymieszaj na worteksie. Upewnij się, że roztwory zmieszały się całkowicie i zawartość probówki jest homogenna. Inkubuj w 60 C przez 15 minut, mieszając na worteksie co 3-5 minut. Zwiruj krótko probówki, aby usunąć krople z wieczka. Nie wolno mieszać buforu DLK bezpośrednio z proteinazą K przed dodaniem do próbki. Jeśli liza enzymatyczna nie zachodzi całkowicie, można zwiększyć stosowaną ilość roztworu proteinazy K do 30 ul. Instrukcja dla użytkownika strona 22\n23 3. Opcjonalnie: Jeśli liza enzymatyczna zaszła niewydajnie, inkubuj w 70 C przez 15 minut, mieszając co 3 minuty poprzez odwrócenie probówki, aż do całkowitej lizy komórek. 4. Dodaj 200 ul etanolu (96-100%), zamknij i zmieszaj na worteksie przez 30 sekund. Upewnij się, że roztwory zmieszały się całkowicie i zawartość probówki jest homogenna. 5. Umieść kolumienkę w probówce 2 ml do płukania. Zwiruj krótko probówki z lizatem, aby usunąć krople z wieczka. Przenieś lizat na kolumienkę. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 6. Przenieś kolumienkę do nowej probówki 2 ml i wyrzuć przesącz razem ze starą probówką. Dodaj do kolumienki 500 ul buforu DP1. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. 7. Dodaj do kolumienki 750 ul buforu DP2. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. 8. Wiruj przez 3 minuty z maksymalną prędkością, aby wysuszyć membranę i pozbyć się z kolumienki resztek buforów zawierających etanol. Upewnij się, że w rogu kolumienki nie został żaden płyn. Ewentualnie usuń go pipetą i powtórz wirowanie. 9. Przenieś kolumienkę do probówki elucyjnej 1,5 ml i wyrzuć starą probówkę z resztkami buforu płuczącego. Ostrożnie, nie dotykając membrany, dodaj na sam środek membrany 200 ul buforu do elucji DE lub wody o ph=7,5-9,0. Zamknij wieczko i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aż bufor wsiąknie w membranę. Instrukcja dla użytkownika strona 23\n24 Wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Objętość elucji i warunki inkubacji mogą być inne. Więcej na temat elucji znajdziesz w rozdziale Elucja DNA. 10. Ostrożnie wysuń kolumienkę i zamknij wieczko w probówce z wyizolowanym DNA. Nie wyrzucaj kolumienki do czasu określenia stężenia wyizolowanego DNA. Jak w przypadku każdej metody chromatograficznej, niewłaściwe ph wody użytej do elucji może wyraźnie zmniejszyć wydajność elucji, a nawet uniemożliwić ją, powodując pozostanie całego DNA na kolumience. Przy pomiarze stężenia DNA metodami spektrofotometrycznymi, stosuj bufor użyty do elucji jako próbę ślepą (blank). Wyizolowany DNA można przechowywać w temperaturze 2-8 C do 4 tygodni, lub w -20 C przez dłuższy czas. Instrukcja dla użytkownika strona 24\n25 Protokół 5 Izolacja DNA z krwi zwierząt Zanim zaczniesz Jeżeli pierwszy raz używasz zestawu Syngen Blood/Cell DNA Mini Kit, najpierw przeczytaj wszystkie rozdziały poprzedzające protokoły. Upewnij się, że przygotowałeś wszystkie potrzebne odczynniki i sprzęty opisane w rozdziale Sprzęt i odczynniki potrzebne do wykonania procedury, a niedostarczone z zestawem. Upewnij się, że bufory płuczące i proteinaza K zostały przygotowane zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale Przygotowanie odczynników przed pierwszym użyciem. Jeżeli w którymś buforze wytrącił się precypitat, rozpuść go inkubując w 37 C przez kilka minut i mieszając. Doprowadź wszystkie bufory do temperatury pokojowej (15-25 C). Nastaw łaźnię wodną, blok grzejny lub termomikser na 60 C. Doprowadź próbki do temperatury pokojowej (15-25 C) i dokładnie je wymieszaj. Przygotuj PBS Procedura 1. Do eppendorfki (nie dostarczono) dodaj 50 ul krwi o erytrocytach bezjądrzastych (większość ssaków) lub 5-10 ul krwi o erytrocytach jądrzastych (np. ryby i ptaki) 2. Dopełnij do objętości 200 ul przy użyciu PBS, zamknij i wymieszaj na worteksie. 3. Zwiruj krótko probówki, aby usunąć krople z wieczka. 4. Przejdź do Protokołu 1 Izolacja DNA z próbek świeżej krwi, osocza, surowicy lub kożuszka leukocytarnego, zacznij krok 1 od miejsca zaznaczonego białą strzałką. Instrukcja dla użytkownika strona 25\n26 Samodzielne rozwiązywanie problemów Za niska czystość A260/A280 Przyczyna Zanieczyszczenia wprowadzone przez użytkownika Niewydajna liza z powodu za dużej ilości komórek w próbce Niewydajna liza z powodu małej aktywności proteinazy K Niewydajna liza z powodu niedokładnego wymieszania z buforem DLK Niewydajna liza z powodu niewystarczających warunków inkubacji Nie dodano etanolu do próbki przed nałożeniem na kolumnę lub zastosowano etanol o złym stężeniu Nie dodano etanolu do buforów płuczących przed pierwszym użyciem lub zastosowano etanol o złym stężeniu Rozwiązanie Stosuj się do wskazówek w rozdziale Ogólne wytyczne dotyczące obsługi zestawów Syngen DNA 3 akapit. Nakładaj bufory i próbki do wnętrza kolumny, nie zanieczyszczając brzegu kolumny Powtórz izolację. Zmniejsz ilość próbki do objętości zalecanej - Powtórz izolację. Użyj świeżej proteinazy K - Powtórz izolację. Przedłuż trawienie - Nie mieszaj proteinazy K z buforem DLK przed dodaniem do próbki Powtórz izolację. Mieszaj dokładnie próbkę z buforem DLK Powtórz izolację. Wydłuż inkubację w 60 st. Powtórz izolację, nie pomijaj żadnego kroku, upewnij się, ze używasz etanolu minimum 96% Powtórz izolację, przygotuj prawidłowo bufory, upewnij się, że używasz etanolu minimum 96% Za wysoki stosunek A260/A280 Przyczyna Duża zawartość RNA w izolacie z powodu pominięcia trawienia RNazą Duża zawartość RNA w izolacie z powodu niewłaściwego wykonania trawienia RNazą Rozwiązanie Powtórz izolację, wykonaj opcjonalne trawienie RNazą (drugi akapit za białą strzałką) Powtórz izolację, nie dodawaj buforu DLK przed trawieniem RNazą Instrukcja dla użytkownika strona 26\n27 Mała lub zerowa wydajność izolacji Przyczyna Mało komórek w próbce Niewydajna liza z powodu za dużej ilości komórek w próbce Niewydajna liza z powodu małej aktywności proteinazy K Niewydajna liza z powodu niedokładnego wymieszania z buforem DLK Niewydajna liza z powodu niewystarczających warunków inkubacji Nie dodano etanolu do próbki przed nałożeniem na kolumnę lub zastosowano etanol o złym stężeniu Nie dodano etanolu do buforów płuczących przed pierwszym użyciem lub zastosowano etanol o złym stężeniu Niewydajna elucja wodą o za niskim ph (niższe niż ) Niewydajna elucja bufor nie wsiąkł w membranę Niewydajna elucja w powodu przedziurawienia membrany Rozwiązanie - Powtórz izolację, użyj kożuszka leukocytarnego - Powtórz izolację, użyj większej objętości i zwiększ proporcje buforów do etapu nakładania na kolumnę - Powtórz izolację, zastosuj nośnikowe DNA Powtórz izolację. Zmniejsz ilość próbki do objętości zalecanej - Powtórz izolację. Użyj świeżej proteinazy K - Powtórz izolację. Przedłuż trawienie - Nie mieszaj proteinazy K z buforem DLK przed dodaniem do próbki Powtórz izolację. Mieszaj dokładnie próbkę z buforem DLK Powtórz izolację. Wydłuż inkubację w 60 st. Powtórz izolację, nie pomijaj żadnego kroku, upewnij się, ze używasz etanolu minimum 96% Powtórz izolację, przygotuj prawidłowo bufory, upewnij się, ze używasz etanolu minimum 96% Wykonaj elucję ponownie buforem DE Powtórz elucję buforem DE - upewnij się, że nanosisz bufor na sam środek membrany - pozwól buforowi wsiąknąć w membranę - inkubuj 5 minut przed wirowaniem Powtórz izolację Instrukcja dla użytkownika strona 27\n28 Materiał po izolacji jest zdegradowany Przyczyna Próbka jest stara lub źle przechowywana Rozwiązanie Powtórz izolację na nowej próbce, izoluj DNA z próbek świeżych lub prawidłowo przechowywanych Brązowy osad na membranie w kolumnie Przyczyna Niewydajna liza z powodu za dużej ilości komórek w próbce Niewydajna liza z powodu małej aktywności proteinazy K Niewydajna liza z powodu niedokładnego wymieszania z buforem DLK Niewydajna liza z powodu niewystarczających warunków inkubacji Nie dodano etanolu do próbki przed nałożeniem na kolumnę lub zastosowano etanol o złym stężeniu Nie dodano etanolu do buforów płuczących przed pierwszym użyciem lub zastosowano etanol o złym stężeniu Rozwiązanie Powtórz izolację. Zmniejsz ilość próbki do objętości zalecanej - Powtórz izolację. Użyj świeżej proteinazy K - Powtórz izolację. Przedłuż trawienie - Nie mieszaj proteinazy K z buforem DLK przed dodaniem do próbki Powtórz izolację. Mieszaj dokładnie próbkę z buforem DLK Powtórz izolację. Wydłuż inkubację w 60 st. Powtórz izolację, nie pomijaj żadnego kroku, upewnij się, ze używasz etanolu minimum 96% Powtórz izolację, przygotuj prawidłowo bufory, upewnij się, ze używasz etanolu minimum 96% Kolumienka zatkała się Przyczyna Skrzep w próbce Próbka jest zbyt gęsta lub lepka Niewydajna liza z powodu małej aktywności proteinazy K Rozwiązanie Powtórz izolację z nowej próbki. Pobierając krew stosuj się do wskazówek z rozdziału Materiał wyjściowy i wydajność DNA, w tym zastosuj antykoagulant Powtórz izolację z mniejszej ilości próbki. - Powtórz izolację. Użyj świeżej proteinazy K - Powtórz izolację. Przedłuż trawienie - Nie mieszaj proteinazy K z buforem DLK przed dodaniem do próbki Instrukcja dla użytkownika strona 28\n29 Protokół skrócony 1 Izolacja DNA z próbek świeżej krwi, osocza, surowicy lub kożuszka leukocytarnego Przed zastosowaniem protokołu skróconego należy zapoznać się z protokołami w pełnej wersji oraz z rozdziałami poprzedzającymi protokoły, opisującymi przygotowanie materiału oraz teorię. Przygotuj potrzebny sprzęt i odczynniki Rozcieńcz bufory płuczące i rozpuść proteinazę K Doprowadź wszystkie bufory do temperatury pokojowej (15-25 C) Doprowadź próbki do temperatury pokojowej (15-25 C) i dokładnie je wymieszaj. Procedura 1. Do eppendorfki dodaj 200 ul próbki oraz 200 ul buforu DLK i wymieszaj. 2. Dodaj 20 ul roztworu proteinazy K, inkubuj w 60 C przez 15 minut, mieszając na worteksie co 3-5 minut, aż do całkowitej lizy komórek. 3. Dodaj 200 ul etanolu (96-100%), zamknij i zmieszaj na worteksie przez 30 sekund. 4. Przenieś całą zawartość probówek na kolumienkę umieszczoną w probówce 2 ml do płukania i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 5. Przemyj kolumienkę w nowej probówce 500 ul buforu DP1 i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 6. Przemyj kolumienkę w tej samej probówce 750 ul buforu DP2 i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 7. Dosusz membranę przez wirowanie 3 minuty z maksymalną prędkością w pustej probówce. 8. Przenieś kolumienkę do probówki elucyjnej 1,5 ml i ostrożnie, nie dotykając membrany, dodaj na sam środek membrany 200 ul buforu do elucji DE lub wody o ph=7,5-9,0. Zamknij wieczko i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aż bufor wsiąknie w membranę. Wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Instrukcja dla użytkownika strona 29\n30 Protokół skrócony 2 Izolacja DNA z hodowli komórkowych Przed zastosowaniem protokołu skróconego należy zapoznać się z protokołami w pełnej wersji oraz z rozdziałami poprzedzającymi protokoły, opisującymi przygotowanie materiału oraz teorię. Przygotuj potrzebny sprzęt i odczynniki Rozcieńcz bufory płuczące i rozpuść proteinazę K Doprowadź wszystkie bufory do temperatury pokojowej (15-25 C) Doprowadź próbki do temperatury pokojowej (15-25 C) i dokładnie je wymieszaj. Procedura 1. Zbierz 5x10 6 komórek, przemyj w PBS, zawieś w 200 ul PBS w eppendorfce 1,5 ml, dodaj 200 ul buforu DLK i wymieszaj. 2. Dodaj 20 ul roztworu proteinazy K, inkubuj w 60 C przez 15 minut, mieszając na worteksie co 3-5 minut, aż do całkowitej lizy komórek. 3. Dodaj 200 ul etanolu (96-100%), zamknij i zmieszaj na worteksie przez 30 sekund. 4. Przenieś całą zawartość probówek na kolumienkę umieszczoną w probówce 2 ml do płukania i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 5. Przemyj kolumienkę w nowej probówce 500 ul buforu DP1 i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 6. Przemyj kolumienkę w tej samej probówce 750 ul buforu DP2 i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 7. Dosusz membranę przez wirowanie 3 minuty z maksymalną prędkością w pustej probówce. 8. Przenieś kolumienkę do probówki elucyjnej 1,5 ml i ostrożnie, nie dotykając membrany, dodaj na sam środek membrany 200 ul buforu do elucji DE lub wody o ph=7,5-9,0. Zamknij wieczko i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aż bufor wsiąknie w membranę. Wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Instrukcja dla użytkownika strona 30\n31 Protokół skrócony 3 Izolacja DNA z wymazówek Przed zastosowaniem protokołu skróconego należy zapoznać się z protokołami w pełnej wersji oraz z rozdziałami poprzedzającymi protokoły, opisującymi przygotowanie materiału oraz teorię. Przygotuj potrzebny sprzęt i odczynniki Rozcieńcz bufory płuczące i rozpuść proteinazę K Doprowadź wszystkie bufory do temperatury pokojowej (15-25 C) Doprowadź próbki do temperatury pokojowej (15-25 C) i dokładnie je wymieszaj. Procedura 1. Wymazówkę z obciętym patyczkiem umieść w probówce 2 ml, dodaj 600 ul PBS oraz 600 ul buforu DLK i wymieszaj. 2. Dodaj 20 ul roztworu proteinazy K, inkubuj w 60 C przez 15 minut, mieszając na worteksie co 3-5 minut, aż do całkowitej lizy komórek. 3. Dodaj 600 ul etanolu (96-100%), zamknij i zmieszaj na worteksie przez 30 sekund. 4. Przenieś całą zawartość probówek na kolumienkę umieszczoną w probówce 2 ml do płukania i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 5. Przemyj kolumienkę w nowej probówce 500 ul buforu DP1 i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 6. Przemyj kolumienkę w tej samej probówce 750 ul buforu DP2 i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. 7. Dosusz membranę przez wirowanie 3 minuty z maksymalną prędkością w pustej probówce. 8. Przenieś kolumienkę do probówki elucyjnej 1,5 ml i ostrożnie, nie dotykając membrany, dodaj na sam środek membrany 200 ul buforu do elucji DE lub wody o ph=7,5-9,0. Zamknij wieczko i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aż bufor wsiąknie w membranę. Wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Instrukcja dla użytkownika strona 31\n32 Instrukcja dla użytkownika strona 32


Śpieszmy się kupować oferty do Grecji, tak szybko się sprzedają? Według prognoz Instytutu Traveldata, ta parafraza wiersza ks. Jana Twardowskiego może przyświecać klientom biur podróży. Zdaniem analityków warto się pospieszyć z zakupem wyjazdu do Grecji, a zwlekanie może oznaczać zarówno mniejszy wybór ofert, jak i mniej atrakcyjne ceny.\nTrzydziesty raport z systemu MerlinX dotyczący roku turystycznego 2016/2017, czyli wycieczek realizowanych w miesiącach listopad 2016 - październik 2017, obejmujący tydzień majówkowy wykazał dynamikę wzrostu sprzedaży najważniejszych dla branży wycieczek lotniczych w wysokości 11,9 procent. Był to pozornie stosunkowo słaby wzrost, gdyż o ponad 11 procent niższy od zanotowanego w ostatnim tygodniu kwietnia (23,5 procent), ale już wcześniej pisaliśmy kilkakrotnie o takim scenariuszu oczekiwanych wydarzeń. Niższa dynamika ma bowiem uzasadnienie faktem mniejszej liczby rzeczywistych dni roboczych wobec majówki sprzed roku, gdyż wypadł z nich wolny w wielu miejscach międzyświąteczny wtorek 2 maja.\nNa razie ta słabsza majówkowa sprzedaż obniżyła nieco wskaźnik skumulowanego wzrostu sprzedaży (czyli liczonego od początku first minute) z 23,9 do 23,6 procent. Z szacunkowych przeliczeń wynika jednak, że generalny trend wzrostu bieżącej sprzedaży nadal utrzymuje się w granicach dwudziestu kilku procent, a zatem na poziomie z końca kwietnia i zarazem prognozowanym przez Traveldata jeszcze na jesieni zeszłego roku. Zdaniem analityków instytutu, bardziej zaawansowane modele ważonych średnich degresywnych wskazują na maj (ewentualnie także pierwszą połowę czerwca) jako potencjalny okres szczególnie korzystnej dynamiki sprzedaży wycieczek, podczas gdy modele oparte na zwykłych nieważonych średnich 12-miesięcznych wskazywały raczej na marzec. Tak czy inaczej obecny okres jest dobry dla branży i ponownie można spodziewać się dynamicznych wzrostów sprzedaży i tak korzystna koniunktura powinna utrzymywać się nawet przez okres około 9-11 tygodni, czyli do czasu gdy dynamika sprzedaży wycieczek wejdzie w okres spadkowy tłumiona malejącą dynamiką wzrostu realnych dochodów gospodarstw domowych.\nZ raportu wynika również, że nadal dobrze sprzedaje się Turcja i Egipt, a niewielkie objawy spowolnienia zaczynają już być widoczne na najważniejszym dla polskich turystów kierunku, czyli w Grecji, gdzie jednak ceny nieco paradoksalnie wykazują wyraźne tendencje do wzrostu. Może to wynikać z rosnącego wyprzedania tego kierunku, zwłaszcza u liderów (Itaka, Grecos Holiday).\nTen znaczny stopień wyprzedania ma swoje źródło w bardzo w tym sezonie atrakcyjnych propozycjach ze strony biur Itaka i Grecos Holiday, co doprowadziło u obu tych organizatorów do bardzo wysokich wzrostów skumulowanej sprzedaży rzędu 50 procent, czyli znacząco większej niż wynosi skala przyrostu przygotowanych przez nich programów czarterowych na kierunkach greckich. Taka powodowała stale rosnące ryzyko korekt w górę cen wycieczek do tego kraju, co zresztą w przypadku Itaki już nastąpiło.\nObecny rozwój sytuacji w zakresie sprzedaży powoduje, że ryzyko wypadnięcia poza przedział prognozy sformułowanej na jesieni przez Instytut Traveldata ustawicznie maleje. Przypomnijmy, że był to wzrost (liczby imprez lotniczych) w przedziale 19-22 procent w wariancie ostrej walki politycznej i 22-25 procent w wariancie "spokojniejszym", z ówczesnego punktu widzenia nieco mniej prawdopodobnym.\nZasadniczym czynnikiem popytotwórczym, w uproszczeniu, jest dynamika wzrostu dochodów realnych gospodarstw domowych, a ważnymi czynnikami dodatkowymi o charakterze korygującym są zmiany poziomu optymizmu konsumenckiego i poziomu obaw przed terroryzmem.Dynamika wzrostu dochodów gospodarstw domowych ma w Polsce (obecnie) dwa zasadnicze aspekty tj. realne dochody z pracy najemnej oraz dochody z wypłat związanych z programem Rodzina 500 plus. O ile wypłaty z programu przebiegają zgodnie z założeniami, to dynamika wzrostu realnych wynagrodzeń zaczęła już nieco hamować. Potwierdzają to zarówno ostatnie dane rynkowe (najnowsze ukażą się w czwartek 18 maja), jak też obniżanie prognoz ich wzrostu (np. ostatni raport o inflacji Narodowego Banku Polskiego). W tym sezonie nie będzie to miało jeszcze większego negatywnego wpływu na koniunkturę w turystyce, ale może jej istotnie zaszkodzić już w sezonie 2017/18. Jako, że jest to czynnik decydujący o dynamice rozwoju branży do tematu tego będziemy periodycznie powracać. W przedsezonowej prognozie przyjęto słabnięcie lub co najwyżej stabilizację zjawiska terroryzmu, a zatem - jak to określono w stosownej prezentacji na listopadowej konferencji podczas TT Warsaw - dodatni wpływ zmian obaw przed terroryzmem na koniunkturę w turystyce. Jak na razie założenie to w pełni się potwierdza, aczkolwiek mogą wystąpić wydarzenia, które tę korzystną dla tegorocznej koniunktury sytuację mogą w pewnym, ale ograniczonym stopniu zakłócić.\nW przedsezonowej prognozie przyjęto prawdopodobny ujemny wpływ zmian nastojów na koniunkturę w turystyce. Było to o tyle uzasadnione, że z wielu źródeł dochodziły wieści, że prawdopodobnie nastąpi wzmożona eskalacja walki politycznej i "będzie gorąco". Na szczęście wydarzenia potoczyły się w dość korzystny dla turystycznej koniunktury sposób. Eskalacja rzeczywiście miała miejsce i to w sposób w Europie raczej niespotykany (kilkutygodniowa świąteczno-noworoczna okupacja sali parlamentu), ale w połowie stycznia sprawa uległa załagodzeniu - i jak to często bywa po zakończeniu wielkich konfliktów - nastąpił okres odprężenia i względnego spokoju. Ponieważ w międzyczasie narastał już strumień korzystnych dla Polski informacji gospodarczych, próbowano - w ramach walki politycznej- uruchamiać liczne tematy zastępcze, ale nie mają one już tej nośności, a poza tym traktowane są (zwłaszcza w Polsce B) z coraz większym pobłażaniem.\nPrzygotowane przez Traveldata zestawienie po raz dwudziesty pierwszy w tym roku obejmuje porównanie cen dla wylotów w wysokim sezonie letnim 2017 definiowanym jako pierwszy pełny tydzień tydzień sierpnia (07.08-13.08 2017), zebranych w dniu 11 maja tego roku z cenami z dnia 4 maja, a w porównaniach rok do roku z cenami z dnia 12 maja 2016 roku.\nPo dużym wzroście w pierwszym tygodniu maja (o 77 złotych) średnia cena wycieczek jeszcze poszła nieco w górę, a mianowicie o 14 złotych, przy czym na ostatnie wyhamowanie dynamiki zwyżek spory wpływ miały działania korekcyjne, zwłaszcza w odniesieniu do nieco przeholowanych wzrostów cen na kierunkach wschodnich, jak Egipt i Turcja i na Wyspach Kanaryjskich. Widać jednak, że w tym sezonie organizatorzy są generalnie lepszej myśli niż przed rokiem, gdyż wówczas korekta dotyczyła niemal całego rynku, a średnia cena spadła o 40 złotych, jako że pomajówkowy wzrost cen o średnio 112 złotych okazał się w tamtych warunkach stanowczo zbyt wysoki.\nNajwiększe spadki średnich cen imprez zanotowano w Hurghadzie (przed tygodniem był tam największy wzrost) - o 131 złotych oraz na kanaryjskich wyspach Gran Canarii i Teneryfie - o 120 i 105 złotych, a największe zwyżki średnich cen wystąpiły w Albanii, Maroku i na Chalkidiki - o odpowiednio 130, 113 i 94 złotych.\nBadanie średniej ceny imprez wobec cen sprzed roku dla wylotów z okresu pierwszego pełnego tygodnia sierpnia 2017 wskazuje, że obecna średnia cena jest wyższa wobec średniej ceny dla poprzedniego sezonu o 206 złotych i był to dość znaczący wzrost różnicy cen rok do roku po dwóch jej spadkach z rzędu, a wynikał on po części z faktu, ze przed rokiem ceny spadły o 40 złotych, o czym była już mowa wyżej. Przed rokiem tej porze średnia różnica cen rok do roku wykazywała minimalną zniżkę, a mianowicie o zaledwie 4 złote.\nGeneralnie wyższe ceny wycieczek w tym roku mogą być po części skutkiem znacznie silniejszego tegorocznego popytu i kolejnych dobrych jego perspektyw w nadchodzących miesiącach, ale stopniowo rosnącego znaczenia może nabierać powiększający się, zwłaszcza na niektórych kierunkach i w niektórych terminach, stopień wyprzedania najbardziej poszukiwanych ofert. Na wzrost popytu, a zatem i cen wobec analogicznego okresu roku ubiegłego oddziałuje też ewidentna poprawa nastrojów konsumenckich (o czym dalej w tym materiale) oraz stopniowo słabnące obawy przed terroryzmem w atrakcyjnych dla turystów regionach turystycznych.\nNadal zdecydowanie w kierunku zwyżek cen działają więc zasadnicze czynniki popytotwórcze w turystyce, a dodatkowy choć coraz bardziej słabnący wpływ na obecny średni wzrost cen wycieczek, wywierają też wyższe o 8 procent (poprzednio o 10, 19, 24, 30, 23 i 17 procent) ceny paliwa lotniczego (2,18 wobec 2,02 zł/litr), które odpowiadają za prawie 30 złotych ich wzrostu. Za to coraz wyraźniej w kierunku zniżek średnich cen zaczyna natomiast działać silniejszy złoty, bowiem umocnił się on rok do roku w relacji z euro już o około 4,5 procent, aczkolwiek nadal pozostaje na poziomie bliskim zeszłorocznemu wobec amerykańskiego dolara.\nSpośród dużych kierunków na pozycji lidera wzrostów cen wobec poprzedniego sezonu wśród najważniejszych dla polskich turystów kierunków ponownie umocniła się Grecja z średnim wzrostem cen o 303 złote (poprzednio było to 262, 293, 320, 271, 264, 233, 230, 223 i 213 złotych). Największe średnie zwyżki cen tradycyjnie zanotowała Kreta - o 461 złotych, nieco mniejsze Rodos - o 396 złotych, a jeszcze mniejsze Kos, Korfu i Zakynthos - o 292, 246 i 243 złote, do których po raz drugi od wielu tygodni nieco zbliżyło się dotychczas sporo tańsze niż w przed rokiem Chalkidiki, gdzie średnie ceny są już wyższe rok do roku o średnio 61 złotych.\nPozycję coraz bardziej tracącego dystans wicelidera wzrostów cen nadal zajmowały Wyspy Kanaryjskie, gdzie były one na poziomie o 194 złote wyższym od zeszłorocznego (poprzednio było to 207, 274, 356, 408, 339, 337, 305, 284 i 257 złotych). Największy dodatni wpływ na tę zwyżkę kolejny tradycyjnie wywierał wzrost cen na Teneryfie - o 267 złotych (poprzednio nawet o 327, 419, 520 i 601 złotych), natomiast w roli kierunku o najłagodniejszym wzroście cen rok do roku nieomal etatowego posiadacza tej pozycji, czyli wyspę Lanzarote, zastąpiła Fuerteventura ze zwyżką średniej ceny o 121 złotych.\nZ czwartej na trzecią pozycję ponownie powróciła Bułgaria, której ceny kształtowały się na poziomie o 104 złote wyższym niż w lecie 2016 (poprzednio było to 78, 118, 136, 122, 141, 157, 180, 150 i 115 złotych). Opiniom, popytowi i cenom w Bułgarii nadal nieco ciąży spora zeszłoroczna liczba reklamacji zgłaszanych przez polskich turystów, a stosunkowo niskie ceny, mimo że nieco niższe niż w Egipcie i o 200 złotych niższe niż w Turcji, mogą być przy wyższej jakości hoteli na tych ostatnich kierunkach za słabym argumentem dla po raz pierwszy wyjeżdżających na zagraniczne wakacje klientów z tzw. Polski B.\nZ trzeciej na czwartą pozycję na liście zwyżek cen rok do roku Ponownie powrócił Egipt, a średnie ceny były tam wyższe o 99 złotych niż przed rokiem (poprzednio były wyższe o 125, 84, 129, 140 i 134 złote, wcześniej niższe o 13, a jeszcze wcześniej wyższe o 48, 33 i 50 złotych). Tym razem najwyższe były wzrosty cen rok do roku w Marsa Alam - 232 złote, słabiej wzrosły średnie ceny na Synaju -o średnio 152 złote, a tańsza niż przed rokiem stała się Hurghada - o 61 złotych, która w ubiegłym sezonie, w odróżnieniu od dwóch poprzednich kierunków, nie była o tej porze przeceniana. Popytowi na ten kierunek nieco zaszkodziły kwietniowe zamachy na koptyjskie kościoły w północnym Egipcie, a w maju wyjaśniana dopiero sprawa śmierci polskiej turystki w egipskim szpitalu w Hurghadzie. Marże stały się w tym sezonie w Egipcie dość wysokie i pozwalają organizatorom na dokonywania znaczących regulacji cen w zależności od wahań poziomu bieżącego popytu.\nPiątą i najniższą pozycję listy zwyżek cen wśród najważniejszych kierunków nadal zajmowała Turcja, a średnie ceny po ostatnich zmianach były tam wyższe niż przed rokiem o 88 złotych (poprzednio były wyższe o 60, 79, 147, 99 i 90 złotych, wcześniej niższe o 18, a jeszcze wcześniej wyższe o 24, 54 i 57 złotych). Relatywnie atrakcyjnym cenom wycieczek do Turcji nadal sprzyja słaby popyt na ten kierunek ze strony turystów zachodnioeuropejskich, zwłaszcza niemieckich i holenderskich, który może być jeszcze jakiś czas kontynuowany ze względu na uprzedzenia tamtejszych społeczeństw wobec polityki wewnętrznej w tym kraju. Jest to bardzo sprzyjająca sytuacja dla materialnie dużo słabiej sytuowanych turystów z Polski, którzy na ogół w większym stopniu kierują się kryteriami czysto ekonomicznymi niż politycznymi.\nZ mniejszych kierunków nadal największe zwyżki cen rok do roku notowały Maroko i Majorka - o średnio o 428 i 291 złotych, w mniejszym stopniu wzrosły ceny wycieczek na Cyprze, Malcie i w Portugalii - o 223, 215 i 162 złote, a średnie ceny w Tunezji wzrosły bardzo niewiele - o 34 złote.\nPorównania zmian cen rok do roku u głównych organizatorów turystyki wskazują, że biurami o wyraźnie mniejszym niż przeciętny wzroście średnich cen (teraz jest to 206 złotych) są obecnie Coral Travel Wezyr i Exim Tours ze wzrostami w granicach 120 złotych oraz Sun&Fun, w którym ceny wzrosły średnio o około 135 złotych. Niewiele niższe wzrosty cen rok do roku od wymienionej przeciętnej prezentuje oferta biura Neckermann Polska - około 190 złotych, ale jego oferta była relatywnie droga przed rokiem. Po ostatnich podwyżkach wzrost w granicach średniej wykazuje oferta biura Itaka, a w pozostałych dużych biurach zwyżki średnich cen przekraczały już przeciętną i mieściły się w granicach 255 - 380 złotych.\nW tym, co dla turystów ma większe znaczenie, czyli w liczbie najatrakcyjniejszych poziomów bieżących cen wycieczek, czyli na pierwszym lub drugim miejscu na 24 kierunkach (dołączyły Malta i Albania) oraz w trzech kategoriach hoteli, to po ostatnich zmianach cen w biurze Itaka czołówka stała się bardziej wyrównana . Pozycję niezmiennego od samego początku sprzedaży first minute lidera zachowała Itaka, ale z nie tak wysoką jak poprzednio liczbą 22 najbardziej atrakcyjnych ofert (poprzednio 37) i wyprzedza biura Coral Travel Wezyr i Rainbow (20 i 19 takich ofert). O tej porze w ubiegłym sezonie liderem był Rainbow z liczbą 23 takich ofert przed biurami Exim Tours i Coral Travel Wezyr (19 i 17 ofert).\nSpośród mniejszych organizatorów wysoką liczbę atrakcyjnych cenowo propozycji oferują obecnie biuro Net Holiday - relatywnie bardzo wiele, bo aż 14 ofert, a także biuro Prima Holiday - 6 takich ofert.\nInstytut Traveldata przedstawia czołówkę organizatorów, którzy po najkorzystniejszych cenach oferowali w ostatnim tygodniu imprezy turystyczne klientom. W tego typu zestawieniach zachowana jest ścisła porównywalność, a zatem dla przykładu biuro Grecos Holiday, które sprzedaje jedynie Grecję, Majorkę i Cypr jest ofertowo porównywane tylko i wyłącznie z tymi destynacjami w innych biurach. Wypada na tym tle bardzo korzystnie, choć ogólna średnia cena statystyczna jego wycieczek nie jest niska, gdyż ma w niej ponadprzeciętnie tanich Egiptu, Tunezji lub Bułgarii, które wpływają na obniżanie ogólnej średniej ceny imprez w ofertach innych organizatorów.\nNa czele tabel już od wielu tygodni niemal niezmiennie królowały biura Itaka i Grecos Holiday, jednakże po ostatnich korektach cen w Itace sytuacja uległa zmianom, przy czym warto zaznaczyć, że Traveldata wskazywała na fakt, że "oba te biura anonsują wyjątkowo wysokie wzrosty sprzedaży, co może oznaczać ( ) rosnące prawdopodobieństwo zbliżania się korekt cen wycieczek w górę".\nOstatnie zmiany są jednak kierunkowo zbieżne z sytuacją z zeszłego sezonu, a pierwsza szóstka organizatorów była przed rokiem pod tym względem taka sama, z tą różnicą, że biuro Grecos Holiday oferowało wówczas ceny na relatywnie jeszcze nieco bardziej atrakcyjnym poziomie. W następnych tygodniach ubiegłego sezonu organizator ten krok po kroku podnosił ceny by w samym szczycie sezonu wakacyjnego przejść do poziomu cen znacznie bardziej zbliżonego do ogólnej średniej.\nZ tego można próbować wyciągać praktyczne wnioski, że akurat z zakupem "greckich wakacji" warto się jednak pospieszyć, a dalsze zwlekanie może być ryzykowne i oznaczać zarówno mniejszy wybór wypoczynku, jak i mniej korzystne ceny.\nPo ostatniej dwóch zwyżkach średnie ceny przelotów na kierunkach turystycznych wobec ostatniego zestawienia w liniach Ryanair z wylotami w badanym okresie (7-13 sierpnia), zanotowały umiarkowany spadek, a mianowicie z 780 do 752 złotych, czyli o 28 złotych lub o 3,6 procent (poprzednio wzrosły o 17 i 57 złotych, a wcześniej spadły aż o 218 złotych). Spadek odnotowano zarówno na kierunkach kanaryjskich- z 945 do 924 złotych, czyli o 21 złotych lub 2,2 procent, jak i na pozostałych kierunkach - z 741 do 712 złotych, czyli o 29 złotych lub 3,9 procent. Największe zniżki cen przelotów miały miejsce z Warszawy do Faro i na Sycylię - o średnio 225 i 195 złotych, a zwyżki z Katowic na Korfu - o 180 złotych.\nŚrednie ceny w liniach Wizzair po dwóch kolejnych zniżkach i stagnacji ponownie spadły, tym razem o 52 złote z 893 do 841 złotych, czyli o 5,8 procent (poprzednio symbolicznie wzrosły o 3 złote i spadły o 105 i 209 złotych). Najbardziej staniały rejsy z Katowic na Sardynię - o średnio 260 złotych, a zdrożały z Warszawy do Alicante i na Cypr- o 190 i 140 złotych.\nW porównaniach rok do roku średnie ceny w liniach Ryanair na kierunkach turystycznych pomimo ostatniego niedużego spadku stały się wyższe od poziomu z ubiegłego sezonu i wyniosły 764 wobec 746 złotych przed rokiem, czyli są wyższe o 18 złotych lub o 2,4 procent (poprzednio były niższe o 6, 12 i 103 złote, a wcześniej wyższe o 93 i 11 złotych). Średnie ceny przelotów na kierunkach kanaryjskich były nadal niższe aż o 140 złotych (13,2 procent) i wyniosły 924 wobec 1064 złotych przed rokiem, a na pozostałych kierunkach wzrosły rok do roku z 677 do 761 złotych, a zatem o 52 złote lub 12,4 procent. Najwięcej rok do roku zwyżkowały ceny rejsów z Katowic i z Warszawy na Korfu - o średnio 360 i 320 złotych, a spadły na połączeniach z Warszawy do Lizbony i z Wrocławia na Teneryfę - o średnio po 310 złotych.\nW liniach Wizzair średnie ceny były wyższe od poziomu ubiegłorocznego o 113 złotych (poprzednio były wyższe o 86, 94, 64, 227, 33, 317, 283 i 227 złotych). Najbardziej rok do roku zwyżkowały ceny rejsów z Warszawy do Lizbony - o średnio 465 złotych, a spadały z Katowic do Barcelony - o 220 złotych.\nGrecja wyjazd cena analiza traveldata wyjazd wczasy urlop turystyka\n[2017-05-16 11:56 80.52.226.*]\nBrawo PIS! tanie waluty i wysokie koszty wreszcie pomogą turystyce wyjazdowej!!!! powiem to swoim pracownikom, gdzie szukać pensji!!! odpowiedz »\n[2017-05-16 14:04 83.31.144.*]\nKonsekwentny, wieczny malkontent ... odpowiedz »\nRestauracja Relax Inn\nKorzystanie z serwisu oznacza bezwarunkową akceptację polityki prywatności, regulaminu i polityki cookies. Wygenerowano:2021-01-16 03:45:10


Plusy z trzezwosci + ataki szału - Strona 2 - Niepijemy\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/01 07:17\t#36\ntu chodzi raczej o stwierdzenie, że:\nile czasu "uczyłeś się pić" - tyle czasu będziesz musiał sobie wpajać nowe, trzeźwe nawyki myślowe i działanie,\ntak by mieć RADOŚĆ z trzeźwego życia.\nNie wiem tylko czy czas picia liczyć się od pierwszego kontaktu z alkoholem, czy mniej więcej\nod momentu picia problemowego.\nReasumując - to powiedzonko ma na celu raczej uświadomić alkoholikowi, że zdrowienie to proces\n- nie jakieś hop siup i po problemie.\nPogody ducha kochani.\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/01 08:43\t#37\nCześć Agnieszko. Tak jak i TY kawał czasu nie poznałem spokojnego i trzeźwego życia. Pozytywy!!! Dam jeden przykład, z mojego życia. Byłem kiedyś normalnym takim samym jak wszyscy chłopakiem i chodziłem na zabawy gdzie się tańczy. Nie umiałem zrozumieć czemu jestem traktowany inaczej niż mnie się wydawało że mój talent zasługuje. Przecież miałem genialny słuch i poczucie rytmu a ciągle nie byłem królem parkietu. Dziewczyny unikały mnie a ja czułem się coraz bardziej pokrzywdzony. Przecież nawet na rozluźnienie przed parkietem piłem i coraz więcej piłem a ciągle coś nie tak było. W końcu dałem sobie spokój z uprzejmym uśmiechaniem się i przestałem szukać radości na zabawie a pić przecież można w domu i taniej to wychodzi. tzn więcej alkoholu będzie.\nKiedy zaczynałem kolejny, ostatni już raz niepicie lekarze powiedzieli że nigdy nie będę normalnie się poruszał. Byłem tak zdeterminowany że - skoro nie będę chodził to poszedłem na kurs tańca. Nie ważne że coś nadal nie wychodziło. Z tego kielicha goryczy już dość wypiłem i zmiany były konieczne. Działałem więc w tym kierunku. Zmiany , zmiany. Wszystko co możliwe wykorzystać by zmieniać siebie jakim byłem na nowego.\nChodzę dziś w różne miejsca, nie piję trochę lat, tańczę i bawię się bez oczekiwań a znajomi twierdzą że niemożliwe jest mieć tyle spokoju i pogody ducha jakie w sobie noszę. Moja nerwowość i oczekiwania minęły wraz ze wzrostem poczucia wartości. Nic już nie potrzebuję udowadniać.\nNajwięcej skorzystałem od AA. Oni mówili o sobie a ja brałem: jak żyć, jak odnosić się do innych, do życia, do rzeczy i zwierząt, W końcu wiele lat trzeba było odbudować i zbudować. Nauczyć się żyć.\nKiedy się potkniesz i coś nie wyjdzie to: krótko: popraw koronę i działaj swoje dalej. Nie poddawaj się. Jeśli będziesz szukać odpowiedzi to je znajdziesz. Same do Ciebie nie przyjdą i nie załatwią nic za Ciebie. Pozdro.\nZa tę wiadomość podziękował(a): andrzejej, Kayo78, Alex75, Krysia 1967, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 12:12\t#38\nCześć, dzisiaj mija 53 dzien.\nPotrzebuje się wygadać..\nRano jest fajnie, nie budze się z kacem i nie mysle ze nie chce mi sie zyc. Ciesze sie, ze przetrwalam kolejny dzień.\nPotem jest troche gorzej.. jakos mi ostatnio ciezej. Teraz bylam u tesciow.. i jak to u nich godzina 12, ladny dzien i tylko "pstryk" jedno po drugim. Az mnie trzeslo aby sie napic i w koncu wyluzowac. Ostatanio nic innego nie robie tylko sie wszystkiego czepiam, mam pretensję i jestem poprostu wsciekla. Meczy mnie to bardzo, nie ma we mnie radości. Przychodzi mi nawet do glowy mysl ze po takim czasie napilabym sie piwka tylko z wiekszymi przerwami.. tak wiem ze nie ma czegos takiego jak kontrolowane picie. Nie wiem jak mam się zrelaksowac. Jestem caly czas spieta i zla.. mam wrazenie ze wszyscy sa przeciwko mnie. Czy sens jest trzymac sie trzezwosci jak sie jest takim nieszczęśliwym? Mam tylko nadzieje ze te czarne dni miną i bedzie troszke lzej..\nPrzepraszam za swoje uzalanie sie nad soba ale potrzebowalam gdzies to wydusic z siebie..\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 12:30\t#39\nGdyby choroba alkoholowa była w butelce, wystarczyłoby zakręcić butelkę i fajnie żyć. Ale choroba jest w człowieku, dlatego po zakręceniu butelki człowiek nadal jest chory i ta choroba jest w nim aktywna.\nDobra wiadomość: tę chorobę się leczy.\nZa tę wiadomość podziękował(a): jerzak, Zakapior, darek70, Rosalinda1985, Annaannaanna, Krysia 1967, Kiszony Ogór, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 13:38\t#40\nSpięcie i zdenerwowanie pojawia się z dwóch powodów.\nPo pierwsze alkoholik na początku drogi nie picia nie ma regulatora uczuć z którego zawsze korzystał.\nA po drugie i to jest poważniejsze wyzwanie. Alkoholik dowiedział się, że jest alkoholikiem i czuje, że coś stracił i coś mu zabrali, czegoś nie może zrobić. I powstaje bunt ponieważ nie zakceptował siebie jako alkoholika i związanych z tym konsekwencji.\nDopóty, dopóki nie znajdziesz prawdziwej akceptacji to zdenerwowanie będzie przychodzić i takie pytania. Czy jest sens nie pić.\nA jest sens pić, odśwież pamięć i sobie przypomnij jak byłaś zniewolona przez alkohol i rytuał picia.\nJednak aby akceptacją nastąpiło potrzeba czasu i przeramowania w głowie pewnych, przekonań i zachowań.\nŻyczę Ci tradycyjnie dużo cierpliwości i konsekwencji.\nZa tę wiadomość podziękował(a): Krysia 1967, Alicja, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 13:46\t#41\nAgnieszko, a jak często pracujesz z terapeutką?\nPoczątki są trudne, a Ty zafundowałaś sobie wielogodzinny kontakt z wyzwalaczem, więc nie dziwi mnie wcale, że Cię nosi.\nU mnie wyglądało to tak, że przez pierwszy rok terapii, pracowałam z 6 godzin tygodniowo z grupą i 1 godzinę tygodniowo z terapeutą indywidualnym. Te cykliczne 7 godzin, przez pierwsze 52 tygodnie, bardzo mocno pomagały mi być blisko siebie i swojego procesu trzeźwienia.\nByć może, potrzebujesz trochę więcej? Przerabiałaś już z terapeutką jak unikać niebezpiecznych sytuacji, jak rozpoznawać i neutralizować głody?\nZa tę wiadomość podziękował(a): siwy, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 13:54\t#42\nAndrzeju fajnie, że mi tłumaczysz, po co powstała ta historia. W każdym razie jak napisałem u mnie poszło zdecydowanie szybciej.\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 14:54\t#43\nJa wlasnie od poczatku rozmawialam z terapeutka przez telefon (jest z innego miasta) i mysle ze rozmawialam z nia tak bardziej ogolnikowo, skierowala mnie tutaj na te forum i teraz ten kontakt nam sie urwal.. musze poszukac kogos na miejscu bo sama nic nie zdzialam. Weszlam tez ostatnio na mityng online ale ze ja nie jestem osoba zbyt wierzaca to co drugie slowo ludzi Bog to i tamto mnie troszeczke odstraszylo. Od razu napisze, ze nie neguje tego - szanuje to ze komus to pomaga.\nChcialabym chodzić na terapie stacjonarnie ale mam problem w tym, ze maz duzo pracuje i czesto wyjezdza a ja siedze w domu z synkiem. Choc w sumie jakby mi sie udalo chociaz raz na 2 tygodnie pojsc to zawsze to lepsze niz nic\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 15:05\t#44\nAgnieszko jest dokładnie tak, jak piszesz. Jak wybierzesz terapeutę/kę, to będziesz mogła się dogadać co do tego, ile, gdzie i kiedy będą odbywać się sesje. Niektórzy chodzą 2 razy w tygodniu, inni raz w miesiącu i obu tym grupom to służy .\nZ kolejnych dobrych wiadomości, to ostatnio się dowiedziałam, że mózg potrzebuje około roku, żeby zregenerować się po piciu. Nie oznacza to, że po tym czasie nie jest się alkoholikiem, ale wszystkie najtrudniejsze nawyki czy mocne wyzwalacze przestają mieć aż takie znaczenie. Więc podsumowując - będzie lepiej!\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 15:15\t#45\n.. mózg potrzebuje około roku, żeby zregenerować się po piciu. Nie oznacza to, że po tym czasie nie jest się alkoholikiem, ale wszystkie najtrudniejsze nawyki czy mocne wyzwalacze przestają mieć aż takie znaczenie. Więc podsumowując - będzie lepiej!\nO tak to dobra wiadomość\nja duzo tutaj czytam bo jak widze wasze wpisy ze nie pijecie juz xx lat i naprawde czujecie sie dobrze, jestescie szczesliwi i wcale wam nie brakuje alkoholu to znaczy tylko to ze sie da..\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 17:42\t#46\nTylko doczytaj sobie jeszcze, co my robiliśmy, żeby te xx lat nie pić i cieszyć się życiem.\nSam upływ czasu niewiele zmienia, liczy się głównie to co my z tym czasem robimy.\nZa tę wiadomość podziękował(a): jerzak, Krzysztof Z., Zakapior, Alex75, marcin, Alicja, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/09 17:49\t#47\nTak wiem, czytam. Dlatego tez chce zmienic terapeute i sprobowac dostac się gdzies na terapie stacjonarna a nie tylko on-line.\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 13:16\t#48\nPowiedzcie mi proszę czy jest tutaj osoba ktora jest juz jakis czas trzezwym alkoholikiem i nie przerabiala z wyboru 12 krokow? Z jakiej innej pomocy korzystaliscie?\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 13:19\t#49\nTerapia alkoholizmu, u mnie całość trwała łącznie ok 2 lat. Do tego wsparcie w realu i telefoniczne ze strony trzeźwych alkoholików, trochę bywałem na mitingach AA, do tego forum.\nZa tę wiadomość podziękował(a): Tomoe, Zakapior, Krysia 1967, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 16:35\t#50\n6 tyg terapii,i luzne kontakty z moim terapeuta prowadzacym z osrodka,luzne znaczy jak mialem jakis problem to moglem zawsze zadzwonic,a oprocz tego raz na 2 miechy spotkanie i pogawedka,teraz po 3 latach trzezwienia i covid rzadziej,ale wiem jak bede mial problem to moge walic do Niego jak w dym,no i sporadycznie mityngi AA,a sporadycznie dlatego ze sie nakrecam po nich za mocno czasami przezywam i rozkminiam,takze jak mam luzniejszy czas i potrzebe to miting tez zachacze,a jak prace i duzo obowiazkow to odpuszczam bo wtedy zasnac nie moge za duzo rozmyslan,tak mam po prostu i tyle pozdrawiam!\nZa tę wiadomość podziękował(a): Krzysztof Z., marcin, Krysia 1967, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 18:06\t#51\nJeśli pytasz między wierszami czy kroki to jedyna droga do trzeźwości to odpowiedź brzmi nie.\nAni z wyboru, ani z przymusu nie pracowałem na krokach i nie chodzę i nie chodziłem na mitingi aa.\nI myślę, że już jakiś czas jestem trzeźwy.\nZ czego korzystałem.\nChodziłem raz w tygodniu na grupę wsparcia w klubie abstynenta i pracowałem godzinkę raz w tygodniu z terapeutką. I tak około przez pięć lat. Może wydaje się to bardzo długi okres czasu, ale bardzo szybko mi ten czas zleciał i były to działania w pełni dobrowolne.\nDziś korzystam jedynie z forum na którym się znalazłem po 18 miesięcznej abstynencji.\nPozdrawiam ciepło i życzę Ci znalezienia najlepszej drogi. Zdecydowanie ważniejsze od tego z jakich rozwiązań skorzystasz jest fakt, abyś je wykorzystała w swoim życiu i pamiętała, że najważniejsza w tym procesie jesteś Ty i Twoja odpowiedzialność za decyzje.\nZa tę wiadomość podziękował(a): jerzak, Krysia 1967, dzordzklunej, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 19:58\t#52\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 20:08\t#53\nJa zaczynałam zdrowienie od terapii uzależnień i mityngów AA, potem robiłam terapię współuzależnienia i terapię DDA. Równolegle byłam cały czas w AA - uczestniczyłam w mityngach, pełniłam służby. Natomiast program 12 kroków AA zrobiłam ze sponsorką w dziewiątym roku swojej abstynencji od alkoholu, gdy byłam w silnym kryzysie. Teraz mogę powiedzieć, że na szczęście Bóg czasem zsyła kryzysy...\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 20:29\t#54\nPowtórzę to co chyba juz wczesniej pisalam, ze jestem naprawde przerazona tym, ze bede musiala na siebie uważać do końca życia, ze tak naprawde zawsze moge sie zlamac i wrocic do picia.\nW co ja sie wpakowalam..\nNie rozumiem tez dlaczego jedni moga np pic pare dni na jakims urlopie a potem 3 miesiace nic a nic i wcale ich do tego nie ciagnie, nie mysla w ogole o tym aby sie napic a drudzy jak ja sa uzaleznieni.\nGlowa az boli od tych przemyslen..\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 20:44\t#55\nNikt nie zna odpowiedzi na to pytanie, dlaczego jedni się uzależniają od alkoholu, a inni nie.\nNie warto sobie zadawać pytania "Dlaczego ja?" bo to tylko użalanie się nad sobą.\nSą ludzie, którzy mają taką skazę, że nie wolno im jeść białka, bo mogą od tego umrzeć. Ja mam taką skazę, że nie mogę pić alkoholu, bo mogę od tego umrzeć. Zamiast się nad sobą użalać, nauczyłam się akceptować ograniczenia mojego organizmu i żyć z nim w zgodzie, i nie dostarczać mu tego, co go niszczy.\nZa tę wiadomość podziękował(a): Zakapior, Annaannaanna, Krysia 1967, dzordzklunej, Kiszony Ogór, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 20:57\t#56\ntak, to prawda, jest to użalanie się nad sobą - zdaje sobie z tego sprawę ale ciężko mi się tego wyzbyć. ii dobrze napisane, dziękuje\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 21:05\t#57\nwlasnie ogladam program z chlopakiem ktory ma czterokonczynowe porazenie i sie z tym juz pogodzil wyglada na pozytywnie nastawionego do zycia mimo ograniczen ktorych nie jestem w stanie sobie wyobrazic,takze ja swoj alkoholizm i drobne ograniczenia,ale takze dobrodziejstwa biere w ciemno acha i jeden z terapeutow podczas mojego pobytu w osrodku powiedzial,ze nie ma ludzi zdrowych sa tylko nie zdiagnozowani wiec ja jestem krok do przodu znam swa przypadlosc i nic tylko dzialac i zdrowiec!pozdrawiam\nZa tę wiadomość podziękował(a): Tomoe, Krysia 1967, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/16 21:35\t#58\nJak już za bardzo sie wkrecam w te swoje uzalania i nieszczesliwosci to tez zaczynam sobie mowic "kurde masz 2 rece, 2 nogi, dach nad glowa.. nie ktorzy nawet tego nie maja, zejdz na ziemie dziewczyno" na trochę to pomaga ale pozniej znowu wracaja te moje doly.\nMoja terapeutka zasugerowala abym udala sie do psychiatry po leki.. ale ja nie chce zadnych lekow. Lubie/lubiłam zmieniać sobie swiadomosc i nie raz kombinowalam z roznymi lekami. Nie ufam sobie na tyle aby wziac cos silnego na recepte.\nZa tę wiadomość podziękował(a): Krysia 1967, Michal84, dzordzklunej\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/17 06:31\t#59\nCzy mozna siebie winic, za swoja chorobe ? Za chorobe, w tym wypadku postepujaca i smiertelna, masz akurat szanse wziac odpowiedzialnosc i calkiem niezle cieszyc sie reszta zycia.\nCzy mam byc ostrozny do konca zycia ? Raczej nauczyc sie pewnego kodu postepowania i stosowania kilku prostych zasad.\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/17 06:50\t#60\nAgnieszko to jest właśnie ten etapie w którym uważasz, że to jest niesprawiedliwe, że poszukujesz odpowiedzi na pytanie. Dlaczego właśnie mnie dopadła ta choroba, a innych nie.\nDlaczego inni mogą dobie bezkarnie popijać, a ja nie.\nCóż nie znalazłem odpowiedzi na to pytanie i już bardzo dawno przestałem szukać, gdyż nie prowadzi ona do żadnych konstruktywnych wniosków.\nWidocznie jednak każdy musi przez to przejść.\nDla mnie następnym etapem było godzenie się z tym faktem, że jest jak jest i już tego nie zmienię, a później co z tym faktem mogę zrobić.\nDoszedłem do wniosku, że ta choroba jest tak naprawdę bardzo spoko, ponieważ po pierwsze masz bezpośredni wpływ na nią czy się będzie rozwijać i Cię niszczyć czy ją zatrzymasz, a po drugie cena za normalne życie w tej chorobie jest bardzo niewielka.\nWięc Agnieszko niezmiennie życzę Ci konsekwencji i cierpliwości na drodze do Twojej spokojnej trzeźwości.\nZa tę wiadomość podziękował(a): Alex75, jankes12, agnieszka89\nPlusy z trzezwosci + ataki szału\t2021/05/17 21:34\t#61\nAgnieszko, na terapii też się z tym mocowałem, terapeuta powiedział mi, cyt. Janek, a gdy byś miał raka, może byś go wyleczył może nie, nie miał byś na to wpływu, leki, leki, leki, tutaj przy tej chorobie ty masz na to wpływ, wystarczy nie wypić tego pierwszego kieliszka, pilnować tego, a będziesz zdrowy. Dało mi to dużo do myślenia i teraz wiem że to jest mądry przekaz.\nZa tę wiadomość podziękował(a): Cyrax 666, Krysia 1967, karencja, agnieszka89


Halo? Czy jest tu jakiś urzędnik? | Nowa Trybuna Opolska\nHalo? Czy jest tu jakiś urzędnik?\nsxc.hu 22.07.2012 Zaktualizowano 20.07.2012\nPo naszej interwencji jemielniccy urzędnicy zapowiedzieli, że sprawdzą działanie centrali. sxc.hu\nTelefoniczny kontakt z gminami Jemielnica i Zawadzkie woła o pomstę do nieba. W urzędach od miesięcy szwankują centrale telefoniczne i nikt nie robi z tym porządku.\n- Dzwoniąc do urzędu w Jemielnicy zgłasza się automat, który podaje numery wewnętrzne, ale nie da się ich wybrać - mówi Adam, który próbował zasięgnąć w gminie informacji. - Po wstukaniu numeru w słuchawce słychać komunikat "brak uprawnień do realizacji połączenia" i rozmowa jest zrywana.\nSprawdziliśmy problem, dzwoniąc do urzędu z kilku telefonów stacjonarnych i z komórki (z wybieraniem tonowym) - rzeczywiście nie da się wybrać żadnego z numerów wewnętrznych. Żeby połączyć się z sekretariatem, osoba dzwoniąca musi najpierw odsłuchać zapowiedzi automatu, która trwa pół minuty, a dopiero później odczekać, aż ktoś odbierze słuchawkę - czas oczekiwania na rozmowę jest płatny.\nPo naszej interwencji jemielniccy urzędnicy zapowiedzieli, że sprawdzą działanie centrali.\nRównie uciążliwe jest telefonowanie do Zawadzkiego. Próba wstukania numeru wewnętrznego do sekretariatu burmistrza kończy się komunikatem głosowym "połączenie nie może zostać zrealizowane". W tym przypadku jedynym wyjściem, żeby się dodzwonić, jest także czekanie.\nGość 23.07.2012 01:18:11\nA szanowny giość na jaki dzwonił numer ??? Konkretnie...\nGość 22.07.2012 19:57:05\nSama prawda! kilka razy dwoniłem do urzedu w jemielnicy i za każdym razem dodzwoniłem sie do restauracji eka


Szorowarki automatyczne, automaty szorujące, automaty szorująco-zbierające w naszej ofercie prezentują maksymalną żywotność, niskie wymagania w zakresie obsługi i konserwacji oraz niezawodność w eksploatacji. Wieloletnie doświadczenie na pozycji jednego z wiodących dostawców w branży pozwala nam dostarczać wyjątkowej jakości maszyny czyszczące, które zapewniają skuteczne czyszczenie w połączeniu z wysoką wydajnością.\nAutomaty szorujące lub automaty szorująco-zbierające są dostępne w zróżnicowanej gamie opcji – od małych modeli prowadzonych po duże automaty samojezdne i z operatorem jeżdżącym na maszynie. Idealne do sprzątania w obiektach instytucjonalnych i przemysłowych.\nAutomaty szorująco-zbierające zostały starannie zaprojektowane z myślą o zwiększeniu wydajności i obniżeniu całkowitych kosztów czyszczenia. Efektywne wykorzystanie wody i detergentu w połączeniu z łatwością obsługi urządzenia sprawiają, że będą one doskonałym wyborem. Samojezdne automaty szorująco-zbierające pozwalają zmniejszyć nakłady pracy i znacznie zwiększają wydajność sprzątania.


Dziennik Bridget Jones - wszystko na temat Dziennik Bridget Jones w serwisie Milion Kobiet\nArtykuły dla frazy : Dziennik Bridget Jones (3)\nPrezentacja zawartości portalu dla wyrażenia Dziennik Bridget Jones. Przygotowany przez nas system wyszukiwania artykułów dla danego słowa kluczowego (w tym przypadku Dziennik Bridget Jones) daje możliwość bardzo szybkiego uzyskania satysfakcjonującej informacji dotyczącej tego, ile artykułów związanych z zapytaniem Dziennik Bridget Jones posiadamy w swoim serwisie. W tej chwili dla zapytania Dziennik Bridget Jones jesteśmy w stanie zaprezentować Ci Dziennik Bridget Jones materiałów. Najstarszy z artykułów na ten temat jest z Poniedziałek 05.10.2015 najnowszy z kolei został przez nas opublikowany Piątek 07.08.2015. Nasz portal daje Ci możliwość śledzenia nowych treści (pojawiających się dla interesującego Cię zapytania Dziennik Bridget Jones ) przez kanał RSS. Dzięki nam na bieżąco będziesz informowany o zmianach, nowych treściach dotyczących tematu Dziennik Bridget Jones.