Decorazioni autunnali. Come decorare un interno in autunno?\nL'autunno, che segue un'estate frizzante e soleggiata, è famigerato. Per molti è un periodo deprimente pieno di nostalgia e tristezza, eppure è una delle stagioni più colorate dell'anno in Polonia. La moda per decorare case e appartamenti in autunno ci è venuta dall'America, dove la festa dei morti - Halloween - viene celebrata in un'atmosfera festosa. Durante questo periodo, gli americani tirano fuori varie decorazioni e ornamenti, invitando così l'autunno nelle loro case. Dominano quindi zucche vuote, pannocchie di mais essiccate, fasci di fieno, ma anche imponenti ghirlande o composizioni composte da fiori secchi, foglie o frutti. Sia l'interno che l'ingresso della casa sono decorati, comprese le scale, il portico e le porte esterne.Come decorare una casa o un appartamento per l'autunno? Quali decorazioni autunnali sono disponibili nei negozi e quali decorazioni dovresti realizzare da solo? Ecco la nostra guida.\nL'autunno, ingiustamente associato solo alla pioggia e al grigio, è quindi una stagione che alla maggior parte di noi non piace. Eppure l'autunno dorato polacco è una vera ricchezza di colori! La tavolozza autunnale include rossi saturi, gialli solari e arance e marroni delicati. Grazie alla sua tonalità calda e piacevole per gli occhi, i colori autunnali creano un'atmosfera accogliente e familiare.\nÈ un dato di fatto che la giornata che si accorcia favorisce stati d'animo pieni di malinconia e nostalgia, mentre l'aura poco invitante fuori dalla finestra di solito ci costringe a trascorrere le serate tra le quattro mura. Pertanto, vale la pena prendersi cura del giusto umore negli interni: le decorazioni e gli accessori autunnali verranno in aiuto , grazie ai quali possiamo introdurre di nascosto la ricchezza dei colori autunnali nelle nostre stanze.\nDecorazioni autunnali negli interni\nIl nostro approccio all'organizzazione di una zona di residenza è senza dubbio cambiato nel corso dei decenni. Fino a poco tempo i nostri interni avevano solo una funzione di utilità, e la loro disposizione si riduceva all'acquisto di mobili e accessori il cui compito era quello di facilitare e migliorare la vita di tutti i giorni. Oggi abbiamo un approccio leggermente diverso allo spazio privato, considerandolo il cuore delle riunioni domestiche. Per questo, cerchiamo di coccolare il più possibile ogni stanza. Ci piacciono i cambiamenti, e la prova di ciò può essere il ritmo naturale delle stagioni, che si insinua anche negli interni sotto forma di ornamenti e decorazioni.\nI produttori che seguono il mercato e le tendenze hanno nelle loro offerte vari accessori, il cui aspetto è in linea con la stagione in corso. Pertanto, i colori ei motivi autunnali possono essere trovati su vasi decorativi, pentole, ciotole e statuette . L'autunno è presente anche nei tessuti per la casa: puoi acquistare copriletti e tappeti decorativi , ma anche cuscini e biancheria da letto dai colori caldi . Le decorazioni autunnali per la casa si riferiscono anche al lavoro agricolo stagionale di quel periodo, cioè al tempo della raccolta - quindi, regnano gli accessori nell'estetica familiare del folklore locale. Possiamo quindi trovare decorazioni con elementi in fieno, paglia, frutta secca o frutta artificiale , che colorano gli interni con la loro finitura naturale e semplice.\nAnche la cucina, definita il cuore della casa, merita di essere adeguatamente arredata. Non dimentichiamo il soggiorno, una stanza altrettanto importante dove la famiglia trascorre del tempo insieme.\nÈ bene essere moderati quando si decora la tavola. Un piano del tavolo sovraccarico di decorazioni creerà un'atmosfera caotica piuttosto che armoniosa: stoviglie anguste dominate da sontuose decorazioni sono una ricetta per il disastro, non un pasto di successo. È quindi una buona idea mettere una grande ciotola sul piano di lavoro . Il suo fondo va ricoperto di foglie secche, sulle quali possiamo disporre verdure e frutta dai colori autunnali: zucca, mele, pere o uva.\nLe decorazioni autunnali per la tavola includono, oltre ai suddetti piatti, tovaglioli decorativi, runner, candele e lanterne . Posizionati nella parte centrale del tavolo, non disturberanno ospiti o membri della famiglia nell'utilizzo del resto del piano del tavolo.\nLe finestre sono una transizione tra l'interno e l'ambiente circostante della casa, quindi vale la pena decorarle per diversi motivi. In primo luogo, saranno una vetrina estetica della nostra casa, e visti dal livello della strada mostreranno una disposizione degli interni ben congegnata e armoniosa, in linea con la stagione in corso. Le finestre decorate saranno un piacevole accento che soddisferà gli occhi dei membri della famiglia. La spiacevole vista dietro il vetro sarà disincantata dalle decorazioni autunnali che porteranno una nota di ottimismo e calore all'interno.\nQuindi come decorare le finestre per l'autunno? Cominciamo dai davanzali , che sono lo spazio perfetto per posizionare le decorazioni autunnali. Qui funzioneranno gli accessori del negozio sotto forma di vasi e candelabri nei colori dell'autunno, così come statuette, lanterne e candele . Le decorazioni illuminate la sera porteranno un'atmosfera accogliente e familiare, e il vetro che riflette la luce delle candele brillerà piacevolmente di luce soffusa. La finestra stessa può anche essere decorata attaccando adesivi decorativi a forma di foglie autunnali .\nScommettiamo anche sulle decorazioni per finestre fai da te . Mettiamo una zucca vuota sul davanzale della finestra, una composizione autunnale di rametti di frutta secca e fiori o fragranze popolari messe in ceste o ciotole. Usiamo le foglie autunnali che gli alberi perdono durante questo periodo. Foglie di acero, quercia, nocciolo o carpino creeranno un bouquet ricco e vario che decorerà la zona della finestra. Le foglie essiccate dovrebbero anche essere appese a un bastone per tende sotto forma di una ghirlanda decorativa : basta attaccarle a una corda e attaccarle alla guida.\nDecorazioni autunnali in carta, ovvero decorazioni murali\nDecorare una casa per l'autunno non deve essere associato a costi elevati, soprattutto se decidiamo di realizzare noi stessi accessori. Vale la pena invitare i più piccoli a giocare, per i quali tagliare e incollare ornamenti di carta sarà un grande divertimento, e per noi - il tempo trascorso insieme ai bambini. Non hai bisogno di molti materiali per realizzare decorazioni autunnali in carta. La famiglia media ha un blocco di fogli di carta colorati, forbici e colla, in caso contrario, possiamo facilmente trovarli in una normale cartoleria.\nPossiamo ritagliare le decorazioni associate all'autunno dalla carta colorata : possono essere foglie, ghiande, funghi, frutta o verdura. Nelle decorazioni tagliate, vale la pena creare contorni con un pennarello scuro, grazie al quale gli adesivi assomigliano a figure reali.\nPossiamo attaccare i ritagli direttamente sulla finestra o creare ghirlande decorative .\nDecorazioni autunnali davanti alla casa\nSempre più spesso si decide di arredare l'esterno della casa con la porta d'ingresso, il portico o le scale. Assicuriamoci che i dintorni del nostro edificio cambino volto e corrispondano ai colori della stagione data. Quando si avvicina l'autunno, vale la pena considerare decorazioni che diversificheranno l'aspetto della nostra proprietà. La decorazione esterna scelta più di frequente è una ghirlanda decorativa attaccata alla porta d'ingresso . Possiamo ordinarlo in un negozio di fiori o provare a realizzarlo da soli, utilizzando a questo scopo foglie essiccate, frutta e ramoscelli decorativi.\nIl portico sarà inoltre decorato con una zucca più grande posta proprio nell'angolo o un vaso con le conifere . Per introdurre una nota di familiarità nell'arredamento, possiamo usare un fascio di fieno più piccolo, che servirà da tavolo decorativo. Mettiamo sopra la suddetta zucca o un cesto più grande con una composizione di foglie e frutta secca.\nTutte le decorazioni autunnali per la terrazza o il portico devono essere adeguatamente protette dalla temperatura e fissate saldamente in modo che non vengano danneggiate da raffiche di vento.\nRicordiamoci della moderazione e del buon senso. Sebbene l'usanza della decorazione d'interni autunnale ci sia venuta dall'Occidente, ciò non significa, tuttavia, che dovremmo seguire ciecamente la moda. I simboli stranieri (ad esempio le decorazioni di Halloween) nel contesto polacco saranno un elemento inappropriato che contrasta con la nostra cultura e tradizione. Concentriamoci dunque sul folklore autoctono e locale, introducendo addobbi e suppellettili in armonia con la stessa estetica.


Tempesta d'amore, anticipazioni puntate dal 21 al 26 aprile: amori e vendette - Televisionando\nTempesta d’amore, anticipazioni puntate dal 21 al 26 aprile: amori e vendette\nPubblicato da Fulvia Leopardi Lunedì 21 aprile 2014\nNuove anticipazioni dalla trama delle puntate di Tempesta d’amore in onda dal 21 al 26 aprile promettono di lasciare le telespettatrici (e i telespettatori) attaccati allo schermo: tra intrighi, misteri e passioni, ecco cosa aspettarci dalla soap opera tedesca in onda su Rete4 alle 20.30.\nIn queste nuove puntate di Tempesta d’amore, Barbara fa capire a Goran che Friedrich costituisce una minaccia per lei: la donna abbandonerà il Furstenhof, trasferendosi in una baita per seguire quel trattamento sperimentale che potrebbe salvarle la vita. Sarà Werner a capire che Barbara sta attuando il piano di cui gli ha parlato, ma gli avvertimenti a Friedrich cadranno nel vuoto, mentre la Von Heidenberg attira il vecchio Stahl nella baita con un pretesto. Barbara inscena il suo stesso omicidio per incastrare Friedrich, e quando Goran si risveglia, vedendo il vecchio Stahl con la camicia insanguinata ed in fuga.\nFriedrich sospetta che Werner voglia comprare le quote del Furstenhof con i soldi che gli ha regalato Barbara, soldi che l’uomo dice di aver bruciato (e sarà Charlotte a scoprire che non è così) ma senza poter portare delle prove: i due uomini si accordano: Friedrich venderà un 15% delle quote a Werner, che in cambio manterrà il segreto riguardo la paternità dei figli che Patrizia aspetta.\nSabrina – la cui bevanda potrebbe essere sottoposta all’esame delle autorità – scopre che Friedrich ha tentato di rubare il denaro di Werner; sia lui che André lo sospetteranno, ma la donna gli fornirà un alibi di ferro e Friedrich lascia a Sabrina l’intera cifra di denaro che ha rubato. La donna nasconderà il denaro orsacchiotto di peluche e propone a Nils di fare un viaggio intorno al mondo fingendo di aver partecipato ad un concorso a premi. Il tutto mentre Natascha sospetta che Sabrina abbia una relazione con Friedrich.\nDaniel ha avuto un incidente in elicottero e Pauline se la prende con Leonard per l’accaduto: i due, nonostante le accuse della donna, cercano Daniel insieme, trovandolo privo di sensi nelle vicinanze di un lago. Coco tenta invano di convincere Tina che tra lei e Goran non c’è nulla, anche se l’uomo soffrirà per il trattamento che la donna gli riserva: scoprirà la verità – Coco voleva favorire la sua relazione con Tina – dopo aver parlato con Natascha. Goran cercherà anche di confortare Tina, preoccupata per il padre che è fuggito dalla casa di cura in cui si trovava. Michael dice a Pauline e Leonard che è stato ritrovato un uomo nel lago: sarà Tina ad identificarlo, come suo padre.\nAlfons teme che Gustl possa creare problemi; quest’ultimo, dal canto suo, vuole conquistare il cuore di Magdalena, ma non mancherà di causare guai: il filmato che l’uomo ha pubblicato sul web in cui si vede Alfons versare del vino nella scollatura di Magdalena durante le riprese di uno spot pubblicitario fa il boom di visite, e Alfons si sente umiliato. Michael cerca di aiutare André dopo le denunce di Natascha, per cui André sostiene di non provare più nulla: l’uomo dovrà anche guardarsi dalla vendetta di Werner.


Piano Locale Giovani: IL LAVORO E' DI RETE RONCO BRIANTINO\nIL LAVORO E' DI RETE RONCO BRIANTINO\nIl Piano Locale Giovani, l’oratorio e Acli presentano tre serate per affrontare, in modo divertente e costruttivo, un tema tanto sentito e discusso in Italia: i giovani e il lavoro.\nLe serate sono rivolte a tutti coloro che sono già inseriti nel mondo del lavoro, a chi si è appena affacciato e a chi si affaccerà. E’ un’occasione per dare vita ad un confronto su questi temi attraverso diverse metodologie.\nLUNEDI’ 8 MAGGIO: POETRY SLAM\nIl poetry slam è una gara di poesia orale ad alta voce. Oltre alla parola, protagonista della “competizione” è il pubblico che diventa giuria. “Il poetry slam è una forma di democratizzazione della poesia: non solo perché chiunque può iscriversi e vincere, ma soprattutto perché trasforma la poesia in un’arte che non glorifica il poeta, bensì celebra la comunità”. Il poetry slam organizzato a Ronco rientra nel campionato nazionale…sarà l’ultimo appuntamento per poter accedere alle semifinali del campionato di Poetry slam Lombardia. Se sei un poeta/poetessa, cantautore, giocoliere di parole puoi iscriverti allo slam scrivendo a: cagroncobriantino@coopaeris.it\nAspettiamo bambini, giovani e adulti a partecipare alla serata.\nMERCOLEDI’ 17 MAGGIO: LAVORIAMOCI SU\nAttraverso la visione di spezzoni di film, di attivazioni a gruppi, cercheremo insieme di mettere a fuoco, sogni, desideri, paure, delusioni che ci hanno accompagnato, che ci accompagno o che ci accompagneranno nel corso della nostra esperienza lavorativa.\nIl workshop è aperto ai ragazzi dai 15 ai 35 anni.\nMERCOLEDI’ 24 MAGGIO: TU COME HAI FATTO?\nStorie di ragazzi e di ragazze che hanno trovato o stanno costruendo la propria strada verso la realizzazione di sé. Abbiamo cercato di invitare alcuni giovani a raccontare il loro modo di approcciarsi al mondo del lavoro, portandoci le loro differenti visioni e le loro singolari esperienze.\nEtichette: lavoro, poetry slam, rete, Ronco Briantino


I mercati azionari mettono un'ipoteca su un ulteriore allungo di non poco conto. I titoli da mettere in portafoglio - Proiezioni di Borsa\nAggiornato alle 21:00 di venerdì 04 dicembre 2020\nHome » Il punto sui mercati » I mercati azionari mettono un’ipoteca su un ulteriore allungo di non poco conto. I titoli da mettere in portafoglio\nIl punto sui mercatiIn Evidenza Gerardo Marciano - 14 Novembre 2020 - 08:00\nI mercati azionari mettono un’ipoteca su un ulteriore allungo di non poco conto. I titoli da mettere in portafoglio\nDopo una settimana tutta al rialzo i mercati azionari mettono un’ipoteca su un ulteriore allungo di non poco conto. Cosa dobbiamo quindi attendere da ora in poi? Ora andiamo a tracciare la solita mappa dei prezzi ma questa volta aggiungeremo oltre ai soliti punti di inversione ribassista anche gli obiettivi di breve termine 1/2 mesi e i titoli da mettere in portafoglio.\nGli ultimi mesi sono stati davvero difficili, infatti da luglio si sono alternati continui alti e bassi e continui falsi segnali. Ogni movimento è durato 1/2 giorni per poi andare in direzione contraria.\nAndiamo a capire come portare gli eventi a nostro vantaggio.\nI mercati hanno chiuso la giornata di contrattazione del 13 novembre ai seguenti prezzi:\nCosa proiettiamo da ora in poi?\nIn blu il grafico delle Borse mondiali fino alla chiusura del 13 novembre.\nIn rosso la nostra previsione annuale per il 2020\nLa previsione annuale proietta un rialzo di almeno un’altra settimana per poi lasciare spazio ad una nuova fase ribassista fino a dicembre. Sarà così? A priori non facciamo valutazioni ma ne prendiamo atto e poi di volta in volta andremo a capire se la tendenza sarà al rialzo o al ribasso (come da frattale).\nI mercati azionari mettono un’ipoteca su un ulteriore allungo di non poco conto\nEcco i livelli da monitorare:\nNuovi ribassi direzionali solo con una chiusura del 20 novembre inferiore a 12.597. Rialzo in corso e inversione ribassista di brevissimo solo con chiusura giornaliera del 16 novembre inferiore a 12.596. Obiettivo primo del rialzo a 13.775.\nNuovi ribassi direzionali solo con una chiusura del 20 novembre inferiore a 3.229. Rialzo in corso e inversione ribassista di brevissimo solo con chiusura giornaliera del 16 novembre inferiore a 3.392. Obiettivo primo del rialzo a 3.595.\nNuovi ribassi direzionali solo con una chiusura del 20 novembre inferiore a 20.610. Rialzo in corso e inversione ribassista di brevissimo solo con chiusura giornaliera del 16 novembre inferiore a 20.610. Obiettivo primo del rialzo a 22.640.\nNuovi ribassi direzionali solo con una chiusura del 20 novembre inferiore a 3.511. Rialzo in corso e inversione ribassista di brevissimo solo con chiusura giornaliera del 16 novembre inferiore a 3.552. Obiettivo primo del rialzo a 3.780.\nI titoli da mettere in portafoglio\nAbbiamo selezionato Enel con stop a 7,78 ed obiettivo primo a 8,65, FCA con stop a 11,38 e obiettivo primo a 13,36, Intesa Sanpaolo con stop a 1,6383 e obiettivo primo a 1,93 , Unicredit con stop a 6,88 e obiettivo primo a 9,41.\nIl punto sui mercati 3 Dicembre 2020\nLe condizioni per far ripartire al rialzo i mercati azionari fin da subito\nIl punto sui mercati 1 Dicembre 2020\nQuanto è pericoloso lo scivolone di ieri sui mercati azionari?


Cani da ricerca delle cimici del letto | Special Dog Facility\nHome » Servizi » Cani da ricerca delle cimici del letto\nIl nostro addestramento mirato alla ricerca di cimici del letto consente di individuare immediatamente la presenza dei parassiti all'interno dei letti.\nProbabilmente i non addetti ai lavori non conoscono nemmeno l'esistenza di questi piccolissimi animaletti, ma gli addetti del settore turistico sanno benissimo quanto questi possano essere dannosi e costosi per la propria attività, se non si interviene per tempo.\nLe cimici dei letti stanno diventando un problema difficile da controllare sia per gli Hotel, per gli ostelli, per le grandi NAVI da Crociera, per i treni, per tutti i dormitori notturni e per tutti i centri di ospitalità.\nLe nostre unità cinofile sono addestrate a scovare le cimici dei letti in maniera rapida ed efficiente, garantendo una interruzione minima del servizio.\nI cani da rilevazione delle cimici del letto sono una soluzione reale per tutte le grandi strutture ricettive che potrebbero incorrere in infestazioni di questi piccoli parassiti.\nIn particolare grandi Hotel, le Navi da crociera, grandi dormitori, treni notturni, navi da trasporto etc. potrebbero trovarsi a risolvere questo problema, che se non preso per tempo, comporta la distruzione totale di tutti i letti infestati.\nDall'altra parte, anche le grandi imprese di disinfestazione, con l'utilizzo dei cani da rilevazione cimici del letto, possono svolgere il loro lavoro in maniera veloce ed accurata, fornendo al cliente un servizio impeccabile, veloce ed efficiente.


Determinare l'host e le caratteristiche virali che influenzano HIV-1 patogenesi e nella progressione della malattia è fondamentale per la progettazione razionale di vaccini. La risposta immunitaria cellulare è un componente chiave della risposta immunitaria umana HIV-1. Linfociti T citotossici (CTL) sono necessari per il controllo iniziale della viremia acuta, e permettono l'host di stabilire uno stato di equilibrio (set point) carica virale 1,2. Deplezione sperimentale di queste cellule effettrici si traduce in perdita di controllo virale 3,4. Nonostante questo, sfuggono le mutazioni sorgono all'interno del genoma virale che sovvertire CTL riconoscimento delle cellule infettate da virus 5-9.\nAlcuni alleli HLA sono stati associati con una carica virale inferiore e la progressione della malattia più lenta tra cui B * 57, B * 27 e B * 81 10-15. Parte del beneficio protettivo di alleli HLA di classe I può essere attribuito al fatto che esse mirano regioni funzionalmente vincolati del genoma come Gage selezionare per le mutazioni di fuga che riducono la capacità del virus di replicarsi in vitro 16-21. Sebbene fuga dal sistema immunitario cellulare è vantaggioso per il virus nel contesto della classe I allele HLA selezione, l'effetto di queste mutazioni può avere conseguenze differenziali per l'host dopo la trasmissione a un HLA-non corrispondenti individuale 22,23. Pertanto, la comprensione degli effetti delle mutazioni trasmesse fuga HLA-associato sulla capacità di replicazione virale sarà importante per migliorare la nostra comprensione dei primi HIV-1 patogenesi.\nSebbene siano stati compiuti molti progressi per identificare e caratterizzare i difetti di fitness di mutazioni di fuga individuali associati con particolare HLA di classe I alleli 24-29, naturalmente HIV-1 isolati sono impronte uniche e complesse di polimorfismi HLA-associato, probabilmente derivanti dalla HLA pressione immunitaria mediata di diversa provenienza immunogenetici 30. In apanalisi revious, Goepfert et al. ha dimostrato che un accumulo di mutazioni HLA-associati nelle sequenze Gag trasmessi derivate da 88 Zambians infezione acuta era associato ad una riduzione della carica virale set point 31. Questo suggerisce che la trasmissione di mutazioni deleterie di fuga, in particolare in Gag, ai destinatari HLA-non corrispondenti fornisce un beneficio clinico, e può essere dovuto ad attenuare la replicazione virale. Andando avanti, è imperativo studiare come complesso combinazioni di polimorfismi Gag all'interno isolati naturali lavorano in concerto per definire le caratteristiche del virus trasmesso come la capacità di replicazione, e come la replicazione precoce potrebbe a sua volta influenzare HIV-1 parametri clinici e di fase tardo- patogenesi.\nBrockman et al. Prima dimostrato un legame tra la capacità di replicazione di sequenze gag-pro isolato durante l'infezione fase cronica e la carica virale sia nel sottotipo C e le infezioni B32-35. L'approccio sperimentale presentato in questi studi, anche se adeguato per esaminare la capacità di replicazione in vitro di sequenze derivate da individui cronicamente infetti, ha diversi avvertimenti tecnici e limitazioni che rendere lo studio di HIV-1 capacità replicativa nel sottotipo C individui con infezione acuta difficile. Questo metodo si basa sulla ricombinazione di base di popolazione sequenze PCR-amplificate nel sottotipo B NL4-3 provirus, che è stato derivato in parte da LAV, un laboratorio adattato virus magazzino 36. Generazione di virus è stato realizzato da co-trasfezione di una base-CEM linea di cellule T 37 con ampliconi della PCR e digerito delta- NL4-3 DNA gag-pro. Questo metodo richiede l'escrescenza di virus in un periodo di settimane o mesi, potenzialmente alterando la natura del virus magazzino recuperati rispetto ai quasispecie virale in vivo, e quindi alterare la misurazione della capacità di replicazione in vitro. Questo metodo is più appropriato per studiare gli individui cronicamente infette, dove seleziona efficacemente per virus con la più alta capacità replicativa, e dove clonazione numerose varianti virali differenti da un gran numero di individui cronicamente infette è piuttosto intenso lavoro e quindi non fattibile. Tuttavia, all'interno di un individuo infetto acutamente, ci sono generalmente 01:59 varianti presenti, ed eliminando così il rischio di inclinazione della natura del virus magazzino recuperato, attraverso pressioni della selezione in vitro, consente una valutazione più accurata della capacità di replicazione in vitro. In secondo luogo, questo metodo richiede ricombinazione sottotipo C sequenze gag-pro in un sottotipo B dorsale derivato, e potrebbe introdurre distorsioni backbone incompatibilità nell'analisi. A causa di queste limitazioni, un gran numero di sequenze devono essere analizzati al fine di superare eventuali distorsioni introdotte potenziali.\nQui si descrive un appro sperimentale alternativaach appropriata per studiare le sequenze derivate dal sottotipo C individui con infezione acuta. Usiamo una strategia di clonazione basata enzima di restrizione per introdurre il gene gag derivato dal acuti momenti di infezione da HIV-1 sottotipo C individui infetti nella spina dorsale provirale sottotipo C, MJ4. L'uso di MJ4 come una spina dorsale comune in cui clonare i geni gag è cruciale per l'analisi di sottotipo C sequenze derivate. MJ4 è derivato da un isolato primario 38, e quindi sarebbe meno probabilità di introdurre bias dovuto al sottotipo incompatibilità tra la spina dorsale e il gene gag. Inoltre, l'approccio di clonazione mediante restrizione basata enzima permette la provirale costruisce essere trasfettate direttamente nelle cellule 293T, e per il recupero di un virus magazzino clonale identica alla sequenza di gag clonata.\nIl metodo presentato qui di seguito è un metodo ad alta produttività per la valutazione della capacità di replicazione del sottotipo C derivato Gag-MJ4virus chimerici. Trasfezione in cellule 293T è semplice e il recupero di virus richiede solo tre giorni. In vitro la capacità di replica viene analizzato sulla stessa base linea di T-cellule CEM-CCR5 creato da Brockman et al. 37, ma con importanti modifiche di protocollo necessario per la replica di successo di sottotipo C MJ4 virus chimerici. L'utilizzo di una linea di T-cella appropriata piuttosto che PBMC permette un gran numero di sottotipo C virus MJ4-chimerico per essere testati con alto dosaggio riproducibilità. Infine, utilizzando un radiomarcato test trascrittasi inversa per la quantificazione del virus nel surnatante è più conveniente rispetto all'utilizzo di kit ELISA disponibile in commercio P24. Inoltre, dà una gamma dinamica superiore, che era importante per rilevare i virus male e altamente replicare all'interno dello stesso test e per la rilevazione di sottili differenze nella replica tra gli isolati.\nIn conclusione, il metodo qui presentato ha permessolo studio approfondito della capacità di replicazione di sequenze gag derivati da HIV-1 sottotipo C acutamente infettato individui dallo Zambia, e come scritto, potrebbe anche essere esteso a studiare altri sottotipo C popolazioni infettato. È stato osservato un alto grado di variazione capacità di replica tra i diversi isolati Gag. Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare un'associazione statistica tra la capacità di replicazione del Gag trasmessi e set point carica virale così come con CD4 + declino nel corso di un periodo di tre anni 39. Tali risultati sottolineano l'importanza di studiare le caratteristiche virali come trasmesso, come la capacità di replica, interagiscono con il sistema immunitario ospite di influenzare patogenesi durante l'infezione precoce e saranno parte integrante per lo sviluppo di interventi di vaccini efficaci e trattamento.\n1 Amplificazione del virus HIV-1 gag Gene da infetti, Frozen Plasma\nEstrarre l'RNA virale da 140 microlitri scongelati HIV-1 nel plasma infetto utilizzando un kit di estrazione.\nQuando possibile, procedere immediatamente alla sintesi del DNA dopo estrazione dell'RNA come RNA virale scongelato produce i migliori risultati di amplificazione. Se possibile, impostare PCR master mix per il primo turno di amplificazione del DNA e conservare a 4 ° C prima dell'estrazione dell'RNA virale.\nReverse-trascrivere cDNA da RNA e amplificare al primo round prodotti DNA utilizzando trascrittasi inversa e una DNA polimerasi termostabile in un one-step RT-PCR.\nPrendere RNA di -80 ° C congelatore (se il congelamento fosse necessario) e brevemente scongelare a temperatura ambiente, poi posto nel blocco freddo. Trasferire 5 ml di RNA per ogni tubo di PCR contenente 45 ml di master mix per dare un volume finale di 50 ml. Porre immediatamente restanti campioni di RNA in -80 ° C freezer.\nDopo enzima è unadded al primo turno PCR Master Mix (Tabella 1A), aliquota 45 microlitri in ciascun tubo di amplificazione PCR a parete sottile per il numero di reazioni desiderate. Assicurarsi di utilizzare provette PCR con i singoli tappi e non togliere i tappi per garantire il minimo la contaminazione incrociata tra i campioni. Mettere provette PCR in un blocco freddo per proteggere la RT enzima e RNA template sensibile alla temperatura. Nota: I campioni devono essere eseguiti in triplice copia, al fine di adeguatamente assaggiare le quasispecie virali. E 'anche importante utilizzare un prodotto con una elevata fedeltà enzima DNA polimerasi per minimizzare misincorporation PCR-introdotta. Si prega di fare riferimento alla lista reagenti per il prodotto consigliato.\nDopo il modello di RNA è stato aggiunto a tutte le provette di reazione, trasferimento provette per PCR a un termociclatore per l'amplificazione utilizzando il programma cycler descritto nella Tabella 1B. Nota: Il prodotto di questa amplificazione sarà utilizzato in un secondo turno nested PCR.\nEseguire un nidificato second tutto l'amplificazione PCR, utilizzando 1 ml del primo turno di amplificazione PCR (1.2) come modello di DNA.\nAliquota 49 ml di secondo turno master mix di PCR (Tabella 2A) a ciascuna provetta PCR a parete sottile per il numero di reazioni desiderate. Trasferire 1 ml del primo turno amplificazione PCR per ciascun tubo di reazione per dare un volume finale di 50 ml. Nota: Questo servirà DNA come modello per l'amplificazione secondo turno. E 'anche importante utilizzare una DNA polimerasi con capacità molto alta fedeltà e revisione al fine di minimizzare misincorporation PCR-introdotta. Si prega di fare riferimento alla lista reagenti per il prodotto consigliato.\nTrasferimento secondo turno Miscela di reazione PCR per termociclatore ed eseguire il programma descritto nella Tabella 2B. Nota: Dopo il completamento del programma, i prodotti di questa reazione vengono eseguiti su un gel di agarosio per confermare la produzione del prodotto.\nAggiungere 3 ml di 5x loading dye a 5 & #181, l del 50 microlitri volume di reazione secondo turno e correre a 120 V su un gel di agarosio-TAE 1% contenente una macchia di DNA fluorescente agli UV fino a quando le bande sono risolti. Visualizza 1.6 kb bande su un illuminatore luce blu (vedi Figura 1A).\nEseguire il restante volume di reazione di 45 microlitri su un gel di agarosio-TAE 1% contenente una macchia di DNA, e asportare le bande appropriate con una lama di rasoio pulito.\nEstrarre DNA dalla fetta gel utilizzando un kit di purificazione gel, eluire in acqua priva di nucleasi, unire tre reazioni positive per ogni individuo, e congelare prodotto a -20 ° C per un uso successivo.\n2. Preparazione ampliconi gag per la clonazione di Introduzione dei siti di restrizione necessari\nAmplificano la Ripetizione lungo Terminal (LTR) / 5 'UTR parte del plasmide MJ4 (vedi Tabella 3).\nVisualizza 1.3 kb PCR prodotti illuminatore, accise ampliconi positivi, gel purificare e congelare come precedentementedescritto (1.4,1.5; vedi Figura 1B).\nCrea fuso MJ4 LTR- ampliconi gag via "splice-overlap-estensione" PCR (vedi tabella 4).\nVisualizzare, accise, purificare, e congelare gli ampliconi 3.2 kb come in 1.4,1.5 (vedi Figura 1C).\n3. Clonazione Amplified gag geni nel MJ4, sottotipo C, infettiva Clone molecolare\nDigest 1.5 mg di MJ4 plasmide e 1,5 mg di prodotto purificato LTR- gag PCR con il BclI (metilazione sensibili) endonucleasi di restrizione per 1,5 ore a 50 ° C (vedi Tabella 5A).\nAggiungere 1 ml di NgoMIV alla reazione di digestione e incubare a 37 ° C per 1 ora.\nAggiungere carico 5x dye a restrizioni digerire reazioni e lentamente il volume totale elettroforesi su gel di agarosio-TAE 1% contenente una macchia gel DNA per 1-2 ore a 100 V. Visualize, accise, e purificare bande indicate per la clonazione come precedentemente discribed (vedi Figura 2).\nPreparare le reazioni legatura usando purificata LTR- inserto gag e MJ4 vettore DNA a 3: 1 inserto rapporto vettore. Incubare le reazioni legatura notte a 4 ° C (vedi Tabella 5B).\nTrasforma JM109 batteri chimicamente competenti con prodotti legatura e la diffusione su piastre di agar LB con 100 mg / ml di ampicillina e crescere a 30 ° C per 22 + ore.\nScongelare JM109 cellule competenti in ghiaccio per 15 min. Etichettare provette da 1,5 ml microcentrifuga e freddo su ghiaccio.\nAliquota 50-100 ml di cellule JM109 di pre-refrigerata 1,5 ml provette da microcentrifuga. Aggiungi 2,5-5 ml di reazione legatura a JM109 cellule, sfogliando il tubo leggermente per mescolare e subito tornare in ghiaccio. Incubare le cellule competenti prodotto legatura in ghiaccio per 30 min.\nShock termico 1,5 ml provette da microcentrifuga contenenti cellule competenti JM109 e reazione legatura in un blocco di calore 42 ° C per 45 secondi e riprendere il ghiaccio per almeno 3 min.\nAggiungere 50 ml di mezzi SOC a ciascuna provetta e piastra tutta reazione di trasformazione sulla temperatura ambiente LB-agar piastre integrate con 100 mg / ml di ampicillina.\nPiastre di trasferimento ad un 30 ° C incubatore e lasciare per 20 ore, o fino a quando le colonie sono chiaramente formate.\nScegli colonie isolate e crescere in 4 ml di LB con 100 mg / ml di ampicillina a 30 ° C per 22 + ore.\nSpin down culture a 3.200 xg per 15 minuti, versare il brodo fuori, ed estrarre DNA plasmidico.\nPer confermare la clonazione fedeltà, tagliare il DNA miniprep con NgoMIV e HPAI enzimi di restrizione in un doppio digerire a 37 ° C per 2 ore. Analizzare il 1% gel-TAE (vedi Tabella 5C).\nSequenza regione inserto LTR-gag di ogni plasmide utilizzando i seguenti primers: GagInnerF1, GagF2, Rev1, Rev3, e GagR6 (Tabella 6) per confermare l'identità di sequenza.\nConfronta le sequenze clonate ottenuti con la popolazione di sequenze derived dal amplicone purificato iniziale 1.5.1. Nota: E 'importante valutare in ultima analisi, la capacità di replica di due cloni indipendenti al fine di garantire che qualsiasi fenotipi di replica in vitro non sono dovuti a errori di backbone introdotti durante il processo di clonazione.\n4 Generazione e titolazione di replica competenti Gag-MJ4 chimerici virus\nGenerare la replicazione del virus competente trasfettando 1.5 mg del chimerico MJ4 plasmide miniprep DNA in cellule 293T con un rapporto 4: 1 di Fugene HD come descritto dal Principe et al 39.\nTitolo raccolte le riserve di virus sulle cellule TZM-bl come descritto di seguito e in Prince et al 39.\nPiatto TZM-bl cellule 24 ore prima dell'infezione con il virus in modo da avere un monostrato di cellule confluenti 30-40% il giorno successivo. In genere, può essere ottenuto aggiungendo 5 x 10 4 cellule in un volume totale di 800 microlitri per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti.\nDopo aver aggiunto le cellule al pozzo, spostare delicatamente la piastra di 24 pozzetti in avanti e indietro, poi un lato all'altro in modo da distribuire in modo efficiente le cellule. Mai turbinio - questo si tradurrà in cellule accumulano nel centro della piastra.\nIl giorno seguente, preparare 1% FBS in DMEM; questo verrà utilizzato per diluire DEAE-Destrano e per diluire le scorte di virus. Archivio DEAE-Destrano è di 10 mg / ml o 125x, e una concentrazione finale di è desiderato 80 mcg / ml o 1x.\nTogliere virus magazzino da testare da -80 ° C freezer e posto su agitatore per scongelare a temperatura ambiente.\nUsando una pipetta multicanale, in serie diluire le riserve di virus in una cultura a fondo tondo tessuto trattato piastra da 96 pozzetti con coperchio. Si tratta di un protocollo di diluizione 3 volte. Vedere la Tabella 7 per il sistema di diluizione.\nRimuovere i supporti da piastre da 24 pozzetti TZM-bl seminate utilizzando un aspiratore a vuoto facendo attenzione a non disturbare monostrato cellulare. Rimuovere il supporto solo da una piastra a 24 pozzetti alla volta in modo che le cellule fannoNon asciugare.\nAggiungere 150 ml di 1x DEAE-Destrano + 1% FBS in DMEM miscela in ogni pozzetto usando una pipetta di 1.000 ml. Non utilizzare ripetere pipetta come questo sconvolge il monostrato.\nAggiungere 150 ml di ogni diluizione virus per il bene appropriato. Aggiungi virus al centro del pozzo e miscelare delicatamente per distribuire uniformemente il virus attraverso il monostrato cellulare. Incubare le cellule infette per 2 ore in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e 5% di CO 2.\nDopo l'incubazione 2 ore, aggiungere 0,5 ml di 10% FBS in DMEM a ciascun bene e tornare piastre ad incubatore per un supplemento di 48 ore.\nDopo 48 ore, le cellule dovrebbero essere al 100% confluenti. Perché MJ4 è un virus competente replica, ci sarà qualche morte cellulare, ma questo è da aspettarselo.\nRimuovere i supporti di ogni bene e aggiungere 400 ml / pozzetto di soluzione di fissaggio (vedi Tabella 8A per ricetta). Fissare un solo piatto per volta. Aggiungi il fissaggio soluzione con una pipetta 1000 ml, e lasciate riposare per 5 minuti atemperatura ambiente.\nRimuovere la soluzione di fissaggio e lavare 3 volte con PBS con Ca 2 + / Mg 2 +. Utilizzare uno spruzzatore per aggiungere delicatamente PBS al lato del bene per evitare di interrompere il monostrato. Dopo il terzo lavaggio, asciugare piatto asciugare su carta assorbente.\nAggiungere 400 ml / pozzetto di soluzione colorante (vedi Tabella 8B per la ricetta) in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e incubare a 37 ° C per almeno 2 ore. Tempi di incubazione più lunghi sono accettabili, ma i tempi di incubazione dovrebbero essere mantenuti coerenti tra esperimenti titolazione.\nLavare 2x con PBS con Ca 2 + / Mg 2 + e il punteggio per l'infezione, o aggiungere PBS e conservare a 4 ° C per il punteggio più tardi. Le piastre possono essere conservati a 4 ° C fino a quattro giorni, finché il monostrato viene mantenuta idratata.\nA segnare per l'infezione, utilizzare un pennarello indelebile per dividere pozzetti della piastra da 24 pozzetti in quadranti. Contare tutte le cellule blu all'interno di un campo di vista, utilizzando un ingrandimento totale di 200X, una volta inciascuno dei quattro quadranti di un pozzo.\nCalcola unità infettive per ml come segue: [(# cellule blu / 4) x 67] / (ml virus aggiunto) = IU / ml. Fare riferimento alla Tabella 8C per il volume in ml di virus aggiunto a ciascun pozzetto. Media diversi pozzi insieme; i numeri dovrebbero essere relativamente simile per una titolazione accurata.\n5 Preparazione di cultura media e propagazione di cellule in vitro per GXR25 replica Assay\nPreparare completo RPMI (cRPMI) per la propagazione delle cellule GXR25. NOTA: E 'estremamente importante per le cellule cultura GXR25 almeno 4 mesi prima esperimenti di replica previste (vedi Tabella 9).\nCellule Split 01:10 due volte a settimana e mantenere la densità delle cellule fra 1 x 10 5 a 2 x 10 6 cellule / ml.\n6. In replica vitro di Gag-MJ4 Chimere in GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Celle\nIl giorno prima l'infection, dividere cellule ad una concentrazione tra 2-3 x 10 5 cellule / ml in modo che siano in crescita logaritmica del giorno dell'infezione.\nIl giorno di infezione, rimuovere le riserve di virus da -80 ° C freezer e scongelare. Calcolare il volume di virus necessaria ciascuno stock sulla base della UI / ml titolo di dosaggio cella TZM-bl per infettare 5 x 10 5 cellule GXR25 ad una molteplicità di infezione di 0,05, con la formula:\nVolume di virus per l'infezione (ml) = 1 ml / X UI x 0.05 x 500.000\nNOTA: Abbiamo scelto una MOI di 0,05 come questo si traduce in una fase di crescita logaritmica per tutti i virus che abbiamo testato. È importante condurre esperimenti iniziali per determinare l'ottimale MOI per catturare la crescita logaritmica per il virus da testare.\nDiluire virus in cRPMI ad un volume di 100 microlitri (per ottenere un MOI 0,05) e inserirlo in un pozzetto di una coltura tissutale V-Fine trattati piastra da 96 pozzetti. Nota: Includere sia positive (MJ4 WT infetto) e negativo (cellule infettate finto) controllo in ogni serie di esperimenti di replica. Impostare la piastra tale che ogni altra colonna è vuota per limitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. Il controllo positivo è indispensabile, come sarà utilizzato in seguito come standard per normalizzare le piste di replica, che sono una misura del tasso di replicazione di repliche sperimentali.\nContare le celle GXR25 utilizzando un contatore automatico di cellule. Calcolare il numero di cellule necessarie in totale per tutte le infezioni (5 x 10 5 x # infezioni). Aliquota il volume richiesto in un tubo da 50 ml e centrifugare a pellet di cellule. Calcolare Sempre per il 25% le infezioni più del necessario.\nSupporti Aspirare accuratamente e risospendere in cRPMI una concentrazione di 5 x 10 5 cellule / 100 microlitri.\nCellule Pipettare in un trogolo sterile e mescolare accuratamente. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenenti il virus diluito. Mix accuratamente.\nAggiungere 2 ml di soluzione 5 mg / ml (100x) di polibrene in ogni pozzetto e mescolare accuratamente cellule.\nIncubare a 37 ° C nel tessuto cultura incubatore con il 5% di CO 2 per 3 ore.\nPer lavare le cellule infette, centrifuga 96 pozzetti piastra V-bottom a pellet di cellule. Quindi rimuovere con cautela 150 ml di medium e sostituirlo con fresche 150 ml di cRPMI senza disturbare il pellet di cellule. Ripetere altre 2 volte (compresa la centrifugazione) per lavare sufficientemente cellule.\nDopo l'ultima centrifugazione e l'aggiunta di 150 ml cRPMI, risospendere il pellet cellulare con una pipetta multicanale e aggiungere la miscela di cellule / virus (circa 200 ml) da ciascun pozzetto indipendente a 800 ml di cRPMI in un pozzo di un tessuto 24 pozzetti piastra di coltura.\nPosizionare la piastra in 5% di CO 2 tessuto cultura incubatore a 37 ° C.\nOgni due giorni, togliere 100 ml di surnatante dalla superficie della cultura bene e trasferire ad un ben-96 Upiastra -bottom e conservare congelati a -80 ° C fino al corretto funzionamento virus test quantificazione. NOTA: Disposizione accurata dei surnatanti in piastre a 96 pozzetti consentirà per il multi-canale di trasferimento pipetta di surnatanti di coltura durante virione quantificazione tramite un test radioattivo trascrittasi inversa (RT). Ogni piastra deve contenere campioni provenienti da uno standard di infezione al fine di normalizzare la variazione inter-piastra nel test di lettura RT.\nDopo aver rimosso ogni campione 100 microlitri, celle divise 1: 2 da cellule accuratamente risospendere e rimuovendo la metà del volume residuo (450 microlitri). Ripristina volume originale (1 ml) con l'aggiunta di 550 ml di fresca cRPMI in ciascun pozzetto.\n7 Analisi della trascrittasi inversa (RT) in coltura cellulare surnatanti\nProtocollo adattato da Ostrowski et al 40.\nImpostare cappa di sicurezza biologica in una struttura BSL-3 per l'uso con materiali radioattivi.\nPosizionare la carta assorbente in hood e sostituire aspirazione per aspiratore designata per l'uso radioattivo. Nota: Tutti i rifiuti radioattivi devono essere correttamente smaltiti con conformità alle norme di sicurezza.\nAggiungere 1-2 ml di 10 mCi / ml di [α- 33 P] dTTP e 4 ml di 1 M ditiotreitolo (DTT) per ogni 1 ml aliquota di RT master mix (vedi Tabella 10 e Ostrowski et al. 40).\nMescolare accuratamente ogni provetta da 1,5 ml microcentrifuga di RT master mix, DTT, e [α- 33 P] dTTP con una pipetta 1.000 microlitri e trasferimento in un trogolo sterile.\nVersare 25 ml di etichetta RT mescolano in ciascun pozzetto di 96 pozzetti a parete sottile piastra PCR. Nota: Includere lo spazio per un controllo positivo (MJ4 infezione WT) e il controllo negativo (infezione Mock).\nAggiungere 5 ml di ogni supernatante alla piastra PCR contenente la master mix RT.\nSigillare piastra PCR con copertura foglio adesivo e incubare per 2 ore a 37 ° C in un termociclatore. Per motivi di sicurezza, rinSE puntali per pipette con Amphyl e smaltire punte in piccolo contenitore contenenti rifiuti Amphyl, che sarà poi essere smaltiti nei rifiuti radioattivi.\nDopo l'incubazione, fare piccoli fori nella pellicola di copertura con un 200 microlitri pipetta multicanale. Nota: Se i puntali delle pipette toccano liquido in bene, sostituire suggerimenti prima di passare alla colonna successiva o riga.\nMix campioni 5x e trasferimento 5 ml di ciascun campione sulla carta DE-81. Asciugare 10 min.\nMacchie Lavare 5x con 1x SSC (cloruro di sodio, citrato di sodio), e poi 2x con il 90% di etanolo a 5 minuti a lavaggio. Lasciare asciugare all'aria.\nMettete ogni macchia in un contenitore lavaggio separato, come ad esempio una scatola di immagazzinaggio panino, aggiungere il tampone di lavaggio abbastanza (1x SSC o il 90% EtOH) per coprire macchia, e agitare per 5 minuti.\nEliminare il tampone di lavaggio nel contenitore e ripetere separato. Nota: I primi 3 lavaggi sono considerati radioattivi e devono essere smaltite correttamente. Gli ultimi 2 lavaggi possono essere smaltiti regolarmente.\nUna volta asciutto, autoefully avvolgere macchia a Saran avvolgere ed esporre ad un phosphoscreen in un cassetto ben chiuso durante la notte a temperatura ambiente.\nAnalizzare phosphoscreens con phosphorimager e quantificare trascrizioni radioattivi.\nDisegnare un cerchio attorno ad ogni segnale radioattivo utilizzando il software OptiQuant. Rappresentare graficamente i valori di Unità Digital Light (DLU) per generare le curve di replica.\nAl fine di generare punteggi di capacità di replica, i valori DLU erano log 10 -transformed e piste sono state calcolate utilizzando il giorno 2, 4, e 6 punti di tempo. Replica piste sono poi divisi per il pendio di WT MJ4 nei punteggi di capacità di replica ordine generare. E 'importante per normalizzare base ai valori MJ4 WT ottenuti dalla stessa piastra RT per ridurre la variabilità intra-saggio.\nPer eseguire correttamente questo protocollo, che crea un plasmide provirale in grado di assemblare completamente funzionale, infettive chimere Gag-MJ4, grande cura deve essere presa per generare le opportune ampliconi della PCR. Determinare se la PCR ha generato all'amplicon bavaglio di dimensioni appropriate è fondamentale. I prodotti dovrebbero essere meno di 100 paia di basi (bp) del amplicone circa 1.700 bp rappresentato nella figura 1A. La lunghezza esatta di questo frammento varierà a seconda del gene gag sotto studio. Successivamente, la porzione 5 'ripetizione terminale lunga (LTR) del clone molecolare MJ4 deve essere amplificato e impiombato all'amplicon gag al fine di renderlo adatto successiva clonazione. Il ampliconi MJ4 LTR dovrebbe essere 1.474 bp di lunghezza. Figura 1B mostra un'immagine rappresentativa del gel per i quali sono indicati i formati di banda corrette. Dopo la giunzione-sovrapposizione-extension PCR 41, prodotti gag LTR- combinati dovrebbero esserecirca 3.200 bp di lunghezza, come illustrato nella Figura 1C.\nUna volta che il gene gag è stato reso adatto per clonazione per fusione al 5 'LTR da MJ4, che contiene il sito necessario NgoMIV restrizione, sia vettoriali e inserto gag deve essere digerito con NgoMIV e BclI enzimi di restrizione e asportato da un gel di agarosio dopo elettroforesi separazione. E 'indispensabile per asportare le appropriate bande vettoriali e inserti. Un gel rappresentativo è mostrato in Figura 2. La porzione vettore del plasmide MJ4 dovrebbe essere di circa 10.000 bp di lunghezza, mentre la LTR- inserto gag dovrebbe rimanere a circa 3.000 bp di lunghezza, come i siti di restrizione sono situati alle estremità di all'amplicon. Qualsiasi riduzione significativa delle dimensioni indicherà un taglio ulteriore sito all'interno del gene gag in fase di studio.\nDopo legatura dei due frammenti, trasformazione batterica, unand isolamento del DNA plasmidico, le chimere Gag-MJ4 deve essere controllato per dimensioni adeguate eseguendo un doppio digest con NgoMIV e HPAI enzimi di restrizione. Figura intera chimere Gag-MJ4 che non sono sostenute eventi soppressione durante la replicazione batterica dovrebbe avere un profilo di restrizione simile a quello illustrato nella figura 3, con due bande di circa 8.700 e 4.300 bp.\nUn'importante distinzione di questo protocollo rispetto agli approcci precedenti, è l'uso del clone molecolare di HIV-1 sottotipo C infettiva, MJ4, piuttosto che il virus NL4-3-laboratorio adattato più comune. Tuttavia, gli approcci descritti nella sezione precedente possono essere modificate per la clonazione di sequenze sottotipo B gag in pNL4-3.\nL'ottimizzazione della molteplicità di infezione (MOI) da utilizzare in successivi esperimenti è stata eseguita al fine di selezionare il MOI ideale che ha mostrato una crescita logaritmica della maggioranza dei virus testati.La Figura 4 illustra le curve rappresentative replica da tre differenti MOI (0,01, 0,05 e 0,25) per MJ4 (Figura 4A) nonché per NL4.3 (Figura 4B). MJ4 replica molto meno efficiente in cellule GXR25 che NL4-3, che è importante prendere in considerazione, come un adeguato MOI per la replica NL4-3 sarebbe probabilmente troppo basso per rilevare la replica MJ4 efficiente. Come si vede nella figura 4A, una MOI di 0,05 rispetto a 0,01 o 0,25, è stata la scelta ideale, perché la crescita logaritmica è stata osservata tra 2-6 giorni per MJ4. Per il MOI più basso, 0.01, giorno 6 valori DLU sono appena rilevabili, e abbiamo anticipato la generazione di Gag-MJ4 virus chimerici che replicava inferiore MJ4. Quindi questo MOI non cogliere la crescita dei più attenuati chimere Gag-MJ4, che possono anche essere biologicamente più critica. Inoltre, una MOI di 0,25 non era ideale, perché la rapida cinetica di replicazione virale ucciso un amou sostanzialent di cellule, anche di giorno 4 Questo fa sì che la curva di replica ad un plateau, e calcolando un pendio sulla base di una curva come questo porterebbe a sottovalutare la capacità di replica. Sulla base di curve generate per NL4-3, anche a una MOI di 0,01, target cellulari disponibili sono stati esauriti notevolmente di giorno 6 dopo l'infezione. In conclusione, una MOI di 0,05 è risultato ottimale per un grande pannello di Gag-MJ4 virus chimerici, i quali avevano diverse sequenze Gag e vari gradi di replica.\nUn totale di 149 Gag-MJ4 virus chimerici derivati dal sottotipo acuta sequenze C Gag sono stati testati per la replica in vitro utilizzando questo test. I valori normalizzati RC variavano da 0,01 a oltre 3,5 con alcuni virus che replicano più di 100 volte più efficiente rispetto wild-type MJ4. Figura 5 mostra le curve di replica di nove rappresentative virus chimerici Gag-MJ4, con wild-type MJ4 raffigurati in rosso, e dimostra l'ampia gamma di replica capacities osservati. Così, la diversità di sequenza nel gene gag solo può influire drasticamente la capacità del virus di replicare in vitro. Mentre questo è rappresentativo di Gag-MJ4 virus chimerici derivati da Zambia infezione acuta, altre sequenze sottotipo C non sono stati ampiamente testati, e possono presentare diverse cinetiche di replica. Pertanto, grande cura deve essere presa per ottimizzare il MOI per soddisfare la replica specifico dei virus di uno studio particolare, perché non ci può essere una vasta gamma dei livelli di replica tra differenti di HIV-1 backbone e Gag isolati.\nUno dei vantaggi di utilizzare una linea di cellule T, come la linea cellulare GXR25, che supporta la replica di MJ4, è il livello di riproducibilità osservato rispetto agli esperimenti di replica utilizzando stimolato cellule mononucleate del sangue periferico come bersagli. In esperimenti di ottimizzazione iniziali, MJ4 wild type esibito una variabilità intra-saggio del 8,7%, e different cloni della stessa Gag-MJ4 virus chimerico esposto variabilità nella replicazione del 8,5%. Poiché diversi master mix e delle esposizioni phosphoscreen possono dare valori DLU che differiscono leggermente in grandezza, la variabilità intra-assay può essere ulteriormente controllata eseguendo lo stesso standard virus (nel nostro caso wild-type MJ4) in ogni piatto test RT. Figura 6 grafici del valori DLU derivano dalla stessa infezione MJ4, quantificato in otto diverse piastre RT. Normalizzare ad un virus che è comune a tutti i saggi RT può contribuire ad attenuare il potenziale errore indotto da questi lievi cambiamenti nella grandezza del segnale tra saggi.\nInter-dosaggio variabile è stato anche testato e replica ripetuto in giorni diversi sono stati altamente correlati. Figura 7 grafici i valori punteggio RC normalizzati da due esperimenti indipendenti effettuati circa un anno di distanza. Un alto grado di correlazione con l'assenza di importanti valori anomali (R 2 = 0,873) è stata osservata between le due repliche indipendenti.\nSebbene altamente correlati, vi è una certa variabilità nella grandezza globale di cinetica di replica tra i due esperimenti indipendenti. Questo può essere attribuito in parte alla differenza di numeri di passaggio tra le cellule GXR25 supporti utilizzati in ciascun esperimento. In generale, GXR25 cellule scorte che sono stato posto per un periodo di tempo superiore a 6 mesi tendono a supportare la replica più efficiente delle chimere Gag-MJ4. Pertanto, si consiglia di valutare la capacità di replica tra gruppi di chimere in un arco di tempo di un mese. Quando i passaggi precedenti sono seguiti da vicino, questo test è in grado di produrre risultati molto robusti e riproducibili, che sono applicabili a una vasta gamma di studi.\nFigura 1 Rappresentante gel images raffiguranti separazione elettroforetica dei prodotti di PCR. Per tutti i prodotti di PCR, 5 ml di ogni reazione di 50 microlitri è stato mescolato con 3 ml di 5x loading dye, caricato in un 1% di agarosio-TAE gel integrato con 1X SYBR-safe macchia gel del DNA, e separati mediante elettroforesi a 120 V per 45 minuti. Il Promega 1 kb DNA ladder (corsia 1) è stato utilizzato per approssimare le dimensioni ampliconi. A) Il gene gag è stato amplificato da RNA virale con un approccio nested PCR. A causa di inserimenti e cancellazioni, all'amplicon bavaglio può variare da 1.600-1.700 bp in lunghezza e appare leggermente sopra il marcatore DNA ladder 1.500 bp. Lanes 2-5 raffigurano successo amplificazione del gene gag. B) Il 5 'LTR di MJ4 è stato amplificato dalla wild-type MJ4 plasmide e visualizzato tramite separazione elettroforetica. Lanes 2-5 raffigurano successo l'amplificazione del prodotto LTR 1.474 bp, che appare leggermente inferiore al 1500 bp marcatore scala del DNA. C) Il 5R17; LTR derivato da wild-type MJ4 e il gene gag amplificato dal plasma del paziente sono fusi insieme con giunzione-overlap-extension PCR e visualizzato tramite separazione elettroforetica. Lanes 2-5 raffigurano fuso con successo ampliconi che sono circa 3.200 bp in termini di dimensioni, e che appaiono leggermente sopra il marcatore DNA ladder 3.000 bp.\nFigura 2 immagine gel Rappresentante raffigurante separazione elettroforetica di restrizione digerisce per la clonazione di geni gag paziente in MJ4. Wild-tipo MJ4 plasmide e LTR- gag prodotti di fusione sono stati digeriti con BclI per 1,5 ore a 50 ° C e NgoMIV per 1 ora a 37 ° C. Inserto vettoriali e frammenti sono stati visualizzati tramite separazione elettroforetica su un 1% di agarosio-TAE gel integrato con 1X SYBR-safe DNA gel macchia a 100 V per 2 ore e con un illuminatore luce blu al fine di ridurre i danni al DNA indotto dai raggi UV. I frammenti vettoriali e inserti adatti per le successive fasi di clonazione appaiono circa 10.000 bp e 2900 bp rispettivamente.\nFigura 3: immagine del gel Rappresentante raffigurante separazione elettroforetica di digest restrizione di purificato Gag-MJ4 chimera DNA plasmidico. Purificato Gag-MJ4 chimera plasmide DNA è stato digerito con doppio NgoMIV e la restrizione HPAI enzimi per 2 ore a 37 ° C. Digest di restrizione sono stati visualizzati tramite separazione elettroforetica su un 1% di agarosio-TAE gel integrato con 1X macchia gel DNA SYBR-safe a 120 V per 45 min. I plasmidi senza grandi delezioni risolveranno a due bande distinte di circa 8.700 e 4.300 bp.\nFigura 4 La replica di MJ4 e NL4-3 isolati di HIV-1 nella linea cellulare GXR25 a diverse molteplicità di infezione (MOI). 5 x 10 5 GXR25 cellule sono state infettate come descritto nel protocollo di metodo con 5-fold aumento MOI di ciascuno stock di virus. I surnatanti sono stati raccolti nei giorni 2, 4, 6, e l'infezione e virione produzione 8 post è stato quantificato tramite un test radioattivo trascrittasi inversa. Le infezioni sono state eseguite in triplicato e le barre di errore indicano la deviazione standard per le tre repliche. (A) MJ4 (B) NL4-3.\nFigura 5 gamma Rappresentante di replica per diverse chimere Gag-MJ4. 5 GXR25 cellule sono state infettate con il wild-type MJ4 o Gag-MJ4 chimere ad una MOI di 0,05, surnatanti sono stati raccolti a intervalli di due giorni post-infezione, e la produzione virione quantificati da un radiomarcato RT test. Inserimento di vari sottotipo C geni gag derivata può avere un impatto drammatico sulla capacità di replica di MJ4. MJ4 replica wild-type è indicato in rosso.\nFigura 6 Confronto di variazione intra-assay nella trascrittasi inversa radiomarcata (RT) test di quantificazione. Il grafico raffigura intrinseca variabilità intra-assay tracciando i valori DLU degli stessi surnatanti da una singola infezione MJ4 wild-type in otto diversi test RT piastre. La variazione in curva riflette le lievi variazioni di scommessa segnale grandezzapiastre di Ween, che possono essere corretti per eseguendo una norma su ogni piatto RT, che può essere successivamente utilizzato per normalizzare le pendici del chimere Gag-MJ4 testati sulla stessa piastra.\nFigura 7 riproducibilità del dosaggio di replica nel corso del tempo nella linea cellulare GXR25. Gli stessi virus chimerici Gag-MJ4 sono stati usati per infettare le cellule GXR25 in due esperimenti indipendenti eseguiti circa un anno di distanza. Punteggi di replica sono stati generati calcolando la pendenza dei valori DLU log-trasformati e normalizzando che degradano a wild-type MJ4. Chimere Gag-MJ4 che replicano più efficiente rispetto wild-type MJ4 avere punteggi di replica maggiori di 1, e quelli che replicano meno efficiente rispetto wild-type MJ4 avere punteggi di replica meno di 1 Le due misure indipendenti sono fortemente correlati (R 2 = 0.87, regressione lineare) ed evidenziare la riproducibilità dei test eseguiti in tempi diversi e con le cellule a diversi passaggi.\nReagente Volume di reazione 1x (ml)\n2x miscela di reazione (Invitrogen) 25\nPriva di nucleasi H 2 O 17\nForward Primer GOF (20 mM concentrazione) 1\nPrimer Reverse Vifor (20 concentrazione mM) 1\nSuperScript III One-step Enzyme Mix 1\nModello di RNA 5\nNumero di cicli Tempo (h: min: sec) Temperatura (° C)\n05:00 + 5 sec / ciclo 68\nTabella 1 A) e B mix Master) gag di amplificazione. * Nota: sequenza GOF Primer: 5'-ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA-3 '. Vifor sequenza di primer: 5'-TTCTACGGAGACTCCATGACCC-3 '.\nPriva di nucleasi H 2 O 35.5\ndNTP (deossinucleotidi 40 mm) 1\nPrimer Forward GagInnerF1 (20 concentrazione mM) 1\nPrimer Reverse BclIDegRev2 (20 concentrazione mM) 1\nPrimo turno-PCR come modello 1\nTabella 2 A) e B mix Master) condizioni Thermocycler per nested secondo turno di amplificazione bavaglio. * Nota: GagInnerF1 sequenza di primer: 5'-AGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3 '. BclIDegRev2 sequenza di primer: 5'-AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR-3 '.\nPrimer Forward MJ4For1b (20 concentrazione mM) 1\nPrimer Reverse MJ4Rev (20 concentrazione mM) 1\nMJ4 plasmide come modello (10 ng / ul) 1\nTabella 3 A) e B mix Master) condizioni Thermocycler per 5 'MJ4 LTR di amplificazione. * Nota: sequenza MJ4For1b Primer: 5'-CGAAATCGGCAAAATCCC-3 '. MJ4Rev sequenza Primer: 5 '-CCCATCTCTCTCCTTCTAGC-3 '.\nPriva di nucleasi H 2 O 34.5\nPrimer Reverse BclIRev (20 concentrazione mM) 1\nMJ4 LTR 1.3 kb ampliconi (gel purificato, ~ 50 ng) 1\nAmpliconi Gag (gel purificato, ~ 100 ng) 1\nTabella 4 A) e B mix Master) condizioni Thermocycler per splice-overlap-extension PCR per generare inserti gag LTR-. * Nota: sequenza BclIRev Primer: 5'-TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT-3 '\nReagente Volume di reazione 1x (ml) Incubazione (hr) Incubazione Temperatura (° C)\n1,5 mg di 3 kb LTR- gag ampliconi o MJ4 plasmide x ml per 1,5 mcg\nNEB CutSmart Buffer (precedentemente ONA Buffer # 4) 2\nBclI enzima di restrizione 1\nPriva di nucleasi H 2 O x\nVolume totale 19 1.5 50\nNgoMIV enzima di restrizione 1\nVolume totale 20 1 37\n50 ng taglio MJ4 vettore plasmidico x ml per 50 ng\n45 ng taglio LTR- inserto gag (rapporto 3: 1) x ml per 45 ng\nTampone di ligasi Roche 10x 2\nT4 DNA ligasi Roche (5 U / ml) 1\nPriva di nucleasi H 2 O\nVolume totale 20 18 + (durante la notte) 4\n450 ng di Gag-MJ4 plasmide x ml per 450 ng\nNgoMIV enzima di restrizione 0.5\nHPAI enzima di restrizione 0.5\nVolume totale 20 2 37\nTabella 5 A) Limitazione digerire master mix e B) la reazione legatura per la generazione di Gag-MJ4 provirus chimerico. C) limitazione diagnostica digest per garantire Gag-MJ4 clonazione fedeltà.\nNome Primer Sequenza nucleotidica (5 '- 3')\nTabella 6 Elenco dei primer di sequenziamento necessari per confermare 5 'LTR e la sequenza gag identità di Gag-MJ4 provirus chimerico.\nBeh A 8 virus ml + 232 ml 1% FBS in DMEM\nBeh B 80 microlitri di Be A + 160 ml 1% FBS in DMEM\nBeh C 80 microlitri di Well B + 160 ml 1% FBS in DMEM\nBeh D 80 microlitri di Be C + 160 ml 1% FBS in DMEM\nBene E 80 microlitri di Ben D + 160 ml 1% FBS in DMEM\nBeh F 80 microlitri di Bene E + 160 ml 1% FBS in DMEM\nTabella 7 schema di diluizione (3volte) per la titolazione di virus infettivi sulle cellule TZM-bl.\nPBS senza Ca 2 + e Mg 2 + 500 ml\nGlutaraldeide 4 ml\nFormaldeide 11 ml\n* Nota: Conservare a 4 ° C.\nPBS senza Ca 2 + e Mg 2 + 4,75 ml\nFerricianuro di potassio (0.2 M) 100 ml\nFerrocianuro di potassio (0.2 M) 100 ml\nCloruro di magnesio (1 M) 20 microlitri\nX-gal (50 mg / ml) 40 microlitri\n* Nota: Fare fresco e conservare al riparo dalla luce fino al momento dell'uso.\nBen diluizione originale La B C D E F\nVolume di virus (microlitri) aggiunto ai pozzetti di una riga 24-pozzetti 5 1,6667 0,5556 0,1852 0,06173 0,02057\nTabella 8 A) B) soluzioni di fissaggio per la titolazione dei virus chimerici Gag-MJ4 sulla linea cellulare spia TZM-bl. C) Il volume di virus aggiunto per pozzetto per calcolare le unità infettive / ml.\nSiero fetale bovino (FBS), definito 55 ml\nPenicillina, streptomicina, glutammina (100x) 6 ml\nTampone HEPES (1 M) 6 ml\nTabella 9 Ricetta per mezzo completo RPMI per la propagazione delle cellule GXR25.\nTris-Cl, pH 7.8 (1 M) 30\nCloruro di potassio (1 M) 37.5\nCloruro di magnesio (1 M) 2.5\nAcido Polyadenylic, sale di potassio (2 mg / ml) 1.25\nOligo-dT Primer (25 mg / ml) 3.25\nTabella 10 Ricetta per radiomarcato reverse trascrittasi Assay Mix master. * Nota: Conservare in 1 ml aliquote a -20 ° C.\nA causa della lunghezza e la natura tecnica di questo protocollo, ci sono diversi passaggi che sono fondamentali sia per la costruzione di successo di plasmidi chimerici Gag-MJ4 nonché per la quantificazione della capacità di replicazione virale. Anche se la strategia di clonazione basata enzima di restrizione per l'introduzione di geni gag estera in MJ4 descritto in questo protocollo ha numerosi vantaggi rispetto ai metodi basati ricombinazione utilizzati in precedenza, il protocollo può essere tecnicamente difficile se passi critici non vengono seguite con precisione.\nIn primo luogo, è assolutamente indispensabile utilizzare MJ4 DNA plasmidico che è stato generato in un ceppo batterico competente mancano DCM ed diga metilasi DNA. Ciò è necessario in quanto l'attività enzimatica della endonucleasi di restrizione BclI, che viene utilizzato per clonare geni gag nella spina dorsale MJ4, è diga / DCM metilazione sensibile. Il JM110 e SCS110 (un Enda negativo derivato JM110) E. coli ceppi unre adatto per la generazione di DNA non metilato MJ4 plasmide. Inoltre, per l'asportazione di bande vettoriali e inserti, è altamente raccomandato che un illuminatore luce blu da utilizzare per la visualizzazione. Ciò consentirà di ridurre il danno al DNA di lunghezza d'onda UV-dipendente e aumentare drasticamente l'efficienza di clonazione. Se un illuminatore luce blu non è disponibile, la clonazione efficienza può essere massimizzata visualizzando DNA con il DNA Sicuro SYBR macchia gel invece di bromuro di etidio e riducendo al minimo il tempo di esposizione ai raggi UV.\nInfine, la clonazione molecolare con grande (> 10kb) e / o plasmidi retrovirali, come MJ4 è sempre stato difficile per una serie di motivi. Grandi plasmidi riducono l'efficienza di trasformazione di ceppi batterici competenti 42, mentre gli inserti retrovirali, che contengono lunga terminal repeat (LTR) sequenze, ridurre la stabilità del plasmide e il compromesso replica fedeltà del DNA plasmide all'interno dell'ospite batterico che conduce al delezioni del genoma retrovirale 43 E. coli sopra il ceppo DH5α, nelle nostre mani. A causa della natura instabile del plasmide, prodotti plasmidi purificati devono sempre essere controllati per la corretta dimensione del plasmide da enzimi di restrizione; qui, una doppia digest con i NgoMIV e HPAI enzimi di restrizione a 37 ° C per 2 ore.\nUna volta riuscita generazione di plasmidi chimerici Gag-MJ4 è stato compiuto, il virus viene generato tramite trasfezione di 293T cellule, titolato su una linea indicatore di cellule, le cellule TZM-bl, e la capacità di replica viene misurata utilizzando una linea cellulare T-based CEM. La linea cellulare GXR25 basato CEM utilizzato per questi studi di replica è una delle poche linee di cellule T istituito in grado di supportare l'ingresso e la replicazione di ceppi CCR5-tropico di HIV-1. Questo è stato ottenuto trasduzione retrovirale per consentire l'espressione stabile di CCR5 umano 37. Questa linea cellulare esprime naturalmente CXCR4 e sosterrà la replica di CXCR4-tropico HIV-1, come il ceppo adattato in laboratorio NL4-3. Tuttavia, al fine di sostenere la replicazione efficiente di ceppi CCR5-tropico, come MJ4, le cellule GXR25 devono essere propagate per non meno di 4 mesi prima dell'infezione. Correttamente culture passaggi possono supportare la replica anche dopo passaging per fino a 1 anno. Attento monitoraggio della replicazione CCR5-tropico in tutta passaging è essenziale per gli esperimenti di successo.\nCome con qualsiasi tecnica, ci sono delle limitazioni al proprotocollo che deve essere considerato. Grazie alla posizione dei siti di restrizione del plasmide MJ4, nonché la disponibilità di siti di restrizione conservati in naturalmente HIV-1 isolati, sito di restrizione distale del 3 ', BclI, si trova a 137 nucleotidi dalla fermata bavaglio codone. Anche se questo genera un gene chimerico proteasi, questa regione è 96,5% conservata in questa coorte, e non abbiamo osservato una grande varietà di virus chimerici morti o difettosi.\nUno dei vantaggi di utilizzare il MJ4 sottotipo C clone molecolare infettivo con sottotipo C sequenze derivate è che riduce il rischio di accoppiamento gene non ottimale tra i geni gag e vettori backbone di diversi sottotipi. Tuttavia, una certa quantità di diversità all'interno-clade esiste come dimostra il raggruppamento di HIV-1 sequenze per paese o regione, anche quando ha trovato all'interno dello stesso sottotipo 31. Questo potrebbe contribuire ad accoppiamento ottimale tra i geni gag derived da Zambians con infezione acuta e contagiosa la spina dorsale clone molecolare MJ4, che è stato derivato da un individuo cronicamente infettati dal Botswana 38. Tuttavia, la maggior parte dei costrutti analizzati prodotta virus progenie infettante. Come diverso HIV-1 sottotipo C cloni molecolari infettivi diventano più ampiamente disponibile, sarà importante per validare ulteriormente questo sistema clonazione in questi geni gag di HIV-1 clade C in altre dorsali, al fine di garantire che vi sia una distorsione minima introdotta a causa di incompatibilità spina dorsale.\nLa linea cellulare GXR25 è una linea cellulare unico, in particolare per la sua capacità di supportare sia CXCR4 e ceppi CCR5-tropico e la sua HIV-1 GFP inducibile giornalista 37. Tuttavia, esistono alcune limitazioni e devono essere attentamente considerati prima di utilizzare questa linea cellulare per esperimenti adattati da questo protocollo. La linea cellulare GXR25 non sembra supportare l'immissione di una maggioranza di sottotipo C o A, CCR5-tropico, primary isola abbiamo testato. Inoltre, la linea cellulare CEM genitore da cui la linea cellulare GXR25 è stato derivato mostre alti livelli di cyclophilin A, fino a 2 a 4 volte superiore di espressione rispetto alla linea cellulare Jurkat 44. A causa di alti livelli di cyclophilin A, il difetto replica normalmente associata con la canonica HLA-B * 57 associato fuga mutazione, T242N, che viene attribuito ad una diminuzione della capacità di capside di legare cyclophilin A, non può essere facilmente individuata in questa particolare linea cellulare 25. Così la linea cellulare GXR25 basato CEM non è l'ideale per studiare i difetti di replica associati a mutazioni del virus HIV-1 capside loop-cyclophilin vincolante.\nInfine, anche se questo protocollo è l'ideale per analizzare la capacità di replicazione di sequenze gag derivate da momenti acuti, le modifiche devono essere effettuate al fine di studiare la capacità di replica di imbavagliare geni derivati da individui con infezione cronica. Questo protocollo prevede l'amAmplificazione di sequenze di popolazione da momenti acuti (mediana 45 giorni Inseriti di infezione stimato) quando la diversità virale è limitata. Il gene gag da ogni chimera viene sequenziato e confrontato con la popolazione iniziale PCR amplicone per garantire la clonazione di fedeltà. A causa della diversità sequenza limitata in momenti acuti, la clonazione da popolazione di PCR prodotti è possibile. Tuttavia, la diversità sequenza esiste all'interno delle quasispecie virali di un individuo cronicamente infetto; Pertanto, al fine di valutare con precisione la capacità di replicazione delle quasispecie croniche, singolo amplificazione del genoma deve essere impiegato per catturare diverse varianti rappresentativi. Ognuna di queste varianti devono poi essere analizzati per la replicazione in vitro.\nQuesta tecnica ha diverse applicazioni più ampie, che derivano dai suoi vantaggi rispetto ai metodi esistenti. Poiché questo processo si traduce in un clonale replica plasmide competente, è semplice da usare costrutti per ulteriori mstudi utagenesis, che possono contribuire a chiarire i contributi di residui specifici per la replicazione virale. Inoltre, clonando in geni gag da punti di tempo longitudinali, si può valutare l'evoluzione della capacità di replicazione virale nel corso del tempo e di come questi cambiamenti possono influenzare la patogenesi in un HIV-1 individuo infetto.\nQuesta tecnica può essere modificato al fine di ampliare la sua utilità per diverse applicazioni. Ulteriori HIV-1 proteine virali possono essere progettati nel plasmide MJ4 al fine di valutare gli effetti sulla replicazione virale e le loro interazioni con proteine dell'ospite. Questo può essere ottenuto progettando restrizioni ulteriori siti in regioni desiderati nel genoma attraverso l'introduzione di variazioni nucleotidiche silenti. Tuttavia, particolare attenzione dovrà essere posta nel ingegneria siti di restrizione romanzo nel 'metà del genoma di HIV-1, come molte proteine accessorie sono codificati in cornici di lettura alternati 3, e cambiamenti silenziosi in unproteine potrebbe portare a sostituzioni di aminoacidi in un altro. In questo caso, il sito di restrizione metodi di clonazione indipendenti, come quelli discussi da Dudley et al. 45 può superare questo limite. Sequenze virali derivate da popolazioni diverse possono avere diversi livelli di capacità di replica, e il MOI possono essere adeguati di conseguenza al fine di catturare la maggior parte degli isolati virali all'interno della loro fase logaritmica di crescita. Infine, la linea cellulare GXR25 è stato stabilmente trasfettate con GFP sotto un LTR-driven, promotore Tat-inducibile, e la diffusione virale può essere misurata in funzione di cellule GFP positive mediante citometria a flusso 37 come alternativa al test RT qui o descritti un p24 tradizionale ELISA.\nIn conclusione, questo protocollo prevede una tecnica efficace e potente per la valutazione della replicazione dell'HIV-1 virale conferita dal gene gag, che codifica per una proteina strutturale conservata necessario per la corretta formazione del virione, Erba, maturazione e smontaggio 46-48. Inoltre, questa tecnica genera una replica competente plasmide clonale, che è ideale per studi di mutagenesi e, quindi, fornisce un metodo per analizzare le determinanti specifici aminoacidi di fitness virale. Studi come questi sono indispensabili per migliorare la comprensione di come l'evoluzione virale immunitario-driven colpisce patogenesi e progressione della malattia da HIV-1 in individui infettati.


Conch Tour Train di Key West | musement\nConch Tour Train di Key West\nHome / Key West / Conch Tour Train di Key West\nAmmira le più affascinanti attrazioni storiche di Key West\nVisita i luoghi di ispirazione frequentati da Ernest Hemingway\nViaggia fino a Truval Village, sede del Butterfly Conservatory e della Grotta Star of the Sea\nCome eredità della "ferrovia sul mare" di Henry Flagler, il Conch Tour Train ha una visione approfondita delle attrazioni più affascinanti, storiche e interessanti della città da 50 anni ... e il conteggio. Il Conch Tour Train ha preso il suo giro inaugurale nel 1958 e da allora offre tour in tutta Key West.\nIl treno Tour Conch parte ogni giorno dal Front Street Depot e termina a Mallory Square, uno dei luoghi più famosi di Key West. Durante il tour, non solo vedrai i luoghi più noti della zona, ma scoprirai anche i numerosi residenti, sia del passato che del presente, che rendono la Conch Republic uno dei luoghi più unici al mondo. Guarda alcuni dei luoghi frequentati da Hemingway e scopri perché Harry Truman ha trascorso così tanto tempo sull'isola. Ascolta i racconti di come vivevano, combattevano e lavoravano pirati, indiani e naufraghi, dando a Key West la sua straordinaria reputazione.\nGli ingegneri esperti sono "Conch", un termine usato per descrivere gli abitanti di Key West che o sono cresciuti qui o sono venuti per una visita e non si sono mai voltati indietro! Diventerete felici e illuminati con divertenti storie dei giorni passati e fatti interessanti su una delle città americane più discusse. Avrai anche una visione ravvicinata di alcune delle più belle architetture vittoriane della città meridionale e famosi tetti di lamiera.\nLo storico tour di Conch Tour Train dura 90 minuti e fa un giro completo attraverso Old Town Key West, comprende tre fermate, e mette in risalto viste, storie e intrattenimenti meravigliosi. Prendi posto sul Conch Tour Train e scopri i numerosi motivi per cui è popolare tra i visitatori e la gente del posto.\nMuseo di Hemingway\nla grotta della stella del mare.\nMappa a colori insieme a un coupon che include sconti per attrazioni, ristoranti e negozi\nI bambini sotto i 12 anni viaggiano gratis\nTrova gli stand presso il deposito dei treni Conch a Mallory Square o nel Truval Village all'angolo di Truman e il parcheggio Duval St. è disponibile presso Mallory Square o The Westin Parking Garage.\nI tour partono circa ogni 30 minuti\nChiuso il 28 ottobre 2017


Fugu, in Giappone il pesce palla è una specialità - Miyo Sushi\nIl fugu o pesce palla è un’autentica specialità della cucina Giapponese. E non solo; è infatti possibile degustarlo anche in forma di apprezzatissimo sashimi.\nMa questo alimento richiede una preparazione speciale per essere commestibile. Il pesce palla infatti al suo stato naturale secerne una tossina mortale. Se però l’idea vi fa impallidire, niente paura; i Giapponesi infatti sono maestri nella preparazione del pesce palla.\nCome vedremo, dopo il procedimento per rimuovere il veleno, la carne di questo pesce è davvero delicata e squisita. E si presta a numerose varianti; dal classico sashimi alla frittura. In Italia però è estremamente difficile poter assaporare questa prelibatezza, in quanto la legge proibisce la vendita del pesce palla. E in Giappone, il costo di questa specialità è giustamente elevatissimo; un piatto di fugu può costare perfino 200 euro.\nPartiamo quindi alla scoperta di uno dei piatti più tipici e affascinanti della tradizione gastronomica giapponese; preparatevi a conoscere i segreti del fugu!\nIl pesce palla e il suo veleno\nCome abbiamo visto, il termine fugu è il nome con cui i giapponesi identificano il pesce palla. In realtà esistono diverse specie di pesci in grado di “gonfiarsi” per allontanare i predatori; tutti appartengono alla famiglia dei Tetradontidi.\nI pesci palla possono vivere sia in acqua dolce che in acqua salata. La loro caratteristica principale non è però solo quella di gonfiarsi assumendo il classico aspetto a palloncino, quando si sentono minacciati.\nInfatti il loro corpo è anche ricoperto di spine molto prominenti, che permettono al pesce di difendersi dai predatori.\nMa c’è di più. Alcuni organi interni di questi pesci contengono infatti un veleno mortale; la tetrodotossina o TTX.\nveleno è contenuto in dosi massicce nel fegato dei pesci palla, ma può essere secreto anche dalla pelle dei pesci.\nSi tratta di uno dei veleni più potenti in tutto il mondo; una sola goccia può uccidere un uomo adulto per blocco cardiorespiratorio.\nI suoi agenti tossici sono fino a 100 volte superiori a quelli del cianuro. E per il veleno del fugu (comune però anche ad altri animali, fra cui alcuni piccoli polpi) non esiste antidoto.\nCome si prepara il fugu\nUn alimento del genere sembrerebbe avverso, sulla carta, al consumo umano. Non fosse altro per la sua tossicità! Ma la cucina giapponese non a caso è rinomata per l’infinita meticolosità e scrupolosità dei procedimenti. Gli chef giapponesi nei secoli hanno sviluppato una preparazione che rende la carne del fugu, o pesce palla, assolutamente innocua e adatta al consumo.\nMa se è vero che il sushi di qualità non si può improvvisare, ciò vale doppiamente con un alimento delicato come il fugu. Occorrono anni di specializzazione per poter preparare questo alimento nel modo corretto, e un’apposita licenza rilasciata dal governo Giapponese. Insomma, un sushiman alle prime armi non potrà mai servirvi del fugu… ma, se troverete questo alimento nel menu, saprete di poterlo ordinare a colpo sicuro. Perché alla sua preparazione sono preposti dei professionisti altamente specializzati.\nCome preparare il fugu perché sia idoneo al consumo alimentare\nLa fugu chorisi menkyo, questa licenza di preparare il fugu a regola d’arte, viene concessa solo dopo uno strenuo esame he prevede numerose prove, sia scritte che pratiche. Al termine della prova, lo chef sarà perfino costretto a mangiare il fugu da lui stesso preparato per assicurarsi che sia commestibile!\nMa come si prepara il fugu? Il segreto sta tutto nella corretta pulizia della carne dalle parti tossiche. Lo chef o sushi man deve sapere come maneggiare il fugu senza contaminare la carne con i batteri che si trovano nelle parti velenose; sbarazzarsi di queste ultime e sanificare l’ambiente prima di procedere alla realizzazione del sashimi con coltelli speciali. Che spesso viene servito con le singole fettine disposte a raggiera, in uno schema che richiama un crisantemo.\nIl fugu si può anche servire bollito insieme alle verdure, oppure fritto. Anche le pinne sono commestibili previa frittura e, solitamente, si accompagnano al saké bollente.\nColtelli per il sushi, come ti affetto il sashimi previous\t Riso venere, il colore viola (e che fa bene!) next


Pappardelle cozze e olive - Fidelity Cucina\nLe pappardelle cozze e olive sono un primo piatto gustoso e con ingredienti mediterranei irresistibili. Ecco la ricetta\nLe pappardelle cozze e olive sono un primo piatto tipicamente mediterraneo, facile e veloce da preparare e molto saporito, da servire in qualsiasi stagione dell’anno.\nUna cottura abbastanza veloce in padella ma un risultato finale molto elegante che renderà questo piatto perfetto anche per essere servito in occasioni particolari e pranzi eleganti.\nVediamo, quindi, insieme come preparare delle ottime pappardelle cozze e oliva ed alcuni consigli utili per un risultato perfetto e delle varianti altrettanto interessanti e gustose per tante occasioni.\nPer iniziare la preparazione delle pappardelle cozze e olive dovete partire proprio dalle cozze, che come prima cosa dovranno essere lavate accuratamente sotto acqua fredda corrente eliminando ogni impurità presente sulla loro superficie.\nFatto questo dedicatevi agli altri ingredienti, ovvero ai capperi, che dovranno essere tritati molto finemente, alle olive che vanno tagliate a rondelle ed ai pomodorini che andranno ridotti in piccoli quarti. Prendete a questo punto una padella antiaderente ben capiente e mettete a scaldare uno spicchio d’aglio, lasciato intero così da rimuoverlo in un secondo, insieme a dell’olio extravergine d’oliva. Fate andare il tutto per un minuto circa ed aggiungete capperi e olive. Aggiungete i pomodorini. Aggiustate di sale e pepe e fate proseguire la cottura per qualche altro minuto così che i pomodorini rilascino il loro succo.\nA questo punto potete aggiungere cozze e coprire con un coperchio facendo andare a fiamma ben vivace. In pochi minuti le cozze inizieranno ad aprirsi ed a rilasciare tutto il loro sapore, rendendo il succo ancora più accattivante e particolare. Le cozze andranno quindi sgusciate, tenendone da parte soltanto qualcuna intera per la decorazione del piatto se volete ottenere un effetto ancora più d’impatto.\nNel frattempo dedicatevi alle pappardelle, che devono essere cotte in abbondante acqua salata portata ad ebollizione. Scolate al dente e fate terminata la cottura in padella con il condimento, facendo saltare il tutto aggiustando di sale e pepe se necessario. A questo punto le pappardelle cozze e olive sono pronte per essere servite ai vostri ospiti quando sono ancora ben calde così da poterle apprezzare al meglio. Aggiungete anche del prezzemolo tritato per dare una nota di colore in più al piatto ed un sapore ancora più accattivante.\nLe pappardelle cozze e olive andranno servite ben calde e consumate subito dopo la loro preparazione.\nPotete usare la quantità di olive e di capperi a seconda del vostro gusto. Se lo gradite potete sostituire i pomodorini con della polpa di pomodoro ed aggiungere un cucchiaino di concentrato di pomodoro per un sapore ancora più intenso. Al posto delle cozze, se lo desiderate, potete utilizzare anche le vongole. Il risultato finale sarà comunque ottimo. Per un risultato più piccante sostituite il pepe con del peperoncino.\nPenne con sgombro, olive, acciughe e capperi


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AF-N: parliamo del cabinet - Pagina 3\nIo mi offro come giardiniere\nE pensare di fare il fronte e retro in plexiglass? Mi ricordo che c'era Laseridea che non era male come prezzi...\n@metal_end ha scritto: E pensare di fare il fronte e retro in plexiglass? Mi ricordo che c'era Laseridea che non era male come prezzi...\nDomani mi arriva il frontale di test in plexiglass trasparente fatto fare da Schaeffer. Proverò a montarlo sul cabinet, se è tutto ok allora manderò il disegno definitivo a @Dirty Harry che lo invierà a HiFi2000. Alla fine avremo un pannello frontale in alluminio, come quello fornito con il cabinet, ma lavorato come serve a noi.\nStessa cosa per il pannello posteriore.\n15/8/2018, 22:49Dirty Harry\nMa è arrivato sto plexiglass?\n@password ha scritto: Ma è arrivato sto plexiglass?\nIo l'ho anche visto\nDirò qualcosa solo davanti al mio avvocato.\nAppena ho fatto il test metto qualche foto e ne parliamo.\nFinalmente, dopo una giornata estenuante al lavoro, riesco a mettere le foto che ho fatto ieri al cabinet con il pannello frontale di test in plexiglass:\nLe posizioni dei fori sono quasi perfette. Nel disegno definitivo ho abbassato i fori dei jack cuffia di 0.75 mm in basso, per renderli perfettamente coincidenti alla posizione dei connettori.\nAlla fine, il pannello frontale dovrebbe avere questo aspetto:\nLo spessore del pannello è di 10 mm, e per i jack cuffia è necessario provvedere con uno sbalzo profondo 3 mm intorno ai fori, in modo da avere a filo il connettore con il pannello, e consentire al jack di entrare senza alcun ostacolo. La svasatura leggera del foro della manopola rende più attraente il tutto. Ho optato per il fissaggio del pannello a vista, con le quattro brugole che sono accolte nel loro incavo, in modo che siano a filo con il pannello stesso. A mio parere questa soluzione è esteticamente migliore delle viti che fissano il pannello da dietro, e oltretutto rende la vita più facile durante il montaggio in quanto si può stringere dall'esterno.\nSe avete idee, suggerimenti o riserve, questo è il momento giusto per sputare il rospo.\nMi fa piacere che tu mi abbia, in qualche modo, ascoltato..............\n@Edmond ha scritto: Mi fa piacere che tu mi abbia, in qualche modo, ascoltato..............\nEh lo so, sono stato in dubbio fino all'ultimo, ma da quando l'avevi scritto ci ho pensato ogni volta che guardavo il frontale... e alla fine dopo aver visto il pannello di test mi sono convinto: hai ragione! Meglio le brugole a vista.\ntutto molto pulito ed essenziale, a me così piace davvero tanto. Ottima anche l'ergonomia nella sua semplicità; mi sono ritrovato con molti ampli commerciali con il potenziometro del volume che interferiva con il cavo cuffia per la troppa vicinanza al relativo jack. Bravo Alex.\n23/8/2018, 11:24Dirty Harry\n@bandAlex ha scritto: Finalmente, dopo una giornata estenuante al lavoro, riesco a mettere le foto che ho fatto ieri al cabinet con il pannello frontale di test in plexiglass\nLa mia opinione personale su un eventuale lavoro in plexiglass è negativa...\nIl frontale è pulito e abbastanza simmetrico nell'effetto complessivo ma non condivido l'entusisasmo per le viti a brugola a vista, soprattutto in considerazione della possibilità del loro occultamento: sono per la pulizia delle forme e trovo irritanti i forellini di contorno tendenti ad impreziosire - facendo da cornice agli altri fori indispensabili - il frontale.\nMa, misteri del decoro audio-estetico a parte, se c'è qualche utilità ad avvitare dal frontale...; comunque sia, a parte la mia propensione all'essenzialità delle forme, sono poco sensibile all'effetto dei canoni estetici a base di trasparenze ed evidenze tamarre: basta che suona, la maggioranza decida per il resto, salva la funzionalità del tutto...\n@Dirty Harry ha scritto: La mia opinione personale su un eventuale lavoro in plexiglass è negativa...\nIl frontale di test è in plexiglass perchè costava meno... l'ho scritto, mi sembra. Quello definitivo sarà in alluminio, ovviamente.\nAnche io sarei per nascondere le viti, soprattutto perchè vista la conformazione del cabinet con i dissipatori ai lati le stesse vengono un po' troppo accentrate.\nOvviamente la cosa comporta anche una difficoltà maggiore nel serraggio, soprattutto di quelle sotto la pcb.\nComunque sia va bene\n@scarecrow ha scritto: tutto molto pulito ed essenziale, a me così piace davvero tanto. Ottima anche l'ergonomia nella sua semplicità; mi sono ritrovato con molti ampli commerciali con il potenziometro del volume che interferiva con il cavo cuffia per la troppa vicinanza al relativo jack. Bravo Alex.\nNon nascondo però che il sistema di fissaggio della pcb, benchè sia solido, può rappresentare un grattacapo non da poco. Il motivo è facilmente deducibile da questo dettaglio indicato dalla freccia:\nCome si vede, la colonnina appoggia su una specie di gobba della lamiera. Tale gobba è prevista da HiFi2000 per evitare che la testa di una eventuale vite di fissaggio con il suo spessore ostacoli il corretto posizionamento del pannello inferiore, che si aggancia proprio su quelle barre di lamiera. Ebbene, la distanza definita dalla colonnina, che è da 20 mm di lunghezza, è fondamentale perchè incide sull'altezza di potenziometro e connettori jack rispetto al pannello frontale. Tale altezza, per il progetto, deve essere di 22 mm, ovvero i 20 del distanziatore più i due della "gobba".\nIl problema è che l'altezza della gobba non è definita. Ora è di due millimetri, ma domani, tra sei mesi, un anno, HiFi2000 potrebbe modificare la procedura di punzonatura (o il macchinario) e la gobba essere più alta o più bassa. Basta un solo millimetro a fregarci.\nQualcuno potrebbe non considerarlo un problema (che ce frega, tanto l'abbiamo costruito prima), però questa è una di quelle cose che differenziano un progetto robusto da uno più ballerino. Un progetto è robusto se non c'è alcun parametro di vitale importanza delegato ad un fornitore e di cui non si ha la certezza matematica che non vari nel tempo. Dal momento che HiFi2000 non ha alcun obbligo su quel dettaglio (mentre ce l'ha sulle misure dichiarate, ad esempio sugli ingombri interni), non abbiamo la certezza assoluta che un cabinet non ci crei quel problema. Oppure potremmo essere fortunati e quel parametro essere considerato da HiFi2000 non modificabile per altri motivi. Il punto è che non lo sappiamo. Diciamo che, con buona probabilità, per qualche migliaio di cabinet almeno non dovrebbe variare (la variazione è un costo, e se non ci sono motivi un'azienda non apporta variazioni ad un disegno già collaudato). Oltre a variazioni volontarie, c'è da considerare eventuali variazioni dovute alla tolleranze di lavorazione. Ma qualunque sia il motivo della variazione, per noi il discorso non cambia, ovviamente. Sono ragionevolmente sicuro che tale altezza sia sufficientemente costante da non essere critica, e del resto un'eventuale alternativa sarebbe stata una complicazione non da poco: agganciare la scheda ai fianchi laterali, forando appositamente i dissipatori oppure le barre in metallo. Inutile dire che il solo pensiero ad una tale eventualità mi fa passare la voglia di usare questo cabinet.\n@b.veneri ha scritto: Anche io sarei per nascondere le viti, soprattutto perchè vista la conformazione del cabinet con i dissipatori ai lati le stesse vengono un po' troppo accentrate.\nMi sfugge una cosa: il pannello definitivo sarà comunque in alluminio?\nPerché a me, così, piace molto, anche se avrei preferito una finitura fumé, grigia o marrone... Escludiamo la realizzazione con frontale in plexy e viti interne?\n@Edmond ha scritto: Mi sfugge una cosa: il pannello definitivo sarà comunque in alluminio?\nUltimamente siete distratti, vedo.\nE' vero che tutto l'incipit del plexiglass fatto a suo tempo ha un po' incasinato le cose, però ho scritto chiaramente che il pannello di test l'ho fatto di plexiglass per motivi di costo, non perchè il definitivo debba essere di plexiglass.\nAnche a me, visto così, con il plexiglass trasparente, non dispiacerebbe affatto. Però... poichè dobbiamo metterci un punto, e poichè farlo in plexiglass sarebbe più complicato (esempio: HiFi2000 scordiamocela, e i tedeschi di Schaeffer arrivano fino a uno spessore di soli 4 mm) bisogna ripiegare sul vile alluminio.\nIn realtà ci sono altre soluzioni che prevedono l'uso del plexiglass, ma sono impraticabili con un gruppo di acquisto, soprattutto perchè già è difficile mettersi d'accordo sul materiale, figuriamoci su soluzioni estetiche "esotiche".\nQuindi alluminio. ALLUMINIO.\nAh, il pannello sarà di ALLUMINIO.\nDel resto, se con l'alluminio ci fanno gli aeroplani, un motivo ci sarà...\n23/8/2018, 13:23Dirty Harry\nEra solo per ricordare una modalità realizzativa su cui si era favoleggiato a suo tempo e, per fortuna, abbandonata...\nSono daccordo con @b.veneri\nA causa della conformazione del cabinet, le viti capitano troppo vicine al potenziometro del volume e ai jack di uscita, e poi rimane tutto quello spazio vuoto all’esterno.\nSe fossero state più esterne ok, ma così sinceramente l’estetica non mi fa impazzire.\nSarei anche io per nasconderle.\n23/8/2018, 13:30Dirty Harry\n@bandAlex ha scritto: Non nascondo però che il sistema di fissaggio della pcb, benchè sia solido, può rappresentare un grattacapo non da poco. Il motivo è facilmente deducibile da questo dettaglio indicato dalla freccia:\nQualcuno potrebbe non considerarlo un problema (che ce frega, tanto l'abbiamo costruito prima), però questa è una di quelle cose che differenziano un progetto robusto da uno più ballerino. Un progetto è robusto se non c'è alcun parametro di vitale importanza delegato ad un fornitore e di cui non si ha la certezza matematica che non vari nel tempo. Dal momento che HiFi2000 non ha alcun obbligo su quel dettaglio (mentre ce l'ha sulle misure dichiarate, ad esempio sugli ingombri interni), non abbiamo la certezza assoluta che un cabinet non ci crei quel problema. Oppure potremmo essere fortunati e quel parametro essere considerato da HiFi2000 non modificabile per altri motivi. Il punto è che non lo sappiamo.\nPiù tardi propongo una soluzione (con alluminio) particolare, vediamo se siete d'accordo.