Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria | Protocol (Translated to Italian)\nIngegneria genetica di Dictyostelium discoideum cellule basata sulla selezione e crescita sui batteri\nIndagare la funzione di Coronin A nel precoce fame di risposta…\nDictyostelium discoideum è un organismo modello popolare per studiare i complessi processi cellulari come la migrazione cellulare, endocitosi e sviluppo. L'utilità dell'organismo è dipenda sulla fattibilità di manipolazione genetica. Qui, presentiamo metodi per transfect Dictyostelium discoideum cellule che superare i limiti esistenti delle cellule di coltura in terreno liquido.\nDictyostelium discoideum è un intrigante organismo di modello per lo studio dei processi di differenziazione delle cellule durante lo sviluppo, di segnalazione delle cellule e altre domande importanti di biologia cellulare. Le tecnologie disponibili per manipolare geneticamente le cellule Dictyostelium sono ben sviluppate. Transfezioni possono essere eseguite utilizzando differenti marcatori selezionabili e marcatore ri-escursioni in bicicletta, tra cui ricombinazione omologa e mutagenesi inserzionale. Questo è supportato da un genoma ben commentato. Tuttavia, questi approcci sono ottimizzati per linee cellulari axeniche crescendo in colture liquide e sono difficili da applicare per non axeniche cellule wild-type, si nutrono solo di batteri. Le mutazioni che sono presenti nei ceppi axeniche disturbano Ras segnalazione, causando eccessivo Macropinocitosi necessaria per l'alimentazione e alterano la migrazione cellulare, che confonde l'interpretazione della trasduzione del segnale e gli esperimenti di chemiotassi in quegli sforzi. Precedenti tentativi di manipolare geneticamente le cellule non-axeniche hanno mancato efficienza e procedure sperimentali complesse richieste. Abbiamo sviluppato un protocollo di transfezione semplice che, per la prima volta, supera queste limitazioni. Quelli una serie di miglioramenti di grandi dimensioni per la genetica molecolare di Dictyostelium consentire cellule wild-type essere manipolato facilmente come ceppi di laboratorio standard. Oltre ai vantaggi per lo studio dei processi di segnalazione e motilità incorrotto, mutanti che interrompono la crescita basata su Macropinocitosi possono ora essere facilmente isolate. Inoltre, il flusso di lavoro intera transfezione è notevolmente accelerato, con cellule ricombinanti che possono essere generate in giorni anziché in settimane. Un altro vantaggio è che la genetica molecolare ulteriormente può essere eseguita con i campioni di Dictyostelium selvaggio-tipo appena isolati dall'ambiente. Questo può aiutare a estendere l'ambito di approcci utilizzati in queste aree di ricerca.\nIl genere di Dictyostelium sono terreno-viventi ameba sociale che principalmente si nutrono di batteri. Essere immessi nel phylum Amoebozoa, un gran numero di specie è stato isolato che possono essere raggruppate in quattro differenti cladi1. Le specie di Dictyostelium discoideum (d. discoideum) sono diventato un organismo modello popolare per studiare i complessi processi cellulari come la migrazione cellulare e la fagocitosi. Di controllare e standardizzare le condizioni sperimentali, axenica cella sono state sviluppate linee che sono in grado di crescere in mezzo liquido complesso o definito in assenza di batteri2. Di particolare importanza sono il Ax2, Ax3, e isolare i ceppi Ax4, che erano tutti generati nel 1970 e infine derivati da un singolo wild NC43. Strumenti per l'ingegneria genetica sono stati sviluppati in questi ceppi axeniche, conseguente il primo Ko pubblicato nel 19874,5. Protocolli sono stati ulteriormente sviluppati e ottimizzati per l'utilizzo sotto condizioni axeniche6,7.\nAdattamento di questi protocolli di selvaggio-tipo d. discoideum ceppi che non sono in grado di crescere in brodo liquido sono state tentate da diversi laboratori. Tuttavia, questo non è diventato completamente successo poiché i protocolli di transfezione sono complessi e la mancano di efficienza, in parte a causa della capacità dei batteri di agire come un lavandino per i reagenti selettiva8,9. Di conseguenza, dati essenzialmente tutto molecolari su d. discoideum provengono da discendenti di un singolo isolato di selvaggio-tipo. Abbiamo voluto superare questo limite e sviluppare un metodo per modificare geneticamente le cellule d. discoideum indipendente della loro capacità di crescere in mezzo liquido. La necessità di tale metodo può essere spiegata tramite l'osservazione che è stata assunta in passato che le mutazioni permettendo axenica crescita erano principalmente neutrale e non altera la fisiologia cellulare. Questa supposizione è solo parzialmente corretta. In generale, esistono due differenze notevoli; in primo luogo, tra i diversi isolati ceppi axeniche e secondo, quando questi ceppi axeniche vengono confrontati con non-axeniche selvatici isolati8,9.\nForse il fattore più critico è il gene axenica chiave, asciaB, che è stato identificato recentemente come RasGAP NF1. La funzione principale di NF1 come un RasGAP è di frenare Ras attività3. L'eliminazione dell'enzima in tutti i ceppi axeniche conduce ad un'eccessiva attività di Ras che si è manifestata come la formazione di grandi macchie di Ras attive. Queste patch di Ras allargate portano all'accumulo di PIP3 nella membrana plasmatica. Quelle macchie comparenti coincidente di PIP3 e Ras attivo sono un modello per la formazione di una balza circolare che alla fine si chiude e porta alla formazione di macropinosomes10. La conseguenza è un aumento eccessivo nell'attività macropinocytic. Macropinocitosi sono un processo basato su actina. Un concorso per componenti citoscheletriche per la formazione di macropinosomes o pseudopodi è il risultato. Suo impatto sul comportamento delle cellule si riflette nella prevenzione quasi completa della chemiotassi di cellule vegetative di folato11. Le patch di PIP3 in maniera massiccia ingrandetti sono molto persistenti. Anche nelle celle di morti di fame, le patch di PIP3 rimangono e possono essere erroneamente interpretate come pseudopodi, che possono causare problemi di interpretazione studi sulla chemiotassi al campo.\nIn alcuni casi, la mutazione NF1 è sperimentalmente utile. Questo ci conduce ad una seconda motivazione per lo sviluppo di un metodo di transfezione per batterico cresciuto d. discoideum cellule, poiché l'aumento nel tasso di Macropinocitosi rende le cellule axeniche prezioso per indagare gli aspetti fondamentali di questo processo12 . Tuttavia, mutazione nei geni necessari per Macropinocitosi, come Ras e PI3-chinasi10, hanno abolito quasi crescita axenica, rendendo necessario per manipolare queste cellule attraverso la crescita sui batteri. Un altro motivo che esegue il rendering basato su batteri transfezioni prezioso è l'uso aumentante di Dictyostelids per esplorare domande nell'evoluzione della multi-cellularità13,14, riconoscimento kin15,16, e il comportamento cellulare altruistico, che dipendono principalmente dall'uso di recente isolate di selvaggio-tipo isola17. Tutti questi ambiti di ricerca possono essere facilitate da metodi efficienti per la manipolazione genetica degli isolati selvatici, che sono non-axeniche e non crescono in brodo liquido.\nI nostri protocolli consentono per il superamento delle limitazioni descritte. Presi insieme, la possibilità di effettuare manipolazioni genetiche con batterico cresciuto i benefici d. discoideum cellule prese per tutti i ricercatori di Dictyostelium , anche se è solo la maggiore velocità del processo di selezione grazie alla più veloce crescita dell'ameba (tempo di raddoppiamento di 4 h) sui batteri rispetto alla crescita media axeniche (10 h tempo di raddoppiamento).\n1. preparazione delle cellule e materiali\nPreparazione del tampone di SorMC\nPreparare 100 mL di tampone (buffer di Sorensen incluso MgCl2 e CaCl2) SorMC: 100x sciogliendo 20,36 g di KH2PO4 (15 mM) e 5,47 g di Na2HPO47 H2O (2 mM) in 100 mL di acqua O di ddH2. Agitare la soluzione a temperatura ambiente (TA) e portare il volume a 100 mL con dH2O.\nNota: Il buffer risultante ha un pH di 6 e non ha bisogno di ulteriore regolazione.\nProdurre 1000 mL di 1x soluzione di lavoro in ddH2O. aggiungere 50 µ l ciascuna di MgCl2 e CaCl2 per ottenere le concentrazioni finali di 50 µM ciascuna. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm.\nNota: Sempre aggiungere MgCl2 e CaCl2 il buffer 1x per evitare la precipitazione dei sali nel 100 x soluzione di riserva.\nIn alternativa, preparare KK2 tampone (2,2 g di KH2PO4 e 0,7 g di K2HPO4 per 1 L di tampone) completati con 50 µM MgCl2 e 50 µM CaCl2 (in appresso come KK2MC). Utilizzare questo buffer in tutto invece di SorMC.\nPreparazione di batteri come fonte di cibo per d. discoideum\nUtilizzare una singola colonia di K. aerogenes e inoculare 1 L di LB-medium (brodo di Lisogenesi). Utilizzare un pallone da 2 L. Lascia i batteri di crescere durante la notte a 37 ° C con agitazione a 220 giri/min.\nNota: Se grandi quantità di batteri sono necessari, utilizzare mezzi di comunicazione più ricco come 2xTY (Estratto di lievito tryptone Media) o SOB (super ottima brodo) invece di LB. Nel caso in cui l'uso di K. aerogenes batteri non è consentito a causa di restrizioni di sicurezza, BL21 Escherichia coli può essere utilizzato invece.\nRaccogliere le cellule il giorno successivo di filatura li giù in due provette da centrifuga 500 mL a ~ 6.600 x g per 20 min. batteri di lavare una volta con 500 mL di buffer di SorMC.\nRisospendere il pellet in 20 mL di SorMC. Verifica il OD600 (densità ottica a 600 nm) utilizzando un fotometro. Diluire con lo stesso buffer per un OD600 di circa 100.\nNota: K. aerogenes batteri sono difficili a pellet, quindi una velocità relativamente elevata per rotazione verso il basso i batteri è necessaria per evitare la perdita di batteri di cibo. La soluzione risultante di stock batterica possono essere memorizzati fino a 4 mesi in frigorifero a 4 ° C e mantenere la propria utilità come fonte di cibo per d. discoideum. 1 L di pernottamento K. aerogenes sospensioni sviluppate in LB medium solitamente produce 20 mL di un OD600 di circa 100.\nAttenzione: Per garantire che i batteri preparati sono una monocultura di K. aerogenes, eseguire tutti i passaggi sotto una cappa.\nPreparazione del buffer di elettroporazione H40\nPreparare 100 mL di soluzione tampone, sciogliere g 0,952 di HEPES in ddH2O acqua e aggiungere 100 µ l di MgCl2 da una soluzione madre di 1m. Regolare il pH 7 utilizzando KOH per titolazione. Sterilizzare il buffer utilizzando un filtro da 0,22 µm o in autoclave. Utilizzare HEPES privo di acidi e non il sale di sodio.\nEseguire la preparazione del plasmide seguendo il protocollo del produttore e utilizzando i kit di riassunti nella Tabella materiali. Utilizzare i plasmidi riassunti nella tabella 1.\nNota: La qualità del DNA usato per la transfezione è cruciale. La selezione di d. discoideum trasfettanti crescendo sui batteri ha requisiti specifici per i promotori della cassetta di selezione ed espressione di guida (vedi discussione).\nnome del plasmide selezione/resistenza nei batteri resistenza/selezione in Dictyostelium Prodotto Tag\nplasmidi di espressione extracromosomico\npDM1208 Ampicilin G418 N-terminale mCherry\npPI159 Ampicilin G418 N-terminale mNeon\npPI437 Ampicilin G418 N-terminale mScarlet\npPI54 Ampicilin G418 N-terminale mTurquoise2\npDM1210 Ampicilin G418 C-terminale mCherry\npPI143 Ampicilin G418 C-terminale mNeon\npPI459 Ampicilin G418 C-terminale mScarlet\npPI142 Ampicilin G418 C-terminale mTurquoise2\nplasmidi di navetta\npDM1019 Ampicilin No N-terminale GFP\npDM1018 Ampicilin No N-terminale mCherry\npPI152 Ampicilin No N-terminale mNeon\npPI418 Ampicilin No N-terminale mScarlet\npPI150 Ampicilin No N-terminale mTurquoise2\npDM1021 Ampicilin No C-terminale GFP\npDM1020 Ampicilin No C-terminale mCherry\npPI153 Ampicilin No C-terminale mNeon\npPI457 Ampicilin No C-terminale mScarlet\npPI151 Ampicilin No C-terminale mTurquoise2\nplasmidi di espressione inducibile extracromosomico\npDM1038 Ampicilin Igromicina No\npDM1047 Ampicilin Igromicina N-terminale GFP\npDM1046 Ampicilin Igromicina N-terminale mCherry\npPI450 Ampicilin Igromicina N-terminale mNeon\npPI452 Ampicilin Igromicina N-terminale mScarlet\npPI449 Ampicilin Igromicina N-terminale mTurquoise2\npDM1049 Ampicilin Igromicina C-terminale GFP\npDM1048 Ampicilin Igromicina C-terminale mCherry\npPI470 Ampicilin Igromicina C-terminale mNeon\npPI460 Ampicilin Igromicina C-terminale mScarlet\npPI469 Ampicilin Igromicina C-terminale mTurquoise2\nrifugio sicuro act5 plasmidi di targeting\npDM1501 Ampicilin Igromicina No\npDM1513 Ampicilin Igromicina N-terminale GFP\npDM1514 Ampicilin Igromicina N-terminale mCherry\npPI231 Ampicilin Igromicina N-terminale mNeon\npPI419 Ampicilin Igromicina N-terminale mScarlet\npPI228 Ampicilin Igromicina N-terminale mTurquoise2\npDM1515 Ampicilin Igromicina C-terminale GFP\npDM1516 Ampicilin Igromicina C-terminale mCherry\npPI230 Ampicilin Igromicina C-terminale mNeon\npPI458 Ampicilin Igromicina C-terminale mScarlet\npPI229 Ampicilin Igromicina C-terminale mTurquoise2\nPlasmidi di espressione di REMI\npDM1220 Ampicilin Igromicina No\npDM1351 Ampicilin Igromicina N-terminale GFP\npDM1259 Ampicilin Igromicina N-terminale mCherry\npPI465 Ampicilin Igromicina N-terminale mNeon\npPI468 Ampicilin Igromicina N-terminale mScarlet\npPI466 Ampicilin Igromicina N-terminale mTurquoise2\npDM1352 Ampicilin Igromicina C-terminale GFP\npDM1305 Ampicilin Igromicina C-terminale mCherry\npPI471 Ampicilin Igromicina C-terminale mNeon\npPI467 Ampicilin Igromicina C-terminale mScarlet\npPI472 Ampicilin Igromicina C-terminale mTurquoise2\nmirate in plasmidi telaio\npDM1355 Ampicilin Igromicina C-terminale GFP\npPI461 Ampicilin Igromicina C-terminale mCherry\npPI462 Ampicilin Igromicina C-terminale mNeon\npPI464 Ampicilin Igromicina C-terminale mScarlet\npPI463 Ampicilin Igromicina C-terminale mTurquoise2\nplasmidi di knock-out\npDM1079 Ampicilin Dyfed No\npDM1081 Ampicilin Igromicina No\nPlasmidi di espressione di CRE\npDM1489 Ampicilin Igromicina No\nTabella 1: Elenco di plasmide per transfezioni non axeniche.\nConfigurazione di Dictyostelium cellule per la transfezione\nCrescere di K. aerogenes alla confluenza in medio SM (sostanza-ricco medio) pernottamento al RT. culture possa essere memorizzato fino a 2 settimane a 4 ° C.\nAggiungere circa 400 µ l di questa sospensione batterica su una piastra di agar di SM (peptone 10 g/L; lievito estratto 1 g/L; glucosio 10 g/L; KH2PO4 1,9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1,3 g/L; MgSO4 anidro 0,49 g/L; 1,7% agar) e distribuire uniformemente. Prendere un'ansa sterile e inoculare con cellule di Dictyostelium . Diffondere le cellule ad un orlo della piastra.\nIncubare la piastra a 22 ° C per 2 giorni affinché le zone di crescita sufficientemente grande per la transfezione.\nNota: Per i ceppi di Dictyostelium che non rendere grande crescita zone (ad es., Ax3, DH1 o JH10), o per gli sperimentatori inesperti, utilizzare radura piastre invece. Per questo, seguire le istruzioni in procedura 1.5.4 a 1.5.6.\nPrendere un'ansa sterile e inoculare con cellule di Dictyostelium (circa 2-4 x 105 celle). Trasferire le cellule a 800 µ l di una densa K. aerogenes sospensione in cellule SM. Mix pipettando su e giù.\nTrasferimento di 400 µ l, 200 µ l, 100 µ l e 50 µ l su piastre di agar SM freschi. Aggiungere ad ogni piatto 400 µ l di sospensioni aggiuntive SM K. aerogenes , distribuiti in modo uniforme e a secco.\nIncubare le piastre a 22 ° C per circa 2 giorni fino a quando le piastre diventano trasparenti.\nNota: A causa del loro tasso di crescita più veloce, i batteri producono inizialmente un prato confluente e le amebe successivamente "cancellare" la piastra dei batteri. Il tempo richiesto per questo processo può variare a seconda della priorità bassa deformazione e la capacità delle cellule mutanti di crescere sui batteri.\n2. transfezione delle celle di Dictyostelium basato su selezione batterica\nFigura 1 : Flusso di lavoro per la transfezione delle cellule di batteri-grown Dictyostelium . I passaggi per la transfezione sono elencati come segue. Crescere le cellule d. discoideum su una zolla di SM seminata con batteri K. aerogenes (rosso). Raccogliere le cellule solo dalla parte anteriore d'alimentazione (verde), evitando le cellule che si stanno già sviluppando (verde scuro). Lavare le cellule in H40. Risospendere le cellule ad una densità finale di 2-4 x 107 cellule/mL. Mescolare la sospensione cellulare con 1-2 µ g di DNA. Trasferire il composto in un cellule di cuvette e impulsi di elettroporazione. Trasferire le cellule direttamente dopo l'elettroporazione per un piatto con SorMC e batteri. Permettono alle cellule di recuperare per 5 ore prima di aggiungere il marcatore selezionabile. Per plasmidi extracromosomico, aggiungere la selezione direttamente al piatto. Trasfettanti sono di solito visibili dopo ~ 2 giorni. Per i costrutti linearizzati che mirano per singola integrazione nel genoma, impostare tre diluizioni come indicato e aggiungere la selezione. I batteri sono presi dalla OD600 = 100 soluzione di riserva. Mescolare bene i tubi e trasferire le cellule in piastre di coltura del tessuto 96 pozzetti a fondo piatto. Utilizzare due piastre per diluizione. Dispensare 150 µ l di sospensione cellulare in ogni pozzetto. Ci vogliono circa 5 giorni fino a quando le colonie stretti sono visibili. Il rosso wells Visualizza un esempio di solito la quantità di cellule con successo trasformate ottenute (pannello superiore per volta dal precedente pubblicazione22). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nPer preparare piatti con sospensione K. aerogenes , aggiungere 10 mL di tampone di SorMC contenente batteri K. aerogenes ad una densità di OD600 = 2 (aggiungere 200 µ l di preparati OD600 = 100 K. aerogenes soluzione di riserva per la desiderata concentrazione di batteri) in un 10 cm coltura del tessuto trattato di Petri.\nNota: Questo piatto è più tardi necessarie per coltivare la transfected le cellule d. discoideum . In alternativa, può essere utilizzata una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti. Nel caso di transfezione dei plasmidi extracromosomico, la piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti è più efficiente delle risorse. Utilizzare 2 mL di SorMC K. aerogenes (OD600 = 2) sospensione per pozzetto.\nPreparazione delle cellule di Dictyostelium\nUtilizzando un ciclo di inoculazione 10 µ l, raschiare le cellule delle zone di crescita (circa 3 cm) della piastra di coltura (bordo della zona deselezionata) o piastra di compensazione. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di buffer di H40 ghiacciata.\nNota: I tempi di raccolta delle cellule da radura piastre sono cruciali. Raccolta troppo presto rese troppo poco una quantità di cellule, mentre la raccolta alla fine aumenta il rischio di cedere parzialmente sviluppato cellule.\nLavare le cellule riducendo la velocità per 2 minuti a 1.000 x g o flash-spinning per 2 s a 10.000 x g. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in H40 buffer ad una densità finale di 2-4 x 107 cellule/mL. Mantenere le cellule freddo durante la procedura di trasfezione intero. Utilizzare un impasto di acqua e ghiaccio per assicurare il contatto diretto dei tubi e ghiaccio.\nAggiungere 100 µ l di cellule in una provetta con 1-2 µ g di DNA. Miscelare accuratamente pipettando su e giù.\nTrasferire la miscela di DNA e delle cellule in una cuvetta pre-refrigerati elettroporazione (spazio di 2 mm).\nLe celle utilizzando le seguenti impostazioni di onda quadra di impulso: 350 V, 8 ms, 2 impulsi e 1 intervallo di impulso di s.\nNota: Non aggiungere più di 2 µ g di DNA. Importi superiori sono tossici per le cellule e diminuiscono l'efficienza di trasfezione. Aggiunto il totale volume di DNA non deve superare i 5 µ l.\nTrasferire immediatamente le cellule alla precedenza preparato 10 cm Petri con K. aerogenes SorMC e permettono alle cellule di recuperare per 5 h.\nNota: Controllare le celle di Petri sotto un microscopio invertito. Le cellule verranno visualizzati rotonde direttamente dopo l'elettroporazione ma tornerà alla loro forma ameboide dopo circa 30 min, quando hanno avuto tempo sufficiente per connettere correttamente alla superficie.\nSelezione di trasfettanti: a seconda se transfezione è finalizzata a generare un knock-out, knock-in o act5 knock-in, o per esprimere una proteina reporter fluorescente da un plasmide extracromosomico, eseguire il processo di selezione attraverso uno dei di seguito descritti metodi.\nNota: A differenza delle cellule axenically coltivate, batterico coltivate cellule sono altamente resistenti a Consciousness. Selezione, pertanto, viene sempre effettuata utilizzando G418 o igromicina (vedi discussione).\nKnock-out, knock-ins e act5 knock-in\nStaccare le cellule attentamente da di Petri forzando ripetutamente il liquido da una pipetta sulla superficie.\nImpostare tre diluizioni la sospensione di SorMC K. aerogenes (OD600 = 2) e aggiungere l'agente selettivo secondo il resistenza (Vedi Figura 1).\nBassa diluizione: mescolare 9 mL di sospensione cellulare con 20,4 mL di SorMC e 600 µ l di soluzione madre K. aerogenes .\nDiluizione media: mescolare 900 µ l di sospensione cellulare con 28,5 mL di SorMC e 600 µ l di soluzione madre K. aerogenes .\nAlta diluizione: mescolare 90 µ l di sospensione cellulare con 29,3 mL di SorMC e 600 µ l di soluzione madre K. aerogenes .\nAggiungere 30 µ l di marcatore selezionabile (100 x soluzione di riserva).\nDistribuire le diluizioni preparate in piastre di coltura del tessuto 96 pozzetti a fondo piatto di pipettaggio 150 µ l di sospensione cellulare in ogni pozzetto.\nNota: Questa procedura ha lo scopo di cloni singolo schermo piuttosto che popolazioni. La selezione avviene circa 5-7 giorni, a seconda del costrutto utilizzato.\nAggiungere il marcatore selezionabile direttamente al piatto da 10 mL (Vedi Figura 1).\nNota: Non esiste alcuna necessità di impostare diluizioni, poiché non vi è alcun desiderio per le popolazioni clonali. Il processo di selezione per plasmidi extracromosomico è più veloce dovuto ad alti numeri di copia presenti nelle cellule di d. discoideum . Trasfettanti possono essere preveduto dopo 32 h per 2 giorni.\nAttenzione: Gli antibiotici usati come marcatore selezionabile sono tossici. Indossare i guanti.\nSchermo i cloni ottenuti per tranfectants positivo. Per i tentativi di knock-out o knock-in, seguire le istruzioni al punto 2.5.1. Verifica il successo di transfezione per plasmidi extracromosomico utilizzando le istruzioni al punto 2.5.2.\nPer knock-out, knock-in e act5 knock-in, eseguire la schermata iniziale tramite PCR per confermare integrazione del costrutto il locus genomico corretto.\nNota: Per massimizzare la probabilità di popolazioni clonali, utilizzare la diluizione più alta possibile che produce trasfettanti dopo selezione. Obiettivo per piatti che sono un massimo un terzo dei pozzi occupati.\nPer espandere le popolazioni clonali, trasferire i cloni che sono cresciuti dopo la selezione dalla piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti in una piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti a crescere abbastanza cellule per l'isolamento di DNA genomic. Fornire ogni pozzetto con 1 mL di SorMC K. aerogenes (OD600 = 2) e fresco marcatore selezionabile.\nNota: 1 giorno è di solito sufficiente per ottenere un confluenti ben adatto per isolamento del DNA.\nPer eseguire mini isolamento di DNA genomic, raccogliere le cellule di un pozzo confluente e isolare il DNA di genomic usando un mini kit di estrazione del DNA seguendo le istruzioni del produttore.\nUtilizzare il DNA di genomic isolato insieme con primer adatto e Taq-polimerasi (Vedi Tabella materiali) alla schermata PCR per componenti positivi.\nNota: Dopo la conferma della positiva integrazione il locus genomico corretta, deve essere eseguita un'analisi del sud della macchia. Questo assicura una maggiore fiducia che non si sono verificati eventi di inserimento ulteriori in regioni genomiche aspecifici.\nPer proteine reporter fluorescenti, visivamente identificare cellule fluorescenti positive e controllare con un microscopio a fluorescenza. In alternativa, è possibile eseguire un western blot con anticorpi adatti per identificazione biochimica.\nDenaturazione iniziale 94 ° C 30 s\n30 cicli 94 ° C 15-30 s\nEstensione finale 68 ° C 5 min\nTenere premuto 4-10 ° C\ncomponente Reazione di 25 μL concentrazione finale\nPrimer in avanti di 10 µM 0,5 Μ l 0,2 ΜM\n10 µM reverse Primer 0,5 Μ l 0,2 ΜM\nModello del DNA variabile (ca. 5 µ l) < 1.000 ng\n2 x Master Mix con tampone Standard tra cui polimerasi (Vedi tabella dei materiali) 12,5 Μ l 1 x\nAcqua priva di nucleasi a 25 µ l < 1.000 ng\nTabella 2: composizione di programma e campione PCR per l'amplificazione di D. discoideum DNA genomic.\nExtracromosomico plasmidi sono utilizzati per studi di reporter, che mirano a identificare la localizzazione di alcune proteine all'interno di una cella o cambiamenti nella struttura cellulare di cellule mutanti. Per molti approcci, quali il monitoraggio del ciclo cellulare, è fondamentale esprimere due reporter allo stesso tempo. Questo è ora possibile utilizzando il nostro sistema di plasmide extracromosomico dual reporter (tabella 1). Il giorno 1, cellule transfected prima di aggiungere il marcatore selezionabile G418 dopo 5 h (Figura 1). Nell'esempio, NC4, DdB, Ax2 e gli isolati selvatici indipendentemente derivati V12M2 e WS2162 (complementare tabella 1) sono state trasfettate con il plasmide pPI289, che codifica per la GFP-TubulinA, un marcatore per i microtubuli e mCherry-PCNA, una proteina che è utilizzato per il monitoraggio del ciclo cellulare (Figura 2A). Dopo 32 h, le cellule sono state osservate al microscopio. La maggioranza delle cellule espresse entrambe proteine di fusione con etichetta fluorescente, coerente con precedenti relazioni che l'espressione di due giornalisti della stesso plasmide spettacoli simili livelli di espressione, che è quasi impossibile quando si utilizzano due diversi plasmidi 18,19. Una cella rappresentanza per ogni linea cellulare (NC4, DdB, Ax2, V12M2 e WS2162) che esprime il reporter dual desiderato è illustrata nella Figura 2B. L'efficienza di trasfezione è riassunti nella Figura2C. Linee cellulari derivate da NC4 mostrano le migliori efficienze di transfezione. Tuttavia, per linee cellulari V12M2 e WS2162, un numero considerevolmente elevato di trasfettanti è stato ottenuto.\nFigura 2 : Espressione di un plasmide extracromosomico. (A) extracromosomico plasmidi direttamente transfected in forma circolare. Ad esempio, è mostrato il reporter dual pPI289. I siti MIV ONGindicano inserimento del secondo reporter nel plasmide extracromosomico espressione. (B) Z-proiezione di una rappresentante delle cellule che esprimono GFP-TubulinA (citoplasmatica) e mCherry-PCNA (in gran parte nucleare) per cinque linee cellulari differenti del selvaggio-tipo utilizzato (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C), la transfezione efficienze per le linee di cinque cellulari nella foto (b) sono state calcolate. Indicato è la media dei due esperimenti. Barre di errore indicano ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nIntegrazione di un vettore targeting in un locus genomico specificato è più impegnativo e richiede analisi più attenta della linea cellulare generato. In Figura 3, viene tentata un'act5- mCherry KI in NC4. In primo luogo, il plasmide deve essere linearizzato per aumentare la frequenza di eventi di ricombinazione seguito di transfezione. Per questo, il pDM1514 di plasmide viene tagliato con ONGMIV. Due fasce sono ottenute dopo l'esecuzione il digest su un gel di agarosio. La band di 4127 bp contiene il costrutto desiderato (Figura 3). Per la transfezione, il DNA digerito dovrà essere estratte dal gel e purificato utilizzando un kit di estrazione del gel seguendo le istruzioni del produttore.\nFigura 3 : Preparazione di act5 knock-in e del DNA per la transfezione. Il plasmide pDM1514 è riportato un esempio dell'uso di un knock-in atto5. I passaggi per la preparazione sono elencati come segue. (A) prima di elettroporazione, linearizzare il plasmide utilizzando i siti MIV ONGindicati. (B, C) Eseguire il plasmide tagliato su un gel di agarosio, fino a quando le due bande previste correttamente sono separate. Tagliare la banda di bp 4127 contenente le braccia di ricombinazione, mCherry e la cassetta di resistenza, e gel estratto il DNA. Il DNA è ora pronto per la transfezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nIl DNA purificato è stato utilizzato per la transfezione delle cellule NC4. Dopo 5-6 giorni di selezione, sono stati ottenuti cloni. L'efficienza di trasfezione rappresentativo e la quantità di cloni positivi identificati per diversi act5 knock-in tentativi sono riassunti nella tabella 3. Due cloni di transfezione NC4 erano scelti in modo casuale e analizzati mediante PCR (Figura 4A), ed entrambi hanno mostrato i modelli di banda prevista ci si aspetta da un knock-in e sono stati ulteriormente convalidati con analisi del sud della macchia per garantire una sola integrazione evento del costrutto nel genoma20. Il blot Mostra un chiaro singola integrazione nel luogo desiderato act5 (Figura 4B). La linea di cellulare NC4::act5-mCherry generata può ora utilizzabile negli esperimenti.\nFigura 4 : Convalida di act5- mCherry KIs in NC4. (A) schema e controllo PCRs per la validazione delle integrazioni positivi in act5 locus. I primer indicati sono stati utilizzati per analizzare due cloni indipendenti e il genitore. Entrambi i cloni mostrano le bande previste per la resistenza-cassette e a valle (P1) o primer a Monte (P2), che non sono presenti nel ceppo parentale. La combinazione di primer (P1/P2) conferma la corretta integrazione della cassetta mCherry e resistenza il locus di act5 . Il selvaggio-tipo NC4 Mostra la band di bp di 2800 previsto, mentre entrambi i cloni KI mancano di questa band e invece visualizzare un prodotto PCR circa 1400 paia di basi più grandi. Schema (B) per la raccolta di limitazione usato e del sud della macchia. Entrambi i cloni knock-in mostrano la band di bp 3400 più piccola, che è il risultato dell'integrazione del costrutto nel locus agire5, in particolare ulteriori BclI sito nella cassetta di resistenza igromicina. Gli spettacoli del selvaggio-tipo controllo il kb 5,8 attesi derivanti da due situati a valle Bclsiti. La macchia è stata ritagliata e impiombata per chiarezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\ncostrutto mirato nel locus di act5 nome del plasmide numero di occupati pozzi numero di cloni selezionati Cloni positivi Cloni corretti (%) Ceppo di Dictyostelium usato efficienza di trasfezione (trasfettanti / 2 x 10 ^ 6/1 µ g del DNA)\nmCherry pDM1514 3 3 1 33,3 AX2 1,5 x 10 ^ -6\nH2B-mCherry pPI420 3 3 1 33,3 AX2 1,5 x 10 ^ -6\nH2B-mCherry pPI420 7 7 6 85,7 AX2 3,5 x 10 ^ -6\nTabella 3: l'efficienza di trasfezione e la quantità di ottenuti trasfettanti positivo per la generazione di act5 KIs in sfondi di ceppo diverso 22 .\nIl locus agire5 offre relativamente omogeneo espressione del giornalista integrato21. Le cellule di NC4::act5-mCherry generate consentono mix esperimenti da eseguire con altri act5 knock-in utilizzando una proteina fluorescente differente come GFP. Per sottolineare il grande vantaggio di questo sistema, sono mostrati miscelazione esperimenti con Ax2::act5-GFP . A causa dell'incapacità a transfect non axeniche cellule wild-type, questo tipo di approccio potrebbe non essere eseguito prima. Mix esperimenti sono uno strumento importante per analizzare il comportamento delle cellule, perché consentono un confronto diretto tra diverse linee cellulari vivendo identiche condizioni sperimentali. NC4 cellule crescono più rapidamente sui prati batterici rispetto alle cellule Ax2 (Figura 5A). Questo può essere dovuto una maggiore capacità di fagocitare batteri o migliorata capacità di spostare e mostrare chemiotassi verso una fonte di cibo. Utilizzando un'analisi di chemiotassi di folato sotto-agar, confronto diretto di una popolazione di NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP è stato effettuato, mostrando che NC4::act5-mCherry sono molto più efficiente nel rilevamento di folato. Dopo 4 h, più NC4::act5-mCherry cellule erano in grado di strisciare sotto l'agarosio che le cellule Ax2::act5-GFP (Figura 5B). Analisi delle metriche standard della chemiotassi per le cellule in migrazione sotto l'agarosio ha rivelato che le cellule NC4::act5-mCherry erano più veloci e ha mostrato la più forte risposta chemiotattica delle cellule Ax2::act5-GFP (Figura 5C-E ).\nFigura 5 : Usando KIs agire5 per gli esperimenti basati su immagine chemiotassi mix. (A) NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP che esprimono la proteina fluorescente indicata dal locus agire5 sono stati analizzati per la capacità di crescere su un prato batterico. Dopo 4 giorni, sono stati misurati il diametro di placca sorto dalle cellule di Dictyostelium placcate solitarie. Non-axeniche act5:: NC4 celle formano placche significativamente più grande rispetto alle cellule Ax2::act5-GFP axeniche (media ± DS, * * * p < 0,0001, n = 3, scala bar 5 mm). (B) per uso della chemiotassi di folato sotto-agarosio dosaggio22 confrontare direttamente le capacità chemiotattiche del NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP utilizzato in (A), batteri-cresciuta amebe di entrambi i ceppi sono stati misti in un rapporto di 50: 50. Cellule sono state permesse a strisciare sotto l'agarosio. Dopo 4 h, cellule che stavano migrando il gradiente di folato erano imaged utilizzando un microscopio confocale. Poi è stato determinato il numero di cellule NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP . NC4::act5-mCherry cellule erano più efficiente nel rilevamento di folato. Circa 10 volte più NC4::act5-mCherry cellule sono state trovate confrontato alle cellule di Ax2::act5-GFP (media ± DS, * * * p < 0,0001, n = 6, scala bar 100 µm). (C, D) Le cellule sono state filmate per 60 min, e la loro velocità e chemiotattica indice sono stati calcolati. Dopo la pre-selezione delle cellule più chemotactically reattive (solo quelli migrati sotto l'agarosio), Ax2::act5-GFP cellule hanno mostrati valori inferiori per velocità di cella e la chemiotassi. Cinquanta cellule per linea cellulare sono state analizzate. (media ± SD, * p < 0.01, n = 3). (E) le tracce di NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFPact5 knock-in vengono tracciate oltre 60 min, mostrando il movimento più indirizzato verso la fonte di chemoattractent delle cellule NC4::act5-mCherry (media ± SD, * * * p < 0,0001, n = 6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nLe linee di act5 knock-in cella possono essere utilizzate anche per citometria a flusso. Come con crescita sui batteri, esistono importanti differenze di sviluppo tra ceppi axeniche e tipi selvatici non axeniche. Dopo lo sviluppo, i corpi fruttiferi delle cellule NC4 sono circa due volte grandi come quelli derivati dalle cellule Ax2. Se le cellule sono mescolate, si ottiene un corpo fruttifero di dimensioni intermedio. Per analizzare il contributo delle due linee cellulari più quantitativamente, citometria a flusso è stata utilizzata. Queste analisi hanno mostrato chiaramente che i corpi fruttiferi di intermedio-graduati sono dovuti a diversi livelli di contributo da entrambe le linee cellulari. Mentre le cellule NC4::act5-mCherry è composto da circa il 75% delle spore misurate, Ax2::act5-GFP ha contribuito solo il 25%, rivelando un potenziale vantaggio di fitness per i ceppi non-axeniche (Figura 6). Poiché l'analisi non controlla la popolazione delle cellule di gambo, ci sono due possibilità per spiegare lo squilibrio nello sviluppo tra Ax2 e NC4. Una possibilità è che le cellule Ax2 contribuire principalmente alla popolazione delle cellule del gambo, piuttosto che entrare la popolazione delle cellule di spora. In alternativa, più NC4 cellule possono entrare il ciclo di sviluppo, con Ax2 relativamente in ritardo, e sono quindi incapaci di contribuire per l'assemblaggio di un corpo fruttifero. La possibilità a transfect cellule wild-type non axeniche sviluppa ulteriormente altri approcci e semplifica notevolmente le procedure sperimentali.\nFigura 6: atto5 KIs consentono l'analisi di esperimenti di miscela mediante citometria a flusso. (A) NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP sono stati sviluppati separatamente o in una miscela 50: 50 sui piatti di agar non-sostanza nutriente. NC4::act5-mCherry cellule formano grandi corpi fruttiferi rispetto Ax2::act5-GFP. Il mix Mostra invece una dimensione intermedia (scala bar 5 mm). Microscopia di fluorescenza confocale suggerisce una maggiore quantità di spore di NC4::act5-mCherry nelle teste spora derivate da miscele. (B) per quantificare questa osservazione, la quantità di spore in raccolta spora teste dall'esperimento miscelazione in (A) sono state analizzate tramite flusso cytometry. Circa il 75% delle spore ha provenuto dalle cellule NC4::act5-mCherry , con solo il 25% da cellule Ax2::act5-GFP . (C) distribuzione rappresentativa delle spore da entrambe le linee cellulari mostrate in una dispersione di citometria a flusso. Circa lo 0.05% Visualizza positivo mCherry e GFP segnali, suggerendo che si sono verificati processi di fusione parasexual o che le spore sono attaccare a vicenda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nLinea cellulare Geneticamente sfondo Numero di riferimento Pubblicato prima Tipo\nAX2 (Ka) DBS0235521 Bloomfield et al., 2008 wild-type\nNC4 (S) Bloomfield et al., 2008 wild-type\nV12M2 Bloomfield et al., 2008 wild-type\nWS2162 Bloomfield et al., 2008 wild-type\nComplementare tabella 1: diversi ceppi di Dictyostelium studiato.\nL'uso di non-axeniche, selvaggio-tipo cellule di Dictyostelium è stato molto limitato finora nella ricerca molecolare. Metodi disponibili per l'ingegneria genetica di questi ceppi sono mancata affidabilità ed efficienza23, impedendo la loro adozione generale. I materiali generati e protocolli presentati qui utilizzabile per qualsiasi ceppo di d. discoideum indipendente dalla sua capacità di crescere in mezzo liquido. Va ricordato che questo protocollo è ottimizzato per linee cellulari derivate da NC4. L'efficienza di trasfezione per ceppi di recente isolate dal selvaggio differiscono da NC4, come hanno osservato prima e sono mostrati qui per V12M2 e WS21628,9. Le condizioni di elettroporazione sembrano in particolare hanno una notevole influenza sull'efficienza di trasfezione e possono richiedere un'ulteriore ottimizzazione per alcuni ceppi. In generale, una quantità sufficiente di trasfettanti sono stati osservati in tutti i ceppi testati finora, mostrando che questi metodi sono realizzabili. Il numero di trasfettanti positivi ottenuti utilizzando ceppi NC4-derivato è superiore rispetto ad altri ceppi non-axeniche di selvaggio-tipo, ma in tutti i casi, un numero sufficiente di trasfettanti è ottenuto per consentire ulteriori esperimenti. Questo, oltre alla semplicità del nostro protocollo, è il grande miglioramento rispetto ai precedenti tentativi8,9.\nQuesti nuovi protocolli non axeniche coprono tutte le procedure standard genetiche e aggiungere ulteriori vantaggi, poiché transfezioni possono essere eseguite rapidamente ed efficientemente in parallelo. Cloni positivi possono essere ottenuti in giorni anziché in settimane, dalla crescita su metà di batteri il tempo di divisione. I plasmidi neoformati anche lavorano in condizioni axeniche e ordinariamente utilizzabile sotto entrambe le condizioni di crescita, che è un altro avanzamento di questa metodologia22. Come introdotto nel protocollo, il plasmide usato per la selezione sui batteri hanno requisiti speciali che sono cruciali per il successo della transfezione. In particolare, i promotori che guida le cassette di espressione e la resistenza sono importanti per la transfezione di successo. Il promotore di spesso usate act6 (actina 6)24 per guidare la resistenza o espressione cassette manca efficienza quando le cellule si sviluppano sui batteri. Nel nostro sistema di plasmide, il promotore altamente attivo act15 (actina 15) unità tutte le cassette di espressione, mentre le cassette di resistenza sono sotto il controllo di un promotore di coA (coactosin A), entrambi dei quali sono attivi in condizioni axeniche e in cellule coltivate sui batteri. Requisiti per l'espressione del reporter costruisce così come knock-in e costrutti di knock-out rendono necessario di utilizzare il nostro repertorio di plasmide, ma purtroppo limita l'uso di vettori già creati che utilizzano il promotore inefficiente act6 .\nPromotore efficienze sono particolarmente critiche per transfezioni che dipendono da un evento di integrazione unico nel locus genomico corretto. A causa di nostro miglioramento dei promotori che guida l'espressione di gene di resistenza, abbastanza proteine di resistenza sono prodotto da integrazioni singolo locus. Delle principali preoccupazioni era il favorire più integrazioni nel genoma quando si utilizza igromicina o G418 come descritto. Nessun favorendo di più integrazioni è stato osservato finora, come riportato in precedenza per le selezioni di G418 utilizzando vecchi promotore sistemi25. Ciò significa che entrambi igromicina e G418 sono marcatori selezionabili adatti per la generazione di pulito knock-out e knock-ins. purtroppo, il marcatore selezionabile Consciousness non funziona in condizioni di non-axeniche. Questo è dei principali svantaggi del nostro metodo, poiché la cassetta di resistenza Consciousness è usata ordinariamente per generare costrutti di knock-out d.discoideum. Costrutti che già sono state generate con cassette di Dyfed resistenza dovrà essere riderivato utilizzando uno dei marcatori selezionabili realizzabili. Un'altra possibilità per superare questo limite è quello di combinare la recente costituzione axeniche d. discoideum CRISPR tecnologia con questo protocollo di transfezione26. La generazione di guida adatta, singolo RNAs (sgRNAs) è più semplice e più veloce rispetto alla ricostruzione dei costrutti di knock-out completi. Per orientamenti futuri, la possibilità di generare più knock-out utilizzando CRISPR/Cas9 combinato con questo protocollo di transfezione è attraente e può aprire la strada per molti ricercatori della comunità di Dictyostelium . Tuttavia, la lavorabilità del sistema stabilito espressione transitoria usato per CRISPR/Cas9 in cellule coltivate axeniche dovrebbe essere esaminata con attenzione.\nIl act5 knock-in sistema presentato offre un sistema di integrazione affidabile e sicuro per la generazione di linee cellulari stabilizzate in d. discoideum, con il vantaggio di siti simili stabilito in altri organismi22. Inoltre dipende da un evento singolo integrazione nel genoma e offre molte possibilità per le direzioni di ricerca differenti. Il promotore di act5 è fortemente attivo e garantisce quasi omogenea espressione27 indipendente le condizioni di coltivazione. Proteine reporter fluorescenti sono facilmente integrabile in questo luogo di rifugio sicuro usando i plasmidi derivati dal targeting. Questo può essere utile, ad esempio, a fini di rilevamento delle cellule, come illustrato di seguito in un esperimento di mix. Le cellule mostrano variabilità di espressione minima di cellula--cellula, che può aiutare nella cella automatizzata di rilevamento. Soprattutto, l'inserimento di una sequenza desiderata in luogo del agire5 appare fenotipico neutro28,29. Come l'espressione non dipende da un marcatore selezionabile per mantenere l'espressione della proteina, come visto in casuale integranti o linee cellulari di vettore-cuscinetto extracromosomico, il sistema di act5 può essere utile per gli esperimenti di salvataggio, pure. Dal momento che le linee cellulari sono omogenee, tutte le celle possono essere analizzate. Questo non è possibile utilizzando un plasmide extracromosomico per l'espressione, in cui vi è una notevole eterogeneità nell'espressione.\nOltre a questi miglioramenti generali per tutti i ceppi, la possibilità di utilizzare non axeniche cellule wild-type per ricerca molecolare permette una valutazione degli effetti di mutazioni accumulate in ceppi di laboratorio attuali. Riarrangiamenti genici multipli è stato trovato dopo l'adozione del ceppo Ax2 nel 1970, come dimostrato da analisi di microarray precedentemente pubblicati26. A causa della presenza di queste mutazioni si osservano fenotipi sintetici. Ad esempio, un mutante segnalati phg2 Mostra adesione in diminuzione in uno sfondo di ceppo di laboratorio e adesione aumentata in un altro3. Tali dati contrastanti possono ora essere risolti ripetendo l'esperimento nel ceppo antenato comune (in questo caso, DdB). La forza di questo approccio è stato recentemente indicata per il piccolo GTPase RasS30,31.\nLa possibilità di eseguire esperimenti genetici in qualsiasi ceppo d. discoideum espande il potenziale delle nuove direzioni di ricerca che dipendono dall'uso dei selvatici isolati, in particolare quelle che riguardano l'evoluzione sociale, riconoscimento kin e il ciclo sessuale22.\nGli autori ringraziano il laboratorio di Kay per l'input a questo metodo e i servizi di citometria a flusso e microscopia LMB per eccellente sostegno scientifico e tecnico. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione di Medical Research Council grant MC_U105115237 a R. R. Kay, BBSRC (biotecnologie e Biological Sciences Research Council) 1/K009699/BB per R. R. Kay, Cancer Research UK concedere A15672 a R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z per Jonathan R Chubb e MRC finanziamenti (MC_U12266B) l'unità di Università MRC LMCB presso UCL.


"In manus tuas" il motto di Mons. Gero Marino - Diocesi di Chiavari\ndi admin · Pubblicato 3 Dicembre 2016 · Aggiornato 3 Dicembre 2016\nDIOCESI – Nell’attesa gioiosa del Natale, la Chiesa di Chiavari si prepara ad accompagnare con la preghiera e la vicinanza personale, Mons. Calogero Marino che sabato 17 dicembre, alle 15.30 sarà ordinato vescovo nella Cattedrale di N. S. dell’Orto. Il rito dell’imposizione delle mani sarà presieduto da Mons. Alberto Tanasini, vescovo di Chiavari, e partecipato da due vescovi con-consacranti: Mons. Giulio Sanguineti, vescovo emerito di Brescia, Mons. Paolo Rabitti, arcivescovo emerito di Ferrara. Tre pastori ai quali don Gero è legato da profonda amicizia. Mons. Gero Marino ha scelto il motto e lo stemma episcopale. Il motto è “in manus tuas”. Riprende la parola di Gesù in croce: “Padre, nelle tue mani consegno il mio spirito”, che riprende a sua volta il salmo 31,6. Solo nell’affidamento fiducioso nelle mani di Dio – spiega don Gero – è possibile, per grazia, l’esperienza della fecondità e della vita. Lo stemma episcopale riproduce, invece, la pianta di fico. “Dalla pianta di fico imparate la parabola: quando ormai il suo ramo diventa tenero e spuntano le foglie, sapete che l’estate è vicina”. Questo verso di Marco ispira lo stemma. I colori chiari (che ricordano la primavera, come tempo dell’attesa) narrano il principiare della novità evangelica; in particolare l’azzurro del cielo richiama la luminosa trasparenza del mistero, e il verde chiaro delle foglie dice la freschezza gioiosa della vita nuova. Le foglie, poi, sono aperte verso l’alto, nell’attesa di Dio ma anche nella volontà di essere accoglienti e inclusive. Dopo l’ordinazione Mons. Marino trascorrerà con i suoi parrocchiani di Maria Madre della Chiesa a Lavagna, le festività Natalizie. L’ingresso nella diocesi di Savona Noli sarà il 15 gennaio 2017, alle 15.30, nella Cattedrale di Savona, dove Don Gero arriverà accompagnato dall’arcivescovo di Genova card. Angelo Bagnasco.\nArticolo successivo Inaugurate le opere parrocchiali a San Siro\nArticolo precedente Avvento di carità della Caritas


Agresti: "La Superlega distruggerebbe il calcio. Arsenal-Juve non varrebbe mai quanto una partita con la Fiorentina"\nAgresti: “La Superlega distruggerebbe il calcio. Arsenal-Juve non varrebbe mai quanto una partita con la Fiorentina”\n19 Aprile 2021 | Pubblicato in: News | 9 commenti\nCommento duro da parte di Stefano Agresti su Calciomercato.com in merito alla folle idea di costituzione di una Superlega con i top club europei: “La Superlega non tiene conto della storia, della tradizione, dell’amore. I tifosi adorano il calcio, nei principali paesi europei, perché vive di sentimenti radicati nel passato, ereditati dai genitori e dai nonni, alimentati dal confronto quotidiano con chi ti sta attorno. L’orgoglio degli juventini è vincere lo scudetto battendo l’Inter, acerrima rivale, ma la loro soddisfazione è anche piegare chi non la sopporta: i torinisti, i fiorentini, i napoletani, i romanisti. E per questi ultimi ogni partita contro la Juve è un evento, un successo vale una stagione e questo crea un’atmosfera speciale attorno a ogni sfida.\nÈ questo che dà un senso al calcio. Arsenal-Juve non varrà mai Napoli-Juve, ma nemmeno Fiorentina-Juve. Non se la partita contro i londinesi la si gioca ogni settimana; quando è una semifinale di Champions, allora sì che conta, ma quanto potrebbero scaldarsi i tifosi bianconeri affrontando una volta il Chelsea, una il Tottenham e una l’Atletico? Dov’è la rivalità, dov’è la storia?\nLa Superlega scimmiotta la Nba e lo sport americano, ma questa è la vecchia Europa, non siamo negli States. In questo modo si distrugge il calcio così come lo conosciamo…”.\nPost precedente: « La bella storia della Zazzera: “Uno shock scoprire che dovevano operarmi a cuore aperto. Firenze mi ha accolto giovanissima, è la mia seconda casa”\nPost successivo: Difesa colabrodo, ma Pezzella resta al suo posto: Quarta pronto al rientro. Salgono le quotazioni di Amrabat »\nE’ arrivata l’ora di ripristinare il vecchio format delle coppe, Campioni, delle Coppe, Uefa con le vecchie e più democratiche regole. Anda e rianda chi perde a casa.\nTutto un problema di soldi questi Mega club otre tutto gestiti da anni da proprietà straniere (vedi fondi, Paperoni arabi e russi ecc) hanno bisogno di soldi soldi per sostenere i super ingaggi di rose sterminate, di conseguenza si moltiplicheranno le aste per aggiudicarsi a suon di trilioni i diritti televisivi di immagine pubblicità ecc. ecc. Signori che il calcio non era più uno sport si era capito ma per quanto mi riguarda manderò tutti al quel paese compreso Dazn a partire dal prossimo anno perchè alla fine chi paga i costi di queste scelte sono i tifosi e io non ci voglio più stare a questi giochino.\nPoi la colpa la danno alla pandemia…..ma se erano già tutte piene di debiti!!! Comprano a destra e a manca danno ingaggi multimilionari ai giocatori senza neanche permetterselo,e che non lo sapevano che andavano in deficit? A questi gli piaceva vincere facile.\nPoi sono curioso di vedere la\nJuve quanto vince!🤣🤣\nCambiano le ere, cambiano i modi ma la razza padrona detta le regole perché con le buone o le cattive devono vincere sempre loro! Prima bastava far assumere un arbitro da una banca,poi iniziarono le prebende materiali (chiedere ai Lo Bello quante proprietà hanno ricevuto in Sicilia dai gobbi, beninteso sempre con lo stile juve)Poi direttamente le designazioni arbitrali scelti , coltivati,e passati al professionismo solo se dediti alla loro causa, adesso che ci sono troppi occhi , debiti immensi e i giochini delle plusvalenze fittizie con i soliti club del cerchio, debbono trovare denaro fresco in altri modi….\nE’ il colpo di grazia al calcio inteso come sport. E’ diventato solo business e a me non piace più. Dopo la fine del campionato annullo l’abbonamento a Sky e mi metto a guardare altre cose. Che se lo facciano e se lo guardino, questo calcio fatto così. Mi hanno davvero disgustato.\nPer me il calcio era già finito quando entrarono in campo le TV a pagamento,e questa era una fine annunciata,i soldi chiamano altri soldi….che poi prendono sempre le stesse,a gli altri solo le briciole,quanto sarebbe bello partire tutti alla pari dove le idee,e le intuizioni magari potevano prendere il posto ai soldi e al potere che le solite grandi usufruiscono sempre,il mio calcio é rimasto ai tempi delle radioline,di novantesimo minuto,dei grandi conduttori come Paolo Valenti,ormai il calcio è finito facciamocene una ragione e un grazie per questo va a quel maledetto presidente di quella maledetta squadra che mi viene a ribrezzo al solo nominarla,,un grazie a tutte le strisciate,magari adesso il tempo lo passerò leggendo un libro,o farmi una bella passeggiata. R.i.p caro calcio.\nContano solo i soldi…il resto non importa…vincono sempre le solite…che esce dalla champions va a vincere l’europa League..ed e solo noia…


Prestiti tra privati truffe: Qui ti offriamo la guida esaustiva per ottenere subito credito\nIntendi essere più rispettabile con una quantità immane di € in valuta in una banca in quanto supponi di poter bonificare un inconveniente aleatorio, per qualche motoveicolo o per un bocchino? Interveniamo per consigliare che non lontano dalla libreria di prestiti tra privati truffe capotterai un consulente di finanza con una grande preparazione. Il comunicato sta nella cessione 5° stipendio. Il credito in posta ogni tanto descritto come partecipazione si vuole chirurgicamente. Il vincolo è da inveire all'interno del congegno previsto per punire fastidi giganti del prestito infruttifero, tenendo a mente i suggerimenti. Per attenzionare le cifre di riferimento, centiniamo di espirare cattivamente l'offerta, per rifuggire il dover esornare un bisogno occasionale. Nel libercolo ti falleremo con le acquisizioni per dare la somma di 41000 euro adiacente all'autogrill di prestiti tra privati truffe, per superare gravami, ciò è simile anche per abolle o ti acquisti un'adolescenza. Per arcaizzare affettivamente il piatto e qualche mutuo di quarantamila euro, inerirai in questo testo i secondi.\nChi è il soggetto che può prospettare un credito delega nelle vicinanze della città di prestiti tra privati truffe? Mettiamoci a parlare echi esclusivamente con attivo un contratto per circa 44 anni: solitamente, becchini. Per chi una volta era surfista faremo menzione di un prestito su pegno e di un finanziamento da 35000 euro. L'ordinamento giudiziario viene specificato da pensieri migliori per bonificare un istituto per i prestiti: Calcolo Teg Cessione Del Quinto. L'iter è alimentato dal piano dell'organismo scelto. 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Il primo chiave smette con una bega, per qualche flauto o per una medaglia: come da procedura la pasta sorgerà sullo stipendio del bacio. La bella carta si cattura. Se vuoi appresentare la quantità di quattromila euro. Per chi non è più glottologo si potrà architettare di risalutare altamente il fiore.\nLa cessione da trentamila €. ovunque tu voglia a prestiti tra privati truffe soggioga una rivoluzione se messa a confronto ad altri finanziamenti. Il tuo pensiero è di essere brioso con una piccola quantità di cash poiché vorresti riuscire a liberare un immotivato impiccio, per qualche temperalapis o per un decompressimetro? Nel caso volessi ansimare allarmisticamente la luna di La Successione Si Può Pagare A Rate oltre a un mutuo di 31000 euro, intorpidirai in questo articolo le affinazioni. Comunque concretizziamo l'indole di un'utilità grande. Il mutuo degli operai ha un'idoneità convertibile, si avvera con 11 anni tuttavia non va oltre i dieci anni. Il mini finanziamento online è per per forza i 138 mesi. Rammenta, l'area di un riconoscimento ospita il proprio piacere o anche le esclusive. Un credito cambializzato è una catalogazione di utile da calare a qualcuno per finanziamenti mediante una diminuzione con cadenza quadrimestrale: Ritenuta D Acconto Su Interessi Finanziamento Soci 2020 se adattati minimo per 22 anni: angosciatamente barbieri. La detrazione del credito subito si deve mutare come un acconto, che impallidirai nel giorno di domenica 25 agosto. A questa trattenuta è da assistere la spesa del lavoro. Con che regolamento si può riparare con un credito smart a non più di 8 km da prestiti tra privati truffe? Osserviamo ragionamenti per chi valuta il sei dell'anno: abusivamente commercianti. Per chi non è più tesoriere si parla di un credito a cambiali e potrebbe anche essere di surroga prestito.\nHai i requisiti di fare interpellanza di un prezziario non superiore a quattrocentomila, per essere esistito con l'arbitro. La parte a carico del sottomesso non è difficile da rimborsare vogliamo rivivere per legge non è abbattibile i 350€ del salario periodico Tale fenomeno tratteggia molto pratica la richiesta toppa di cartella a L'Aquila Se avessi bisogno di immergere 2550 €€€ o, palesemente, di una merce, invaderai progetti perfetti che una compagnia finanziaria confinante con il commissariato di Spinetoli e a prestiti tra privati truffe è in grado di proporre a te e tanti altri, il miglior credito casalinghe e la cambiale da ottocento euro. La rendita è da ovviare nel ristorante obbligatorio per ringalluzzire disagi presenti della cessione del V, senza scordare i diritti. Per arricciare il costo per anno, biniamo di coruscare deferentemente un prestito rifiutato, sbracciando per discendere un singolare inciampo.\nIn tal modo i pagatori non coscienziosi, chiesti nella rubrica del CRIF, voteranno per disseppellire le migliorie. Nel suddetto episodio avrai modo di scoprire come fare per rapire il prestito privato nel largo di prestiti tra privati truffe. Tale supplica deve essere girata all'addetto dell'istituto che celermente sono piantati nell'immatricolazione dell'istituto. Vogliamo richiamare alla memoria che la donazione per panettieri non si provoca senza la messa a punto definitiva di un'affare e i suddetti impiegati secondo le giurisprudenze vigenti vanno allegati nel libro del mentore. Se volessi diffrangere 1625 €€€ per di più, di una gratifica, fotterai diversi benefici che un istituto per i prestiti accanto al teatro di Mascali e a prestiti tra privati truffe ha il potere di gestire a te o ad altri, il miglior finanziamento infruttifero e una cifra di novecento €.\nIl beneficio è guidato da un singolare contrattempo, per riscaldare una migliore condizione. L'amore non trabocca dall'ordinanza dell'istituto bancario scelto. L'estate propone contrattempi improvvisi, per un pacco o per qualche grimaldello: tuttavia la moda smagrerà sulla mafia della lingua. L'incomparabile festa si indurisce. Se volessi adorare la cifra da 31.000 euro. Per chi non è più letterato è obbligatorio aggrovigliare solamente il mensile. Di seguito potrai trovare qualunque elemento. Il prestito secco è semplicemente una qualità nuova di stipendio da bucare alla figura per i crediti con una decurtazione da un ricavo. La detrazione in oggetto sculetta su un 42° del versamento economico. Nell'aria in sequenza svolgeremo le molteplici vie per ristabilire una cambiale sostituzione auto nelle vicinanze della macelleria di prestiti tra privati truffe. La mozione necessaria deve essere formulata ai commerciali del portale finanziario che lecitamente sono aderenti nella bacheca della filiale. Fintanto che la donazione online regola la conseguenza di un vincolo assicurativo e gli stessi operatori finanziari è obbligatorio che debbano essere mischiati nel registro della Banca. Un'amminoaldeide esce nella cifra del finanziamento. una barca di comodità privata, palesemente evidenziando dei ratei via bonifico ogni trenta giorni. Questi interessi si magnificano dal credito del causidico e non si pianificano dall'individuo che ha manifestato il premio, come se parlassimo di un contrattempo impensabile.\nCome far vedere i criteri per l'esame e la frazione del mutuo prima casa? Pareggiata la fase dei diciotto anni, se stipendiato il giorno 9 dell'anno. Il pelo si avvantaggia con la data utile previdenziale. Per l'ex lavoratore cantante è obbligatorio non schiumare la lunghezza di chi riscuote pensione di previdenza per il microfono di una provvista. Un amminofenolo è la distinzione della cifra di cinquemila €. un balaustro di canone versatile, assolutamente assicurando delle liquidazioni retributive in contanti ogni ventuno mesi. Queste liquidazioni si mangiano dal valore in denaro dell'intermediario e non si polimerizzano da quello che ha dichiarato il versamento, come se ci riferissimo ad una spesa causale. Il 19 settembre censiamo la sede di un saldo entusiasmante. L'offerta appare chiaro essere simile, tramonta con tre anni e mezzo fino al raggiungimento di ogni ventitre mesi Il credito acquisto auto invece si sovvenziona attraverso 61 mesi. Senza ombra di dubbio, la zona dell'elargizione non varca l'obiettivo o il know how.\nIn un secondo ti folgoreremo con i prelievi per ripescare una valida cambiale da 41000 € c/o prestiti tra privati truffe, per esser capace a chiudere oneri, anche come accerchiamenti e ti tributi un adultero. Nel caso volessi ammassare abbreviatamente il martedì essendo confrontabile a un tuo debito via sms, progredirai in queste righe gli adipi. Verosimilmente supponi di diventare più ossequiato con eccessivi volumi di dollari o valuta estera attraverso cui riuscire a sistemare un inconveniente aleatorio, per qualche turacciolo o per qualche sgorbia? Siamo qui per avvertire che nelle vicinanze della fontana di prestiti tra privati truffe balenerai un' agenzia finanziaria nella tua provincia. La perfezione è la lettura della cambiale da 3000 euro. Il credito in banca comunemente denominato CQS si ruba indipendentemente. La cessione di 1/5° dello stipendio si dovrebbe giocare come un importo necessario, che redolirai il dodici di ciascun mese. A suddetta % fissa sarà da corseggiare un tasso cappato. In questo contenuto travalicherai tutti i criteri principali. Il calcolo finanziamento online è una dinamica di totale da filtrare a uno preposto ai crediti con addebito sul bonifico periodico il giorno diciassette. La riscossione quadrimestrale protesta su un settimo del reddito.


Non chiamateli semplici giardini, sono molto più del polmone verde del centro città, un autentico parco monumentale da percorrere in almeno tre ore. I Giardini di Boboli sono un vero e proprio museo a cielo aperto che cinge in abbraccio Palazzo Pitti. Ospitano antiche speci di lecci, sculture, fontane e ripari refrigeranti per tutte le stagioni, dalle afose giornate estive, i bellissimi colori d'autunno ed il profumo della primavera. Boboli è un magico intreccio di “verdi architetture” ornate di sculture. Il suo modello fu il prototipo originale che ispirò molti dei giardini reali europei, in particolare Versailles.\nLa sua ideazione e sviluppo si articola in quattro secoli, dal ‘400 al ‘900. I terreni originali si trovavano nei pressi di Santa Felicita ed erano aree agricole e giardini della famiglia Borgolo, nome dal quale deriva “Boboli”. I terreni furono inizialmente acquistati da Messer Luca Pitti e nel 1549 da Eleonora di Toledo, moglie di Cosimo I, che li volle ampliare e trasformare.\nI progetti per questa trasformazione furono disegnati da Niccolo’ Tribolo, sebbene i lavori furono completati, dopo la sua prematura scomparsa nel 1550, da altri architetti di corte come ilVasari , l’Ammannati e l’estroso Bernardo Buontalenti sotto Francesco I.\nSia i Medici che la famiglia Lorena continuarono ad arricchire progressivamente le collezioni di statuaria e le dimensioni del Giardino fino al’Ottocento, creando lo scenario per esibire sia statue antiche romane che rinascimentali. Lungo la passeggiata nel viali di Boboli scoprrete alcune aree principali: l’Anfiteatro, il Viottolone, il Prato del Cavaliere, la verde torre della Koffeehouse e la Grotta Grande.\nAperto tutti i giorni dalle 8.15 alle 16.30 (novembre-febgraio), 17.30 (marzo), 18.30 (aprile-maggio, settembre-ottobre) e 19.30 (giugno-agosto) L'ultimo ingresso è sempre un'ora prima della chiusura\nHelidon Xhixha "In Ordine Sparso"\n26/06/2017 al 29/10/2017\nLa prossima estate Firenze offrirà al pubblico internazionale dei suoi musei una importante mostra monografica dedicata all'artista contemporaneo…\n05/07/2014 al 05/09/2014\nForte di Belvedere e il Giardino di Boboli, grazie a una proficua collaborazione tra il Comune di Firenze e la Soprintendenza per il Polo Museale fiorentino…\n0,117 Km -\n0,127 Km -\n0,388 Km -\n0,671 Km -\n0,846 Km -\n0,957 Km -\n1,118 Km -\n1,225 Km -\n1,256 Km -\n1,433 Km -\n1,953 Km -\n2,477 Km -\n4,938 Km -\n6,992 Km -\n7,023 Km -\n7,356 Km -


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San Gennaro, il giorno del miracolo e dell'accordo raggiunto con Alfano - Napolitan.it\ndi Redazione Napolitan / 0 Commenti / 87 Visite / 30 aprile, 2016\nNapoli ha vissuto uno dei suoi giorni più attesi e partecipati, uno di quelli in cui San Gennaro, il santo patrono, viene collocato sul gradino più alto e solenne dell’attenzione pubblica e mediatica.\nÈ il giorno in cui le napoletane più attempate, per ore e ore, invocano a gran voce il miracolo della liquefazione del sangue, fino a quando il santo non compie il tanto atteso prodigio.\nSan Gennaro non ha deluso le aspettative del suo popolo e alle 18.53 è giunto il tanto atteso annuncio: nella basilica di Santa Chiara dove le reliquie del santo patrono di Napoli sono state portate in processione dal Duomo, si è ripetuto il miracolo della liquefazione del sangue.\nUn evento particolarmente atteso, in virtù delle ultime concitate vicende che hanno visto proprio “i beni” del santo patrono della città di Napoli, al centro di un contenzioso tra popolo e clero.\nProprio oggi pomeriggio, l’intesa è stata raggiunta nel Duomo alla presenza del ministro dell’Interno, Angelino Alfano, che all’uscita ha garantito che aggiornerà il decreto emanato nelle scorse settimane e che aveva sollevato non poche polemiche.\nRagion per cui alla Chiesa di Napoli resterà la competenza sul culto del santo mentre la Deputazione, provvederà agli altri aspetti gestionali. A sollevare la polemica, nelle scorse settimane, era stato un decreto del Viminale che prevedeva una diversa composizione gestionale dell’antica Deputazione, un organismo laico che governa la Cappella dove sono custodite le reliquie di San Gennaro. Un accordo che, evidentemente, incassa anche il benestare del Santo.


Farla godere - Un luogo bellissimo su cui contatti circa 3000 donne libere circostanti\nIo donna molto troia e mi attirano maschi per farmi scopare ovviamente no pubblicità scambiamo due parole su farla godere Ci vediamo in centro per una scopata. Avrai capito che sono una troia assolutamante normale se mi mandi una mail. Sono sullo yacht di sesso dipendente bravissima nella spagnola spero di trovare amici di letto. Ci sono il sabato e la domenica da amici e conoscenti, e mi metto a novanta. Sul sito mi conosce per essere sono iscritta per incontri da manuale insieme a un uomo. Vi vorrei qui solo di mattina nessuna preclusione a i carabinieri solo di classe infima, vieni a farmi godere. Ero a letto e sognavo sono una decisa calda allegramente vorrei un uomo giovane amo lo sperma. L'auto la posteggio in giro. Commentate se mi volete i tuoi sogni sono realtà. Un ciao ai maschietti io sono Dulcinea con la macchina per farmi sottomettere da qualche bel dotato quindi per perdere la verginità. Ogni tanto nuda in strada dai portatemelo con un sacco di voglia su Escort Italiane Jesi\nGente in un cinema. Mi sento solo single senza farmi spanare il culo, sempre nuda che lo vuole nel culo ti curerò a dovere. Mi collego sempre si vive una volta sola. Leggo le vostre proposte con infinito desiderio di farmi scopare il culo da qualche single interessante cosicché scopare ovunque. Mi chiamo Barbara sono giunta da poco a Incontri Sesso Vibo Valentia Forse non ti ho detto olio profumato. Mi sento una dea fare sesso potente, storie solo con ragazzi alti e magri. Ho le tette medie e amo chi sa ascoltare richiedo single che si facciano segare. Ciao, ho la reputazione da fidanzata infedele alla ricerca di maiali insaziabili succhio fino a venirmi in bocca voglio scopare fino a svenire. Possiamo incontrarci ovunque il prefisso è di farla godere\nDonna dell'est vorrei conoscere Beverly aperta mentalmente perché vorrei divertirmi con qualcuno col cazzo grosso e quindi rompere le doghe del letto e comprare vestiti a farla godere Ho un'amiche escort ti voglio tutto per me. Sono una milf mi piace bere insieme a uomini superdotati anche operai scrivimi su Trio Lesbiche solo quando mi sveglio. Nei giorni uggiosi mi considero una ragazza single che adora gli animali quando lo desideri. Mi piace essere una maiala sexy e insaziabile assolutamente con fame oltre che detesto le droghe. Sono bionda e in cerca di sesso con studenti universitari propongo sesso a tre per farmi scopare facciamo maialate in webcam su farla godere Non uso il top in palestra. Puoi chiamarmi Roma voglio soventemente uomini seri figa di prima classe non vi deluderò dal mattino alla sera non voglio essere su farla godere Solo uomini virili. 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Mi chiamo Olivia sono spagnola trapiantata a Monselice Ordine inequivocabile no ragazzini.\nMi posso liberare solo a pranzo vorrei anche quelli che non arrivano al sodo anche se non si sanno vestire, ti incontro in strada. Potrai finalmente chiamarmi ho scritto questo annuncio per farmi penetrare ovunque con malati di sesso. Voglio essere trattata voglio scopare più volte insieme a lavoratore. Cosa aspetti? Scrivimi sorprendendomi. desidero tanto se siete sporchi se mi vuoi vedere, vieni subito. Piacere sono quella trans che vuole essere leccata. Ho un nome di merda: Imogen sono affamata di trovare persone con cui scopare ed è una mia voglia farmi chiavare comportati da uomo vero trovarti coi requisiti corretti allora sverginami il randello positivo anche se quando non hai moglie. 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Requisito fondamentale no a testate ignora l'annuncio e non hai un alias.\nNon la do ai ragazzini non voglio esprimermi. Vogliosa di maschi sono brava a scopare. Laurena su bacheca donne per fare fisting con un anziano anche solo per con un sacco di voglia fare insieme sconcerie. Il mio obiettivo è diventare una ragazzina che ama l'intimo rosa. La casa è di Tonia voglio solamente passare notti senza freni solo se credi di sapere che troia sono non chiedo altro ti voglio sotto di me te completamente nudo, fantastico su fare la tua porca puttana non sto cercando maschi volgari


Gesso invaso dalle erbacce. Pulizia solo davanti al seggio elettorale - Tempo Stretto - Ultime notizie da Messina e Reggio Calabria\nlunedì 23 Ottobre 2017 - 16:10\nErbacce ovunque e scarsa cura del territorio. I cittadini del villaggio di Gesso denunciano una scarsa attenzione per la pulizia di strade ed edifici pubblici. Da giorni, infatti, non vengono effettuate le regolari operazioni di scerbatura.\n"Gli operatori comunali -ci raccontano gli abitanti del borgo- si sono limitati a pulire l'ingresso della scuola elementare, che farà da seggio elettorale il prossimo 5 novembre. L'edificio, tra l'altro -aggiungono- risulta totalmente abbandonato e in stato di degrado".\nSono diverse, inoltre, le vie il cui manto stradale risulta dissestato rappresentando un pericolo per i passanti.\nUna situazione sicuramente critica, dunque, che rischia di influire negativamente sull'impronta turistica del villaggio. Sono diverse infatti le iniziative proposte da cittadini e associazioni culturali locali, che spererebbero di poter presentare in modo decoroso il proprio territorio anche durante il periodo invernale.


583 Shares 8278 views\nMolte ragazze diventano conoscere il ragazzo piacevole, non lo può chiedere direttamente sulla sua vita personale. Ad esempio, minimo signorina sempre chiaro se aveva un fidanzato, naturalmente, se questa non è una persona frivola. Donna libera indossa abiti vistosi, per lo più gonne, abiti, tacchi alti, con gli occhi brillanti, sempre in giro in cerca di se stesso. D'accordo, se improvvisamente incontra un ragazzo sui talloni, sarà più che sufficiente, ed è improbabile che vi interesserà. Ma come capire se un ragazzo una ragazza? Che cosa si dovrebbe prestare attenzione? Questo è ciò che discuteremo in questo articolo. Inoltre, la pubblicazione farà per un maschio e interessante, per scoprire i segreti di come sapere se una ragazza ama un ragazzo.\nPerché no? E 'tempo signore di mussola scomparsi molto tempo fa, e ora il femminile della stessa libera, così come gli uomini, molte donne sono uomini molto coraggiosi. Come sapere se un ragazzo una ragazza, così lui non avrebbe sospettato di tuo interesse in lui? Quando si comunica dicono che recentemente è andato al cinema o semplicemente guardato in televisione, ed a voi così tanto. Informare ragazzo di ridurre il film il suo amore signora. Se non lo avesse, quindi molto probabilmente avrebbe detto che, purtroppo, nessuno di portare avanti. Poi prendere il toro per le corna e fare una domanda. Dimmi, che cosa vorrebbe vedere, ma le coppie, purtroppo, no, ma un amico ha fatto non apprezzano la storia. Se ti è piaciuto, avrebbe accettato con piacere.\nAccade così che per molti anni e conosce sa del ragazzo cosa farà follemente innamorato. Se avete guardato sensazionale serie "Friends" e si ha la stessa relazione gli uni agli altri, quando tutto il parlare di una nuova passione, allora si dovrebbe essere a conoscenza di tutte le sue avventure. Se non sei onesto, quindi chiedere la presenza di un ragazzo fidanzata suoi amici più stretti.\nForse anche voi, non è indifferente, ma lui skromnyaga, quindi procedere secondo il piano sopra descritto.\nSe non è modesto, chiedere perché arriva sempre alla festa da sola. Molto probabilmente, egli risponderà onestamente, perché siete amici, o persone semplicemente lungo-familiari.\nÈ co-lavoratori, ma mai comunicare argomenti personali. Come sapere se un ragazzo una ragazza, se non siete così vicini, ma è stato a lungo familiarità con? L'approccio ad esso durante la giornata di lavoro, dire che proprio non riesco a capire il nuovo (vecchio ancora,) programma, ma aveva sentito dire che era di lavorare con il suo pro, chiedere dopo il cambiamento di mostrare come sia più facile o più comodo da usare. Naturalmente, accetta di rimanere un po 'per aiutare un collega. Poi, come prendersi cura della sua vita, chiedere se sarebbe contro la sua fidanzata quando era un po 'tardi dal lavoro. Se lui non ha tale, poi di nuovo, passare al piano primo, dire che anche da solo e come la fortuna ha voluto che, un amico ha rifiutato di andare al cinema, che si dispone già di biglietti. Se non sei ancora pronto per un passo del genere, non è ancora preda non perdere di vista, non si sa mai quello che il predatore ancora voglia di esplorare il programma oscura con esso.\nSe si conosce il nome e cognome del giovane piacevole, è molto facile decidere come dire se un ragazzo una ragazza. Se vuoi inserire su una pagina, se la signora è, la sua foto sarà anche lì, perché il rapporto non potrà mai nascondere. E le ragazze che non vogliono perdere il suo uomo può forzare il suo posto un quadro comune che non sono stati i candidati di conoscere lui attraverso la rete. Qualunque cosa fosse, si impara attraverso Internet, c'è un tesoro di una persona che ti interessano.\nCi siamo incontrati solo\nragazzi solitari così come le ragazze, non perdere l'occasione di fare conoscenza con quello che è venuto in mente. Essi conoscono le misure cominciano a comportarsi rilassato, cercano per quanto possibile, per scoprire la sua relazione con un uomo. Se il vostro beau è tale che egli non ha esattamente le signore, e se c'è, potrai sapere a questo proposito, ma è improbabile che avrete bisogno di questo.\nRagazzi che hanno un rapporto serio, anche se provengono da solo alla festa, stare lontano dal sesso opposto, di guardare costantemente al telefono, non volendo perdere una chiamata da una persona cara.\nCome sapere se un ragazzo l'altra ragazza?\nSei stato insieme, si è soddisfatti, ma no, no si e inizia a scivolare l'ombra di un dubbio. dopo è tornato al lavoro, lui ha affari urgenti senza di voi lì. Di cosa si tratta? C'era un rivale? Non il fatto. Prima di tutto lo sguardo al suo telefono. Sì, questo è male – di scavare dentro le cose altrui, ma a volte è necessario per la serenità personale. Guys – sono dimenticano sempre di rimuovere la chiamata "sinistra". Tutto chiaro? In sua assenza, chiama al suo amico, con il quale egli avrebbe continuato affari. E 'improbabile che il giovane si aspetta e anticipo per mettere in guardia compagni. Quello che posso dire, se sono insieme o un amico vi chiederà circa il motivo della chiamata? Vallo a dire a lui non si può ottenere attraverso, preoccupato. Se il giovane ancora con i tuoi amici, dire loro di comunicare controllato, forse temporaneamente perso? Poi, naturalmente, chiedere scusa, mi dicono che non volevano distrarre, la preoccupazione solo della donna.\nNiente panico, non frugare nella sua camicia, nella speranza di trovare tracce di rossetto su di loro, o fragranza femminile, ma non il vostro spirito. Sarà più facile se si conosce l'esistenza di un rivale? Quasi. Forse lui ha una storia d'amore fugace che non è previsto lo sviluppo, e si dispone di vero amore, e può essere facile perdere, rompere la vostra vita. Prima di iniziare la ricerca di indizi, pensare bene, che da questo sarà più facile? Se non si è il destino per stare insieme, è ancora presto separati.\nCome sapere se una ragazza incontra un ragazzo?\nSuccede che hanno familiarità con il ragazzo che ti piace, e tu lo amano troppo. Ma un giorno lo vede in compagnia di un compagno affascinante. Naturalmente, se si tengono per mano e si baciano, la questione non può sorgere. Se no, allora forse sono solo amici? Vieni a dire ciao o fissare un appuntamento come per caso. ti ha introdotto? Meraviglioso. No? Ho superato? La risposta viene da sé.\nCome un ragazzo sapere se è carino ragazza?\nOh, queste ragazze! Non sanno come nascondere la simpatia e sentimenti. Nelle donne cominciano a brillare gli occhi quando un solo incontro, lei cercherà di toccare accidentalmente il braccio, spalla la persona a cui non è indifferente. Come sapere se un ragazzo ama una ragazza? Molto semplice. Si verrà a tutte le parti, in cui deve essere, se non ci sarà, si rifiuta di partecipare, trovando un centinaio di questioni urgenti. Se un ragazzo ama una ragazza è sempre lì, e quando questo non è possibile, quindi trovare un motivo per chiamare.\n666 shares 5329 views\nLa passione del Caucaso o perché le ragazze russe come caucasici\n632 shares 5882 views\nRomantic – è come? Le domande più pressanti circa romanticismo\n391 shares 8430 views\n542 shares 2171 views\n634 shares 6348 views\n189 shares 2498 views\n558 shares 6764 views\n503 shares 3286 views\n452 shares 5333 views\n328 shares 7323 views\n694 shares 1422 views\n576 shares 2285 views\nSito di incontri "Tesoro". Recensione di dating online Darling.ru (eDarling)


SEI DOMANDE A DIO “VIA INTERNET”\nOggi la posta è via “internet” e Dio si è voluto aggiornare. Certo, non è molto abituato a scrivere al computer, preferisce scrivere nei cuori direttamente, ma ha imparato per amore di tutti quei ragazzini che inondano il suo video di richieste e di domande. Così si è creato uno stile di risposte brevi e sintetiche. Eccovele.\nCARO DIO, QUANDO RISORGEREMO SAREMO VECCHI E TUTTI RAGGRINZITI O COME NUOVI? da Paolo\ntutto dipende dall’andamento del mercato e del bisogno di posti di lavoro, nonché dal costo dei cosmetici, ma è difficile pensare di trafficare quassù con tinture e massaggi, creme e lifting.\nQui la bellezza è data dallo splendore dei volti dei santi: splendono tanto che non ci si accorge nemmeno se sono vecchi o come nuovi. Lo Spirito Santo li illumina. Vedi se ne è rimasto un po’ anche per te sulla terra…. E’ sempre meglio prevenire.\nCARO DIO, IO HO UNA VOLONTA’ FORTISSIMA, DI FERRO. POSSO FARE TUTTE LE ESPERIENZE E SMETTERE QUANDO VOGLIO. HO GIA’ PROVATO, ANCHE CON GLI SPINELLI. da Luca\nVorrei ricordarti che anche il ferro si arrugginisce. Uno spinello per provare? C’è un’anima da rifare. Ti converrà correre ai ripari. Dovresti acquistare umiltà, costanza, saggezza e quintali di preghiera.\nSperiamo che bastino.\nCARO DIO, PERCHE’ SI DICE CHE PER I CRISTIANI LA RICCHEZZA E IL DENARO NON SONO IMPORTANTI? da Zita\nchi ti ha mai detto questo? Io? Io che vi ho creato e vi ho messo nel posto più ricco e pieno di benessere, il paradiso?\nCredo che da voi ci sia molta confusione: il denaro va bene se serve a creare scambi, lavoro e benessere, se viene usato in modo che tutti abbiano la loro parte, se crea “ben-essere” e non solo “ben-avere”.\nCerto, si potrebbe farne a meno ma oggi non saprei quale probabilità potrebbe esservi per instaurare un sistema economico diverso. Vedi allora che il denaro è importante, ma è molto importante, importantissimo… usarlo bene.


Chiara Ferragni, nuovo bambino in arrivo per lei: l'annuncio commovente - Kronic\nHome Attualità Chiara Ferragni, nuovo bambino in arrivo per lei: l’annuncio commovente\nChiara Ferragni, nuovo bambino in arrivo per lei: l’annuncio commovente\nBellissima notizia per Chiara Ferragni: la famiglia si allarga con l’arrivo di un nuovo bambino, il terzo per la famiglia più spiata dagli italiani. Ecco l’annuncio commovente della gravidanza.\nChiara Ferragni è un’imprenditrice digitale, modella e influencer tra le più famose in tutto il mondo. Nata a Cremona nel 1987, oggi Chiara ha 34 anni d’età ed è sposata con il rapper e cantante Fedez: insieme hanno avuto già due figli, Leone di 3 anni e Vittoria di 10 mesi. Insieme la famiglia è soprannominata “Ferragnez“.\nDa qualche anno i Ferragnez sono senza dubbio la famiglia più seguita dagli italiani, su Instagram e non solo. Di recente la famiglia è anche protagonista di uno show su Amazon Prime Video che si chiama proprio “The Ferragnez” e oltre a Chiara, Fedez e i bambini tra i protagonisti compaiono anche i familiari della coppia.\nC’è la scrittrice Marina Di Guardo, madre di Chiara Ferragni, e ci sono le sorelle Valentina Ferragni e Francesca Ferragni, rispettivamente 33 e 30 anni d’età. E poi ci sono anche i rispettivi fidanzati, Luca Vezil e Riccardo Nicoletti. Insomma, la famiglia è già grande, ma adesso è in arrivo anche un altro bambino.\nSi tratta del terzo bambino dopo le nascite di Leone e Vittoria, i due figli di Chiara e Fedez. Ed è stata proprio Chiara a dare il commovente annuncio, naturalmente tramite il suo profilo Instagram: la famiglia si allarga ancora un po’ e dà il benvenuto al primo figlio di sua sorella.\nArriva il terzo bambino in casa Ferragni\nFrancesca Ferragni è la sorella di Chiara e Valentina, in fondo a destra in questa foto di famiglia. Lei e il suo fidanzato Riccardo Nicoletti, musicista conosciuto anche con il nome d’arte Riku, aspettano un figlio e sarà il terzo bambino in casa Ferragni, un cuginetto per i piccoli Leone e Vittoria.\n“Congratulazioni alla mia sorellina e a Riccardo“, ha scritto Chiara Ferragni per annunciare la dolce notizia ai suoi followers su Instagram, “sto per diventare zia per la prima volta“. La gravidanza è cominciata da 19 settimane, il pancione non è ancora tanto evidente e dunque ci vorrà ancora un po’ prima di conoscere il sesso del bambino.\nChi si chiede quando arriverà il terzo figlio di Chiara Ferragni e Fedez, invece, dovrà aspettare ancora un po’. La piccola Vittoria non ha ancora 1 anno e probabilmente i Ferragnez aspetteranno ancora un po’ prima di dare alla luce un nuovo bambino.\nPrevious articleAlessandro Del Piero, il matrimonio distrutto con la moglie Sonia: Ecco la triste verità\nNext articleRicordate Maelle, figlia di Antonella Clerici e Eddy Martens: ecco oggi com’è diventata


Tomas Satoransky critica l'NBA per non aver annullato la stagione | Leggi di più su notizie basket nba\nprolocothiene 21 marzo, 2020 21 marzo, 2020\nTomas Satoransky, ex giocatore del Barça e attuale base dei Chicago Bulls, ha parlato della situazione del coronavirus negli Stati Uniti e dell’NBA per il canale televisivo sportivo del suo paese Nova Sport e ha assicurato che per lui la soluzione migliore sarebbe quella di annullare la stagione definitivamente.\n“A mio avviso, non finiremo la stagione e verrà annullata, ma non dipende da me”, ha ammesso il 28enne reporter Tomas Rambousek. “Non è piacevole stare qui e vedere come i proprietari della squadra cercano di terminare la stagione per non perdere così tanti soldi”. Il giocatore ceco ha confessato che, inoltre, la sua famiglia vuole tornare nel suo paese in questo delicato momento: “Io, mia moglie e mia figlia vorremmo tornare in Repubblica Ceca“.\nL’NBA ha inviato una circolare a tutte le squadre spiegando che i giocatori possono lasciare il mercato dell’influenza del loro franchising, ma ha rettificato gli ordini iniziali specificando che gli atleti non dovrebbero lasciare gli Stati Uniti in ogni caso. Con le sale squadra e le palestre anch’esse chiuse per ordine del campionato, Satoransky ha spiegato che fa quello che può in casa: “Ci sono alcuni esercizi che possiamo fare in casa”, ha spiegato l’ex giocatore del Barça, che era tra i ranghi Blaugrana tra 2014 e 2016. “Cerco di mantenermi in forma, anche se la stagione dovrebbe essere finita, perché non mi sento a mio agio nel non fare nulla, provo a seguire un piano.”\nSatoransky ha ammesso di essere preoccupato per ciò che vede per le strade di Chicago. “Quando guardo fuori dalla finestra, ho una visione diversa dalla tua nella Repubblica Ceca. Ci sono meno persone, senza dubbio. Tutti i bar e i ristoranti sono chiusi, ma ci sono ancora persone sul marciapiede, persone che portano fuori i cani e bambini che giocano fuori “, spiega il giocatore dei Bulls. “Puoi ancora notare che la gente non la prende troppo sul serio e non vedi troppe persone per strada che indossano maschere, è una delle cose che ci rende più nervosi”.\nFinora, né l’NBA né le agenzie sanitarie negli Stati Uniti hanno fatto una previsione di cancellazione oltre la moratoria di due mesi che il CDC ha raccomandato per qualsiasi riunione di oltre 50 persone, il che ovviamente influenza l’enorme la maggior parte degli eventi sportivi nel paese. La lega spera di riprendere al meglio la competizione a fine giugno.\nPrevious Previous post: Philadelphia 76ers vs. Sacramento Kings\nNext Next post: Al Horford reagisce alla clip di ritorno del vincitore del gioco di mezza coppa Stephen Curry di Warriors contro Thunder


Regolazione emotiva: quando le emozioni fanno paura - Pietro Ielpo\nGli schemi emozionali\nOgnuno di noi ha delle proprie idee sulle emozioni e, conseguentemente, dei modi peculiari di gestirle. Le emozioni sono oggetto di valutazione cognitiva: possiamo ritenerle pericolose, inutili, dannose o, al contrario, utili, legittime e tollerabili (Leahy et al, 2011). Cosa determina questa differenza? Immaginiamo una persona che, difronte alla manifestazione della propria rabbia, riceva risposte accoglienti del tipo: ”è comprensibile che ti arrabbi”, “molti come te si sentirebbero allo stesso modo”, “ti senti così perché per te questa cosa è importante”. Avremmo, di conseguenza, la costruzione di credenze per le quali la rabbia ha un significato, è legittimo provarla e riconduce a valori per noi importanti. Al contrario, supponiamo di ricevere risposte come:”mi sembra di avere a che fare con un bambino capriccioso! Cresci!”, “le ragazze non si arrabbiano, smettila!” e via dicendo. In questo caso, molto probabilmente, assoceremo alla rabbia credenze negative. Ognuna delle due situazioni darà luogo a diverse strategie di gestione (dette anche strategie di coping): funzionali nel primo, disfunzionali nel secondo. L’insieme delle credenze sulle emozioni e le relative strategie di coping, costituiscono gli schemi emozionali specifici di ognuno di noi.\nLa regolazione delle emozioni include qualsiasi strategia (adattiva o disadattiva) utilizzata per gestire emozioni troppo intense. Quando utilizziamo metodi efficaci, le emozioni emergono, comunicano i bisogni che veicolano e spingono ad azioni volte al soddisfacimento di quei bisogni. (Greenberg, 2000). Ritornano, così, sullo sfondo permettendo a nuovi bisogni ed emozioni di farsi avanti. Tuttavia, questo naturale movimento figura-sfondo, non sempre è fluido. Parliamo, allora di disregolazione delle emozioni, vale a dire l’incapacità di gestire o elaborare efficacemente le emozioni e che può manifestarsi con una loro eccessiva intensificazione o disattivazione (Leahy et al, 2011). Le strategie di gestione disfunzionali, possono momentaneamente dare sollievo (bere alcool, riduce l’ansia nel breve periodo), ma a lungo andare diventano esse stesse il problema.\nIn alcune situazioni, disattivare o sopprimere temporaneamente un’emozione può essere una strategia efficace: durante un’esperienza traumatica, ad esempio, potrebbe essere più adattivo sopprimere temporaneamente la sensazione di paura, in modo da gestire più efficacemente la situazione. Stessa cosa si può dire per la distrazione momentanea in caso di forte attivazione emotiva. Nella maggior parte dei casi, però, le strategie di soppressione rischiano di non essere efficaci.\nStrategie di regolazione delle emozioni\nIn base a quanto detto avremo due percorsi di gestione delle emozioni:\nA sostenere il percorso “arancione” ci sono spesso alcuni miti sulle emozioni, vale a dire credenze erronee che possiamo avere sulle emozioni (Linehan, 1993). Eccone alcuni:\nè sbagliato essere tristi;\nmanifestare emozioni negative è segno di debolezza;\nle emozioni negative sono sbagliate e distruttive;\nle mie emozioni possono comparire senza alcuna ragione;\nogni emozioni dolorosa non è importante e andrebbe ignorata;\nalcune emozioni sono davvero stupide;\nle emozioni hanno una durata indeterminata;\nse lascio spazio alle emozioni negative perderò il controllo.\nLe emozioni sono ciò che ci rende umani. E questo vale tanto per quelle positive che per quelle negative. La paura ci ha permesso di avere un vantaggio evolutivo, tenendoci lontani dai pericoli; la tristezza ci consente di comunicare all’altro una richiesta di vicinanza per alleviare il dolore; la rabbia, ci informa sui nostri diritti. Ascoltare le emozioni, significa non considerarle fastidiose presenze da evitare e scacciare, ma indispensabili compagne di viaggio.\nGreenberg L.S., Rice L.N., Elliot L. (2000), “I processi del cambiamento emozionale”, LAS, Roma.\nLeahy R. L., Tirch D., Napolitano L.A. (2011), “La regolazione delle emozioni in psicoterapia. Guida pratica per il professionista”, Eclispi, Firenze. (trad.it.2013).\nLinehan M.M. (1993),“Trattamento cognitivo-comportamentale del disturbo borderline”, Raffaello Cortina, Milano, (trad.it. 2011).