Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts | Protocol (Translated to Italian)\nL'obiettivo di questo studio era quello di stabilire un metodo per studiare le dinamiche cardiache utilizzando un modello animale traslazionale. L'approccio sperimentale descritto incorpora l'optocardiografia a doppia emissione in combinazione con uno studio elettrofisiologico per valutare l'attività elettrica in un modello cardiaco porcina isolato e intatto.\nI modelli animali di piccole dimensioni sono più comunemente utilizzati nella ricerca cardiovascolare a causa della disponibilità di specie geneticamente modificate e dei costi inferiori rispetto agli animali più grandi. Eppure, i mammiferi più grandi sono più adatti per domande di ricerca traslazionale relative alla fisiologia cardiaca normale, alla fisiofisiologia e ai test preclinici degli agenti terapeutici. Per superare le barriere tecniche associate all'impiego di un modello animale più grande nella ricerca cardiaca, descriviamo un approccio per misurare i parametri fisiologici in un cuore di maialino isolato e perfuso da Langendorff. Questo approccio combina due potenti strumenti sperimentali per valutare lo stato del cuore: studio di elettrofisiologia (EP) e mappatura ottica simultanea di tensione transmembrana e calcio intracellulare utilizzando coloranti sensibili ai parametri (RH237, Rhod2-AM). Le metodologie descritte sono adatte per studi traslazionali che studiano il sistema di conduzione cardiaca, alterazioni nella morfologia potenziale d'azione, gestione del calcio, accoppiamento di contrazione eccitazione e l'incidenza di alternanze cardiache o Aritmia.\nLe malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di malattia e morte in tutto il mondo. Come tale, un obiettivo di ricerca primaria è quello di ottimizzare le metodologie che possono essere utilizzate per studiare la fisiologia cardiaca normale e meccanismi sottostanti che possono contribuire alla morbilità e mortalità negli esseri umani. La ricerca cardiovascolare di base si è tradizionalmente affidata a piccoli modelli animali, tra cui roditori e conigli1,2,3, a causa della disponibilità di specie geneticamente modificate4,5, minore costo, ingombro sperimentale più piccolo e una maggiore produttività. Tuttavia, l'uso di un modello di suina ha il potenziale per fornire dati più rilevanti dal livello clinico6. Infatti, studi precedenti hanno documentato somiglianze nell'elettrofisiologia cardiaca (EP) tra esseri umani e suini, tra cui correnti ioniche simili7, forma potenziale di azione8e risposte ai test farmacologici9. Inoltre, il cuore porcina ha cinedi contrattili e relax che sono più paragonabili agli esseri umani di roditori o conigli10. Rispetto a un modello canino, l'anatomia coronaria porcina assomiglia più da vicino a un cuore umano11,12 ed è il modello di scelta per studi incentrati sullo sviluppo del cuore, cardiologia pediatrica e/o difetti cardiaci congeniti 13.Anche se ci sono differenze tra il maiale e il cuore umano8, queste somiglianze rendono il cuore di porcina un modello prezioso per la ricerca cardiovascolare14.\nLa perfusione retrograda del cuore è diventata un protocollo standard per lo studio delle dinamiche cardiache ex vivo15 dalla prima fondazione da Oskar Langendorff16. Di conseguenza, Langendorff-perfusione può essere utilizzato per sostenere un cuore isolato e intatto in assenza di influenze autonome. Questo modello è uno strumento utile per confrontare direttamente l'elettrofisiologia cardiaca e la contrattilità tra cuori sani e non sani. Poiché le dinamiche cardiache sono complesse sia dal tempo che dallo spazio, una leggera alterazione in una regione può influenzare drammaticamente la capacità dell'intero cuore di funzionare come sincitio17. Pertanto, l'imaging spatiotemporale elevato di coloranti sensibili ai parametri è uno strumento utile per monitorare la funzione cardiaca sulla superficie del cuore18,19. Infatti, la doppia imaging simultanea di sonde fluorescenti sensibili alla tensione e al calcio consente la valutazione dell'attività elettrica, la manipolazione del calcio e l'accoppiamento di contrazione di eccitazione a livello tissutale20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Le tecniche di mappatura langendorff-perfusione e/o ottica sono state precedentemente utilizzate per documentare il declino delle prestazioni cardiache dovuto all'invecchiamento o alle mutazioni genetiche e per valutare la sicurezza degli agenti farmacologici o delle esposizioni ambientali29 ,30,31,32,33.\nIn ambito clinico, uno studio di elettrofisiologia cardiaca invasivo viene spesso utilizzato per studiare disturbi del ritmo cardiaco, identificare patologie e individuare possibili opzioni di trattamento. Allo stesso modo, descriviamo un protocollo EP che può essere utilizzato per valutare la funzione del nodo del seno, misurare la conduzione atrioventricolare e identificare la refrattanza del tessuto miocardico. Lo studio EP descritto può essere eseguito in combinazione con la mappatura ottica, o optocardiografia34, per caratterizzare completamente la fisiologia cardiaca nei cuori isolati. Nel protocollo descritto, l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione spatiotemporale è stato eseguito con una combinazione di coloranti di tensione (RH237) e calcio (Rhod-2AM) in una configurazione a doppia emissione. Inoltre, i parametri di elettrofisiologia cardiaca sono stati monitorati sia sotto il ritmo del sinusale che in risposta alla stimolazione elettrica programmata.\nTutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con il National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Ottava edizione). Tutti i metodi e protocolli utilizzati in questi studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Protocol Committee presso il Children's National Hospital seguendo le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicate da NIH. Tutti gli animali utilizzati in questo studio hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.\nPreparare 6 L della soluzione Krebs-Henseleit modificata16 (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 glucosio, 2.0 pyruvate di sodio, 2% albumina, 2.0 CaCl2). Aggiungere CaCl2 il giorno dell'esperimento, poiché nel corso del tempo, in presenza di fosfati, il cloruro di calcio precipiterà terminalemente fuori dalla soluzione come fosfato di calcio.\nRegolare il pH a 7,4 dopo il filtraggio sterile (dimensione del poro: 0,22 m). Controllare l'osmolalità della soluzione per garantire un'autonomia di 275 mOsm/kg. Raffreddare 1 L sul ghiaccio per l'uso immediatamente dopo l'esordio cardiaco. Riscaldare 3 L in un bagno d'acqua a circa 37 gradi centigradi prima di spumeggiare con carbogeno (95% O2, 5% CO2).\nNOT: Il riscaldamento riduce al minimo le bolle e l'embolia potenziale, poiché il liquido freddo ha una maggiore capacità di gas di sciogliersi; pertanto, man mano che i supporti Krebs-Henseleit modificati passano attraverso il sistema di perfusione e si riscaldano, il gas verrà rilasciato come bolle.\nPreparare 2 L di cardioplegia (modificata della soluzione di cardioplegia di Nido, Tabella 1). Congelare abbastanza cardioplegia in un vassoio di cubetti di ghiaccio per riempire un becher da 500 mL.\nAccendere i bagni d'acqua circolanti impostati a 42 gradi centigradi. Accendere le pompe per far circolare il perfse in un circuito di riscaldamento idronico chiuso (per un elenco completo dei materiali, vedere Tabella dei materiali e Figura 1).\nNOT: Un bagno d'acqua circolante riscaldato viene utilizzato per riscaldare i tubi con giacca d'acqua e gli scambiatori di calore.\nPulire i circuiti e le camere di tubazione eseguendo 2 L di una soluzione di detersivo universale in acqua attraverso il sistema. Sciacquare tutti i circuiti e le camere del sistema Langendorff con >4 L di acqua purificata. Eseguire le pompe fino a quando tutta l'acqua è stata rimossa dal sistema.\nAggiungere un filtro a membrana sintetica in linea con le pompe perfusione (filtro polipropilene, dimensione dei pori >5 m). Gas un ossigenatore a microfibra (emofiltro) con 95% O2 e 5% CO2 a 80 kPa.\nNOT: Quando si utilizza albumin, c'è spesso schiuma associata all'ossigenazione e/o all'attività di pompaggio attraverso il circuito dei tubi. Un composto anti-foam (emulsione antifoam Y30) può essere aggiunto periodicamente gocciolante (ogni 30 min) per placare come si verifica.\nControllare una calibrazione a due punti (0 e 60 mmHg) per il sensore di pressione situato sopra l'aorta o nella trappola a bolle; calibrare in base alle esigenze.\nImmediatamente prima dell'escissione cardiaca, versare i media nel sistema di perfusione loop Langendorff. Assicurarsi che perfusate passi attraverso ossigenatori in microfibra (emofiltri) gasati con perfusate ossigenati, che poi scorre attraverso scambiatori di calore per mantenere una temperatura mediaperusate di 37 gradi centigradi all'aorta.\nImpostare il bagno d'acqua circolante a pochi gradi superiore a 37 gradi centigradi, ad esempio 42 gradi centigradi, per tenere conto della perdita di calore durante lo scambio e in tutto il sistema. Monitorare la temperatura del perfusate circolante con termocoppie.\n2. Escissione cardiaca e Langendorff-perfusione\nSedare il maiale con un'iniezione intramuscolare (I.M.) di ketamina (20 mg/kg) e xylazina (2 mg/kg) e intubata con un tubo endotracheale. Per l'induzione, somministrare un'iniezione endovenosa (I.V.) di fentanil (50 g/kg) e rocuronio (1 mg/kg). Mantenere l'anestesia con Isoflurane inalato (0,5-3%), fentanil (10-25 g/kg) e pancuronio (1 mg/kg).\nNOT: Per questo studio di prova di principio, sono stati utilizzati giovani maiali dello Yorkshire (14-42 giorni, n - 18) che variavano da 2,5,10,5 kg di peso corporeo e 18-137 g di pesocardiaco( Figura 2 ). Se è necessaria un'iniezione aggiuntiva per l'induzione, la chetamina (10 mg/kg) può essere iniettata I.M.\nUna volta che l'animale è completamente anestesizzato e non reattivo, eseguire una sternotomia per esporre l'aorta ascendente e atrio destro.\nUtilizzando un bisturi, fare un'incisione mediana dalla parte superiore dello sterno presso l'inserizione toracica, fino al processo xifoide. Con un cauterio (o forbici), sezionare il grasso sottostante e il muscolo fino a quando lo sterno è visibile.\nDal processo xifoide, tagliare lo sterno media attraverso il manubrio con forbici ossee chirurgiche o una sega ossea. Inserire retrattini nell'incisione per esporre il cuore.\nFornire una dose di bolus di eparina (300 U/kg) all'atria destra, utilizzando un ago e una siringa da 18 G, per ridurre al minimo i coaguli di macchie sull'escissione dell'organo. Posizionare le pastiglie assorbenti nella cavità toracica e il ghiaccio intorno al cuore.\nCon le forbici, tagliare con cura attraverso il pericardio, isolare l'aorta per dissezione smussata dal tessuto connettivo circostante e bloccare l'aorta appena sotto il primo ramo arterioso sull'arco aortico. Utilizzando una siringa da 50 mL con un ago da 18 G, iniettare cardioplegia ghiacciata (20 mL/kg) attraverso la parte superiore dell'aorta ascendente.\nTagliare i vasi che conducono al cuore e rimuovere il cuore con l'aorta ascendente intatta e immergere il cuore eccitato nella cardioplegia ghiacciata.\nAfferra le pareti dell'aorta con un paio di emostati e infilala su una cannula a coste attaccata a tubi che portano a 1 L di supporti di cardioplegia ghiacciata sospesi sopra il cuore (95 cm per fornire 70 mm Hg). Consentire al fluido di entrare e riempire l'aorta fino a quando non trabocca per evitare che qualsiasi bolla entri nella vascolatura.\nNOT: L'uso di un disaccoppiatore meccanico (2,3-butanedione monoxime [BDM] o blebbistatin) diminuirà il tasso di perfusione coronarica come la domanda di ossigeno del tessuto diminuisce.\nFissare l'aorta alla cannula utilizzando nastro ombelicale e ancorarla ulteriormente legando gli emostati a sopportare il peso del cuore, che ora è appeso alla cannula (Figura 1C). Lasciare che i supporti freddi perfondono il cuore a una pressione costante di 70 mmHg a causa della gravità. Mantenere il cuore immerso nella cardioplegia fredda fino a quando non è pronto per essere trasferito al sistema riscaldato Langendorff-perfusione (<10 min).\nNOT: L'aorta sui cuori più piccoli (<50 g, fino a 2 settimana di maiale) sosterrà il peso del cuore, ma i cuori più grandi sono a rischio di scivolare dalla cannula. Durante la canonale iniziale e durante il passaggio al sistema riscaldato, impedire all'aria di entrare nell'aorta, che può causare emboli coronarici. Utilizzare grandi tubi di foro (>3/8" diametro interno) che consente alle bolle di salire più velocemente della soluzione che entra nell'aorta.\nTrasferire il cuore al sistema Langendorff (37 gradi centigradi) senza introdurre aria nella cannula. Lasciare che il ritmo del sinustorio per lavare la vascolatura di qualsiasi sangue rimanente e cardioplegia.\nNOT: Nello studio descritto è stata osservata una portata iniziale media di 184 x 17 mL/min nei cuori di maialino giovanile isolati. La portata è scesa a 70 x 7,5 mL/min (media e SEM) dopo la perfazione con supporti riscaldati contenenti un disaccoppiatore meccanico (20 mM BDM). Non immergere il tessuto cardiaco, in quanto può incidere sull'imaging cardiaco. La temperatura dei tessuti è mantenuta dal flusso coronarica nel cuore del maiale a causa del suo volume maggiore e della superficie più piccola, rispetto ai roditori. A pieno regime, le temperature dell'epicardio e dell'endocardio variavano rispettivamente dai 35 ai 37 gradi centigradi.\nATTENZIONE: Indossare adeguati dispositivi di protezione personale, compreso l'usura degli occhi quando si lavora con disaccoppiatori meccanici. Il cuore può espellere i media rapidamente e inaspettatamente.\nDefibrillare il cuore in caso di aritmie scioccanti (tachicardia ventricolare, fibrillazione ventricolare) posizionando pale esterne all'apice e alla base del cuore e consegnando un singolo shock a 5 J, aumentando in incrementi di 5 J (o come selezionabili dal defibrillatore) fino a 50 J, cardioversione, o ritmo non scioccante. Ripetere gli ammortizzatori a 50 J se necessario.\nNOT: Nello studio presentato, l'89% dei preparati ha richiesto la defibrillazione. Dopo l'equilibratura (10 min), è stata osservata una frequenza cardiaca media di 70 x 4,5 bpm (media - SEM) per i cuori giovani delle suine (Figura 2).\nSciacquare il cuore con almeno 1 L di supporti Krebs-Henseleit modificati, senza ricircolare, per rimuovere sangue residuo e cardioplegia. Una volta che il supporto scorre chiaro attraverso il cuore, chiudere il ciclo circolante per ricircolare perfusate.\n3. Studio di elettrofisiologia\nPer registrare un elettrocardiogramma piombo standard II (ECG) durante tutto il corso dello studio, collegare un elettrodo di 29 G di ago all'epicardiodio ventricolare vicino all'apice, con un altro elettrodo nell'atrio destro. Collegare gli ingressi positivi e negativi di un bioamplificatore differenziale rispettivamente all'apice e all'atrio destro.\nFissare un elettrodo di stimolo bipolare sull'atria destro e un secondo elettrodo di stimolo bipolare al ventricolo sinistro laterale a scopo di stimolazione.\nPasso il cuore usando uno stimolatore di elettrofisiologia, con la corrente iniziale impostata su due volte la soglia diastolica (1-2 mA) e una larghezza di impulso di 1 ms35,36.\nNOT: Se la stimolazione non riesce a suscitare una risposta, la larghezza dell'impulso può essere aumentata fino a 2 ms. È necessaria più corrente (10x) con grandi elettrodi coassiali (stimolazione bipolare).\nIdentificare la soglia di stimolazione applicando una serie di impulsi di stimolo (larghezza dell'impulso di 1 mA, 1 ms) a lunghezze di ciclo di stimolazione definite (PCL) per garantire una risposta di stimolo coerente.\nNOT: Una volta stabilito il tasso intrinseco, il treno d'impulso iniziale può iniziare a una libreria di classiPortacomi leggermente più corta.\nEseguire il ritmo extrastimolato utilizzando un treno di stimolazione S1, S1 o S1, in quest'ultimo un treno di 6-8 impulsi (S1) è stato seguito da un singolo impulso (S2). Diminuire la libreria PCL S2 di 10 ms (ad esempio, 200 ms, 190 ms, 180 ms e così via) fino a quando non riesce a catturare. Passare alla penultima libreria di classi Portaimodale (cioè 190 ms) e diminuire in intervalli di 1 ms per trovare la libreria PCL più precisa prima della perdita di cattura (ad esempio, 184 ms).\nNOTA: Gli stessi parametri di stimolazione vengono utilizzati sia per S1 che per S2( Vedere la figura 3 per esempi rappresentativi o i valori pubblicati in precedenza sulle misurazioni dell'elettrofisiologia del cuore di porcina37.\nPer stabilire il periodo refrattario efficace ventricolare (VERP), utilizzare l'elettrodo di stimolo sul ventricolo sinistro laterale per identificare l'intervallo S1-S2 più breve in cui l'S2 (battito prematuro) avvia la depolarizzazione ventricolare.\nNOT: Il periodo refrattario è l'intervallo di accoppiamento s1-S2 più breve.\nPer definire la lunghezza del ciclo di Wenckebach (WBCL), utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per trovare l'intervallo S1-S1 più breve in cui 1:1 conduzione atrioventarelare propaga attraverso il percorso di conduzione normale.\nNOT: In caso contrario, il blocco cardiaco di 2o.\nPer definire il tempo di recupero del nodo del seno (SNRT), utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per applicare un treno di stimolazione (S1-S1) e misurare il ritardo tra l'ultimo impulso nel treno di stimolazione e il recupero dell'attività spontanea mediata dal nodo sinoatriale.\nPer stabilire un periodo refrattario efficace del nodo atrioventricolare (AVNERP), utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per trovare l'intervallo di accoppiamento S1-S2 più breve in cui la stimolazione atriale prematura è seguita da un suo potenziale fascio che suscita un QRS complesso, che significa depolarizzazione ventricolare.\n4. Mappatura ottica della tensione transmembrana e del calcio intracellulare\nNOT: Un disaccoppiatore meccanico deve essere utilizzato per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante la mappatura ottica ed evitare l'ipossia3,38,39,40. (-/-) La blebbistatina (5 M di concentrazione circolante) può essere aggiunta lentamente come dose di bolus di 0,5 mM in 5 mL di perfusate (100x di concentrazione finale)41. In alternativa, il BDM può essere inizialmente incluso nel supporto perfusate ad una concentrazione circolante di 20 mM.\nPreparare il tintura di tensione sciogliendo 5 mg di RH237 in 4 mL di anhydrous DMSO. Diluire l'aliquota di tintura con un massimo di 5 mL di supporti e vortice. Aggiungere lentamente RH237 (62,1 g per 500 mL di perfusate) proximal alla cannula aortica.\nNOT: Il tessuto miocardico può essere ri-macchiato con RH237, se necessario, per tutta la durata dell'esperimento.\nPreparare il colorante di calcio sciogliendo 1 mg di Rhod2-AM in 1 mL di Anhydrous DMSO. Mescolare il colorante con 50 o L di acido pluronico, mettere in un bagno di sonicazione 37 gradi per un massimo di 10 min, quindi diluire con un massimo di 5 mL di supporti. Aggiungere lentamente il colorante di calcio (50 g per 500 mL di perfusate) proximal alla cannula aortica.\nNOT: Per garantire una colorazione uniforme, i coloranti devono essere aggiunti lentamente (>30 s). Rhod-2AM impiega fino a 10 min per raggiungere la massima fluorescenza, mentre RH237 macchia il cuore all'interno di un 1/2 min. Utilizzando il carico di colorante descritto, è possibile prevedere intervalli di rapporto segnale/rumore (SNR) di 42,86 e 35 dollari per tensione e calcio, rispettivamente. I valori SNR possono essere calcolati come SNR (Conteggi picco-picco)/(Deviazione standard durante l'intervallo didiastolico)42.\nPosizionare l'hardware di imaging (fotocamera, barra di divisione immagini, obiettivo) come illustrato nella Figura 1,per mettere a fuoco un campo visivo appropriato.\nNOT: La barra di divisione è configurata con un mirror dichroico (660 nm) che supera RH237 e riflette gli spettri di emissione Rhod2. I filtri di emissione ad alta trasmissione vengono utilizzati per il RH237 (710 nm long pass) e Rhod2 (585 nm) luce emessa (pass lungo ET710, vedere Tabella dei materiali). Un'ampia lente da 50 mm/F0.95l è attaccata alla parte anteriore dello splitter dell'immagine. Questa configurazione si traduce in un'adeguata separazione della luce di emissione, come precedentemente convalidato43,44.\nCollegare la fotocamera a una stazione di lavoro e acquisire immagini utilizzando un software selezionato, con un tempo di esposizione di 0,5 ms. Eseguire l'allineamento delle immagini con l'aiuto di software in grado di dividere le regioni desiderate, sovrapporre e visualizzare una sottrazione in scala di grigi o pseudo-colore oltre a evidenziare il disallineamento (vedere Opzione Tabella dei materiali per il software).\nSpegnere la luce della stanza per ridurre al minimo l'interferenza della fluorescenza dall'illuminazione ambientale. Testare le luci LED (525 nm, 1,4 mW/mm2) prima dell'inizio dell'imaging per garantire un'illuminazione epicardiale uniforme e massima, come determinato dalla profondità del pozzo del sensore.\nNOT: Ogni luce è diretta attraverso un filtro di eccitazione (535 x 25 nm). Le luci LED possono essere attivate manualmente prima delle riprese per massimizzare la linearità del segnale. La fluorescenza emessa dall'epicardio viene passata attraverso lo splitter di immagini e i filtri di emissione. Le immagini divise vengono proiettate su un sensore ad alta velocità. Il campo visivo di è di circa 12 cm x 10 cm, ovvero 5,9 cm x 4,7 cm per ogni immagine divisa, a seconda della scelta dell'obiettivo e della distanza dal cuore.\nPer gli studi di mappatura ottica, immagine del miocardio durante il ritmo del sinusale, fibrillazione ventricolare (Figura 4) o ritmo dinamico (S1, 1 mA, 1 ms di larghezza dell'impulso) tramite un elettrodo di stimolazione posizionato sul ventricolo sinistro (Figura 5). Iniziare con una lunghezza del ciclo di stimolazione di 350 ms e diminuire di 10-50 ms per generare curve di restituzione (Figura 5E)35,36.\nTogliere il cuore dal sistema e drenare tutti i perfusate. Risciacquare i tubi del sistema e le camere con acqua purificata.\nPer la manutenzione ordinaria, sciacquare periodicamente il sistema con una soluzione detergente o una soluzione diperossido di idrogeno diluito, se necessario.\nConfermare la qualità del segnale ottico durante tutto lo studio aprendo un file video, selezionando una regione di interesse e tracciando la media fluorescenza nel tempo utilizzando un pacchetto software appropriato o un algoritmo personalizzato.\nAnalizzare i dati di imaging come descritto in precedenza23,33,43,45,46, per quantificare il potenziale d'azione e i parametri temporali transitori di calcio, compreso il tempo di attivazione, tempo di accoppiamento tensione-calcio (differenza tra i tempi di attivazione di Vm e Ca) e misurazioni della durata di ripolarizzazione.\nApplicare la soglia per isolare i pixel epicardici fluorescenti ed eliminare i dati di sfondo rumorosi.\nNOT: La soglia semplifica e velocizza l'analisi su video di grandi dimensioni.\nFiltrare spazialmente i segnali ottici su una superficie epicardiale con dimensioni del kernel che vanno da 3 mm x 3 mm a 5 mm x 5 mm, come illustrato nella Figura 4 e Figura 5.\nNOT: Quest'ultimo migliorerà la SNR senza distorcere le caratteristiche potenziali di azione, la morfologia transitoria del calcio o il contorno complessivo dei fronti d'onda19,47. Questo potrebbe non essere necessario se si utilizza un sensore con pixel di grandi dimensioni o se binning durante l'acquisizione.\nFiltra temporalmente i segnali con un filtro digitale a passo basso (ad esempio, Butterworth di quinto ordine) con una frequenza di taglio compresa tra 100 e 75 Hz per eliminare il contenuto di segnale insignificante45.\nNOT: Vedere la figura 5C per un esempio di tracce elaborate rappresentative.\nApplicare la rimozione e la sottrazione della deriva, tramite raccordo polinomiale di ordine Nth, per ridurre al minimo gli effetti del fotosbiancamento, del movimento o di altre fonti significative di variazione.\nDopo l'elaborazione e la normalizzazione dei dati ottici in un intero video, calcolare il potenziale dell'azione e i parametri transitori di calcio di interesse. Determinare il tempo di attivazione, definito come il tempo della derivata massima durante la depolarizzazione e la fluorescenza di picco per calcolare i tempi e i periodi di ripolarizzazione (durata potenziale dell'azione [APD] e [Ca2]idurata [CaD], vedere Figura 5).\nDopo aver calcolato i parametri temporali, generare mappe isocroniche per rappresentare gli aspetti di una singola azione potenziale o calcio transitorio attraverso l'intera superficie epicardiale immagine utilizzando algoritmi personalizzati23,33, 43,45,46.\nNOT: Vedere Figura 5D per un esempio.\nFigura 1A mostra un diagramma del sistema di perfusione cardiaca isolato, che comprende il circuito tubo, pompa, filtro, ossigenatore, serbatoi ed elementi di riscaldamento. Il posizionamento degli elettrodi ECG (configurazione lead II) e della stimolazione è illustrato nella Figura 1Be la configurazione dell'immagine è illustrata nella Figura 1C. Uno schema dei componenti ottici e dei percorsi luminosi è illustrato nella Figura 1D.\nSono stati condotti studi sperimentali su cuori interi intatti e isolati dai giovani maiali dello Yorkshire (14-42 giorni, n - 18) che variavano in dimensioni da 2,5,10 kg di peso corporeo e 18-137 g di peso cardiaco (Figura 2A). Dopo aver trasferito il cuore isolato in un sistema Langendorff (37 gradi centigradi), la frequenza cardiaca si è stabilizzata a 70 s 4,5 bpm (media : SEM) entro 10 min di defibrillazione e rimase costante per tutta la durata dello studio (Figura 2B). È stata misurata una portata media di 184 mL/min (media e SEM), che è rallentata a 70 , 7 mL/min, dopo la perfusing con supporti riscaldati contenenti un disaccoppiatore meccanico (Figura 2C).\nGli ECG di piombo II sono stati registrati per tutta la durata dello studio durante il ritmo del sinusale(Figura 3A) o in risposta al ritmo esterno (Figura 3B-E) per quantificare i parametri elettrofisiologici. Per la valutazione dell'EP, all'atrio destro è stato applicato il ritmo dinamico (S1-S1) per individuare il WBCL e la SNRT (tempo di recupero dopo l'inizio di S1-S1, Figura 3C),in cui la WBCL è stata indicata come la PCL più breve che ha avviato la conduzione atriale alla conduzione ventricolare. Un protocollo di stimolazione S1-S2 è stato implementato utilizzando un elettrodo di stimolo bipolare sul ventricolo sinistro al fine di identificare l'intervallo di accoppiamento più breve che ha iniziato la depolarizzazione ventricolare, individuando così VERP (Figura 3D). In alternativa, viene applicato un protocollo di ritmo atriale S1-S2 per individuare AVNERP (S1-S2), come illustrato nella Figura 3E. Esempi rappresentativi di parametri di elettrofisiologia del cuore di maiale si allineano strettamente con quelli precedentemente pubblicati37.\nGli esperimenti di mappatura ottica sono stati eseguiti durante il ritmo del sinusoio, la fibrillazione ventricolare spontanea (Figura 4),o durante il ritmo dinamico (S1-S1) del ventricolo sinistro (LV) per generare curve di restituzione elettriche e calcio Figura 5. Immagini rappresentative di un cuore di maialino carico di tintura sono mostrate nella Figura 4 con i corrispondenti potenziali di azione ottica (Vm) e calcio (Ca) transitori raccolti da due regioni di interesse sulla superficie epicardiale (ventricolo destro [RV] - blu, LV - rosso) . I segnali non elaborati vengono visualizzati durante il ritmo del senzio e durante la fibrillazione ventricolare. Come accennato in precedenza, durante gli esperimenti di mappatura ottica è stato utilizzato anche il ritmo epicardiale dinamico (S1-S1) per normalizzare qualsiasi leggera differenza nellafrequenza cardiacaintrinseca ( Figura 5A-E). Vengono visualizzati i segnali grezzi (RV - blu, LV - rosso), che sono stati utilizzati per rappresentare il potenziale di azione - tempo di accoppiamento transitorio di calcio (Figura 5C), attivazione e durata (Figura 5D), restituzione elettrica e restituzione del calcio (Figura 5E). Per le preparazioni miocardiche spesse, il filtraggio spaziale con dimensione del kernel 3 mm x 3 mm è appropriato per il potenziale di azione epicardiale o l'analisi transitoria del calcio19,47. Di conseguenza, le immagini ad alta risoluzione spaziale (nell'impostazione descritta 1240 x 1024 totale, o 620 x 512 per canale, dimensione dei pixel di 6,5 m) sono spesso collocate spazialmente durante o dopo l'acquisizione (Figura 5C). L'elaborazione delle immagini può essere eseguita per generare mappe di attivazione e ripolarizzazione utilizzando algoritmi personalizzati23,33,43,45 ( Figura3D), con il tempo di attivazione di ogni pixel sul cuore è stato definito come il derivato massimo del potenziale di azione o upstroke transitorio di calcio.\nFigura 1: Configurazione sperimentale. (A) Diagramma del sistema di perfusione cardiaca isolato; frecce indicano la direzione del flusso. (B) Un cuore cannulato è mostrato con posizionamento elettrodo. RA - atria destra, RV - ventricolo destro, LV - ventricolo sinistro, elettrocardiogramma di piombo II. (C) La piattaforma di imaging in prossimità del tessuto cardiaco. (D) L'emissione di ogni sonda complementare (tensione, calcio) è separata dalla lunghezza d'onda utilizzando un dispositivo di scissione dell'immagine con filtri di emissione appropriati e specchio dicroico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 2: Misurazioni del peso cardiaco, della frequenza e del flusso. (A) Rapporto peso cardiaco/peso corporeo per ogni suinio utilizzato nello studio (n - 18). (B) La frequenza cardiaca misurava 10 min dopo la defibrillazione e di nuovo alla fine dello studio (circa 1 h). (C) Il flusso coronario scende precipitosamente dopo la perfusione con un disaccoppiatore meccanico (BDM) a causa della ridotta domanda di ossigeno. Le barre della scala rappresentano la media : SEM.\nFigura 3: Esempi rappresentativi delle registrazioni di elettrocardiogramma di piombo II raccolte durante il ritmo del sinusale o in risposta al ritmo esterno. (A) Ritmo del peccato normale. (B) Esempio di ritmo epicardiale alla durata del ciclo di 400 ms ( S1-S1), che è stato utilizzato per esperimenti di imaging. (C) Top: Atrial pacing per identificare WBCL; l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 250 ms in cuiin atriale a conduzione ventricolare è osservato. Si noti che il ritmo atriale può essere utilizzato per determinare SNRT (tempo di scarico del nodo del sino, dopo l'inizio del ritmo esterno). In basso: Come la lunghezza del ciclo S1 è diminuita a 205 ms, la conduzione al ventricolo fallisce. (D) Superiore: Stimolazione Epicardiale (S1-S2) per identificare VERP; l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 450 ms, S2 - 300 ms. Bottom: Poiché la lunghezza del ciclo S2 viene ridotta a 250 ms, il tessuto ventricolare non riesce a catturare. (E) Atrial pacing (S1-S2) per identificare AVNERP. In alto: l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 450 ms, S2 - 200 ms. In basso: Quando la lunghezza del ciclo S2 viene ridotta a 199 ms, la conduzione al ventricolo ha esito negativo. Le frecce blu indicano picchi di stimolazione, le frecce rosse indicano la cattura ('C') o nessuna cattura ('NC'). S1-S1 - ritmo dinamico, S1-S2 - stimolazione extrastimolante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 4: Dati ottici durante il ritmo del senno e la fibrillazione ventricolare. Sinistra: immagini rappresentative di un cuore di maiale carico di tintura (Vm - tensione, RH237; Ca - calcio, Rhod2), vista anteriore. Tensione transmembrana filtrata spazialmente e segnali fluorescenti intracellulari del calcio da un cuore di maiale durante il ritmo del senno (centro). Segnali di tensione e calcio durante la fibrillazione ventricolare (destra). Dimensioni della regione del segnale (15 x 15 x 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 x 4,8 x 4,8 mm2 dimensioni del kernel) rappresentate come quadrati rossi e blu. Unità : F/F. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 5: Dati ottici provenienti da cuori di maiale langendorff-perfusi. La tensione transmembrana non lavorata, filtrata spazialmente (A) e (B) la fluorescenza intracellulare del calcio da destra e sinistra durante il ritmo elettrico all'apice. I segnali non filtrati e mediati nello spazio raffigurano i potenziali di azione ottica e i transitori di calcio provenienti da regioni di interesse (le unità di segnale sono f/F. (C) Una sovrapposizione di transitori normalizzati illustra il tempo di accoppiamento transitorio potenziale calcio (basso passaggio filtrato a 75 Hz). (D) Elaborazione dei segnali attraverso la superficie epicardiale per generare mappe isocroniche di parametri temporali, inclusi il tempo di attivazione (tact) e l'80% del tempo di ripolarizzazione. (E) Curve di restituzione transitorie elettriche e di calcio generate a più frequenze (a sinistra) con analisi statistica (a destra) per illustrare tempi di ripolarizzazione più lunghi a cicli di stimolazione più lenti. Barre di scala - media - SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nChimica Formula Peso molecolare g/L\nCloruro di sodio Nacl 58.44 5.26\nGluconato di sodio C6H11NaO7 218.14 5.02\nTriidrato di acetato di sodio C2H3NaO2s3H 2O 136.08 3.68\nCloruro di potassio Kcl 74.55 0.63\nCloruro di magnesio (anidroso) MgCl2 95.21 0.1405\n8,4% bicarbonato di sodio NaHCO3 84.01 13\nMannitolo C6H14O6 182.17 16.3\nSolfato di magnesio MGSO4 120.37 4\nOsmolarità (mOsmol/L) 294\nTabella 1: Ricetta di cardioplegia di del Nido modificata.\nAnche se i modelli di ricerca cardiovascolare vanno dai preparati cellulari ai preparati in vivo, c'è un compromesso intrinseco tra rilevanza clinica e utilità sperimentale. In questo spettro, il cuore isolato Langendorff-perfuso rimane un compromesso utile per studiare la fisiologia cardiaca48. L'intero modello cardiaco rappresenta un livello più elevato di integrazione funzionale e strutturale rispetto ai monostrati a cella singola o a tessuto, ma evita anche le complessità confuse associate ai modelli in vivo. Un grande vantaggio durante la doppia mappatura ottica è che la superficie epicardiale del cuore isolato può essere osservata, e l'imaging a fluorescenza del potenziale transmembrana e della manipolazione del calcio può essere utilizzato per monitorare la fisiologia cardiaca34.\nI modelli di roditori sono più comunemente utilizzati per preparazioni cardiache isolate rispetto agli animali più grandi, in parte a causa del costo associato di up-sizing di tutti gli elementi coinvolti (ad esempio, volume della soluzione, circuito di perfusione, quantità di coloranti e disaccoppiatori meccanici) insieme a una maggiore instabilità e propensione per le aritmie in animali più grandi10,36,49. Un vantaggio dell'uso dei cuori di maiale è che assomigliano strettamente al cuore umano nella struttura, nelle dimensioni e nella velocità di contrazione, modellando quindi in modo più accurato parametri emodinamici come il flusso sanguigno coronavo e l'uscita cardiaca. Allo stesso modo, gli esseri umani e i maiali hanno una gestione simile del calcio, intervalli di elettrocardiogramma37e una morfologia potenziale di azione compresi i canali sottostanti che rappresenta12,50,51, 52. Questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la creazione di un modello animale di grandi dimensioni riproducibile per caratterizzare in modo completo la funzione miocardio. L'imaging simultaneo della tensione transmembrana (RH237) e del calcio intracellulare (Rhod2), utilizzato in combinazione con protocolli elettrofisiologici stabiliti, offre l'opportunità di individuare i meccanismi responsabili di Funzione. La metodologia descritta può essere utilizzata per test di sicurezza preclinici, screening tossicologico e lo studio di patologie genetiche o di altro tipo. Inoltre, la metodologia descritta può essere modificata e adattata per l'uso con altri modelli cardiaci (ad esempio, canino, umano) a seconda dello specifico focus di ricerca53,54,55.\nCi sono alcune modifiche critiche da tenere a mente quando si passa da un modello di roditore più piccolo a un modello di maiale più grande per preparazioni isolate e intere del cuore. Durante la preparazione e la configurazione, si consiglia di aggiungere albumina al perfusate per mantenere la pressione oncotica e ridurre l'edema (più antifoam, se necessario)56,57,58,59. Inoltre, la perfusate contenente albumina può anche aiutare in studi metabolici che richiedono anche il completamento dell'acido grasso ai media60,61. A differenza dei cuori dei roditori, il cuore di maiale più grande non ha bisogno di essere immerso nei supporti caldi a causa del suo rapporto superficie-volume più piccolo e dell'aumento del volume dei supporti riscaldati che scorre attraverso i vasi coronarici che meglio mantiene la temperatura. Come notato in precedenza, abbiamo posizionato sonde di temperatura all'interno del ventricolo destro e sulla superficie epicardiale dei ventricoli destro e sinistro, osservando solo lievi fluttuazioni di temperatura di 1o2 gradi centigradi in tutte e tre le posizioni in tutto lo studio. È importante sottolineare che tali flussi più veloci possono anche aumentare la probabilità di bolle e una potenziale embolia. Per aggirare questo problema, si consiglia di utilizzare una trappola a bolle con grandi tubi di foro che conducono direttamente alla cannula aortica. Allo stesso modo, abbiamo trovato più utile avere due individui che lavorano in tandem per cannulare l'aorta su un cuore più grande (e più pesante); una persona per tenere l'aorta aperta con robusti emostati e un'altra per fissare l'aorta alla canula con nastro ombelicale. Nella metodologia descritta, abbiamo scoperto che la perfusione con cardioplegia e defibrillazione era vitale per il recupero cardiaco, il che è contrario ai preparati cardiaci dei roditori. Nella nostra esperienza, solo pochi cuori ascisi ripresero la normale attività guidata dal sino senza cardioversione.\nPer migliorare gli endpoint dell'imaging ottico, una preparazione del cuore appeso ha limitato l'effetto dell'abbagliamento che può verificarsi con un cuore sommerso. Inoltre, il cuore appeso evita anche qualsiasi compressione o compromesso dei vasi coronarici sull'aspetto posteriore del cuore che può verificarsi quando si posa il cuore orizzontalmente per l'imaging verticale. Abbiamo anche scoperto che il caricamento di coloranti fluorescenti dopo la trappola a bolle (vicino alla cannula aortica) ha notevolmente migliorato la colorazione dei tessuti e i segnali ottici. Infine, per migliorare gli endpoint di elettrofisiologia cardiaca, l'uso di un elettrodo di stimolazione coassiale più grande ha facilitato il pacing atriale di successo. Anche se descriviamo l'uso di elettrocardiogrammi per identificare la cattura e la perdita di cattura per vari parametri EP, possono essere utilizzati anche cateteri intracardiaci o elettrodi di registrazione bipolari.\nIl nostro studio si è concentrato sullo sviluppo di una metodologia per la doppia mappatura ottica e la valutazione elettrofisiologica cardiaca in un modello di cuore di porcina isolato e intatto. A causa di somiglianze con il cuore umano giovanile, il cuore porcina rimane un modello popolare per gli studi incentrati sulla cardiologia pediatrica o difetti cardiaci congeniti. È importante sottolineare che l'approccio descritto può essere adattato per l'uso con cuori adulti di dimensioni maggiori e/o diverse specie di interesse. Infatti, altri laboratori possono scoprire che l'uso di cuori canini o umani (donatore o malato) sono più applicabili per il loro specifico focus di ricerca53,54,55. Un'altra potenziale limitazione a questo studio è l'uso di un disaccoppiatore meccanico per ridurre l'artefatto di movimento durante l'imaging. Blebbistatin è diventato lo scollegatore di scelta nelle applicazioni di imaging cardiaco grazie ai suoi effetti minimi sui parametri ECG, l'attivazione e i periodi refrattari41,62,63. BDM è una scelta meno costosa, che può essere particolarmente importante negli studi sugli animali di grandi dimensioni che richiedono maggiori volumi di perfusate e uncoupler meccanico, ma è noto per avere un maggiore impatto sulle correnti di potassio e calcio che possono alterare il potenziale di azione morfologia64,65,66,67. Se si utilizza BDM, si noti che l'accorciamento APD aumenta la vulnerabilità dei cuori agli arrythmias68indotti da urti . Al contrario, la principale limitazione all'uso della blebbistatin è la sua fotosensibilità e fototossicità, anche se formulazioni alternative che hanno ridotto questi effetti69,70,71. Infine, la metodologia descritta utilizza un unico sistema di telecamere per la doppia mappatura ottica, ma è importante notare che gli studi di ricerca si sono concentrati sulla fibrillazione ventricolare e/o sul tracciamento delle onde elettriche attraverso la superficie epicardiale dovrebbe modificare questo approccio per includere l'imaging panoramico tridimensionale, come descritto dagli altri15,19,72,73,74,75 .\nGli autori riconoscono con gratitudine il Dr. Matthew Kay per una guida sperimentale utile, e Manelle Ramadan e Muhaymin Chowdhury per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (R01HL139472 a NGP, R01 HL139712 a NI), Dall'Istituto nazionale di ricerca per bambini, dall'Istituto Nazionale del Cuore dei Bambini e dall'Istituto Sheikh s'ayed per l'innovazione chirurgica.


Lo si desume dal Testo unico sulle imposte dei redditi del 1986\nSono deducibili le donazioni delle imprese al Papa\nLe aziende possono erogare fino al 2% del reddito\nRisoluzione Agenzia delle entrate 76/E del 5.3.2002\nLe aziende possono dedurre dal loro reddito erogazioni liberali in favore del Papa fino al 2 per cento del reddito di impresa. La risoluzione 76/E dell’Agenzia delle entrate spiega che anche il Santo Padre – ma anche la Segreteria di Stato del Vaticano, il Consiglio per gli affari pubblici della Chiesa e gli altri organismi della Curia romana – sono personalità di diritto canonico per l’ordinamento giuridico italiano per disposizione normativa espressa. E non, come in altri casi di istituzioni religiose, per effetto del provvedimento canonico di erezione o di approvazione dell’ente ecclesiastico, necessario per chi voglia assumere in Italia la sede legale. Dunque anche il Papa rientra – in base al Testo unico sulle imposte dei redditi - nel gruppo delle persone giuridiche, perseguendo in questo caso finalità di culto, cui un’azienda può fare erogazioni liberali fino a un massimo del 2 per cento del reddito di impresa.\nAgenzia delle entrate. Risoluzione 76/E/2002. OGGETTO:Deducibilità dal reddito delle erogazioni liberali in favore del Romano Pontefice.\nSono stati chiesti chiarimenti in ordine alla deducibilità delle erogazioni liberali effettuate dai contribuenti ai sensi dell'art. 65, comma 2, lettera a) del TUIR.\nIn particolare, si chiede se sia possibile dedurre dal reddito di impresa le erogazioni liberali in favore del Romano Pontefice\nAl riguardo si evidenzia che, ai sensi dell'art. 65, comma 2, lettera a) del Testo Unico delle imposte sui redditi, approvato con DPR 22 dicembre 1986, n. 917 (TUIR) , sono deducibili dal reddito di impresa "le erogazioni liberali fatte a favore di persone giuridiche che perseguono esclusivamente finalità tra quelle indicate nel comma 1" del medesimo articolo, tra le quali rientrano anche le "finalità di culto". La deduzione è ammessa nella misura massima del 2 per cento del reddito d'impresa dichiarato.\nIn base alla norma citata, è possibile dedurre dal reddito di impresa esclusivamente le erogazioni liberali effettuate a favore di soggetti dotati di personalità giuridica ai sensi del codice civile. Qualora il soggetto beneficiario sia di diritto straniero, occorre che i requisiti essenziali per il riconoscimento della personalità giuridica (statuto, iscrizione ad un apposito registro...) siano conformi a quelli richiesti dalla legislazione italiana.\nNell'ipotesi in cui il beneficiario sia un ente di diritto vaticano, il possesso della personalità giuridica si ritiene comprovato per effetto del solo provvedimento canonico di erezione o di approvazione dell'ente ecclesiastico, che ai sensi dell'art. 2 del regolamento di esecuzione della legge 20 maggio 1985, n. 222, approvato con DPR 13 febbraio 1987, n. 33 , recante "disposizioni sugli enti e beni ecclesiastici in Italia e per il sostentamento del clero cattolico in servizio nelle diocesi", deve essere allegato alla domanda di riconoscimento dell'ente che voglia assumere in Italia la sede legale.\nCome chiarito dalla scrivente con risoluzione 99/E del 17 giugno 1996, tale provvedimento di erezione o approvazione "vale a conferire all'ente ecclesiastico un ulteriore connotato giuridico di esclusiva valenza italiana (la qualifica di ente ecclesiastico civilmente riconosciuto) che presuppone, per vero, il possesso di personalità giuridica. (...) La personalità di diritto canonico è portatrice di effetti diretti nel nostro ordinamento, in adempimento alle norme speciali pattizie concordatarie pur dopo la revisione di cui all'Accordo 18 febbraio 1984, ratificato con legge 20 maggio 1985, n. 206, che si fondano sul recepimento nel nostro sistema dei principi giuridici di quell'ordinamento in tema di conferimento di personalità (...) Conseguentemente, si ritiene che ai siffatti enti vaticani spetti senza riserve la prospettata equiparazione alla nozione interna di persone giuridiche."\nLa personalità di diritto canonico rilevante per l'ordinamento giuridico italiano può essere acquisita, oltre che con provvedimento canonico di erezione, anche per disposizione normativa espressa.\nÈ questo il caso della Chiesa Cattolica e della Santa Sede, che ai sensi del canone 113 del Codice di diritto canonico "sono persone morali in forza della stessa disposizione divina".\nNella nozione di Santa Sede rientra anche il Romano Pontefice, in virtù del canone 361 del citato Codice, secondo cui "Col nome di Sede Apostolica o Santa Sede si intendono nel codice non solo il Romano Pontefice, ma anche, se non risulta diversamente dalla natura della questione o dal contesto, la Segreteria di Stato, il Consiglio per gli affari pubblici della Chiesa e gli altri Organismi della Curia Romana".\nSi precisa pertanto che le erogazioni liberali in favore del Romano Pontefice, al pari di tutte le erogazioni in favore di enti provvisti di personalità giuridica di diritto canonico, sono deducibili dal reddito di impresa ai sensi del citato art. 65, comma 2, lettera a) del TUIR.\n Ecco il testo del primo comma e del secondo comma lettera a del Testo unico sulle imposte dei redditi del 1986: “1. Le spese relative ad opere o servizi utilizzabili dalla generalità dei dipendenti o categorie di dipendenti volontariamente sostenute per specifiche finalità di educazione, istruzione, ricreazione, assistenza sociale e sanitaria o culto, sono deducibili per un ammontare complessivo non superiore al 5 per mille dell'ammontare delle spese per prestazioni di lavoro dipendente risultante dalla dichiarazione dei redditi.\na) a) le erogazioni liberali fatte a favore di persone giuridiche che perseguono esclusivamente finalità comprese fra quelle indicate nel comma 1 o finalità di ricerca scientifica, nonché i contributi, le donazioni e le oblazioni di cui alla lettera g) dell'articolo 10, per un ammontare complessivamente non superiore al 2 per cento del reddito d'impresa dichiarato”. (…)\n Questo è il testo dell’articolo 2 del regolamento sulle "disposizioni sugli enti e beni ecclesiastici in Italia e per il sostentamento del clero cattolico in servizio nelle diocesi" così come è stato modificato nel 1999: “1. La domanda di riconoscimento prevista dall'art. 3 della legge è diretta al Ministro dell'interno ed è presentata alla prefettura della provincia in cui l'ente ha sede. In essa devono essere indicati la denominazione, la natura e i fini dell'ente, la sede e la persona che lo rappresenta.\n3. L'atto di assenso, prescritto dagli articoli 3, 8 e 9 della legge, può essere allegato alla domanda o scritto in calce alla medesima. ( da www.italiapuntodoc.it )


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ARCS e la sua identità visiva | ARCS Culture Solidali\nARCS e la sua identità visiva\ndi Alfonso Marzano e Nino Santomartino, Idea Comunicazione\nIl progetto realizzato per ARCS è un’ulteriore conferma di come il concetto di Identità visiva rappresenti un modello alternativo a quello tradizionale della comunicazione di corporate. Una delle caratteristiche fondamentali è che il marchio assume un ruolo centrale, ma non esclusivo. È il perno del tutto, il centro gravitazionale che tiene insieme gli elementi del sistema dell’identità visiva, ma non il “buco nero” che li fagocita e li annulla.\nOgnuno di essi ha il suo ruolo strategico, ognuno agisce armonicamente con gli altri, dando vita ad un sistema aperto, fl essibile, dinamico. Mentre lo stile unitario garantisce la riconoscibilità della “voce” dell’ente, l’elasticità del sistema si sposa perfettamente con le caratteristiche e i tempi degli attuali strumenti e modi di comunicazione (internet, social media, ecc.).\nQuesta duttilità appare ancor più evidente nel momento in cui si rendano necessari interventi di restyling, o (come nel caso di ARCS) di perfezionamento del sistema di identità visiva. Il marchio, riassumendo in sé i tratti identitari dell’ente, diventa il punto fermo dal quale, tramite un procedimento “deduttivo”, discendono colori, immagini, caratteri tipografi ci.\nQuesti vanno a definire in maniera più completa l’identità dell’ente e, al contempo, lo mettono in grado di interagire adeguatamente con tutto il suo mondo, dagli stakeholder ai volontari. La nuova identità visiva di ARCS è fondata, appunto, su questi principi.\nAccanto alla stella del marchio viene posizionato un campo colorato, che la stella “incide” così come ARCS vuole agire e, appunto, incidere sul contesto in cui opera. Ai colori originari del marchio (il grigio e il magenta), sono stati aggiunti il nero e il giallo, a formare un parco cromatico dal forte impatto visivo, che evoca la molteplicità delle attività e dei temi di ARCS. I font individuati sono caratterizzati da un alto grado di eleganza, da grande leggibilità e “universalità”.\nA completamento del tutto, c’è la mappa di Peters (personalizzata con i nuovi colori ARCS), icona di una visione “altra” del mondo, sotto il profi lo geografico e non solo, e patrimonio di molte organizzazioni di cooperazione e solidarietà internazionale.\nScarica il manuale di identità visiva di ARCS


5 buoni motivi per cui sceglierci | anellodifidanzamento.it\nServizio & offerte\n50 giorni di garanzia per la restituzione\nIndicazioni per l'ordine\nConsegna gratuita Europa\nLa nostra manifattura\nL'idea della fondazione\nNormativa sulla riservatezza\n5 buoni motivi per anellodifidanzamento.it\nPerché dovrebbe sceglierci e perché ordinare l'anello di fidanzamento sul nostro sito? Le diamo 5 buoni motivi per anellodifidanzamento.it:\nOrdinare senza rischio con 50 giorni di diritto di restituzione\nConsegna veloce – possibile entro 72h\nQualità di prima categoria, design unico e materiali di ottima qualità\nAssistenza competente e gentile con i nostri esperti\nRecensioni eccellenti: i nostri clienti sono soddisfatti!\nLa nostra storia in breve: la nostra manifattura produce da più di 60 anni gioielli con diamanti nella città dell'oro Pforzheim, in Germania. Dal 2012 offriamo i nostri anelli di fidanzamento online. I modelli si trovano esclusivamente online.\n1. Ordini senza rischio: ha ben 50 giorni di diritto di rescissione\nSul nostro sito ordina senza rischio:\nInviamo l'ordine in un pacchetto discreto con un indirizzo neutrale dell'emittente, senza nessuna indicazione del nome dell'impresa venditrice di gioielli.\nL'invio standard e l'invio del reso sono sempre gratis.\nSe un anello senza incisione non va bene lo cambiamo gratuitamente.\nL'anello può essere inciso – anche più tardi – gratuitamente.\nIl costo per cambiare un anello con un'incisione è di 35 €.\nCon il nostro portale del reso cambiare l'anello è semplicissimo!\nComunque non è ancora soddisfatto? Allora restituisca gratuitamente l'anello.\nLei ha il diritto di recedere dal contratto, senza darci un motivo, entro e non oltre 50 giorni. Il termine per il recesso finisce 50 giorni dal giorno in cui Lei, o un terzo diverso dal trasportatore e stabilito da Lei, prende fisicamente possesso del bene. La condizione: l'alnello è stato portato almeno per provarlo.\nNon facciamo domande e rimborsiamo l'intero prezzo. Promesso!\nComunichiamo la data di consegna per ogni anello. Ci si può fidare di tale data. Se durante l'invio qualcosa va storto La avvisiamo tempestivamente.\n3. Qualità di prima categoria e design unico\nGarantiamo la qualità della produzione, dei metalli e dei diamanti:\nControlliamo ogni anello prima che parta dalla manifattura.\nGarantiamo una buona e costante qualità dei nostri prodotti.\nLavoriamo precisamente e nel rispetto di severe regole interne.\nProduciamo i nostri anelli a partire dai seguenti metalli:\n- oro bianco, 14 e 18 K\n- oro giallo, 14 e 18 K\n- oro rosa, 14 e 18 K\n- argento 925 (argento sterling)\n- platino 950\nI diamanti e le pietre provengono da fonti controllate. La provenienza legale é garantita.\nTutti gli anelli hanno un timbro che dà informazioni riguardanti il metallo usato, il peso e la qualità del diamante.\nAcquisire valori veri\nI metalli subiscono ovviamente delle fluttuazioni di prezzo. Tuttavia hanno conservato da secoli un controvalore stabile al momento dello scambio con merci. Forse conosce questo detto: « An ounce of gold buys a decent men's suit». O in italiano: con un'oncia d'oro si può sempre comprare un bel completo.\nSul nostro sito non compra solo un gioiello prezioso, ma dei valori che rimangono o diventano ancor più preziosi.\nLa nostra conoscenza dei diamanti crea fiducia\nI nostri esperti hanno seguito i corsi presso il rinomato Gemological Institute of America (GIA).\nControlliamo accuratamente tutti i diamanti offerti. Da 0.50 ct alleghiamo ai diamanti un certificato GIA.\n4. Assistenza competente dei nostri esperti – chat, telefono o sul posto\nCon i nostri esperti\nL'acquisto di un anello di fidanzamento è una questione di fiducia e un avvenimento molto personale. Ovviamente ha molte domande e per questo siamo sempre disponibili per qualsiasi chiarimento o desiderio.\nCi chiami al +39 035 - 6306135 (Lun - Gio: 8 - 18 h e Ven: 8 - 15 h), ci scriva in chat o una mail a info@anellodifidanzamento.it.\n5. Recensioni eccellenti: i nostri clienti sono soddisfatti!\nSiamo soddisfatti solo anche se Lei lo è! Riceviamo spesso delle recensioni eccellenti dai nostri clienti. Perché? Semplicissimo: il nostro impegno infaticabile nei confronti dei clienti ripaga. E ne siamo fieri. Inoltre la ricerca per il Suo anello perfetto ci motiva.\nAlla fine per Lei si tratta di tutto e della domanda più bella della vita!\nIl Suo team\nIl mio anello non va bene, e adesso?\nTutte le risposte nelle FAQ\nLegga le FAQ\nPiù di 1000 coppie felici li hanno già. Prenda ispirazione!\nScopra i più venduti


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Processo in formazione – Sarah Maria 76\nLa domanda del giorno : in cosa sei specializzata nell’ ambito #Artcounseling? – io, ritengo di essere in viaggio e ogni esperienza è gratificante per me. In cosa mi specializzo. Se proprio è da dire, nel sentire, nella sensibilità e nelle emozioni. I clienti che ho avuto avevano necessità e bisogno di risentirsi, di tornare in contatto con se stessi. Ecco probabilmente questa è la mia strada. Il corpo parla prima. Ripeto sono ancora in viaggio. Vedremo. Intanto mi lascio portare dalle mie #integrazioni.\nA presto per la prossima domanda del giorno. 🌸\nDopo 13 incontri sto per stilare la relazione finale del tirocinio Emozionando. Un totale di 90 ore che non dimenticherò. Tante emozioni e tanta crescita interiore. Ho capito e sentito che sono fatta per il sentire, per le emozioni e per i bambini. Anche se non sono madre. C’è molta affinità. Loro sentono che possono fidarsi e giocare con me. Non è una questione di ore, ma di processo, di esperienza. Grazie! #emozioni #artcounseling #sentire 🌸\nInsomma pillole, per un processo in formazione.\n” Quando nasci in un mondo in cui non riesci ad adattarti è perché sei nato per aiutare a crearne uno nuovo”\n– R. Azatl –\nInviato su ॐ Accademia Danzamovimentoterapia Yoga-Danza Counseling & Arteterapie ॐ, Emozioni in parole.... Contrassegnato da tag formazione, Processo, Sentire.\nPrevious: Articolo precedente: Essere sensibile – Un’esperienza come contributo nel mondo\nSuccessivo: Articolo successivo: Domanda del Giorno – Autosvelamento


Endometriosi e la fertilità, l’endometriosi … – Zestful\nEndometriosi e la fertilità, l’endometriosi …\nAlcune donne con endometriosi possono diventare incinte senza alcuna difficoltà, tuttavia vi è una associazione tra endometriosi e infertilità. Nelle forme avanzate di endometriosi in cui vi sia una significativa cicatrici e la distorsione anatomica nel rilascio del bacino e il trasporto di uova dalle ovaie attraverso le tube di Falloppio può essere compromessa. Allo stesso modo lo sperma e il trasporto degli embrioni nelle tube di Falloppio possono anche essere colpiti in queste situazioni. Nel complesso, questi fattori possono ridurre la fertilità.\nIn prime forme di endometriosi l’associazione tra endometriosi e infertilità è più controverso. Tuttavia, questa forma di endometriosi è più comune nelle donne con difficoltà di fertilità. Ci sono anche alcune evidenze che l’eliminazione chirurgica di endometriosi precoce aumenta i tassi di fertilità, il che suggerisce che anche le prime forme di endometriosi possono ridurre la fertilità.\nQuali sono le opzioni di trattamento per la fertilità nelle donne con endometriosi?\nAlcune donne possono concepire senza alcun trattamento. Quando vi è una difficoltà nel concepire vi è alcun vantaggio dell’utilizzo di trattamento ormonale per migliorare la fertilità. Il trattamento chirurgico, di solito sotto forma di chirurgia laparoscopica è noto per aumentare le possibilità di gravidanza.\nL’eliminazione di macchie endometriosiche, noduli e cicatrici e il restauro di anatomia pelvica a un intervento chirurgico tende ad aumentare i tassi di gravidanza.\nIn alcune donne con endometriosi, la chirurgia da sola non può essere sufficiente per ottenere una gravidanza e il trattamento supplementare può essere necessario. Se l’anatomia pelvica è relativamente normale e le tube di Falloppio sono aperte inseminazione artificiale (inseminazione intrauterina, IUI) può essere utile.\nQuesto è solitamente combinato con l’uso di farmaci per la fertilità per aumentare il numero di uova rilasciati durante il ciclo di trattamento per migliorare i tassi di successo. Tuttavia quando l’anatomia pelvica è gravemente danneggiato, in particolare quando le tube di Falloppio sono bloccate o quando le altre opzioni di trattamento non riescono, il trattamento bambino provetta (fecondazione in vitro) possono diventare necessario. Nelle donne in cui le tube di Falloppio sono gravemente danneggiati la possibilità di rimuovere il tubo (salpingectomia) prima del trattamento di fecondazione in vitro possono essere sollevati.\nEndometriosi e Fertilità …\nL’endometriosi è associata ad un aumentato rischio di avere difficoltà a rimanere incinta, o infertilità. Studi hanno dimostrato che la quantità di endometriosi che si vede al momento della …\nPrevious Post: Idee regalo migliori e peggiori di nozze …\nNext Post: Endometriosi e infertilità, endometriosi miglior trattamento.


Rassegna Stampa: la probabile formazione di Juventus-Genoa\nHome Rassegna Stampa Rassegna Stampa del 13 Gennaio: la probabile formazione di Juventus-Genoa\nRassegna Stampa del 13 Gennaio: la probabile formazione di Juventus-Genoa\nArriva Strootman, si allontana Sokratis e si avvicina Onguene. Portanova e Rovella contro il loro futuro, in arrivo a Genova anche Petrelli. Tuttosport: fase di stallo per Scamacca, si valuta la soluzione migliore per Pjaca. Gazzetta: stasera Ballardini in campo con la "formazione B"\n13 Gen 2021 10:11\nCORRIERE DELLO SPORT – Tanti big a riposo e diversi giovani (come Dragusin e Frabotta) in campo: Pirlo in Coppa Italia ritrova Chiellini e convocherà alcuni ragazzi dell’Under 23, di comune accordo con la Asl di Torino, ragazzi che resteranno in bolla fino a domenica prossima. Rovella è pronto a mettersi in mostra contro quella che sarà a breve la sua nuova squadra, Scamacca è diviso fra campo e mercato: i bianconeri hanno cominciato a trattare con il Sassuolo, i rossoblu sono pronti a liberarlo già a gennaio. Nel frattempo Vavro, saltato il passaggio in Liguria, aspetta ancora notizie dalla Lazio e spera di trovare una squadra entro l’1 febbraio.\nLA PROBABILE FORMAZIONE (3-5-2) Paleari; Bani, Goldaniga, Masiello; Ghiglione, Lerager, Badelj, Rovella, Czyborra, Scamacca, Destro\nGAZZETTA DELLO SPORT – Il Genoa è pronto a schierare la “formazione B” contro la Juventus: Marchetti fra i pali, in mediana spazio all’ultimo acquisto bianconero Rovella, sulle corsie laterali Ghiglione e Czyborra, la coppia titolare formata da Destro e Shomurodov partirà dalla panchina. In difesa occasione per Dumbravanu? Nel frattempo a Genova è atterrato Strootman, probabilmente già fra i convocati per la gara di campionato contro l’Atalanta. Capitolo Juve: chance per Bernardeschi, Chiellini torna titolare dopo 2 mesi e mezzo,\nLA PROBABILE FORMAZIONE (3-5-2) Marchetti; Goldaniga, Bani, Masiello; Ghiglione, Rovella, Melegoni, Radovanovic, Czyborra; Pjaca, Scamacca\nREPUBBLICA GENOVA – Monta l’entusiasmo per l’arrivo in città di Strootman (pochi tifosi ad attenderlo in aeroporto, “forse per scaramanzia” dopo l’arrivo di Schöne?), ma i brividi sono per il ciclone Juve, avversario da affrontare agli Ottavi di Coppa Italia. Potrebbe essere l’ultima partita di Scamacca con la maglia rossoblu: l’attaccante è infatti destinato a vestire proprio bianconero. L’accordo con il Sassuolo è vicinissimo e la società continua a coltivare il sogno di riportare all’ombra della Lanterna il “pistolero” Krzysztof Piatek.\nIL SECOLO XIX – Terrestri contro marziani? Il pragmatico Ballardini affronta l’esordiente Pirlo in coppa, ma la testa di entrambi è soprattutto al campionato. “Mi ha insegnato a calcio” racconta Massimo Ambrosini, al Decimonono, in merito all’allenatore del Genoa che oggi lotta per salvare ancora una volta il Grifone. “Le sue priorità ora sono altre: per chi vuole salvarsi la Coppa Italia è un’occasione per far giocare chi gioca meno, ma poi durante la partita anche provare a passare il turno”. Se nella Juve potrebbe vedersi in campo Manolo Portanova, destinato a vestire la maglia rossoblu, dall’altra parte ci saranno anche Nicolò Rovella e Gianluca Scamacca: “la punta piace ai bianconeri, lo scambio fra centrocampisti è pronto” sottolinea il Secolo. Dopo l’arrivo di Strootman, sbarcato al Cristoforo Colombo con un volo privato e dettosi pronto a dimostrare il suo valore sul campo, è lontano il ritorno di Sokratis Papastathopoulos. Al contrario, si avvicina il buon esito della trattativa per Jerome Onguene.\nLA PROBABILE FORMAZIONE (3-5-2) Marchetti; Goldaniga, Bani, Dumbravanu; Ghiglione, Lerager, Rovella, Melegoni, Czyborra; Pjaca, Scamacca\nTUTTOSPORT – Stasera Scamacca sarà titolare, mentre l’affare che potrebbe portarlo a giocare allo Stadium è entrato in una fase di stallo. E chissà che la partita di coppa non possa aiutare a far smuovere qualcosa nella trattativa. Fatta per Rovella, Portanova e Petrelli, ma occhio anche al nome di Eldor Shomurodov per l’estate: dell’attaccante uzbeko, che si sta segnalando fra i migliori prospetti del campionato italiano, si è parlato nelle scorse settimane anche se risulta “quasi impossibile” un suo addio già nel mercato di gennaio. Fra gli oggetti delle lunghe video-conferenze fra Genoa e Juventus c’è stato anche Marko Pjaca, per il quale si sta valutando se sia il caso di trovare una nuova sistemazione. Vavro e Sokratis non si sono concretizzati, ecco perché il nome nuovo è Onguene. Arriva Strootman e in caso di partenza di Scamacca potrebbero aprirsi nuovamente le porte per Piatek.\nLA PROBABILE FORMAZIONE (3-5-2) Marchetti; Bani, Radovanovic, Goldaniga; Ghiglione, Melegoni, Rovella, Lerager, Czyborra; Pjaca, Scamacca\nArticolo precedenteGenoa, Strootman: “Contento di questa opportunità. Mi batterò per i tifosi”\nArticolo successivoGenoa, striscione per caricare la squadra prima della Juventus – FOTO


Progetti esotici e denaro pubblico - La Nuova Gazzetta Molisana\nHome / Politica / Progetti esotici e denaro pubblico\nProgetti esotici e denaro pubblico\nGiuseppe Saluppo 17 marzo 2018\tPolitica 3 Commenti 94 Visualizzazioni\nRieccoli i progetti esotici, i partenariati transfrontalieri più strambi e incomprensibili che fanno strame di risorse europee per obiettivi complicati e inconcludenti, assolutamente impenetrabili e, quindi, valutabili, se e quando si concludono (finora dei tanti cui ha preso parte il Molise non si hanno tracce di ciò a cui sono serviti e di ciò che hanno prodotto) che, però, fanno tanto tendenza culturale nella parte radical chic delle commissioni europee e delle dirigenze regionali: basta pronunciarli i titoli di questi progetti per gonfiare il petto e lievitare a cospetto di qualsiasi platea. Ne diamo un esempio. Eccoli gli ultimi due cui prende parte il Molise dai titoli roboanti, quanto inconcludenti: Progetto Common Initiatives to pRomoteCinEmaacrossItaly – Albania – Montenegro, in acronimo CIRCE; e Progetto cONnectingCLOse and UnexploredDestinations with New INter-AdriatictransportsErvices, in acronimo ON CLOUD NINE, entrambi nell’ambito del Programma Interreg-IPA CBC Italia-Albania-Montenegro, un programma trilaterale di cooperazione transfrontaliera co-finanziato dall’Unione Europea attraverso lo Strumento di Assistenza Pre-Adesione (IPA)nel periodo di programmazione 2014-2020; Programma concepito nel quadro della strategia dell’Unione Europea per una crescita intelligente, inclusiva e sostenibile (Europe 2020) che mira ad assistere i paesi partecipanti nel perseguimento dei loro obiettivi nazionali per il 2020, rafforzando la cooperazione transfrontaliera nel Mediterraneo, nell’ottica di preadesione di Albania e Montenegro all’Unione Europea; Programma allineato alla più ampia Strategia UE macro-regionale per la Regione Adriatico Ionica (Eusair) che intende aiutare le regioni adriatico – ioniche italiane, albanesi e montenegrine a raggiungere la crescita puntando sui quattro pilastri tematici Eusair:” Crescita Blu”, “Connettere la Regione”, “Qualità ambientale, “Turismo sostenibile”. Se sia possibile fare un’analisi oppure una descrizione meno sommaria degli obiettivi così condensati non è mai stato dimostrato. Difatti, questi progetti, come abbiamo accennato, siccome durano anni e nel corso del tempo perdono via via interesse e capacità di realizzazione, difficilmente hanno una loro esaltazione finale. Mancia competente a colui o colei della Regione Molise (politico o dirigente) che sia in grado di offrire un progetto (esotico) transfrontaliero nella sua completezza e, soprattutto, nella sua concreta incidenza (economica, sociale, culturale). Non faranno eccezione i due progetti appena sopra indicati. Anche più degli altri, indistinti nella loro finalità, e sicuramente ispirati all’auspicio di vedere l’Albania e il Montenegro nella Ue, anche grazie a queste forme di interazione e collaborazione. Prendiamo il progetto Circe Il progetto si pone l’obiettivo di rilanciare il sistema produttivo territoriale dell’area coinvolta, investendo in industrie culturali e creative come risorse strategiche per stimolare la crescita economica dei territori. Il focus principale è quello di migliorare le condizioni per la crescita delle industrie culturali e creative del settore audiovisivo che può favorire la valorizzazione del patrimonio culturale delle aree, attuando iniziative transfrontaliere in grado di stabilire una connessione importante tra le regioni partecipanti e attori chiave nella realizzazione di nuove produzioni creative. Principali output di progetto: piattaforma di produzione transfrontaliera congiunta che consentirà agli operatori audiovisivi di lavorare insieme per co-produrre una web series; rete creativa istituita tra i festival del cinema nell’area interessata, valorizzazione delle competenze digitali delle imprese audiovisive.\nIl progetto ON CLOUD NINE a sua volta si pone come obiettivo quello di stabilire collegamenti aerei diretti nell’area del Programma che possano contribuire a generare nuove opportunità di sviluppo socio-economico ed abbattere le barriere esistenti per promuovere la circolazione delle persone, al fine di rafforzare la crescita economica e incoraggiare la cooperazione nel Bacino adriatico. L’obiettivo generale del progetto si concentra sullo sviluppo di una connettività transfrontaliera sostenibile attraverso un sistema integrato di modelli di trasporto in grado di aumentare la multimodalità e l’accessibilità agli aeroporti. Tra gli output di progetto: miglioramento di soluzioni di trasporto transfrontaliero, sostenibile e integrato; sviluppo di tre nuove rotte aeree; miglioramento dei servizi rivolti ai viaggiatori, nonché miglioramenti nelle connessioni a livello urbano e interregionale. Chiacchiere, prevalentemente chiacchiere. La parte solida, per pochi addetti ai lavori e specifici destinatari. In questo quadro, l’impegno economico della Regione Molise supera abbondantemente i 300mila euro. L’Europa è sui livelli di milioni.\nPrecedente Una terra chiamata Molise\nPross In fatto di proroghe\nIl timore che ad avvantaggiarsene sia principalmente l’ altra parte dell’Adriatico mi sembra reale senza che sia chiaro, invece cosa puo’ venirne di buono al Molise. Non sarà miça una “bandierina” o uno specchietto per le allodole?\nil molise e’ diventata, da molti anni, una regione che si conclama da sola senza far nulla di positivo.Tutte le regioni ormai sono diventate un assemblamento di spese inutili e dannose.sono da eliminare e costituire dei nuclei avanzati con regole valevoli ugualente per tutti e con scopi che portino all’Italia vantaggi sociali e culturali e tenendo conto che l’Italia e’ vecchia e,pertanto, investire sulle intelligenze giovanili sarebbe auspicabile. Quando si vedono in giro facce antidiluviane ti viene una domanda; ma questi cosa possono ancora pensare?\nla ristrutturazione industriale riparte dalla scuola di formazione di manager capaci ed autonomi, dal portare nelle scuole una ventata di modernita’, aderire a fondamentali idee per la nuova sanita’ pubblica. Insomma creare un pool di cervelli nostrani che conoscano il territorio, ecc. Ma e’ un sogno..invece assistiamo ancora a tutte le mano vre di bassa lega per le poltrone che apportano ingenti entrate e prebende senza alcuna utilita’ per il molise.\nSposo la tesi del signor Abbazia. In che senso si può e si vuole ancora difendere l’autonomia di questa regione?\nAbbiamo una nostra identità socio-culturale, è vero, e nessuno osi toccarla perché fa parte della nostra storia, ma è altrettanto vero che difendere a spada tratta la presenza di una miriade di uffici pubblici, di consulenti, di corti d’appello, di doppioni di reparti ospedalieri sta nuocendo gravemente alla salute di questa regione, ed in particolar modo a quella del capoluogo: quei pochi che vi sono rimasti hanno la puzza sotto il naso, spesso lavorano per grazia ricevuta, non hanno il benché minimo senso della solidarietà e della comunità: sono queste pustole che rendono Campobasso ed il Molise dei soggetti malati.


Bleu de Chanel lancia SportFair 2.0, il bello dello sport si tinge di blu. - Gazzetta di Napoli\nHome Sport Bleu de Chanel lancia SportFair 2.0, il bello dello sport si tinge...\nBleu de Chanel lancia SportFair 2.0, il bello dello sport si tinge di blu.\nSportFair si rinnova, taglia con il passato per proiettarsi al futuro, aggiungendo contenuti esclusivi ed originali ad un giornale sempre più aggiornato e al passo con i tempi. Notizie, approfondimenti e storie raccontate in modo ‘fair’ all’interno di una veste grafica completamente rinnovata, che permette all’utente di navigare in maniera molto più semplice e fluida all’interno del sito, trovando ogni notizia a portata di clic su https://www.sportfair.it/.\nContenuti inediti, interviste, approfondimenti e tante fotogallery: sono questi i fiori all’occhiello del giornale pronto ad oltrepassare i canoni della bellezza e dell’originalità. Più news e una maggiore attenzione alla homepage, completamente rivista in meglio rispetto al passato. Un template scelto con maniacale attenzione, per permettere all’utente di navigare con semplicità e chiarezza, sposando la sua curiosità con la fluidità del sito. Particolare cura dedicata anche alle foto, che abbelliscono ed esaltano la grafica di SportFair 2.0, che punta ad essere uno dei giornali più chic del web.\nQueste novità sono state premiate dal prestigioso marchio Chanel, che ha deciso di legare il proprio prodotto ‘Bleu de Chanel’ al lancio del nuovo SportFair. Una partnership importante che conferma l’autorevolezza di quelli che sono gli obiettivi che la redazione intende raggiungere, come sottolineato dall’Ing. Fabrizio Spinelli, editore di SportFair: “Sono orgoglioso del fatto che il restyling del nostro giornale abbia come partner commerciale il prestigioso marchio Chanel, frutto di un gran lavoro da parte nostra e soprattutto della nostra consolidata sinergia con la concessionaria SportNetwork e del loro ingente e continuo impegno a trovare sponsor di qualità eccellente. Dopo quattro anni di crescita continua e ricchi di soddisfazione, abbiamo rinnovato il nostro sito con una grafica semplice e snella, a vantaggio dei contenuti e dei relativi approfondimenti. La linea editoriale rimarrà inalterata, ma con un focus più attento verso alcuni sport che nel corso del tempo sono diventati sempre più importanti per i nostri lettori”.\nLa mission di SportFair è quella di raccontare le sfaccettature più sane, belle e originali dello sport. A confermarlo è il Direttore Peppe Caridi: “Dall’autunno del 2015 abbiamo iniziato a raccontare il bello dello sport ed oggi essere un importante punto di riferimento per gli sportivi di tutti i livelli è un orgoglio che ci onora e, al tempo stesso, ci stimola a lavorare sempre meglio, in tempi difficili per l’informazione sul web. La Redazione lavora ogni giorno a stretto contatto con gli ambienti sportivi di tutti i livelli e ne evidenzia le novità e particolarità più curiose e originali: non solo notizie, ma focus e approfondimenti sui temi più stuzzicanti di tutti gli sport. Nella nuova versione del giornale diamo ampio risalto alle ‘Storie di Sport’, cavallo di battaglia che ha costruito l’identità di SportFair, raccontando emozioni e realtà quotidiane legate al mondo dello sport. Pagine a volte commoventi e spesso sorprendenti e uniche, che stimolano e amplificano la passione che muove ogni sport. Adesso siamo proiettati al 2020 che sarà un anno speciale con gli Europei di Calcio, che si disputeranno anche in Italia, e soprattutto le Olimpiadi di Tokyo a cui riserveremo uno ‘Speciale’ molto approfondito. Siamo convinti che Sport Fair 2.0 ci consentirà di promuovere e presentare al meglio i nostri contenuti editoriali“.\nArticolo precedenteL’antica scuola calzaturiera napoletana rivive con il corso di Tecnico dell’Orlatura.\nArticolo successivoSant’Anastasia, Comune addobbato mentre arrestavano il sindaco.\nNapoli sconfitto anche dalla Fiorentina. Gattuso: siamo senza anima.


Policy - Alessandra Zengo\nNel caso non si fosse capito, la titolare e responsabile del trattamento dei dati per il sito www.alessandrazengo.com sono io, Alessandra Zengo. Piacere.\nL’indirizzo è sempre lo stesso:\nIn conformità alla vigente normativa, non sono tenuta a chiedere il consenso per l’utilizzo dei cookie tecnici e di statistica aggregata (grazie!), dato che sono strettamente necessari per l’ottimizzazione del sito e raccolgono informazioni in forma aggregata sul numero di utenti e sul loro utilizzo dello spazio web.\nCookie di terze parti | Questi sono i cookie legati alla presenza dei plugin social (maledetti social network, eh?). Per fortuna, qui non ce ne sono, quindi puoi continuare a navigare traquillo.\nCome forse già sai, ho una newsletter personale, Elementary, che gestisco attraverso la piattaforma MailChimp. I dati che inserisci all’iscrizione vengono salvati nei server di MailChimp. Al seguente indirizzo trovi la loro Policy. Io ho accesso ai dati che MailChimp raccoglie (nome, cognome, e-mail, posizione, browser, ecc.), ma non li conservo a mia volta.\nNel caso non volessi più essere iscritto alla newsletter, puoi cancellarti in qualsiasi momento cliccando la voce al termine delle mie e-mail. Se decidi di restare, invece, sappi che non venderò i tuoi dati sensibili a nessuno, nemmeno per un sacco di soldi: la tua privacy è al sicuro.


Corso di formazione politica 2012 -\nCorso di formazione politica 2012\nLa crisi economica e finanziaria, unita al processo di globalizzazione, ha reso sempre più necessaria un’attenta lettura di quei principi che stanno alla base della nostra società.\nQuesti incontri vogliono offrire ai giovani l’occasione di approfondire i temi che riguardano il nostro vivere quotidiano, il rapporto tra principi e valori, il diritto e la dignità del lavoro, il ruolo della partecipazione politica in vista del bene comune.\nPapa Benedetto XVI in molte occasioni ha esortato un impegno dei giovani affinché si rendano testimoni dei valori di solidarietà e carità cristiana e ha più volte espresso la necessità di “evangelizzare il mondo del lavoro, dell’economia, della politica” con il contributo di “una nuova generazione di cristiani laici impegnati”.\nUna nuova progettualità di tipo culturale e morale deve partire da un percorso di formazione rivolto ai giovani, affinché riscoprano la propria vocazione e i propri talenti nella prospettiva della condivisione e del dono per il bene comune.\nIl laboratorio promosso dai circoli di impegno culturale e sociale presso la Basilica del Sacro Cuore avrà lo scopo di rispondere a questa esigenza e sarà un occasione di formazione e preparazione allo studio della Dottrina Sociale in vista della Winter School – Studium Aquinatis di Aquino (FR).\nIl Corso si articola per l’intero arco dell’anno (tranne luglio e agosto) in due incontri mensili: uno di formazione – il martedì – e uno di dibattito – il mercoledì – per un totale di 20 incontri.\nTutti gli appuntamenti si svolgeranno presso la sede dell’Istituto del Sacro Cuore in via Marsala, 42 a partire dalle ore 18.\nIl Corso è preceduto nell’ultimo trimestre 2011 da un modulo di incontri preliminari sulla dottrina sociale della Chiesa cattolica.\n1) 10 gennaio 2012 – Diritti umani (formazione)\n25 gennaio – Diritti umani (dibattito)\n2) 7 febbraio 2012 – Famiglia (formazione)\n22 febbraio – Famiglia (dibattito)\n3) 6 marzo 2012 – Dignità dei lavoratori (formazione)\n21 marzo – Dignità dei lavoratori (dibattito)\n4) 10 aprile 2012 – Impresa e mercato (formazione)\n25 aprile 2012 – Impresa e mercato (dibattito)\n5) 8 maggio – Giustizia e solidarietà (formazione)\n23 maggio – Giustizia e solidarietà (dibattito)\n6) 5 giugno – Partecipazione e democrazia (formazione)\n20 giugno – Partecipazione e democrazia (dibattito)\n7) 11 settembre – Globalizzazione (formazione)\n26 settembre – Globalizzazione (dibattito)\n8 ) 16 ottobre Ecologia e ambiente (formazione)\n31 ottobre – Ecologia e ambiente (dibattito)\n9) 13 novembre – Pace e guerra (formazione)\n28 novembre – Pace e guerra (dibattito)\n10) 4 dicembre – Italia-Europa (formazione)\n19 dicembre – Italia-Europa (dibattito)\nRivista “Cuore del Mondo”


Intervista SEO: Stefano Natale - Seogarden.net\nIntervista SEO: Stefano Natale\nby francesco 28 Settembre 2015 16:08 1.9K views0\nStefano Natale, seo specialist alla SN Web Solution, da anni si occupa principalmente di posizionamento in Google in Italia ed all’estero. Grande sostenitore del sistema Joomla e gestore di una web directory. Ecco il racconto della sua esperienza.\nCiao Francesco, iniziamo dagli albori quindi? Mi sono affacciato al mondo della seo nel 2009, il perché è presto detto, avevo clienti che avevano siti web e volevano ottenere visibilità, quindi a chi chiedono prima? ovviamente a chi gli ha fatto il sito con cui hanno già un rapporto lavorativo e, spesso, anche personale. Fu così che iniziò quest’avventura, ovvero dicendo “sì, aspetta che ci penso io a rendertelo visibile”, ora mi studio come fare. Poi ovviamente quando capisci come funziona la logica ed inizi a crearti un portfolio di siti aziendali ben posizionati, è molto facile vendere il servizio ad altri.\nTutta autodidattica, cercando su blog italiani e stranieri, provando e riprovando, un test dopo l’altro ho capito il funzionamento e da lì in poi basta mantenersi aggiornati, cosa assolutamente da non sottovalutare sennò si rimane all’età della pietra. Ho partecipato poi anche a corsi online, come quello di Madri all’inizio, ad un Convegno GT, ho acquistato alcuni ebook, ed ora invece faccio anche io da relatore ad alcuni convegni di web marketing parlando di argomenti seo. Mi piace dare lezioni a convegni ma ciò che non mi piace fare è scrivere, non troverete neanche un articolo di blog fatto da me cercando di insegnare agli altri come fare un qualcosa. Mi dedico solo ai miei progetti, a quelli dei miei clienti, e lascio l’insegnamento a gente come te, che sa trasmettere molto più che semplici nozioni tecniche, si capisce lontano 1 km dai testi che scrivi che quella è pura passione per l’insegnamento.\nLo abbraccerei senza ombra di dubbio, molti sembra che ce l’abbiano con lui ma, non le web agency! ci offre lavoro nuovo ad ogni cambiamento che fa. Ti faccio un esempio, mobilegeddon, a cosa ha portato? Ha fatto sì che contattassimo tutti i nostri clienti dicendo che era da rendere il sito web responsive per non perdere il posizionamento, ovviamente lavoro da pagare, cosa credi che abbiano risposto tutti? La fatturazione del mese di aprile ben al di sopra della media la dobbiamo al Matt (di turno), tu che dici? Per noi ogni modifica è tutto lavoro in più.\nGuarda, sinceramente non ci sono seo che mi abbiano ispirato bensì progetti singoli. Analizzavo la concorrenza, analizzavo la strategia del primo in classifica, ed ogni volta imparavo cose nuove, spesso non sapevo chi fosse il seo in questione. Grazie a questa attenta attività d’analisi del lavoro di altri seo più preparati di me, riuscivo a capire come lavoravano e quindi miglioravo le mie strategie. Attingendo nozioni da diversi progetti, quindi da diversi seo, mi sono fatto una strategia tutta mia che è, in sostanza, un mix di tutte quelle altrui. Questo nella fase di apprendimento ovviamente, ora le strategie me le creo da solo sulla base di tutte le esperienze pregresse e delle novità che nascono ogni giorno.\nGuarda… io la seo la vedo proprio nel senso stretto del termine, ottimizzazione onsite (testi compresi ovviamente) e link building + segnali social, il resto per me è marketing, il miglioramento delle conversioni, si basa su strategie di marketing che non dico che non le forniamo al cliente eh, però non le includerei nel termine stretto della seo, oggigiorno si dice che la seo è evoluta in qualcosa di più grande, ma quel “qualcosa” secondo me, ha un altro nome.\nLi avranno detti in mille già, però quelli che più uso sono senza dubbio:\n– seoquake e mozbar per un’analisi veloce della concorrenza\n– majestic per l’analisi dei backlinks\n– semrush per l’estrapolazione di parecchi dati ma, soprattutto per le parole chiave semanticamente correlate che a te piacciono tanto\n– Advanced web ranking per l’analisi delle posizioni per ogni parola chiave, geolocalizzata per i luoghi necessari, per ogni sito web.\n– A volte WordAI ma, solo per progetti personali sui quali posso spammare di brutto, come direbbe il buon vecchio Matteo Auletta (seo da cui non si smette mai di imparare, soprattutto seduti davanti ad un bel bicchiere di vino).\nImpara da quelli più bravi di te, sia che siano seo, sia che si parli di progetti singoli di chissàchi, non smettere mai di avere sete di conoscenza e, soprattutto, non ti dimenticare dell’ABC, molti imparano la Z e sembra che l’ABC non abbia più importanza, mentre invece non è così, bisogna sempre segnarsi tutti i punti da effettuare per ogni progetto, così da avere statistiche ben chiare su cosa funziona, cosa no, dove possiamo migliorare ecc.\nL’intuizione deve essere la caratteristica madre di ogni buon seo secondo me, bisogna capire cosa può essere più utile per un determinato progetto. A seconda delle esigenze e del contesto, nascerà la strategia.