Les virus de la grippe A (IvIV) causent des maladies respiratoires humaines qui sont associées à des conséquences économiques et sanitaires importantes. Comme pour d'autres virus, l'étude de la LUTTE anti-I nécessite l'utilisation d'approches secondaires laborieuses pour détecter la présence du virus dans les cellules infectées et/ou dans les modèles animaux d'infection. Cette limitation a été récemment contournée avec la génération de IAV recombinants exprimant facilement traçablefluorescent ou bioluminescent (luciferase) protéines reporter. Cependant, les chercheurs ont été forcés de sélectionner des gènes de reporter fluorescents ou de luciferase en raison de la capacité restreinte du génome de l'IAV pour inclure des séquences étrangères. Pour surmonter cette limitation, nous avons généré une réplication recombinante-compétente bi-reporter IAV (BIRFLU) exprimant de façon stable à la fois un gène fluorescent et un journaliste luciferase pour suivre facilement les infections par le VI in vitro et in vivo. À cette fin, les segments viraux non structuraux (NS) et hémagglutinine (HA) de la grippe A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) ont été modifiés pour coder la Vénus fluorescente et les protéines bioluminescentes de luciférase Nanoluc, respectivement. Ici, nous décrivons l'utilisation de BIRFLU dans un modèle de souris de l'infection par le VI et la détection des deux gènes reporter à l'aide d'un système d'imagerie in vivo. Notamment, nous avons observé une bonne corrélation entre les expressions des journalistes et la réplication virale. La combinaison de techniques de pointe en biologie moléculaire, en recherche animale et en technologie d'imagerie offre aux chercheurs l'occasion unique d'utiliser cet outil pour la recherche sur la grippe, y compris l'étude des interactions virus-hôtes et la dynamique des infections virales. Fait important, la faisabilité de modifier génétiquement le génome viral pour exprimer deux gènes étrangers provenant de différents segments viraux ouvre la possibilité d'utiliser cette approche pour : (i) le développement de nouveaux vaccins anti-IAV, (ii) la génération de IAV recombinants qui peuvent être utilisés comme vecteurs vaccinaux pour le traitement d'autres infections pathogènes humaines.\nLe virus de la grippe A (IAV) est un virus d'ARN segmenté à sens négatif à un seul brin de la famille des Orthomyxoviridae 1,2,3. L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) estime 3 à 5 millions de cas de grippe annuels et plus de 250 000 décès dus à la grippe dans le monde4,5,6. Les groupes particulièrement vulnérables à la grippe sont les personnes âgées, les personnes immunodéprimées et les enfants7,8,9,10,11. Bien que les vaccins soient disponibles et représentent l'intervention la plus courante et la plus efficace contre l'infection virale, le IAV est capable d'évoluer rapidement et d'échapper à l'immunité préexistante3,12,13, 14 (en) , 15. La réapparition d'une souche pandémique H1N1 en 2009 et l'émergence d'un IAV pathogène réitèrent la menace constante pour la santé publique humaine dans le monde4,16.\nLors d'une épidémie ou d'une pandémie, il est crucial de déterminer rapidement la pathogénicité et la transmissibilité des virus nouvellement isolés. Les techniques actuellement disponibles pour détecter le virus prennent beaucoup de temps et nécessitent parfois l'utilisation d'approches laborieuses, ce qui peut retarder l'achèvement de ces analyses17,18,19,20. En outre, les tests viraux actuels sont difficiles à intensifier, ce qui pourrait être nécessaire en cas d'éclosion. Enfin, l'utilisation de modèles animaux validés d'infection, tels que les souris, les cobayes et les furets, est couramment utilisée et est essentielle à l'étude des infections grippales, des réponses immunitaires et de l'efficacité de nouveaux vaccins et/ou antiviraux. Cependant, ces modèles sont restrictifs en raison de l'incapacité d'observer la dynamique virale en temps réel; cela limite les études à l'imagerie statique des infections virales21,22,23,24,25. Les animaux utilisés dans ces essais sont également euthanasiés afin de déterminer la charge virale, augmentant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour compléter ces études26. Pour contourner toutes ces limitations, de nombreux chercheurs s'appuient sur l'utilisation de recombinants réplication-compétents, journaliste-exprimant IAVs, qui sont capables d'accélérer les essais virologiques et de détecter la charge virale et la diffusion in vivo en temps réel26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Fait important, ces AIV exprimant des journalistes sont capables de se répliquer de la même façon que les AIV de type sauvage (WT) dans la culture cellulaire et dans les modèles animaux d'infection33,42.\nLes protéines fluorescentes et bioluminescentes sont deux systèmes de reporter couramment utilisés par les chercheurs en raison de leur sensibilité, de leur stabilité et de leur facilité d'utilisation. En outre, il ya un soutien énorme et l'avancement dans les technologies de détection de protéines fluorescentes et bioluminescentes43,44,45,46,47,48 . Les protéines fluorescentes et la luciferase ont différentes propriétés qui leur permettent de briller, en particulier différentes dans la façon dont les états excités sont générés et comment l'émetteur est détecté43,44,45, 46,47,48. Les protéines fluorescentes sont d'abord excitées par l'absorption de l'énergie, qui est ensuite libérée sous forme de lumière à une longueur d'onde différente à mesure que les molécules diminuent à un état d'énergie inférieur43. D'autre part, la bioluminescence est dérivée d'une réaction chimique exothermic qui implique un substrat, l'oxygène, et parfois l'ATP afin de produire la lumière45. En raison des propriétés variables de ces deux types de protéines reporter, l'un peut-être plus avantageux que l'autre en fonction de l'étude de l'intérêt. Alors que les protéines fluorescentes sont largement utilisées pour observer la localisation cellulaire28,41, leurs signaux in vivo ont une intensité insuffisante et sont souvent obscurcis par l'autofluorescence dans les tissus vivants49. Par conséquent, les chercheurs s'appuient sur les luciferases pour évaluer la dynamique virale chez les organismes vivants, bien que les protéines fluorescentes peuvent être préférées pour les études ex vivo50,51,52,53. Contrairement aux protéines fluorescentes, les luciferases sont plus pratiques pour les études in vivo et plus applicables dans les approches non invasives26,27,28,29,30 , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34 Ans, états-unis ( , 35 Annonces , 36 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu'ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 54. En fin de compte, en fonction du type d'étude, les chercheurs doivent choisir entre l'utilisation d'une protéine fluorescente ou d'une protéine de journaliste de luciferase comme lecture, qui soumet leur étude à un compromis de fonctionnalités et de sensibilités, et sévèrement limite l'utilité des virus des journalistes recombinants. En outre, on s'inquiète de la corrélation entre l'expression de différents gènes de reporter utilisant des systèmes de fluorescence ou de luciferase et de réplication ou de diffusion virale, ce qui pourrait compromettre l'interprétation des données obtenues avec les VSI exprimant des journalistes.\nNous avons surmonté cette limitation en générant une réplication recombinante-compétente bi-reporter IAV (BIRFLU) qui code à la fois pour une protéine fluorescente et une luciférase dans le même génome viral55 (Figure 1). Ici, NanoLuc luciferase (Nluc), une petite protéine bioluminescentebrillante 48, a été insérée en amont de la séquence d'hémagglutinine (HA) dans le segment viral HA de la grippe A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. En outre, Vénus, une protéine fluorescente monomeric fréquemment utilisée, a été insérée dans le segment viral non structurel (NS)32,33,36,41,55. Puisque BIRFLU code pour les gènes de journaliste fluorescents et de luciferase, le signal de protéine de journaliste peut être employé comme readout pour déterminer la réplication et la diffusion viraleines in vitro ou in vivo55. Des informations supplémentaires concernant la génération et la caractérisation in vitro ou in vivo de BIRFLU peuvent être trouvées dans notre récente publication55. BIRFLU peut être utilisé pour tester l'efficacité des médicaments antiviraux ou neutraliser les anticorps par le biais d'un nouvel essai de microneutralisation fluorescente et bioluminescente55. En outre, BIRFLU peut également être utilisé pour évaluer la dynamique virale dans un modèle de souris de l'infection55. Dans ce manuscrit, nous décrivons les procédures pour caractériser BIRFLU55 in vitro et comment étudier l'infection DE BIRFLU chez les souris utilisant des systèmes in vivo d'imagerie de luminescence pour la détection de Nluc in vivo ou de Vénus ex vivo.\nLa combinaison de techniques de pointe en biologie moléculaire, en recherche animale et en technologie d'imagerie offre aux chercheurs l'occasion unique d'utiliser BIRFLU pour la recherche sur les IAV, y compris l'étude des interactions virus-hôtes, la dynamique de l'infection virale; l'élaboration de nouvelles approches vaccinales pour le traitement thérapeutique des infections à VIH ou l'utilisation potentielle du VI comme vecteur vaccinal pour le traitement d'autres infections pathogènes.\nTous les protocoles impliquant des souris ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) et le Comité de biosécurité institutionnelle (IBC) de l'Université de Rochester, École de médecine et de dentisterie. Toutes les expériences réalisées sur des animaux suivent les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches58. Le Vivarium and Division of Laboratory Animal Medicine facilities de l'École de médecine et de dentisterie de l'Université de Rochester est accrédité par l'Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International et aux lois fédérales et des États et à la politique des National Institutes of Health (NIH). Un équipement de protection personnelle (EPI) approprié est nécessaire lorsque vous travaillez avec des souris. Des politiques et des exigences similaires devraient être mises en œuvre lors de l'exécution d'expériences décrites dans ce manuscrit dans chaque institution.\n1. Utilisation de petits animaux vertébrés\nAchetez des souris BALB/c femelles de cinq à sept semaines et entretenez-les dans l'établissement de soins aux animaux dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes. À l'arrivée des souris dans les installations déterminées, prévoyez une période de repos de 4 à 5 jours pour permettre aux animaux de s'acclimater à leur nouvel environnement.\nSuivant les protocoles de l'IACUC, placez un maximum de 5 souris par cage.\nREMARQUE: À la fin de l'expérience, afin de s'assurer que l'animal est mort, les souris ont été euthanasiées à l'aide de deux procédures approuvées, en tenant compte du fait que la seconde doit être une méthode physique. Dans cette étude, après l'infection de souris avec BIRFLU et l'imagerie in vivo, les animaux sont euthanasiés avec une dose mortelle de 2,2,2-tribromoethanol (TBE), et en coupant la veine hépatique comme méthode secondaire physique comme nous l'avons précédemment montré23.\nREMARQUE: Dans ce manuscrit, BIRFLU a été généré dans l'épine dorsale de la grippe A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), qui est une souche de laboratoire adaptée à la souris iAV23,32,33,56. Le virus a été généré à l'aide d'approches de génétique inverse à base de plasmides précédemment décrites et d'une description complète de la génération, et la caractérisation in vitro et in vivo de BIRFLU peut être trouvée dans notre récente publication55. Toutes les procédures impliquant des infections par le VI (in vitro ou in vivo) ont été effectuées dans un coffret de sécurité biologique dans des conditions de biosécurité (BSL)-2.\nMISE EN GARDE: Un niveau de biosécurité approprié devrait être déterminé conformément à une évaluation des risques pour la biosécurité. Des renseignements supplémentaires sur l'exécution d'évaluations des risques liés à la biosécurité et l'établissement d'un confinement efficace de la biosécurité devraient être consultés auprès de l'établissement où les expériences seront effectuées.\nNettoyez les armoires de biosécurité avec 70 % d'éthanol ou de désinfectant au dioxyde de chlore avant et après avoir effectué toutes les procédures expérimentales. Pour le travail des souris, stériliser tous les matériaux de dissection (ciseaux, forceps disséquants, etc.) et l'homogénéisateur Dounce avant et après leur utilisation.\nJetez tout le matériel biologique produit au cours des procédures en vertu des directives appropriées du BAC et de l'IACUC.\n3. Caractérisation in vitro de BIRFLU (figure 2)\nREMARQUE: Consultez le tableau 1 pour toutes les compositions de mémoire tampon et de médias.\nAnalyser l'expression des protéines par fluorescence (figure 2A) et l'immunofluorescence indirecte (figure 2B)\nUn jour avant l'infection, les plaques de semence24 puits avec madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellules épithéliales (1 x 105 cellules / puits, triplicates) dans les médias de culture tissulaire et de maintenir les plaques dans un incubateur de 37 oC avec 5% CO2. Préparez suffisamment de puits pour évaluer tous les anticorps choisis dans les cellules infectées par des simulacres et les cellules birFLU.\nREMARQUE: Nous recommandons de visualiser les cellules sous un microscope léger pour confirmer une monocouche avant de commencer l'infection virale. Une monocouche de confluence de 90% des cellules de MDCK au moment de l'infection est recommandée.\nPréparer des dilutions de WT ou BIRFLU IAVs dans les médias d'infection et infecter les cellules ensedutes MDCK avec une multiplicité d'infection (MOI) de 0,1 plaque-formation des unités (PFU) par cellule dans un volume final de 0,25 ml/puits de médias d'infection.\nRetirez le milieu de culture tissulaire de l'étape 3.1.1 et lavez les cellules MDCK deux fois avec 1x salin tamponné par phosphate (PBS). Ajouter les dilutions virales de 3.1.2 aux cellules MDCK et placer les plaques sur une plate-forme de bascule pendant 1 h à température ambiante pour permettre l'adsorption virale.\nREMARQUE: Les cellules simulées ne sont incubées qu'avec des milieuis d'infection en l'absence de virus.\nAprès l'adsorption virale (étape 3.1.3), retirez l'inoculum viral par aspiration et ajoutez 1 ml de support post-infection contenant 1 g/mL de trypsine TPCK-traitée à chaque puits. Incuber les cellules pendant 18 h dans un incubateur humidifié co2 à 33 oC.\nAprès 18 h d'infection, retirez le supernatant de culture tissulaire des plaques de 24 puits (3.1.4). Fixer et perméabiliser les cellules avec 0,25 ml/puits de solution de fixation/perméabilisation pendant 20 min à température ambiante.\nREMARQUE: Préparer la solution de fixation/perméabilisation dans un capuchon de fumée pour éviter l'exposition au formaldéhyde.\nRetirez la solution de fixation/perméabilisation de l'étape 3.1.5, lavez les cellules deux fois avec 1x PBS, et incubez les cellules avec 0,25 ml/puits de solution de blocage pendant 1 h à température ambiante.\nREMARQUE: Passez à l'étape suivante ou entreposez les cellules dans une solution de blocage à 4 oC pendant la nuit.\nRetirez la solution de blocage (étape 3.1.6) et ajoutez 0,25 ml/puits (1 g/mL) d'un anticorps monoclonal de souris (MAb) contre la nucléoprotéine IAV, NP (HB-65) ou une dilution de 1:1 000 d'un anticorps polyclonal de lapin (pAb) contre NLuc (voir la Table des Matériaux), tous deux dilués dans la solution de dilution d'anticorps (1x PBS, 2,5% BSA), et incubent les cellules pendant 1 h à 37 oC.\nRetirez l'anticorps primaire de l'étape 3.1.7, lavez les cellules trois fois avec 1x PBS et incubez-les avec 0,25 ml/puits d'un anti-souris ou d'anticorps secondaires anti-lapins du Texas (voir le Tableau des matériaux) dilué 1:200 dans l'anticorps solution de dilution.\nREMARQUE: Les noyaux cellulaires peuvent être tachés en même temps en ajoutant 0,5 g/mL de 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) à la même solution d'anticorps secondaire. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 oC dans l'obscurité. D'autres anticorps secondaires conjugués à d'autres fluorophores peuvent être utilisés.\nRetirez l'anticorps secondaire et Le DAPI de l'étape 3.1.8, lavez les cellules trois fois avec 1x PBS. Après le lavage, laisser les cellules dans 0,25 ml/puits de 1x PBS.\nPlacez la plaque sur le stade d'un microscope à fluorescence pour détecter l'expression des journalistes de Vénus et Nluc, et NP à partir de cellules infectées à l'aide des filtres fluorescents appropriés. Capturez des images à l'aide d'un microscope à fluorescence (grossissement 20x) et fusionnez-les à l'aide d'un logiciel d'édition d'images (Figure 2A, B).\nAnalyser l'activité du Nluc (Figure 2C) et la réplication virale (Figure 2D).\nUn jour avant l'infection, les plaques de semences de 12 puits avec des cellules MDCK (2 x 105cellules/bien, tripliciates) utilisant des supports de culture tissulaire dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pour atteindre environ 90 % de confluency au moment de l'infection.\nREMARQUE: Avant l'infection, vérifiez les cellules au microscope pour vérifier une monocouche de cellules MDCK.\nLe jour de l'infection prépare des dilutions des virus WT et BIRFLU dans les médias d'infection pour infecter les cellules MDCK (étape 3.2.1.) dans le triplement avec un MOI de 0.001 PFU dans 0.5 mL/puits. Enlever le milieu de culture tissulaire et laver les cellules MDCK deux fois avec 1x PBS.\nAjouter les dilutions virales aux monocouches MDCK et permettre l'adsorption virale à température ambiante pendant 1 h sur une plate-forme à bascule. Après l'adsorption virale, retirez l'inoculum du virus et ajoutez 1,5 ml de support post-infection contenant 1 g/mL de trypsine traitée par TPCK, à chaque puits. Incuber les cellules infectées dans un incubateur humidifié au CO2 de 5 % à 33 oC et recueillir des supernatants aux points indiqués à l'étape 3.2.4.\nÀ 24, 48, 72 et 96 h après l'infection (p.i.) recueillir 150 L de supernatant de culture tissulaire de chaque puits et stocker les échantillons dans un tube de microcentrifuge à -80 oC pour effectuer les essais Nluc et les titres viraux.\nPour effectuer l'exemple d'activité Nluc, suivez les indications du fabricant. Tout d'abord, décongeler le supernatant de culture tissulaire stocké à -80 oC (étape 3.2.4) sur la glace.\nREMARQUE: Reportez-vous aux recommandations du fabricant et optimisez l'analyse si nécessaire.\nPréparer la solution d'analyse de luciferase (voir la Table des Matériaux) en diluant le substrat Nluc 1:50 avec le tampon de dilution. Dans une microplaque blanche à fond plat de 96 puits pour les essais de luciferase, mélangez 25 ll de solution d'analyse de luciferase avec 10 à 25 l des échantillons de supernatant de culture de tissu recueillis. Incuber le mélange pendant 2 à 3 minutes avant de mesurer la luminescence à l'aide d'un luminomètre (figure 2C).\nREMARQUE: La présence de particules virales infectieuses dans la culture tissulaire des supernatants est déterminée par l'analyse immunitaire-focus de fluorescence (Vénus) ou l'immunofluorescence indirecte (coloration virale d'antigène) comme précédemment décrit23,32, 33,56.\nUn jour avant les titrations virales, les cellules de Semence MDCK dans une plaque de 96 puits (2 x 104 cellules/puits, tripliques) avec des supports de culture tissulaire et permettent aux cellules d'atteindre 90% de confluence au moment de l'infection dans un incubateur réglé à 37 oC avec 5% de CO2.\nUtilisez les échantillons de supernatant de culture tissulaire qui ont été décongelés sur la glace (étape 3.2.4.). Ajouter 90 lde de support d'infection à chacun des puits dans une nouvelle plaque de 96 puits, puis ajouter 10 l de la culture tissulaire décongelée supernatant (étape 3.2.4) au premier puits (rangée A). Utiliser une tuyauterie multicanal pour mélanger et transférer 10 L de la rangée A à la rangée B. Changez les pointes entre les dilutions et mélangez bien.\nREMARQUE: Cette procédure doit être répétée jusqu'à la dernière rangée (H). Nous recommandons d'effectuer des titrations virales dans des tripliques pour une mesure précise des titres viraux.\nRetirez le milieu de culture tissulaire des cellules MDCK dans les plaques de 96 puits (étape 3.2.7) et lavez deux fois avec 1x PBS. Ajouter 50 L des dilutions supernatant de la plaque de 96 puits contenant les dilutions virales (étape 3.2.8) à chaque puits dans la plaque de 96 puits contenant des cellules MDCK.\nIncuber la plaque de 96 puits sur une plate-forme à bascule pendant 1 h à température ambiante pour permettre l'adsorption virale. Après l'adsorption virale, retirez l'inoculum et ajoutez 100 L/puits de support post-infection contenant 1 g/mL de trypsine traitée par TPCK. Incuber les cellules infectées pendant 12 h dans unincubateur de 33 oC avec 5 % de CO 2.\nDepuis BIRFLU exprime Vénus, le nombre de cellules infectées peut être directement compté à l'aide d'un microscope à fluorescence. Alternativement, les titreleurs viraux peuvent être déterminés par immunofluorescence indirecte comme précédemment décrit utilisant un anticorps contre une protéine virale23,56,57,59. Pour ce dernier, procéder à la correction /perméabilize des cellules et la tache en utilisant l'anti-NP mAb HB-65 tel que décrit dans la section 4.4.\nDéterminer les titreleurs viraux en comptant le nombre d'unités fluorescentes (FFU)/mL à l'aide de la formule : ((nombre de FFU) x 20 x 1/dilution (Figure 2D).\n4. Caractérisation in Vivo de BIRFLU (Figure 3 et Figure 4)\nInfection de souris\nREMARQUE : L'infection intranasale des souris a été faite comme précédemment décrit23. Pour un protocole plus détaillé de l'infection par le VI in vivo en utilisant le modèle de souris de l'infection, nous vous recommandons de visionner la vidéo associée à la publication précédente23. Cette section résume seulement les étapes requises pour l'infection de souris avec BIRFLU.\nInspecter les souris pour évaluer leur santé et leur apparence physique globale. Préparer la dilution de BIRFLU en 1x PBS pour inoculer les souris avec 1 x 106 PFU de BIRFLU dans un volume total de 30 L/souris. Maintenir le virus sur la glace jusqu'à l'inoculation de la souris.\nREMARQUE: Des souris simulées (1x PBS) seront nécessaires comme contrôle interne pour l'imagerie. Placez des souris simulées dans une cage différente de celle des animaux infectés par le BIRFLU.\nAnesthésiez des souris BALB/c femelles de cinq à sept semaines par voie intrapéritone avec 240 à 250 mg/kg de tribromoéthanol (TBE) en insérant l'aiguille dans le caudal 2/3 du côté droit de l'abdomen. Ensuite, retournez la souris dans la cage et attendez environ 5 min. Vérifiez que la souris est anesthésié avant l'inoculation du virus par l'absence du réflexe de pincement des orteils.\nREMARQUE: Les sédatifs injectables sont recommandés sur les sédatifs inhalés pour les infections grippales in vivo, car ces derniers peuvent modifier le comportement et l'utilisation du virus par l'épithélium des voies respiratoires. En outre, ils peuvent également affecter les réponses immunitaires locales du poumon et interférer avec l'imagerie in vivo des souris infectées. Enfin, les sédatifs inhalés ont réduit la durée d'effet, ce qui constituerait un problème pour l'imagerie in vivo des animaux infectés.\nInoculer les souris intranasally avec les 30 L de la dilution BIRFLU préparée. Vérifiez que les souris respirent correctement avant de les retourner à la cage.\nSurveillance de la bioluminescence des souris infectées par BIRFLU (Figure 4A)\nREMARQUE: Dans ce manuscrit, l'expression de Nluc ou de Vénus et la réplication virale dans les poumons de souris infectées par BIRFLU sont déterminées à 3 jours après l'infection. Cependant, la nature de l'imagerie par bioluminescence permet une surveillance répétée de l'expression de Nluc chez des animaux infectés par le BIRFLU sans qu'il soit nécessaire de les euthanasier pour chaque période expérimentale. Un système de formation image in vivo avec un collecteur d'anesthésie d'isoflurane est exigé pour exécuter les procédures expérimentales décrites. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails concernant l'instrument d'imagerie et le logiciel d'image utilisés pour l'acquisition d'images et l'analyse des données.\nRaser la poitrine des souris pour améliorer le signal de bioluminescence. Ouvrez le logiciel d'imagerie et appuyez sur Initialize. Ensuite, définiz les paramètres qui seront utilisés, y compris la mise en mode d'imagerie à la bioluminescence, l'économie automatique, le temps d'exposition à l'automobile, filtre ouvert, etc.\nUne fois que la machine est entièrement paraphée, allumez le système d'anesthésie isoflurane. Placer les animaux dans la chambre d'anesthésie. Les souris sont simultanément et légèrement anesthésiées avec un mélange de gaz d'oxygène et d'isoflurane vaporisé de 1 à 2 %.\nUne fois que les souris sont anesthésiées, administrer le substrat Nluc (voir le Tableau des matériaux)dilué 1:10 en 1x PBS (volume final 100 l/souris) par voie rétro-orbitale à l'aide d'une seringue avec une aiguille de 22 G.\nImmédiatement après l'administration du réactif Nluc, placez les animaux dans l'instrument d'imagerie avec leurs poitrines orientées vers le haut et le museau à l'intérieur du cône multiple pour garder les animaux anesthésiés pendant l'imagerie. Immédiatement après la fermeture de la porte de l'imageur, cliquez sur Acquérir dans le logiciel (Figure 4A, en haut).\nAprès l'imagerie, renvoyez les souris dans leurs cages en les surveillant jusqu'à ce qu'elles aient complètement récupéré et éteignez le vaporisateur d'isoflurane. Ensuite, procédez à l'imagerie ex vivo des poumons de souris pour évaluer l'expression du gène de journaliste de Vénus (section 4.3).\nUtilisez les outils logiciels d'imagerie pour analyser les données de bioluminescence acquises. Utiliser l'outil ROI (région d'intérêt) pour désigner le signal spécifique et effectuer des mesures de flux dans la région d'intérêt (généralement autour de la poitrine) (Figure 4A, en bas). Bien que la forme du retour sur investissement ne soit pas pertinente, les iA plus importants sont généralement préférables pour capturer toute la zone de diffusion du signal.\nCliquez sur Mesure. Évaluer la bioluminescence dans les photons puisqu'elle fournit une mesure absolue des émissions de photons qui est comparable aux mesures de sortie fournies par différents paramètres ou instruments d'imagerie.\nAnalyse de fluorescence chez les souris infectées par BIRFLU (Figure 3 et Figure 4B)\nRecueillir les poumons de la souris après l'imagerie in vivo, comme précédemment décrit23.\nEn bref, euthanasiez les souris avec une dose mortelle de TBE (500 mg/kg). Désinfecter le site d'incision avec 70% d'éthanol. À l'aide d'un scalpel, faire une incision du sternum à la base de l'abdomen, puis couper du bas de l'incision sur les côtés avec des ciseaux. Ensuite, couper la veine hépatique (deuxième méthode d'euthanasie physique) pour saigner l'animal.\nREMARQUE: Pour éviter le signal de fond élevé pendant l'imagerie, il est important de réduire au minimum la quantité de sang dans les poumons (voir ci-dessous).\nPlacez la souris dans la charge dorsale, et utilisez les ciseaux pour couper la pleure et ouvrir la cage thoracique. Par la suite, retirer les poumons en arrachant l'extrémité de la trachée avec des ciseaux tout en tenant doucement les poumons avec des forceps.\nPlacer les poumons dans une plaque de six puits avec 2 ml de 1x PBS et laver les poumons trois fois avec 1x PBS.\nREMARQUE: Pour éviter la contamination entre les échantillons, nettoyez et désinfectez les outils de dissection entre chaque animal.\nDémarrez le logiciel d'acquisition d'images en cliquant sur initialiser et définir les paramètres pour l'imagerie, y compris le réglage du mode d'imagerie à la fluorescence, l'économie automatique, le temps d'exposition à l'automobile, l'excitation (500 nm) et les filtres d'émission (540 nm).\nLorsque la machine est paraphée, placez les poumons dans un plateau de fond noir, en veillant à ce que les tissus sont séparés les uns des autres, introduisez le plateau dans l'imageur, et cliquez sur Acquérir sur le programme du système d'imagerie après la fermeture de la porte de l'imageur ( Figure 4B, en haut).\nAprès l'imagerie, retirer immédiatement les tissus et les conserver sur de la glace (4 oC) si les échantillons sont traités le jour même; ou sur un tube et de la glace sèche pour les congeler rapidement, avant de les stocker à -80 oC, si les échantillons seront traités plus tard un autre jour.\nPour le traitement de l'image, sélectionnez l'outil de retour sur investissement et dessinez des ROIs autour de chacun des poumons individuels. Cliquez sur Mesure. Ensuite, à l'aide des mesures moyennes d'efficacité radiante qui en résultent, soustrayez les valeurs des souris infectées par une simulacre (figure4B,en bas).\nREMARQUE: Avec BIRFLU, il ya une bonne corrélation des niveaux d'expression De Nluc et Vénus, et la distribution du signal. Par conséquent, il est important d'analyser l'expression de Nluc (souris entière) et De vénus (poumons excisés) du même animal, et de maintenir la même orientation.\nÉvaluation de la réplication DU BIRFLU dans les poumons des souris (figure3 et figure 4C)\nHomogénéiser les poumons des souris pour la titration virale par l'assay de plaque comme précédemment décrit23.\nPlacer les poumons dans un homogénéisateur Dounce avec 1 ml de support d'infection réfrigérée. Homogériser les poumons avec le pilon pendant 1 min à température ambiante jusqu'à ce qu'il se soit complètement désintégré et stocker les échantillons dans un tube stérile à 4 oC.\nCentrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min et recueillir le supernatant dans un tube stérile. Entreposez les échantillons sur la glace s'ils seront utilisés le même jour ou congelez-les à -80 oC pour évaluer les titreleurs viraux à une date ultérieure.\nREMARQUE: Un nouvel homogénéisateur Dounce doit être utilisé pour chaque échantillon pulmonaire.\nPour effectuer l'analyse de plaque, la veille de l'exécution de la titration virale, les plaques de semence de six puits avec des cellules MDCK (5 x 105 cellules/ bien) dans les médias de culture tissulaire. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC avec 5 % de CO2 pour atteindre 90 % de confluence le lendemain. Avant l'infection, confirmer que les cellules forment une monocouche sous un microscope léger.\nPréparer 1:10 dilutions sérielles du supernatant à partir des échantillons homogénéisés (étape 4.4.1) dans les médias d'infection. Préparer les tubes de microcentrifugeavec 540 l de supports d'infection, ajouter 60 L de l'échantillon de poumons homogénéisés au premier tube, mélanger en pipetting de haut en bas, puis en utilisant une nouvelle pointe, transférer 60 'L au tube suivant. Répétez ce processus de dilution en série jusqu'à la dernière dilution.\nREMARQUE: Dans notre expérience 7 dilutions sont suffisantes pour déterminer les titreleurs viraux par l'assay de plaque des poumons des souris infectées.\nLaver les cellules MDCK (étape 4.4.3) deux fois avec 1x PBS et transférer 500 L des échantillons dilués en série à chaque puits dans la plaque de six puits. Placer les plaques sur une plate-forme de bascule et permettre l'absorption virale de se produire pendant 1 h à température ambiante.\nAprès 1 h d'absorption virale, retirez l'inoculum viral, ajoutez 2 mL/puits de milieu de superpose contenant 1 g/mL de trypsine traitée par TPCK, puis incubez les cellules à 33 oC sous 5 % de CO2 pendant 3 jours.\nFixer les cellules infectées (étape 4.4.6) avec 1 ml/puits de 4% de formaldéhyde dilué dans 1x PBS à température ambiante pendant 2 h, puis retirer soigneusement le milieu de superposition et ajouter 1 ml de 1x PBS à chaque puits. Pour la visualisation de Vénus, imagez les plaques de six puits avec un système d'imagerie pour la détection de la fluorescence.\nREMARQUE: Les plaques virales peuvent être colorées à l'aide d'un logiciel d'édition d'images (voir le Tableau des matériaux).\nPour évaluer l'expression de Nluc, visualisez les plaques virales en immunostaining utilisant un pAb anti-Nluc. Pour cela, retirer les 1x PBS, les cellules perméabilize en utilisant 0,5 ml/puits de solution de perméabilisation pendant 15 min à température ambiante.\nRetirez la solution de perméabilisation, lavez les cellules trois fois avec 1x PBS et bloquez avec 0,5 ml/puits de solution de blocage pendant 1 h à température ambiante.\nRetirez la solution de blocage de l'étape 4.4.9 et incubez les cellules avec 0,5 ml/puits de l'anti-Nluc pAb dilué 1:1,000 dans la solution de dilution pendant 1 h à 37 oC.\nUtilisez le kit ABC Alkaline Phosphatase et le Kit substrat Peroxidase DAB suivant la recommandation du fabricant pour la visualisation des plaques exprimant Nluc.\nEn bref, laver les cellules à partir de 4,4,10 trois fois avec 1x PBS et les incuber avec 0,5 ml/puits d'anticorps secondaires anti-lapin biotinylated pendant 1 h à 37 oC.\nRetirez l'anticorps secondaire, lavez les cellules trois fois avec 1x PBS, et incubez avec la solution ABC pendant 1 h à 37 oC. Laver les cellules trois fois avec 1x PBS et visualiser les plaques virales avec le kit de substrat DAB HRP. Scanner les plaques immunostained à l'aide d'un scanner conventionnel.\nREMARQUE: D'autres kits similaires pour l'immunostaining pourraient être utilisés.\nTachez les plaques virales avec une solution violette cristalline pendant 1 h à température ambiante. Jeter la violette de cristal, laver les assiettes trois fois avec de l'eau, laisser sécher les assiettes et scanner à nouveau les assiettes.\nPour déterminer les titreneurs viraux, comptez les plaques révélées après la coloration de la violette cristalline. Scanner les plaques à l'aide d'un scanner conventionnel. Calculer le titre de virus sous forme d'unités de formation de plaque (PFU) par mL (PFU/mL).\nPour évaluer la stabilité birFLU in vivo, calculez le pourcentage de virus exprimant des journalistes en comptant le nombre de plaques teintées de violette cristalline (nombre de virus infectieux, étape 4.4.12) et comparez avec le nombre de plaques exprimant Vénus et Nluc ( l'étape 4.4.7 et l'étape 4.4.11, respectivement).\nGénération et caractérisation de BIRFLU in vitro (figure 1 et figure 2)\nUn IAV recombinant réplication-compétent exprimant deux gènes différents de journaliste (BIRFLU) a été construit utilisant la biologie moléculaire de l'état de l'art et les techniques de génétique inverse plasmides-basées (figure1). Ici, nous avons choisi d'utiliser Nluc en raison de plusieurs avantages par rapport à d'autres luciferases, y compris sa petite taille, ATP-indépendance, une plus grande intensité, et le substrat optimisé48,60. Nluc a été cloné dans le segment HA de l'IAV PR8, suivi du site de clivage porcin teschovirus (PTV) 2A (2A) devant le cadre de lecture ouvert (ORF) de HA (Figure 1). L'ORF de HA comprenait des mutations silencieuses pour enlever les signaux d'emballage d'origine et éviter toute recombinaison possible. Le signal complet d'emballage HA a été ajouté devant Nluc pour permettre l'incorporation appropriée du segment HA modifié dans la virion et l'expression Nluc et HA du même segment d'ARN viral (Figure 1). En outre, la protéine fluorescente Vénus a été clonée dans un segment modifié IAV PR8 NS qui code les deux protéines virales NS1 et NEP à partir d'une transcription unique32,36,41,54, 57. À cette fin, Vénus a été fusionnée au terminal C de NS1 et l'ensemble du NEP ORF a été cloné en aval du site de clivage PTV 2A qui a été placé entre les séquences NS1-Venus et NEP (Figure 1). En fin de compte, ces deux constructions modifiées de plasmide viral HA et NS ont été utilisées en combinaison avec le reste des plasmides de génétique inverse iAV PR8 pour générer BIRFLU (Figure 1). La caractérisation in vitro et in vivo de BIRFLU a été décrite précédemment55.\nDans la figure 2, nous avons caractérisé le BIRFLU in vitro en déterminant les niveaux d'expression de Vénus, de Nluc et de NP en utilisant des approches de fluorescence et d'immunofluorescence indirecte (figure2A,B). Les monocouches de confluents des cellules MDCK ont été soit simulées ou infectées (MOI 0.1) avec des virus WT ou BIRFLU PR8 et, à 18 h après l'infection, l'expression de Vénus a été directement évaluée à l'aide de la microscopie à fluorescence (figure 2A,B). L'expression Nluc (Figure 2A) et NP (Figure 2B) ont été visualisées par immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticorps spécifiques pour chaque protéine. Comme prévu, l'expression de Vénus et de Nluc n'a été détectée que dans les cellules infectées par BIRFLU et non dans les cellules infectées par le virus WT PR8. En outre, la microscopie indirecte d'immunofluorescence a indiqué l'expression de NP dans les cellules WT et BIRFLU PR8-infectées. Aucune expression de Vénus, De Nluc ou de NP n'a été détectée, comme prévu, dans des cellules simulées infectées (figureA,B).\nPour évaluer les niveaux d'expression de Nluc in vitro, les cellules MDCK ont été infectées (MOI 0.001) avec des virus WT ou BIRFLU PR8 et l'activité de Nluc dans les supernatants de culture tissulaire a été évaluée à 24, 48, 72 et 96 h après l'infection (figure 2C). Seule l'activité de Nluc a été détectée chez les supernatants de culture tissulaire des cellules MDCK infectées par BIRFLU (figure 2C). L'activité de Nluc dans les supernatants de culture de tissu a été détectée dès 24 h après l'infection avec des niveaux d'expression plus élevés à 96 h après l'infection, probablement parce que l'effet cytopathique (CPE) induit pendant la libération virale d'infection la protéine de Nluc a conservé dans la cellule. Pour évaluer l'aptitude du BIRFLU dans les cellules cultivées, la cinétique de croissance des virus WT et BIRFLU PR8 a également été évaluée (Figure 2D) et la présence de virus infectieux dans les supernatants de culture tissulaire a été déterminée par l'analyse du foyer immunitaire (figure2D ). Notamment, la cinétique de réplication de BIRFLU était comparable à ceux du virus de PR8 de WT, bien que la réplication de BIRFLU ait été légèrement retardée et n'ait pas atteint les mêmes titers viraux que WT PR8. Cependant, BIRFLU a été en mesure d'atteindre des titreleurs de 5 x 107 PFU/mL (Figure 2D), ce qui indique que l'expression de deux gènes reporteurs dans le génome viral n'interfère pas de façon significative avec la réplication du BIRFLU dans les cellules MDCK.\nSuivi de l'infection À BIRFLU chez la souris(figure3 et figure 4)\nLa figure 3 est un diagramme de flux schématique pour l'évaluation de la dynamique BIRFLU dans un modèle de souris de l'infection par le VI. Des souris femelles de CINQ à sept semaines de BALB/C ont été simulées-infectées avec 1x PBS ou infectées avec 1 x 106 PFU de BIRFLU intranasally. À 3 jours après l'infection, des souris ont été anesthésiées avec l'isoflurane et puis injectées avec le substrat de Nluc rétro-orbitalement. Toutes les souris ont été immédiatement placées dans l'instrument IVIS et le signal de Nluc a été évalué in vivo à l'aide de l'IVIS. Ensuite, les souris ont été euthanasiées et les poumons ont été récoltés. Les poumons excisés ont ensuite été analysés ex vivo à l'aide de l'imageur in vivo pour déterminer l'intensité de fluorescence par l'expression de Vénus. Enfin, les poumons de souris ont été homogénéisés, et les titres et la stabilité virales ont été déterminées par l'analyse de plaque. Les plaques ont été évaluées par la fluorescence directe de Vénus, par immunostaining utilisant des anticorps spécifiques pour Nluc et par la coloration de violette cristalline.\nLes IAV exprimant des iAVs qui expriment des informations de réplication précédemment, qui expriment des iAV, expriment un seul gène de journaliste, le plus souvent une protéine fluorescente ou bioluminescente, comme substitut de l'infection virale et de la réplication. Cependant, BIRFLU, est capable d'exprimer les deux types de gènes reporter sur l'infection virale. Pour évaluer la corrélation entre la bioluminescence (imagerie in vivo) et la fluorescence (imagerie ex vivo) après l'infection BIRFLU, des souris balb/c femelles de cinq à sept semaines ont été simulées infectées par 1 x PBS ou inoculées par BIRFLU (106 PFU) intranasalement . L'activité de Nluc (figure 4A) a été évaluée par l'administration du substrat de Nluc injecté rétro-orbitalement à 3 jours après l'infection utilisant un instrument d'imagerie in vivo. Nous avons choisi d'évaluer la bioluminescence au jour 3 parce que les études précédentes indiquaient que la réplication du IAv, y compris le PR8, culmine entre les jours 2 et 4 après l'infection24,54. La bioluminescence a été surveillée (figure4A, en haut) et utilisée pour calculer le flux total moyen (Flux (log10 p/s) (Figure 4A, en bas). Comme prévu, les souris inoculées avec BIRFLU ont montré une activité de bioluminescence élevée, mais aucun signal n'a été détecté chez les souris infectées par un simulacre. Par la suite, les poumons des souris infectées ont été récoltés et l'expression de Vénus a été évaluée à l'aide de l'imagerie ex vivo (figure4B, en haut). De plus, l'efficacité radiante moyenne de fluorescence a été calculée (Figure 4B, en bas). Les poumons de souris excisées ont également été homogénéisés pour déterminer les titreleurs viraux et la stabilité génétique de BIRFLU in vivo (Figure 4C, D). La stabilité génétique de BIRFLU a été analysée par l'analyse de plaque utilisant les virus isolés des poumons de souris et la microscopie fluorescente (Vénus, dessus), l'immunostaining (Nluc, milieu) et la coloration de violette cristalline (en bas). BIRFLU récupéré à partir de souris poumons ont été en mesure de former des plaques et exprime de façon stable les deux gènes journaliste (Figure 4C). Notamment, nous avons observé une bonne corrélation entre les signaux de bioluminescence et de fluorescence avec la réplication virale.\nFigure 1 : Représentation schématique de la structure de virion IAV PR8 et BIRFLU et des segments génomiques. Les IAV sont entourés d'une couche lipidique contenant les deux principales glycoprotéines virales hémagglutinine (HA; noir) et neuraminidase (NA; bleu). Le IAV contient huit segments d'ARN à simple brin, à sens négatif (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M et NS). Chaque segment viral contient des régions non codantes (NCR) aux extrémités 3' et 5' (boîtes noires). En outre, à la fin 3' et 5' des viraux (v)RNAs sont les signaux d'emballage, responsables de l'encapsidation efficace des vRNAs en virions naissantes (boîtes blanches). Les segments et produits viraux IAV PR8 HA et NS sont indiqués en noir. Les séquences de Nluc, Devénus et PTV 2A sont indiquées dans des boîtes rouges, vertes et rayées, respectivement. La représentation schématique des segments HA et NS modifiés exprimant Nluc et Vénus, respectivement, dans BIRFLU sont également indiquées. Ce chiffre a été adapté de Nogales et coll.55. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.\nFigure 2 : Caractérisation in vitro de BIRFLU. (A, B) Analyse de l'expression des protéines par fluorescence directe et immunofluorescence. Les cellules MDCK ont été simulées ou infectées (MOI 0.1) par des virus PR8 WT ou BIRFLU. Les cellules infectées ont été fixées à 18 h après l'infection pour visualiser directement l'expression de Vénus par microscopie fluorescente directe et pour visualiser l'expression Nluc (A) et virale NP (B) utilisant des anticorps spécifiques et l'immunofluorescence indirecte. Les noyaux ont été tachés avec DAPI. Des images représentatives (20x grossissement) sont affichées. Barres d'échelle de 100 m. (C, D) Cinétique de croissance de PR8 WT et BIRFLU. L'activité de Nluc (C) et les titres viraux (D) dans les supernatants de culture de tissu des cellules de MDCK infectées (MOI 0.001) avec wT et BIRFLU PR8 des virus ont été évalués aux heures indiquées après l'infection. Les données représentent les moyens de SD des tripliques. Les titrages viraux ont été déterminés par l'analyse immunisée-focus (FFU/mL). La ligne pointillée indique la limite de détection (200 FFU/ml). Ce chiffre a été adapté de Nogales et coll.55. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.\nFigure 3 : Représentation schématique pour l'étude du BIRFLU chez la souris. L'expression des gènes de journaliste de Nluc et de Vénus a été évaluée chez des souris infectées par 1 x 106 PFU de BIRFLU à l'aide d'imagerie in vivo ou ex vivo. En bref, le jour 1, 5 à 7 souris femelles de BALB/c de semaine ont été simulées-infectées (1x PBS) ou inoculées avec 1 x 106 PFU de BIRFLU intranasally. Au jour 3 après l'infection, des souris ont été légèrement anesthésiées utilisant l'isoflurane et le substrat de Nluc a été injecté rétro-orbitalement. Le signal de Nluc a été directement évalué utilisant l'imagerie in vivo. Immédiatement après la formation image, des souris ont été euthanasiées et l'expression de Vénus dans les poumons excisés entiers a été analysée utilisant la formation image ex vivo. Les poumons récupérés de souris ont été homogénéisés pour évaluer la réplication et la stabilité virales par l'analyse de plaque. Les flèches indiquent une corrélation entre la fluorescence (Vénus), l'immunostaining (Nluc) et la coloration de la violette cristalline. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.\nFigure 4 : Expression de bioluminescence et de fluorescence in vivo. Les souris femelles de CINQ à sept semaines de BALB/c ont été simulées-infectées (1x PBS) ou inoculées avec 1 x 106 PFU de BIRFLU intranasally. Au jour 3 post-infection, l'activité de Nluc (A) dans la souris entière a été déterminée. Images représentatives d'une souris unique montrant l'échelle d'éclat (p/sec/cm2/sr). Les valeurs d'éclat de bioluminescence ont été quanties et le flux total moyen est indiqué (Flux (Log10 p/s). Après l'imagerie De Nluc, les poumons ont été récoltés pour l'imagerie ex vivo (B). Des images représentatives de poumons entiers sont montrées. Pour quantifier l'expression de Vénus, les valeurs moyennes des régions d'intérêt (ROIs) ont été normalisées à l'autofluorescence pulmonaire des souris simulées-infectées et des changements de pli ont été calculés. Pour analyser la stabilité génétique de BIRFLU in vivo, les virus récupérés dans les poumons des souris ont été analysés par test de plaque à l'aide d'une microscopie fluorescente (Vénus, en haut), d'immunostaining (Nluc, milieu) et de coloration violette cristalline (en bas) (C). Des images représentatives d'une souris sont affichées. Pour évaluer la réplication du virus, des poumons entiers ont été homogénéisés après l'imagerie et utilisés pour infecter les cellules MDCK et déterminer les titreleurs viraux par test de plaque (PFU/mL) (D). Les flèches indiquent une corrélation entre la fluorescence (Vénus), l'immunostaining (Nluc) et la coloration de la violette cristalline. Les barres représentent la moyenne des titres de virus pulmonaires. Ce chiffre a été adapté de Logales et coll.55. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.\nMédias et solutions de culture tissulaire rédaction espace de stockage utiliser\nMédias de culture tissulaire : Dulbecco modifié Eagle's medium (DMEM), 10 % Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-glutamine (PSG) (DMEM 10 % FBS 1% PSG). 445 ml d'AMEM, 50 ml de FBS et 5 ml de 100x PSG. 4 oC Entretien des cellules MDCK\nMédias post-infection: DMEM 0,3% Bovine Albumin (BA), 1% PSG (DMEM 0.3 % BA 1% PSG). 491 ml DMEM, 4,2 ml de 35 % BA et 5 ml de 100x PSG 4 oC Maintien des cellules MDCK après une infection virale\n10x Phosphate tamponné saline (PBS) 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na2HPO4.7H2O, 2 g de KH2PO4. Ajouter ddH2O jusqu'à 1 L. Ajuster le pH à 7,3 température Pour préparer 1x PBS\n1x PBS Diluer 10x PBS avec ddH2O température Laver les cellules\nMédias d'infection : 1x PBS, 0.3% BA, 1% Penicillin-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS). 487 mL 1x PBS stérile, 4,2 mL de 35% BA et 5 ml de 100x 1% PS(100 U/mL) 4 oC Infections virales\nSolution de fixation/perméabilisation : 4 % de formaldéhyde, 0,5 % de triton X-100 dilué en 1x PBS. 400 mL de formaline tamponneutre neutre 10 %, 5 ml de Triton X-100 et 595 ml de 1x PBS température Correction et perméabilisation des cellules MDCK.\nSolution de blocage : 2,5% d'albumine bovine (BSA) en 1x PBS. 2,5 g de BSA en 97,5 ml de 1x PBS 4 oC Solution de blocage pour l'immunofluorescence et les essais de plaque.\nSolution de dilution d'anticorps (1% BSA en 1x PBS) 1 g de BSA en 99 ml de 1x PBS 4 oC Dilution des anticorps primaires et secondaires.\nSolution de violette cristalline de 0,1 % 1 g de violette cristalline dans 400 ml de méthanol. Ajouter 600 ml de ddH2O température Coloration des cellules MDCK dans les essais de plaque.\nTosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl cétone (TPCK)-traité trypsin Préparer une solution de stock 1000x à 1 mg/mL en ddH2O -20 oC Pour les infections virales.\nTableau 1 : Médias et solutions de culture tissulaire.\nLes chercheurs se sont appuyés sur les virus recombinants exprimant des journalistes comme outils moléculaires vitaux pour comprendre et développer la compréhension actuelle de la réplication virale et de la pathogénie26,27,28, 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34 Ans, états-unis ( , 35 Annonces , 36 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu'ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 54. Les gènes de reporter les plus couramment favorisés sont les luciferases et les protéines fluorescentes, principalement en raison des progrès technologiques dans leur identification, le développement de variantes améliorées, et la détection par les technologies d'imagerie43 , 44 Ans, en est à qui , 45 Annonces , 46 Annonces , 47 Annonces , 48. Les virus reporterres sont souvent utilisés pour accélérer les essais virologiques, étudier la dynamique des virus in vitro et in vivo, et tester l'efficacité des approches vaccinales et thérapeutiques actuellement approuvées ou nouvelles26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Malheureusement, dans le cas de l'IAV, les études antérieures se limitaient à l'expression d'un gène reporter unique, ce qui entrave le type d'étude qui pourrait être menée 26,27,28,29 , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34 Ans, états-unis ( , 35 Annonces , 36 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu'ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 54. Pour éviter cette limitation, nous avons généré un IAV bi-reporter réplication-compétent qui exprime une luciferase de Nluc et une protéine fluorescente de Vénus (BIRFLU).\nDans ce rapport, nous décrivons la caractérisation in vitro de BIRFLU et les approches expérimentales pour employer BIRFLU pour suivre l'infection virale in vivo utilisant un modèle de souris de l'infection d'IAV. BirFLU Nluc et l'expression de Vénus se sont corrélées avec des titers viraux. En outre, BIRFLU est resté stable et a continué à exprimer les deux gènes de journaliste après avoir été récupéré des poumons des souris infectées. Cette approche offre aux chercheurs une excellente occasion d'étudier les iAV dans les cellules cultivées et dans les modèles animaux, y compris l'identification et le développement de nouvelles alternatives thérapeutiques pour le traitement des infections par le VIH.\nBien que BIRFLU ait été généré à l'aide de l'épine dorsale de PR8, d'autres IAV recombinants utilisant différents types, sous-types ou épines dorsales de souche virale pourraient être générés en utilisant la même approche expérimentale. De même, dans ce rapport, nous avons décrit les procédures expérimentales pour l'utilisation de BIRFLU dans un modèle de souris de la IAV. Cependant, BIRFLU pourrait être une technologie précieuse pour évaluer l'infection par le VI chez d'autres modèles animaux.\nLa recherche sur le virus de l'influenza dans le laboratoire LM-S est partiellement financée par le New York Influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), membre du contrat NO des Centres d'excellence pour la recherche et la surveillance de la grippe (CEIRS) du NIAID. HHSN272201400005C (NYICE) et par le Department of Defense (DoD) Peer Reviewed Medical Research Program (PRMRP) subvention W81XWH-18-1-0460.


Traduction français ancien en français moderne — Forum littéraire\nJe tiens d'ores et déjà à m'excuser car ce sujet n'a absolument aucun liens avec de quelconques études mais plutôt de la curiosité.\nJ'habite dans un immeuble du XVIème siècle et j'ai une cheminée avec une grande plaque de métal arborant un blason et 4 mots au dessus de celui-ci : " Si mieux non pi ".\nJ'ai commencé quelques recherches et je suis tombés sur un site nommé Dicfro. Mais comme certains de ces mots ont plusieurs significations et que je n'ai aucune notions de traduction dans notre ancienne langue, je me perds un peu.\nEt c'est pourquoi je demande votre aide .\nJe vous remercie de prendre le temps de me répondre et désolé en ce qui concerne les fautes que j'ai pu faire pendant cette explication ^^.\nPourriez-vous nous adresser une photo de cette plaque ?\nJe pense qu'il s'agit de "Si mieux non pis", la devise de la famille Seyturier :\nJe suppose que vous connaissez la devise d'Arago :\nSinon, cela fait dix fois que je relis la phrase de notre ami.\n...4 mots au dessus de celui-ci : " Si mieux non pi ".\nPour qui ou quoi est mis "celui-ci" ?\nMais pour "le blason", bien sûr.\nune grande plaque de métal arborant un blason et 4 mots au dessus de celui-ci : " Si mieux non pi ".\nC'était trop évident. J'avais dans la caboche que la devise était généralement inscrite sur le blason.\nOui bien sûr. J'ai pris 3 photos : une globale, une pour le blason et une pour les 4 mots.\nMalheureusement la plaque est dans un mauvais état...\nBon, l'écu est, comme on voit, surmonté d'une couronne comtale (neuf perles), d'une mitre et d'une crosse.\nLe reste est difficile à interpréter.\nLes plaques de cheminées ont souvent fait l'objet de blasons de fantaisie rassemblant des éléments épars. C'est probablement le cas de celle-ci.\nA l'intérieur du blason il y a :\n- en bas à gauche : Un oiseau avec deux rectrices arrondi et une central rectiligne (Phénix?)\n- en haut à gauche : Une épée avec une garde dans son fourreau\n- en haut à droite : Un oiseau (Aigle?)\n- en bas à droite : difficile de savoir...\nJe peux faire une photo avec un flash pour aider si vous voulez.\nJe me suis renseigner sur la famille Seyturier et effectivement la devise est bien la leur.\nPar contre le blason ne correspond pas du tout à celui de cette famille : deux faux d'argent manchées d'or, posées en sautoir.\nC'est pourquoi je ne serais pas surpris qu'il s'agisse d'un ensemble inventé. Mais je ne suis nullement spécialiste en héraldique et ne donne qu'un avis pifométrique !\nJ'ai lu quelque part que les plaques de cheminées (ou taques, selon les régions) se sont surtout répandues au XIXe siècle, donc assez tardivement, et que les mouleurs réutilisaient souvent des modèles de moules anciens, à peine modifiés, et pas forcément en rapport avec la famille ou l'habitation pour laquelle la plaque était destinée.\nHum cela serait logique. J'habite à Dijon et la famille Seyturier ont un château à Cornod dans le Jura. C'est proche mais je ne crois pas qu'il y ait de lien.\nEt pour en revenir à cette devise, que signifie-t-elle alors?\nOn dirait une lapalissade : "Si c'est mieux, ce n'est pas pis (pis = plus mal) ".\nLa forme ovale de l'écu indique que ce sont les armes d'une femme.\nC'est qu'ils avaient de l'humour dans le temps!\nDans mes recherches j'ai vu que le mot " pi " pouvait se traduire par les mots " pieux " ou " miséricordieux ".\nMais c'est vrai qu'avec ce dernier la devise n'a pas beaucoup de sens...


Mission Photo sur France 3 : épisode 12 - Vivre la Photo\nVous êtes ici : Accueil » Actu photo » Mission Photo sur France 3 : épisode 12\nPar Cathy le 5 avril 2012 dans Actu photo 3 commentaires\nSamedi dernier, c’est le dernier épisode de Mission Photo qui était diffusé ! Alors je vous le dis tout de suite, je n’ai pas encore pu le visionner mais je vais essayer de ne pas rater le coche avant samedi sinon ça serait triste. On verra bien si une nouvelle saison émerge, et qui sait, pourquoi pas sur France 3 national (ok on peut toujours rêver…).\nVoici le lien pour voir ce dernier épisode de l’émission Mission Photo dans lequel les candidats photographes se rendent à Cannes : http://www.pluzz.fr/mission-photo-2012-03-31-16h45.html\nJe sais pas vous, mais je vais m’ennuyer maintenant sans émission de photo à la télévision :/…\nPrécédent : 1 jour de plus pour le projet photo 52\nSuivant : Photographie culinaire : coulisses de la photo des pancakes\n5 avril 2012 à 16 h 00\nune des rares fois ou le sujet ne m’ a pas rendue jalouse : festival de Cannes\nBof bof le thème , les photos, une seule m’a plu celle sur l’orchestre de la 2ième partie. Quant au thème studio avec le chat en vedette , mouais !!\n6 avril 2012 à 6 h 45\nD’accord avec Chrichri pas jalouse du tout, je trouve que pour conclure la saison c’est bof, comme au dessus la seule photo qui m’a plu c’est celle de l’orchestre.\nLe studio était plus marrant qu’intéressant, mais j’ai trouvé qu’un chat blanc sur un fond blanc c’était bof.\nCet émission était sympa j’espère qu’il en feront une nouvelles saison, peut être pas aux même horaires par contre.\n6 avril 2012 à 11 h 19\nJ’ai préféré la prise de vue avec le chat, mais si vous ne le savez pas encore, j’adore la photo de chat et j’aurais adoré avoir la possibilité de faire un tel shooting. Le blanc sur blanc je trouve ça intéressant, j’aime bien ces approches monochrome et puis ça permet d’accessoiriser au mieux. Dommage que la fille ait mal choisi ses photos sur la fauteuil club car il y en avait pourtant de sympas. Sur Cannes, seule celle avec les musiciens valait le coup je trouve…\nDans l’ensemble l’émission est assez décevante même si je n’ai pas vu tous les épisodes.


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Sujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 0:19\nOui ça peut être héréditaire, mais je vais quand même essayer de changer de marque de croquettes, c'est peut être ça car elles sont grosses mais c'est probable qu'elles collent, elles semble assez moelleuses...\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 5:37\nTiens nous au courrant sa doit pas etre marrant pour lui les anesthésies aussi frequente :s\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 9:55\nNon c'est pourquoi j'ai quand même attendu, car 2x par an ça fait trop, et moi ça m'angoisse à chaque fois. mais là il a quand même trop, j'ai peur qu'il fasse une infection ce qui peut aussi etre dangereux\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 10:06\nvi tu risques l'endocardite a long terme\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 10:28\n:( faut vraiment que je trouve quelque chose qui empêche le tartre de s'installer, une fois qu'il y est je pense que c'est déjà trop tard...\nEline, tu parles de minéraux, sais-tu s'il y a un moyen de les diminuer?\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 13:40\nLe veto n'a pas trouvé de solution pour mr fagin ? car tu y vas souvent il devrait déjà t'avoir donner des médicaments ou autres\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 14:11\nNon, il m'a dit de brosser les dents mais j'y arrive vraiment pas, Fagin bouge la tête dans tous les sens il déteste...\nJe reviens du magasin d'animaux, je voulais tester les science plan oral care parce que j'avais vu que les grains étaient gros, mais alors quand j'ai tâté à travers le paquet, j'ai vu que gros voulait dire ENORME! Ils font la taille d'un demi bouchon de bouteille! Alors c'est quand même exagéré, ça va pour un dogue allemand lol\nRésultat j'étais de nouveau au point de départ, j'ai demandé conseil pour rester dans le haut de gamme, grosses croquettes et pour les dents mais y avait pas. Du coup on m'a recommandé soit du proplan, soit du rc soit eukanuba. Comme il n'aime pas les deux dernières j'ai opté pour proplan agneau digestion difficile, ils sont assez gros mais pas trop, mais pas spécifiques pour les dents malheureusement. On va voir si y a du mieux, j'ai donné une ou deux croquettes à Fagin il a l'air d'apprécier ouf!\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 14:26\nje vais me répéter j'ai essayé le dentifrice et pareil c'était impossible du coup je donne le batonnet prozym essai de voir peut-etre que ...\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 15:47\nProzym c'est la marque? Je donne les trucs à ronger en peau de buffle, les espèces de brosses à dents vertes, et j'ai encore des lamelles à ronger et des dentastix..\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 20:03\nNon, je n'y connais rien, malheureusement, c'est juste ce que j'ai lu.\nTu peux peut-être essayer de lui donner une eau avec très peu de calcaire, comme Volvic ?\nC'est sûr qu'il faut trouver une solution pour Mr Fagin.\nJ'ai lu sur le post à propos de la pub avec un papillon que Choupette disait qu'elle donnait des croquettes d'1cm de diamètre a ses chiens et qu'ils n'avaient aucun problème de tartre. Il faudrait peut-être connaître sa marque de croquettes ?\nEt si au lieu de la brosse qui est trop grosse pour les petits becs de nos toutous tu mettais juste un mouchoir sur ton auriculaire avec un peu de dentifrice pour chien, est-ce que Mr Fagin ne finirait pas par s'habituer à ce que tu lui frottes les dents ?\nRemarque, avec la mienne, je n'ai jamais réussi avec une brosse et je n'ai pas essayé autrement.\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 23:31\nOui si je me rappelle bien Choupette donne des royal canin? Mais une variété particulière si c'est bien ça je n'avais pas trouvé cette gamme en magasin mais je sais plus si c'est elle qui m'avait dit. Pour l'eau calcaire ce n'est pas une mauvaise idée, c'est vrai que chez nous elle est très calcaire et j'ai un filtre à eau alors pourquoi ne pas essayer! Mais il ne risque pas d'y avoir une perte de nutriments ou je ne sais quoi nécessaire à l'organisme?\nSujet: Re: Détartrage Sam 4 Fév 2012 - 23:56\nPour l'eau calcaire ce n'est pas une mauvaise idée, c'est vrai que chez nous elle est très calcaire et j'ai un filtre à eau alors pourquoi ne pas essayer! Mais il ne risque pas d'y avoir une perte de nutriments ou je ne sais quoi nécessaire à l'organisme?\nJe ne sais pas mais il y a des régions de France où l'eau est aussi douce que la Volvic. Les gens ne boivent donc que de l'eau sans calcaire ou presque. Je n'ai jamais entendu dire que ça leur posait des problèmes de santé.\nSur Internet, j'ai lu qu'un truc qui s'appelle Plaque Off marcherait contre le tartre, pour les chiens. C'est à base d'algues.\nEst-ce que Mr Fagin boit après avoir mangé ? Le faire boire pourrait lui "rincer" les dents ?\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 0:10\nOui j'ai essayé le plaque off ainsi que les algues caniflora! La totale lol mais aucun résultat. Ou s'il y en a eu un je n'ose pas imaginer comment auraient été ses dents autrement... Mais je vais en racheter pour réessayer, peut être qu'en combinant tout en même temps on va y arriver. Je vais continuer à essayer de lui brosser les dents, peut être que je finirai par réussir\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 6:07\nOui c'est la marque sa aide a la digestion aussi le dentifrice c'est la meme marque\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 7:06\nje donne du CC de chez rc , c'est "l'entrée de gamme " comme on dit poliment pour ne pas dire le bas de gamme de chez rc , en boutique çà tourne autour de 30 euros les 20 kgs . je sais si on lit la compo. les puristes vont sauter au plafond , mais les miens pètent le feu , sont tous champions , ont un beau poils et font de beaux bébés en bonne santé ... j'avais pris çà qd nous étions au chomage pd 3 ans , donc si nous ne mangions pas du foie gras ... eux non plus , et je me suis rendue compte que leur poids se stabilisait , et qu'ils étaient en bonne santé les selles sont bien , ils n'en font ni plus ni trop peu et surtout la taille des croquettes aide à faire sauter des plaques de tartre .\nSi le CC ne te plais pas , passe à la croquette pour chiens moyen , voir gros chiens . Une fois j'avais eu des échantillons de rc pour bergers allemands , ils en ont raffolé car ils prenaient leur temps pour l'exploser . Prend des petits sacs et fais des essais , tu garderas la croquette la plus dure possible qu'il arrive à éclater et dont il aime la saveur .\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 9:05\nLe CC? Ca s'appelle comme ca?\nLa dernière fois que je voulais changer de croquettes j'avais pris des rc et fagin les boudait ça a été dur de lui faire finir le paquet, mais c'était des petites. Mais celles que je dis, de la taille d'un demi bouchon, c'est quand même trop gros non? Ici c'est nul, on trouve des échantillons nulle part j'ai demandé hier ils n'avaient rien, c'est pourquoi j'ai direct du acheter un paquet de 3kg sans savoir s'il aimait, et sans pouvoir quand même tester les énormes que j'etais partie pour acheter\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 10:49\nEn y allant petit à petit, j'espère que tu vas réussir à brosser les dents de Mr Fajin. Une fois, j'avais lu que deux fois par semaine suffisaient.\nPeut-être pendant quelques jours, l'habituer à ce que tu lui touches les dents, puis les toucher avec un peu de dentifrice, etc.\nMême notre auriculaire est gros par rapport à leur petites dents. Avec un coton tige, peut-être ? L'idéal, ce serait de trouver une brosse à dents pour poupées, si ça existe !\nje sais si on lit la compo. les puristes vont sauter au plafond , mais les miens pètent le feu , .\nC'est hors sujet mais la chatte de mes parents ne voulait que des Frieskies au poisson du supermarché. Elle a vécu vingt ans (âge auquel elle grimpait encore aux arbres...) et elle est juste allée chez le vétérinaire pour de petites blessures mais pas pour des maladies.\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 10:56\nHaha c'est drôle, pour mon chat pareil il avait tout le temps la diarrhée, même avec les croquettes du veto. Quelqu'un nous a parlé des Friskies et ça a marché, plus jamais il a été malade c'est drôle quand même!\nSinon pour Fagin il me laisse regarder ses dents sans problème mais s'il voit que j'ai quelque chose dans la main alors il panique!\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 11:10\nSinon pour Fagin il me laisse regarder ses dents sans problème mais s'il voit que j'ai quelque chose dans la main alors il panique![/quote]\nils vendent des doigtiers chez les vétos que l'on met sur l'index et qui servent à frotter la gencive et les dents .si tu le parfumes au jus de viande ou de poulet auparavent , il en aura moins peur et petit à petit tu pourras peut être ne t'en servir que pour frotter ?\nMes croquettes se nomment club croc et TOUS les chiens sans exception à ce jour bien sûr en raffolent , mes chiots foncent dessus dès qu'ils sortent du parc et laissent le spécial chiots ;-(\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 11:30\nAh oui alors c'est bien ce que je me rappelais, on n'en a pas ici...\nPour le doigt je vais essayer, peut être que ça va marcher mais ils sont énormes ceux que j'avais trouvés, la vendeuse m'a plutôt recommandé une brosse pour enfants\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 15:53\nPetite parenthese pour le friskies dom est tombé malade il doit manger des croquettes hypo il a du cholesterol et du diabete a cause de cette marque ...\nLes brosses pour enfants etant toutes petites sa irais surment mieux mais pour la confirmation au lof les examinateur on dû lui regarder les dents et peut-etre les toucher il n'a rien dit ?\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 16:01\nBah pour les croquettes ce son les seules qui lui restaient dans l'estomac alors on a préféré ça, un peu plus et on le perdait, il avait trop maigri à cause d'une bactérie... Non pour l'expo je ne sais plus si il lui a examiné les dents, mais il n'a rien dit.\nSujet: Re: Détartrage Dim 5 Fév 2012 - 16:06\nSujet: Re: Détartrage Lun 6 Fév 2012 - 18:55\nSujet: Re: Détartrage Lun 6 Fév 2012 - 20:35\nmoi depuis que j'utilise ça plus de tartre, mais il faut en faire pas beaucoup à la fois et doucement :


Alzheimer : Michel-Edouard Leclerc a "vu son père s’infantiliser"\n13h00, le 22 septembre 2018 , modifié à 13h17, le 22 septembre 2018\nLe patron du groupe Leclerc se mobilise en faveur de la recherche contre la maladie d’Alzheimer, en lançant une "Opération orchidée" dans ses magasins. Il se confie à Europe 1 sur la "dégénérescence" de son père.\n"C'est toujours une histoire personnelle au départ". Invité d’Europe 1 samedi, Michel-Edouard Leclerc s’est confié sur les raisons de son engagement en faveur de la recherche contre la maladie d’Alzheimer. Le groupe Leclerc vient en effet de lancer "l’opération orchidée" : jusqu’au 30 septembre, ceux qui le souhaitent peuvent acheter en magasin une orchidée (8 euros 95), et les bénéfices seront reversés à la Fondation pour le recherche contre la maladie.\n"J'ai vu la violence en lui". "J'ai vu mon père atteint d'Alzheimer, je l'ai vu perdre toutes notions des choses. J'ai vu sa révolte lorsqu'il a pris conscience qu'il n'y avait pas de voie de Salut. J'ai vu la violence en lui, je l'ai vu s'infantiliser, tromper son monde parce qu’il était bon orateur", se rappelle Michel-Edouard Leclerc, fils d‘Edouard Leclerc, fondateur de la chaîne de supermarchés éponyme. "Les journalistes et les gens autour de lui ne se rendaient pas compte, car il a une tchatche pas possible. […] Il trompait son monde mais il ne répondait pas aux questions, il ne les comprenait même pas. […] Ça a été une dégénérescence très lente", détaille l’actuel dirigeant du groupe au micro d’Europe 1.\n"J'ai vu le drame de ma mère". Michel-Edouard Leclerc insiste sur l’urgence de lutter contre une maladie qui n’a toujours pas de remède, et qui frappe bien au-delà des malades eux-mêmes. "J'ai vu le drame de ma mère, qui a accompagné mon père. Ça ne touche pas que la vie des personnes affectées, ça touche la vie des épouses, des enfants, des proches", martèle-t-il. Et de poursuivre : "Même le cancer, on peut espérer une rémission, une guérison. Je ne dis pas que c'est la panacée mais il y a des moyens de lutte. Alzheimer, la dégénérescence, une fois que c'est partie, il y a comme l’impression d’un compte à rebours. Il y a une violence dans l'inéluctabilité des choses".\n450.000 euros récoltés l'an dernier. L’an dernier, l’opération orchidée avait permis de lever 450.000 euros de fonds pour la Fondation. Une goutte d’eau face à l’immensité du défi que pose la maladie. Mais qui pourrait apporter une pierre non négligeable à l’édifice de la recherche, ô combien importante pour les patients et leurs proches.\nPar Gaétan Supertino avec Fabienne Le Moal


Saturday, 03-Oct-20 11:46:34 UTC\nOde a la joie beethoven paroles\nVous pouvez jouer la musique de Hymne européen (Ode à la joie) en public (pour chant, ou bien arrangée pour tout autre instrument de votre choix), et ce sous les mêmes conditions. Vous avez des partitions libres de droits dans vos cartons? Vous pouvez les proposer facilement (et gratuitement, évidemment) par ici! Les partitions disponibles sur ce site sont téléchargeables gratuitement, et sont utilisables dans le cadre de leur licence. Si vous estimez qu'une partition ne devrait pas se trouver sur ce site, contactez le webmestre et elle sera aussitôt retirée.\n1 janvier 2007 1 01 / 01 / janvier / 2007 00:11 Ce magnifique poème a été écrit par Schiller en 1786. Beethoven a manifesté l'intention de composer une œuvre à partir de l'Ode à la Joie de Friedrich von Schiller au moins dès 1792. Dès 1799, Beethoven avait esquissé une mise en musique, sous forme d'un Lied, puis s'était servi de quelques vers dans Leonore-Fidelio, son opéra. Enfin, Beethoven adapta le texte pour sa neuvième symphonie. A cette fin, il s'inspira d'une version de 1803 révisée par Schiller lui-même. Cette Ode à la Joie correspond aux idéaux fraternels de Beethoven, d'où sa volonté incessante de composer une œuvre à la mesure de l'écrit de Schiller: « L'homme est pour tout homme un frère – Que tous les êtres s'enlacent! - Un baiser au monde entier! ». Ode à la Joie O Joie, belle étincelle divine, Fille de l'Elysée, Nous entrons ivres d'enthousiasme, Ô Déesse, dans ton sanctuaire. Tes charmes réunissent Ce que la mode sépare; Tous les hommes deviennent frères Là où tes douces ailes reposent.\nOde de joy beethoven\nHymne à la joie beethoven orgue\nPlan nichoir rouge gorge\nBeethoven - Ode à la joie | WatZatSong\nLes Freres Petards - Vidéo Dailymotion\nValses Viennoises En Français Ligne De Mélodie, Paroles et Accords Universelles Entrez Dans La Danse N°8? Valses Viennoises Partitions Pour Ligne Mélodie, Paroles Et Accords. Selon Un Traité Chorégraphique De 1782, Weber Fut Un Des Premiers, Avec Son Oeuvre `L'invitation A La Valse`, A Utiliser La … 11. 15 EUR - vendu par Note4Piano Délais: 3-6 jours - En Stock Fournisseur Four by Four: Clarinet Ensemble: Instrumental Work De Haske Publications For four clarinets-Les quatre danses qui composent ce recueil ont pour objectif de compléter la formation individuelle et surtout de faire aimer la musique d? ensemble. Les arrangements ont été spécialement écrits pour des clarin… 11. 25 GBP - vendu par Musicroom GB Ludwig van Beethoven Marc-Antoine Charpentier: Ode to Europe: Concert Band: Orchestre d'harmonie De Haske Publications La nouvelle collection Essential Elements European Band Series offre des pièces de concert idéales pour les Classes d? Orchestre les Orchestres Juniors ou les Orchestres à l?


La Luss | Ethique et TIC’s : quelle éthique dans l’utilisation des nouvelles technologies en matière de santé?\nÉTHIQUE ET TIC’S, PARLONS-EN !\nLa LUSS a le plaisir de vous inviter à son prochain Jeudi de la LUSS sur le thème « Éthique et TIC’s Ou, quelle éthique dans l’utilisation des nouvelles technologies en matière de santé ? » qui aura lieu le 21 juin de 18 à 21h à la LUSS Namur (Avenue S. Vrithoff 123 – 5000 Namur)\nQuels enjeux éthiques pour le citoyen et pour la société se cachent derrière ces technologies et leur utilisation dans le domaine de la santé ? Autant de questions auxquelles nous tenterons de répondre lors de cette soirée débat avec le professeur Jean-Marc Van Gyseghem – Directeur de recherche au Centre de Recherches Information, Droit et Société (www.crids.eu) au sein de l’Université de Namur.\nCette rencontre est ouverte aux associations de patients et de proches mais aussi à toute personne intéressée.


hors sujet 2 - Page 2 -\nNous sommes le 07 juil. 2020, 00:43\nMessage non luPosté : 07 mai 2005, 12:31\n"Je te suis dans ton implacable logique. Donc, soit.\n1) Puisqu'il n'y a sur les lieux qu'un seul véhicule, celui de Ranucci, l'assassin est donc venu à pied avec la fillette (à moins que Ranucci l'ait pris en stop avec la petite après avoir occasionné l'accident).\nDans l'hypothèse où il ne l'a pas pris en stop, l'assassin et la fillette arrivent au pied de la colline, et passent tranquillement devant Ranucci qui, déjà, une ou deux minutes à peine après avoir causé l'accident dort du sommeil du juste.\nSur ces entrefaites arrivent les Aubert.\nIls aperçoivent un homme qui s'enfuit avec la petite.\nIls s'approchent du véhicule dont ils notent soigneusement le n° minéralogique, mais ne se rendent pas compte que le conducteur dort comme un loir !\n2) Deuxième hypothèse :\nLes Aubert se trompent et les gendarmes ont raison. L'homme en question est totalement étranger à l'histoire. Il n'a pas la fillette à ses côtés. Il porte simplement un "paquet volumineux" que l'on ne retrouvera jamais !\nMessage non luPosté : 07 mai 2005, 13:35\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 01:40\nRien ne permet d'affirmer qu'il n'y avait qu'un véhicule sur les lieux. J'ai montré que la simca pouvait fort bien se trouver à ce moment là dans le Clos de la Doria comme l'indique ce schéma :\nL'assassin est forcément arrivé avant Ranucci puisque l'on situe l'enlèvement autour de 11h, 11h15 et donc il se trouvait sur les lieux à 11h40, 11h50.\nRanucci arrive lui à 12h15.\nDonc quand l'assassin a traversé la route, il n'y avait personne.\nLes Aubert ne se sont pas aperçu que Ranucci était encore dans sa voiture parce que justement, ils sont restés derrière la peugeot, à une vingtaine de mètres et qu'ils ont fait aussitôt demi-tour, en croyant que la silhouette qu'ils apercevaient dans la colline était le conducteur.\nIl n'y a rien qui ne colle pas là-dedans. Quand les Aubert racontent qu'ils sont à deux mètres de la gamine qui parle d'une voix fluette, c'est incohérent. Alors...\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 09:20\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 11:12\nEt c'est par la piste suivie par le chien qu'on sait qu'il est remonté jusqu'à l'aplomb du lieu où l'on découvre le corps, et c'est parce que la piste s'arrête trente mètre au-delà qu'on peut en déduire qu'il a traversé la route et que sa voiture, la simca 1100 aperçue par Jean Rambla, Eugène Spinelli, Mme Mattéi et un témoin aux cerisiers, se trouvait de l'autre côté.\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 11:41\nQuand vous arrivez quelque part pour vous garer vous devez donc obligatoirement connaitre déjà les lieux ? c'est celà gihel ?\nben alors vous devez pas sortir souvent de votre rue sinon commet faites-vous ? vous allez et venez pendant 10 jours dans une rue avant de vous décider a tenter de vous garer ?\nMoi quand j'arrive a n'importe quel endroit en voiture je suis capable de me garer immédiatement, marche AR créneau, tout ce que vous voudrez !\nelle est bien bonne celle là ...maintenant il faut connaitre parfaitement un endroit pour y ciculer et s'y garer !\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 11:48\nPour penser effectuer une manoeuvre de cette nature, bien évidemment qu'il faut connaître.\nEt avoir une autre idée en tête que celle de réparer sa bagnole.\nPersonne n'aurait l'idée de rentrer dans un tunnel comme cela, surtout s'il faut redresser une aile : il faut de la lumière !!!!\nLa personne qui fait rentrer le véhicule en marche arrière dans ce tunnel ne peut pas être Ranucci.\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 11:50\nJe prévois votre réponse :\nil fallait savoir que la galerie existait\nVous n'avez jamais (ou vous en étes incapable) imaginez que ranucci se soit arrété a proximité du tas de tourbe et qu'il soit allé faire une reconnaissance , et pourquoi cette rexconnaissance ? il fallait qu'il se cache mais ou ?\nil arrive en haut de la cote mais il apercoit des constructions, constructions = habitations= habitants\nalors ou voulez-vous qu'il aille ?\nil ne peut plus revenir sur la route, alors il regarde autour de lui et il trouve la galerie, il descend le chemin qui y méne et trouve que ca lui convient\nil est méme possible qu'il n'est pas eu l'intention de rentrer dans la galerie mais d'y rester a l'entrée, on ne peut pas voir la voir d'en haut\nMais voilà qu'il se retrouve DANS la galerie (fausse manoeuvre,glissade...)\net donc coincé\nQuans a la marche AR il est débile de penser que le "type" est imaginé de descendre la 304 en marche AR dans le chemin, pour quoi faire ? pour que le pauvre con qui est sur la banquette AR puisse plus facilement sortir de la galerie et remonter le chemin ?\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 11:52\nJe vois pas où se situe le problème.\nMoi qui suit une chêvre au volant, je pourrais me garer en marche arrière dans c'te champi.\nDe plus, il est plus facile de se garer en marche arrière qu'en marche avant.\nIl était pas triso, Ranucci!\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 11:54\nAh oui...le chien qui perd la piste sur 10 métres alors qu'il vient de la suivre depuis 1500 m !\nles effluves d'essence qui bloquent la piste qui traversent la route...\nGihel ,allez donc dans une gendarmerie (mais surtout ne dites pas votre nom ni qui vous étes car avec toutes les noms d'oiseaux dont vous les avez affublés...!) et posez leurs la question\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 11:56\nPour pouvoir repartir tout simplement. Il laisse la voiture parce qu'elle s'est embourbée, mais elle ne se serait pas embourbée, il serait reparti avec et il serait remonté en voiture récupérer la simca 1100.\nTout ce dont vous parlez, je veux bien mais c'est où dans les aveux ? Nulle part.\nLe seul moment où il sort de la voiture, c'est pour jeter son couteau sil'on en croit les aveux, sinon, il ne parle pas de reconnaître les lieux ni rien du tout de cet ordre.\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 11:58\nAh bon, c'est plus facile de faire trente mètres en marche arrière qu'en marche avant dans une pente descendante en courbe ?\nSi vous ne le voyez pas, moi je le vois le problème. Mais bon quand on a envie de ne surtout pas réfléchir...\nCe n'est pas mon problème c'est le vôtre.\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 12:00\nAh je pense qu'ils me confirmeront que les effluves odorantes disparaissent sur une route en deux jours suite à la circulation, tandis qu'elles persistent dans le fossé où personne ne les trouble. Je n'ai même pas besoin de leur poser la question pour être sûr de la réponse.\nMessage non luPosté : 08 mai 2005, 12:03\nGihel, je suis sûre que si j'étais un mec, tu me causerai autrement, mais bon.....\nRanucci s'est planqué dans la champi, qu'il ne connaissait pas, sinon, ce con se serait pas embourbé.\nChanger une roue, il pouvait le faire sur le bord de la route.\nVoyez-vous, je peux tout aussi être désagréable, très facile, et même pire...


LOGOS & identité visuelles - Krank Du / Design & Photo-Graphisme\nIdentité visuelle de l'AGENCE MAUVE\nLogotype & charte graphique d'Anthropos\nRéalisation d'une charte graphique pour Anthropos, une entreprise de coaching, formation et conseil en développement. La création originale du logotype et de la typographie ont ensuite donné naissance à la carte de visite (en utilisant une photographie signée Krank Du) , puis la carte de vœux 2021 ainsi que divers éléments de papeterie et visuels pour le web.\nIdentité visuelle de la REDADEG\nCréation d'une signature graphique\nAffiche de la Redadeg 2020 et autocollant adapté de ce visuel.\nDéclinaison du visuel de l'affiche en t-shirts\nDéclinaison en badgeS\nGIFs d'annonce pour les réseaux sociaux\ndépliant de présentation (ÉCLATÉ)\nadaptation des visuels en tatouages éphémères\ncréation du logo de la fête des fraises\nCréation d'un logo pour le cercle celtique de carhaix\nL'identité visuelle du Cercle Celtique AHES reprend le dessin d'une tête de taureau, symbole de la ville de Carhaix. Le visuel apparaît par le jeu graphique d'un couple de danseurs, en soulignant certains de leurs traits.\nRecherche et développement d'une identité visuelle pour le Bagad Penhars\nCi-dessous : planches de recherches en vue du choix et de l'élaboration du logo et de la typographie.\nRecherche d'une identité visuelle pour le championnat de sonneurs de Gourin\nImpression de l'illustration sur bâche noire en fond de scène\nCréation d'une identité visuelle pour la marque PILHOUZEN\nPilhouzen est une marque bretonne créée en 2009 par Rozenn Jodin créatrice et modéliste de formation.\nFabriqués de façon artisanale à Plougastel-Daoulas, ses vêtements de dessus & accessoires pour adultes et enfants sont réalisés dans des tissus chauds, doux et le plus souvent colorés.\nRéalisation d'un logo : BRETAGNE 5/5!\nRéalisation de l'identité visuelle du bagad plougastell\nIdentité Visuelle du restaurant "Saturne" à Paris\nRéalisation d'une typographie pour l'identité visuelle du restaurant SATURNE à Paris\nIl s'agissait de penser un graphisme unique pour incarner le concours musical "Duos Libres". Cet événement, dans le cadre du concours de musique traditionnelles de Gourin (56), amène depuis 10 ans les musiciens à s'affronter dans des duos les plus imprévus qu'ils soient.\nRéalisation de cartes de visites par découpe laser\nCréation d'une identité visuelle et d'une enseigne pour Pierrick Le Roux\nPionnier dans la redécouverte des algues marines, Pierrick Le Roux les cuisine depuis 1983. Enseignant la cuisine aux particuliers et rédigeant de nombreux livres et recettes, ce cuisinier novateur a rapidement vu l'intérêt d'unir ses différentes activités sous une seule et même identité visuelle.\nIdentité Visuelle pour VINIBRATO, Maison de Négoce en Vins\nCréation d'une identité visuelle pour la maison de négoce en vins, Vinibrato. Ce logo réinterprète une illustration présente sur de nombreux canthares, où l'on aperçoit Dionysos à bord de sa barque, avec en guise de mat un pied de vigne. Le logo a ensuite été décliné pour divers supports...\nIdentité visuelle WEZENN Elagage\nLOGO DE RIBL AN ELORN, Association de formation musicale basée dans la région brestoise\nLOGO de la CIGA, Association à caractère événementiel et culturel\nACCUEIL / QUI EST KRANK DU? / VOTRE PROJET / COMMUNICATION VISUELLE / illustrations / logos & Co / affiches/CD / animations\nPHOTOGRAPHIE / CONTACT / DEVIS / BREZHONEG


Lyon People n°200. Découvrez le palmarès de nos 201 couvertures ! -\n08/10/2019 | DERNIERE MINUTE | 0 |\nPatrick Bruel en une du premier numéro de Lyon People – Photo Marco\nPaul Bocuse, Gérard Collomb, Olivier Ginon, Jean-Michel Aulas, Laurent Gerra ? Qui détient le record de couvertures de Lyon People ? Réponse ce mois-ci.\nA l’occasion de ce numéro 200, nous publions un dossier spécial regroupant les 201 couvertures de Lyon People. Du numéro 1 Patrick Bruel en mode paparazzi jusqu’au dernier adieu de Paul Bocuse, façon Libé, vous saurez tout sur les coulisses de votre magazine préféré. Vous découvrirez également le palmarès des Lyonnais qui ont fait le plus souvent la couverture de Lyon People depuis 20 ans. Cerise sur le gâteau, nous vous donnons des nouvelles de chaque personnalité ayant fait la une. Un palmarès qui se double de celui des photographes qui collaborent avec notre magazine depuis sa création.\nQui va faire la Une ?\nQuand elle n’est pas programmée depuis belle lurette, la question de la couverture revient se poser deux semaines avant le bouclage. C’est à ce moment-là que se dégage le sujet le plus important du futur numéro. N’étant que ponctuellement vendu en kiosque, Lyon People n’a pas besoin d’une couv’ racoleuse pour appâter ses 100 000 lecteurs mensuels. Notre ligne éditoriale, claire comme de l’eau de roche, privilégie l’humain, et c’est donc en toute logique qu’une personnalité – très souvent pas prévenue à l’avance – a le privilège de figurer sur 20 000 exemplaires de papier glacé. Mais encore faut-il se mettre d’accord sur l’heureux élu !\nLes deux unes du spécial Sainte Foy. Quelle est la couverture de Marco et celle de Nico ? A vous de deviner ! – Photos Fabrice Schiff et Saby Maviel\n201 couvertures pour 200 numéros\nA l’heure du café, la discussion s’engage avec mon ami et associé Nicolas Winckler, et il peut arriver que le soir venu, la question n’ait toujours pas été tranchée. Sur les 201 couvertures publiées, une seule n’a pas pu faire l’objet d’un accord. Il s’agit du magazine consacré au patrimoine de Sainte Foy Les Lyon. Il fut alors décidé – en guise de jugement de Salomon – de couper le tirage en 2. C’est ainsi que pour le numéro 131, notre imprimeur Jacques Chirat a stoppé les machines à 10 000 exemplaires pour caler la seconde couverture également tirée à 10 000 exemplaires. Une édition doublement collector donc !\nEtienne Blanc en privé\nA découvrir également dans ce numéro, le retour de Jean-Paul Lucet ; l’envol de l’artiste Plum et le Mama Chow de Sylvie Huynh. Et en exclusivité, le portrait d’Etienne Blanc qui a reçu Lyon People dans son appartement de Saint Jean. L’occasion de faire plus ample connaissance avec le candidat de la droite et du centre né à Givors qui brigue le fauteuil de maire de Lyon en mars prochain. Et à la fin du magazine, un volumineux cahier évènementiel regroupant les 21 plus belles soirées de la rentrée (Inauguration de la Brasserie du Louvre, les 100 ans du Golf Club de Lyon, la Biennale d’Art contemporain avec Cardinal, le salon de l’automobile, le Club des Clubs…).\nBonne lecture à toutes et à tous, et merci pour votre fidélité.\nLyon People n°200 – octobre 2019 – 144 pages\nDiffusé chez nos 1200 dépositaires de Lyon et du Grand Lyon\nPrécédentBanque Palatine. Wine and Jazz au Prieuré de Taluyers\nSuivantInauguration. Lugdunum Construction construit son histoire


Gabon: Mastria d’AJANE, en gestation pour l'épanouissement des jeunes | Africa Foot United\nGabon: Mastria d’AJANE, en gestation pour l’épanouissement des jeunes\nL’Association des Jeunes d’Assock Nkolayop Eba (AJANE) pense à l’épanouissement des jeunes de la localité. Un centre de formation agréé pour les jeunes d’Ondogo sera bientôt inauguré, selon les responsables.\nMastria d’AJANE sera composé de trois catégories de jeunes (benjamins, minimes et cadets). Ce centre de formation voulu par ses responsables, se veut un cadre d’épanouissement pour les jeunes de Libreville. Une initiative de Erick Akuè Ndoumou, entraîneur licence B Caf dans le quartier Ondong, dans le 6ème arrondissement de Libreville, informe Gabon All Sports.\n« Ayant constaté dans mon quartier que les jeunes passent leur temps à ne rien faire de concret de leurs journées alors que nous avons des petits terrains où ils peuvent s’occuper en jouant au ballon, l’idée m’est venue de créer ce centre de formation qui pour le moment concerne encore rien que les jeunes du quartier Ondogo afin d’assurer à ces enfants-là un avenir meilleur dans le domaine du football », a indiqué le promoteur au journal local.\nLa phase de détection a commencé avec un staff composé de Désiré Mfa Mintsa, Jean-Robert Ollo Mba, François Enzeigne et Geoslin Edou Bekui, tous détenteurs de la licence B Caf.\n« Nous avons trouvé une quarantaine de jeunes qui ont été répartis en trois équipes et on a fait jouer les matchs de 20min. De là sortiront ceux qui seront retenus dans la catégorie benjamins et minimes, ensuite nous passerons à la catégorie cadet », a expliqué Désiré Mfa Mintsa.\nUne bonne nouvelle pour les tous jeunes de Ondong.


Ces psychopathes qui nous gouvernent - Belgique Loisirs\nAccueil Ces psychopathes qui nous gouvernent\nAchat livre : Ces psychopathes qui nous gouvernent - Jean-Luc Hees à prix réduits\nIls sont psychopathes, sociopathes, névropathes... Ils règnent sur les pays du Caucase ou d'Amérique Latine, sur la Corée du Nord ou sur les Philippines. Ils régissent de façon extravagante la vie de la Maison Blanche ou du Kremlin. Ils violentent et massacrent leur propre peuple comme en Syrie. Ils abaissent leur fonction comme en Thaïlande, tourmentent leurs opposants comme aux Maldives. Ce sont les Princes qui nous gouvernent, des Princes de l'immoralité, du dérèglement, du narcissisme, de l'aberration, parfois de la démence, de la violence et de son corollaire, la cruauté. Certains sont catalogués par l'ONU comme « criminels de guerre », ou encore ils sont accusés de « génocide ». Le monde les regarde oeuvrer, souvent sans réagir. Tous n'ont pas commis les mêmes atrocités. Le Président Philippin se vante d'avoir, à plusieurs reprises, tué de ses mains. Donald Trump n'a jamais pointé son revolver sur un passant New Yorkais. Mais tous ces personnages affichent certaines caractéristiques troublantes. Et ils présentent un risque pour la planète. Bachar al-Assad, avec un demi million de morts sur la conscience, peut mettre le Proche Orient à feu et à sang. Kim un-Jung peut rayer de la carte une ville américaine ou japonaise. Et Donald Trump qui demande souvent à ses conseillers militaires à quoi peut bien être utile une bombe atomique si on ne peut pas s'en servir n'est guère rassurant. En dépit des tragédies du XXe siècle, la longue lignée des monstres se renouvelle dans un monde globalisé, où jamais l'information n'a autant circulé.\nAchat Ces psychopathes qui nous gouvernent - Jean-Luc Hees\nEvaluations (0) Ces psychopathes qui nous gouvernent Jean-Luc Hees


Le 18/06/2008 à 10:22 par Clément Solym\n18/06/2008 à 10:22\nC'est lundi soir que Mario s'est éteint, âgé de 86 ans, dans la ville d'Asiago au nord de l'Italie, selon l'agence Ansa. Ayant combattu dans toute l'Europe au cours de la Seconde Guerre mondiale, Mario s'est rendu célèbre pour le récit de ses aventures, dans Le sergent dans la neige. Il y décrit la fin de la guerre pour quelques Italiens, perdus dans une Russie gelée, quand l'Italie et l'Allemagne sont en pleine débâcle.\nPour Primo Lévi, l'existence de cet homme fut un miracle et un paradoxe. Non violent il eut à endurer la guerre, toutes celles de son siècle, mais également parce qu'il « est parvenu à conserver son authenticité dans notre époque de fous ».\nPour Giorgio Napolitano, c'est « une des figures les plus représentatives de la littérature italienne contemporaine » qui disparaît dont les récits s'inspirèrent « des douloureuses expériences de la prison ».\nEt les hommages se succèdent, comme celui de Walter Veltroni, qui estime qu'un « homme extraordinaire s'en va » après avoir décrit « l'histoire de notre pays vue par les paysans, les malheureux soldats opprimés par la guerre, les gens de la montagne ».\nMardi, il fut enterré et seul un cercle de proches, dont sa veuve Anna, était présent. Le public l'avait vu pour la dernière fois en octobre à la télévision : « C'est la dernière fois que je descends de mes hauts plateaux », déclarait-il.