Un nouveau clone et une nouvelle méthode pour la production\net la purification de l’entérotoxine STb d’Escherichia coli\npar Maud Kerhoas\nMémoire présenté à la Faculté de médecine vétérinaire\nen sciences vétérinaires option microbiologie\npMAL-p via PCR. Par la suite, deux constructions plasmidiques ont été\nrealisées à partir de ce nouveau vecteur, nommé pMAL-STb. Dans un premier\ntemps, un marqueur hexahistidine (His\n) a été ajouté entre malE et estB, et\ndans un deuxième temps, un marqueur décahistidine (His\n) a été placé en\namont de malE. La séquence signal de la protéine liant le maltose (MBP)\ndirige l’exportation de la protéine de fusion du cytoplasme vers le périplasme,\noù l’entérotoxine STb acquière sa conformation active. MBP est également\nreconnue pour améliorer le rendement et la solubilité de la protéine passagère\ntandis que le marqueur histidine, connu comme étant le meilleur marqueur\nd’affinité pour la purification protéique, facilite sa purification jusqu’à\nhomogénéité. De plus, les gènes fusionnés sont sous le contrôle du promoteur\n), un promoteur fort et inductible. Suite à l’induction par l’IPTG, la\nsouche recombinante exprime une protéine d’environ 48 kDa, qui est\nfacilement identifiable par électrophorèse à partir du surnageant obtenu via\nchoc osmotique. Une séquence encodant un site de clivage spécifique au\nfacteur Xa est présente dans le plasmide afin de séparer les marqueurs MBP et\nhistidine de STb. Le clivage de la protéine de fusion avec le facteur Xa libère\nMBP (42 kDa) attachée au marqueur histidine et un polypeptide de 5.2 kDa,\ncorrespondant au poids moléculaire de STb mature. Avec cette méthode, nous\nvisons à obtenir une méthode plus efficace pour la production et la\npurification de STb.\nMots-clés : La protéine liant le maltose (MBP), Hexahistidine (His\nPCR. Afterward, two plasmid constructs were realized from this new vector,\nnamed pMAL-STb. Firstly, a hexahistidine tag (His\n) was added between\nmalE and estB and secondly, a decahistidine tag (His\n) was placed upstream\nof malE. The signal sequence of maltose-binding protein (MBP) directs the\nexport of the fusion protein from the cytoplasm to the periplasm, where the\nenterotoxin STb acquires its active conformation. MBP is also known to\nimprove the yield and solubility of the passenger protein while the histidine\ntag, viewed as the best affinity tag for protein purification, facilitates its\npurification to homogeneity. Furthermore, the fused genes are controlled by\nthe tac promoter (P\n), a strong inducible promoter. Following IPTG\ninduction, the recombinant strain expressed a protein of approximately 48\nkDa, which is easily identified from osmotic shock fluid following\nelectrophoresis. A sequence encoding a factor Xa cleavage site is present in\nthe plasmid to separate MBP and histidine tags from STb. The cleavage of the\nfusion protein with factor Xa generates the maltose-binding protein (42 kDa)\nattached to the histidine tag and a polypeptide of 5.2 kDa, corresponding to\nthe molecular mass of mature STb. With this method, we aim at obtaining a\nmore efficient way to produce and purify STb.\nKeywords : Maltose binding protein (MBP), Hexahistidine (His\n), Escherichia coli, STb enterotoxin, production,\nLISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS ... xi\nREVUE DE LITTÉRATURE ... 4\n1 Escherichia coli ... 5\n1.1 Généralités ... 5\n1.2 Classification des E. coli pathogènes ... 6\n1.2.1 Les EPEC ... 7 1.2.2 Les EHEC ... 7 1.2.3 Les EAEC ... 8 1.2.4 Les EIEC ... 9 1.2.5 Les DAEC ... 10 2 Les ETEC ... 11 2.1 Généralités ... 11 2.2 Épidémiologie ... 11 2.3 Pathogenèse ... 12\n2.4 Facteurs de virulence associés aux ETEC ... 13\n2.4.1 Adhésines ... 14\n2.4.2 Entérotoxines ... 15\n2.4.2.1 L’entérotoxine thermolabile ... 16\n2.4.2.2 Les entérotoxines thermostables ... 18 2.4.2.2.1 Généralités ... 18 2.4.2.2.2 STa ... 19 2.4.2.2.3 EAST1 ... 21 3 STb ... 22 3.1 Généralités ... 22 3.2 Génétique ... 23 3.3 Biogenèse ... 23 3.4 Structure tridimensionnelle ... 25 3.5 Mécanisme d’action ... 26 3.5.1 Oligomérisation ... 26 3.5.2 Liaison au récepteur ... 27 3.5.3 Altération cellulaire ... 28 3.5.4 Perméabilisation membranaire ... 28 3.5.5 Internalisation ... 29\n3.5.6 Cascade d’évènements proposée ... 31\n3.6 Variant ... 33\n3.7 Intérêt clinique ... 34\n3.8 Développement de vaccins ... 35\n4 Production de STb ... 37\nMÉTHODOLOGIE ... 42\n1. Extraction du plasmide pMAL-STb ... 43\n2. Production de cellules compétentes ... 43\n3. Construction du plasmide pMAL-His6-STb ... 44\na. Digestion du plasmide pMAL-STb par Hpa1 et Kpn1 ... 44\nb. Réaction de polymérase en chaine (PCR) ... 45\nc. Ligation ... 46\nd. Transformation ... 46\n4. Construction plasmidique de pHis10-MAL-STb ... 47\na. PCR ... 47\nb. Transformation ... 48\nc. Vérification de la présence du marqueur décahistidine ... 48\n5. Production de l’entérotoxine STb ... 48\n6. Exposition du marqueur hexahistidine ... 49\n7. Vérification de la présence et de l’identité de la protéine de fusion ... 50\na. Buvardage en point ... 50 b. SDS-PAGE 15% ... 50 c. Immunobuvardage ... 52 RÉSULTATS ... 54 DISCUSSION ... 67 CONCLUSION ... 73 BIBLIOGRAPHIE ... 76\nFigure 1 : Image de microscopie électronique à balayage montrant E. coli. ... 5\nFigure 2 : La pathogenèse des ETEC chez le porc. ... 13\nFigure 3 : Mécanisme d’action de LT. ... 17\nFigure 4 : Mécanisme d’action de STa. ... 20\nFigure 5 : Biogenèse de STb. ... 24\nFigure 6 : Structure tertiaire de STb. ... 26\nFigure 7 : Mécanisme d’action de STb. ... 32\nFigure 8 : Construction des plasmides pMAL-IN et pMAL-STb ... 39\nFigure 9 : Électrophorèse sur gel d’agarose 0,7% du plasmide pMAL-STb extrait à l’aide d’une trousse commerciale (QIAfilter plasmid maxi kit, QIAGEN #12262) et visualisé avec un appareil Alpha Imager mini system (Protein Simple #92-14023-00) ... 55\nFigure 10 : Électrophorèse sur gel d’agarose 1% suite à la digestion du plasmide pMAL-STb par Hpa1 et Kpn1 visualisé avec un appareil Alpha Imager mini system (Protein Simple #92-14023-00) ... 56\nFigure 11 : Électrophorèse sur gel d’agarose 0,8% suite à la réaction de polymérase en chaîne pour la réalisation du plasmide pMAL-His6-STb visualisé avec un appareil Alpha Imager mini system (Protein Simple #92-14023-00) ... 57\nFigure 12 : Résultat de séquençage obtenu suite à la transformation d’E. coli compétentes DH5α avec le plasmide pMAL-His6-STb (plate-forme d’analyses génomiques de l’Université Laval) ... 58\nFigure 13 : SDS-PAGE 15% du fluide de choc osmotique dialysé obtenu à partir de la souche recombinante pMAL-His6-STb et chromatographié sur colonne HisTrap HP en absence et présence d’un traitement à l’urée 8M ... 59\nFigure 14 : Immunobuvardage du fluide de choc osmotique dialysé obtenu à partir de la souche recombinante pMAL-His6-STb et chromatographié sur colonne HisTrap HP en absence et présence d’un traitement à l’urée 8M en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin anti-STb HS24 ... 60\nFigure 15 : Buvardage en point du fluide de choc osmotique dialysé obtenu à partir de la souche recombinante pMAL-His6-STb et chromatographié sur colonne HisTrap HP en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin anti-STb HS24 ... 61 Figure 16 : Électrophorèse sur gel d’agarose 1,5% suite à la réaction de polymérase en\nchaîne pour la réalisation du plasmide pHis10-MAL-STb visualisé avec un appareil Alpha Imager mini system (Protein Simple #92-14023-00) ... 62 Figure 17 : Résultat de séquençage obtenu suite à la transformation de cellules DMT\ncompétentes par le plasmide pHis10-MAL-STb (Laboratoire de génétique vétérinaire à la Faculté de médecine vétérinaire de l’Université de Montréal) ... 63 Figure 18 : SDS-PAGE 15% du fluide de choc osmotique dialysé obtenu à partir de la\nsouche recombinante pHis10-MAL-STb et chromatographié sur colonne HisTrap HP ... 64 Figure 19 : Immunobuvardage du fluide de choc osmotique dialysé obtenu à partir de la\nsouche recombinante pHis10-MAL-STb et chromatographié sur colonne HisTrap HP en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin anti-STb HS24 ... 65 Figure 20 : Buvardage en point du fluide de choc osmotique dialysé obtenu à partir de la\nsouche recombinante pHis10-MAL-STb et chromatographié sur colonne HisTrap HP en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin anti-STb HS24 ... 66\nAAF Aggregative adherence fimbriae\nAC Adénylate cyclase\nAcryl/Bis Acrylamide/Bis-acrylamide ADN Acide désoryribonucléique AE Attaching and effacing\nAIDA-I Adhesin involved in diffuse adherence I AMPc Adénosine monophosphate cyclique APS Ammonium Persulfate\nARNase A Ribonucléase A\nATP Adénosine triphosphate ATPase Adénosine triphosphatase BFP Bundle-forming pilus BSA Bovine serum albumin\nCaCC Canal chlorique calcium-dépendant\nCaMKII Protéine kinase Ca2+-calmoduline-dépendante II CF Colonization factors\nCFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator CT Toxine cholérique\nDA Diffuse adherence\nDAEC Diffuselly adhering E. coli DAF Decay-accelerating factor DTT Dithiothréitol\nEAEC Enteroaggregative E. coli EAF EPEC adherence factor\nEAST1 Enteroaggregative heat stable toxin 1 EDTA Éthylène-diamine-tétraacétique acide EHEC Enterohemorrhagic E. coli\nEhx EHEC toxin\nEIEC Enteroinvasive E. coli EPEC Enteropathogenic E. coli ETEC Enterotoxigenic E. coli\nExPEC Extra-intestinal pathogenic E. coli FITC Fluorescéine isothiocyanate GC-C Guanylate cyclase C\nGMPc Guanosine monophosphate cyclique GMPcPKII Protéine kinase GMPc-dépendante II GTP Guanosine triphosphate\nHAF Hemagglutinating factor His6 Hexahistidine\nHPLC High Performance Liquid Chromatography HRP HorseRadish Peroxydase\nIglC Island Protein C\nIPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IS Insertion sequence\nLA Localized adherence\nLEE Locus of enterocyte effacement LT Heat-labile enterotoxin\nLTB B subunit of heat labile enterotoxin MBP Maltose binding protein\nMNEC Meningitis-associated E. coli MgSO4 Sulfate de magnésium\nNTA Acide nitrilotriacétique OSF Fluide de choc osmotique\nPCR Polymerase chain reaction PDE3 Phosphodiestérase 3 Pet Plasmid-encoded toxin\nPic Protein involved in colonization PGE2 Prostaglandine E2\nPKA Protéine kinase A PKC Protéine kinase C\nPMSF Phényl-Méthyl-Sulfonyle Fluoride\nPTac Promoteur Tac\nRTX Repeats in toxin\nSAAT Self-associating autotransporters SDS Sodium dodecyl sulfate\nSDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ShET1 Shigella enterotoxin 1\nST Heat-stable enterotoxin\nSTa Heat-stable enterotoxin A (or I) STb Heat-stable enterotoxin B (or II) STEC Shiga toxin-producing E. coli Stx Shiga toxin (or Shiga-like toxin) Stx2e Shiga toxin 2e\nTAE Tris-Acétate-EDTA TBS Tris Buffered Saline\nTBS-T Tris Buffered Saline-Tween 20 TEMED Tétra-Méthyl-Éthylène-Diamine TER Résistance électrique transépithéliale TEV Tobacco Etch Virus\nTMB Tétra-Méthyl-Benzidine TSL Toxin-specific locus UPEC Uropathogenic E. coli\nJ’aimerais remercier le docteur Daniel Dubreuil pour m’avoir accueillie dans son laboratoire de recherche ainsi que pour la confiance qu’il m’a accordé afin de mener à bien ce projet de maîtrise. Merci aux organismes subventionnaires d’avoir financé le projet ; le CRSNG, le CRIPA, le GREMIP et la FMV.\nJe remercie aussi Josée Labrie pour son écoute et sa présence, pour son aide et sa patience, tout au long de ma maîtrise et de ce projet.\nJe remercie également tous les membres des autres laboratoires, particulièrement Coralie Goetz pour m’avoir épaulée pendant ces deux années, de par ses judicieux conseils et son énergie positive.\nUn énorme merci à ma famille, spécialement à mon père et ma mère qui ont toujours cru en moi et qui ont toujours été là pour moi, malgré la distance qui nous sépare. Merci 1000 fois.\nFinalement, merci à Sébastien, mon amoureux, pour ses encouragements et son soutien au quotidien, dans les bons comme dans les mauvais moments.\nEscherichia coli est une entérobactérie découverte en 1885 par Theodor Escherich\ndans des selles de nourrisson (Escherich, 1885). Il s’agit d’un coliforme fécal, généralement commensal mais quelques fois pathogène (Lim & al., 2010). Les E. coli pathogènes entrainent quatre différents syndromes cliniques : des maladies entériques, des infections urinaires, des septicémies et des méningites. Ainsi, deux pathotypes sont la cause d’infections extra-intestinales et six pathotypes sont responsables d’infections intestinales (Nataro & Kaper, 1998).\nLes E. coli entérotoxinogènes (ETEC) sont impliquées dans des pathologies chez divers êtres vivants. Chez l’Homme, elles sont impliquées dans des diarrhées infantiles et des diarrhées du voyageur alors que chez les animaux, notamment chez le porc, elles provoquent des diarrhées aqueuses chez les porcelets nouveau-nés et sevrés (Kaper & al., 2004 ; Nagy & Fekete, 2005). Ces infections entraînent la perte annuelle de cinq millions de porcelets dans le monde ce qui représentent 50% des dix millions de porcelets qui meurent annuellement (Gyles, 1994 ; Kovšca Janjatović & al., 2009). Une étude réalisée aux Etats-Unis a démontré que 72,6% des isolats d’ETEC isolées de porcelets diarrhéiques présentaient le gène estB, codant pour l’entérotoxine thermostable b (STb), suggérant l’importance du rôle de STb dans la pathogenèse des ETEC (Francis, 2002 ; Zhang & al., 2007).\nSTb est une entérotoxine thermostable monomérique de faible poids moléculaire encodée par le gène estB retrouvé dans différents plasmides (Fekete & al., 2003 ; Dubreuil\n& al., 2014). Ce peptide de 48 acides aminés contient plusieurs cystéines afin de permettre\nla formation des deux ponts disulfures nécessaires à son activité biologique (Okamoto &\nal., 1993 ; Arriaga & al., 1995). Ainsi, sous sa forme active, STb se fixe au sulfatide à la\nsurface des entérocytes puis une cascade d’événements entraîne la sortie d’ions et d’électrolytes dans la lumière intestinale provoquant des diarrhées aqueuses (Rousset & al., 1998a&b ; Dubreuil, 2012).\nCependant, de nombreuses études sur le mode d’action de STb ont été freinées par la faible quantité de toxine produite par les souches sauvages, le gène estB étant régulé par un promoteur faible. Les chercheurs ont alors tenté de construire différentes protéines de fusion à partir du gène estB afin de produire davantage de STb (Spandau & Lee, 1987 ; Handl & al., 1988 ; Lawrence & al., 1990 ; Urban & al., 1990 a&b). En 1993, le groupe de\nBossé & al. a alors présenté une protéine de fusion dans laquelle était fusionnée le gène\nestB et le gène malE, codant pour la protéine liant le maltose (MBP), contrôlés par le\npromoteur fort et inductible PTac. La fraction MBP permettait alors de solubiliser la protéine de fusion et de transporter cette dernière du cytoplasme au périplasme d’E. coli où les ponts disulfures de la fraction STb étaient formés afin de lui conférer sa conformation biologiquement active (Bossé & al., 1993 ; Nallamsetty & al., 2005). Toutefois, une importante quantité de la protéine de fusion était perdue lors de l’étape de purification par chromatographie d’affinité sur colonne d’amylose. En effet, MBP s’est avérée être une protéine avec un faible potentiel pour la purification due à sa faible affinité pour son ligand, l’amylose (Handl & al., 1993). Ainsi, ce mémoire porte sur l’étude d’un nouveau clone et d’une nouvelle méthode dans le but d’améliorer la production et la purification de STb via la construction d’une nouvelle protéine de fusion à partir du gène estB, combinant les marqueurs MBP et histidine, un marqueur à fort potentiel pour la purification grâce à sa forte affinité pour une matrice d’ions métalliques immobilisés, ici des ions Ni2+ (Nallamsetty & al., 2005).\nDécouverte dans des selles de nourrissons par Théodore Escherich en 1885,\nEscherichia coli est une bactérie anaérobie facultative à Gram négatif et à flagelles\npéritriches de la famille des Enterobacteriacae (Escherich, 1885 ; Neill & al., 1994).\nFigure 1 : Image de microscopie électronique à balayage montrant E. coli. (Réalisée par Shirley Owens, Center for Electron Optic, MSU, USA)\nE. coli est une bactérie commensale commune de la flore intestinale, elle s’établit\ndans le tractus digestif des animaux à sang chaud en bonne santé au cours des premières heures suivant la naissance (Drasar & Hill, 1974) ; chez les mammifères, sa niche se trouve dans la couche de mucus du côlon. Elle entre alors en compétition avec d’autres bactéries prévenant ainsi la colonisation par des pathogènes. Cependant, les mécanismes par lesquels\nE. coli parvient à coloniser l’intestin ne sont pas encore bien caractérisés (Kaper & al.,\nPar ailleurs, il s’est avéré que E. coli n’était pas qu’un commensal, mais aussi un agent pathogène. En effet, certaines souches se sont adaptées par acquisition de facteurs de virulence conférant la capacité de coloniser de nouvelles niches tout en causant différentes pathologies (Lim & al., 2010).\n1.2 Classification des E. coli pathogènes\nLes facteurs de virulence sont souvent localisés sur des éléments génétiques mobiles tels que les plasmides, les transposons et les phages mais ils peuvent aussi être situés sur l’ADN chromosomique, appelé îlot de pathogénicité, provenant d’autres bactéries par un transfert horizontal ou vertical de gènes. Il peut de ce fait exister différentes combinaisons de facteurs de virulence conduisant à divers pathotypes (Lim &\nal., 2010). Les E. coli pathogènes engendrent quatre syndromes cliniques généraux : des\nmaladies entériques, des infections urinaires, des septicémies et des méningites. Ainsi, il y a six pathotypes responsables d’infections intestinales : les E. coli entéropathogènes (EPEC), entérohémorragiques (EHEC), entéroagrégatives (EAEC), entéroinvasives (EIEC), à adhérence diffuse (DAEC) et entérotoxinogènes (ETEC), puis deux pathotypes responsables d’infections extra-intestinales (ExPEC) ; les E. coli responsables des septicémies et des méningites (MNEC) et les E. coli responsables des infections urinaires (UPEC) (Nataro & Kaper, 1998). Les différentes souches d’E. coli pathogènes sont caractérisées par la présence d’antigènes lipopolysaccharidiques (O), flagellaires (H) et capsulaires (K) (Lior, 1996) conférant un sérotype (définis par la combinaison des antigènes O et H) ou un sérogroupe (défini par l’antigène O seulement) particulier (Nataro & Kaper, 1998). Au total, il y a 174 antigènes O et 53 antigènes H décrits pour le moment. L’antigène K n’est plus déterminé de routine alors que l’antigène fimbriale (F) est de plus en plus utilisé, particulièrement pour les souches ETEC d’origine animale (Gyles & Fairbrother, 2010).\nLa pathogenèse des souches virulentes d’E. coli se traduit par l’adhérence au site mucosal, la colonisation de la muqueuse, l’évasion du système immunitaire, la multiplication de la souche virulente et les dommages à l’hôte (Nataro & Kaper, 1998).\n1.2.1 Les EPEC\nLes E. coli entéropathogènes furent les premières souches connues d’E. coli impliquées dans des cas de diarrhée chez l’Homme dans les années 1940-1950. Depuis, ce pathotype est devenu l’une des causes majeures de gastroentérites infantiles dans les pays en développement (Chen & Frankel, 2005). L’adhérence à la muqueuse intestinale est une étape essentielle à la pathogenèse des EPEC. Elle se produit via l’attachement à certains endroits de la cellule (LA - Localized Adherence) via le fimbriae BFP (Bundle-Forming Pilus) codé par le gène bfpA, porté par un plasmide EAF (EPEC Adherence Factor) (Donnenberg & al., 1992). Les lésions histopathologiques associées sont dites attachantes et effaçantes (AE - Attaching and Effacing). Elles sont caractérisées par la destruction des microvillosités de la bordure en brosse de l’épithélium du jéjunum puis par le réarrangement du cytosquelette des cellules épithéliales intestinales formant un piédestal (Moon & al., 1983). Elles sont le résultat de l’expression de plusieurs gènes de virulence localisés sur une région chromosomique de 35 kb appelée LEE (Locus of Enterocyte Effacement) encodant un système de sécrétion de type III, l’intimine, des chaperones, des adhésines, des protéines régulatrices et effectrices. Cette région chromosomique est également présente chez les EHEC (Nataro & Kaper, 1998).\n1.2.2 Les EHEC\nLes premières souches pathogènes d’E. coli entérohémorragiques furent isolées dans les années 1980 suite à des cas de colites hémorragiques associés à la consommation\nprésence de la souche E. coli O157:H7 (Riley & al., 1983). Ce pathotype entraine ainsi des diarrhées aqueuses rapidement suivies de diarrhées sanglantes, aussi appelées colites hémorragiques, et parfois du syndrome hémolytique urémique, caractérisé par une anémie, une thrombocytopénie et une insuffisance rénale aiguë potentiellement fatale (Kaper & al., 2004). Ce pathotype produit les vérocytotoxines VT1 et VT2, aussi appelées shiga-like toxines Stx-1 et Stx-2 et codées respectivement par stx1 et stx2 (Calderwood & al., 1996), ainsi qu’une hémolysine de la famille des RTX (Repeats in ToXin), appelée EHEC hémolysine (Ehly) mais aussi EHEC toxine (Ehx) et codée par le gène ehlyA (Bauer & al., 1996 ; Reid & al., 2000). Un phage possède les gènes codant pour les vérocytotoxines alors que des plasmides portent les gènes codant pour l’hémolysine (Nataro & Kaper, 1998) et des adhésines, telles que ToxB, essentielles à la colonisation de la muqueuse épithéliale de l’intestin (Gomes & al., 2011). Il existe deux types de facteurs de virulence clés associés aux complications. D’abord les vérocytotoxines, elles entraînent l’apoptose des cellules épithéliales du côlon provoquant les colites hémorragiques puis elles circulent dans le sang jusqu’aux reins où elles endommagent les cellules endothéliales pouvant engendrer le syndrome hémolytique urémique. Puis les produits du LEE, comme l’intimine, codée par le gène eae, il s’agit d’une protéine critique pour l’adhésion des bactéries aux entérocytes via la formation de lésions attachantes et effaçantes (Donnenberg\n& al., 1993 ; Kaper & al., 2004).\n1.2.3 Les EAEC\nLes E. coli entéroagrégatives sont reconnues comme étant la cause de diarrhées aqueuses, souvent persistantes et parfois inflammatoires, chez les enfants et les adultes aussi bien dans les pays industrialisés que dans les pays en développement (Kaper & al., 2004). Ce pathotype est caractérisé par l’adhérence agrégative des bactéries à la surface des cellules épithéliales par des fimbriae AAF (Aggregative Adherence Fimbriae I, II et III) formant une structure semblable à des briques empilées (Bernier & al., 2002 ; Czeczulin, 1997 ; Nataro, 1992). Les EAEC adhèrent alors aux cellules du côlon, envahissent le côlon puis y sécrètent des entérotoxines et des cytotoxines telles que Pet\n(Plasmid-encoded toxin), ShET1 (Shigella EnteroToxin 1) et EAST1 (EnteroAggregative heat Stable Toxin 1) ainsi que d’autres facteurs de virulence capables de stimuler la sécrétion de mucus dans l’intestin comme Pic (Protein involved in colonization) (Navarro-Garcia & Elias, 2011). Ce mucus retient les bactéries d’où la formation d’un biofilm bactéries-mucus (Tziporo & al., 1992). Il a été démontré que Pet entraînent le remodelage du cytosquelette induisant des effets cytotoxiques sur les cellules épithéliales intestinales alors que ShET1 et EAST1 engendrent la sécrétion d’ions par les entérocytes menant aux diarrhées (Kaper & al., 2004).\n1.2.4 Les EIEC\nLes E. coli entéroinvasives sont biochimiquement, génétiquement et pathologiquement étroitement liées à Shigella spp. Ainsi, ce pathotype peut entraîner la dysenterie ainsi que des colites inflammatoires suite à l’invasion de la muqueuse intestinale par les bactéries. Cependant, dans la plupart des cas il cause principalement des diarrhées aqueuses (Nataro & Kaper, 1998). La pathogenèse des EIEC est similaire à la pathogenèse de Shigella spp. avec d’abord l’adhérence de la bactérie aux cellules épithéliales du côlon via une adhésine afimbriale hémagglutinante HAF (HemAgglutinating Factor) (Simi & al., 2002), l’invasion des cellules via des vacuoles endocytiques menant à l’inflammation et à l’ulcération de la muqueuse puis multiplication et extension aux cellules adjacentes (Nataro & Kaper, 1998 ; Sansonetti, 1992). L’invasion de la muqueuse intestinale est médiée par un plasmide de 213 kb portant les gènes requis, notamment un système de sécrétion de type III encodé par les gènes mxi et spa capable de sécréter les protéines IpaA, IpaB, IpaC et IpgD médiant la signalisation intracellulaire, la formation de pores, le réarrangement du cytosquelette d’actine, l’internalisation et la lyse des vacuoles endocytaires (Tran Van Nhieu & al., 2000 ; Kaper & al., 2004), ainsi que de nombreuses protéines membranaires, comme l’autotransporteur IcsA engendrant la réorganisation des filaments d’actine pour permettre les mouvements intracellulaires (Egile, 1999 ; Kaper & al., 2004).\n1.2.5 Les DAEC\nLes E. coli à adhérence diffuse sont impliquées dans des cas de diarrhées aqueuses infantiles qui touchent principalement les enfants de moins de 12 mois (Kaper & al., 2004). Ce pathotype est caractérisé par l’adhérence diffuse des bactéries sur toute la surface de la cellule (DA – Diffuse Adherence) médiée notamment par des adhésines afimbriaires (AfaE-I et AfaE-III) et fimbriaires (F1845 et Dr), codées par les opérons afa/dra/daa et capables de lier DAF (Decay-Accelerating Factor). Cette liaison entraîne le démantèlement du réseau d’actine des cellules épithéliales intestinales provoquant l’élongation des microvilli et la redistribution des protéines du cytosquelette (Le Bouguénec & Servin, 2006). De plus, les gènes aah et aidA sont nécessaires pour une parfaite adhérence. Ils encodent AIDA-I (Adhesin Involved in Diffuse Adherence I), un autotransporteur médiant l’attachement spécifique de la bactérie à une cellule cible via une glycoprotéine cellulaire de 119 kDa (Laarman & al., 2003). La souche possédant cette adhésine a été isolée suite à un cas de diarrhée infantile mais il a été démontré qu’elle est rarement impliquée dans des cas de diarrhée chez les humains et qu’elle est plutôt impliquée dans les cas de diarrhée post-sevrage et d’œdèmes chez les porcs (Côté & al., 2012).\n2 Les ETEC\nLes E. coli entérotoxinogènes sont impliquées principalement dans des cas de diarrhées aqueuses infantiles et de diarrhées du voyageur dans les pays en voie de développement où les conditions d’hygiène sont inappropriées (Kaper & al., 2004). De plus, les adultes n’ayant jamais été en contact avec ce pathotype peuvent aussi être sensibles aux infections dont les principales sources sont l’eau et la nourriture contaminées (Nataro & Kaper, 1998).\nNéanmoins, l’humain n’est pas l’unique cible des ETEC, en effet les infections par les ETEC entrainent également des diarrhées et même la mort chez les animaux d’élevage nouveau-nés et sevrés, tels que les veaux et les porcelets (Jacks & al., 1980). Ainsi, l’industrie agroalimentaire mondiale subit de lourdes pertes économiques dues aux infections causées par ce pathotype (Zanello & al., 2011). En effet, les ETEC sont responsables de diarrhées sévères chez les animaux, principalement chez les veaux et les porcs, mais aussi chez les lapins et les agneaux (Smith & Halls, 1967). Ainsi, les ETEC sont la cause de la plupart des diarrhées chez les porcs, aussi bien nouveau-nés que sevrés, responsables de pertes économiques dues à l’augmentation des taux de morbidité et de mortalité, à la diminution du taux de croissance et à l’utilisation des médicaments (Nagy & Fekete, 2005).\nIl a été rapporté que les ETEC sont responsables de la mort de 10,8% des porcelets nouveau-nés et 1,5 à 2% des porcelets sevrés (Tubbs & al., 1993 ; Hampson, 1994). Au cours des dernières années, l’incidence des diarrhées néonatales a été réduite grâce au développement de vaccins. Cependant, les diarrhées post-sevrages continuent d’entrainer\nd’importantes pertes économiques dans l’industrie porcine Nord-Américaine. Ainsi, dans une portée, 20 à 50% des porcelés sevrés peuvent être atteints de diarrhées post-sevrages, généralement la mortalité ne dépasse pas 10% (Taylor, 1999), mais si aucun traitement n’est administré, la mortalité peut atteindre jusqu’à 25% (Fairbrother & Gyles, 2012). De ce fait, les ETEC engendrent la mort de cinq millions de porcelet par année dans le monde (Kovšca Janjatović & al., 2009), soit 50% des dix millions de porcelets qui meurent annuellement (Gyles, 1994).\nD’abord, les bactéries sont ingérées par l’animal puis elles suivent le tube digestif pour atteindre le tractus gastro-intestinal. Les bactéries colonisent alors la muqueuse du jéjunum et/ou de l’iléon grâce à leurs facteurs de colonisation CF (Colonization Factors) capables de se lier à la surface des entérocytes (Knutton & al., 1985) . Les bactéries peuvent ensuite produire une ou plusieurs toxines qui agissent sur ces entérocytes afin de provoquer une fuite hydroélectrolytique dans la lumière intestinale entraînant dès lors des diarrhées. Ces diarrhées mènent à la déshydratation ainsi qu’à la perte de poids et parfois même, à la mort de l’animal (Fairbrother & al., 2005).\nFigure 2 : La pathogenèse des ETEC chez le porc.\n1. Les bactéries pathogènes sont ingérées par les animaux 2. Ces bactéries possèdent des adhésines fimbriaires qui permettent l’adhésion aux cellules épithéliales de l’intestin et la colonisation du jéjunum et/ou de l’iléon. 3. Les bactéries produisent des entérotoxines provoquant la perte d’eau et d’électrolyte dans la lumière intestinale. 4. Une déshydratation, une perte de poids et/ou la mort de l’animal s’ensuivent. (Tirée de www.ecl-lab.com)\n2.4 Facteurs de virulence associés aux ETEC\nPlusieurs facteurs de virulence interviennent dans la pathogenèse des ETEC tels que les adhésines, importantes pour la colonisation de la muqueuse intestinale, et les entérotoxines thermolabiles (LT) et/ou thermostables (ST), à l’origine des diarrhées aqueuses. La plupart des gènes de virulence des ETEC sont localisés sur des plasmides (Johnson & Nolan, 2009). Ainsi, le gène pour l’entérotoxine STa (heat-Stable enteroToxin a) se trouve sur le transposon Tn1681 alors que le gène pour l’entérotoxine STb\n(heat-Stable enteroToxin b) se trouve sur le transposon Tn4521. Plusieurs gènes de virulence peuvent alors se trouver dans une même souche et sur un même plasmide. Fekete & al. ont démontré que les gènes codant pour STa et STb se situaient sur un fragment de 10 kb ou 9872 pb, appelé TSL (Toxin-Specific Locus), localisé sur un plasmide de 120 kb (pTC) isolé de la souche ETEC 2173 provenant du petit intestin d’un porc sevré, mort à la suite de diarrhée post-sevrage. Un fragment de 40 kb contenant l’origine de réplication du plasmide ainsi que le TSL présentait à ses extrémités des éléments d’insertion IS (Insertion Sequence) indiquant l’existence d’un ilot de pathogénicité (PAI I2173) de 40 kb dans la souche ETEC 2173 porcine (Fekete & al., 2003).\nLes adhésines sont des structures protéiques situées au niveau de la membrane externe des cellules bactériennes. Elles permettent aux ETEC de coloniser la muqueuse du petit intestin en médiant l’attachement aux microvillosités des cellules épithéliales (Nagy & Fekete, 1999). La majorité des adhésines retrouvées chez les souches ETEC porcines, bovines et ovines sont fimbriales. Il est alors possible de rencontrer F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41 et F18 chez les souches porcines et F5 (K99), F41 et F17 chez les souches bovines et ovines (Gyles & Fairbrother, 2010). Le fimbriae F4 est le plus fréquemment retrouvé chez les souches ETEC causant des diarrhées chez les porcelets nouveau-nés, allaités et sevrés, alors que les fimbriae F5, F6 et F41 sont associés aux souches provoquant des diarrhées néonatales chez les porcs nouveau-nés tandis que le fimbriae F18 est retrouvé chez les souches causant des diarrhées post-sevrages chez des porcs sevrés (Melkebeek & al., 2013). En effet, les récepteurs des fimbriae F18 ne sont pas présents chez les porcs nouveau-nés, les souches avec le fimbriae F18 provoquent donc des diarrhées uniquement chez les porcs sevrés alors que les récepteurs des fimbriae F4 sont présents aussi bien chez les porcs nouveau-nés que chez les porcs sevrés, ainsi les souches ayant le fimbriae F4 entrainent des diarrhées chez les porcs nouveau-nés et chez les porcs sevrés (Nagy & al., 1992). Ainsi, F4 et F18 ont été identifiés dans 92.7% des souches ETEC isolées à partir de porc souffrant de diarrhées post-sevrages et/ou de la maladie de l’œdème (Frydendahl, 2002). Les souches ETEC produisant les fimbriae F4 et F18 sont\ndonc fréquemment associées au cas de diarrhées chez le porc (Francis, 2002). Certains fimbriae expriment plusieurs variants, comme F18 avec F18ab et F18ac ainsi que F4 avec F4ab, F4ac et F4ad (Francis, 2002). Ces différences antigéniques sont causées par quelques changements au niveau des acides aminés (Coddens & al., 2011 ; DebRoy & al., 2009). Chaque variant antigénique procure un attachement spécifique à la souche (Francis & al., 1999 ; Gyles & Fairbrother, 2010).\nDe plus, il existe des adhésines afimbriales, telles que AIDA-I, un autotransporteur monomérique de la famille des SAAT (Self-Associating AutoTransporters). AIDA-I est à l’origine de l’adhérence à différentes surfaces ainsi qu’à l’agrégation des bactéries contribuant à la formation de biofilm (Benz & Schmidt, 1999 ; Côté & al., 2012). Cet autotransporteur joue également un rôle dans la colonisation de la muqueuse intestinale par les ETEC (Ravi, 2007). À l’origine, AIDA-I fut découverte dans une souche DAEC (Benz & al., 1992), puis par la suite dans d’autres pathotypes, tels que les ETEC, où elle est associée à STb ou encore les STEC (Shiga Toxin-producing E. coli) où elle est associée à Stx2 et F18 (Côté & al., 2012). L’autotransporteur fut alors détecté dans 40,9% et 7,5% des souches ETEC isolées à partir de porcs souffrant de diarrhées post-sevrages ou de la maladie de l’œdème, en Allemagne (Niewerth & al., 2001) et en Corée (Ha & al., 2003), respectivement.\nLes entérotoxines produites par les ETEC sont classées en deux catégories, les toxines thermolabiles de poids moléculaire élevé, et les toxines thermostables de poids moléculaire faible (Sears & Kaper, 1996) ; EAST1 étant aussi une entérotoxine thermostable de faible poids moléculaire retrouvée chez les ETEC (Yamamoto & al., 1996 ; Yamamoto & al., 1997).\n2.4.2.1 L’entérotoxine thermolabile\nLes toxines thermolabiles (LT) sont un groupe d’entérotoxines de hauts poids moléculaires (Dubreuil, 2014) qui tiennent leur nom du fait qu’elles sont détruites après 30 minutes à 60°C (Jay & al., 2005). Elles sont codées par les gènes elt ou etx portés par des plasmides souvent capables de coder pour d’autres facteurs de virulence tels que ST ou certains CF (Nataro & Kaper, 1998). Elles sont structurellement et biologiquement apparentées à la toxine cholérique (CT), exprimée par Vibrio cholerae, avec 77,9% d’homologie au niveau nucléotidique et 78,8% au niveau des acides aminés (Yamamoto &\nal., 1984). Il s’agit de toxines oligomériques de 86 kDa composées d’une sous-unité A de\n28 kDa, responsable de l’activité enzymatique, liée de façon non covalente à cinq sous-unités B de 11,5 kDa, responsables de l’attachement aux récepteurs gangliosides présents à la surface des entérocytes (Smith & Fratamico, 2005). Les sous-unités B forment un anneau où chaque monomère contient une hélice α. Le domaine A2 est lié de façon covalente via un pont disulfure au domaine A1, la sous-unité A est insérée dans le canal formé par les sous-unités B connectant ainsi A et B (Holmes & al., 1995). Les LT se fixent ainsi à des récepteurs gangliosides, puis sont internalisées dans des vésicules endocytiques pour être transportées par transport rétrograde vers l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique. La sous-unité A est alors clivée en deux domaines A1 et A2. A1 est alors transportée vers la membrane basolatérale pour permettre la ribosylation de la sous-unité α de la protéine G, menant à l’activation de l’adénylate cyclase (AC) et à la production d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) par cette dernière. Par la suite, un certain niveau d’AMPc active la protéine kinase A (PKA) qui phosphoryle le CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) localisé dans la membrane apicale ainsi qu’un échangeur Na+/H+. Cette phosphorylation induit la sortie d’eau, d’ions chlorures et bicarbonates dans la lumière intestinale et inhibe l’entrée d’ions sodium dans les cellules (Dubreuil, 2013 ; Dubreuil, 2012 ; Smith & Fratamico, 2005 ; Nataro & Kaper, 1998).\nFigure 3 : Mécanisme d’action de LT.\n1. LT-I se lie au récepteur GM1 via les sous-unités B. 2. L’holotoxine est internalisée dans des vésicules. 3. Par transport rétrograde, les vésicules se ridigent vers l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique. 4. L’holotoxine est désassemblée dans l’appareil de Golgi pour permettre à la sous-unité A d’être transloquée dans le réticulum endoplasmique. 5. Dans le réticulum endoplasmique, la sous-unité A est clivée en deux domaines : A1, capable de ribosyler une protéine G, et A2, capable de lier la sous-unité B. 6. A1 ribosyle la sous-unité α d’une protéine G régulatrice résultant en l’activation de l’AC impliquée dans la production d’AMPc. 7. L’accumulation de ce dernier dans le cytoplasme entraine l’activation d’une PKA. 8. PKA phosphoryle le CFTR et l’échangeur Na+/H+. 9. Il y a alors induction de la sortie d’eau, d’ions chlorure et bicarbonate dans la lumière intestinale et inhibition de l’entrée d’ions sodium dans la cellule. (Dubreuil, 2012)\nAinsi, il est possible de distinguer deux sérogroupes, LT-I et LT-II (Holmes & al., 1995), dont la sous-unité A est identique de 55 à 57% (Pickett & al., 1989) tandis que les sous-unités B n’ont pas de similarité significative. LT-I est aussi bien produite par les souches ETEC humaines que par les souches ETEC animales alors que LT-II est principalement retrouvées chez les souches ETEC animales et rarement chez les souches ETEC humaines (Nataro & Kaper, 1998). De même, pour LT-II, il est possible de distinguer deux variants antigéniques LT-IIa et LT-IIb, dont la sous-unité A est similaire à 71% et les sous-unités B à 66% (Pickett & al., 1989). Ainsi, LT-I, LT-IIa et LT-IIb présentent des propriétés adjuvantes distinctes. Cette distinction reflète des différences au niveau de la liaison aux récepteurs gangliosides (Hajishengallis & al., 2004). En effet, LT-I lie avec une grande affinité le récepteur ganglioside GM1 mais avec une faible affinité GD1b, GD2 et GM2 (Teneberg & al., 1994) alors que LT-IIa lie fortement GD1b et faiblement GD1a et GM1, et LT-IIb lie fortement GD1a et faiblement GD1b et GM1 (Fukuta & al., 1988).\n2.4.2.2 Les entérotoxines thermostables\nLes toxines thermostables sont un groupe d’entérotoxines monomériques de faible poids moléculaire qui tiennent leur nom du fait qu’elles ne sont pas détruites après 15 minutes à 100°C (Jay & al., 2004). Chacune contient plusieurs cystéines permettant la formation de ponts disulfures (Sukumar & al., 1995 ; Sato & Shimonishi, 2004 ; Dubreuil, 2014) essentiels à l’intégrité structurelle et biologique. Chez les ETEC, trois toxines thermostables ont été décrites ; STa, STb et EAST1. STa est plutôt associée à des diarrhées chez les humains tandis que STb est principalement liée aux diarrhées chez les animaux, particulièrement chez les porcs (Dubreuil, 2014). Quant à EAST1, elle est majoritairement la cause de diarrhée chez les humains mais elle a déjà été associée à des cas chez les porcelets ainsi que les veaux (Ménard & Dubreuil, 2002 ; Veilleux & Dubreuil, 2006).\nSTa est une petite toxine d’environ 2 kDa (Nataro & Kaper, 1998 ; Dubreuil, 2014) produite par les ETEC mais aussi d’autres bactéries Gram négatif telles que Yersinia\nenterocolitica, Vibrio cholerae et Citrobacter freundii (Nataro & Kaper, 1998 ; Dubreuil,\n2006 ; Dubreuil, 2014). Elle se différencie de STb principalement par sa solubilité dans le méthanol (Parija, 2009). Elle est produite sous la forme d’un précurseur pré-STa de 72 acides aminés codé par le gène estA porté par le transposon Tn1681 retrouvé sur différents plasmides (Fekete & al., 2003). Lorsque le précurseur pré-STa de 72 acides aminés traverse la membrane interne pour rejoindre le périplasme, il est clivé entre les acides aminés 9 et 20 par une peptidase. Lorsque le peptide pro-STa de 53 acides aminés traverse la membrane externe pour être sécrété dans le milieu, il est à nouveau clivé par une protéase (Rasheed & al., 1990 ; Nataro & Kaper, 1998) pour donner la forme mature de STa de 18 ou 19 acides aminés, respectivement STaP ou STaH (Moseley & al., 1983). STaP est produite par des souches ETEC d’origine animale (bovine, ovine, porcine et canine) ainsi qu’humaine alors que STaH est produite uniquement par des souches ETEC d’origine humaine (Nataro & Kaper, 1998). STa possède six cystéines qui permettent la formation de trois ponts disulfures aux positions 5 et 10, 6 et 14 puis 9 et 17 grâce à l’action de la disulfide oxydoréductase DsbA. Ces ponts disulfures sont importants pour maintenir la conformation fonctionnelle et permettre l’activité biologique de la toxine (Yamanaka & al., 1994). Une séquence de treize acides aminés de la cystéine amino-terminale à la cystéine carboxy-amino-terminale est essentielle pour l’activité toxique de la toxine (Dubreuil, 2014). Afin d’exprimer sa toxicité, STa se fixe à son récepteur ; la guanylate cyclase C (GC-C), présent sur la surface apicale des cellules épithéliales de l’intestin. La GC-C dégrade alors la guanosine triphosphate (GTP) en guanosine monophosphate cyclique (GMPc) ce qui entraine l’activation d’une protéine kinase GMPc-dépendante II (GMPcKII) qui phosphoryle un domaine du canal CFTR engendrant la sécrétion d’ions chlorure et bicarbonate dans la lumière intestinale (Sears & Kaper, 1996 ; Dubreuil, 2007, Dubreuil, 2012). En parallèle, l’élévation du niveau de GMPc intracellulaire inhibe la phosphodiestérase 3 (PDE3) ce qui engendre une augmentation du niveau d’AMPc menant à l’activation de PKA. PKA va alors phosphoryler le CFTR et un échangeur Na+/H+ pour\ninduire la sécrétion d’ions chlorure et bicarbonate et inhiber l’entrée d’ions sodium (Dubreuil, 2012). Etant donné que la GC-C est présente à la surface apicale et que l’AC est située au niveau de la surface basolatérale, STa provoque une sécrétion de fluides dans la lumière intestinale plus rapidement que LT (Nataro & Kaper, 1998).\nFigure 4 : Mécanisme d’action de STa.\n1. STa se lie au GC-C. 2. Cette liaison entraine la conversion de GTP en GMPc. 3. L’accumulation de ce dernier dans le cytoplasme induit l’activation de la GMPcKII capable de phosphoryler le CFTR. 4. La phosphorylation du CFTR entraine la sécrétion d’ions chlorure et bicarbonate dans la lumière intestinale. 5. En parallèle, l’accumulation de GMPc dans le cytoplasme inhibe la PDE3 ce qui engendre la production d’AMPc menant à l’activation de PKA. 6. PKA phosphoryle alors le CFTR et un échangeur Na+/H+ pour induire la sortie d’ions chlorure et bicarbonate et inhiber l’entrée d’ions sodium. (Dubreuil, 2012)\nEAST1 est une toxine de 4.1 kDa (Dubreuil, 2014) codée par le gène astA et produite principalement par les EAEC mais aussi par les ETEC, les EPEC, les EHEC (Nataro & Kaper, 1998) et d’autres entérobactéries telles que Salmonella et Klebsiella (Sousa & Dubreuil, 2006). Elle est composée de 38 acides aminés dont quatre cystéines qui permettent la formation de deux ponts disulfures aux positions 17 et 27 puis 20 et 24 (Veilleux & Dubreuil, 2006). De plus, elle partage 50% d’homologie avec le domaine entérotoxinogène de STa (Savarino & al., 1993). Une étude a démontré la présence du gène astA dans 31,3% des souches E. coli isolées de porcs souffrant de diarrhées ou de la maladie de l’œdème. Parmi ces isolats, 44,3% portaient uniquement le gène codant pour EAST1 et aucun gène codant pour des fimbriae ou des toxines (Choi & al., 2001). Ainsi certaines souches, sans aucun autre facteur de virulence connu, à part EAST1, ont pu être associées à des cas de diarrhées (Kawano & al., 1998). Par ailleurs, au sein des isolats, 55,7% portaient le gène codant pour EAST1 en plus de gènes codant pour des fimbriae et d’autres toxines. Ainsi, il a été possible de constater que les souches E. coli exprimant EAST1 exprimaient fréquemment aussi la toxine STa et/ou le fimbriae F4 (Choi & al., 2001). Cependant, son mécanisme d’action reste encore méconnu. Une étude évoque une hausse de la concentration de GMPc suite à une exposition des cellules à EAST1 appuyant l’hypothèse que la GMPc servirait de médiateur intracellulaire à EAST1 et que la GC-C serait un potentiel récepteur pour la toxine (Savarino & al., 1993). Cependant, une autre équipe rapporte que EAST1 n’engendrerait pas d’augmentation de la concentration de GMPc suite à une exposition des cellules à EAST1 réfutant l’hypothèse émise précédemment (Ruan & al., 2012).\nSTb est une toxine de 5,2 kDa (Dubreuil, 2014) produite par les ETEC (Nataro & Kaper, 1998). Elle fut isolée et différenciée de STa pour la première fois en 1978 à partir de la souche E. coli porcine P16 (Burgess & al., 1978). En effet, contrairement à STa, STb est insoluble dans le méthanol (Parija, 2009). En effet, STb est retrouvée principalement chez les porcs (Dubreuil, 2014) mais il est aussi possible de la rencontrer chez les bovins (Mainil & al., 1986), les ovins et les lapins (Rose & al., 1987), les poulets (Akashi & al., 1993), les chiens (Hammermueller & al., 1995), les chats (Beutin, 1999) et également chez l’Homme (Lortie & al., 1991 ; Okamoto & al., 1993).\nD’un point de vue immunologique, STb est considérée comme étant peu immunogène. Afin de rendre la toxine plus immunogène, plusieurs injections de la toxine à un animal de laboratoire ont été réalisées, cependant les anticorps anti-STb produits n’étaient pas capables de neutraliser la toxicité de STb (Dubreuil & al., 1991). Par ailleurs, le couplage de la toxine à une protéine de fusion a permis de produire des anticorps anti-STb capables de neutraliser la toxicité de la toxine (Dubreuil & al., 1996). Ces anticorps sont alors capables de neutraliser STb, mais pas STa ou CT (Hitotsubashi & al., 1992). En ce qui concerne ses caractéristiques biochimiques, son point isoélectrique a été déterminé comme étant de 9,6, démontrant que STb est une protéine hautement basique (Handl & al., 1993). Elle est résistante à des pH allant de deux à douze ainsi qu’à des traitements à l’urée (Dubreuil & al., 1991). Cependant, elle est sensible à la dégradation protéolytique (Whipp, 1987) et elle perd sa fonction biologique suite à des traitements à la trypsine ou au β -mercaptoéthanol (Burgess & al., 1978 ; Dubreuil & al., 1991 ; Fujii & al., 1991). Étant donné qu’elle ne contient qu’une tyrosine, deux phénylalanines et aucun tryptophane, elle possède une absorbance quasi nulle à 280 nm (Handl & al., 1993).\nSTb est encodée par le gène estB porté par le transposon Tn4521 retrouvé sur différents plasmides (Fekete & al., 2003). Ce transposon est capable de se transposer de plasmide en plasmide, répandant le gène estB dans plusieurs souches ETEC (Lee & al., 1985 ; Dubreuil, 1997). Ces plasmides portent généralement d’autres gènes codant pour différents facteurs de virulence tels que des fimbriae, d’autres toxines, des résistances antibiotiques ou des peptides antimicrobiens (Lee & al., 1985 ; Harnett & Gyles, 1985).\nL’expression du gène estB est basse car sa transcription est régulée par un promoteur faible ce qui pourrait expliquer la quantité réduite de STb produite par les souches ETEC (Spandau & Lee, 1987). De plus, la présence de glucose peut inhiber l’expression du gène, toutefois elle n’est pas irréversible puisque l’ajout d’AMPc permet de contrer l’effet du glucose sur l’expression de estB (Busque & al., 1995).\nIl est important de noter qu’il n’y a aucune homologie de séquence entre STa et STb, indiquant qu’il s’agit bien de deux toxines différentes (Lee & al., 1985).\nSTb est synthétisée dans le cytoplasme sous la forme d’un précurseur pré-STb de 71 acides aminés (Lee & al., 1983). Lors du passage de pré-STb vers le périplasme, son peptide signal d’une longueur de 23 acides aminés situé au niveau de la région N-terminale de la protéine est clivé par une adénosine triphosphatase (ATPase) cytoplasmique associée au système de sécrétion de type II (SecA) pour donner la forme mature de STb de 48 acides aminés (Kupersztoch & al., 1990). De là, la toxine devient la cible d’une disulfide oxydoréductase périplasmique (DsbA) capable de former des ponts disulfures (Foreman &\nal., 1995). Les ponts disulfures protègent la toxine de la dégradation par les protéases\npériplasmiques, notamment au niveau des acides aminés 14 et 15 (Dreyfus & al., 1992 ; Okamoto & al., 1995). Par la suite, STb est prise en charge par un transporteur de type\nABC présent au niveau de la membrane interne (MacAB) qui interagit avec un canal présent dans la membrane externe (TolC) pour sécréter la toxine dans le milieu extracellulaire (Yamanaka & al., 2007 ; Foreman & al., 1995). Ce canal est également essentiel pour la sécrétion d’autres facteurs de virulence tels que d’autres toxines ou encore des peptides antimicrobiens (Yamanaka & al., 2008).\nFigure 5 : Biogenèse de STb.\n1. STb est synthétisée dans le cytoplasme sous la forme d’un précurseur pre-STb de 71 acides aminés. 2. Lors de son passage dans le périplasme, le précursuer est clivé par SecA pour donner la forme mature de STb de 48 acides aminés. 3. Dans le périplasme, DsbA forme les ponts disulfures de la toxine. 4. MacAB transporte la toxine jusqu’à TolC. 5. La toxine est excrétée hors de la cellule. (Dubreuil & al., 2016)\n3.4 Structure tridimensionnelle\nSTb est un peptide de 48 acides aminés dont la structure est stabilisée par deux ponts disulfures entre Cys10 et Cys48 puis Cys21 et Cys36 (Okamoto & al., 1993). La formation de ces ponts disulfures est primordiale pour conserver la structure native de STb et permettre l’activité biologique de la toxine ; la sécrétion de fluides dans la lumière intestinale (Arriaga & al., 1995).\nLa résonance magnétique nucléaire a démontré que STb est composée de deux hélices α antiparallèles. La première hélice α entre les acides aminées 10 et 22 est amphipatique alors que la deuxième hélice α entre les acides aminées 38 et 44 est hydrophobe. Chaque hélice comprend des résidus hydrophobes qui permettent aux deux hélices d’entrer en contact. Elles sont séparées par une boucle riche en glycine formée entre les résidus 21 et 36. Cette boucle possède également des résidus hydrophobes, comme l’Arg29 et l’Asp30, exposés au solvant (Sukumar & al., 1995). Lorsqu’elles sont mutées, l’Arg29 entraine une baisse de l’attachement de STb à son récepteur ainsi qu’une diminution de la toxicité, alors que l’Asp30 engendre une chute de la toxicité mais une hausse de l’attachement entre la toxine et le sulfatide. Cela pourrait être dû à l’élimination de la charge négative présente sur la chaine latérale de l’aspartate qui éliminerait par la même occasion la force répulsive au niveau du récepteur sulfatide (Labrie & al., 2001b). De plus, il a été montré que les acides aminés Asp8, His12, Gln15, Lys18, Glu19, Lys22 et Lys23 sont également exposés au solvant, formant une surface hautement polaire. Les résidus Lys22 et Lys23 joueraient un rôle important dans la toxicité de STb (Sukumar & al., 1995). En effet, une mutation de ces résidus cause une diminution de l’attachement de la toxine à son récepteur (Fujii & al., 1994). De même, des mutations au niveau des résidus Gly24, Gly27 et Gly31 entraînent une baisse de l’attachement de STb au sulfatide suivie d’une diminution de la toxicité. Ces mutations pourraient réduire la flexibilité caractéristique de la boucle (Labrie & al., 2001b). Enfin, des mutations au niveau des acides aminés 37, 41 et 42 empêcheraient la formation d’oligomères. La formation d’oligomères serait due à la répulsion de l’eau entre les acides aminés hydrophobes. La mutation de ces résidus hydrophobes empêcherait la répulsion de l’eau et donc la formation\nd’oligomères. De plus, ces mutations entrainent une diminution de l’attachement et de la toxicité. Ainsi, l’oligomérisation de la toxine pourrait avoir un rôle important dans l’activité toxique de STb (Labrie & al., 2001a ; Labrie & al., 2001b).\nFigure 6 : Structure tertiaire de STb.\nLa forme mature de STb est composée d’une hélice α amphipathique, d’une boucle flexible riche en glycine, d’une hélice α hydrophobe et de deux ponts disulfures. (Sukumar & al., 1995)\n3.5 Mécanisme d’action\nSTb est capable de former une interaction protéine-protéine avec elle-même en formant des hexamères et des heptamères via l’interaction des hélices α-hydrophobes en C-terminale des monomères de STb. L’étude de Labrie et al. a révélé que l’oligomérisation se produisait aussi bien en présence qu’en absence du récepteur sulfatide et qu’elle ne\nmontrait aucune différence lorsque le récepteur était en solution et lorsqu’il était contenu dans un liposome, ce qui suggérait que l’oligomérisation précédait l’insertion dans la membrane. Ils démontrèrent également que l’ajout d’un agent réducteur, tel que le β -mercaptoéthanol, abolissait l’interaction entre les monomères de STb, ce qui indiquait que la toxine devait avoir une structure tridimensionnelle intacte afin de former des oligomères. Ainsi l’oligomérisation pourrait être une étape nécessaire à la pathogenèse de STb, étant donné que la réduction de la toxine entraine une perte de la toxicité, liée à une baisse de l’attachement de la toxine à son récepteur, ce qui pourrait être due à l’incapacité de former des oligomères (Labrie & al., 2001b).\n3.5.2 Liaison au récepteur\nLa liaison de la toxine aux cellules épithéliales intestinales est l’étape primordiale menant à la sécrétion d’eau et d’électrolytes dans la lumière intestinale. Hitotsubachi et al. ont rapporté que STb se liait à une protéine de 25 kDa présente dans un extrait concentré de cellules épithéliales intestinales murines (Hitotsubashi & al., 1994). Chao et Dreyfus ont, quant à eux, observé l’attachement de la toxine à des cellules épithéliales intestinales en culture, ainsi que la formation d’une interaction stable entre STb et les lipides de la membrane, suivie de l’internalisation de STb dans le cytoplasme. Ils ont ensuite déterminé que STb ne se liaient pas à des protéines, des glycoprotéines ou des protéoglycanes mais plutôt à des lipides au niveau de la membrane (Chao & Dreyfus, 1997). De là, Rousset et\nal. se sont intéressés aux détails moléculaires via lesquels la toxine pouvait lier la surface\ndes cellules épithéliales. Ils démontrèrent dans un premier temps que les glycosphingolipides présents à la surface des cellules épithéliales du jéjunum de porc étaient responsables de l’attachement de la toxine (Rousset & al., 1998a). Puis dans un second temps, ils rapportèrent une forte affinité de liaison pour le résidu terminal Gal(3SO4)β1 du sulfatide et une faible affinité de liaison pour les résidus d’acide sialique retrouvés sur divers gangliosides (Rousset & al., 1998b). Le sulfatide est un glycosphingolipide acide, composé d’un céramide lié à un galactose sulfaté en position 3, retrouvé au niveau des cellules du tractus gastro-intestinal, du rein, de la rate, du cerveau et\nsur les granulocytes, les plaquettes et même certaines cellules cancéreuses (Beausoleil &\nal., 2002). Une constante de dissociation de 2,4 ± 0,61 nM a été déterminée par résonnance plasmonique de surface pour le sulfatide et STb confirmant une forte affinité entre le sulfatide et la toxine (Goncalves & al., 2008). Cependant, STb est aussi capable d’interagir avec d’autres glycosphingolipides comme les 3-sulfolactosylcéramides (76%), les glucocéramides (63%), les galactocéramides (27%) et les lactocéramides (24%) même si le sulfatide reste le récepteur privilégié (100%) de STb (Beausoleil & Dubreuil, 2001).\n3.5.3 Altération cellulaire\nWhipp et al. ont démontré la perte et l’atrophie des microvilli suite aux traitements de segments de jéjunum porcin avec un filtrat de culture d’E. coli capable de produire STb. Ces dommages reflétaient une perte de cellules absorptives indiquant que STb était la cause de la diminution de l’absorption par les entérocytes traités avec la toxine (Whipp & al., 1987 ; Rose & al., 1987 ; Nataro & Kaper, 1998). Hitotsubashi et al. ont observé, quant à eux, une dilatation des capillaires de la sous-muqueuse et une diminution de l’épaisseur de la lamina propria suite au traitement du jéjunum de souris avec STb purifiée. Cependant, aucun dommage cellulaire n’a été révélé (Hitotsubashi & al., 1992). Ainsi, ces résultats suggèrent que les dommages à l’épithélium intestinal se produisent lorsqu’un surnageant de culture contenant STb est utilisé, mais pas quand la toxine purifiée seule est employée (Dubreuil, 1997).\n3.5.4 Perméabilisation membranaire\nD’abord, la capacité de STb à induire la perméabilisation membranaire a été testée via l’utilisation de vésicules membranaires dérivées d’un jéjunum porcin. L’étude montra que la toxine était capable de perméabiliser les vésicules via la formation de pores non-spécifiques, de façon saturable et dose-dépendante. Cependant, la perméabilisation était possiblement facilitée par l’absence de machinerie endocytaire cellulaire dans les vésicules\nmembranaires (Goncalves & al., 2007). L’expérience a alors été reproduite avec des cellules IPEC-J2 et NIH-3T3. L’étude démontra alors que STb permettait de perméabiliser la membrane des cellules sans altérer la viabilité de ces dernières. Toutefois, les auteurs ont remarqué que malgré la même quantité de toxine utilisée, la perméabilisation des cellules était inférieure à la perméabilisation des vésicules membranaires. Cela pourrait s’expliquer par un nombre différent de récepteurs sulfatide entre la surface des cellules et celle des vésicules appuyant une potentielle implication du sulfatide dans la perméabilisation cellulaire causée par STb (Goncalves & al., 2008 ; Goncalves & Dubreuil, 2009).\nEn 1997, Chao et Dreyfus ont démontré pour la première fois l’internalisation de la toxine dans des cellules T84 et HT29. D’abord, ils ont observé l’attachement de la toxine STb marquée à l’iode radioactive (125I) aux cellules épithéliales. Puis ils ont traité les cellules avec de la saline acide afin d’enlever STb-125I liée à la surface des cellules pour ainsi constater que 55% ± 10% de STb-125I était éliminée par le traitement, suggérant que la moitié de STb-125I était fortement associée à la membrane et/ou internalisée dans le cytoplasme. L’association à la membrane et l’internalisation dans le cytoplasme des cellules épithéliales ont été confirmées ensuite par immunofluorescence. L’immunofluorescence permit également de constater que les cellules traitées avec la toxine présentaient une diffusion cytoplasmique de la fluorescence, indiquant que STb ne semblait pas s’associer préférentiellement avec des vésicules membranaires ou des organelles cellulaires. De plus, l’immunofluorescence a été réalisée à 4°C, 22°C et 37°C, l’internalisation de STb n’était pas modifiée malgré les changements de température indiquant que le phénomène était indépendant de la température. Ils ont également traité les cellules avec des inhibiteurs du cytosquelette, tels que la cytochalasine D et la colchicine, ils ont alors constaté que l’internalisation de la toxine n’était pas altérée par l’un de ces traitements suggérant que les filaments d’actine et les microtubules n’étaient pas impliqués. Les cellules ont alors été traitées avec de l’azide de sodium afin de bloquer la machinerie métabolique, ils ont dès lors observé que l’internalisation de la toxine n’était\nDownload ( - 107 Page - 2.56MB)\n[Christiaan A. Sepp], Atlas des enfans, ou nouvelle méthode pour apprendre la gé...\nSes contenus et ses méthodes sont remis en question : on tente d’innover, de rendre les leçons plus attrayantes pour un pu- blic jeune.. Elles prennent de nouvelles formes :\nCaractérisation de l'activité biologique de l'entérotoxine STb d'Escherichia col...\nSulfatide from the pig jejunum brush border epithelial cell surface is involved in binding of Escherichia coli enterotoxin b. 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GP59, une nouvelle bactérie dénitr...\nA DSP based SVC IP STB using open SVC decoder


Charte de la participation et de l’accompagnement de la personne handicapée intellectuelle - Adapei 63\nAccueil » Charte de la participation et de l’accompagnement de la personne handicapée intellectuelle\nCharte de la participation et de l’accompagnement de la personne handicapée intellectuelle\nL’association “ Nous Aussi ” (Association française des personnes handicapées intellectuelles) affirme le droit de chaque personne handicapée intellectuelle à participer à son projet de vie et aux décisions qui la concernent, quel que soit le degré de ses difficultés et en fonction de celles-ci. Dans ce but, l’association “ Nous Aussi ” a pour objectif d’être le porte¬parole de l’ensemble des personnes handicapées intellectuelles et exprime le souhait d’être aidée et soutenue par les parents et les professionnels des associations de l’Unapei. De son côté, l’Unapei s’engage à accompagner les personnes handicapées intellectuelles dans cette démarche et propose des moyens susceptibles d’être mis en œuvre par les associations qu’elle fédère.\nLes Demandes des Personnes Handicapées Intellectuelles\nLes personnes handicapées intellectuelles souhaitent changer leur regard sur elles-mêmes et faire changer le regard de la société, vers plus de tolérance et de respect.\nElles souhaitent que soient mises en avant leurs capacités et leurs compétences, plutôt que leurs déficiences.\nLes personnes handicapées intellectuelles veulent être des acteurs responsables et aller le plus loin possible dans leurs capacités.\nLes personnes handicapées intellectuelles souhaitent que tous puissent bénéficier de cette évolution de l’accompagnement et que, en particulier, les plus en difficulté d’entre elles ne soient pas oubliées, en ayant recours à l’émulation, les plus à l’aise aidant ceux qui sont plus en difficulté.\nElles demandent que la participation s’exerce dans le respect des règles définies avec la famille, avec l’établissement, avec l’association.\nLes Propositions de l’UNAPEI :\nQue la personne handicapée intellectuelle soit associée systématiquement et quel que soit le degré de ses difficultés, à la conception et à la mise en œuvre de son projet individuel et aux décisions qui la concernent : dès son plus jeune âge et chaque fois que c’est possible ; dans la famille, dans l’établissement (conseils de la vie sociale, règlement intérieur…), dans l’association (conseils d’administration, journées associatives, commissions dans le cadre de la vie associative…).\nQue soient exploités et développés les moyens adaptés aux capacités de chaque personne, en particulier en matière de « communication aidée » pour les plus en difficulté (emploi d’un langage simplifié, utilisation des pictogrammes, recours à l’ordinateur et aux nouvelles technologies…).\nQue les temps et les lieux de parole soient multipliés, de façon individuelle et en groupe, dans et en dehors des établissements d’accueil.\nQue la formation des personnes à l’expression et à la prise de parole soit assurée.\nQue la participation et l’expression soient valorisées au moyen de journées portes ouvertes, de conférences, d’articles dans la presse… dans le but de mieux faire connaître les potentiels des personnes handicapées intellectuelles, à l’extérieur\nPar cette résolution, les congressistes de l’Unapei s’engagent à mettre en œuvre les moyens nécessaires à la participation et l’accompagnement : en dégageant du temps, pour les personnes handicapées intellectuelles et pour les accompagnants ; dans le respect des contraintes et des obligations des établissements et des associations.\n» Nous Aussi » et l’Unapei s’engagent à tout faire, dans un respect mutuel avec les familles, les associations et les établissements, pour que tout se passe bien.\nCharte adoptée par l’Assemblée Générale de l’Unapei et l’Assemblée Générale de » Nous Aussi » le 5 octobre 2002 à Angers.


Météo Cardet heure par heure (30350) ☁ M6 météo France\nActuellement: Météo Cardet\nMétéo Cardet Ville (30350) , Gard, Occitanie , France\nQuel temps fait-il aujourd'hui à Cardet (Gard, France) ?\nBulletin météo du samedi 21 mai 2022 pour Cardet\nPleuvra-t-il aujourd'hui à Cardet ?\nPlus de détails dans notre graphique sur l'évolution des précipitations heure par heure à Cardet.\nLe temps ce matin à Cardet\nCe matin à Cardet, le ciel sera ensoleillé et sans nuage. La température à Cardet ce matin sera de 23°C . La force du vent oscillera aux alentours des 6 km/h (orientation du vent : Est-Sud-Est). L'humidité relative de l'air sera de 65%.\nVous avez besoin de plus de précisions sur les températures à l'heure près ou de l'historique pour aujourd'ui ? Consultez nos courbes sur l'évolution des températures heure par heure à Cardet.\nLe temps pour cet après-midi à Cardet\nDans l'après midi à Cardet, le ciel sera ensoleillé et sans nuage. La température cet après-midi pour Cardet atteindra les 28°C (ressentie 32°C). Le vent devrait atteindre en moyenne les 7 km/h (orientation du vent : Nord-Ouest).\nConsultez la page de la météo agricole de Cardet réservée aux experts qui contient plus de détails sur les températures, la pluie, le vent ou la pression atmosphérique.\nLe temps ce soir à Cardet\nEt ensuite, quel est le temps prévu à Cardet pour demain matin ?\nNouveau ! Trouver un hôtel à Cardet pour ce soir\nVous devez passer la nuit à Cardet ? Réservez un hotel, un gîte ou une chambre d'hôte à Cardet dès maintenant grâce à notre carte des hôtels pas cher. Ce sera l'étape idéale pour une visite de la région ou simplement pour y passer la nuit.\nTrouver un hôtel pas cher à Cardet\nOrganisez votre séjour à Cardet en trouvant un hôtel pas cher, même pour une nuit, grâce à notre carte des hôtels à proximité. Déplacez la carte et zoomez pour obtenir de nouvelles propositions de logements.\nLa météo quotidienne de Cardet par e-mail\nLa courbe de l'évolution des températures à Cardet vous aidera à mieux prévoir le futur et à agir en conséquence.\nLe graphique sur l'évolution du vent à Cardet peut être difficile à comprendre ou à décrypter. Consultez notre FAQ pour savoir comment interpréter les données sur le vent.\nÀ proximité de Cardet\nMontpellier à 49 km\nAvignon à 59 km\nAix-en-Provence à 123.1 km\nMarseille à 132.4 km\nSaint-Jean-de-Serres à 3.8 km\nCassagnoles à 4.1 km\nSaint-Christol-lès-Alès à 6.4 km\nAnduze à 8.2 km\nAlès à 11 km\nSaint-Privat-des-Vieux à 13.7 km\nSaint-Martin-de-Valgalgues à 15.2 km\nSalindres à 17.3 km\nSaint-Jean-du-Gard à 17.8 km\nSaint-Hippolyte-du-Fort à 19.2 km\nRousson à 19.7 km\nLa Grand-Combe à 21 km\nClarensac à 25 km\nSommières à 26.9 km\nCaveirac à 27 km\nUzès à 27.2 km\nSaint-Ambroix à 27.7 km\nCalvisson à 28.2 km\nSaint-Quentin-la-Poterie à 28.9 km\nBessèges à 29.6 km\nPoulx à 30 km\nLieux à découvrir près de Cardet, France\nVoici quelques lieux particuliers à voir si vous vous trouvez dans le coin autour de Cardet. Ces lieux marquants font la renommée de la région et sont incontournables.


17h28 , le 18 janvier 2019, modifié à 08h32 , le 19 janvier 2019\nHugues Vidor est président de l'Udes. (Sipa)\nAllez-vous jouer un rôle dans le déroulement du grand débat?\nLire aussi - Le plan du gouvernement pour l'économie sociale et solidaire\nCes consultations citoyennes vous paraissent-elles utiles?\n60.000 contrats aidés vont être supprimés en 2019 dans le secteur de l'ESS\nMais comment dessiner des solutions communes avec des revendications souvent individuelles?\nLa synthèse demandera beaucoup d’agilité. Le fait que ces débats soient organisés sur les territoires de manière ascendante et non pas descendante est intéressant. Nous y participerons donc afin de faire passer nos messages. A l’issue, nous avons demandé à ce que le Premier ministre nous fasse une restitution, ainsi qu’à tous les corps intermédiaires, comme lorsqu’il avait donné le coup d’envoi le 10 janvier. Edouard Philippe n’a pas l’air d’y être opposé.\n150.000 ont été supprimés en 2018, 100.000 le seront en 2019. 60.000 concernent directement le secteur de l’ESS. Des associations sont contraintes de devoir fermer partiellement ou totalement des services, leur équilibre économique est remis en cause. Elles ont dû dire à des salariés qu’elles connaissaient bien que leur contrat n’était pas renouvelé après leur avoir laissé penser le contraire. Tout cela créé de l’incompréhension et de la défiance entre les employeurs de l’ESS et l’Etat.\nLe Pacte de croissance de l’ESS lancé fin novembre est-il une réalité?\nL’ESS est-elle toujours un secteur économique de seconde zone pour certains politiques?\nL’économie sociale a son magazine


Blog de web-eau.net\nD'après de nombreuses études, les français sont de plus en plus tentés par la création d'entreprise. Il serait plus juste de parler de création d'activité si l'on veut être précis. Bien que souvent décrié, l'ancien staut auto-entrepreneur a donné à de nombreuses personnes les clefs d'accès à la création (ou à la légalisation) d'une activité. Même si pour beaucoup l'idée n'est pas de lâcher son emploi salarié, l'objectif de cette seconde vie professionnelle est bien de générer des revenus supplémentaires.\nLire la suite Commentaire (8) Clics: 1834\nCorée du Nord, le pays aux 28 sites Web\nC'est sans doute une faille dans le système nord-coréen qui est à l'origine d'une découverte assez étonnante : seuls 28 sites web sont enregistrés en Corée du Nord, pays pourtant peuplé de 25 millions d'habitants. En effet, le 19 septembre 2016, l’administration nord-coréenne a accidentellement (ou pas) laissé l’un de ses serveurs répondre automatiquement aux demandes d’informations sur les noms de domaines enregistrés en .kp. Aussi étonnant que cela puisse paraitre, le web nord-coréen a bien un visage.\nLire la suite Commentaire (1) Clics: 2721\nVie privée et Internet, union impossible ?\nJe parie que votre ordinateur est équipé d'un anti-virus car pour vous, la sécurité informatique est une question importante. Parallèlement à cela, vous publiez parfois des photos de vos enfants sur les réseaux sociaux, vous indiquez quand vous partez en vacances et vous utilisez plusieurs fois le même mot de passe sur Internet. Si tout cela vous semble normal et ne vous pose pas de problèmes, alors ce qui suit pourrait vous intéresser et devrait faire changer vos habitudes.\nLire la suite Commentaire (6) Clics: 4427\nLes moteurs de recherche éthiques et solidaires\nSi je vous dis "moteur de recherche", vous pensez quasiment à coup sûr à Google. Eh oui, fort de ses 90% de part de marché, le géant de Mountain View truste le haut du panier du marché de la recherche sur le Web, loin devant tout le monde. Mais cette hégémonie pose quand même quelques problèmes sur notre vie privée. La curiosité excessive de Google a poussé quelques esprits subversifs a imaginer un monde où la recherche sur le Web serait... éthique.\nLire la suite Commentaire (2) Clics: 4091\nComment supprimer proprement une page web ?\nLorsque l'on travaille sur l'optimisation et l'amélioration de son site, on est souvent amené à modifier des pages, à en changer l'ordre et parfois même à en supprimer certaines. Si ces opérations ne posent pas de difficultés d'un point de vue technique, il convient cependant de prendre quelques précautions du point de vue du SEO.\nEn effet, déplace ou supprimer une page n'est pas sans conséquences, comme vous allez le voir dans cet article.\nLire la suite Commentaire (0) Clics: 4648\nVous l'avez constaté, la technologie Flash a quasiment disparu de nos pages Web. Et c'est plutôt une bonne chose. Lourde à gérer et à modifier, peu ou pas du tout ergonomique, c'est à se demander comment on a pu s'en servir aussi longtemps. De son côté, le duo HTML5 et CSS3 ont fait d'énormes progrès, à tel point qu'ils sont devenus la référence.\nVoici 15 effets CSS3 à appliquer aux images et qui vont vous étonner !\nLire la suite Commentaire (18) Clics: 80506\nSécuriser la communication des mots de passe\nDans mon activité de webmaster, je suis souvent confronté à un souci majeur de sécurité informatique avec mes clients. En effet, lors de la livraison d'un site, je dois communiquer au propriétaire, des données sensibles (identifiants et mots de passe). Si d'autres professionnels ne prennent pas cette peine avec leurs clients, je mets un point d'honneur à livrer un site complet aux miens.\nMon souci est la sécurisation du transfert de ces données. Voici comment il est possible de le résoudre.\nLire la suite Commentaire (8) Clics: 6657\nLes 10 meilleurs templates Joomla gratuits pour les petites entreprises (150668 clics)\n15 effets CSS3 pour vos images (80506 clics)\n10 outils en ligne pour tester la sécurité de votre site (55741 clics)\nComparatif : les navigateurs Internet (Sept. 2014) (47330 clics)\n10 extensions incontournables pour Joomla (27392 clics)\n12 outils pour valider le Responsive Design de votre site (27235 clics)\nTutoriel : réaliser un site web avec l'effet Parallaxe (25834 clics)\nFélicitations très cher auteur!\nBonjour, Je voudrais juste dire que, dans mon contexte professionnel, nous devions utiliser une solu...\n10 outils en ligne pour tester...\nTon article est super!Merci pour le blog.\nLes 10 meilleurs templates Joo...\nComment réussir son projet web...\nDes outils intéressants que je découvre, notamment ceux pour supprimer les liens nocifs comme Remove...\n11 outils pour lutter contre l...\nLe SEO, la sécurité, le web design, les langages web, le respect de la vie privé, l'e-commerce, le marketing online et plus largement tout ce qui touche aux sujets en lien avec le web vous intéresse ? 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vendredi 29 mars 2019 02:47\nSujet : individus non reliés\nindividus non reliés\nJe voudrais identifier dans un fichier sous HEREDIS 2019 tous les individus qui ont été saisis mais ne sont pas reliés à l'arbre sachant qu'ils ne sont pas forcement isolés (cela peut être un couple ou toute une branche)\nJe n'ai pas su faire avec la recherche intelligente\ndimanche 2 déc. 2018 15:35\nSujet : archives Marmande\nRe: archives Marmande\nje connaissais bien entendu vote lien et j'ai fini par retrouver l'acte recherché mais bien caché\nmercredi 28 nov. 2018 14:38\nbonjour, je rencontre pas mal de difficultés pour mes recherches sur Marmande - plusieurs paroisses - pas de site de dépouillement - et ca c'est ainsi ....des registres souvent illlisibles Alors à tout hasard, je recherche les ascendants de ARNAUD DUTHEIL (duthil, dutil, duteilh....) Marié le 8 juil...\nmercredi 21 nov. 2018 16:13\nSujet : CONNEXION AUTOMATIQUE ?\nRe: CONNEXION AUTOMATIQUE ?\nJe vois ce que vous voulez dire ... Quand je suis sur un individu (dans Heredis 2019) et que je fais "rechercher dans tous les sites" comme j'ai sélectionné 3 sites : HEREDIS, GENEANET et Filae (je suis abonnée aux 3), mon navigateur s'ouvre sur 3 onglets : HEREDIS online, GENEANET et Filae je consu...\nmercredi 21 nov. 2018 13:19\nSujet : liste de notes individuelles\nRe: liste de notes individuelles\nC'est ok, désolée du dérangement et merci\nmercredi 21 nov. 2018 13:14\n1) Lancer une recherche intelligente sur individus, notes, note individuelle, n'est pas vide 2) Dans le traitement des individus résultant de cette recherche : - editer une liste paramétrable d'individus Dans cette liste ajouter : Identité/Note individuelle c'est le "n'est pas vide" que je ne trouv...\nmercredi 21 nov. 2018 13:03\nca c'est fait mais il faut que je clique sur "connexion"\nmercredi 21 nov. 2018 12:31\nliste de notes individuelles\nJe voudrais faire un peu de nettoyage dans mes notes individuelles\nSous Heredis 2019 est il possible de les éditer en liste ?\nmercredi 21 nov. 2018 12:29\nj'ai un abonnement heredis premium et j'ai heredis 2019 et lorsque que je lance une recherche d'un individu sur plusieurs sites , je dois systématiquement me reconnecter à Heredis Online\nPourquoi, n'y a t il pas moyen de rester connecté ?\nmardi 13 nov. 2018 18:59\nSujet : aide à la lecture - merci\nRe: aide à la lecture - merci\nTu as l'air d'avoir l'oeil.... alors je continue, je cherche le nom de la mère de la mariée\n.... et de Marie ...., père et mère ...\n(veux tu que je te donne un indice ?)\nCapture d’écran 2018-11-13 à 17.47.11.png (164.04 Kio) Vu 1458 fois


200 Magasin De Meuble Reims | southfloridasalon.com\nHome » table de bar but » 200 Magasin De Meuble Reims\nApril 3, 2019 January 18, 2019 · table de bar but by andini\nIntérieur réalité il y a ces gens qui generate améliorations within leur habitation chaque individu et chaque saison.\ndécoration est un chemin vers lancer prompt ajustements in emplacement . Américains visite a Magasin De Meuble Reims\nsont parfois attirés vers vers les produits cosmétiques de la zone région . Pour certains bizarre raison]@ la femme habitants Plaisir Faire Variantes, particulièrement en direction de leurs Magasin De Meuble Reims\n. Sable désinvolte, jusqu’à ce que la fin stop semble être un minime porté. Pin wooden Magasin De Meuble Reims\nsont spécialement magnifique, avec le étincelant réflexion de chaque chose within Magasin De Meuble Reims\n. Ceci est sincère mon favorisé style de habitation decor cause qu’ils fournissent a exceptionnel et rustique aspect visuel en direction de votre residence et ces types de peuvent en plus être employé pour divers autres tactiques. Avoir besoin d’avoir à vers insérer votre individuel personne contact vers région décor? Crochet un couple doilles, développer un pays Magasin De Meuble Reims\nétagère murale vers vers continue de garder certains de vos bibelots. Même un instant grande différence within votre house la décoration va délivrer vous ressentez frais et contemporain. Pour certains non conventionnel raison]@ la femme populace Plaisir Fabriquer Améliorations, spécialement en direction de leurs Magasin De Meuble Reims\nMaximum femmes de tous âges apprécier joie principe de Magasin De Meuble Reims\ndécoration. Avoir maison décoration stratégies et idées, Ceux complètement transformer leurs ménages dans la direction de en forme le chaque année.\nQuand a propriétaire leur home, un peu de Magasin De Meuble Reims\ndécorant @[may|might|may|may|may may|pourrait|peut-être|peut-être|peut-être|renforcer leurs options de résultats. Cela serait certainement définitivement produire un Merveilleux influence on a futur client.\nGallery of 200 Magasin De Meuble Reims\nTags: magasin de meubles luxembourg, magasin de meubles saint tropez, magasin de musique wissembourg, magasin de tissu a cherbourg, magasin dk, magazin de articole religioase, magazin de prezentare blanuri orastie, magazin deckblatt erstellen, magazin decoratiuni, magazin der hamburger, magazin der schwarzwald, magazin deutscher drucker\nRelated Post to 200 Magasin De Meuble Reims


Bain d'huile contre chauffage électrique...\n14/01/2019, 00h02 #1\nVoilà, je ne suis que locataire de mon appartement mais je me pose tout de même la question de savoir s'il est possible de faire changer le radiateur du salon contre un bain d'huile.\nEn effet ces grille-pains consomment un max pour une efficacité très douteuse (sans parler de l'esthétique)\nDonc s'il est possible, en terme de branchements, raccords... de remplacer mon radiateur par un en fonte à bain d'huile (car oui c'est cela que j'ai en tête) si quelqu'un parmi vous pouvait me renseigner sur la faisabilité de l'entreprise ainsi que son coût, je lui en serais très reconnaissante !\n14/01/2019, 01h24 #2\nRe : Bain d'huile contre chauffage électrique...\nbonjour, Alors, si je comprends bien, vous avez un convecteur électrique, et vous voudriez le faire remplacer par un radiateur électrique à fluide ou à coeur de chauffe en fonte. C'est soit fluide soit fonte.\nUn radiateur bain d'huile est un radiateur électrique contenant une sorte d'huile chauffée par une résistance électrique et il est sur roulettes. Les radiateurs fixés au mur sont soit à fluide, soit fonte, céramique, stéatite etc....\nMais il faut savoir que dans un radiateur, il n'y a que la résistance qui produit de la chaleur, le reste, fluide, fonte.... ne sert qu'à faire un petite stockage pour avoir une chaleur plus régulière qu'avec un convecteur, mais aucun solide ou liquide n'a la propriété surnaturelle de multiplier les calories produites par la résistance. Déjà il faut savoir cela. Donc, normalement le même rendement, mais un peu plus agréable, même si un peu plus long à chauffer.\nSi vous tenez à remplacer un radiateur à vos frais, personne ne vous en empêchera (mais si vous voulez le récupérer à la sortie, il faut conserver ce que vous avez pour le rendre au propriétaire.)\nNe vous ruinez pas, car un radiateur à 500 euros de même puissance qu'un autre à 150 euros consommeront pareil.\nAttention aux écrans compliqués pour lesquels il faut afficher le mode d'emploi au dessus du radiateur. En tout cas, il ne faut pas le perdre.\nVous pouvez aller voir dans les magasins de bricolage ils peuvent vous indiquer un installateur qui leur fait la pose pour ceux qui le désirent. Et ne vous laissez pas trop baratiner par le vendeur qui est payé pour faire du chiffre. Les radiateurs à fluide sont ceux dont l'effet se rapproche le plus de celui du chauffage central, et ils ne sont pas trop chers. allez dans plusieurs magasins. Actuellement les soldes commencent, vous pourriez faire une bonne affaire.\nPour ne pas trop consommer : jamais de thermostat à fond sinon la résistance fonctionne bien plus longtemps (souvent pour rien : surchauffe de l'appart donc gaspillage). Il faut savoir qu'un radiateur a une puissance FIXE. Par ex. un radiateur de 1000 watts consomme 1000 watts à l'heure lorsque le thermostat lui donne le courant, et plus rien lorsque le thermostat coupe le courant. Le thermostat n'agit que sur la durée de conso de la résistance et pas sur la puissance qui est fixe. donc la conso est proportionnelle à la durée de fonctionnement de la résistance. Ceci dit il faut avoir un thermomètre dans la pièce à au moins un mètre du radiateur et pas dans un courant d'air pour voir ce que ça donne et régler le thermostat en fonction. Attention, ça ne réagit pas instantanément, loin de là.\nIl faut regarder la puissance du radiateur actuel et prendre la même puissance, en tout cas pas moins, sinon ça risquerait d'être insuffisant ce qui ferait consommer plus.\n14/01/2019, 07h43 #3\nEnvoyé par Paulinploi\nTu te fais tromper par le RESSENTI de ce que tu nommes " efficassité".\nLe grille pain ou celui à bain d'huile te restiturons la MEME puissance si leur consommation\nEn clair ils produisent la meme quantité de calories...MAIS le ressenti n'est pas forcément le meme.\nCa ne chauffera pas MIEUX une piéce.\n« Un plafond bien isolé, réchauffe les maisons passoires. | Humidité relative et sensation de sécheresse »\n[Thermique] radiateur électrique a bain d'huile en panne\nPar Omnitrix dans le forum Dépannage\nDernier message: 05/11/2017, 14h45


Récompensé du prix du meilleur film dramatique aux Golden Globes, ce chef-d’œuvre cinématographique, filmé par Sam Mendes (qui a lui-même obtenu le prix du meilleur réalisateur lors de la cérémonie), nous plonge dans les méandres de la Première Guerre mondiale à travers des images époustouflantes. Le scénario? Deux soldats britanniques doivent traverser le territoire ennemi afin de délivrer un message d’une importance capitale.\nLe scénariste de To All the Boys I’ve Loved Before, succès phare de Netflix, nous offre une nouvelle comédie à l’eau de rose. Le synopsis ne réinvente pas la roue: l’été avant le début de son université, Auden – élève consciencieuse qui a toujours fait passer l’école avant le reste – rencontre Eli dans la petite ville paisible de Colby. Insomniaque comme elle, il lui fera découvrir les joies de l’adolescence et l’insouciance qui l’accompagne.\nÀ voir dès le 6 mai.\nCe documentaire choquant revient sur un fait divers qui a bouleversé la ville d’Indianapolis, aux États-Unis, en 2019. Médecin spécialiste en fertilité, Donald Cline a, dans les années 1970 et 1980, utilisé son propre sperme pour inséminer au moins une cinquantaine de patientes, sans qu’elles soient tenues au courant. Des années plus tard, cette fraude – qui reste encore aujourd’hui impunie par la loi – est mise en lumière par l’une de ses filles biologiques, après qu’elle a réalisé un test ADN.\nÀ voir dès le 11 mai.\nInspiré d’une histoire vraie, Operation Mincemeat revient sur un plan étonnant élaboré par le service de renseignement britannique lors de la Seconde Guerre mondiale: faire échouer sur les côtes ennemies un cadavre porteur de (faux) documents hautement confidentiels. Le but? Éloigner les troupes allemandes de la Sicile, en vue d’un débarquement.\nOn a dévoré Selling Sunset en une fin de semaine? Heureusement, la saison 2 de Bling Empire arrive juste à temps pour satisfaire nos envies de drames et de potins. Cette téléréalité, filmée à Los Angeles, nous dévoile le quotidien grandiose – pour ne pas dire scandaleux – d’un groupe ultrariche d’amis asiatiques ou américains d’origine asiatique.


Andréanne Larouche en Égypte: décembre 2013\nAndréanne Larouche en Égypte\nLa journée a commencé tôt, vers 4h30 environ, puisque je fus réveillée par les prières crachées par les hauts parleurs des mosquées près du gîte. Déjà que j’avais eu de la difficulté à m’endormir... À notre réveil officiel vers 6h30, c’est encore un matin de course folle, puisqu’il fallait prendre notre vol pour Luxor à 10h30, qu’on a presque manqué d’ailleurs… Et oui, j’avais trop bien rangé le filage de Richard et il fallait repasser par le détour de la veille sur la route barrée…\nFinalement, la suite de notre déplacement s’est très bien déroulée. Nous sommes même atterris à Luxor avec un vol de moins d’une heure. Le trajet vers l’hôtel m’a permis de voir un paysage vert… dans les deux sens, c’est-à-dire avec une belle végétation et sans déchet sur le chemin... ou presque. La température à l’extérieur est de 23˚C et surtout… il n’y pas de smog !!! Le bonheur pour mon système respiratoire !!!\nArrivé à l’hôtel, Richard se montre très méfiant en prévision de notre visite du lendemain dans la vallée des rois et dans la vallée des reines, probablement échaudé par notre expérience de la veille… Nous décidons plutôt d’aller marcher dans la ville jusqu’au temple de Karnak qui est une véritable merveille selon Richard. Le trajet fût une expérience plutôt difficile, entrecoupé de chauffeurs de calèches qui vous supplient de vous conduire au temple pour quelques livres égyptiennes… pour sauver leur cheval !!! Sans oublier les enfants qui marchent pieds nus dans la rue, qui viennent te demander ton nom et quelques pièces pour manger…\nVue panoramique des temples de Karnak au lac sacré\nLa suite se déroula plutôt bien, Richard refusant systématiquement toute demande d’assistance d’un guide ou d’un directeur photo ; ) Après les pyramides hier, j’ai découvert aujourd’hui une autre partie sacrée de l’histoire égyptienne. Les temples représentaient pour les égyptiens des lieux de rassemblements festifs. Ici, ce n’était pas la mort que l’on célébrait, mais la vie ! C’est aussi là que les grands prêtres réfléchissaient aux règles qui devaient dicter la société. Et oui, comme quoi, ce n’est pas d’hier que religion et politique sont inter-reliées. Y avait-il aussi à l’époque un débat autour des accommodements raisonnables ?\nAlors que nous nous questionnions si nous étions pour sauver un cheval pour notre retour à l’hôtel, le Nil est apparu devant nous, majestueux !!! Nous avons plutôt marché le long du fleuve sous le soleil couchant qui donne au décor une couleur dorée rappelant le passé glorieux des grands pharaons d’Égypte…\nTrêve de poésie, nous sommes arrivés au Iberhotel pour planifier notre soirée du nouvel an. Alors que nous voulions simplement savoir les prix et les choix du menu à la carte, nous apprenions que le forfait du réveillon à 92 euros, oui, oui, vous avez bien lu, près de 125$ can, nous était offert gratuitement. Une offre que nous ne pouvions refuser. Au moment d’écrire ces lignes, je reviens d’un souper sept services sur un bateau stationné sur le Nil… pour la modique somme d’une bouteille de vin…Pas mal pour terminer 2013 et commencer 2014… avec sept heures d’avance sur vous xxx\nPublié par François Danis à 13:53 Aucun commentaire:\nLa journée avait pourtant bien commencé avec une belle séance au gym du Novotel. Puis, la route vers les pyramides me confirma les grandes inégalités des classes égyptiennes. En plus de me faire voir de véritables dépotoirs à ciel ouvert un peu partout le long des routes. Nous rencontrons finalement un premier obstacle, une route en construction. Nous devons faire un détour sous le bruit infernal de centaines de klaxons, véritable pollution auditive. Mais loin de moi l’idée de vouloir me plaindre…\nSurtout qu’après avoir cherché notre gîte avec notre chauffeur de taxi, nous arrivons à destination. Nous sommes merveilleusement bien accueillis et la vue est superbe. De notre balcon, nous pouvons carrément apercevoir les pyramides et le Sphinx. Nous partons donc à la recherche de l’entrée du site, sous les avertissements de notre aubergiste.\nAprès avoir marché un peu dans la ville, nous décidons de revenir à notre gîte où l’on nous confirme le lieu exact de l’entrée du site des pyramides. Nous calculons notre argent en nous disant que nous avons le montant exact pour entrer et que sur place, nous pourrons sûrement retirer les fonds pour la suite des choses. À notre arrivée, un sympathique jeune homme se présente comme un employé du site qui ne veut pas d’argent. Nous lui expliquons que nous venons de dépenser nos dernières livres égyptiennes et que nous devons retirer de l’argent pour pouvoir entrer à la grande pyramide de Khéops et au musée de la barque solaire. Richard insiste également auprès de lui pour lui dire qu’il n’en est pas à sa première visite et qu'il n'a pas besoin d'un guide.\nPar la suite, nous le suivons et il nous fait découvrir le Sphinx. Je prends une série de clichés plutôt rigolos. Il nous présente ensuite à son oncle qui nous entraîne à la grande pyramide en nous disant de ne pas nous soucier de l’argent, qu’il nous fait confiance, qu'il nous l'avance et que nous lui rembourserons plus tard. Nous grimpons ainsi au cœur de la pyramide de Khéops. Claustrophobes s’abstenir. L’air est rare et les couloirs jusqu’à la chambre des morts sont étroits et montent parfois très abruptement. À notre sortie, l'oncle nous confirme que les touristes se font beaucoup plus rares qu’avant. Il nous conduit ensuite jusqu’au musée de la barque solaire. Plutôt impressionnant ce voir cet immense vaisseau conçu en cèdre libanais pour apporter le roi vers l’au-delà.\nNous pensions que notre après-midi s’achevait ainsi, lorsque notre guide nous appela une calèche et nous propose de nous conduire à un magnifique point de vue où nous pourrions apercevoir les neufs pyramides. Je rappelle à Richard que tout se paie ici, mais nous nous faisons entraîner à cheval vers cet endroit promis. Sur place, je me fais littéralement prendre et poser sur le dos d'un dromadaire. Je sens que nous perdons le contrôle de cette visite. Un jeune homme me tire vers une balade. Je dois lui rappeler que je n’ai plus d’argent et que je n'ai pas de bonbons pour qu’il me ramène au reste du groupe. Il insiste quand même pour recevoir des sous. Les flashs de caméras se multiplient et je commence à perdre patience face à la situation.\nLa calèche nous conduit ensuite à la 3e pyramide, Mykérinos, pour une ascension sur les pierres. Un nouveau guide nous entraîne vers une énième séance de photos. Je vois la facture monter en flèche. Encore une fois, on essaie de nous rassurer et de nous dire de ne pas nous soucier des sous. Puis, ce guide nous fait découvrir un nouveau tombeau, un site encore sous les fouilles archéologiques. Les hiéroglyphes sont impressionnants ! Notre visite doit se terminer là, mais les négociations musclées commencent à peine… Le guide de la pyramide de Mykérinos veut de l’argent, de même que l’oncle du 1er jeune homme, qui veut bien entendu se faire rembourser le prix d’entrée de la pyramide de Khéops et du musée de la barque. Le conducteur de la calèche aussi veut sa part du gâteau. Bref, je sens que cette journée va nous coûter plutôt cher. Et oui, tout se paie ici…\nDe retour à notre gîte, cette séance de négociation nous a un peu beaucoup gâché ce bel après-midi. Nous nous installons pour manger un repas et pour voir le spectacle de son et lumière, mais le cœur n’y est pas… Je réalise l’ampleur de la détresse de la majorité du peuple égyptien et comme le rappelle Richard, seulement 10% de la population peuvent vraiment se payer les produits de luxe que l’on voit sur les panneaux publicitaires le long de l’autoroute. Le reste, ils doivent tenter de tirer le maximum des touristes qui se font de plus en plus rares… Sans oublier la situation politique plutôt complexe. Bref, ce soir, le vin a un goût plutôt doux amer…\nPublié par François Danis à 13:17 Aucun commentaire:\nJour 2... et 1 !\nOuf !!! Je suis déjà rendue à la fin de la 2e journée… disons que la 1ère journée a passé… un peu rapidement ! Pour résumer notre départ, nous avons pris l’avion à Montréal le 27 décembre vers 19h, après le tchin que tant de gens ont vu sur facebook, destination Amsterdam. Après un vol de nuit d’environ six heures où je n’ai pu dormir étant donné trop de bons films, dont l’excellent néerlandais Het diner, nous atterrissons à… sept heures du matin heure locale d’Amsterdam. Et pas question d’aller se coucher, puisque notre vol pour le Caire ne repart qu’à 20h50 le soir et que Richard Leclerc a décidé de faire mon initiation d’Amsterdam. Mais pas celle du type que vous imaginez… nous sommes restés sages.\nNous marchons donc jusqu’au train pour nous rendre au centre-ville sous un ciel gris. Première chose à faire, prendre un bon café latté au Café Van Gogh, et oui, nous sommes à Amsterdam. Nous nous retrouvons donc à siroter la précieuse boisson chaude sur le bord d’un des milles canaux. Nous marchons ensuite vers le musée du même nom. Après près d’une heure de marche, nous croisons une patinoire extérieure. À première vue, cela peut paraître normal en hiver, mais ici, il fait plus de cinq degrés et il n’y a pas de neige. En plus, le soleil chasse même les nuages et le gazon est même plutôt vert !\nArrivés au musée, nous constatons qu’il y a plus d’une heure d’attente, mais Richard insiste, c’est un musée à voir absolument dans cette ville. J’avoue que la visite fût plus qu’intéressante. Malheureusement, puisque la visite de ce musée est plutôt longue, il ne nous reste que le temps de manger une bouchée dans un sympathique pub néerlandais… accompagnée d’une Heineken bien sûre ! S’ensuivit une course folle vers l’aéroport entre les nombreux vélos et la marée humaine qui est venue célébrer au Winter Market… Dommage que nous devions déjà quitter, car je pense qu’il me reste beaucoup à découvrir de cette ville.\nL’avion vers Le Caire repart à 20h50 pour un vol de plus de quatre heures. Nous atterrissons finalement à 2h10 du matin, heure locale égyptienne, avec encore de l’attente pour le visa et pour les douanes. Heureusement, c’est avec un miracle comme le demande Richard que la navette pour le Novotel arrive. Premier constat, ceux qui se plaignent de la qualité de l’air au Québec n’ont pas pris une bouffée égyptienne. Ce qui fait qu’au moment de déposer les bagages et de se mettre au lit, cela fait pour moi près de 48 heures que je n’ai pas dormi.\nMalheureusement, trop de temps de sommeil à rattraper fait que nous nous levons à… midi ! Une douche, un bon cappuccino et c’est déjà la course pour essayer de profiter de cette 1re journée au Caire, car le musée de la capitale ferme à 16h30. Richard négocie un taxi et en route pour le musée du Caire. Avis à ceux qui se plaignent de la conduite de certaines personnes au Québec, ils n’ont rien vu. Ici, la ceinture de sécurité ne sert pas, même pour les enfants, les sens uniques et les lignes blanches ne veulent rien dire.\nAprès un parcours stressant, nous sommes accueillis par de nombreux chars d’assauts, des soldats et des barbelés. Malgré cette présence inquiétante, nous réussissons à entrer dans le Musée du Caire. J’avoue que ma bouche est restée ouverte devant tant de pièces historiques racontant un passé si fascinant. J’aurais bien porté certains bijoux de Toutânkhamon et de Nefertiti. Bien hâte de voir la suite dans les jours suivants. En sortant, nous nous arrêtons pour prendre rapidement la fameuse photo avec le sphinx, car je constate qu’un soldat portant une mini mitraillette qui vous demande de circuler est un élément convaincant pour quitter les lieux.\nNous reprenons ensuite notre taxi pour un arrêt-photo sur la désormais mythique Place Tahrir, dont Richard m’a tant parlé après y avoir été en janvier 2011. Comme nous n’avons toujours pas eu le temps de manger, notre chauffeur nous conduit au restaurant conseillé par Christian Mésenge, le directeur du Département Santé de l’Université Senghor où Richard donnera sa formation la semaine prochaine. Situé dans un quartier huppé de la ville et sur le bord du Nil, le Left Bank se révèle un excellent choix. Le canard glacé et la crème brûlée y sont délicieux.\nDe retour à l’hôtel, c’est déjà le temps de refaire les bagages pour quatre autres journées de découvertes.\nPublié par François Danis à 14:48 Aucun commentaire: