Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies | Protocol (Translated to French)\nPCR a émergé comme une technique courante dans de nombreux laboratoires de biologie moléculaire. Pourvu voici un guide rapide à plusieurs protocoles de PCR classiques. Parce que chaque réaction est une expérience unique, les conditions optimales nécessaires pour générer un produit varie. Comprendre les variables dans une réaction permettra d'améliorer grandement l'efficacité de dépannage, augmentant ainsi les chances d'obtenir le résultat souhaité.\nDans le domaine des sciences biologiques, il ya eu des avancées technologiques qui catapultent la discipline dans les âges d'or de la découverte. Par exemple, le domaine de la microbiologie a été transformée avec l'avènement du microscope Anton van Leeuwenhoek, qui a permis aux scientifiques de visualiser les procaryotes pour la première fois. Le développement de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une de ces innovations qui ont changé le cours de la science moléculaire avec son impact s'étend sous-disciplines de la biologie innombrables. Le processus théorique a été décrite par Keppe et ses collègues en 1971, mais il a fallu encore 14 ans jusqu'à ce que la procédure complète de PCR a été décrit et appliqué expérimentalement par Kary Mullis, tout en Cetus Corporation en 1985. Automatisation et raffinement de cette technique progressé avec l'introduction d'une ADN polymérase stable thermique de la bactérie Thermus aquaticus, par conséquent, la Taq ADN polymérase nom.\nLa PCR est une Powetechnique d'amplification rful qui peut générer une grande quantité d'un segment spécifique de l'ADN (c.-à-un amplicon) à partir de seulement une petite quantité de matériau de départ (par exemple, la matrice d'ADN ou la séquence cible). Bien que simple et généralement sans problème, il ya des pièges qui compliquent la réaction produisant des résultats erronés. Lorsque PCR échoue, il peut conduire à de nombreux produits d'ADN non-spécifiques de différentes tailles qui apparaissent comme une échelle ou un frottis de bandes sur des gels d'agarose. Parfois, aucun produit se former à tous. Un autre problème potentiel se produit lorsque les mutations sont introduites involontairement dans les amplicons, résultant dans une population hétérogène de produits de PCR. Échecs PCR peut devenir frustrant à moins de patience et de dépannage attention sont employées pour trier et résoudre le problème (s). Ce protocole énonce les principes fondamentaux de la PCR, fournit une méthodologie qui se traduira par l'amplification de séquences cibles la plupart des, et présente des stratégies pour optimiser une réaction. En suivant ce guide PCR, students devrait être en mesure de:\nMettre en place des réactions et des conditions de cyclage thermique pour une expérience PCR conventionnelle\nComprendre le fonctionnement des composants de réaction différentes et leur effet global sur une expérience de PCR\nConcevoir et optimiser une expérience de PCR pour toute matrice d'ADN\nRésoudre les problèmes liés échoué expériences de PCR\n1. Concevoir des amorces\nConception des amorces appropriées est essentiel à la réussite d'une expérience de PCR. Lors de la conception d'un ensemble d'amorces à une région spécifique de l'ADN désiré pour l'amplification, une amorce doit s'hybrider au brin plus, qui, par convention est orienté dans le sens 5 '→ 3' (aussi connu comme le sens ou nontemplate brin) et le autre amorce doit compléter le brin moins, qui est orientée dans la 3 '→ 5' (antisens ou brin matrice). Il ya quelques problèmes communs qui se posent lors de la conception des amorces: 1) Auto-hybridation avec les amorces entraînant la formation de structures secondaires telles que des boucles en épingle à cheveux (Figure 1a), 2) hybridation des amorces à l'autre, plutôt que de la matrice d'ADN, la création d'amorce dimères (figure 1b), 3) des températures de fusion radicalement différents (T m) pour chaque amorce, ce qui rend difficile de sélectionner une température de recuit qui seront tousomment les deux amorces pour lier efficacement à leur séquence cible au cours Thermal vélo (figure 1c) (voir les sections calcul de la température de fusion (T m) et modifications des conditions de CYCLISME pour plus d'informations sur les T m s).\nVoici une liste de caractéristiques qui devraient être considérés lors de la conception des amorces.\nLongueur de l'amorce doit être 15-30 résidus nucléotidiques (bases).\nOptimal teneur en GC devrait se situer entre 40-60%.\nL'extrémité 3 'des amorces devrait contenir un G ou C en vue de serrer l'amorce et d'empêcher "respire" d'extrémités, en augmentant l'efficacité d'amorçage. ADN «respiration» se produit lorsque les extrémités ne restent pas recuit, mais une bagarre ou diviser. Les trois liaisons hydrogène dans les paires GC aider à prévenir la respiration, mais aussi d'augmenter la température de fusion des amorces.\nLe extrémités 3 'd'un jeu d'amorces, qui comprend une amorce brin plus et une amorce brin moins, ne doivent pas être c COMPLEMENTAIRES une à l'autre, ni l'extrémité 3 'd'une amorce simple être complémentaire à d'autres séquences dans l'amorce. Ces deux scénarios entraîner la formation de dimères d'amorces et les structures en boucle en épingle à cheveux, respectivement.\nTempératures de fusion optimales (T m) pour la gamme des amorces entre 52-58 ° C, bien que la gamme peut être étendu à 45-65 ° C. Le m final T pour les deux amorces devraient ne diffèrent pas de plus de 5 ° C.\nDi-nucléotidiques répétitions (par exemple, ou GCGCGCGCGC ATATATATAT), les pistes de base unique (par exemple, AAAAA ou CCCCC) devraient être évités car ils peuvent provoquer le glissement le long du segment amorcée des structures de boucle en épingle à cheveux d'ADN et ou à la forme. Si inévitables dues à la nature de la matrice d'ADN, puis seulement comprennent répétitions ou à une base unique fonctionne avec un maximum de 4 bases.\nIl ya de nombreux programmes informatiques conçus pour aider à concevoir des paires d'amorces. Outil de conception d'amorce NCBIw.ncbi.nlm.nih.gov / outils / amorce-fourneaux / "target =" _blank "> http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ et Primer3 http://frodo .wi.mit.edu/primer3 / sites recommandés sont à cet effet.\nAfin d'éviter l'amplification de pseudogènes connexes ou homologues il pourrait être utile d'exécuter un coup sur NCBI pour vérifier la spécificité de la cible des amorces.\n2. Matériels et réactifs\nLorsque la mise en place d'une expérience de PCR, il est important d'être préparé. Porter des gants pour éviter de contaminer le mélange réactionnel ou réactifs. Inclure un contrôle négatif, et si possible un contrôle positif.\nDisposer tous les réactifs nécessaires pour l'expérience PCR dans un seau à glace fraîchement rempli, et laissez-les dégeler complètement avant de mettre en place une réaction (Figure 2). Gardez les réactifs sur la glace tout au long de l'expérience.\nStandard réactifs PCR comprend undéfinir des amorces appropriées pour le gène cible désirée ou d'un segment d'ADN à amplifier, l'ADN polymérase, une mémoire tampon pour la polymérase d'ADN spécifique, désoxynucléotides (dNTP), la matrice d'ADN, et de l'eau stérile.\nDes réactifs supplémentaires peuvent comprendre sel de magnésium Mg 2 + (à une concentration finale de 0,5 à 5,0 mM), K sel de potassium + (à une concentration finale de 35 à 100 mM), diméthylsulfoxyde (DMSO; à une concentration finale de 1-10% ), le formamide (à une concentration finale de 1,25 à 10%), la sérum albumine bovine (à une concentration finale de 10-100 pg / ml), et la bétaïne (à une concentration finale de 0,5 M à 2,5 M). Les additifs sont discutées plus loin dans la section dépannage.\nOrganiser le matériel de laboratoire sur l'établi.\nLe matériel comprend des tubes PCR et casquettes, d'une étagère tube de PCR, un marqueur résistant à l'éthanol, et un ensemble de micropipettes qui distribuent entre 1 à 10 pi (P10), 2 - 20 pi (P20), 20 - 200 pi (P200)et 200 - 1000 pl (P1000), ainsi que un cycleur thermique.\nLorsque la mise en place de plusieurs expériences de PCR qui utilisent tous les mêmes réactifs, ils peuvent être mis à l'échelle appropriée et combinés entre eux dans un mélange maître (Master Mix). Cette étape peut être effectuée dans un stérile 1,8 ml microtube (voir Notes).\nPour analyser les amplicons résultant d'une expérience de PCR, réactifs et du matériel pour l'électrophorèse sur gel d'agarose est nécessaire. À estimer la taille d'un produit de PCR, une échéant, disponible dans le commerce type moléculaire taille poids est nécessaire.\n3. Mise en place d'un mélange réactionnel\nCommencez par faire une table des réactifs qui seront ajoutés au mélange réactionnel (voir tableau 1).\nEnsuite, l'étiquette PCR tube (s) avec le marqueur résistant à l'éthanol.\nDes volumes de réaction varie en fonction des concentrations des réactifs d'achat d'actions. Les concentrations finales(FC) pour un type réactionnel de 50 ul sont les suivantes.\nX tampon (généralement fourni par le fabricant de l'ADN polymérase; peut contenir 15 mM MgCl 2). Ajouter 5 pi de tampon 10X par réaction.\n200 uM de dNTP (50 uM de chacun des quatre nucléotides). Ajouter 1 ul de 10 mM de dNTPs par réaction (dATP, dCTP, dTTP et dGTP sont à 2,5 mM chacun).\n1,5 mM de Mg 2 +. Ajouter uniquement si elle n'est pas présente dans le tampon 10X ou comme nécessaire pour l'optimisation de PCR. Par exemple, pour obtenir le 4,0 mM Mg 2 + nécessaire à la production optimale d'un amplicon conservé 566 pb segment d'ADN trouvé dans une mycobactériophage non caractérisés ajouter 8 pi de 25 mM MgCl 2 à la réaction (figure 3).\n20 à 50 pmol de chaque amorce. Ajouter 1 ul de chaque amorce 20 uM.\nAjouter 10 4 à 10 7 molécules (ou d'environ 1 à 1000 ng) matrice d'ADN. Ajouter 0,5 pi de 2ng / & mu; L'ADN génomique mycobactériophage l.\nAjouter 0,5 à 2,5 unités d'ADN polymérase par réactionnel de 50 ul (Voir les recommandations du fabricant) Par exemple, ajouter 0,5 pi de Sigma 0,5 unités / ul ADN polymérase Taq.\nAjouter QS eau distillée stérile pour obtenir un volume de 50 ul final par réaction comme pré-déterminée dans le tableau de réactifs (QS est une abréviation latine pour quantum satis-dire le montant qui est nécessaire). Ainsi, 33 pi par réaction est nécessaire pour porter le volume à 50 ul. Toutefois, il convient de noter que l'eau est ajouté en premier, mais exige d'abord faire une table de réactifs et de déterminer les volumes de tous les autres réactifs ajoutés à la réaction.\n4. Basic PCR protocole\nPlacez une plaque de 96 puits dans le seau à glace en tant que titulaire pour les 0,2 ml minces parois des tubes PCR. Permettre réactifs de PCR pour être ajouté dans le froid de 0,2 ml minces parois des tubes PCR aidera à prévenir nucleasl'activité e et d'amorçage non spécifique.\nIntroduire à la pipette les réactifs de PCR suivantes dans l'ordre suivant dans un tube de 0,2 ml PCR à paroi mince (Figure 4): de l'eau stérile, un tampon PCR 10X, les dNTP, de MgCl 2, amorces et l'ADN matrice (voir tableau 1). Comme les expériences doivent avoir au moins un contrôle négatif, et éventuellement un contrôle positif, il est avantageux de mettre en place un Master Mix dans un tube de 1,8 ml de microcentrifugation (Voir l'explication dans les notes).\nDans quelques 0,2 ml séparés minces parois des tubes PCR (Figure 4) ajouter tous les réactifs à l'exception de l'ADN modèle pour un contrôle négatif (augmentation de l'eau pour compenser le volume manquant). En outre, une autre réaction (si réactifs sont disponibles) doit contenir un contrôle positif en utilisant l'ADN matrice et d'amorces précédemment connues ou d'amplifier dans les mêmes conditions que les tubes PCR expérimentales.\nTaq ADN polymérase est généralement stocké dans un glycérol à 50%solution et la dispersion complète dans le mélange réactionnel nécessite douce mélanger des réactifs de PCR en pipetant au moins 20 fois. La micropipette devrait être fixé à environ la moitié du volume de réaction du mélange maître lors du mélange, et les soins devraient être prises pour éviter d'introduire des bulles.\nPlacer des bouchons sur les tubes de 0,2 ml minces parois PCR et les placer dans le thermocycleur (Figure 5). Une fois le couvercle pour le thermocycleur est correctement fermé démarrer le programme (voir tableau 2).\nLorsque le programme est terminé, les 0,2 ml à paroi mince tubes PCR peut être enlevé et stocké à 4 ° C. Les produits de PCR peut être détectée par le chargement des parties aliquotes de chaque réaction dans des puits d'un gel d'agarose puis coloration d'ADN qui a migré dans l'électrophorèse sur gel suivant au bromure d'éthidium. Si un produit de PCR est présent, le bromure d'éthidium se intercaler entre les bases des brins d'ADN, ce qui permet de visualiser les bandes avec un illuminateur UV. </ Li>\nLorsque la mise en place de multiples expériences de PCR, il est avantageux de monter un mélange de réactifs communs à toutes les réactions (c.-à-Mix Master). Habituellement le cocktail contient une solution de l'ADN polymérase, dNTP, un tampon de réaction, et de l'eau assemblé dans un tube de microcentrifugation 1,8 ml. La quantité de chaque réactif ajouté au mélange maître est équivalent au nombre total de réactions plus 10% arrondi au plus proche de réaction entière. Par exemple, si il ya 10 x 0,1 = 1 réaction, alors (10 + 1) x 5 pi de tampon 10X est égal à 55 pi de tampon 10X pour le Master Mix. Les réactifs dans le Mix Master sont mélangés minutieusement en faisant doucement le piston de pompage d'une micropipette de haut en bas environ 20 fois comme décrit ci-dessus. Chaque tube de PCR reçoit une aliquote de la Master Mix à laquelle la matrice d'ADN, des amorces requises, et d'expérimenter les réactifs spécifiques sont ensuite ajoutés (voir les tableaux 1 et 7).\nLe followisite ng offre un calculateur pour la détermination du nombre de copies d'un ADN matrice ( http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html ). Le nombre total de copies d'ADN double brin peut être calculée en utilisant l'équation suivante:\nNombre de copies d'ADN = (quantité d 'ADN (ng) x 6.022x10 23) / (longueur de l'ADN x 1x10 9 ng / ml x 650 daltons)\nCalcul du nombre de copies d'ADN est utilisée pour déterminer combien de modèle est nécessaire par réaction.\nLes faux positifs peuvent se produire comme une conséquence du report d'une autre réaction de PCR qui serait visualisées sous forme de plusieurs produits non désirés sur un gel d'agarose après électrophorèse. Par conséquent, il est prudent d'utiliser la bonne technique, notamment un contrôle négatif (et le contrôle positif lorsque cela est possible).\nAlors que le bromure d'éthidium est la plus courante f tacheou des acides nucléiques, il existe plusieurs alternatives plus sûres et moins toxique. Le site suivant décrit plusieurs des solutions de rechange, y compris le bleu de méthylène, Cristal Violet, SYBR Safe, et Gel-Rouge ainsi que des descriptions de la façon d'utiliser et de détecter le produit final ( http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the- solutions de rechange ou ).\nAlors que la plupart des machines modernes PCR utilisent des tubes de 0,2 ml, certains modèles peuvent nécessiter des réactions dans tubes de 0,5 ml. Consultez votre manuel thermique cyclistes afin de déterminer le tube de taille appropriée.\n5. Température de fusion de calcul (T m)\nConnaissant la température de fusion (T m) des amorces est impératif pour une expérience réussie PCR. Bien qu'il existe plusieurs calculateurs T m disponible, il est important de noter que ces calculs sont une estimation de la réelle m T, étant donné d'un manque de renseignements précis sur une réaction particulière et les hypothèses faites dans les algorithmes pour les calculatrices m T eux-mêmes. Toutefois, les modèles thermodynamiques du plus proche voisin sont préférés sur le calcul plus classique: T m ≈ 4 (GC) + 2 (AT). Le premier vous donnera plus précis T m estimation car elle prend en compte l'énergie d'empilement de paires de base voisines. Ce dernier est utilisé plus fréquemment parce que les calculs sont simples et peuvent se faire rapidement à la main. Voir la section Dépannage pour plus d'informations sur la façon dont diverses conditions de PCR et des additifs sur la température de fusion.\nPour calculer les valeurs T m par des modèles thermodynamiques du plus proche voisin, l'un des calculateurs suivants est recommandé:\nhttp://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py? # formes :: fusion\n6. Configuration conditions de cyclage thermique\nThermocycleurs PCR rapidement chauffer et refroidir le mélange réactionnel, permettant à la chaleur induite de dénaturation de l'ADN double brin (séparation des brins), recuit d'amorces à des brins plus et moins de la matrice d'ADN, et l'allongement du produit de PCR. Temps de cycle est calculée sur la base de la taille de la matrice et la teneur en GC de l'ADN. La formul généraleune commence par une étape de dénaturation initiale à 94 ° C à 98 ° C en fonction de la température optimale pour une activité ADN polymérase et la teneur en GC de l'ADN matrice. Une réaction typique commence par une dénaturation d'une minute à 94 ° C. Les plus de 3 minutes peut inactiver l'ADN polymérase, en détruisant son activité enzymatique. Une méthode, connue sous le nom de démarrage à chaud PCR, s'étend considérablement le temps de dénaturation initiale de 3 minutes à 9 minutes. Démarrage à chaud avec PCR, l'ADN polymérase est ajoutée après l'étape de dénaturation initiale exagérée est terminé. Cette modification de protocole évite l'inactivation de l'enzyme susceptible d'ADN polymérase. Reportez-vous à la section Dépannage de ce protocole pour plus d'informations sur Démarrage à chaud PCR et autres méthodes alternatives.\nL'étape suivante consiste à configurer le thermocycleur pour lancer le premier de 25 à 35 tours d'un cycle de température en trois étapes (tableau 2). Tout en augmentant le nombre de cycles au-dessus 35 entraîne uneune plus grande quantité de produits de PCR, tours de trop nombreux se traduit souvent par l'enrichissement de produits secondaires indésirables. Les trois étapes de température dans un seul cycle d'accomplir trois tâches: la première étape dénature le gabarit (et dans des cycles ultérieurs, les amplicons ainsi), la deuxième étape de recuit permet optimale d'amorces, et la troisième étape permettant l'ADN polymérase de se lier à la matrice d'ADN et de synthèse du produit de PCR. La durée et la température de chaque étape dans un cycle peut être modifiée pour optimiser la production de l'amplicon désiré.\nLe temps pour l'étape de dénaturation est aussi courte que possible. Habituellement 10 à 60 secondes est suffisant pour la plupart des modèles d'ADN. Le temps de dénaturation et de la température peut varier en fonction de la teneur en GC de l'ADN matrice, ainsi que le taux de rampe, qui est le temps que prend le cycleur thermique pour changer d'une température à l'autre. La température de cette étape est généralement le même que celui utilisé pour la phase initiale de dénaturation(Étape n ° 1 ci-dessus; par exemple, 94 ° C).\nUn 30 deuxième étape de recuit qui suit dans le cycle à une température définie d'environ 5 ° C au-dessous du ressort m T des amorces (idéalement entre 52 ° C à 58 ° C).\nLe cycle se termine par une étape d'élongation. La température dépend de l'ADN polymérase choisie pour l'expérience. Par exemple, l'ADN polymérase Taq avec une température optimale d'allongement de 70 ° C à 80 ° C et nécessite 1 minute à allongé les 2 premiers kb, oblige ensuite une minute supplémentaire pour chacun 1 kb supplémentaires amplifiés. Pfu ADN polymérase est une autre enzyme thermostable qui a une température optimale d'allongement de 75 ° C. Pfu ADN polymérase est recommandé pour utilisation dans la PCR et les réactions d'extension d'amorce qui nécessitent une haute fidélité et nécessite 2 minutes pour tous les 1 ko être amplifiés. Voir les recommandations du fabricant pour des températures d'allongement et l'heure exactes allongement indiquées pour chaque ADN polymérase spécifique.\nTaq, permet l'addition d'un résidu adénine à l'extrémité 3 'de tous les produits de PCR. Cette modification est médiée par l'activité du terminal transférase de l'ADN polymérase Taq et est utile pour la suite des procédures de clonage moléculaire qui nécessitent un surplomb 3'-.\nFin de la réaction est réalisée en refroidissant le mélange à 4 ° C et / ou par l'addition de l'EDTA à une concentration finale de 10 mM.\n7. Considérations importantes lors du dépannage de PCR\nSi des conditions standard de PCR ne donnent pas l'amplicon désiré, PCR optimisation est nécessaire pour atteindre de meilleurs résultats. La stringence d'une réaction peut être modulé de telle sorte que la spécificité est ajusté par des variables de modification (par exemple, le réactifconcentrations, les conditions de cyclisme) qui influent sur le résultat du profil amplicon. Par exemple, si la réaction n'est pas suffisamment rigoureuse, de nombreux parasites amplicons sera généré avec des longueurs variables. Si la réaction est trop stricte, aucun produit ne sera produite. Dépannage des réactions de PCR peut être un effort frustrant par moments. Toutefois, une analyse minutieuse et une bonne compréhension des réactifs utilisés dans une expérience de PCR peut réduire la quantité de temps et d'essais nécessaires pour obtenir les résultats souhaités. De toutes les considérations qui ont un impact PCR rigueur, le titrage de Mg 2 + et / ou de manipuler des températures de recuit probablement résoudre la plupart des problèmes. Toutefois, avant de changer quoi que ce soit, assurez-vous qu'un résultat erroné n'était pas due à une erreur humaine. Commencez par confirmer tous les réactifs ont été ajoutés à une réaction donnée et que les réactifs ne sont pas contaminés. Veuillez également prendre note du résultat erroné, et poser les questions suivantes: Est-dimères d'amorces visibles sur le gel après électrophorèserésistance (ceux-ci d'exécution en petites bandes <100 b près du fond de la ruelle)? Y at-il des produits non spécifiques (bandes qui migrent à une taille différente de celle du produit désiré)? Y at-il un manque de tout produit? Est l'ADN cible sur un plasmide ou dans un extrait d'ADN génomique? En outre, il est sage d'analyser la teneur en GC de l'amplicon désiré.\nDéterminez d'abord si l'un des réactifs de PCR sont catastrophiques pour votre réaction. Ceci peut être réalisé en préparant de nouveaux réactifs (par exemple, frais de stocks d'exploitation, les dilutions de nouvelles), puis systématiquement ajout d'un réactif nouveau à la fois à des mélanges de réaction. Ce processus permettra de déterminer qui était le coupable réactif pour la PCR expérience ratée. Dans le cas de l'ADN très ancien, qui s'accumule souvent inhibiteurs, il a été démontré que l'addition de sérum albumine bovine peut aider à atténuer le problème.\nDimères d'amorces peuvent se former lorsque amorces préférentiellement auto recuit ou recuit à l'autre amorce dans la réaction. Si cela se produit, une petiteProduit de moins de 100 pb apparaît sur le gel d'agarose. Commencez par modifier le rapport de modèle à l'amorce, si la concentration d'amorce est en excès extrême de la concentration de modèle, puis les amorces seront plus susceptibles de s'hybrider à eux-mêmes ou les uns des autres au cours de la matrice d'ADN. Ajout du DMSO et ou en utilisant une méthode de démarrage à chaud cyclage thermique peut résoudre le problème. En fin de compte, il peut être nécessaire de concevoir de nouvelles amorces.\nProduits non spécifiques sont produites lorsque la rigueur PCR est trop faible résultant dans des bandes de PCR non spécifiques avec des longueurs variables. Cela produit un effet échelle sur un gel d'agarose. Il est alors conseillé de choisir des conditions de PCR qui augmentent la rigueur. Un frottis de différentes tailles peuvent également résulter de amorces conçues pour des séquences hautement répétitives lors de l'amplification d'ADN génomique. Cependant, les mêmes amorces peuvent amplifier une séquence cible sur un plasmide sans rencontrer le même problème.\nLe manque de produits de PCR est probablement due à des conditions de réactionqui sont trop strictes. Dimères d'amorces et les structures en boucle en épingle à cheveux qui forment avec les amorces ou dans la matrice d'ADN dénaturé peut également empêcher l'amplification des produits de PCR parce que ces molécules ne peuvent plus la paire de bases avec l'homologue d'ADN désiré.\nSi la teneur en GC n'a pas été analysé, il est temps de le faire. PCR des régions riches GC (teneur en GC> 60%) présentent quelques-uns des plus grands défis à la PCR. Cependant, il ya de nombreux additifs qui ont été utilisés pour aider à atténuer les défis.\n8. De manipuler les réactifs PCR\nComprendre la fonction des réactifs utilisés sur la PCR conventionnelle est essentiel lors de la première décider la meilleure façon de modifier les conditions de réaction pour obtenir le produit désiré. Le succès tout simplement peut s'appuyer sur modification de la concentration de MgCl 2, KCl, dNTP, amorces, matrice d'ADN, ou l'ADN polymérase. Toutefois, la mauvaise concentration des réactifs tels peuvent conduire à des résultats faux, en diminuant la stringency de la réaction. En cas de dépannage PCR, un seul réactif doit être manipulé à la fois. Cependant, il peut être prudent de titrer le réactif manipulé.\nSel de magnésium Mg 2 + (la concentration finale de réaction de 0,5 à 5,0 mM)\nADN-polymérases thermostables requérir la présence de magnésium d'agir en tant que cofacteur pendant le processus réactionnel. Modification de la concentration en magnésium est l'un des réactifs les plus faciles à manipuler avec peut-être le plus grand impact sur la rigueur de la PCR. En général, le rendement du produit PCR va augmenter avec l'ajout de plus grandes concentrations de Mg 2 +. Toutefois, l'augmentation des concentrations de Mg 2 + va aussi diminuer la spécificité et la fidélité de l'ADN polymérase. La plupart des fabricants comprennent une solution de chlorure de magnésium (MgCl 2) ainsi que l'ADN polymérase et une solution tampon de PCR 10X. Les 10 X PCR solutions tampons peuvent contenir 15 mM MgCl 2, ce qui est suffisant pour un type PCRréactionnel, ou bien il peut être ajouté séparément à une concentration optimisée pour une réaction spécifique. Mg 2 + n'est pas réellement consommée dans la réaction, mais que la réaction peut avoir lieu sans qu'il ne soit présent. Quand il ya trop de Mg 2 +, il peut empêcher la dénaturation complète de la matrice d'ADN par la stabilisation du brin duplex. Trop de Mg 2 + peut également stabiliser fausse hybridation avec les amorces vers des sites de modèles erronés et la spécificité en résulte une diminution dans les produits de PCR indésirables. Quand il n'ya pas assez de Mg 2 +, la réaction ne procédera pas, résultant en un rien de produit de PCR.\nSel de potassium K + (la concentration finale de réaction de 35 à 100 mM)\nProduits de PCR plus (10 à 40 ko) bénéficient de la réduction du sel de potassium (KCl) à partir de sa concentration réaction normale 50 mM, souvent en conjonction avec l'addition de DMSO et / ou de glycérol. Si l'amplicon recherché est en dessous de 1000 pb et de longues produits non spécifiques se forment, specificité peut être améliorée par une titration de KCl, ce qui augmente la concentration de 10 mm jusqu'à 100 mM. L'augmentation de la concentration en sel permet de molécules d'ADN plus courtes pour dénaturer préférentiellement à des molécules d'ADN plus longs.\nDésoxynucléotide 5'-triphosphates (concentration finale de réaction de 20 et 200 uM chacun)\nDésoxynucléotide 5'-triphosphates (dNTP) peuvent causer des problèmes pour la PCR, si elles ne sont pas à des concentrations appropriées équivalentes (c.-à-[A] = [T] = [C] = [G]) et / ou en raison de leur instabilité à partir répétée gel et de dégel. La concentration de dNTP habituelle est de 50 uM de chacun des quatre dNTP. Cependant, la PCR peut tolérer des concentrations entre 20 et 200 uM chacun. Des concentrations plus faibles de dNTP peut augmenter à la fois la spécificité et la fidélité de la réaction alors que les concentrations excessives dNTP peut effectivement inhiber la PCR. Cependant, pour de plus longues PCR des fragments, une plus grande concentration de dNTP peut être nécessaire. Un grand changement dans la concentration de dNTP peut nécessiter une corresformation de flaques changement dans la concentration de Mg 2 +.\nThermiques ADN polymérases stables\nEnzymes de PCR et des tampons associés à ces enzymes ont parcouru un long chemin depuis l'ADN polymérase Taq initiale a d'abord été employé. Ainsi, le choix d'une enzyme appropriée peut être utile pour l'obtention de produits d'amplification souhaités. Par exemple l'utilisation de l'ADN polymérase Taq peut être préférable à l'ADN polymérase Pfu si processivité et / ou l'ajout d'un résidu adénine aux extrémités 3 'du produit de PCR est souhaitée. L'ajout d'un 3 'adénine est devenue une stratégie utile pour les produits de PCR clonage dans des vecteurs TA whit 3' surplombe la thymine. Toutefois, si la fidélité est plus important une enzyme telle que Pfu peut être un meilleur choix. Plusieurs fabricants ont un tableau des ADN polymérases spécifiques conçus pour répondre aux besoins spécialisés. Jetez un oeil à des conditions de réaction et les caractéristiques de l'amplicon désiré, puis correspondre l'expérience PCR avec l'ADN approprié polymerase. La plupart des fabricants ont des tables de l'aide que la sélection polymérase de l'ADN par des caractéristiques telles que la fidélité d'inscription, le rendement, la vitesse, la longueur des cibles optimales, et si elle est utile pour riche en GC ou d'amplification PCR démarrage à chaud.\nQualité de l'ADN et la pureté aura un effet considérable sur la probabilité d'une expérience réussie PCR. ADN et ARN concentrations peuvent être déterminées en utilisant leurs mesures de densité optique à 260 nm (DO 260). La masse de des acides nucléiques purifiés en solution est calculée à 50 pg / ml d'ADN double brin ou 40 pg / ml pour les ARN ou d'ADN simple brin à une DO 260 = 1,0. Contaminants extraction de l'ADN sont des inhibiteurs de communes dans la PCR et doit être soigneusement évité. Communes inhibiteurs d'extraction d'ADN de PCR sont les protéines, l'ARN, les solvants organiques, et des détergents. Utilisation de l'absorption maximale des acides nucléiques OD 260 par rapport à celle des protéines DO280 (DO 260/280), il est possible de détermie une estimation de la pureté de l'ADN extrait. Idéalement, le ratio de la DO 260/280 est compris entre 1,8 et 2,0. Basse OD 260/280 est l'indicatif de la protéine et / ou contamination par les solvants qui, selon toute probabilité, sera problématique pour la PCR.\nEn plus de la qualité de l'ADN modèle, optimisation de la quantité d'ADN peuvent grandement bénéficier le résultat d'une expérience de PCR. Bien qu'il soit commode de déterminer la quantité de pi ng /, ce qui est souvent la sortie pour nanospectrophotometers modernes, l'unité pertinente pour une expérience réussie PCR est le nombre de molécules. C'est, combien de copies de matrice d'ADN contient une séquence complémentaire à des amorces de PCR? Molécules cibles optimales sont entre avril 10-juillet 10 molécules et peut être calculée comme cela a été décrit dans les notes ci-dessus.\n9. Réactifs additifs\nRéactifs additifs peuvent donner des résultats quand tout le reste échoue. Comprendre les réactifset ce qu'ils sont utilisés pour est essentiel dans la détermination des réactifs peut être plus efficace dans l'acquisition du produit désiré PCR. Ajouter des réactifs dans la réaction est compliquée par le fait que la manipulation d'un réactif peut influer sur la concentration utilisable d'un autre réactif. En plus des réactifs énumérés ci-dessous, propriété additifs disponibles dans le commerce sont disponibles à partir de nombreuses entreprises de biotechnologie.\n10. Les additifs qui bénéficieraient Modèles riche en GC\nDiméthylsulfoxyde (concentration finale de DMSO réaction 1-10%)\nDans des expériences de PCR dans laquelle l'ADN matrice est particulièrement riche en GC (teneur en GC> 60%), en ajoutant le DMSO peut favoriser la réaction de perturber par appariement de bases et en réduisant efficacement la T m. Certains calculateurs T m comprennent une entrée variable pour ajouter la concentration de DMSO souhaité dans l'expérience PCR. Toutefois, l'ajout de plus de 2% de DMSO peut exiger l'ajout polymérase ADN plus il a été démontrédémontré à inhiber l'ADN polymérase Taq.\nFormamide (concentration finale de réaction de 1,25 à 10%)\nComme DMSO, le formamide également perturbe appariement de bases, tout en augmentant la stringence des hybridation d'amorce, ce qui entraîne moins de non-spécifique d'amorçage et l'efficacité d'amplification accrue. Le formamide a également été montré pour être un activateur pour les modèles riches en GC.\n7-déaza-2'-désoxyguanosine-5'-triphosphate (concentration finale de réaction à courant continu 7 GTP, 3 DC 7 GTP: 1 dGTP 50 uM)\nUtilisation de 3 pièces, soit 37,5 pM, de la guanosine de base analogique en courant continu GTP 7 en combinaison avec 1 partie, ou 12,5 uM, dGTP va déstabiliser la formation de structures secondaires dans le produit. Comme l'ADN amplicon ou le modèle est dénaturé, il sera souvent former des structures secondaires telles que des boucles en épingle à cheveux. Incorporation de courant continu 7 GTP dans l'amplicon ADN interdire la formation de ces structures aberrantes.\n7 GTP atténue le signal de la coloration au bromure d'éthidium qui est pourquoi il est utilisé dans un rapport de 3:1 avec le dGTP.\nLa bétaïne (concentration finale de réaction de 0,5 M à 2,5 M)\nBétaïne (N, N, N-triméthylglycine) est un analogue d'acide aminé zwitterionique qui réduit et peut même éliminer la dépendance en température d'ADN de fusion de la composition nucléotidique. Il est utilisé comme un additif à l'aide d'amplification par PCR de la GC cibles riches. La bétaïne est souvent employé en combinaison avec du DMSO et peut grandement améliorer les chances d'ADN cible d'amplification avec un contenu en GC élevée.\n11. Additifs qui aident PCR en présence d'inhibiteurs\nDes détergents non ioniques fonctionner pour supprimer la formation de la structure secondaire et aider à stabiliser l'ADN polymérase. Des détergents non ioniques tels que le Triton X-100, Tween 20, ou NP-40 peut être utilisé à des concentrations de réaction de 0,1 à 1% afin d'augmenter la production amplicon. Toutefois, concentrtions supérieures à 1% peut être inhibitrice à la PCR. La présence de détergents non ioniques diminue la rigueur PCR, qui pourrait aboutir à la formation du produit factice. Toutefois, leur utilisation sera également neutraliser l'inhibiteur affecte de la SDD, un contaminant occasionnel de protocoles d'extraction d'ADN.\nAddition de protéines spécifiques tels que l'albumine de sérum bovin (BSA) utilisé à 400 du gène de protéine 32 ng / l et / ou T4 à 150 aide ng / pi PCR en présence d'inhibiteurs tels que FeCl 3, hémine, l'acide fulvique, l'acide humique, acides tanniques, ou des extraits de selles, d'eau douce et l'eau marine. Cependant, les inhibiteurs de PCR, y compris les sels biliaires, de la bilirubine, l'EDTA, du NaCl, SDS, ou le Triton X-100, ne sont pas atténués par addition soit BSA ou T4 gène 32 protéine.\n12. Modifications des conditions vélo\nOptimisation de la température de recuit permettra d'améliorer toute réaction PCR et doit être considérée en combinaison avec d'autres additifs et / ou avec d'autres mo difications des conditions de cyclisme. Ainsi, afin de calculer la température optimale de recuit de l'équation suivante est utilisée:\nT a OPT = 0,3 T m Primer + 0,7 T m produit -14,9\nT m apprêt est calculée comme la Tm de la paire moins stable en utilisant l'équation:\nT m = abc ((AH / (AS + R x ln (c / 4))) + 16,6 -273,15 log [K +] où AH est la somme des plus proches voisins variations d'enthalpie pour hybrides; AS est la somme de l' plus proches voisins variations d'entropie, R est la constante des gaz (1,99 cal K-1 mol-1); C est la concentration d'amorce, et [K +] est la concentration de potassium.\nCette dernière équation ne peut être calculé en utilisant l'un des calculateurs m T énumérés à l'adresse suivante:\nrs / fusion / sup_mat / servers_list.html "target =" _blank "> http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html\nT m du produit est calculée comme suit:\nT = 0,41 m du produit (GC%) + 16,6 log [K +] - longueur 675/product\nPour la plupart des réactions PCR de la concentration de potassium ([K +]) va être de 50 mm.\nDémarrage à chaud PCR est une modification polyvalent dans lequel le temps de dénaturation initiale est augmenté de façon spectaculaire (tableau 4). Cette modification peut être constituée avec ou sans d'autres modifications aux conditions de cyclisme. En outre, il est souvent utilisé en conjonction avec des additifs pour la formation amplicon capricieuse. En fait, à chaud début PCR est de plus en plus comme un aspect régulier des conditions générales de cyclisme. Démarrage à chaud a été démontrée pour augmenter le rendement amplicon, tout en augmentant la spécificité et la fidélité de la réaction.Le raisonnement derrière chaud début PCR est d'éliminer les dimères d'amorce et non spécifique d'amorçage qui peuvent être une conséquence de la mise en place de la réaction ci-dessous la m T. Ainsi, une réaction de début typique chaude chauffe l'échantillon à une température supérieure à la T m optimale, au moins à 60 ° C avant d'amplification est capable de se produire. En général, l'ADN polymérase est retenu à partir de la réaction au cours de la première, de forme allongée, le temps de dénaturation. Bien que d'autres composants de la réaction sont parfois omises au lieu de l'ADN polymérase, ici nous allons nous concentrer sur l'ADN polymérase. Il existe plusieurs méthodes qui permettent l'ADN polymérase de rester inactif ou physiquement séparés jusqu'à ce que la période initiale de dénaturation a terminé, y compris l'utilisation d'une barrière de cire solide, d'anticorps anti-ADN polymérase, et protéines accessoires. En variante, l'ADN polymérase peut simplement être ajouté à la réaction après le cycle de dénaturation initiale est terminée.\nTouchdown PCR (TD-PCR) estl'intention de prendre une partie de la conjecture de limitations T les calculs m en mettant entre parenthèses les températures calculées de recuit. Le concept est de concevoir deux phases de conditions de cyclisme (tableau 5). La première phase emploie successivement des températures plus basses de chaque cycle de recuit seconde (traditionnellement 1,0 ° C), à partir de 10 ° C au-dessus et en finissant à la Tm calculée ou légèrement en dessous. La deuxième phase utilise les types 3-étape conditions avec la température de recuit fixé à 5 ° C au-dessous de la T m calculé pendant 20 à 25 cycles. La fonction de la première phase devrait atténuer mispriming, conférant un avantage de 4 fois le produit correct. Ainsi, après 10 cycles, un avantage de 410 fois donnerait 4096 copies du produit correct sur toute l'amorçage fausse.\nRéducteur PCR est similaire à TD-PCR avec des incréments de moins de la première phase d'amorçage. A titre d'exemple, la première phase abaisse la température de recuit tous lessecond cycle de 3 ° C, à 10 ° C au-dessus et en finissant à 2 ° C au-dessous de la Tm calculée. Comme TD-PCR, la deuxième phase utilise les types 3-étape conditions avec la température de recuit fixé à 5 ° C au-dessous de la Tm calculée pendant 20 à 25 cycles. Cela permettrait le bon produit d'un avantage de 256 fois par rapport aux produits d'amorçage de faux.\nRalentissement PCR est tout simplement une modification de la TD-PCR et a été couronnée de succès pour amplifier extrêmement riche en GC (ci-dessus 83%) des séquences (tableau 6). Le concept prend en compte un élément relativement nouveau associé à thermocycleurs modernes, ce qui permet le réglage de la vitesse de rampe ainsi que la vitesse de refroidissement. Le protocole utilise également à courant continu 7 GTP pour réduire la formation de structure 2 ° qui pourrait inhiber la réaction. La vitesse de rampe est abaissée à 2,5 ° C s -1 avec une vitesse de refroidissement de 1,5 ° C s -1 pendant les cycles de recuit. La première phase commence par une unenealing température de 70 ° C et réduit la température de recuit de 1 ° C toutes les 3 cycles jusqu'à ce qu'il atteigne 58 ° C. La deuxième phase se poursuit ensuite avec une température de recuit de 58 ° C pendant 15 cycles supplémentaires.\nLa PCR nichée est un outil puissant utilisé pour éliminer les produits falsifiés. L'utilisation d'amorces imbriquées est particulièrement utile quand il ya plusieurs gènes paralogues dans un seul génome ou quand il est faible nombre de copies d'une séquence cible dans une population hétérogène de séquences orthologues. La procédure de base comporte deux jeux d'amorces qui amplifient une seule région de l'ADN. Les amorces externes chevauchent le segment d'intérêt et sont utilisés pour générer des produits de PCR qui sont souvent non spécifique de 20 à 30 cycles. Une petite aliquote, habituellement d'environ 5 pi de la première réactionnel de 50 ul, est ensuite utilisé comme matrice d'ADN pour un autre 20 à 30 cycles d'amplification en utilisant la deuxième série d'amorces qui s'hybrident à un parent emplacement interneà la première série.\nD'autres protocoles de PCR sont plus spécialisées et aller au-delà de la portée du présent document. Les exemples incluent RACE-PCR, Multiplex-PCR, Vectorette-PCR, quantitative-PCR et RT-PCR.\n13. Les résultats représentatifs\nReprésentant résultats de la PCR ont été générés en suivant les protocoles de base de PCR décrit ci-dessus. Les résultats intègrent plusieurs stratégies de dépannage pour démontrer l'effet de divers réactifs et les conditions de la réaction. Les gènes de la levure Saccharomyces cerevisiae en herbe et d'un mycobactériophage non caractérisés ont été amplifiés dans ces expériences. La norme 3-étape de PCR protocole décrit dans le tableau 2 a été utilisé pour toutes les trois expériences décrites ci-dessous.\nAvant la mise en place de l'expérience PCR, l'ADN génomique de deux S. cerevisiae et le mycobactériophage ont été quantifiés et diluée à une concentration qui serait allow entre 10 4 et 10 7 molécules d'ADN par réaction. Les stocks de travail ont été préparés comme suit. Une préparation de levure de l'ADN génomique a donné 10 4 ng / ul. Une dilution à 10 ng / ul a été généré en ajoutant 48 pl dans 452 ul de TE pH 8,0 tampon. Depuis le S. génome cerevisiae est d'environ 12,5 Mo, 10 ng contiennent 7.41 X 10 5 molécules. La préparation de l'ADN génomique a donné mycobactériophage 313 ng / ul. Une dilution à 2 ng / pi a été généré en ajoutant 6,4 pi en 993,6 pi de pH 8,0 TE tampon. Cet ADN du phage est d'environ 67 Kb. Ainsi, 1 ng contient 2,73 X 10 7 molécules, ce qui est à la limite supérieure de l'ADN généralement utilisée pour une PCR. Les stocks de travail ont ensuite été utilisées pour générer les solutions de Master Mix décrites dans le Tableau 7. Des expériences variées des conditions de cycle tel que décrit ci-dessous.\nDans la figure 3a, l'ADN génomique de S. cerevisiae a été utilisé comme un modèle pour amplifierle gène GAL3, qui code une protéine impliquée dans le métabolisme du galactose. L'objectif de cette expérience était de déterminer la concentration optimale de Mg 2 + pour cet ensemble de réactifs. Pas de MgCl 2 était présent dans la mémoire tampon d'origine PCR et a dû être complétée dans les concentrations indiquées avec une gamme testée de 0,0 mm à 5,0 mm. Comme le montre la figure, un produit de PCR de la taille attendue (2098 pb) apparaît à partir d'un Mg 2 + concentration de 2,5 mM (piste 6) avec une concentration optimale à 4,0 mM (piste 9). La concentration recommandée fournies par le fabricant est de 1,5 mm, ce qui est du montant prévu dans les tampons de PCR typiques. Peut-être étonnamment, la concentration nécessaire nécessaire à la formation du produit dans cette expérience dépassé ce montant.\nUne matrice d'ADN différent a été utilisé pour l'expérience présentée dans la figure 3b. L'ADN génomique à partir d'un mycobactériophage a été utilisé pour amplifier un segment d'ADN conservé 566 pb.Comme l'expérience précédente, l'optimal Mg 2 + concentration devait être déterminée. Comme le montre la figure 3b, l'amplification du produit désiré PCR nécessite au moins 2,0 mM de Mg 2 + (piste 5). Bien qu'il y ait une plus grande variabilité dans la quantité de produit formé à l'augmentation des concentrations de MgCl 2, le produit le plus de PCR a été observée à 4 mM Mg 2 + (piste 9), la même concentration observée pour la levure GAL3 gène.\nNotez que dans les expériences présentées dans les figures 3A et 3B, une bande discrète a été obtenue en utilisant les conditions de cyclage pensé pour être optimale en fonction de la température de recuit d'amorces. Plus précisément, la température de dénaturation de 95 ° C avec une température de recuit de 61 ° C, et l'extension a été réalisée pendant 1 minute à 72 ° C pendant 30 cycles. La finale extension de 5 minutes a été fait alors à 72 ° C. Pour la troisième expérience présentée à la figure 3c figure 3c, ce qui était une bande discrète à la figure 3a, devient un frottis de produits non spécifiques dans ces conditions, le cyclisme sous-optimales. En outre, avec la rigueur globale de la réaction réduit, une faible quantité de Mg 2 + est requis pour former un amplicon.\nTous les trois expériences qui montrent que lorsque la concentration de Mg + 2 sont trop bas, il n'y a pas de production amplicon. Ces résultats démontrent également que lorsque les deux conditions de cyclismesont correctement conçus et les réactifs sont à des concentrations optimales, l'expérience de PCR produit un amplicon discrète correspondant à la taille attendue. Les résultats montrent l'importance de réaliser des expériences de PCR à une rigueur suffisante (par exemple, des bandes discrètes par rapport à un frottis). En outre, les expériences montrent que le changement d'un paramètre peut influer sur un autre paramètre, ce qui affecte le résultat de réaction.\nRéactif Concentration des solutions d'achat d'actions Volume 13X **\nMix Master Concentration finale\nStérile H 2 O QS à 50 pi QS à 650 pi\nTampon PCR 10X 5 pl 65 pl 1X\ndNTP 10 mM 1 pl 13 pi 200 uM\nMgCl 2 25 mM 3 pl 39 pl 1,5 mM\nPrimer avant 20 uM = 20 pmol / ul 1 pl 13 pi 20 pmol\nInverser Primer 20 uM = 20 pmol / ul 1 pl 13 pi 20 pmol\nMatrice d'ADN Variable Variable Variable ~ 10 5 molécules\nADN polymérase Taq 5 unités / * pi 0,5 pl 6,5 pl 2,5 unités\n50 pl / Réaction\nTableau 1. Réactifs de PCR dans l'ordre où elles devraient être ajoutés.\n* Les unités peuvent varier entre les fabricants\n** Ajouter tous les réactifs à l'exclusion de toute Master Mix dans le besoin de titrage ou qui peut être variable à la réaction. Le Master Mix représenté dans le tableau ci-dessus est calculé pour 11 réactions plus 2 réactions supplémentaires pour accueillir la perte pipette de transfert s'assurer qu'il ya assez d'aliquote de chaque tube de réaction.\nNorme 3-étape de PCR vélo\nÉtape du cycle de Température Temps Nombre de cycles\nDénaturation initiale 94 ° C à 98 ° C 1 minute 1\nExtension 94 ° C\n5 ° C inférieure à T m\n70 ° C à 80 ° C 10 à 60 secondes\nPolymérase ADN dépendante et Amplicon 25-35\nExtension final 70 & dpar exemple; C à 80 ° C 5 minutes 1\nTenez * 4 ° C ∞ 1\nTableau 2. Type 3-étape à vélo PCR.\n* La plupart des cyclistes thermiques ont la capacité de faire une pause à 4 ° C indéfiniment à la fin des cycles.\n2-étape de PCR cyclisme\nRecuit / Extension\nExtension final 70 ° C à 80 ° C 5 minutes 1\nTableau 3. 2-étape cyclisme PCR.\nHot Start PCR vélo\nÉtape du cycle de Température Temps Cycles\nDénaturation initiale 60 ° C à 95 ° C 5 minutes puis ajouter l'ADN polymérase 1\nTableau 4. Hot Start PCR vélo.\nTouchdown PCR vélo\nDénaturation initiale 94 ° C à 98 ° C 1\nX = 10 ° C au-dessus Tm\nPolymérase ADN dépendante et Amplicon 2\nX-1 ° C de réduire de 1 ° C tous les deux cycles\nAmplicon et de la polymérase dépendante 28\nPolymérase ADN dépendante et Amplicon 20-25\nTableau 5. Touchdown PCR vélo.\nRalentissement PCR vélo\nÉtape du cycle de Temdegré voulu Temps Cycles\nX ° C = 10 ° C au-dessus Tm\nAmplicon et de la polymérase dépendante 2\n70 ° C à 80 ° C * 10 à 60 secondes\nUnemplicon et polymérase dépendante 28\nAmplicon et de la polymérase dépendante 20-25\nTableau 6. Ralentissement PCR vélo.\n* Pour ralentissement PCR, la vitesse de rampe est abaissée à 2,5 ° C s -1 avec une vitesse de refroidissement de 1,5 ° C s -1 pendant les cycles de recuit.\nSolution stock Volume ajouté à réactionnel de 50 ul 13 Mix Master X de levure 13 X Phage Master Mix Concentration finale\nStérile H 2 O qs à 50 pi = 31 pi ou 30,5 qs à 650 pi = 396,5 qs à 520 pl = pl 403\nTampon PCR 10X 5 pl 65 pl 65 pl 1X\n10 mM 1 pl 13 pi 13 pi 200 uM\nMgCl 2 Titrage Ajouté à chaque réaction Ajouté à chaque réaction Ajouté à chaque réaction Des variables, voir titrage\nPrimer avant 20 uM = 20 pmol / ul 1 pl 13 pi 13 pi 20 pmol\nInverser Primer 20 uM = 20 pmol / ul 1 pl 13 pi 13 pi 20 pmol\nMatrice d'ADN 2 ng / ul phage ou 10 ng / ul levure 0,5 ou 1 Phage ul ul levure 6,5 pl 13 pi ~ 10 7 molécules de phage ou ~ 10 5 molécules de levure\nPolymérase 0,5 unités / ** ul 0,5 pl 6,5 pl 6,5 pl 0,5 unités / Réaction\n40 pl + 10 (titrage) ul / Réaction\nMgCl 2 0,00 pi 1,00 pi 2,00 pi 3,0 pl 4,00 pi 5,00 pi 6,00 pi 7,00 pi 8,00 pi 9,00 pi 10,00 pi\nH 2 O 10,00 pi 9,00 pi 8,00 pi 7,00 pi 6,00 pi 5,00 pi 4,00 pi 3,00 pi 2,00 pi 1,00 pi 0,00 pi\n<strong> Tableau 7. Titrage de Mg 2 + utilisé dans la figure 3.\nFigure 1. Problèmes communs qui se posent avec des amorces et des 3-étape d'amplification par PCR de l'ADN cible. (A) d'auto-recuit d'amorces entraînant la formation de la structure en épingle à cheveux boucle secondaire. Notez que les amorces ne sont pas toujours recuit aux extrémités et peut former des structures plus petites boucles. (B) hybridation d'amorce à l'autre, plutôt que la matrice d'ADN, créant dimères d'amorces. Une fois les amorces s'hybrident les uns aux autres, ils seront allongés aux extrémités d'amorces. (C) des cycles de PCR générer un amplicon spécifique. Norme 3-étape de PCR vélo comprennent la dénaturation de l'ADN matrice, hybridation avec les amorces, et l'extension de l'ADN cible (amplicon) par l'ADN polymérase.\nSeau à glace la figure 2. Avec Reagents, les pipettes et supports nécessaires pour une PCR. (1.) P-200 de pipette, (2.) P-1000 de pipette, (3.) P-20 de pipette, (4.) P-10 de pipette, (5). Plaque à 96 puits, et 0,2 ml à paroi mince tubes PCR , (6.) Réactifs, y compris la Taq polymérase, tampon de PCR 10X, MgCl 2, de l'eau stérile, dNTP, amorces et l'ADN matrice, (7.) 1,8 ml tubes et la crémaillère.\nFigure 3. Exemple de 2 Mg + titrages utilisés pour optimiser une expérience de PCR en utilisant une norme 3-étape du protocole PCR. (A) S. l'ADN génomique de levure cerevisiae a été utilisé comme un modèle pour amplifier un pb 2098 GAL3 gène. Dans les voies 1 à 6, où le Mg 2 + concentration est trop faible, soit il n'existe pas de produit formé (voies 1-5) ou très peu de produit formé (piste 6). Lanes 7 à 11 représentent des concentrations optimales de Mg 2 + pour cette expérience PCR comme indiqué par la présence du produit 2098 amplicon pb. (B) Un uncharacterized matrice d'ADN génomique a été mycobactériophage utilisées pour amplifier un amplicon de 566 pb. Voies 1 à 4, Mg 2 + concentration est trop faible, comme indiqué par l'absence de produit. Lanes 5 à 11 représentent des concentrations optimales de Mg 2 + pour cette PCR comme indiqué par la présence du produit 566 ko amplicon. (C). S. l'ADN génomique de levure cerevisiae a été utilisé comme un modèle pour amplifier un gène 2098 pb GAL3 comme indiqué dans le panneau a. Toutefois, la température de recuit a été ramené de 61 ° C à 58 ° C, ce qui entraîne quelques bandes PCR non spécifiques avec des longueurs variables produisant un effet bavures sur le gel d'agarose. Les pistes 1 à 4, où le Mg 2 + concentration est trop faible, il n'y a pas de produit formé. Lanes 5 à 8 représentent des concentrations optimales de Mg 2 + pour cette PCR comme on le voit par la présence d'un frottis et de la bande autour de la taille 2098 ko produit amplicon. Lanes 9 à 11 sont révélateurs des conditions excessivement strictes sans produit formé. (AC) est une Lanes 12 négatifs auve de contrôle qui ne contient aucune matrice d'ADN. Lane M (marqueur) a été chargé par l'ONÉ 1kb Ladder.\nFigure 4. Tubes stériles utilisés pour la PCR. (1.) 1,8 ml tube (2.) 0,2 ml personne mince tube à paroi PCR, (3.) 0,2 ml de bandes minces parois des tubes PCR et casquettes.\nFigure 5. Thermocycleur. Fermé l'image thermocycleur gauche. Image de droite contient 0,2 ml à paroi mince tubes PCR placées dans le bloc de chauffage d'un cycleur thermique ouvert.\nPCR est devenue un outil indispensable dans l'arsenal des sciences biologiques. PCR a changé le cours de la science qui permet aux biologistes de céder le pouvoir au cours des génomes, et de faire des gènes hybrides avec de nouvelles fonctions, permettant spécifique et précis des essais cliniques, en obtenant un aperçu sur les génomes et de la diversité, ainsi que les gènes tout simplement de clonage pour l'analyse biochimique plus loin. L'application PCR n'est limitée que par l'imagination du scientifique qui exerce son pouvoir. Il ya beaucoup de livres et de documents qui décrivent les nouvelles utilisations spécialisées de la PCR, et beaucoup d'autres seront développés au cours de la prochaine génération de la science biologique. Cependant, quelles que soient les approches prévues, le cadre fondamental est resté le même. PCR, dans toute sa grandeur, est une application in vitro afin de générer de grandes quantités d'un segment spécifique de l'ADN.\nConception d'une expérience de PCR nécessite une réflexion et de patience. Les résultats présentés dans la figure 3 illustrent l'un des principaux challenges lors de la conception d'une stratégie d'optimisation pour la PCR. C'est, comme un paramètre de la PCR est modifié, il peut avoir un impact autre. A titre d'exemple, si la première PCR a été réalisée à la température de recuit sous-optimale (58 ° C) avec une concentration de 2 mg optimale + de 2,0 mM, alors le résultat serait de produire un frottis comme on le voit dans la figure 3c. Une tentative pour résoudre le frottis peut impliquer la mise en place des conditions de PCR avec des réactions contenant 2,0 mM MgCl 2 et en ajustant la température de recuit à 61 ° C. Toutefois, comme on le voit dans la figure 3a, ce ne serait pas céder un quelconque produit. Par conséquent, il est conseillé de doser les réactifs, plutôt que l'ajout d'une concentration à une seule réaction, lors du dépannage des résultats erronés. En outre, les ajustements les plus courants qui sont nécessaires pour l'optimisation d'un expérience de PCR sont à changer le Mg 2 + concentration et de corriger les températures de recuit. Toutefois, si ces changements ne sont pas de minimiser ou d'abroger des résultats aberrants, titrage de additives et / ou de modifier les protocoles de la situation de cyclisme tels que décrits dans les tableaux 2-6 peuvent atténuer le problème. Si tout cela échoue, redessiner les amorces et essayez, essayez encore.\nUn merci spécial à Kris Reddi à l'UCLA pour la mise en place des réactifs et en versant des gels et à Erin Sanders à l'UCLA pour l'inspiration, d'orientation et de soutien et de la relecture du manuscrit. Je tiens également à remercier Giancarlo Costaguta et Gregory S. Payne pour la fourniture de l'ADN génomique de levure et des amorces pour amplifier le gène GAL3. Je voudrais également remercier Shah Bhairav pour prendre des photos de l'équipement de laboratoire et des réactifs utilisés pour faire des figures 2 à 4. Le financement de ce projet a été fourni par HHMI (HHMI Grant n ° 52006944).


Semaine Emploi & Handicap : à la découverte d’un atelier d’initiation au conditionnement - Vivre & Devenir\nVivre et devenir > Actualités > Semaine Emploi & Handicap : à la découverte d’un atelier d’initiation au conditionnement\nSemaine Emploi & Handicap : à la découverte d’un atelier d’initiation au conditionnement\nDepuis septembre 2020, l’institut médico éducatif (IME) Excelsior, situé au Raincy en Seine-Saint-Denis, propose aux jeunes qu’il accompagne de suivre un atelier d’initiation au conditionnement.\nL’IME Excelsior accueille une centaine de préadolescents ou adolescents présentant une déficience intellectuelle légère à moyenne avec ou sans troubles associés se traduisant par des troubles de la conduite et du comportement avec des difficultés familiales et/ou sociales.\nLa formation sur les métiers du conditionnement existait déjà 1 an auparavant. Cependant elle a été adaptée pour permettre aux élèves ayant plus de difficultés et/ou une condition physique particulière de pouvoir suivre et comprendre les cours. Monsieur Lamek, moniteur d’atelier, s’exprime : « Cet atelier d’initiation permet de faire un marchepied avec la formation initiale et de mettre en valeur les élèves malgré leurs difficultés ».\nEncadré par trois moniteurs d’éducation, six élèves de l’IME suivent cet atelier afin d’apprendre l’étiquetage, l’empaquetage ou encore la numérisation des produits. D’après monsieur Lamek : « Avec l’épidémie liée au Covid-19, les élèves sont amenés à souvent faire des boîtes avec des paquets de gels hydroalcooliques pour les grands distributeurs. ».\nLa semaine de formation est divisée en trois temps, si les deux premiers réfèrent à l’éducation et aux cours, le dernier correspond à la professionnalisation des jeunes et se déroule à l’extérieur dans un établissement et service d’aide par le travail (ESAT). Ils peuvent ainsi mettre en pratique leurs connaissances et compétences acquises en cours. Des stages de deux semaines sont également organisés en ESAT durant l’année.\nGrâce à cet atelier professionnalisant, les jeunes peuvent espérer trouver du travail dans le conditionnement à leur sortie de l’IME.


L'événement croisé Fortnite et Rocket League Llama-Rama débute ce week-end\nVous êtes ici : Accueil / Action / L’événement croisé Fortnite et Rocket League Llama-Rama débute ce week-end\nFortnite célèbre le passage de la Rocket League au free-to-play avec Llama-Rama, un événement croisé où les joueurs peuvent relever des défis de la Rocket League pour débloquer des récompenses pour les deux jeux.\nLa Fortnite and Rocket League Llama-Rama débutera le 26 septembre et se poursuivra jusqu’au 12 octobre.\nTout commence après la sortie de Party Royale Spotlight Concert de la série mettant en vedette le favori des fans de la Rocket League, DJ Slushii.\nLlama-Rama sera en direct sur les plateformes où Rocket League est disponible.\nPendant le jeu, les joueurs de la Rocket League recevront des objets sur le thème de Fortnite lorsqu’ils termineront les défis Llama-Rama dans Rocket League. De plus, les joueurs de Fortnite recevront des objets sur le thème de la Rocket League dans Fortnite dans le cadre des mêmes défis.\nRécompense de la Rocket League: Topper de lamas\nRocket League Challenge: marquez 5 buts, arrêtez ou passes avec le Llama Topper\nAprès avoir terminé les défis Llama-Rama, les joueurs peuvent consulter la page des défis de l’événement de la Rocket League pour échanger des récompenses de la Rocket League contre des défis terminés.\nPour Fortnite, les joueurs recevront des récompenses de défi après s’être connectés à Fortnite une fois que chaque défi est terminé dans Rocket League. Vous n’avez pas besoin de réclamer des récompenses dans Fortnite pour obtenir vos objets Fortnite.\nTous les défis terminés mais non récupérés sont automatiquement réclamés lorsque l’événement se termine le 12 octobre.\nDans d’autres nouvelles de Fortnite, le groupe de garçons K-Pop BTS sera présenté à Party Royale. Le groupe fera ses débuts avec un nouveau clip vidéo du single Dynamite, et ensuite, les joueurs pourront profiter d’une afterparty Dynamite. Vous pourrez également acheter un bundle BTS Dynamite qui comprend deux émoticônes similaires aux mouvements de danse BTS.


L'UMP déploie sa communication de crise\nPublié le 07/11/2011 à 19:54 , Mis à jour le 07/11/2011 à 22:04\nJean-François Copé, secrétaire général de l'UMP. Abaca/Luyssen Jean-Luc/ABACA\nTous sur le pont pour «vendre» la rigueur aux Français. Lundi matin, Jean-François Copé a vu François Fillon en tête à tête, juste avant le Conseil des ministres et l'annonce du nouveau plan gouvernemental. Le secrétaire général de l'UMP est «satisfait»: selon lui, «il y a un vrai coup d'accélérateur sur la diminution des dépenses improductives par rapport aux décisions prises le 24 août», qui privilégiaient les augmentations de recettes. Ce «rééquilibrage» s'effectue en outre «non plus seulement par des dispositions ponctuelles, mais par des réformes structurelles, comme celle des retraites».\nJean-François Copé, «mis dans la confidence» par Nicolas Sarkozy, savait que le report à 62 ans de l'âge de la retraite devait entrer en vigueur dès 2017, soit un an avant la date prévue, mais il a attendu que le premier ministre le confirme publiquement pour mettre au travail les équipes chargées d'élaborer les argumentaires du parti.\nLes parlementaires, mais aussi les secrétaires départementaux et les délégués de circonscription devraient recevoir au plus tard mercredi les premières fiches rédigées rue La Boétie. L'idée générale est d'opposer le «courage» de la droite à l'«irresponsabilité» de la gauche. Valérie Rosso-Debord, Franck Riester, Sébastien Huyghe et les autres députés UMP préposés à la riposte ont déjà décliné ce thème dans la salve de communiqués qui a suivi la conférence de presse de François Fillon. De son côté, Jean-François Copé a l'intention de continuer à poser «en boucle» les trois mêmes questions à François Hollande, qu'il a baptisé «Monsieur 65%», en référence à un sondage où le candidat du PS était gratifié de ce score pour le moins improbable face à Nicolas Sarkozy. La première question concerne la retraite à 60 ans, sur laquelle Copé trouve Hollande «très ambigu». La seconde porte sur le financement des postes qu'il entend créer dans l'Éducation nationale et la troisième est une demande de clarification de sa position sur le nucléaire.\nParallèlement à la défense et illustration de l'action gouvernementale et à sa guérilla contre le PS, l'UMP va mettre les bouchées doubles dans l'élaboration de son projet. Le comité de pilotage a souhaité modifier l'ordre des conventions préparatoires pour mieux s'adapter à l'actualité : l'économie sera traitée dès le 22 novembre lors d'une convention sur le «courage» qui se tiendra à Lambersart (Nord). L'occasion, pour Jean-François Copé, de répéter que «le coût de la réduction du temps de travail ne sera pas tenable durablement» et qu'il faudra «poser la question à l'occasion du débat présidentiel, en la liant à celle d'une TVA anti-délocalisation».\nLe secrétaire général de l'UMP n'a pas l'intention d'aller plus loin sur ce terrain dans les prochaines semaines. Le sujet des 35 heures est trop sensible. Son dernier accrochage avec Fillon, à propos de Paris, a alimenté la campagne de ses détracteurs, qui l'accusent de jouer la défaite de Sarkozy en 2012. Copé ne veut donc rien dire qui puisse gêner le président. Et, apparemment, cette volonté d'afficher une entente parfaite est réciproque, puisque c'est à Meaux, dont Copé est maire, que Sarkozy a décidé de participer vendredi aux commémorations du 11 Novembre.\n» Sarkozy et Fillon font le pari de la rigueur\n» Les députés UMP à la pointe du combat pour 2012


iPhone 6s : les composants pour Force Touch sont en pleine production - iPhoneAddict.fr\nAccueil » Actualité & avis iPhone / iPod » iPhone 6s : les composants pour Force Touch sont en pleine production - iPhoneAddict.fr\niPhone 6s : les composants pour Force Touch sont en pleine production\n31 Juil 2015à 17:30\nL’iPhone 6s et l’iPhone 6s Plus sont toujours en cours de production. Selon Digitimes, les modules Force Touch sont eux aussi entrés dans une production à grande échelle pour être intégrés dans l’écran des nouveaux iPhone. Apple s’attendrait à produire entre 36 et 40 millions d’iPhone 6s au troisième trimestre et 50 millions pour le quatrième. Ce dernier étant le plus important parce qu’il y a Noël.\nForce Touch est une technologie qui a fait ses débuts sur l’Apple Watch. Intégrée dans l’écran, elle sait détecter une pression courte ou une pression prononcée avec le doigt. Selon la pression, différentes actions sont proposées à l’utilisateur. Les nouveaux MacBook ont adopté ce système au niveau du trackpad. Là aussi, des fonctionnalités supplémentaires sont proposées.\nPour l’instant, nous ne savons pas quel sera l’intérêt sur iPhone. Dans Safari, une pression longue sur un mot pourrait donner sa définition, tandis qu’une pression sur le bouton « suivant » lors d’une lecture de vidéo pourrait accélérer la vitesse de manière significative. Ces deux fonctionnalités sont déjà proposées sur Mac.\nL’iPhone 6s et l’iPhone 6s Plus devraient arriver en septembre. Les rumeurs évoquent un design extérieur similaire à l’iPhone 6, un processeur A9, 2 Go de RAM, un appareil photo de 12 mégapixels à l’arrière, 5 mégapixels à l’avant, une meilleure puce 4G et plus encore.\nLe 31 juillet 2015 à 17:41\nJe vais pouvoir renouveler pour 5c avec ce nouvel iPhone! L’amélioration des APN est intéressante, la qualité actuelle est déjà géniale alors ça promet !\nLe 31 juillet 2015 à 17:42\nForce Touch détecte la force de pression pas la longueur. Une longue pression sur le bouton lors d’une vidéo avance déjà la vidéo.\nLe 31 juillet 2015 à 19:33\nBen oui. J’ai bien rigolé en lisant cette phrase dans l’article.\nLe 31 juillet 2015 à 21:31\n+1, erreur écrite dans plusieurs articles. Ne pas confondre temps et pression !\nLe 2 août 2015 à 16:21\nMdrrrrr ils ont rien compris lol\nLe 31 juillet 2015 à 17:44\nJe prends DAY ONE 6S PLUS 128 Go tant que c’est en dessous de 1200 € ça me va :)\nLe 31 juillet 2015 à 17:48\nOh que c’est bon, Oh que ça passe pas vite…. il va envoyer celui là, et j’annonce le samsung galaxy s7 avec force touch en Avril-Mai 2016… haha\nLe 31 juillet 2015 à 17:59\nAvec un capteur qui va revenir à 12 mp parce que comme des grand ils se seront rendu compte que sa sert à rien 16 mp sur un capteur photo de smartphone !\nEt n’oublions pas la couleur or rose sur le S7 totalement inédite 😂\nLe 31 juillet 2015 à 18:04\n+10000 Effectivement la couleur or rose qui sera désigné comme nouvelle couleur « Samsung » et qui va bien évidemment par une ptite vidéo moqueur de la part de Samsung pour prouver que leur rose est un vrai rose et pas un faux rose comme Apple… haha merci Sam….G\nLe 31 juillet 2015 à 18:12\nJe ne comprends pas : même les premiers iPhone savent détecter une pression courte et prolongée non ? A savoir un appui court ou long sur une app ne produit pas la même action.\nDonc c’est pas vraiment une nouveauté.\nLe 31 juillet 2015 à 18:26\nTu parles de la durée de la pression, pas de son intensité…\nLe 31 juillet 2015 à 19:30\nOn parle de FORCE de pression pas de la durée\nLe 1 août 2015 à 12:39\nBah je sais, mais l’article parle de la durée..\nLe 2 août 2015 à 16:19\nMDRRRRRR force Touch c’est tout nouveau et rien à voir avec le temps ! C’est avec la force ! Je l’est dur Apple Watch et c’est sur la force que tu donne pas le temps que tu tien !\nLe 31 juillet 2015 à 18:28\nC’est la technologie la plus inutile au monde, ça va rendre l’écran sûrement plus fragile et plus coûteux à remplacer. Même sur le nouveau MacBook je n’en ai pas trouvé l’utilité…\nLe 31 juillet 2015 à 18:33\nPeut-être que sur l’iphone ca peut nous donner des actions ou fonctionnalités supplémentaires, attendons de voir ce qu’Apple va proposer avec ce nouveau systéme, et qui sait ça sera peut-être aussi à nous de choisir quel option ou fonctionnalité nous souhaitons en exerçant une petite ou forte pression par exemple !\npetite pression coller- forte pression coller enfin y’a pleins de probabilité !\nLe 31 juillet 2015 à 18:34\nCopier/ coller pardon !\nLe 31 juillet 2015 à 18:46\nT’as juste rien pigé toi !\nPrimo pas besoin d’appuyer comme un taré !\nSecondo cela permet d’afficher de nouvelles fonctions par dessus l’interface actuelle sur laquelle placer des boutons est indispensable pour interagir !\nSur l’apple watch c’est très bien intégré !\nLe 31 juillet 2015 à 18:57\nDonc moi j’ai un peu raison tout de même ! c’est ce que j’ai dit !\nLe 31 juillet 2015 à 20:46\nAi je parlé d’appuyer comme un taré ? Non. Je dis que l’écran sera sûrement plus fragile même si on appuie pas fort, et ayant testé MacBook ( pendant pas mal de temps ) et Apple Watch. Cette technologie est inutile, encore sur l’Apple Watch ça peut se comprend vu que l’écran est minuscule, ça permet d’affiché des options plus facilement mais sur iOS c’est nul, c’est un système où tu as déjà très peu d’option donc pourquoi rajouter un système permettant de faire apparaître d’autres quasi inexistantes…\nLe 2 août 2015 à 16:23\nTu juge sans avoir compris le système ! Tu va aller loin toi !\nLe 2 août 2015 à 19:31\nD’accord, merci pour ton commentaire constructif, c’est vrai que c’est difficile de comprendre comment marche le « Force Touch », on appui fort et ça fait un truc… Ton commentaire m’a aussi aidé à comprendre le sens de la vie, merci !\nLe 31 juillet 2015 à 20:30\nSur l’Apple Watch c’est pas mal ! Mais avec l’iPhone chez pas se que ça va donner\nLe 31 juillet 2015 à 20:31\nSi quelqu’un est intéressé par un 6 plus 64 go dispo en fin de mois qu’il me contact\nLe 31 juillet 2015 à 23:32\nLe 31 juillet 2015 à 22:35\nSur un laptop ce n’est pas déterminant mais sur un device tactile ça a tout son sens et c’est la première évolution sensible depuis le premier iphone en terme d’interactions avec les écrans car à part l’augmentation de définition on stagnais depuis 10 ans !\nMais yaura toujours des techniciens de leur quartier pour dire que c’est inutile lol…


Prévisions de neige de Remarkables à 1475 m\nPrévisions pour Remarkables 1475 m\nPrévisions pour Remarkables 1475 m altitude Émis: 5 am 01 Jul 2022 (heure locale)\nNouvelle neige à Remarkables: 4.0cm1.6in sur mar. 5 (après 9 PM)\nÉmis: 5 am 01 Jul 2022 (heure locale)\nmar. 5th (NGT)\nLes prévisions de neige pour Remarkables sont : Généralement sec. Températures en dessous de zéro (max 0°C le sam. matin, min -7°C le ven. matin). Le vent sera généralement faible.\nRemarkables Weather (Next 3 days): The snow forecast for Remarkables is: Généralement sec. Températures en dessous de zéro (max 0°C le sam. matin, min -7°C le ven. matin). Le vent sera généralement faible.\nRemarkables Weather (Days 4-6): Légère couche de neige fraîche, tombant surtout le mar. soir. Conditions de gel-dégel (max 2°C le lun. après-midi, min -6°C le mer. matin). Le vent sera généralement faible.\nLégère couche de neige fraîche, tombant surtout le mar. soir. Conditions de gel-dégel (max 2°C le lun. après-midi, min -6°C le mer. matin). Le vent sera généralement faible.\n15 km loin de Remarkables\nSnow falling heavily in Coronet Peak. de Coronet Peak\n29 km loin de Remarkables\nThere is heavy snow falling at Snow Farm. de Snow Farm\nÉmis: 5 am 01 Jul 2022 / Mises à jour dans ::\nPublié par Snow-Forecast.com sur : 5 am (heure locale) / 01 Jul 2022\nGénéralement sec. Températures en dessous de zéro (max 0°C le sam. matin, min -7°C le ven. matin). Le vent sera généralement faible.\nAutres stations en New Zealand signalent aussi: poudreuse (1) / bonne piste (1)\nLe tableau ci-dessus montre les prévisions météo pour Remarkables à l'altitude spécifique de 1475 m. Notre modèle de prévisions météo sophistiqué nous permet de donner des prévisions de neige en bas, au milieu et en haut de la station Remarkables. Pour accéder aux prévisions météo à d'autres altitudes, utiliser l'onglet de navigation au-dessus du tableau. Pour une vue d'ensemble du temps, référez-vous à , la Carte Météo de New Zealand.\nJeff Mcrobb de Australia écrit:


°HOTEL MICROTEL INN AND SUITES CARTERSVILLE, GA 2* (États-Unis) - de € 46 | HOTELMIX\n1348 Joe Frank Harris Pkwy, Cartersville, États-Unis, 30120 montrer la carte\nMicrotel Inn And Suites Cartersville est un établissement splendide 2 étoiles qui propose des chambres non-fumeur à quelques pas d'High Museum of Art, Rose Lawn Museum et Booth Western Art Museum.\nLes hôtes peuvent rejoindre le centre de Cartersville, qui est à 5 km. A proximité de l'établissement il y a les lieux historiques, les théâtres et les musées.\nLes hôtes de la propriété peuvent rejoindre Microtel Inn And Suites Cartersville de l'aéroport Hartsfield-jackson Atlanta International dans 75 minutes.\nPour un séjour confortable Microtel Inn And Suites Cartersville offre 71 chambres sur 4 étages proposées avec un climatiseur individuel, espace pour s'asseoir, un four à micro-ondes, la télévision par satellite et le système stéréo. Elles sont équipées avec une cafétière/théière électrique, un frigidaire et une lave-vaisselle.\nDans la matinée un petit déjeuner gratuit continental est servi. Сhefs sont spécialisés dans la cuisine mexicaine au restaurant sur place. Vous pourrez dîner dans Grand China situés à 5 minutes à pied de la propriété.\nLes clients peuvent également profiter des services tels qu'un centre d'affaires et une salle de réunion et des services de réception 24/24, des services de journaux et des services de repassage sur place.\n1348 Joe Frank Harris Pkwy, Cartersville, États-Unis, 30120\nEmplacement de l’hôtel Microtel Inn And Suites Cartersville\nGames People Play2.9 km\nEuharlee Museum12.5 km\nParks and Rec Maintenance Dept5.6 km\nWilliams Street Community Ctr4.2 km\nPhoenix Air9.8 km\nEtowah Bend Airport13.2 km\nEmory Cartersville Medical Ctr2.2 km\nTellus Science Museum7.8 km\nRed Top Mountain State Park12.0 km\nEtowah Indian Mounds State Park8.9 km\nCommentaires sur l’hôtel Microtel Inn And Suites Cartersville\nLes commentaires sont mis à jour par nos clients après leurs séjours au Microtel Inn And Suites Cartersville\nEnglish - Microtel Inn And Suites Cartersville - Cartersville


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Rallye d'Argentine : Sébastien Ogier et les occasions manquées - L'Équipe\nRallye d'Argentine : Sébastien Ogier et les occasions manquées\nMême sous son règne avec Volkswagen, avec qui il a remporté ses quatre premiers titres mondiaux, Sébastien Ogier n'est jamais parvenu à s'imposer en Argentine. (J. Prévost/L'Équipe)\nLe Championnat du monde des rallyes WRC aurait dû faire étape en Argentine ce week-end. Une épreuve que Sébastien Ogier n'a bizarrement jamais remportée en dix participations.\nJ.B. 26 avril 2020 à 16h00\nAu volant de la Toyota Yaris avec laquelle Ott Tänak s'était imposé en 2018, Sébastien Ogier espérait bien remporter ce dimanche l'une des rares épreuves manquant à son riche palmarès de 48 victoires : le Rallye d'Argentine. S'il s'est imposé sur les routes ou les chemins de dix-sept épreuves du calendrier WRC, le sextuple champion du monde n'a encore jamais triomphé dans les Sierras de la région de Cordoba, qui fait partie des six rallyes auxquels il a pris part sans jamais y triompher (Chypre, Bulgarie, Irlande, Nouvelle-Zélande, Norvège).\nEn dix participations entre 2009 et 2019 (le Rallye d'Argentine n'a pas eu lieu en 2010), Ogier est monté cinq fois sur le podium. Un bon ratio. Mais s'il compte trois deuxièmes places, il n'a jamais décroché ce succès après lequel il court toujours... et après lequel il va courir encore quelques mois au minimum puisque la manche argentine du WRC, prévue cette semaine, a été reportée sine die en raison de la pandémie de Covid-19. Petit coup d'oeil dans le rétro sur les occasions manquées du Français en Argentine.\n2009 et 2015 : loin du compte\nEn 2009, pour sa première saison complète au plus haut niveau, Ogier est dans le dur. Comme sur les manches précédentes, il est incapable de se lâcher au volant de la C4 WRC. Victime d'une casse d'amortisseur lors de la deuxième étape et ralenti par quelques soucis mécaniques, il termine péniblement à la septième place alors que Loeb et Sordo, sur la même voiture, signent le doublé pour Citroën. Ogier montera sur son premier podium deux rallyes plus tard, en Grèce, assurant son avenir chez Citroën.\nSébastien Ogier au Rallye d'Argentine en 2009. (P. Huit/Presse Sports)\nEn 2015, Ogier se classe seulement 17e du Rallye d'Argentine. Un problème d'injecteurs sur sa Volkswagen Polo le stoppe dès la deuxième spéciale. Il se console en signant, le dimanche, le meilleur chrono de la Power Stage, ce qui lui permet de gratter de précieux points dans la quête d'un troisième titre mondial.\n2011, 2013 et 2016 : tout près du but\nÉquipier de Loeb chez Citroën, Ogier effectue un début de saison 2011 tonitruant, avec des victoires au Portugal et en Jordanie. Pour sa deuxième apparition en Argentine, il effectue un récital pendant deux jours. Au départ de la dernière étape, il possède près de 45'' d'avance sur Loeb. Mais une erreur de concentration minime l'envoie en tonneau dès la première spéciale dominicale. Contraint de terminer la course avec une DS3 bien amochée, il voit Loeb et Hirvonen lui passer devant. Il termine 3e à 7''3 seulement de l'Alsacien. « Assurément mon échec le plus rageant », assurait Ogier en 2018.\nSébastien Ogier au Rallye d'Argentine en 2011. (P. Huit/Presse Sports)\nEn 2013, sa première saison chez Volkswagen, il s'incline devant le « maître des lieux », Sébastien Loeb, qui effectue un mini-programme de quatre courses avec Citroën avant de bifurquer vers les courses de tourisme et qui signe là son huitième succès consécutif en Argentine ! Après la première journée de course, c'est pourtant Ogier qui est en tête, avec plus de quinze secondes d'avance sur son ancien équipier. Mais le Haut-Alpin, perturbé par un souci de frein à main sur sa Polo WRC, se fait surprendre par une plaque de boue et tire tout droit dans la septième spéciale. Une mésaventure qui lui coûte 45'' et toutes ses chances de victoire. Il décrochera tout de même son premier titre mondial cette année-là.\nEn 2016, toujours au volant de la Polo, Ogier est cette fois le dauphin d'Hayden Paddon. Au départ de la dernière spéciale, 2''6 séparent les deux hommes, à l'avantage du Néo-Zélandais. Ogier, sur la route de son quatrième titre avec VW, a le Championnat à l'esprit et ne parvient pas à se libérer complètement sur l'itinéraire rocailleux de cette spéciale de Mina Clavero. Il concède plus de dix secondes à un Paddon survolté. Le pilote Hyundai signe sa première victoire mondiale (et la seule à ce jour) de manière magistrale. « Contrairement à lui, je n'ai pas osé prendre tous les risques », explique Ogier.\n2014 : si près mais si loin\nEn 2014, Ogier est cette fois battu par son équipier de l'époque chez Volkswagen, Jari-Matti Latvala. Si les deux hommes font jeu égal en tout début de course, le Finlandais prend le large en fin de première étape, profitant d'une meilleure position sur la route et de sa capacité à faire des chronos dans les ornières de chemins défoncés.\nSébastien Ogier au Rallye d'Argentine en 2014. (P. Huit/Presse Sports)\n« J'ai bien essayé d'aller plus vite, mais Jari-Matti est simplement plus rapide que moi. Contrairement à lui, je n'aime pas trop ce profil de spéciales : ce sol sablonneux se creuse très vite au fil du passage des voitures, il faut arriver très fort dans les rails, en survitesse par rapport à la note, et le rail de sable te cale, guide ta trajectoire, explique Ogier. Ce n'est pas du tout fin comme pilotage. Ce n'est pas mon truc mais bravo à ceux qui vont vite là-dedans, ça reste du rallye ! »\n2012 : si loin mais si près\nComme en 2009, Ogier se classe septième du Rallye d'Argentine 2012. Mais les circonstances sont bien différentes puisqu'il s'agit cette fois d'un exploit. Remercié par Citroën après une cohabitation houleuse avec Loeb en 2011, Ogier a décidé de s'impliquer dans le projet Volkswagen. En attendant le développement de la Polo R WRC, il effectue la saison 2012 au volant d'une Skoda Fabia R5, la catégorie inférieure, afin de garder le rythme. Décrocher une telle place d'honneur, devant les WRC de Novikov, Al-Attiyah et Tänak (en galère chez M-Sport à l'époque), est un authentique exploit.\nSébastien Ogier au Rallye d'Argentine en 2012. (P. Huit/Presse Sports)\nNeuville apprend à vivre avec son nouveau copilote\nMonte-Carlo, morne montagne\nOgier : «Difficile de se lâcher»\nTänak prend la tête, Ogier 5e\nSpectaculaire sortie de route de Suninen\nOgier : «Le Championnat du monde d'Endurance m'attire»\nOcon sur une Alpine\nLes principaux enjeux de la saison 2021