The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro | Protocol (Translated to French)\nIsolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)…\nNous présentons ici une nouvelle application du test de l’anneau aortique où prémarqués cellules mésenchymateuses sont conjointement cultivés avec réseaux endothéliales dérivées aorte de rat. Cette nouvelle méthode permet la visualisation des homing cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et intégration aux réseaux endothéliales, quantification des propriétés du réseau et l’évaluation des MSC immunophenotypes et l’expression génique.\nL’angiogenèse est un processus complexe, fortement réglementé, responsable de fournir et de maintenir la perfusion tissulaire adéquate. Entretien de vascularisation insuffisante et des malformations pathologiques peuvent entraîner maladies ischémiques sévères, tandis que trop abondante développement vasculaire est associée avec le cancer et les troubles inflammatoires. Une forme prometteuse de pro-angiogénique thérapie est l’utilisation de sources de cellules angiogéniques, qui peuvent fournir des facteurs de régulation ainsi que le soutien physique pour développer nouvellement système vasculaire.\nCellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont intensivement étudiés candidats pour régénération vasculaire en raison de leurs effets paracrine et leur capacité à détecter et abritant les tissus ischémiques ou enflammées. En particulier, premier trimestre des cellules du cordon ombilical humain périvasculaires (FTM HUCPVCs) sont un candidat très prometteur en raison de leurs propriétés pericyte, fort potentiel prolifératif et multilignée, privilège immunitaire propriétés et paracrine robuste Voir le profil. Evaluer efficacement potentiellement angiogénique cellules régénératrices, c’est une condition pour tester en fiable et « traduisible » essais précliniques. L’essai de l’anneau aortique est un modèle d’angiogenèse ex vivo qui permet pour la simple quantification des structures tubulaires d’endothéliales, fournit les accessoires cellules de soutien et de la matrice extracellulaire (MEC) de l’hôte, exclut les composantes inflammatoires et est rapide et peu coûteuse à mettre en place. Ceci est avantageux par rapport aux modèles in vivo (p. ex., cornée dosage, Matrigel prise test) ; l’essai de l’anneau aortique peut suivre les cellules administrées et observer les interactions intercellulaires tout en évitant le rejet de xeno-immunitaire.\nNous présentons un protocole pour une nouvelle application du test de l’anneau aortique, qui comprend les MSCs humaines dans des cultures co avec le développement de réseaux endothéliales aortiques de rat. Ce test permet l’analyse de la contribution de MSC dans le tube de formation et développement grâce à des interactions de type pericyte physiques et de leur puissance de migration activement aux sites de l’angiogenèse et pour évaluer leur capacité à effectuer et médiation Traitement de l’ECM. Ce protocole prévoit plus d’informations sur les changements MSC phénotype et l’expression génique suite co-culture.\nLe processus complexe de l’angiogenèse améliore et maintient la perfusion tissulaire en favorisant le développement de navire du sang neuf de préexistant vascularisation1. C’est un processus fortement réglementé, équilibré par des facteurs pro-angiogéniques et anti-angiogéniques. Toute carence dans ce système peut conduire à l’entretien insuffisant de navire ou de croissance, provoquant de graves maladies ischémiques, y compris la maladie myocardique, accident vasculaire cérébral et les maladies neurodégénératives. Cependant, développement vasculaire exagérée est caractéristique pour les conditions, y compris le cancer et les troubles inflammatoires,2.\nDéveloppement de thérapies visant à contrôler l’angiogenèse pour atteindre la régénération tissulaire favorable est d’une importance capitale. Malgré des recherches précliniques et cliniques approfondies, tentatives de stimuler l’angiogenèse à l’aide de micro-ARN et facteurs pro-angiogéniques ont échoué à atteindre les résultats souhaités3,4,5. Les raisons possibles pour les effets transitoires incluent : longévité limitée de protéines angiogéniques et acides nucléiques et le nombre fini de ciblée des facteurs de croissance6,7. Bien que les facteurs angiogéniques solubles sont essentiels pour initier l’angiogenèse, l’entretien et la fonctionnalité du système vasculaire dépendent supportant les types de cellules, y compris les péricytes et muscle lisse cellules8. Le domaine des thérapies pro-angiogénique étudie maintenant les sources potentielles de cellule cellules souches et progénitrices qui pourraient constituer des facteurs angiogéniques localement, tandis que physiquement soutenir nouvellement développé vascularisation, renouvellement automatique ou même différencier en cellules endothéliales9,10. Trouver l’angiogénique optimale des types de cellules ayant la capacité de répondre à ces exigences fonctionnelles est un très prometteur pour la régénération des tissus ischémiques.\nAfin de les traduire avec succès des thérapies potentielles sur les cellules dans les essais cliniques, des études précliniques doivent démontrer leur efficacité et de mettre en évidence les mécanismes angiogéniques. Malgré le nombre élevé d’essais établis l’angiogenèse, le champ n’est pas un essai de « étalon-or » in vitro qui pourrait sûrement évaluer l’efficacité du potentiel candidat cell types11,12, 13. plupart in vitro l’angiogenèse essais (y compris les essais de formation tube, la migration et la prolifération endothéliales) généralement évaluer les effets des cellules ou des composés sur changements phénotypiques ou la différenciation en cellules endothéliales tubulaire et des structures de réseau14,15. Alors que ces caractéristiques sont essentielles pour l’angiogenèse, un test « traduisible » devrait également évaluer : 1) l’augmentation mammaire ou le remplacement des prise en charge types de cellules y compris les péricytes ou 2) le traitement des ECM ou membrane basale, les cellules musculaires lisses, et 3). l’efficacité pour promouvoir la formation de microcirculation fonctionnelle. Modèles in vivo angiogenèse, y compris le dosage cornéenne et Matrigel fiche dosage, récapitulent le microenvironnement unique in vivo mais sont contestées par la difficulté des cellules de suivi administré d’observer des interactions physiques. En outre, dans des modèles in vivo , rejet de xeno-immunitaire peut se produire lors du test de potentiels cellules allogéniques thérapie candidats16. Ex vivo angiogenèse modèles, en particulier le dosage de l’anneau aortique peut fournir : observation 1) facile et quantification des structures tubulaires, des cellules de soutien 2) accessoires, ECM 3) de l’hôte et fournitures artificiels, 4) exclusion d’inflammatoire composants et 5) installation rapide et peu coûteux de17,18. En règle générale, l’essai de l’anneau aortique peut tester le potentiel angiogénique de petites protéines sécrétoires, agents pharmacologiques et les modèles de rongeurs transgéniques19,20,21.\nMSCs sont prometteurs pour la régénération vasculaire principalement par leurs effets médiés par les paracrine22,23,24. MSCs auraient dû être divulgués à sécréter des facteurs angiogéniques clés dont le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance des hépatocytes (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) et angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs peuvent également détecter et tissus abrite ischémique ou enflammés, cependant, les mécanismes exacts sont toujours sous enquête. De plus en plus, la littérature soutient l’hypothèse que MSCs la plupart proviennent des cellules périvasculaires, expriment co pericyte marqueurs et peuvent se comporter comme des péricytes27. HUCPVCs sont une source de jeune de MSCs, dérivée de la région périvasculaire du cordon ombilical humain. Ils représentent une population de MSCs ayant des propriétés pericyte et ont été caractérisés de FTM et à terme des cordons ombilicaux. FTM HUCPVCs démontrent une forte expression de marqueurs pericyte y compris CD146 et NG2, fort potentiel prolifératif et multilignée, propriétés immunitaires de privilèges et afficher une robuste paracrine profil28. FTM HUCPVCs sont un type de cellule du candidat idéal pour favoriser la régénération des tissus lésés par le biais de la promotion du nouveau système vasculaire par l’intermédiaire de leurs propriétés pericyte.\nPour tester le potentiel angiogénique et pericyte-comme des propriétés de MSCs humaines, un nombre très limité d’essais de l’angiogenèse est disponible où positive angiotropic migrations (ci-après dénommé « homing »), ECM traitement et développement de physique interactions entre les types de cellules peuvent être étudiées, tout en obtenant des données quantitatives sur le développement de la microcirculation.\nPar les présentes, nous présentons un protocole décrivant une nouvelle application du test de l’anneau aortique. MSCs humaines ont été conjointement cultivés avec développement dérivée de rat aortiques endothéliale des réseaux afin d’évaluer leur contribution pour la formation, la maturation et l’homéostasie de tube. Cette version du test de l’anneau aortique évalue la capacité et la puissance des candidats de thérapie cellulaire Accueil aux sites de l’angiogenèse, effectuer et médiation traitement ECM, et contribuer à endothélial développement tubulaire en créant des pericyte forme physique interactions. En plus de la quantification de l’effet net de MSCs sur la formation de réseau endothéliales in vitro et en observant les interactions intercellulaires, nous avons également optimisé un protocole visant à isoler les MSCs des co-cultures. En effectuant de qPCR et cytométrie en flux, il est possible de caractériser les changements MSC phénotype et gene expression suite co-culture. En tant que types de modèle de cellule, nous avons comparé ontologiquement au début (prénatal) et des sources tardives (adultes) de MSCs humaines : FTM HUCPVCs et MSCs de moelle osseuse humaine (BMSC), respectivement, dans l’essai de l’anneau aortique. Nous proposons que l’essai de l’anneau aortique peut être utilisé pour étudier le potentiel angiogénique de n’importe quel type de cellule physiquement soutien lorsque incriminés pour applications régénératrice angiogénique.\ntoutes les études portant sur des animaux ont été effectuées et selon arrivée directives 29. Toutes les études sont effectuées avec l’approbation du Conseil de recherche institutionnelle éthique (nombre de CÉR 4276). Animal toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l’University Health Network (Toronto, Canada), et tous les animaux ont reçu des soins compatissants en conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, 8 ème édition ( Les instituts nationaux de santé 2011).\n1. installation de dosage anneau aortique\nisolat l’aorte de rat.\nEuthanasier 8 - rats Sprague-Dawley de 10 semaines à l’aide de CO 2 asphyxie : remplacement de gaz CO Set 2 chambres à 20 % (débit = 0,2 x chambre volume/min). Confirmer en l’absence de pincement réflexe et le coeur bat en palpant poitrine.\nMouiller la fourrure sur la région de la poitrine à l’aide de gaze stérilisé avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des ciseaux et pinces stérilisées pour pratiquer une incision dans la médiane de la poitrine et couper à travers les couches de peau et le muscle.\nUne fois la cage thoracique est exposée, la cage thoracique, découpez chaque côté et plier vers le haut environ 5 mm du sternum sur chaque côté. Des saignements sont attendu à partir des artères intercostales dans les cadavres frais.\nPousser le tissu pulmonaire et le cœur vers la droite anatomique pour exposer l’aorte. L’aorte est le blanc de couleur navire situé adjacente à la colonne vertébrale.\nUtilisation pince à pincer l’aorte (après la crosse aortique) et utiliser des ciseaux chirurgicaux pour faire l’incision première tout en tenant l’aorte avec une pince. Après coupure de l’aorte, la cage thoracique se remplira rapidement avec le sang, c’est pourquoi il est essentiel de travailler rapidement pour obtenir de l’aorte avant la coagulation sanguine.\nPinces à utiliser pour tenir l’aorte et décoller doucement l’aorte vers le bas, la colonne vertébrale. La traction va rompre les artères intercostales sans autres incisions. Obtenir environ 10 cm de tissu et/ou avant de l’aorte se divise en deux branches dans la cavité abdominale et coupe l’aorte de la carcasse. Pousser le diaphragme si nécessaire à la direction caudale pour gagner accès à des sections de l’aorte à.\nNOTE : Peler l’aorte doucement car force intense peut amener à déchirer. Si les larmes de l’aorte, permettent la coagulation du sang pendant quelques secondes et utilisez un essuie-tout pour enlever le sang coagulé, assurant une visibilité de l’aorte restante.\nPlacer l’aorte dans un tube de 15 mL avec 10 mL de Hank glacee ' s Balanced Salt Solution (HBSS) additionné de 1 % la pénicilline/streptomycine (P/S). Garder les lampes sur glace\nNOTE : Le tissu aortique peut durer pendant 1-2 h sur la glace, mais il est préférable de le traiter aussi rapidement que possible.\nPréparer les milieux de culture de dosage anneau aortique dans une armoire de biosécurité stérile (BSC).\nPréparer le milieu de croissance endothéliale (EGM) en utilisant une unité de filtration pour filtre 500 mL de milieu Basal endothélial (EBM) additionné de 2 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 % de gentamicine et facteurs de croissance (voir Table des matières). Placer 50 mL des médias filtrées dans un talon ou le bain-marie à 37 ° C.\nUne autre unité de filtration permet de filtrer 100 mL de EBM additionné de 2 % de SVF et 1 % P/S à préparé l’EBM 2 % SVF (EBM-BF) et conserver à 4 ° C.\nEnduire des plaques de culture de tissu de 12 puits avec l’extrait de Membrane basale (BME) alors qu’il travaillait sur la glace.\nPlace une plaque de 12 puits sur une surface froide (gros bloc de glace ou un plateau). Ajouter 200 µL/puits d’utilisation de BME fraîchement décongelées réfrigéré pointes de pipette et agiter les Afro-Caribéens afin d’assurer le même revêtement. Travail rapidement pour éviter une polymérisation inégale de la BME.\nRemarque : Une excision aorte typique donne 20 anneaux aortiques. Pour tenir compte de la variabilité entre les essais de l’anneau aortique, configurer au moins trois essais de l’anneau aortique par groupe de traitement et inclure un contrôle. Si la source le permet, il est recommandé de 6 anneaux par groupe de traitement.\nPlacer les plaques revêtues en incubateurs humidifiés (95 % d’humidité relative, 37 ° C, 5 % CO 2 ; ces conditions s’appliquent à toutes les étapes de l’incubateur humidifié ci-après) pendant 30 min. Place 1 000 µL pipette bascule à-20 ° C pour l’étape 1.5.3.\nNOTE : Tandis que l’extrait de la membrane basale est utilisé en concentration stock, sa consistance et la rigidité est strictement contrôlé par le temps de polymérisation. Veillez à garder les mêmes temps de polymérisation exacte pour tous les parallèles et les expériences indépendantes.\nLa section de l’aorte en rondelles uniformes.\nPrenez l’aorte du tube de 15 mL et placez-le dans un plat de 10 cm avec 10 mL de HBSS frais additionné de 1 % P/S.\nUtiliser deux paires de pinces pour séparer soigneusement l’excès de tissu conjonctif, le tissu adipeux et utilisez un scalpel pour les autres branches des artères intercostales connecté à l’aorte. Cela réduit la variabilité entre les unités de l’anneau issu des différents niveaux du tissu résiduel. Enlever tout résidu coagulé sang prélevé à l’intérieur de l’aorte.\nPlacer une règle ou une grille sous le plat de 10 cm pour couper précisément à 1-2 mm larges sections de l’aorte à l’aide de forceps et bistouri stérile. Couper les sections aussi exacte que possible de réduire la variabilité entre les unités.\nIncorporer les anneaux aortiques dans BME.\nRemarque : Si le sectionnement des anneaux aortiques n’est pas terminé avant l’incubation de polymérisation BME, enlever les plaques de revêtement de l’incubateur humidifié et ajouter 100 µL de l’EBM dans chaque puits de mettre fin à la polymérisation. Chronologie exacte est critique car trop de polymérisation des afro-caribéens peut-être interférer avec la migration de développement et de la cellule endothéliale réseau. Une fois que les anneaux aortiques sont prêts, retirer les puits de l’EBM et continuer sur l’étape 1.5.2.\nSupprime les puits BME enduite des incubateurs humidifiés et retourne à la GCS.\nSoigneusement ramasser les anneaux aortiques individuels avec une pince et placez-en un au milieu de chaque puits BME-enduit. Répéter pour les reste des anneaux aortiques.\nNOTE : Media transféré avec l’anneau aortique doit être maintenu un minimum afin d’éviter des irrégularités de polymérisation.\nUtilisation refroidi (-20 ° C) 1 000 pointes de pipette µL d’ajouter 300 µL d’afro-caribéens sur le dessus de chaque anneau aortique et répartir uniformément le BME autour du puits.\nRetourner les anneaux aortiques embarqués pour les incubateurs humidifiés pendant 30 min.\nEnlever les plaques avec l’anneau aortique incorporé les incubateurs humidifiés et ajouter lentement 1 000 µL d’EGM (préparé et réchauffé à étape 1.2.1) en plaçant la pipette Astuce contre le mur de la culture bien.\nNOTE : Pipetage directement les médias sur les Afro-Caribéens peut perturber le BME polymérisée et entraver le développement du réseau endothéliales continue. Utilisez une pipette multicanaux appropriée, le cas échéant.\nAprès 24 h, retirez 1 000 µL d’EGM et remplacez-le par 1 000 µL de EBM-FBS préparées à l’étape 1.2.2, encore une fois en pipettant également lentement contre le côté de la culture bien.\nMaintenir l’essai de l’anneau aortique en remplaçant 500 µL de EBM-FBS avec 500 µL de frais EBM-FBS (37 ° C) chaque 48 h\nRemarque : Voir section 2 pour démarrer l’expansion de la culture du SMC sur le même jour que la création de test anneau aortique. Cela garantira que MSCs sont prêts pour la co-culture, lorsque les réseaux endothéliales sont prêts.\nUtiliser la microscopie lumineuse pour suivre le développement de réseau endothéliales test anneau aortique (voir la Figure 1 comme référence pour le développement de réseau optimale). Une fois l’aspect endothéliales réseaux tel qu’illustré à la Figure 2, procéder à la mise en place de l’anneau aortique dosage-MSC co-cultures (section 3). Reportez-vous à l’étape 4.1 pour plus de détails sur l’imagerie des réseaux endothéliales.\n2. Culture de tissus\npréparation des solutions mères de milieux de culture de tissu.\nCulture FTM HUCPVCs (précédemment établie, n ≥ 3 lignes indépendantes pour chacune) 30 et BMSC commercialement disponible en alpha-MEM additionné de 10 % de SVF et 1 % P/S.\nStériliser les médias à l’aide de 0,2 µm pore taille filtre bouteilles.\nStocker les solutions supports préparés à 4 ° C pendant 3 semaines.\nMaintenir FTM HUCPVC et BMSC cultures dans des incubateurs humidifiés ou passage à la confluence de 70 à 80 % déterminé par microscopie à contraste de phase. Utilisation des volumes appropriés des médias pour la taille du plat de la culture de tissus utilisés (c'est-à-dire 10 mL dans un plat de 10 cm). Utilisez ces conditions de culture pour le maintien et le passage des MSCs.\nSe dissocient les monocouches MSC pour passage ou anneau aortique dosage-MSC conjointement les cultures à l’aide d’une solution d’enzyme de dissociation (plat de 4 mL/10 cm) et incuber dans les incubateurs humidifiés pendant 3 min. veiller à ce détachement des cellules à l’aide de la microscopie en champ clair ; incuber pour un 1-2 min supplémentaire, si nécessaire.\nTransférer les cellules dissociées dans un tube de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.\nAspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire et remettre en suspension les cellules dans 1 mL d’un milieux de culture appropriés (alpha-MEM de médias complet pour le passage des cellules ou EBM-FBS pour anneau aortique dosage/MSC co-cultures) pour le comptage en utilisant un compteur cellulaire.\n3. Préparation de l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures\n10 graines 4 MSCs sur chacun incorporé anneau aortique (9 000 cellules/cm 2 / plaque de 12 puits). Basée sur le nombre d’épreuves de l’anneau aortique, pré tacher les MSCs avec colorant fluorescent viable et non transférable. Maintenir au moins trois puits des anneaux aortiques sans MSCs pour un groupe de contrôle.\nPour colorer 10 médias 5 MSCs/mL EBM-FBS, ajouter 2,5 µL de viable, médias non transférable colorant fluorescent/mL (5 µM) dans un tube de 15 mL et placez dans l’incubateur humidifié pendant 30 min. mélangent doucement le tube au milieu de l’incubation.\nSuivant les 30 min d’incubation, ajouter 1 volume de EBM-FBS fraîches aux cellules colorées et essorer à 400 x g pendant 5 min.\nEnlever le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de médias de EBM-FBS. Confirmer la coloration réussie des MSCs à l’aide de la microscopie de fluorescence.\nSortir les plaques contenant de l’anneau aortiques de l’incubateur humidifié et retirez chaque puits de 500 µL de EBM-FBS.\nGraines soigneusement 10 4 MSCs dans 500 µL de EBM-FBS sur chaque anneau aortique embarqué par pipetage uniformément autour des réseaux endothéliales. Répartissent en le secouant doucement la plaque de culture.\nAjouter EBM-FBS supplémentaires pour s’assurer que le volume total des médias sur l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures est 1 000 µL.\nLa microscopie de fluorescence permet de visualiser les MSCs fluorescent étiquetés dans l’essai de l’anneau aortique.\nutilisation brillante-microscopie d’imager les réseaux endothéliales rat avant l’anneau aortique dosage/MSC cultures conjointement des mesures de référence (jour 0) des propriétés réseau endothéliales (p. ex., réseau longueur, boucles de réseau). Image 4 quadrants / puits de l’anneau aortique à la section plus éloignée du réseau endothéliale dans ce quadrant. Réseaux d’anneau\nimage de l’aorte après l’anneau aortique dosage/MSC cultures co 3, 5 et 7 jours. Utiliser ces images pour quantifier l’effet MSC sur le développement du réseau endothéliales.\nUtiliser la microscopie de fluorescence pour image préétiquetés MSCs dans l’essai de l’anneau aortique.\n24h suivant de l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures, utiliser la microscopie de fluorescence pour visualiser MSC homing, élongation et intégration avec les réseaux endothéliales. Se chevauchent les images fluorescentes de MSCs avec les images de champ lumineux des cellules endothéliales à observer la co-localisation des deux types de cellules.\nD’image les MSCs localisées au sein des réseaux endothéliales développés proximales pour le tissu de l’anneau aortique et les MSCs localisées à l’intérieur nouvellement développement réseaux distales dans le tissu de l’anneau aortique ( Figure 2).\n5. Flow Cytometry et qPCR\nun jour avant la dissociation des réseaux endothéliales anneau aortique, décongeler a gelé à 4 ° C O/N. Section 5.3 est identique pour la cytométrie en flux et qPCR.\nChauffer 50 mL d’a et 50 mL de 0,5 % trypsine dans bain de perle ou de l’eau 37 ° C.\nRécupérer les cellules pour l’analyse de l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures.\nAprès 1 semaine de culture mixte de dosage/MSC anneau aortique, retirez le support de culture et ajouter 1 mL de Phosphate-Buffered Saline (PBS) lentement pour chacun bien pendant 3 min et retirer. Répétez ce laver deux fois plus.\nAjouter 800 µL de préchauffée a dans chaque puits et incuber dans les incubateurs humidifiés pendant 15 min.\nRetirer les plaques les incubateurs humidifiés et suspendre a de pipetage (5-10 x) pour défaire les afro-caribéens et transférer le contenu de chaque puits dans des tubes distincts 15 mL.\nRépéter l’étape 5.3.3 avec frais a préchauffé jusqu'à aucun résiduel BME est observée dans la culture bien. Ajouter 1 volume de PBS additionné de 3 % SBF à la suspension de cellules a pour inactiver l’a. Retirer les anneaux aortiques flottant dans la suspension de cellules à l’aide de pointes de pipette.\nTourner les suspensions cellulaires à 400 g pour 5 min. Retirez le surnageant avec soin, laissant 3 mL de suspension cellulaire dans le tube de 15 mL.\nRemarque : Une pastille évidente, solide n’est peut-être pas visible, mais les cellules et les Afro-Caribéens sont présents.\nAjouter 3 mL de préchauffée trypsine de 0,5 % pour les cellules de remettre (5-10 x par pipetage) suspension cellulaire et vigoureusement. Incuber les solutions de débris cellulaires dans les incubateurs humidifiés pendant 10 min.\nEnlever les suspensions de débris cellulaires de l’incubateur humidifié et ajouter 6 mL de PBS additionné de 3 % FBS et remettre quelques times. Faites tourner les suspensions cellulaires à 400 g pendant 5 min.\nSoigneusement retirer tous le surnageant, en laissant le culot cellulaire dans le tube et remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS additionné de 3 % FBS dans chaque tube.\nFiltrer la suspension cellulaire de 1 mL à l’aide d’une passoire de cellule 70 µm pour enlever les cellules agrégées et BME résiduelle de la suspension cellulaire. Compter les cellules dans 1 mL de suspension cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules.\nPréparer les cellules pour la cytométrie en flux.\nIncuber les cellules des suspensions (10 cellules de 5 à 200 µL de PBS additionné de 3 % FBS) conjugué à un fluorophore (FITC ou APC) les anticorps primaires (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentration = 01:40) à 4 ° C pendant 30 min, l’abri de la lumière.\nNOTE : Cytométrie en flux pour MSCs a été optimisé par Hong et al., 2013 28. Il faut un minimum de 10 000 cellules pour une lecture précise.\nAprès l’incubation de 30 min, de remettre en suspension les cellules dans 2 mL de PBS additionné de 3 % FBS et centrifuger (400 x g, 5 min).\nCellules de conserver à 4 ° C, abri de la lumière jusqu'à ce que l’analyse par cytométrie en flux (au moins 1 x 10 4 événements) à 1 h. Pour la stratégie de blocage, voir supplémentaire Figure 1. Trier les MSCs humaines à l’aide d’anti-TRA-1-85 (APC) (concentration : 01:40 et à 0,5 % FBS/PBS) et trier des cellules dans 350 µL de tampon de lyse cellulaire pour l’analyse de qPCR.\nRemarque : Les cellules lysées peuvent être stockées à-80 ° C jusqu'à 3 mois pour l’analyse des futurs qPCR.\nPréparer les cellules pour l’analyse de qPCR.\nIsoler l’ARN des cellules lysées à l’aide de kits d’isolation RNA basée sur les colonnes et déterminer la concentration d’ARN et de la qualité.\nPrepare cDNA de jusqu'à 5 µg d’ARN par 100 µL de la transcriptase inverse. Exécuter une étape de pré amplification si le rendement de RNA est faible (< 10 ng/µL). Utilisation de moins de 100 ng d’ARN se traduira par un taux élevé de faux négatifs.\nRemarque : Les modèles de cDNA peuvent être stockés à-20 ° C pour une analyse ultérieure jusqu'à 4 mois.\nEffectuer le qPCR l’utilisation de l’angiogenèse expression profileur tableaux pour détecter des changements dans l’expression des gènes. L’utilisation de 5 ng de l’ADNc par réaction (40 cycles, 60 ° C température de recuit/extension). Express pli changement d’expression par rapport aux échantillons de cDNA MSC dérivé indifférenciées. Exécuter les contrôles négatifs appropriés (anneau aortique sans humains MSCs).\n6. Réseau de Quantification suivante aortique Ring test/MSC co-cultures\nTélécharger le logiciel d’imagerie comme ImageJ ainsi que de l’angiogenèse Analyzer plugin 31.\nImporter les images réseau endothéliales prises et d’ouvrir en utilisant le logiciel.\nConvertir les échelles d’image basés sur les spécifications du microscope utilisé.\nUn outil linéaire permet de mesurer la croissance du réseau radial.\nCompter les boucles endothéliales réseau à l’aide de l’outil de compteur de cellules (les boucles au moins 4 côtés doivent être quantifiés).\nPour quantification supplémentaire des propriétés du réseau, utilisez le plugin angiogenèse Analyzer ou autres plugins similaires pour analyser les segments maîtres, total longueur de segment, zones de l’ensemble du réseau et nombre de jonctions. Utilisez l’outil de masque flou pour brouiller les tissus de l’anneau aortique et des espaces vides pour éviter des fausses positifs calculs.\nTransférer les valeurs dans un programme et graphique réseau endothéliales propriétés des statistiques suite à l’anneau aortique dosage/MSC co-cultures.\nLe flux de travail schématique pour établir le dosage de co-culture anneau aortique/MSC est illustré dans la Figure 1. Les étapes principales incluent : isolement de l’aorte, sectionnement et incorporation des anneaux aortiques, suivi l’endothéliale de la germination et le développement de réseau et enfin l’étiquetage et administrer les MSCs de rat. La chronologie de l’analyse de réseau endothéliales décrit la fenêtre pour les analyses réalisables pour chaque période de co-culture : jour 1, 5 & 7. Notes complémentaires sont mises en évidence par des zones en pointillés.\nL’identification des régions structurellement distinctes dans les cultures de cellules endothéliales de l’anneau aortique est réalisée par microscopie en champ clair, 3-5 jours après que les anneaux aortiques sont incorporés dans l’ECM (Figure 2). Le secteur non structuré (Figure 2 a) est caractérisé comme une région de prolifération cellulaire élevée mais faible organisation structurale dans le voisinage direct du tissu aortique. Les réseaux développés endothéliales (Figure 2 b) se référer aux régions avec une forte structure de l’organisation, où les réseaux sont pleinement mis en place et principalement composés de boucles fermées, même avant l’addition de MSCs. Les développement des réseaux (Figure 2) sont situés dans les régions distales des cultures endothéliales. Ce sont les sites de migration des cellules endothéliales et l’allongement sous la nouvelle forme de structures de réseau. Les 3 régions mentionnées ci-dessus sont facilement identifiables au cours des expériences et sont utilisées lorsque vous référencez où les MSCs abrite dans les cultures co. Les MSCs prémarqués doivent être co cultivés avec le test de l’anneau aortique lorsque tous les trois segments du réseau ont mis au point. La quantification des réseaux endothéliales suite MSC co-cultures incluent les régions des pays développé et en développement réseau (Figure 2, cadre blanc).\nLa microscopie en fluorescence permet des mesures qualitatives de MSC migration, intégration et morphologie en conjonction avec le développement de réseaux endothéliales dans l’essai de co-culture de l’anneau aortique-MSC (Figure 3). Les MSCs étiquetés avec un fluorophore viable, cytoplasmique ont été imagées 24h après son administration aux cultures co. FTM HUCPVCs ont été trouvées à la périphérie des réseaux endothéliales en voie de développement, affiche des morphologies de cellules allongées et a contribué à la poursuite du développement des réseaux endothéliales (Figure 3 a, B). Pour comparaison, BMSC hébergés pour les développement des réseaux tout en affichant moins d’interaction avec les cellules endothéliales (Figure 3, D). Images de grossissement élevé après 72 h ont montré que les FTM HUCPVCs maintenu une couverture élevée et la stabilisation des réseaux endothéliales tandis que BMSC co-cultures présentées une morphologie sphérique avec intégration limitée dans les réseaux endothéliales (Figure 3E , F). L’observé différences démontrent clairement les différences qualitatives et fonctionnelles entre les types humains de MSC. Un type de cellule de candidat ayant homing significative et propriétés intégration endothéliales (Figure 3 a, B & E) se distingue par rapport à un type de cellule avec intégration réseau endothéliales limité et augmentation mammaire capacités (Figure 3, D & F).\nImages de microscopie de fluorescence fort grossissement ont été acquises pour disséquer davantage des interactions physiques entre les cellules endothéliales et FTM HUCPVCs dans réseaux tubulaires. Le préétiquetés HUCPVCs FTM (Figure 4 a, vert) sont montrés adhérant avec des cellules endothéliales non colorés (Figure 4 a, blanc flèches). FTM HUCPVCs trouvées à apporter un soutien structurel aux cellules endothéliales en servant comme une surface axe et l’attachement entre les nœuds. Les réseaux endothéliale de l’anneau aortique peuvent également être préalablement marqués à l’aide d’un fluorophore viable de même vers le MSC coloration (Figure 4 b, rouge). En doubles co-cultures tachées, microscopie à fluorescence a révélé allongées des adhérences entre les deux types cellulaires, fortifiant l’observation de la coopération et le comportement de la cellule de soutien.\nLa quantification des propriétés structurelles endothéliales réseau a été réalisée au jour 5 des co-cultures MSC (Figure 5). Quadrants uniformes ont été définis pour le mesurage dans tout le réseau endothéliales tout anneau aortique (Figure 2, cadre blanc). La croissance du réseau moyenne a été calculée comme la distance entre les boucles de réseau fermé proximale premières en anneau aortique aux plus éloignées boucles fermées distales (taille de rayon) (Figure 5 a). La croissance moyenne réseau des co-cultures anneau aortique-MSC étaient comme suit : FTM HUCPVCs (2,98 ±0, 3 mm) et BMSC (1,5 ±0, 15 mm). Les réseaux endothéliales non traités mis au point un rayon moyen de 1,9 ± 0,1 mm. La comparaison statistique entre les groupes de traitement MSC a démontré que FTM HUCPVCs a contribué à la croissance réseau significativement plus élevée par rapport à BMSC et réseaux non traités (p 0,001). Le non traitées réseaux endothéliales développé considérablement plus de BMSC contenant des co-cultures (p ≤0.01) (Figure 5 b).\nLe nombre total de boucles ont été calculé dans chaque quadrant et exprimé en formation moyenne totale du circuit (Figure 5). Le nombre moyen de boucles fermées totales étaient comme suit : FTM HUCPVC traités co-cultures (81 ±7), BMSC (±3 26) et n’est pas traité les anneaux (55 ± 7). FTM HUCPVCs contribué à significativement plus grande boucle endothéliales formation comparativement aux BMSC (p ≤0.01) et de réseaux non traités (p ≤0.01). Le BMSC co cultures endothéliales a entraîné moins boucles par rapport aux réseaux non traités (p ≤0.01) du réseau. Cette quantification identifie un type de cellule qui a un effet nettement positif sur le développement du réseau endothéliales (FTM HUCPVC) et un type de cellule qui risqueraient même de réseaux endothéliales. Il est à noter que le développement du réseau une augmentation significative a été observé en corrélation avec la couverture MSC sur les réseaux endothéliales. Il suggère que les interactions directes sont déterminantes pour les MSCs exécuter leur fonction de soutien.\nLes écueils possibles des établissements co-culture anneau aortique sont représentées dans la Figure 6. Polymérisation inadéquate ou irrégulière de BME est un problème qui peut interférer avec le développement du réseau endothéliales réussie. Chronométrer la polymérisation de BME pendant exactement 30 minutes et le transfert des médias sans perturber le polymère assurera une phase BME intacte et fonctionnelle (Figure 6 a). Coloration les MSCs pour temps d’incubation prolongée et permettant les MSCs granuler pendant des périodes prolongées peuvent interférer avec la morphologie cellulaire et phénotype sur co-cultures. Figure 5 b montre FTM HUCPVCs colorés pendant 1 h et a permispour granulés pour 1 h avant la co-culture, les deux étant sous-optimale timings. HUCPVCs FTM ne montrent pas de préférence aux sites de réseaux endothéliales et sont dispersées à travers le réseau. Comparer correctement traitée de cellules (Figure 3) à mal FTM HUCPVCs, les cellules mal affichent la morphologie des cellules arrondies et les interactions cellule-cellule limitées avec les cellules endothéliales (Figure 6 b). Enfin, si l’essai de l’anneau aortique ne peut être établi le jour de la dissection, les aortes peuvent être stockées à-80 ° C en milieu EGM-C additionné de 10 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) et 10 % FBS. Le développement du réseau endothéliales peut prendre 1-3 d plus longtemps lors de l’application des anneaux aortiques décongelés par rapport au tissu frais, mais les réseaux endothéliales suffira pour création de co-culture MSC (Figure 6).\nComme une procédure alternative de l’évaluation de co-culture anneau aortique, la fraction cellulaire des anneaux aortiques BME incorporé peut être extrait et analysée par cytométrie en flux (supplémentaire Figure 1). Le marqueur spécifique humain TRA-1-85 (complémentaire de la Figure 1 a, B, axe des y) population de cellules positives de FTM HUCPVC contenant des co-cultures a été identifié comme humains MSCs. L’étiquetage Co a montré faible expression du marqueur endothélial CD31 (complémentaire de la Figure 1 a) et forte expression du marqueur pericyte CD146 (complémentaire Figure 1 b) au sein de la population de cellules positives humaines marqueur spécifique. Cette évaluation peut déchiffrer immunophénotypiques éventuelle et changements engagement lineage des MSCs induites par les interactions avec les cellules endothéliales et fournissent également des informations précieuses sur le type de cellule testé. Afin d’obtenir un nombre suffisant de cellules pour l’analyse des FC, les cellules extraites du puits parallèles du même groupe expérimental peuvent être combinés. Il est important d’envisager l’utilisation non pré-teinté MSC contenant les anneaux aortiques pour analyse en cytométrie en flux, afin que la fluorescence qui rappelle le colorant viable n’interfère pas avec le signal de l’anticorps-connexe fluorophores. Dans le cas contraire le déclenchement négatif devrait prendre la fluorescence cellulaire pré colorés en considération.\nNous avons trié MSCs extrait forme anneau aortique co cultures humaines (jour 7 de co-culture) à l’aide de l’anticorps spécifique de la surface de marqueur de cellules humaines (TRA-1-85). HUCPVCs FTM et BMSC extraite de l’essai de l’anneau aortique ont été traités pour l’analyse de qPCR tester l’expression des gènes angiogénique. À l’aide d’un tableau de qPCR disponibles dans le commerce, trois cultures co de l’anneau aortique a fourni une quantité suffisante de matériel génétique pour quantifier l’expression des gènes de facteur de croissance humain 84 (complémentaire Figure 2 a). Les résultats préliminaires indiquent que les FTM HUCPVCs et BMSC exprime des facteurs angiogéniques sécrétées clés à des niveaux comparables (complémentaire Figure 2 b). En plus de comparer les niveaux d’expression des différents types de cellules dans le dosage, l’effet de transfert de cellules à EBM base dosage médias de leur milieux de culture d’expansion sont à considérer. Lors de l’utilisation de cellules de la plasticité phénotypique ou génétique plus élevée, un groupe de contrôle de comparaison de MSCs humaines dans les médias EBM - sans le tissu aortique - devrait figurer dans l’évaluation.\nLes similitudes dans l’expression du facteur angiogénique de MSCs suggère que la différence significative de leur augmentation de réseau n’est pas un résultat des activités différentes paracrine. C’est en concordance avec l’observation antérieure qui interaction intercellulaire directe accrue semble favoriser le développement du réseau endothéliale.\nFigure 1 : Schéma d’une nouvelle Application de la configuration de test anneau aortique.\nLes principales étapes de l’installation et l’analyse des co-cultures MSC avec le test de l’anneau aortique sont exposées dans des boîtes solides et notes additionnelles sont décrites dans des boîtes en pointillés. Echelle = 1 000 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 2 : Image de représentant de l’analyse de réseau anneau aortique.\nRéseaux endothéliales sont divisés en trois régions concentriques issues des différences structurelles : secteur non structuré à proximité immédiate de l’anneau aortique tissu (A), développé ou structuré des réseaux endothéliales (B) et développement des réseaux situé dans la périphérie de la culture de tissus ex vivo (C). Croissance du réseau radial et quadrant uniforme pour le nombre de boucles sont définis au sein du réseau avancé endothélial (B). x: fermée boucle endothélial comptés dans quadrant uniforme. Echelle = 250 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 3 : Fluorescent région dépendante du réseau d’imagerie intégration de humaine MSCs dans le test d’anneau aortique suite 24 & 72 h.\nMarqueur (vert) FTM HUCPVCs et BMSC ont été ajoutés pour les développement des réseaux de tube endothéliales anneau aortique. Images de microscopie de fluorescence prises 24h après avoir établi la MSC co-cultures affichent HUCPVCs FTM qui migrent dans l’ECM et la maison aux périphériques réseaux endothéliales en développement (A). Images de grandissement supérieurs afficheront morphologies allongées de FTM HUCPVCs alors qu’il est en contact étroit avec les réseaux endothéliales (B). BMSC moins traite l’ECM et la maison aux réseaux endothéliales avec aucune préférence observable pour le développement de périphériques réseaux (C). BMSC affiche morphologies cellule sphérique (D).\nImages de microscopie de fluorescence fort grossissement de marqueur MSCs dans test anneau aortique de rat après 72 h de co-culture (E, F). FTM HUCPVCS présentent des morphologies allongées tout en affichant endothéliale couverture grâce à des interactions directes de cellule à cellule avec des cellules endothéliales (flèches blanches solides) aussi bien dans les noeuds du réseau et les tubules (E). BMSC maintenir morphologies de cellules sphériques regroupées dans les nœuds de réseau endothéliales (F). Broken arrow représente le sens de la croissance du réseau endothéliales dans les tissus de l’anneau aortique. A, C: Echelle = 1 000 µm B, D: échellebar = 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 4 : Fort grossissement les Images de microscopie par Fluorescence des Interactions physiques Pericyte-endothélial.\nLes cellules endothéliales non colorés trouvées associées à des protubérances continus reliant préalablement teinté FTM HUCPVCs dans le réseau tubulaire (A). Images fluorescentes des réseaux endothéliales préalablement teinté (EC, rouge) avec pré teinté FTM HUCPVCs (FTM, vert) démontrent récapitulant les cellules endothéliales, les interactions des interactions pericyte (B). A: section Echelle = 100 µm B: section Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 5 : Quantification de la croissance du réseau dans le traitement de MSC regroupe 5 D après établissement de co-culture.\nFaible grossissement phase contraste microscopie images ont été prises par les groupes de traitement anneau aortique pour évaluer la croissance et le développement (A). Épars flèche indique le sens de la croissance du réseau. Echelle = 250 µm. microscopie images ont été utilisées pour quantifier les propriétés du réseau, y compris la croissance moyenne réseau et signifie la formation de boucle de réseau dans le quadrant d’un dosage. HUCPVCs FTM ont contribué à une plus grande croissance de réseau par rapport aux cultures co BMSC et réseaux non traités (p 0,001) (B). La valeur de p a été calculée à l’aide d’une ANOVA à être p <0,0001 à l’aide de Tukey Post test (N = 3). Boucles de réseau au moins quatre côtés fermés ont été quantifiés (C). FTM HUCPVC cultures conjointement développés boucles de réseau supérieures par rapport aux cultures co BMSC (p 0,001) et réseaux non traités (p ≤0.01). La valeur de p a été calculée à l’aide d’une ANOVA à être p < 0.0001 à l’aide du test de Post de Tukey (N = 3). La moyenne des 4 domaines de réseaux endothéliales ont été quantifiées. Echelle = 250 µm. Pour la comparaison par paire, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤0.01, *** = 0,001 p. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 6 : Les erreurs possibles dans l’établissement de dosage anneau aortique.\nDes anneaux aortiques incorporés dans la polymérisation incomplète BME peuvent conduire à réseaux endothéliales incompatibles et cassés (A). FTM HUCPVCs colorées pendant de longues périodes avec des écarts de temps importante entre la coloration et l’établissement des co-cultures, rendement minimal homing et interactions entre les cellules endothéliales (B). Le réseau endothélial de l’aorte de rat stockées à-80 ° C et décongelé pour l’analyse de l’anneau aortique (C). A: section Echelle = 250 µm B, C: échelle = 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nSupplémentaire Figure 1 : Analyse d’écoulement Cytometry de FTM humaine HUCPVCs extraits des co-cultures anneau aortique.\nDes fractions cellulaires des cultures de l’anneau aortique ont été isolées et travaillées pour analyse en cytométrie en flux. Fluorophore conjugués anticorps contre marqueur de surface spécifiques de cellules humaines (TRA-1-85, APC) a été appliqué en combinaison avec le marqueur endothélial (CD31, FITC, (A)) ou des anticorps spécifiques de la pericyte marqueur (CD146, FITC, (B)). La population de cellules positive pour le marqueur humain (axe y) testé faible positivité pour marqueur endothélial CD31 (A, T2) et fortement positif pour le marqueur de pericyte CD146 (B, Q6). Ceci suggère que les FTM HUCPVCs maintenu leurs propriétés de cellule périvasculaire dans les cultures co de l’anneau aortique et n’ont pas développé un phénotype endothélial. Les quadrants sur parcelles ont été définies en utilisant isotype contrôles correspondant à l’anticorps primaires appliquées. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.\nSupplémentaires Figure 2 : Analyse PCR Quantitative des gènes clés angiogénique.\nL’expression des gènes similaires de gènes clés angiogéniques par FTM HUCPVCs et BMSC après 1 semaine culture mixte dans l’essai de l’anneau aortique (A). Les valeurs de CT représentatives figurent au tableau (B). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.\nIl y a plusieurs étapes essentielles à mettre en place un test réussie anneau aortique expérience de co-culture MSC. Tout d’abord, les étapes les plus importantes lorsque l’isolant et en sectionnant l’aorte sont : 1) obtenir exclusivement le segment thoracique de l’aorte ; 2) soigneusement enlever les vaisseaux sanguins ramifiés, conjonctif et le tissu adipeux et ; 3) coupe même des sections de l’aorte (~ 1 mm) pour limiter la variabilité entre chaque essai. Deuxièmement, l’intégration réussie des anneaux aortiques dans BME est essentiel pour ce dosage. Si les Afro-Caribéens n’est pas complètement polymérisés ou polymérisés inégalement, les anneaux aortiques incorporés dans le BME ne sera pas en mesure d’ouvrir la germination endothéliale ou ils peuvent développer des réseaux endothélium discontinus. Si la polymérisation de BME est insuffisante, dosages ne sont pas fiables pour la quantification. En troisième lieu, complète enrichie en facteur endothélial médias sont nécessaire pour trouver de la nourriture pour les anneaux aortiques à amorcer la germination. Une fois que les anneaux de l’anneau aortique ont initié navire de germination, les prochaines étapes à venir critiques impliquent le type de cellule à tester. À cette fin, MSCs doivent être correctement pré-teint et administré aux germination des anneaux aortiques. Il existe deux procédures critiques pour cette section. 1) en sélectionnant le jour approprié pour l’amorçage : les réseaux devraient être dans la phase de développement et ne pas parvenir à une couverture élevée de la culture bien. Si les MSCs ne sont pas administrés de manière opportune, il devient difficile de quantifier les effets nets des MSCs sur le développement du réseau. 2) prestaining les MSCs avant addition : si les MSCs sont trop colorés ou restent en granulés pendant une longue période de temps, agglutination se produit qui détériore homing et intégration au sein de réseaux endothéliales. Enfin, quantifier les réseaux peut être facilement réalisée si les contrôles appropriés sont prêts. Anneaux aortiques sans MSCs mettra au point des réseaux endothéliales parce que l’aorte elle-même prend en charge la germination, mais les MSCs peuvent favoriser le développement de réseau plus important avec des structures de réseau différent tel que décrit dans ce manuscrit. La quantification des réseaux endothéliales devrait être effectué au moins 5 d établissant co cultures suivantes. En raison du système fermé, réponse angiogénique est transitoire et endothéliales réseaux commencent à dégénérer après environ 7 jours. Si l’observation vise à évaluer l’effet de type cellule testée sur le développement des réseaux endothéliales, les images doivent être acquis au sein de la première semaine de co-culture.\nUne éventuelle modification du dosage actuel peut être l’application de tissus humains primaires. Comme une section de 1 mm de l’aorte de rat fait une unité de culture mixte, aortes humaines peuvent fournir un grand nombre de sections de mesures très cohérentes. Malgré la disponibilité très limitée du tissu principal humain viable, à haut rendement suggère faisabilité potentielle. Lors du développement d’un test pour les évaluations à grande échelle, formant avant l’essai et stocker ses composants jusqu'à ce que les cellules pour les tests deviennent disponibles peuvent être considérés. Le revêtement de BME peut être préparé sur des plaques de culture de tissus et stocké sous forme congelée, déshydratée pour longues périodes de temps. Aussi, que nous avons testé dans notre laboratoire, le tissu aortique de rat peut être congelé et stocké pour application ultérieure, ainsi faisant travailler avec l’élément essentiel de l’essai plus commode.\nMalgré les nombreux avantages du test de l’anneau aortique, il y a quelques limitations à énumérer. Tout d’abord, la mise en place des cultures dosage peut être difficile. Dans sa forme actuelle, l’application systématique nécessite suffisamment de compétences manuelles. Erreurs d’opérateur peuvent introduire de la variabilité. Il peut être reflété dans la croissance du réseau et peut rendre difficile d’évaluer avec fiabilité l’effet des cellules administrées et, par conséquent, les propriétés angiogénique important. Toutefois, ces défis sont semblables si pas inférieurs par rapport à celles des autres méthodes disponibles, et la période de formation requis peut être facilement courtes et économiques plutôt que des expériences in vivo . Ensuite, une période de latence entre l’incorporation de l’ex vivo le tissu aortique et le développement du réseau initial qui marque le moment de l’administration de la cellule doit être pris en compte par l’utilisateur. Troisièmement, la quantification des propriétés réseau endothéliales peut prendre du temps mais peut être résolue en assignant des paramètres de hallmark, y compris la croissance radiale, tube dimensions de maille de longueur et réseau. Cela peut être effectuée en utilisant l’analyse assistée par ordinateur d’images (Image J), qui peut diminuer considérablement le temps requis pour la quantification fiable et constante. Quatrièmement, la variabilité entre chaque essai peut survenir à la suite de légères incohérences dans la source de tissus d’origine animale et de la manipulation par l’opérateur. Nous avons constaté que ce défi peut être surmonter efficacement et la quantification devient statistiquement fiable en mettant en place réanalysés pour chaque groupe de traitement. Enfin, extraire et de trier les cellules de l’homme et l’origine de rat pour dosage après analyse peuvent être difficiles. Cependant, les protéinases spécifiques, y compris a et solution de récupération de cellules peuvent être appliquées pour récupérer des cellules pour l’analyse de l’expression immunophénotypiques ou gène.\nPar rapport aux méthodes existantes qui soit à la culture de cellules endothéliales du même type ou vivent les systèmes animaux, ceci présenté test utilise la combinaison de ex vivo tissu aortique et afro-Caribéennes. Cette configuration permet à l’utilisateur d’obtenir des données qualitatives et quantitatives élucider les propriétés angiogéniques des candidats de la thérapie cellulaire. Combinant des afro-caribéens et multicellulaire ex vivo des tissus fournit des propriétés étroitement imitant le microenvironnement que le type de cellules thérapeutiques peut-être rencontrer après administration locale. En raison de la possibilité d’un nombre élevé de parallels et le contrôle étroit des conditions de culture, l’opérateur est pourvu d’un système qui contient les éléments nécessaires à l’évaluation fiable, tout en éliminant des variables et des incohérences trouvées dans modèles animaux. En outre, les évaluations sont plus réalisables parce qu’elle réduit les coûts et la nécessité de procédures répétées d’animaux. Essais sur des cellules simples et des modèles animaux plus n’ont pas les facteurs et les variables introduites par des réponses immunitaires qui se produirait autrement dans l’application clinique des candidats de la thérapie cellulaire. La réponse inflammatoire altère l’angiogenèse et par conséquent, l’effet thérapeutique de substances implantés ou cellules ne peuvent être quantifiées avec précision. L’essai de l’anneau aortique exclut de nombreux composants inflammatoires qui perturbent le dosage des mesures. Cependant, il contient des macrophages résidents qui sont des acteurs importants dans le développement de système microvasculaire32. Avec l’identification facile du réseau endothéliale et marqueur de cellules humaines, l’effet des cytokines inflammatoires MSC sécrétée et éléments même cellulaires du système immunitaire, on peuvent facilement observer à l’aide de ce test.\nHaut contrôle par l’utilisateur sur les conditions de test et le caractère reproductible d’expérimental permet l’introduction de nouveaux éléments du système. Tout d’abord, l’essai de l’anneau aortique peut servir comme un modèle de blessures. Suite à l’incorporation des anneaux aortiques et germination endothéliale, dosages peuvent être introduits à une lésion ischémique, facteurs inflammatoires (TNF-α) ou bactérien lipopolysaccharides (LPS), suivi par addition de MSC pour déterminer possible sauvetage d’angiogénique réponse à la suite de blessures. Deuxièmement, pour élucider les mécanismes possibles de comment les MSCs contribuent à la réponse angiogénique, zationZing anticorps peuvent être utilisés pour faire taire les critiques concernant les interactions cellule-cellule les récepteurs potentiels. Enfin, afin d’étudier les propriétés paracrine de MSCs, l’essai de l’anneau aortique peut être configuré dans un système de transwell à exclure l’effet des interactions cellule-cellule de la réponse angiogénique, mais se concentrer sur les propriétés paracrine.\nEn résumé, le test de l’anneau aortique peut évaluer la capacité et la puissance des candidats de thérapie cellulaire de médiation ECM traitement, migrer vers des régions de l’angiogenèse et contribuer au développement de navire par contact physique. L’anneau aortique ex vivo angiogenèse dosage pourrait être développé comme un outil de présélection précieux, quantitatif pour les lignées cellulaires candidat pour thérapie régénérative.\nDr. Clifford L. Librach est cotitulaire du brevet : méthodes d’isolement et d’utilisation de cellules provenant de tissus de cordon ombilical premier trimestre. Accordée au Canada et en Australie.\nLes auteurs remercie les membres du personnel suivants et personnel de recherche : Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai et Sarah Laronde.


La guérison du monde – Changeons notre vie.blog\nPublié par Sylvie le juin 27, 2017 juin 27, 2017\nJe viens de terminer le livre de Frédéric Lenoir (Sociologue, Philosophe) : La guérison du monde et je vous recommande cette lecture. J’avais précédemment lu » L’âme du monde » du même auteur.\nIl existe pourtant des voies de guérison. En m’appuyant sur des expériences concrètes, je montre l’existence d’une autre logique que celle, quantitative et mercantile, qui conduit notre monde à la catastrophe : une logique qualitative qui privilégie le respect de la Terre et des personnes au rendement ; la qualité d’être au « toujours plus ». Je plaide aussi pour une redécouverte éclairée des grandes valeurs universelles – la vérité, la justice, le respect, la liberté, l’amour, la beauté – afin d’éviter que l’homme moderne mû par l’ivresse de la démesure, mais aussi par la peur et la convoitise, ne signe sa propre fin. »Frédéric Lenoir.\nLa solution peut venir de chacun de nous, par un travail sur soi, une conversion du regard, un changement d’attitude. Il suffit de le savoir, et de le vouloir.\nD’autre livres ICI : CLIC\nArticle précédent Information et désinformation\nArticle suivant Défi numéro 10 (et si vous incarniez le changement ?)\nUn livre a partager 😉\nCest drôle! Mon livre de chevet est Petit traité de vie intérieure du même auteur… J’aime ces livres. Bises\nMoi aussi ! Ces livres me font du bien. Nous avons banni la tv, la radio, ou nous choisissons nos programme. Les livres sur la spiritualité, la méditation ou autre me font un bien fou ! Ton livre est-il bien ?\nOui, et ce qui me plait c’est que je peux LIRE des passages , sauter des pages et y revenir suivant mon souhait… Je surfe sur ma vague intérieure ;)) La TV est allumé juste pour un programme choisi également. Bisous\nJe le rajoute à ma liste de lecture 🙂\njuin 28, 2017 à juin 28, 2017\nC’est pareil avec le livre de Pierre Rabhi. On peut lire à sa guise, c’est vraiment parfait pour des vacances.\nJe vais voir A La bibliothèque si je le trouve pour les vacances…! Bisous\nLe mien vient de la médiathèque 🙂\nQue de chouettes lectures 🙂\nJe vais le lire….. SAGESSE….. merci, bisous\nhum, c’est quoi la tv …. lol\nj aime cette phrase !\nBien que je pratique cette jolie pensée: « La solution peut venir de chacun de nous, par un travail sur soi, une conversion du regard, un changement d’attitude. Il suffit de le savoir, et de le vouloir. » J’ai du mal à comprendre comment va le monde. Sans doute sommes nous la minorité 🙂\nOui, et la minorité peut se transformer en majorité 🙂\nC’est ajouté à ma liste de futur livre à lire. Merci !\nAu regard de nos échanges, je pense que ce livre te plaira 🙂\nJ’en ai aucuns doutes. Merci 🙂


Ile-de-France Europe : Numérique : Le premier appel à projets WiFi4EU sera lancé le 15 mai\nNumérique : Le premier appel à projets WiFi4EU sera lancé le 15 mai\n22.03.2018 - Appels à projets\nThème : Société de l'information\nLes communes et groupements de communes souhaitant participer peuvent d'ores et déjà s'inscrire sur le portail WiFi4EU\nLa Commission a lancé le 20 mars le portail web WiFi4EU. Les communes de l’UE et leurs groupements sont invités à s’inscrire en prévision du premier appel à projets qui sera lancé le 15 mai et permettra à 1000 d’entre elles environ de bénéficier d’un financement communautaire pour la création de points d’accès gratuits à l’internet sans fil.\nLe programme WiFi4EU offrira aux communes sélectionnées des coupons d’une valeur unitaire de 15 000 euros pour installer des points d’accès Wi-Fi dans les espaces publics tels que les bibliothèques, les musées, les parcs ou les places. Les zones ciblées par l’initiative sont les territoires et espaces les plus fragiles ou moins bien couverts par les réseaux fixes et mobiles. L’aide de la Commission couvrira 100 % des coûts d’équipement (dans la limite de 15 000 euros par bénéficiaire donc) ; les coûts de maintenance (fonctionnement des serveurs, gestion et stockage des identifiants et des échanges effectués par chacun des usagers sur le réseau Wi-Fi) seront à la charge des maîtres d’ouvrage public.\nL’utilisation des réseaux financés par l’initiative WiFi4EU devra être gratuite, exempts de publicités et sans collecte de données personnelles. Les réseaux faisant double emploi avec des offres gratuites privées ou publiques existantes garantissant un niveau de qualité similaire dans le même espace public ne peuvent pas bénéficier d’un financement.\nComment demander un coupon WiFi4EU ?\nPhase d’enregistrement : les communes doivent s’inscrire sur le portail WiFi4EU ;\nPhase de candidature : le premier appel sera lancé à la mi-mai 2018, et les communes inscrites pourront alors postuler pour obtenir un des 1 000 coupons WiFi4EU à attribuer à travers le premier appel à projets. Les coupons seront distribués selon le principe du « premier arrivé, premier servi » mais avec la volonté d’une réparation géographique équilibrée sur l’ensemble de l’UE ;\nPhase d’attribution : La Commission annoncera, en veillant à l’équilibre géographique, les 1 000 communes qui bénéficieront d’un financement au titre du premier appel.\nQuatre autres appels à projets seront lancés au cours des deux prochaines années. A l’issue des cinq appels à projets, 640 coupons maximum pourront être distribués en France.\nQuestions et réponses de la Commission\nLe dossier du CGET


Marché public de communication : 6 compétitions lancées - CB News\nConseilMarché public de communication : 6 compétitions lancées\nMarché public de communication : 6 compétitions lancées\nLe 06 janvier 2020 à 02:17\nPendant les fêtes de fin d’année, l’AMF, la Caisse des Dépôts, la Monnaie de Paris, le Musée du Louvre Lens, le Musée Picasso ainsi que l’Agence de la biomédecine ont publié une série d'appels d'offres au JO européen.\n- L’Agence de la biomédecine met en compétition la définition de la stratégie, du plan d'actions et de mise en œuvre de la communication sur le don de gamètes (spermatozoïdes et ovocytes) dans le cadre d'une assistance médicale à la procréation, auprès du grand public et des professionnels de santé. Le marché inclut plus particulièrement la mise en place de campagnes nationales de recrutement de donneurs, et toutes autres actions de communication d'opportunité en fonction de l'actualité. D’une durée d’un an reconductible trois fois un an, le marché a un budget minimal alloué à la campagne de 800 000 € TTC par an, alors qu’un budget complémentaire annuel pourrait être affecté, oscillant entre 1 et 2 millions €. La date limite de réception des offres est fixée au 27 janvier.\n- L’Autorité des marchés financiers (AMF) met en consultation la gestion de son budget d’accompagnement en communication interne, sociale et marque employeur. D’une durée d’un an reconductible trois fois un an, le contrat d’un montant estimé à 355 000 € HT a pour date limite de réception des offres le 31 janvier.\n- Le Musée du Louvre Lens est à la recherche d’une agence pour le conseil et la création de ses campagnes e-marketing. Scindé en 2 lots (SEA - Search engine advertisement + SMO - Social media optimization), le marché de 4 ans est d’un montant global de 270 000 € HT. La date limite de réception des offres est fixée au 31 janvier.\n- La Monnaie de Paris publie un appel d’offres pour des prestations d’agence de concept créatif produit et packaging. L’annonceur souhaite ainsi « challenger son offre Produits auprès du grand public et spécialistes afin d’accroître sa notoriété de marque et stimuler ses ventes », selon les termes de l’avis paru au JO européen. A charge pour l’agence de proposer une réflexion stratégique sur les besoins en matière de thématique et de supports d’expression de la marque et « d'apporter à la marque Monnaie de Paris ses recommandations créatives sur les packagings », poursuit-il. Le contrat qui devrait débuter en mars prochain et s’achever en décembre 2023, est estimé à 480 000 € HT. La date limite de réception des offres est fixée au 31 janvier.\n- La Caisse des Dépôts lance une compétition pour la réalisation du magazine groupe. Le contrat comprend la maquette, la rédaction ponctuelle d'articles, le secrétariat de rédaction, la correction-révision ainsi que le BAT… D’une durée d’un an reconductible trois fois, le marché de ce bimestriel est estimé à quelque 360 000 € HT. La date limite de réception des offres est quant à elle fixée au 20 janvier.\n- Le Musée Picasso, à Paris, est à la recherche d’une agence RP pour la promotion de ses événements. D’un montant estimé à 80 000 € HT, le contrat d’un an renouvelable trois fois un an a pour date limite de réception des offres le 13 janvier 2020.


Verrières (10390) | Entreprise anti-fourmis • Prix\nPour entrer en contact avec notre entreprise anti-fourmis à Verrières\nÀ Verrières a quels dangers les fourmis vous exposent-elles ?\nSi vous connaissez les dangers des termites ou lyctus pour votre demeure, alors considérez qu'il en est de même pour les fourmis, parce qu'il y a une espèce de fourmis tout aussi nuisible pour la charpente de votre maison à Verrières.\nÀ Verrières, les fourmis charpentière s'avèrent être une espèce de fourmis particulièrement dangereuses, parce qu'elles ne s'attaquent pas à vous-même, mais plutôt à votre demeure.\nÀ Verrières les qualités de nos spécialistes de la désinsectisation\nChez nous, les prix s'avèrent être étudiés avec soin, étant donné que nous savons à quel point il est primordial pour vous de payer le tarif juste pour un service, et rien de plus à Verrières.\nQuels s'avèrent être les avantages d'une prestation professionnelle contre les fourmis à Verrières ?\nPourquoi devez-vous confier l'élimination de vos insectes à nos experts ? Tout tout bonnement pour bénéficier de tous les avantages qu'ils ont à vous procurer à Verrières.\nÀ Verrières, une fois dans votre demeure, ou dans les locaux de votre société, nos pros se chargeront de chercher toutes les cachettes possibles des fourmis.\nÀ Verrières, nous mettrons nos qualités à l'œuvre, dans l'optique de définir la dangerosité de l'incursion de fourmis dans votre demeure ou bien dans votre compagnie.


Gamelles doubles Poisson pour chat blanc | La Compagnie des Animaux\nPourquoi choisir Fish Bowl ?\nFish Bowl est un plateau hygiénique, pratique et esthétique pour les repas de votre chat avec deux gamelles en inox amovibles.\nVotre boule de poil pourra ainsi passer de l'eau à la nourriture en un mouvement de tête. En effet très pratique, cette gamelle au design alléchant peut contenir l'eau et la nourriture de votre chat dans deux bols en inox posées sur le plateau, ce qui limitera la possibilité de les renverser.\nLes bols en acier inoxydablessont robustes, très résistants, décoratifs, faciles à nettoyer et parfaitement sans danger pour les chats.\nIls ne rouillent pas et sont bien plus résistants que les autres bols.\nLe plateau en plastique dotée d'une forme fantaisiste de poisson, accueuille les deux bols pour éviter que votre chat les renverse ou disperse la nourriture.\nQuelles sont les caractéristiques de Fish Bowl ?\nSupport de gamelles pour chat au design original\nPlateau en plastique équipé de patins anti-dérapants\n2 bols de 400 ml inclus\nDisponible en 3 couleurs : Blanc, Noir, Rouge\n1 plateau blanc avec 2 gamelles en inox\nReference : AL8253947\nReference : Ora330\nReference : PL1830230\nReference : LKCCC18x1\nLily's Kitchen Noel Boite dinde et jambon pour chat sans céréales 85 g


▷ Avis poste radio bigben ▷ Un Comparatif / Des Tests【 Meilleur produit 2019 】\nZetteandthecity.fr » Top 171 » ▷ Poste radio bigben ▷ Comparatif / Test / Avis du meilleur choix consommateur\n▷ Poste radio bigben ▷ Comparatif / Test / Avis du meilleur choix consommateur\nPoste radio bigben 4 promotions de la semaine\nMeilleurs Poste radio bigben 15 ventes de l’année\nBigBen - LECTEUR CD RADIO PORTABLE MOTIF CHIEN\nPoste radio bigben 4 des plus grosses ventes de la semaine\nBigBen CD47 AU303261 Lecteur CD avec 2 Microphones...\nBigBen Interactive CD46 Radio/Radio-réveil...\nComment choisir votre poste radio bigben ? Vous vous posez des questions, et vous hésitez entre plusieurs modèles ? Nous avons ici quelques astuces à vous donner, et qui pourront réellement vous aider.\nNotre site de vente poste radio bigben est définitivement celui sur lequel vous devez passer commande. Pourquoi ? Nous avons un comparatif poste radio bigben, qui vous permettront de faire un classement poste radio bigben des meilleurs produits. Mais attendez, ce n’est pas tout. En effet, nous allons vous proposer de découvrir notre avis poste radio bigben, ainsi que notre test poste radio bigben. Rien de tel, pour bien choisir. Avec un comparateur poste radio bigben, ainsi qu’une comparaison poste radio bigben, vous allez forcément dénicher l’appareil qui vous convient.\nMais alors, il faut dès à présent parler du tarif poste radio bigben. Vous recherchez forcément le meilleur prix poste radio bigben, et c’est normal. Aujourd’hui, tout le monde souhaitez pouvoir réaliser des économies. De ce fait, nous vous conseillons vivement de faire un poste radio bigben sur notre plateforme. Pourquoi poste radio bigben chez nous ?\nTout simplement parce que nous allons vous proposer le meilleur prix poste radio bigben. Le tarif poste radio bigben est très avantageux, notamment lorsque vous allez tomber sur une promotion poste radio bigben. N’attendez plus, pour réellement vous faire plaisir !\nVous allez forcément être satisfait de votre achat. Tarif, comparatif, test et avis et commentaire poste radio bigben des utilisateurs, c’est l’occasion pour vous d’investir dans un produit qui vous convient vraiment.


Jeux Wifi : Zelda,castlevania,MPH,Animal crossing,jump ultimate star,MKDS,ect...\nSujet: Tales of symphonia Sam 29 Mar - 23:53\nUn bon jeux jeux de rôles sur game cube\nLa version GameCube s'est vendue à plus de 1,2 millions de copies à travers le monde.\nUne autre version sera prévu sur le wii\nSujet: Re: Tales of symphonia Dim 30 Mar - 0:02\nC'était moi qui devait faire ce topic.\nJe déconne.Ce jeu est pour le must en A-RPG rien n'a lui reprocher si ce n'est qu'il est trop bien.\nSujet: Re: Tales of symphonia Dim 30 Mar - 0:03\nje ne connait pas trop, je devrai me renseigner sur ce jeu\nSujet: Re: Tales of symphonia Dim 30 Mar - 2:07\nJe ne pense pas que ce soit seulement un "bon jeu" (sans "x" à "jeu" ^^), mais plutôt l'un des meilleurs RPG de la console.\nSujet: Re: Tales of symphonia Dim 30 Mar - 12:50\nJe vous le conseille c'est l'un des meilleurs jeux vidéo faisant partit de la game cube ( c'est juste que le début et un peu chiant comme aux début on a pas beaucoup de technique de combat et faut les gagner)\nSujet: Re: Tales of symphonia Dim 30 Mar - 19:22\nkriskris a écrit:\nFaut dire qu'entre tales of et baten kaitos, question RPG on avait pas grand choix sur GC\nSujet: Re: Tales of symphonia Mar 22 Avr - 12:12\nJ'ai enfin testé le jeu hier et faut bien avouer que le début est bien chiant et que l'histoire n'a pas l'air très passionnante. Après, le système de combat est sympa mais finalement je préfère les bons vieux combats au tour par tour.\nCertains d'entre vous ont Baten Kaitos pour comparer?\nSujet: Re: Tales of symphonia Mar 22 Avr - 12:21\nOui et je peut te dire que tales of symphonia remporte la palme car Baten kaitos en denhors des combats est catastrophique.Le jeu a des graphismes superbes mais aucune animation ou quasiment.Quant au combat ce n'est pas vraiment génial.En bref je préfère de loin tales of symphonia qui a des combats pulsifs et en dehors des combats le jeu reste quand même bien et on voit ce qu'on fait.....(ce qui n'est pas le cas de Baten Kaitos)


Environnement & propreté - Ville de Bruxelles Ce site web porte le label AnySurfer, une marque de qualité belge pour les sites accessibles. Vous trouverez plus d'information sur www.anysurfer.be. 16°C FR NL EN Sauter directement au texte Plan du siteDe A à Z Chercher par mots-clés\nBruxelles prend des initiatives pour permettre à ses habitants de vivre dans une ville à la fois plus propre et plus verte, tout en étant respectueuse de l'environnement.\nUne ville-capitale comme Bruxelles doit offrir un cadre agréable à ses habitants, aux travailleurs qui, quotidiennement, s'y rendent, aux touristes... Cette préoccupation passe par des mesures prises tant dans le domaine de la propreté que dans la préservation des espaces verts tout en veillant et en respectant l'environnement.environnementnature et espaces verts propreté Tweet\n12 balades dans les espaces verts bruxellois La Cellule Eco-conseil de la Ville de Bruxelles programme 12 balades dans les parcs et les espaces verts du territoire communal. Lire la suite\nAnnée de Flore De mars 2014 à mars 2015 dans différents lieux à Bruxelles. Lire la suite\nJournée portes ouvertes des serres de la Ville de Bruxelles à Sterrebeek Le samedi 17 mai 2014, de 10h à 17h, dans les serres et pépinières de la Ville de Bruxelles à Sterrebeek. Lire la suite\nBalade guidée. Le Bois de la Cambre Le dimanche 14 septembre 2014 à 10h. Rendez-vous aux pavillons d'octroi, au bout de l'avenue Louise. Lire la suite\nMardis de l’Environnement. Conférence sur les cosmétiques naturels Le 16 septembre 2014, à 18h, salle salle de la Milice - Hôtel de Ville. Accès gratuit. Lire la suite\nBalade guidée. Parc du Cinquantenaire Le dimanche 5 octobre 2014, à 10h. Rendez-vous avenue de la Joyeuse Entrée (côté Schuman). Lire la suite\nBalade guidée. Parc Sobieski et Jardins du fleuriste Le samedi 11 octobre 2014, à 10h. Rendez-vous devant l'entrée principale du parc Sobieski (Laeken). Lire la suite


Bonjour, je viens de recevoir un Blackberry Q10 et je n'arrive pas à recevoir ni envoyer de photo par MMS. - Avec Réponse(s)\nQuestion: « Bonjour, je viens de recevoir un Blackberry Q10 et je n'arrive pas à recevoir ni envoyer de photo par MMS. »\nBonjour, je viens de recevoir un Blackberry Q10 et je n'arrive pas à recevoir ni envoyer de photo par MMS.\nAvec mon ancien téléphone, je n'avais pas de soucis pour envoyer ni recevoir de MMS. Depuis que j'ai mit ma carte SIM dans mon Blackberry Q10, impossible d'envoyer ou recevoir de MMS. Y aurait-il un réglage particulier à réaliser ?\nJe suis navrée, mais comme indiqué dans le guide tarifaire de votre offre le forfait Le Complet n'est pas compatible avec les téléphones sous système Blackberry.\nComment pouvoir recevoir et envoyer MMS avec Blackberry Q10 et avoir internet?\nBonjour, je viens de recevoir un BlackBerry Q10. Depuis l'installation de ma carte SIM, je ne peux pas envoyer ni recevoir de MMS, ni aller sur internet sauf en WIFI. Y a t'il...\nBonjour Franck, Votre BBY est sur OS10, nous avons donc modifié les options de votre ligne afin que vous puissiez utiliser pleinement ce dernier. Merci de modifier l'APN...\nJe n'arrive pas envoyer et recevoir les photos et multimédia dans les SMS et mms ?\nDepuis l'achat de ce mobile Huawei y10 l'envoi et la réception de photos dans les SMS et mms est impossible\nBonjour Sylvie, Pouvez-vous vérifier si les APN (Noms des Points d'Accès) Internet et MMS de votre Huawei sont bien renseignés comme suit : -APN INTERNET- Nom : SFR...\nBonjour, je suis passé au forfait essentiel au 01.03.2018 et depuis je ne peux plus ni recevoir ni envoyé de MMS J'ai un blackberry Q10 sqn100-3 J'ai bien activé le service...\nBonjour Patrick, Je suis navrée, mais comme il est précisé dans le guide tarifaire de votre offre les nouveaux forfaits L'Essentiel et Le Complet ne sont pas compatibles avec...


Auteur : twiki\nPublié le avril 28, 2018 avril 28, 2018\nHyderabad est une grande ville en Inde dans l’état d’Andhra Pradesh. Elle est aussi une des plus peuplées de l’Inde avec 8 millions d’habitants. La ville est en constant mouvement. Elle a plus de 3 millions de véhicules et plus de 8 millions de déplacements sont réalisés par jour.\nDans ce type de megacités, un système de transport efficace pour alléger la circulation et la pollution est d’une première nécessité.\nLa solution à Hyderabad survient avec Mass Rapid Transit Système (MRTS) et la construction du nouveau métro. Hyderabad Metro Rail Project est le plus grand projet d’association d’entreprises publiques et privées dans le secteur du métro dans le monde. Une fois que ce projet sera terminé, Hyderabad sera l’une des villes les plus modernes de l’Inde.\nLe Hyderabad Metro Rail sera intégré aux stations existantes de chemin de fer, aux réseaux de trains de banlieue (MMTS) et aux stations d’autobus. Il se ralliera aux services de MMTS à Bharatnagar, Begumpet, Malakpet et Falaknuma et aux gares à Secunderabad, Nampally et Begumpet. Le Metro Rail se reliera aussi avec quelques stations d’autobus telles que Miyapur, MGBS, Koti, Dilshuknagar, Charminar et Jubilee. Enfin, des stationnement seront construits à des endroits stratégiques. Depuis septembre 2012, la phase 2 pour ce projet a été approuvée et ajoutera 80 kilomètres de parcours au système.\nCe système de métro a été conçu pour qu’il consomme peu d’énergie et prenne en compte l’environnement en réduisant les émissions de carbone et la contamination.\nLongueur du réseau: 72kms\nVitesse moyenne: 34kms/h\nVitesse maximale: 80kms/h\nHyderabad Metro Rail: lignes et stations\nLa phase 1 du projet a été approuvée pour construire 72 kilomètres à travers les 3 corridors routiers avec la plus grande densité de circulation de la ville. Un total de 66 stations sont prévues. Ces routes seront élevées sur des bornes en béton et relieront la ville avec des stations séparées par moins de 1 km de distance. Le Métro de Hyderabad est actuellement en construction et son ouverture est prevue en 2015.\nRoute I: 27 stations sur une distance de 29 kilomètres. De Miyapur à LB Nagar en 45 minutes (1h 44 min par la route).\nStations: Miyapur, JNTU College, KPHB Colony, Kukatpally, Balanagar, Moosapet, Bharat Nagar, Erragadda, ESI Hospital,\nS R Nagar, Ameerpet, Punjagutta, Irrum Manzil, Khairatabad, Lakdikapul, Assembly, Nampally, Gandhi Bhavan,\nOsmania Medical College, MG Bus station, Malakpet, New Market,\tMusarambagh,,Dilsukhnagar, Chaitanyapuri,\nVictoria Memorial, L B Nagar.\nRoute II: 16 stations sur une distance de 15 kilomètres. De JBS à Falaknuma en 22 minutes. (1h 10 min par la route).\nStations: JBS, Parade Grounds, Secunderabad, Gandhi Hospital, Musheerabad, RTC Cross Roads, Chikkadpally, Narayanguda,\nSultan Bazar, M G Bus Station, Salarjung Museum, Charminar, Shalibanda, Shamsher, Gunj, Jungametta, Falaknuma.\nRoute III: 23 stations sur une distance de 28 kilomètres. De Nagole à Shilparamam en 39 minutes. (1h 26 min par la route).\nStations: Nagole, Uppal, Survey of India, NGRI, Habsiguda, Tarnaka, Mettuguda, Secunderabad, Parade Grounds, Paradise,\nRasool Pura, Prakash Nagar, Begumpet, Ameerpet, Madhura Nagar, Yusuf Guda, Road No 5 Jubilee Hills, Jubilee Hills Check Post,\nPedamma Temple, Madhapur, Durgam Chervu, HITEC City, Shilparamam.\nIl y a 3 stations de transfert prévues pour relier ces 3 routes. Station Ameerpet pour les routes I et III. Station MGBS pour les routes I et II et la Station Parade Grounds entre les routes II et III\nLa fréquence estimée serait de 3 à 5 minutes aux heures de pointe.\nLe Système de Transport Multimodal (MMTS) est un système de trains légers qui opère sur 3 lignes suburbaines et 27 stations sur 43 kilomètres de voies. Il est utilisé par plus de 150 000 passagers tous les jours. Il est entré en fonction le 9 août 2003. Il relie Secunderabad, Nampally, Dabirpura, Malakpet, Falaknuma, Madhapur et Lingampally.\nLignes, stations et routes du MMTS\nRoute Lingampally à Falaknuma.\nLingampally, Chandanagar, Hafeezpet, Hitech City, Borabanda, Bharatnagar, Fatehnagar, NatureCureHospital, Begumpet,\nSanjeevaiahPark, JamesStreet, Secunderabad, Sitafalmandi, Arts College, Jamai Osmania, Vidyanagar, Kacheguda,\nMalakpet, Dabirpura, Yakutpura, Huppuguda, Falaknuma.\nRoute Hyderabad à Lingampalli.\nHyderabad, Lakdikapul, Khairatabad, Necklace Road, Begumpet, NatureCureHospital, Fatehnagar, Bharatnagar,\nBorabanda, Hitech City, Hafeezpet, Chandanagar, Lingampalli\nRoute Hyderabad à Falaknuma.\nHyderabad, Lakdikapul, Khairatabad, Necklace Road, SanjeevaiahPark, James Street, Secunderabad,\nSitafalmandi, Arts College, Jamai Osmania, Vidyanagar, Kacheguda, Malakpet, Dabirpura, Yakutpura,\nCarte de MMTS\n0-10kms coûte\t5INR\n10-15kms coûte 6INR\n15-20kms coûte 7INR\n20-25kms coûte 10INR\n25-30kms coûte 10INR\n30-35kms coûte 10INR\n35-40kms coûte 11INR\nIl existe également un tarif Première Classe qui coûte environ 12 fois plus cher que le tarif général d’un billet simple détaillé ci-haut.\nLe Global Infrastructure Leadership Forum a considéré en 2013 que le Hyderabad Metro Projet était le plus grand projet mondial gèré par un partenariat entre des organismes publics et privés.\nSe rendre à l´aéroport\nDe l´Aéroport International Rajiv Gandhi(RGAI) à Hyderabad: Vous pouvez y aller avec des services de taxi dans le Pushpak Airport Liner et en autobus économiques sans climatisation. Il y a aussi un service Express, le PV Narasimha Rao Expressway. La distance est d’environ 40 kilomètres.\nMétro d’Istanbul a ouvert ses portes le 16 Septembre 2000.\nIl dispose de 2 lignes, 30 stations et une longueur totale de 36,1 Kms (M1 et M2 confondus).\nSystème de transport urbain d’Istanbul est également complétée par une ligne de prémétro\n(Hafif Metro), un train de banlieue, un système de tram, un réseau urbain de bus et un\nfuniculaire. Système de métro a plus de 50 millions d’utilisateurs par an\nLigne M1 (Aksaray-Havalimani).\nIl s’agit d’un train léger. Il dispose de 18 stations et une longueur totale de 19,6 km. La vitesse moyenne est 36,7 Km / h. Temps de trajet est de 32 minutes. Fréquence aux heures de pointe est de 5 minutes. M1 fait environ 416 voyages par jour.\nPlus importantes stations M1: Havalimani (à l’aéroport Atatürk terminal), Zeytinburnu (connecté avec Tram T1) et Aksaray. Taksim poste se connecte avec tran dans le tunnel et souterrains. Stations de Yenikapi interconnexions de trains légers et les banlieues.\nLigne M2 (Taksim-4.Levent). Il est de 16,5 kms de long et dispose de 12 stations. Au début, il peine recouvert de Taksin à 4.Levent. Maintenant, la ligne s’est développé et couvre de Sishane à Haciosman. Temps de trajet est de 27 minutes et la vitesse moyenne est de 36,7 Km / h. Fréquence aux heures de pointe est de 4 minutes.It fait 394 voyages par jour.\nStations: Hacıosman, Darüşşafaka, Atatürk Oto Sanayi, l’UIT – Ayazağa, Seyrantepe – Stadyum, Sanayi Mahallesi, 4. Levent, Levent, Gayrettepe, Sisli – Mecidiyeköy, Osmanbey, Taksim, Şişhane.\nGolden Horn métro pont, Unkapani, Sehzadebasi, Yenikapı\nM4 (en construction). 19 stations sont prévues à partir de Kadiköy à Kaynarca.\nStations: Kadikoy, İbrahimağa, Acibadem, Ünalan, Göztepe, Yenisahra, Kozyatagi, Bostanci, Küçükyalı, Altayçeşme, Maltepe, Gülsuyu, Cevizli, Hastane, Soğanlık, Kartal, Yakacik, Pendik, Kaynarca.\nMétro d’Istanbul horaire est de 6:00 à 24:00. Selon ce que la ligne et l’heure de la journée, la fréquence est de 4-5 minutes aux heures de pointe à 5-15 minutos à des heures normales.\nPrix est de 1 Jeton. 1 Jeton coûte 1,75 TL (0,70 euros). Jeton est une languette en plastique valable pour un seul trajet.\nIl en coûte 10TL (environ 5 euros) sans rides. Comme Jeton, carte Istanbulkart est valable pour les bus, métro, tramway, bateau et funiculaire. Avec cette carte, les attractions sont un peu moins cher, mais vous aurez à payer pour la carte elle-même.\nLe métro de Dortmund\nPlus connu sous le nom de Stadtbahn, le métro de la ville de Dortmund détient un système de métro intégré (le train métropolitain de transit rapide – Stadtbahn) complété par la ligne de trams, et de trains, le S-Bahn et le métro souterrain d’U-Bahn. Au total, le réseau comprend 8 lignes pour 83 stations (37 stations et 3 lignes souterraines).\nA l’origine, les plans pour la construction du Rhein-Ruhr Stadtbahn, ont été dessiné pendant les années 70′, et prévoyait 3 routes pour aller vers la ville de Dortmund, qui depuis ont été construites. Elle fut inaugurée le 17 mai 1976, avec un trajet s’étendant sur 4,1 km, partant de la station Kirchderne et allant jusqu’à Grevel. La première ligne va du nord-est au sud-est, et la seconde, va du nord-est au sud-ouest. L’ensemble de ces lignes sont connectées directement à la station de Westfalenhallen, où les trains de la ligne U46 continuent, comme la U45 qui va jusqu’au Hauptbahnhof mais dans le sens contraire. La troisième ligne, mise en service depuis 2008, proyectada dans un tunnel, qui va d’est en ouest, pero el servicio es prestado por tranvías de piso bajo.\nLes lignes de Stadtbahn et de Dortmund\nActuellement, il y a 8 lignes pour un total de 83 stations.\nLa ligne U41: elle part de la station Clarenberg et va jusqu’à la station Brambauer.\nLa ligne U42: elle part de la station Grevel va jusqu’à la station Grotenbachstraße.\nLa ligne U43: elle part de la station Dorstfeld et va jusqu’à la station Wickede Bf\nLa ligne U44: elle part de la station Marten et va jusqu’à la station Westfalenhütte.\nLa ligne U45: elle part de la station Westfalenhallen et va jusqu’à la station Hauptbahnhof\nLa ligne U46: elle part de la station Westfalenhallen et va jusqu’à la station Brunnenstraße\nLa ligne U47: elle part de la station Westerfilde et va jusqu’à la station Aplerbeck\nLa ligne U48: elle part de la station Hacheney et va jusqu’à la station Hauptbahnhof\nLe métro commence à circuler entre 3 h 30 et 4 h 30 du matin et jusqu’à 00 h 45.\nLa fréquence de passage du métro pendant la journée, est de 10 minutes, et pendant la nuit de 15 à 20 minutes.\nNote: La fréquence de passage pour la ligne U42 est de 20 minutes.\nDortmund forme une partie du système tarifaire VRR (Verkehrsverbund Rhein-Ruhr), en plus d’inclure des villes comme Düsseldorf, Essen ou Bochum. Les prix dépendent du numéro des zones que vous empruntez, la zone A correspond à la ville de Dortmund. Quelques prix:\nLe billet simple de métro: 1,75 €\nL’abonnement de 4 voyages: 5,60 €\nL’abonnement pour un jour: 6,35 €\nL’abonnement hebdomadaire: 14,70 €\nL’abonnement mensuel: il se nomme Ticket 1000, c’est un abonnement transférable mais valide pour 2 adultes, et un maximum de 3 enfants, qui leur permet de voyager la nuit ou les week-ends. Ce ticket est plus économique, que si vous utilisez le métro après 9 h du matin, et en dehors de l’heure de pointe, son prix est de 44,70 € et de 32,25 € pour le reste de la journée après 9 h du matin.\nL’abonnement annuel transférable: il s’appelle le Ticket 2000, cet abonnement à comme avantage, qu’il est transférable et permet également d’emmener son vélo. Vous donnant droit aux mêmes avantages, le Ticket 1000, est destiné aux familles. Son prix est de 49,30 € et de 35,40 €, vous ne pouvez l’utiliser qu’en dehors de l’heure de pointe.\nL’aéroport de Dortmund se situe à seulement 13 km du centre de la ville. Le bus express passe toutes les heures, et va jusqu’à la Zentraler Omnibus Bahnhof qui se situe en face de la station centrale de Dortmund. Le trajet dure 25 minutes et reste le moyen de transport le plus rapide pour parvenir jusqu’à l’aéroport. Le premier bus express de Dortmund, pour se rendre à l’aéroport part à 4 h 30 du matin et le dernier passe vers 22 h. Vous pouvez également emprunter le train via la ligne de Dortmund. La durée du trajet est approximativement de 45 minutes.\nEnfant de 6 à 14 ans: 2 €\nLe Métro de Turin est un système de transport en commun qui relie la ville de Turin, en Italie, avec la ville voisine de Collegno.\nLe système est opéré par le Groupe de Transport Turinois et transporte environ 22 millions de passagers par an (statistiques datant de 2010). La caractéristique la plus remarquable est que ce métro opère avec un système breveté par Siemens dénommé VAL 208, qui est utilisé dans très peu de villes. Les sigles VAL signifient « Véhicule Automatisé Léger », un système de métro sur pneus complètement automatique. Tous les éléments du système VAL (trains, voies, systèmes de sécurité, quais d’embarquement) ont été conçus exclusivement pour ce système, il n’est donc pas compatible avec d’autres types de métro, ni avec les métros avec conducteur.\nL´unique ligne existante jusqu´à ce jour a été inaugurée en 2006, juste à temps pour les Jeux Olympiques de Turin.\nLignes du Métro de Turin\nLe réseau de Métro de Turin se compose d’une seule ligne, ligne 1, fonctionnelle depuis 2006, d’une longueur de 13,2 kilomètres et comptant 21 stations.\nCette ligne s´étend de la station Fermi (Collegno) jusqu´à la station de Lingotto, en passant par le centre de la ville à travers les stations de Porta Nuova et de Porta Susa.\nLes stations sont les suivantes : Fermi, Paradiso, Marche, Massaua, Pozzo Strada, Monte Grappa, Rivoli, Racconigi, Bernini, Principi d’Acaja, XVIII Diciembre, Porta Susa FS, Vinzaglio, Re Umberto, Porta Nuova FS, Marconi, Nizza, Dante, Carducci-Molinette, Spezia, Lingotto Deux autres stations sont en cours de construction pour 2013 : les stations de Italia 61 et de Bengassi.\nEn 2009, la construction de la ligne 2 a été approuvée et celle-ci devrait être fonctionnelle en 2020-2022.\nPour faire le parcours complet de la ligne depuis le commencement jusqu´à la fin, il faut seulement 23 minutes, avec une moyenne de 60 secondes entre chaque station.\nLe métro est ouvert du lundi au vendredi de 05h30 jusqu´à 23h50, le samedi de 05h30 jusqu´à 01h30 et le dimanche de 07h jusqu´à 23h50.\nToutes les 2 minutes.\nLe prix du billet est le même pour tout le territoire du réseau urbain exploité par GTT.\nBillet aller simple urbain: 1 €, valable pour une durée de 70 minutes à partir de sa validation à travers tout le réseau urbain de bus, de tramways et de métro.\nCarte de 15 billets urbains : les cartes de 15 billets sont disponibles pour 13,50€.\nBillet Simple Suburbain: 1,30 € valable pendant 90 minutes à partir de sa validation dans tout le réseau de bus, tramways et métro de l´aire suburbaine.\nBillet aller simple urbain + suburbain : 1,70 €, valable pour une durée de 90 minutes à partir de sa validation à travers tout le réseau de bus, de tramways et de métro dans les zones urbaine et suburbaine.\nBillet de 5 voyages aller simples urbains + suburbains : 6,50 €\nBillet de 1 jour : billet valable pour une durée de 1 jour à l´intérieur des zones urbaine et suburbaine de transport de la GTT. Il coûte 5 €. Non transférable.\nBillet de 2 jours: billet valable pour une durée de 2 jours à l´intérieur des zones urbaine et suburbaine de transport de la GTT. Il coûte 7,50 €. Non transferable.\nBillet de 3 jours: billet valable pour une durée de 3 jours à l´intérieur des zones urbaine et suburbaine de transport de la GTT. Il coûte 10,00 €. Non transferable.\nBillet Shopping: c´est un billet valable pour une durée de 4 heures qui permet de se déplacer à l´intérieur de la zone urbaine de 09 h jusqu´à 20 h. Il coûte 3 €.\nL’Aéroport International Sandro Pertini de Turin est situé à 16 kilomètres au nord du centre-ville.\nLa gare est à seulement quelques mètres de l’aéroport et elle est accessible depuis les Départs à travers une passerelle couverte d’une longueur de 150 mètres.\nLes trains circulent entre 05 h et 21 h 45 en direction de la station Dora GTT de Turin. Il y a des trains entre l’Aéroport et la station GTT Dora de Turin toutes les 30 minutes entre 06 h 49 et 21 h 19. Le service inverse, depuis la station Dora GTT vers l´Aéroport a également une fréquence de passage de 30 minutes et est en fonction entre 05 h 03 et 19 h 43. La durée du voyage est de 19 minutes et un billet aller simple, billet « Trenibus » coûte 3,70 €, et permet d’utiliser non seulement le métro jusqu´à Dora GTT, mais aussi le transport en commun urbain de la GTT pour une durée de 70 minutes.\nIl y a aussi un service de navette de la compagnie SADEM qui circule toutes les 30-45 minutes. Le service circule de l’aéroport à la ville entre 05 h et 23 h et de la ville jusqu´à l’aéroport entre 06 h et 24 h Le trajet dure environs 40 minutes jusqu´à Turin, avec quelques arrêts. Le billet coûte 6,50 €, 7,00 € s’il est acheté à bord.\nPublié le avril 7, 2018 avril 7, 2018\nLe Premetro d’Anvers\nAnvers (Anttwerp ou Amberes) et la capitale de la province d’Anvers en Flandres, l’une des destinations majeures de la Belgique. Bien qu’Anvers soit une petite ville, c’est aussi l’une des villes les plus peuplées de Belgique, signifiant que la question des transports en commun se pose tout à fait naturellement. Par ailleurs, vous pourriez aussi visiter les sites touristiques les plus importants à pieds, en effet, une grande partie de la vieille ville est une zone piétonne.\nLes transports en commun de la ville d’Anvers sont gérés par De Lijn. A Anvers, nous avons un réseau de bus, un réseau de tram et le Premetro. Le Premetro est juste une partie souterraine du réseau de tramway d’Anvers. Exactement 6 des 12 lignes du réseau entier fonctionnent sous terre.\nLes lignes Premetro circulent sous terre dans tout le centre-ville le long de la rue principale, Diamant sous la station centrale, jusqu’à ce qu’elles arrivent à Groenplaats. Depuis Gorenplaats, les lignes continuent sous la rivière la Scheldt jusqu’à rejoindre la surface sur Linkeroever.\nConnu sous le nom de : Premetro\nLignes : 6 (lignes 2,3,5,6,9 et 15 du réseau de tramway)\nLongueur : 7,6 km (4,7 miles)\nSite officiel http://www.delijn.be/\nOuverture : Mars 1975\nLignes et stations Premetro\nComme nous l’avons noté ci-dessus, le metro d’Anvers, aussi connu sous le nom de Premetro, n’est pas un vrai metro mais une partie du réseau tramway de la ville d’Anvers. Il existe depuis le 25 mars 1975. Il est composé en partie de ces 6 lignes (lignes 2,3,5,6,9 et 15) et a 11 stations.\nAstrid, Diamant, Elisabeth, Frederik van Eeden, Groenplaats, Handel, Meir, Opera, Plantin, Schijnpoort, Sport. Il y a également 8 stations supplémentaires qui ne sont pas utilisées à l’heure actuelle : Carnot, Drink, Zegel, Collegelaan, Morckhoven, Foorplein, Sint-Willibrordus, Stuivenberg.\nRéseau Tram de la ville d’Anvers\nLa totalité du réseau de tram d’Anvers est constitué de 12 lignes, 6 d’entre elles sont souterraines.\nLa ligne 2 ou ligne verte : va de Merksem (Keizershoek P&R) jusqu’à Hoboken\nLigne 3 ou ligne jaune : va de Zwijndrecht (Melsele Krijgsbaan) à Merksem (Keizershoek P&R)\nLigne 4 ou ligne bleue clair :va de Hoboken (Kioksplaats) à Silsburg\nLigne 5 ou burgundy : va de Wijnegem à Linkerover (P&R).\nLigne 6 ou rose : Va de Metropolis à Olympiade\nLigne 7 ou bleue : va de Sint Pietersvliet à Mortsel (Gemeenteplein)\nLigne 9 ou orange : va de Linkerover (P&R) à Deurne (Ekserlaar)\nLigne 10 ou verte : va de Melkmarkt à Wijnegem\nLigne 11 ou blanche et rouge : va de Melkmarkt à Berchem Station\nLigne 12 ou rouge : va de Sportpaleis à Zuid ou Groenplaats\nLigne 15 ou blanche et verte : va de Linkerover (P&R) à Boechout (P+R Capenberg)\nLigne 24 ou rose pastel : va de Hoboken (Schoonselhof) à Deurne (Silsburg)\nLes transports en commun sont habituellement en service de 6h du matin à minuit. La fréquence est d’environ 4-6min en heure de pointe et de 15min pour le reste de la journée. Il y a aussi un bus de nuit (nachtlijn) qui circule le weekend.\nLes mêmes tickets peuvent être utilisés pour les bus, les trams et le Premetro.\n60 minutes coûtent 1,3€/2€\nUn ticket SMS de 60 minutes coûte 1,55€ (SMS DL 4884)\nUn ticket SMS de 120 minutes coûte 2,35€ (SMS DL120 4884)\nTicket journée (appelé dagpas)\nUn ticket à la journée coûte 5€/7€\nUn carnet de 10 tickets 60 minutes coûte 10€ (lijnkaart)\nPour une meilleure explication des tarifs\nLes bus stad (bus de ville) et les bus streek (bus régionaux) sont au départ de Rooseveltplaats ou de Koningin Astridplein. Vérifiez bien dans quelle direction vous allez car, normalement, les bus et les trams démarre d’un côté de la ville et finissent à l’autre. Donc, il se peut que vous soyez dans le bon bus ou tram mais que vous alliez dans la mauvaise direction.\nL’aéroport international d’Anvers est localisé dans le district de Deurne, à 2km de la ville d’Anvers