In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis | Protocol (Translated to Spanish)\nSe describe un procedimiento para la detección de elementos químicos presentes in situ en células humanas, así como su cuantificación en vitro . El método es adecuado para cualquier tipo de células y es particularmente útil para los análisis químicos cuantitativos en las células siguiendo en vitro exposición de nanopartículas de óxido de metal.\nMicro-analítico técnicas basadas en la proyección de imagen de elementos químicos permiten la localización y cuantificación de la composición química a nivel celular. Ofrecen nuevas posibilidades para la caracterización de los sistemas vivos y son especialmente apropiados para detectar, localizar y cuantificar la presencia de nanopartículas de óxido de metal tanto en muestras biológicas y el medio ambiente. De hecho, estas técnicas todas necesidades relevantes en términos de sensibilidad (i) (de 1 hasta 10 μg.g-1 de masa seca), (ii) micrómetro gama resolución espacial y elemento (iii) detección. Dadas estas características, la proyección de imagen de elemento químico microhaz puede poderosamente complementar rutina técnicas de imagen tales como óptica y microscopía de fluorescencia. Este protocolo describe cómo realizar un análisis de microsonda nuclear en células cultivadas (U2OS) expuestas a las nanopartículas de dióxido de titanio. Las células deben crecer y ser expuestas directamente en un soporte de muestra especialmente diseñada en el microscopio óptico y en las etapas de análisis de microsonda nuclear. Inmersión de congelación criogénica fijación de las muestras conserva la organización celular y la distribución de elementos químicos. Análisis de microsonda nuclear simultánea (microscopía transmisión de iones, espectrometría de retrodispersión de Rutherford y partículas inducidas por emisión de rayos x) en la muestra proporciona información sobre la densidad celular, la distribución local de los elementos químicos, así como el contenido celular de nanopartículas. Hay una necesidad creciente de tales herramientas analíticas en biología, especialmente en el contexto emergente de la Nanotoxicología y la nanomedicina para que nuestra comprensión de las interacciones entre las nanopartículas y las muestras biológicas debe ser profundizado. En particular, como análisis de microsonda nuclear no requieren de nanopartículas que se etiqueten, abundancia de nanopartículas es cuantificable hasta el nivel de células individuales en una población celular, independientemente de su estado superficial.\nHomeostasis celular está determinada por el control de la absorción, asimilación y localización intracelular de diferentes oligoelementos (iones, metales, compuestos inorgánicos exógenos). Estos componentes son frecuentemente en forma de huellas, pero sin embargo pueden tener un impacto considerable en la fisiología del sistema. Así, el estudio de la Bioquímica celular en situaciones normales y patológica, destacó es un paso clave hacia una comprensión global de los mecanismos metabólicos celulares. Por lo tanto, hace necesario el desarrollo de técnicas de proyección de imagen y analíticas que permiten la investigación de abundancias químicas intracelulares, organización estructural y sus funciones metabólicas relacionadas. Muy pocos métodos son capaces de proporcionar una pieza cuantitativa en situ de la información relativa a la naturaleza en general química de una muestra. Aparte de métodos de análisis de muestras en forma masiva, análisis en situ consideran muestras biológicas en su integralidad sin perder información masiva y estructural, conservando así sus constituyentes químicos (iones y elementos traza) y proteínas. Además, como las nanociencias continúan desarrollándose, la proyección de imagen mejorada y métodos analíticos para la vigilancia del medio ambiente a escala celular será necesarios observar y cuantificar las interacciones y los comportamientos de nano-objeto. 1\nNanopartículas (NPs) han sido definidas como objetos de exhibir al menos una dimensión facial en el rango 1 y 100 nm. 2 debido a sus propiedades fisicoquímicas particulares, NPs son ampliamente utilizados en la industria. NPs se emplean en aplicaciones de bio y en nanomedicina. 3 , 4 a pesar de las numerosas características físico-químicas del NPs, que pueden generar riesgos de efectos adversos sobre la salud humana y el medio ambiente. Estos riesgos pueden ser inducidos por la exposición prolongada y repetitiva en varios niveles de concentración y esto no todavía se ha establecido claramente. 5 , 6 , 7 , 8 en particular, el destino de NPs dentro de las células y las respuestas celulares asociadas son, hasta la fecha, no se describe. Esto es en parte debido a la escasez de métodos que permiten la detección y cuantificación de NPs interiorizados en una sola celda. 9\nLas herramientas analíticas clásicas utilizadas para estimar la dosis celular de nanopartículas son Microscopias, espectrometría de masas (MS), acoplado inductivamente a plasma MS (ICP-MS)10,11 y cromatografía líquida de que MS (LC-MS), pero sólo proporcionan información útil en la escala macroscópica. Ninguno de ellos puede proporcionar una evaluación precisa de los contenidos subcelulares de NPs ni la distribución de NPs sin el uso de métodos de fraccionamiento. Una evaluación sistemática de la dosis-respuesta por lo tanto es imposible con estos métodos, en comparación con métodos basados en la espectroscopia atómica como la microsonda nuclear análisis12,13, microscopía de fluorescencia de rayos x de sincrotrón14 y Spectrometry total de Ion secundario (SIMS). 15 , 16 estos métodos son particularmente interesantes como complemento de observaciones mediante microscopía de fluorescencia, sobre todo cuando NPs no pueden ser etiquetados con moléculas fluorescentes y así se estudiaron en su estado nativo. Hasta cierto punto, incluso cuando los NPs son injertados con fluoróforos, i cuantificación sigue siendo difícil porque se desconoce el nivel marcado por NP y (ii) la modificación química de la superficie de la NP puede modificar su distribución celular.\nEn este artículo, nos centramos en un método basado en una combinación de técnicas de microsonda nuclear con el objetivo de la morfología y composición elemental de muestras biológicas en mayor, menor, la proyección de imagen y seguimiento de las concentraciones.\nAnálisis de microsonda nuclear resulta particularmente adecuado para la medición de elementos químicos en los tejidos biológicos. La resolución lateral del haz (0.3 a 1 μm) y la sensibilidad en la detección de elementos químicos (de 1 a 10 μg.g-1 masa en seco) son ideales para estudios a nivel celular. Microsonda nuclear técnicas se basan en la detección de partículas (fotones, electrones, iones) emitida después de la viga de ion (típicamente funcionando a energías de MeV) interactúa con los átomos presentes en la muestra. Las interacciones que ocurren en las células son principalmente: 1) excitación/ionización de átomos seguido por una emisión de fotones después de átomos vuelven a su estado fundamental; y 2) difusión de las partículas entrantes hacia el cambio en su energía y dirección. La medida de la identificación de permita de energía emite partículas de átomos involucrados en la interacción. Para realizar el mapeo de elementos, el ion microhaz es repetidamente analizado sobre la superficie de la muestra, a menudo sobre un área de cerca de 100 por 100 μm2 que contiene varias células. Se detectan las partículas emitidas y su energía se registra para cada posición de la viga. Clasificación de partículas según la posición de la viga, identificando así la estructura responsable de la emisión de dichas partículas es el objetivo del tratamiento de datos. Aquí, describimos precisamente un enfoque basado en la microscopía de fluorescencia y análisis de microsonda nuclear para detectar como para cuantificar NPs exógenas en las escalas celulares y subcelular, con el fin de investigar las consecuencias de las interacciones NP con vida sistemas. Enfocará particularmente en las oportunidades ofrecidas por este método en términos de cuantificación en situ de dióxido de titanio nanopartículas (TiO2 NPs) agregados a nivel subcelular.\n1. sostenedor de la preparación\nPreparación y diseño de muestra\nFabricación de un sostenedor de la muestra por un cuadrado de 5 x 5 mm en un marco PEEK grueso de 1 milímetro de la perforación.\nLimpieza por lavado con etanol 70% (v/v) y mantener en placas estériles hasta que esté listo para usar.\nTenga en cuenta. Un sostenedor de la muestra apropiado para cultivo celular y manejo de celular se requiere. Debe diseñarse para cultivo, en vitro observaciones con microscopía óptica y análisis de microsonda nuclear y la proyección de imagen de la célula. Este soporte se hace de una ojeada marco13.\nPreparación de soporte para la muestra\nPreparar la solución de Formvar disolviendo 1 mg de Formvar en polvo en 100 mL de cloroformo.\nEstirar la lámina de policarbonato en un marco metálico que no presenta doblez.\nUtilice una punta estéril para distribuir la solución de Formvar alrededor del agujero del soporte de muestra.\nColocar delicadamente el portamuestras con pegamento sobre la lámina de policarbonato estirado (un cuadrado de 5 x 5 mm).\nRepetir la secuencia anterior para preparar un sostenedor de la muestra para cada repetición.\nTenga en cuenta. La película de policarbonato (PC) es biocompatible, suficientemente gruesa y resistente a los diferentes protocolos y limitaciones analíticas.\nPRECAUCIÓN- cloroformo es tóxico. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente y filtros adecuados.\nEsterilización de sostenedor de la muestra\nColoque el portamuestras montado en un erlenmeyer con 50 mL de etanol 70% (v/v) con agitación a 180 rpm y + 37 ° C durante la noche, utilizando un incubadora/agitador.\nEnjuague el titular varias veces en agua destilada estéril.\nEl aire seco en condiciones estériles y exponerlos a la luz ultravioleta (lámpara germicida de banco de seguridad biológica, clase II) por 30 min en cada lado.\nMantener las muestras en placas de pocillos 12 estériles (poseedor de una muestra por pozo) hasta que esté listo para usar.\nNota: Varios titulares de la muestra pueden almacenarse a temperatura ambiente en estériles y secas placas 12-bien sellado con parafilm durante varios días.\n2. crecimiento de las células en el portamuestras apropiado.\nPRECAUCIÓN: Protocolo debe realizarse en un banco de flujo laminar de seguridad biológica (clase II) para excluir los microorganismos contaminantes. Manejar antibióticos (e.g. penicilina, estreptomicina) con guantes. Respetar las mejores prácticas al manipular material biológico (líneas celulares genéticamente modificadas derivan de las células humanas).\nCrítico: las líneas celulares usadas deben controlarse para asegurar que no están infectados con micoplasma.\nTransfectar U2OS línea de células con el plásmido roGFP matriz 17,18,19 usando un método de transfección de acuerdo al protocolo establecido por el fabricante del cojinete.\nPara confirmar la transfección con el plásmido-llevar el biosensor y para evitar la pérdida del plásmido, seleccionar y mantener las células transfected en el medio de cultivo apropiado.\nVisualizar células transfected por microscopía de fluorescencia para que la transfección ha ocurrido y para confirmar la expresión de la fluorescencia y el despliegue de una red mitocondrial reticular y tubular19.\nPausa punto: Las células pueden ser congeladas en nitrógeno líquido durante varios años.\nUtilizar la población de células transfected las células en un medio adecuado de cultivo para obtener poblaciones celulares los confluentes. Crecen las células a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 en un ambiente saturado de agua.\nSemilla de las células en una concentración, tal como son en el 80% de confluencia el día de la fijación. Por lo general, se podría utilizar una concentración de 500 células por μl. Células con 400 μL de tripsina-EDTA 0.25% (v/v) de la cosecha y mantener durante 3 minutos a 37 ° C. Detener la acción de la tripsina con 1 mL de medio de cultivo. Sedimenten las células por centrifugación durante 5 min a 230 x g y + 4 ° C, luego retirar el sobrenadante y añadir el volumen deseado de medio de cultivo fresco.\nNota. El protocolo es aplicable para todo tipo de celular y el número de células sembradas depende del tamaño de celda y en el tiempo de duplicación de la célula.\nPRECAUCIÓN: Evitar someter a tripsina, antibióticos y suero a ciclos de congelación y descongelación repetida. Mantenerlos estériles. Dividir la solución en alícuotas y congelarse a −20 ° C. Almacenar las alícuotas hasta la fecha de caducidad. Enjuague cuidadosamente el precipitado de células con el fin de eliminar completamente la tripsina. Vestigios de tripsina residual serán retrasar y disminuir la eficacia de la galjanoplastia.\nContar las células y realizar una dilución con medio completo fresco de la cultura mantenido a 37 ° C para obtener una suspensión con 500 células por μl.\nNota: La concentración de la suspensión de células tiene que ser adaptado en función del tipo de la célula, para una caída de 40 μl de la placa.\nUna gota de 40 μL en el centro de la hoja del policarbonato de la placa. Coloque con cuidado la muestra por 2 h a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 en un ambiente saturado de agua.\nCrítica: Una vez que la muestra se coloca en la incubadora, limitar tanto como sea posible cualquier movimiento mecánico para favorecer la fijación rápida de la célula. Según el tipo celular, podría ser necesario incubar las células de más de 2 h para una óptima eficiencia de baño. Compruebe que la atmósfera de la incubadora está bien saturado para impedir la evaporación de gotas.\nCompruebe que las células estén bien conectadas en la hoja de policarbonato utilizando un microscopio óptico. Añadir 2 mL de medio completo fresco y mantenga durante 24 h.\n3. nanopartículas preparación y exposición\nNota: Fluorescente tinte modificado TiO2 NPs fueron diseñado, sintetizados y modificados químicamente con tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC). 20 , 21 esta modificación superficial permite la detección de nanopartículas, rastreo y localización en situ y en cellulo en células vivas y fijadas o en los organismos multicelulares. 12 , 13 , 18\nPRECAUCIÓN: Nanomateriales y nanopartículas deben manipularse con cuidado. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Para evitar la difusión en el aire, las nanopartículas se mantienen en solución (agua ultrapura).\nPreparar una suspensión de 1 mg.mL−1 deTiO2 NPs en agua ultrapura. Dispersar el TiO2 NPs usando pulsos de intensa sonicación de 1 min a temperatura ambiente (750 W, 20 kHz, amplitud: 30%) utilizando un generador de ultrasonidos y un dedicado microprobe cónico.\nDiluir el TiO2 NPs en la concentración deseada en el medio de cultivo para obtener una suspensión de la exposición de 4 μg.cm−2 (concentración final). Reemplazar el medio con el volumen adecuado de medio conteniendo NPs en células y mezclar suavemente para una distribución homogénea de TiO2 NPs. preparar células control igualmente sin la adición de TiO2 NPs.\nIncubar las poblaciones celulares por 24 h a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 y una atmósfera saturada de agua.\n4. paraformaldehido fijación y fluorescencia microscopía.\nPreparar una solución fresca de solución paraformaldehido (PFA 4% p/v) en tampón de fosfato salino (PBS, pH 7,4).\nDisolver 4 g de polvo de la PFA en 100 mL de PBS. Calentar la solución a 65 ° C removiendo con un imán y un agitador magnético en una campana de humos. Aumentar el pH mediante la adición de una gota de 1 M de NaOH en un momento hasta que se aclare la solución. Enfriar la solución a temperatura ambiente y ajustar el pH a 7.4. Utilizar la solución recién preparada de inmediato o mantener a + 4 ° C y proteger de la luz.\nNota: Soluciones prefabricadas de PFA se podrían utilizar sin embargo una preparación extemporánea de PFA garantiza mejor calidad de fijación y conservación a largo plazo de las muestras fijas.\nPRECAUCIÓN: PFA es tóxica; evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente y filtros adecuados.\nUna vez transcurrido el tiempo de incubación, retirar el medio de cultivo celular que contiene el TiO2 NPs. Enjuague las poblaciones celulares una vez con medio de cultivo fresco y una vez con PBS (2 mL). Quite el PBS, enjuague rápidamente con una alícuota de la PFA fresca y fría (4% w/v, + 4 ° C).\nAñadir PFA (mL 2, 4% w/v, + 4 ° C). Incubar 15 min a temperatura ambiente.\nQuite la PFA, lavar las células con PBS (2 mL, 3 veces, 5 minutos) bajo agitación.\nPausa punto: Estos fijos químicamente muestras pueden utilizarse para el procedimiento de "penetración-freeze" después de la proyección de imagen (ir al paso 5) la fluorescencia o utilizado sólo para (ir al paso 4.3) la proyección de imagen de la fluorescencia.\nTiñen el núcleo con Hoechst33342 incubando las células durante 10 minutos en PBS. Hoescht33342 se utiliza a una concentración final de 500 nM. Después de la incubación retirar la solución y lavar con PBS.\nPRECAUCIÓN: Hoechst33342 es florescente de la célula y puede ser tóxico. Evitar el contacto directo y use guantes mientras preparando y utilizando Hoechst33342.\nCrítico: que el Hoechst33342 solución de tinción es recién preparado y mantenido en condiciones estériles.\nProceso de fijado muestras para in situ y la proyección de imagen de célula mediante microscopía de fluorescencia (figura 1).\n5 "deshidratación y fijación de"congelación de inmersión\nPreparar una placa de aluminio de transferencia por el enfriamiento de nitrógeno líquido. La placa en una caja llena de nitrógeno líquido y mantener la superficie de la placa sobre el líquido en el vapor del nitrógeno frío.\nNota: La placa de transferencia se puede hacer de cualquier placa metálica (aquí hemos utilizado aluminio) que puede ser enfriado a temperatura de nitrógeno líquido, y que puede entrar en la cámara de muestra congelar-secador.\nCrítica: La caja debe mantenerse cerrada tanto como sea posible para evitar la deposición de vapor de agua sobre la superficie de la placa fría. La muestra almacenada en la placa durante la preparación no debe ser cubierta por nitrógeno líquido.\nEnjuague las células una vez en medio de cultivo y luego dos veces más, brevemente, en agua ultrapuro estéril para conseguir deshacerse de cualquier rastro de las restantes sales extracelulares.\nCrítica: Asegúrese de que los medios de comunicación están recién preparados y mantenidos en condiciones estériles. Todos los medios a 37 ° C de calor antes de ser utilizados. El enjuague debe ser muy breve (pocos segundos) y el exceso de líquido en las muestras quitado tan rápido como sea posible.\nInmersión de congelación de las células a-150 ° C en líquido nitrógeno frío 2-Metilbutano durante 30 s y el lugar de ellos sobre el aluminio transfieren placa. Almacenar las muestras aquí durante la preparación del resto de las muestras. Cuando las muestras son cryofixed todos, todos-de una vez mediante la colocación de la placa de transferencia en un secador de congelación de la transferencia.\nCrítica: El proceso general de criofijación no debería durar más de 20 minutos con el fin de evitar modificaciones estructurales para aparecer en las muestras almacenadas temporalmente en la caja de transferencia.\nLiofilización de las muestras utilizando las siguientes secuencias: 1) efectuar una desecación primaria por 12 a 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) a baja presión y baja temperatura, luego 2) realizar una fase de desecación secundaria durante al menos 24 h, aumentando la temperatura de la placa a + 40 ° C, manteniendo la presión baja (+ 40 ° C, 10-3 mbar).\nPRECAUCIÓN: Nitrógeno líquido extremadamente frío y puede producir daños graves de congelación o los ojos al contacto. Utilice recipientes superior Banco adaptado para el transporte y usar equipo de seguridad (protección facial y ocular, Guantes criogénicos).\nPRECAUCIÓN: 2-Metilbutano es extremadamente inflamable. Una perjudicial contaminación del aire se puede llegar bastante rápidamente en la evaporación de esta sustancia a 20 ° C. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Uso de respiración y protección ocular y guantes de protección. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente. Puede ser almacenado a + 4 ° C.\nCrítica: Utilice un termómetro apropiado (-150 ° C) para monitorear las temperaturas de 2-Metilbutano durante la sesión de "Congelamiento de penetración". El 2-Metilbutano debe mantenerse fresco en una fase líquida. Transferencia de muestras de cryofixed a la atmósfera ambiente puede causar daño celular debido al aumento de la temperatura o vapor de agua de condensación en la superficie de la muestra. En consecuencia, la transferencia debe hacerse tan rápidamente como sea razonablemente posible (30 s)\nPausa punto: Después de criofijación, las muestras pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios días en condiciones estériles y secas (protegidos contra polvo y humedad). Manejar las muestras con pinzas finas y colocarlas en una placa de 12 pozos estéril sellada con parafilm. Desecante se puede utilizar para secar el ambiente.\n6. nuclear análisis de microsonda\nNota: Análisis de microsonda Nuclear se llevó a cabo en la línea de microhaz de AIFIRA (aplicaciones Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en Région Aquitaine) utilizando las técnicas analíticas de haz de iones complementarios emisión de rayos x inducida por partículas (μ- PIXE) y microscopía de transmisión de iones (μ-STIM). La instalación está basada en un acelerador de partículas de 3,5 MV entrega de haces de iones ligeros en la gama de energía del MeV. 22 , 23\nPausa punto: AIFIRA es una instalación de la viga de ion organizada por la Universidad de Bordeaux que ofrece un acceso a los equipos nacionales e internacionales después de la evaluación científica del experimento propuesto.\nMonte los portamuestras PEEK en una placa perforada usando cinta de doble cara.\nColoque la placa de apoyo muestra en un plano vertical perpendicular a la dirección de la viga.\nCierre el compartimiento de análisis y vacío de la cámara de análisis.\nMicroscopía de transmisión de iones (μ-STIM)\nNota: STIM se utiliza para registrar los mapas de densidad de las células después de la conversión de la pérdida de energía a masa celular, aprovechando el hecho de que la pérdida de energía es proporcional a la densidad areal de la muestra (expresada en μg.cm-2).\nUtilizar un microhaz de helio (él+) de 2 MeV como una sonda con un tamaño en el plano focal de alrededor de 300 nm de diámetro y baja fluidez (2000 ions.s-1). Medida de la energía de los transmisión iones con un detector de silicio planar (detector de puntos, 25 mm2, 11 keV energía resolución @ 5,4 MeV), colocado detrás de la muestra en el eje de la viga.\nPartículas inducidas por emisión de rayos x (μ-PIXE) y espectrometría de retrodispersión Rutherford (RBS-μ).\nNota: los análisis Pixe de μ y μ-RBS proporcionan la distribución espacial y cuantificación de elementos químicos con una resolución del secundario-micrómetro.\nUtilice un microhaz de protón (H+) de 1,5 MeV (50-150 pA), centrado hasta un diámetro de 1 μm y análisis sobre las mismas células de interés identificados por STIM de 4 a 8 horas y alrededor de 100 x 100 μm2.\nRecoger inducidos fotones de rayos x emitidos de los átomos presentes en la muestra (más pesada que el Na) por un detector estado sólido de alta resolución Li (resolución de energía de 145 eV, @Mn-Kα) colocados a 45 ° del eje de la viga entrante. Utilizar la energía del fotón detectado para identificar la naturaleza de los emisores (por ejemplo, Z del elemento) y la intensidad de rayos x para determinar la concentración de elemento.\nAl mismo tiempo recoger los protones back-esparcidas a-135 ° con un detector de silicio (detector parcialmente depletado, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) para medir el número total de partículas entrantes y para normalizar las intensidades de rayos x.\nCrítica: Una colección de estándares de calibración certificados para la cuantificación de la concentración atómica se utiliza para calibrar la respuesta del detector de rayos x. Materiales de referencia son una colección de películas delgadas de atomicas en 6,3 μm espesor láminas de Mylar. Emite la gama de energías de rayos x de 0.6 (Li, K line) a 20.2 keV (Rh, K line).\nReconstrucción de mapas elementales químicos usando el plugin de IBA-J de ImageJ. 24\nNota: Software dedicado en forma de un plugin para ImageJ ha sido desarrollado para procesar datos de análisis de microsonda nuclear cruda. Datos corresponden a una lista de acontecimientos derivados de la interacción del haz de partículas con las células que se registran junto con la posición de la viga como una secuencia cronológica.\nUsar el plugin J IBA a ordenar los eventos según su tipo: transmite energía del ion (STIM), dispersión energía del ion (RBS) o energía del fotón de rayos x (PIXE). Luego, procesar por separado cada tipo de datos.\nCalcular el mapa de densidad de área STIM\nCalcular promedio espectros de energía de fotones de rayos x y definir para cada elemento químico de interés una ventana de energía para recuperar la distribución espacial del elemento.\nDefinir regiones de interés (ROI) (por ejemplo, las células individuales, estructura densa, agregados, etcetera) y calcular los correspondientes espectros de rayos x.\nAnalizar los correspondientes espectros RBS para calcular el número total de partículas incidentes25.\nAjuste de los espectros de rayos x utilizando los Gupix software26 para determinar la concentración de elemento para cada ROI.\nNota: Típico límite de detección (LOD) del método está en la gama 1 a 10 μg.g-1 masa seca según el número atómico de los elementos (LOD está disminuyendo con Z).\nCultivo celular y proyección de imagen de fluorescencia de etiquetado fluorescente TiO 2 NPs\nHemos diseñado un sostenedor de la muestra para cultivo celular, manejo de celular así como análisis multimodal. Específicamente, es importante que el titular permitió microscopia óptica rutinaria como bien como nuclear proyección de imagen y análisis de microsonda. Este sostenedor de la muestra se basa en una lámina de policarbonato grueso 2-μm depositada en un marco PEEK. Las células son cultivadas directamente en policarbonato, en condiciones de cultivo estériles durante varios días y luego utilizadas para diferentes configuraciones experimentales, tales como exposición de NPs.\nLa modificación química de la superficie con fluoróforos (TRITC) permitió la detección de TiO2 NPs así como su localización en situ y en vitro en vida o en paraformaldehido fijada las células mediante microscopía de fluorescencia. El núcleo de la célula y las mitocondrias fueron teñidas con el colorante vital Hoechst33342 (azul para el núcleo) y la matriz-roGFP transfected (verde para las mitocondrias), respectivamente. Esta coloración múltiple permitió la localización intracelular del TRITC TiO2 NPs (por su rojo emitiendo fluorescencia) 20 h después de la exposición. NPs se encontraron sólo en el citoplasma de las células expuestas con la no detección en el núcleo. NPs fueron localizados al azar en la región perinuclear del citoplasma y totalmente excluidas de las mitocondrias (no hay solapamiento entre TRITC y GFP señales).\nAunque la microscopía de fluorescencia es muy útil para localizar NPs dentro de las células expuestas, no es capaz de evaluar el número exacto de NPs por la célula. La principal dificultad de la microscopia de fluorescencia con respecto a la cuantificación de NPs está vinculada a la incertidumbre acerca de (i) el número de fluoróforos conectados a un determinado NP y la estabilidad blanqueaba de fluoróforo solicitada durante la observación y (ii) la Estado de agregación del NPs dentro de la célula.\nFigura 1 : in vitro e in situ fluorescencia de U20S células transgénicas expresando RoGFP matriz de la proyección de imagen y expuestos a TiO TRITC 2 NPs. Las células U2OS (superior) marcadas con Hoechst33342 (azul), matriz-roGFP (verde) se exponen a 4 μg.cm-2 marcado con TRITC TiO2 nanopartículas (rojo) para 20 h. observaciones indican que el TiO2 agregado de NPs en células en un región perinuclear. Barra de escala: 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nPara superar estas deficiencias, microsonda nuclear análisis techniquesprovide un enfoque complementario a la microscopía óptica convencional debido a su sensibilidad a lo NPs que evita el uso de cualquier señal intermedia como la fluorescencia de una injertada colorante. Además, también son completamente cuantitativas, proporcionando datos sobre (i) el contenido bioquímico celular que es de otra manera desconocido y (ii) la cantidad intracelular de NPs a nivel unicelular.\nCriofijación de células después de la proyección de imagen vivo.\nLa mayor restricción en la realización de análisis de microsonda nuclear debe trabajar bajo condiciones de vacío. Hemos desarrollado un protocolo de fijación celular que permite la preservación de la ultraestructura de la biológica y la integridad bioquímica de la muestra biológica. La fijación química se sabe que modificar la composición del elemento de rastro de células porque requiere el reemplazo de su medio celular por un polímero utilizado para preservar la ultraestructura celular. Por otra parte, la extracción de agua también libera iones libres y otras especies, que el general se modifica composición de la muestra. Por lo tanto, se convierte en obligatorio para dar prioridad a un método de fijación física, en particular métodos criogénicos. Estos procedimientos criogénicos inducen un rápido cese de la actividad celular y, en la escala de tiempo de milisegundos.\nMicroscopia de microsonda nuclear análisis y cuantificación de NPs a escala celular.\nMicroscopía de transmisión de iones (μ-STIM) y análisis de rayos x inducida por partículas de la emisión (μ-PIXE) fueron realizados en las muestras después de criofijación y deshidratación para obtener datos cuantitativos precisos en su composición química elemental.\nImágenes de μ-STIM reveló las diferencias locales de densidad y permite la detección de estructuras celulares como el núcleo y el citoplasma. Aunque la resolución lateral del haz permite la observación de densas estructuras tan estrechos como 300 nm ancho, fino aquí agregados visibles en el citoplasma, los métodos STIM no pueden discriminar entre NP agregados y otras estructuras celulares densos. Esto es porque, como microscopía electrónica de transmisión (TEM), el proceso físico que conduce a la variación en la energía transmitida es la interacción de los iones entrantes con la nube de electrones atómicos. A diferencia de los análisis TEM sin embargo, porque se analiza el volumen de toda la célula, las variaciones locales de espesor impiden la discriminación entre estructuras de alta impedancia y un aumento local de densidad celular.\nFigura 2 : Imágenes de la densidad y distribución elemental obtienen por STIM μ y μ-PIXE en cryo-fijos U2OS células. U2OS células del control (arriba) comparadas expuesto células U2OS cryo-fijos (expuestas a 4 μg.cm-2 TiO2 NPs, abajo) y observadas mediante análisis de microsonda nuclear/microscopía. Microscopia STIM (a la izquierda, mapas de escala de grises) reveló densidad intra o extra cellular estructuras (núcleo, sal agregados, nanopartículas). La resolución espacial (300 nm) es comparable a la microscopía de fluorescencia y muestra estructuras como agregados de NP en la región perinuclear. Identificación de estructuras basadas solamente en su densidad sin embargo puede ser ambigua. Los mapas elementales μ-PIXE de K, P y Ti (escala de color termal) son complementarios a mapas de μ-STIM. Pueden ser utilizados para asegurar la presencia de NPs en células. Cada célula puede ser analizada individualmente en términos de concentración de elemento (ver figura 3). Barras de escala: 10 μm. escalas de Color van desde mínimo (azul) a intensidad máxima (gris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nComo se ilustra en la figura 2, la representación de μ-STIM permite el reconocimiento de células individuales dentro de una población y compartimientos intracelulares secundario como el nucleolo y el núcleo. Lamentablemente y como se ha mencionado anteriormente, NPs no siempre se podían detectar con reconstrucción de μ-STIM.\nAnálisis de la emisión (μ-PIXE) de rayos x inducida por partículas proporciona no sólo la composición química de la muestra, sino también su mapeo elemental (figura 2). Durante la interacción con el haz emocionante, los elementos químicos se someten a procesos de excitación-de-excitación atómicos que eventualmente conducen a la emisión de un fotón que exhibe la energía característica del número atómico del elemento excitado. Un espectro característico pico se construye de la suma de todos los eventos de fotones emitidos y se considera una firma química de la muestra.\nConfiguraciones experimentales estándar y detectores utilizados para experimentos de μ-PIXE permiten la cuantificación simultánea de todos los elementos más pesados que el Na con un límite de detección de masa seca de 1 a 10 μg.g−1 . Exactitud en la medición de concentraciones elementales se limita generalmente a alrededor del 20% debido a la eficiencia de colección y detector de carga.\nEn este estudio, se observa la distribución de elementos como potasio y fósforo y para cuantificar la cantidad intracelular de TiO2 NPs con la asignación de titanio por análisis de microsonda nuclear. Mapas de elemento químico se calculan después de que los fotones se clasifican según la posición de la viga en el momento de la grabación y la selección de una ventana de energía centrada alrededor de un elemento específico. Mapas son representante del número de eventos detectados en la posición de la viga y cuantitativos. Ruido y fondo numérico simulados y filtran. Además, mapeo químico puede utilizarse para extraer el espectro PIXE local necesario para la cuantificación.\nComo se ilustra en la figura 2, fósforo se distribuye homogéneamente en la célula, como era de esperar, mucha mayor concentración en el área nuclear. Potasio se distribuye homogéneamente en el volumen de la célula. Titanio se encuentra en la región citoplasmática perinuclear en forma de agregados, como se observó mediante microscopía de fluorescencia (figura 1). NPs muestran la misma localización perinuclear cualquiera que sea su estado superficial: funcionalizados (figura 1) o nativo (figura 2). Mientras tanto, no hay rastro de titanio fue detectada en células de control confirma que la distribución de titanio observada por μ-PIXE debe atribuirse al TiO2 NPs, de acuerdo con nuestros anteriores análisis por microscopía de fluorescencia.\nAdemás, como se ilustra en la figura 2, es posible extraer la distribución intracelular de NPs y las concentraciones de NPs cuantitativas de regiones específicas de interés. Basado en los mapas STIM y en correlación con la distribución de fósforo potasio, análisis de células individuales es posible.\nFigura 3 : Análisis cuantitativo de unicelular mediante μ-PIXE. Los espectros de rayos x calculados para las celdas que se muestra en la figura 2 se pueden montar con el fin de determinar la concentración del elemento en el nivel celular. Esta característica es particularmente interesante para el análisis de NP donde concentraciones celulares generalmente muestran fuertes variaciones dentro de la misma población. Por ejemplo, la misma supone la exposición, la gama de concentraciones de Ti desde 0.2 hasta 1,8 μg.cm-2. Controles corresponden a poblaciones celulares no tratados. Dosis de exposición: 4 μg.cm-2. Boxplots representan la distribución de las concentraciones celulares individuales con valor mediano (línea horizontal) y bares que se extiende hacia el menor y mayor medición valores. Las células de control: N = 14; Expuestas las células: N = 16.\nPor consiguiente, hemos no sólo cuantifica el contenido promedio de titanio en una población celular pero también se muestra la distribución de titanio por la célula en una población en una condición experimental específica. El contenido promedio de titanio mide aquí es bastante bajo (500 ng.cm-2) en comparación con la dosis de exposición de 4 μg.cm-2 de la población de la célula (figura 3) y la variación entre las células es grande (Ti concentraciones van desde 0.2 hasta 1,8 μg.cm -2 según las células analizadas). También notamos un incremento de iones intracelulares como el potasio y calcio en las muestras expuestas, sugiriendo una homeostasis celular alteración inducida por la presencia de TiO2 NPs, como la descrita por varios autores. 21 , 27\nSe describe un método que proporciona información útil más allá de lo que es posible con otras técnicas de imagen, especialmente en el nivel subcelular. Además de su capacidad de proyección de imagen, análisis de microsonda nuclear también ofrece posibilidades de cuantificación de elementos químicos en la composición de una muestra biológica. En el presente trabajo, estudiamos las poblaciones de células humanas y enfocado hacia el análisis de una región solicitada de interés basándose en una sola celda expuesta a TiO2 NPs. Su combinación con otras técnicas ofrece la proyección de imagen morfológica celular y datos cuantitativos precisos sobre la composición química elemental.\nPara aplicar con éxito análisis de microsonda nuclear, es obligatorio respetar los siguientes puntos para evitar peligros potenciales. En primer lugar, es imprescindible utilizar un protocolo criogénico para la fijación de la célula para mantener su integridad bioquímica y su ultraestructura. En segundo lugar, también es obligatorio realizar análisis de muestras delgadas con espesor por debajo de 20 μm. Si es necesario, podría realizar seccionamiento de muestras cryofixed. Las muestras absolutamente deben mantenerse congeladas. En tercer lugar, también es importante tener en cuenta que el análisis de microsonda nuclear revela una representación bidimensional de las muestras biológicas. Así, la distribución de elementos químicos obtenida es una proyección bidimensional que posiblemente podría introducir confusiones. Esta limitación se pasa por alto en el futuro por el uso de adquisición tomográfica.\nAnálisis de microsonda nuclear también tiene limitaciones. Debe destacarse que su principal limitación es la necesidad de realizar análisis bajo vacío. Por lo tanto, es imperativo utilizar protocolos de fijación celular que preserva la integridad bioquímica y la ultraestructura de las células. Por lo tanto es necesario probar la resistencia de las muestras biológicas para el procedimiento de la criogenia (sin la adición de resina química). Esto podría limitar el uso de análisis de microsonda nuclear.\nOtra limitación es la accesibilidad a las instalaciones para llevar a cabo análisis de microsonda nuclear. Los tiempos asignados de la viga son por lo tanto a veces limitados, y esto es una restricción adicional para este tipo de experimento desperdiciador de tiempo. A menudo se necesitan varias horas para una adquisición.\nEsta técnica difiere de otros métodos analíticos, incluyendo microscopia, plasma MS (ICP-MS), MS (LC - MS), la cromatografía líquida de espectrometría de masas (MS) acoplado inductivamente e isótopo radiactivo. Este último hecho se utiliza para estimar la dosis celular de elementos químicos pero sólo son capaces de proporcionar información en un macroscópico escala es decir, en una cantidad macroscópica de una muestra. Ninguno de ellos puede dar acceso, como análisis de microsonda nuclear, una detección precisa y mapeo de una dosis subcelular de determinados elementos químicos (iones, de metal o metal óxido NPs). Estos datos ayudan a acceder a un estudio más sistemático de evaluación dosis-respuesta.\nLa estimación precisa de la dosis en el estudio de la internalización de NPs en células es crucial desde ambos NP toxicología y Farmacología puntos de vista cuantitativos. Según lo sugerido por la gran discrepancia en el contenido de NP observado, que muestra una diferencia de 10 veces entre el mínimo y máximo observado de las concentraciones (figura 3), la concentración celular media podría no ser un parámetro relevante para describir la fenómeno de la exposición de partículas. Esto es particularmente cierto cuando un efecto de umbral se supone que ocurren porque la dosis no homogénea exposición podría llevar a observaciones contradictorias. Puesto que la naturaleza fraccionada de nanopartículas aparece claramente en el nivel celular, este estudio plantea, por tanto, otra vez la cuestión de la pertinencia de métodos basados en el análisis de las variables globales en abordar preguntas acerca del comportamiento de las células expuestas a dosis no homogéneas de los contaminantes.\nComo se ilustra en el caso estudiado aquí, observación y cuantificación de NPs en células individuales nos permiten entender mejor la bioacumulación de elementos endógenos/exógenos como el óxido de metal NPs. Esta es una tarea crítica para otros usos de NPs en biomedicina, donde un pobre entendimiento del subyacente distribución NP en las células podría conducir a resultados malinterpretados.\nEste protocolo pone de relieve la conveniencia de utilizar análisis de microsonda nuclear con otras técnicas para futuras evaluaciones de las interacciones NP con muestras biológicas. El enfoque cuantitativo proporciona información sobre el impacto de estos NPs en cuanto a la detección, identificación, localización y cuantificación del nivel de una sola célula.\nAgradecemos a Serge Borderes para dirección y edición del vídeo. La Agencia Nacional de investigación francés apoya el programa de investigación TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). El CNRS y la Comunidad Europea como una actividad de integración proporcionan el "apoyo de público y Industrial investigación usando Ion viga tecnología (espíritu)" bajo la CE contrato n ° 227012. Este trabajo ha sido apoyado por acciones Marie Curie - redes de formación inicial (ITN) como una "integración actividad apoyo postgrado con prácticas en industria y formación excelencia en la investigación" (SPRITE, D1.3) bajo contrato CE nº 317169. C'NANO Grand Sud Ouest y la región Aquitania apoyan el programa de investigación TOX-NANO (n ° 20111201003) y el programa de investigación POPRA (n ° 14006636-034).


Niegan dar de alta a bebé que podría ser deportada de Australia – Noticias Ya\nNiegan dar de alta a bebé que podría ser deportada de Australia\nUn hospital se niega a dar el alta a una niña de un año de edad, conocida como “bebé Asha”, debido a las preocupaciones de que podría ser devuelta a malas condiciones de vida\n02/15/2016 8:06 PM 05/16/2018 1:39 PM\n(CNN).- El destino de una bebé que se encuentra hospitalizada y enfrenta la posibilidad de ser deportada aún es incierto luego de que el primer ministro australiano Malcolm Turnbull dijera que su gobierno no “pondría en peligro la salud o la seguridad de ningún individuo”.\nUn hospital de Brisbane, Queensland se niega a dar el alta a la niña en cuestión de un año de edad, conocida como “bebé Asha“, debido a las preocupaciones de que podría ser devuelta a malas condiciones de vida en un centro gubernamental de detenciones costa afuera.\nUn portavoz del hospital dijo a CNN que ella solo sería dada de alta “una vez se identificara un hogar adecuado”. “Bebé Asha” sufrió quemaduras severas en un campamento en la isla de Nauru, un estado de Micronesia situado en el océano Pacífico central, a más o menos 3.379 km de Australia, según el grupo de defensa GetUp. La organización ha estado trabajando con la familia, quienes buscan asilo en Australia.\nLas autoridades de inmigración aún tienen que tomar una decisión en el caso. “Estamos manejando esta política con gran cuidado y con gran compasión”, dijo Turnbull.\n“Y al mismo tiempo, estamos haciendo todo lo que podemos para asegurarnos de que no hagamos o digamos nada que vaya a ser utilizado por los traficantes de personas para subir a más personas vulnerables a esos barcos”.\nEl ministro de salud de Queensland, Cameron Dick, dijo que “apoya fuertemente a los médicos en nuestros hospitales para que tomen las decisiones clínicas correctas”. Durante el fin de semana, multitudes se reunieron para mostrar su apoyo a la niña.\nHace dos semanas, el máximo tribunal de Australia dictaminó que el papel del gobierno en la financiación y participación en las detenciones en alta mar no era una violación de la ley. Esto significa que más de 260 personas que han sido enviadas a Australia para recibir cuidados médicos, como la “bebé Asha”, probablemente sean enviadas de vuelta.\nOtro informe de la Comisión Australiana de Derechos Humanos concluyó que “los niños de Nauru están sufriendo niveles extremos de malestar físico, de angustia emocional, psicológica y de desarrollo”.\nUn hospital se niega a dar el alta a una niña de un año de edad, conocida como "bebé Asha", debido a las preocupaciones de que podría ser devuelta a malas condiciones de vida


Talara también marchó por la vida - Talara mi orgullo\nTalara también marchó por la vida\nUna llamativa y alegre marcha en la que participaron centenares de talareños se realizó por las calles más importantes de nuestra ciudad en defensa y en celebración de la vida. Diversas instituciones privadas y estatales, grupos parroquiales, estudiantes y docentes de colegios y universidades respondieron al llamado a custodiar la “perla preciosa de nuestra vida, pero también la de los demás”, como indicaron algunos de los participantes.\nLlamativa fue la participación de escolares quienes se declararon “defensores incansables de la vida humana, pero especialmente de la vida humana de los Niños por Nacer, a los que consideraron “los más indefensos y vulnerables miembros de nuestra sociedad”.\nUno de los lemas de la marcha fue “Mi vida está en tus manos”. El profesor Carlos Navarro Azabache consideró que es injusto que quienes promueven el aborto son personas que ya nacieron y gozan de todos los derechos que niegan a los más indefensos. “La vida es un don que debemos defender con este tipo de marchas”, dijo a Talara, mi orgullo.\nPor su parte Kelly Cobeñas Morales consideró que la marcha sirve para sensibilizarnos. “Debemos cuidar la vida que está en nosotros. “Las mujeres no podemos ser tan irresponsables de tener intimidad con nuestras parejas y luego cortar la vida de seres preciosos y que tienen tantos derechos como nosotros en nacer”, explicó durante la realización de la Marcha por la Vida en Talara.


Bajar de peso en 1 semana dieta mediterranea - Ejercicios para adelgazar en casa rapidamente\nPlantearte seguir una dieta para adelgazar 10kg en un mes además de no se realista, ten por seguro que afectará a tu salud y que obtendrás un efecto rebote. Bajar de peso 10 kilos en 10 dias elena Dieta Shakra Keto - Quemador de grasa rápido En la respuesta confluyen varios problemas Nunca la humanidad ha estado tan mal en un problema de salud.\nPues en primer lugar, las bebidas azucaradas. Y desde luego, todo lo que es fast food, hamburguesas, salchichas, y el exceso de bollería y de pan blanco. Una tostada check this out pan integral con aceite de oliva virgen extra con un trozo de tomate y un poquito de jamón serrano y un yogur con unas piezas de fruta.\nMi padre era endocrino y cuando tenía ocho años ya sabía lo que Bajar de peso en 1 semana dieta mediterranea las proteínas, las vitaminas De las grasas, las mejores son las vegetales de origen natural como el aceite de oliva virgen extra, los frutos secos, el aguacate Hay estudios que aseguran que quien toma yogur, evita ganar peso.\nRecursos Keto: 28 días Keto Challenge Plan de dieta cetogénica, Keto..\nsource Licenciada en Psicología por la Universidad de Valencia en el año A partir del ejerce como formadora de psicología e inteligencia emocional en centros de secundaria y ofrece apoyo psicopedagógico a niños con problemas del desarrollo y aprendizaje.\nVideo motivacional adelgazar la voz\n¿Por qué estoy aumentando de peso con una dieta cetosis?\n¿Puedes comer solo claras de huevo con dieta cetosis?\nHacer conejo para dietas\nMediterranea en de 1 dieta peso Bajar semana Hamburguesa Double Down de KFC: el tocino y el queso se encuentran en medio. Bajar de peso en 1 semana dieta mediterranea.


ISS - Como dar de alta una cámara en el software SecurOS ISS | Base de Conocimiento\nISS - Como dar de alta una cámara en el software SecurOS ISS\nEjecutamos el software como administrador.\n2. Nos aparecen 3 opciones de configuración, en este caso utilizaremos el asistente rápido (Ayuda del asistente)\n3. A continuación nos muestra la cantidad de licencias de canales que nos soporta y las marcas de cámaras compatibles, damos clic en Siguiente.\n4. Es importante realizar el cambio de la contraseña que viene de fábrica, la cual es securos. El usuario root no podrá ser cambiado.\n5. Recuerden que este es el password de superusuario, en cada proyecto deberá de ser cambiado. Es importante documentarlo.\n6. Se permite agregar mayor cantidad de usuarios con diferentes privilegios\nUsuario avanzado: Tiene mayores accesos para los componentes del sistema de seguridad. Los accesos asignados al usuario avanzado son suficiente para controlar el sistema y llevar a cabo tareas de monitoreo de video.\nUsuario Simple: Tiene accesos limitados a los componentes del sistema. Los accesos asignados son suficientes para tareas de monitoreo de video. Clic en Siguiente .\n7. Especificamos los parámetros del servidor de video, se recomienda cambiar el nombre que nos da por default, en este caso le pusimos Servidor de video Herman. Ya para este paso nos detecta la unidad de disco duro donde vamos a grabar nuestro video.\nDebemos de habilitar las dos opciones que nos aparecen en la parte inferior.\n8. En el siguiente paso agregamos cámaras, dando doble clic en la columna de dispositivo, modelo, dirección IP y usuario, podemos agregar otra cámara solo dando clic en Agregar. Al ser agregados los dispositivos damos clic en Siguiente.\n9. Cabe mencionar que la configuración que hemos estado realizando es la del servidor, en el siguiente paso podemos agregar a nuestros operadores (Clientes), para ello damos en Agregar, en seguida se habilita una casilla, damos clic en los puntos suspensivos (…)\n10. Aparecen los nombres de los host agregados a nuestra red, seleccionamos el dispositivo y damos clic en OK. Clic en Siguiente.\n11. Se muestra una información resumida de configuración. Damos clic en Terminar.\n12. Hemos concluido nuestra configuración correctamente damos clic en OK\n13. Iniciamos sesión colocando el usuario root y nuestra contraseña.\n14. Al iniciar nos mostrará la imagen de la cámara que agregamos.


Programa “Cultura financiera para no financieros”. – La clave de tu éxito\nPrograma “Cultura financiera para no financieros”.\nLos modelos de financiación y gestión economica de la gran variedad de modelso de negocio emergentes, hace qeu manejar cada negcio sea más complejo y especifico. Incluso el negocio tradicional, amparado en el banco, es un modelo de gestión economica claramente insuficiente para getsionar las empresa 4.0.\nEs preciso adquirir conocimientos y competencias para gestionar el dinero y financiar los negocios de la nueva economía.\nCada vez está más próxima la economía a base de transacciones sin dinero. Sólamente electrónicas. Prepara tu negocio. Prepárate tú.\nObjetivos Ampliar la visión de las oportunidades de financiación de mi negocio, en las diferentes etapas de crecimiento.\nIdentificar los nuevos modelos de financiación y las oportunidades para mi empresa\nAdquirir nuevos conocimientos sobre entorno gepolítico y económico de negocios. Principales actores, e impacto de los nuevos giros en mi negocio.\nFortalecer la capacidad de toma de decisiones financieras para su empresa.\nContenidos La nueva economía, la empresa 4.0. Las transacciones sin dinero.\nPlan de financiación del negocio de innovación.\nFuentes de financiación del negocio 4.0.\nLos inversores: cuándo incorporarlos, por qué incorporarlos, y garantías\nEstrategia de negocio y política de financiación.\npolítica de reinversión y fiscalidad.\nGlobalización de negocios y estrategia financiera.\nToma de decisiones financieras en alta incertidumbre.\nDuración 56 h\nEl liderazgo innovador: el agente de cambio e innovación en la empresaApuntate, solo faltan3/03/174 días para que ocurra.\nMónica Grossoni\tMónica Grossoni\tMónica Grossoni presetna su libro “Salva tu vida”\tMónica Grossoni nos presetna su libro Salva tu vida. 2007\tMónica Grossoni en clase de control de estrés\tMónica Grossoni en clase se contról de estrés\tMónica Grossoni\tSigue el blog por Email


Texto - Ensayos - 735 Palabras\nPágina principal Ensayos Texto\nPáginas: 3 (735 palabras) Publicado: 29 de mayo de 2011\n1.\tDocumentos Públicos\n2.\tDocumentos Privados\nEl Documento o instrumento público es aquel Documento expedido o autorizado por funcionariopúblico o fedatario público competente y que da fe de su contenido por sí mismo.\nEl Registro Civil es un organismo administrativo o servicio público, encargado de dejar constancia delos hechos o actos relativos al estado civil de las personas naturales, así como otros que las leyes le encomienden.\n1.\tREGISTRO DE NACIMIENTO\nEl acta de nacimiento es un documento públicoprobatorio que hace constar de manera fehaciente la identidad de la persona, la personalidad jurídica del individuo ante la sociedad, su nacionalidad y filiación. Además, es el primer acontecimiento dentro denuestra vida que debe quedar asentado y registrado ante la institución pública del registro del estado familiar.\n2.\tREGISTRO DE MATRIMONIO\nel matrimonio es una institución social y permanente, porla cual se establece la unión jurídica de un solo hombre y una sola mujer, que con igualdad de derechos y obligaciones, originan el nacimiento y estabilidad de una familia, así como la realización deuna comunidad de vida plena y responsable.\n3.\tREGISTRO DE DEFUNCION\nEl acta de defunción es el documento a través del cual se declara legalmente el fallecimiento de una persona.\n4.\tREGISTRO DEDIVORCIO\nEs la disolución del vínculo matrimonial y solo tiene lugar mediante la declaración de la autoridad judicial.\n5.\tFe de Vida.\nDocumento librado por el Registro Civil a fin de acreditar laexistencia de una persona. También se puede acreditar por acta notarial de presencia.\n1)\tCedula de Identidad\nEl carné de identidad, oficialmente y según la legislación DocumentoNacional de Identidad (DNI) o cédula de identidad, es un documento emitido por una autoridad administrativa competente para permitir la identificación personal de los ciudadanos.\n...CORRUPCION En términos generales, la corrupción política es el mal uso público (gubernamental) del poder para conseguir una ventaja ilegítima, generalmente secreta y privada. El término opuesto a corrupción política es transparencia. Por esta razón se puede hablar del nivel de corrupción o transparencia de un estado. Todos los tipos de gobierno son susceptibles a la corrupción política. Las formas de corrupción varían, pero las más comunes son el uso ilegítimo de información privilegiada,...\n...Cada vez que producimos un texto debemos entre en cuenta los aspectos que conforman ese proceso que es complejo. Como siempre escribimos en un contexto, debemos adecuar nuestro lenguaje al contexto en el que nos hallamos para que nuestros interlocutores nos entiendan, usamos competencias. Por ejemplo evaluar si es el lugar adecuado para interactuar y si se esta usando el canal más eficiente, diferenciar tipos de registros. La competencia lingüística se basa en el conocimiento...\n...DÍA INTERNACIONAL DE LA MUJER ¡ENTREGATE...AMOR! ¡Ven hasta mí -como la voz del viento-; -como el beso del alba y de la nieve-, que acarician la faz del sufrimiento!. Hermanemos la pena suavizada, mientras comulga mi quimera leve con tu candor de alondra enamorada. ¡Ven hasta mí!; quiero que me comprendas; que no finjas caprichos ni ademanes; quiero que humanamente me desprendas tu racimo de amor..., y lo desgranes. Cultiva mi soñar con tus ofrendas, pero el ritmo...\n...USO DE LA "G" Sonidos de la G _ La "g" tiene sonido suave delante de las vocales: "a", "o", "u". Ej.: Gato, goma, gusano. _ La "g" tiene sonido fuerte cuando va delante de las vocales "e", "i". Ej.: General, gente, girar, colegio _ Si tiene que sonar suave delante de "e", "i", deberá llevar una "u" que no se pronuncia entre la "g" y la "e" o la "i". Ej.: Guerra, hoguera, guisante, monaguillo. _ Si, en el caso anterior, tiene que sonar la "u", se le colocará diéresis (¨). Ej.: Cigüeña,...\n...EDICION BASICA DE IMAGEN Y SONIDO Diseñado por la Mtra. Blanca Estela de los Santos Camacho y el Mtro. José Tomás Gallegos Ahedo del Aula de Medios. En este curso aprenderá a guardar imágenes y sonidos para usarlos con Edilim. Para imágenes usaremos PaintShopPro (PSP4) y para Sonido WavePad (WPSETUP) por ser gratuitos, pero se podrían usar otros programas. Se pueden instalar desde la Carpeta Anexo Mich08-Instaladores del DVD1 Enciclomedia. PRIMERA PARTE a.\tLas imágenes pueden ser...\n...Establecer diferencia entre catolicismo, protestantismo e islamismo. ------------------------------------------------- a)orígenes de cada una ------------------------------------------------- Catolicismo: El nombre de Iglesia católica (o catolicismo) se ha utilizado para referirse a la "Iglesia Universal" desde principios del siglo II, ya que consta la utilización del término por primera vez en las cartas de Ignacio de Antioquía, quien según Juan Crisóstomo, habría sido ordenado por el...\n...Mercosur: EL mercado comun del sur (MERCOSUR), es un bloque subregional integrado por Argentina, Brasil, Paraguay (que actualmente está suspendido por violación a un protocolo), Uruguay y Venezuela. Tiene como paises asociados a: -Bolivia. -Chile. -Colombia. -Perú. -Ecuador. Observadores ▪ Estados Unidos Mexicanos ▪ Nueva Zelanda Los idiomas oficiales de Mercosur son: Español, Guaraní y Portugues. Fue creado el 26 de marzo de 1991 con la firma del tratado de Asunción, que...\n...Violencia Laboral: ¿Qué es? En el mundo del trabajo la violencia se manifiesta como abuso de poder para doblegar la voluntad del otro mediante el empleo de la fuerza física, psicológica, económica y política. En este sentido, las mujeres aparecen como las más afectadas y vulnerables a esta agresión. La violencia laboral es toda acción ejercida en el ámbito del trabajo que manifieste abuso de poder por parte del empleador, del personal jerárquico, de quien tenga la función de mando, de...\nMovimientos guerreros en mexico\nLeds en agricultura\nNorma predio cl 86 a 12 16


Casa en C/ Pablo Neruda. - PEREZ&ALCARAZ\nCalle Pablo Neruda, 14700 Palma del Río, Córdoba, España\nREBAJADO, VENTA\t78.000€ - CASAS\nCasa en planta baja, situada en una magnifica zona residencial de Palma del Río, cerca de colegios, supermercados, etc. Al visitar la vivienda nos encontramos con un amplio jardín desde donde se acede a la vivienda, recibidor de entrada, salón, tres dormitorios, patio interior, trastero, cocina y cuarto de baño.\nSolar en calle Rioseco\nCompartirAmplio solar a dos calles en pleno casco histórico…\tMás detalles\nCasa en C/ La Isla.\nCompartirCasa en planta baja en calle La Isla, tiene…\tMás detalles\nCasa en C/ La Isla. Nave en C/ Vado Viejo.


Familia de Carolina del Norte representa a los latinos - Enlace Latino NC - Carolina del Norte\nPaola Jaramillo 19 agst., 2020\nCAROLINA DEL NORTE, Raleigh– Una familia de Carolina del Norte representó a los hispanos en la tercera noche de la Convención Nacional Demócrata que se celebra en Milwaukee (Wisconsin).\n“Mi madre emigró a este país con mi hermana, que nació con espina bífida, porque los médicos no dieron ninguna esperanza a mi madre, le dijeron que mi hermana no sobreviviría”, empezó Lucy.\nSu madre Silvia, quien es una reconocida activista dijo que gracias a la decisión de emigrar a Estados Unidos su hija hoy vive. “Hice lo que cualquier madre haría para la salvar la vida de su niña”, aseguró.\nSilvia explicó cómo tomó a su hija en brazos y viajó por la frontera.\nLucy destacó que su madre ha trabajado duro para dar a sus hijas una buena vida, pero ahora temen que sea deportada por las políticas del Gobierno de Trump.\nJessica recordó que a ella le fue concedido el programa Acción Diferida para los Llegados en la Infancia (DACA), creado por el expresidente Barack Obama en 2012 y que amparó a unas 650.000 personas traídas ilegalmente al país cuando eran menores de edad.\n“Desde que Trump fue elegido no sabemos si acabaremos separados”, indicaron, mientras que Jessica expresó su temor de que le quiten la atención médica.\nLucy, quien ya es ciudadana americana dijo que este 3 de noviembre, votará por su “familia, por el respeto y la dignidad”.\n“Nuestra historia es como la de millones de otras familias inmigrantes que ha sido atacada por las administración racista de Trump”, indicó.\nPrevio a la intervención de la familia Sanchez, la pequeña Estela, de 11 años, cuya madre fue deportada a México, compartió su historia.\n“Me llamo Estela, tengo 11 años y mi madre es mi mejor amiga, vino como adolescente sin papeles en busca de una vida mejor”, lamentó la niña, que leyó una carta dirigida al presidente de EE.UU., Donald Trump, sobre inmigración.\n“Señor presidente, usted ha destruido nuestro mundo”, se quejó Estela, que recordó que su madre, casada con un marine estadounidense, pagaba impuestos y que la Administración del anterior mandatario, Barack Obama, le dijo que podía quedarse en el país.\n“Ahora, mi madre no está, ha sido expulsada sin razón”. Fue lo que señaló Estela en la misiva. Denunció que “Trump ha separado a miles de menores (inmigrantes) de sus familias y los ha puesto en jaulas. Ahora algunos son huérfanos por su culpa”.\nAceptación de Kamala Harris\nDurante esta tercera jornada de la Convención Nacional Demócrata intervinieron la candidata a la Vicepresidencia Kamala Harris y del exmandatario Barack Obama (2009-2017).\nHarris aceptó la nominación demócrata a la Vicepresidencia del país; previo a que el jueves Biden dé su discurso de aceptación de la candidatura del partido a la Casa Blanca como cierre de la convención.\nPrevPreviousLeve reducción en porcentaje de latinos con Covid-19\nNextCooper firma orden ejecutiva que elimina pregunta de antecedentes penales en agencias estatalesSiguiente


YAS EXPRESS HOTEL desde $1,245 (Ras al-Jaima, Emiratos Árabes Unidos) - opiniones y comentarios - apartamento - TripAdvisor\nYas Express Hotel Apartamento, Ras al-Jaima\nN.º 8 de 17 alojamientos especiales en Ras al-Jaima\nAl Dhait South C Shk Muh'd Bin Salem Rd, Ras al-Jaima, Emiratos Árabes Unidos\nA 11.3 km de Aeropuerto Internacional de Ras Al Khaimah\nMostrar las 71 cosas que hacer en Ras al-Jaima\nSólo un hotel bien!\nVine impactados cuando todos me esperaba la vista a la playa como marcadas en el sitio web de me reserva, no fue asi. La señora de recepción con el chico que tomó mi maleta durante la salida fue muy agradable y servicial, como contraposición a...personal de limpieza que no pueden proporcionar una caja de pañuelos n wc (vamos, sólo 1 habitaciones hacen durante 4 días de estancia no podía ser alojados con eso?). La ropa de cama era dura y no me puedo imaginar tener cocina outlet abrió sus puertas a las 12 del mediodía? Considérate advertido de haber elegido este hotel por sus instalaciones.Más\nUbicación privilegiada, fácil acceso, personal agradable, usted será sorprendido cuando entra en las habitaciones del hotel son amplias y están limpias, tiene dos spa (china y tailandesa) Una preciosa piscina y el chef es genial, ya que hacen una mezcla deliciosa grial\nque nos registramos en este hotel por una noche, ya que teníamos venía en Dubai y conducirá temprano ir a Omán. Así que decidimos tener una noche parar y descansar en el hotel. El lugar es fácil de localizar ya que está cerca de la...autopista. Como llegar a el lugar, no hay ningún espacio dedicado de estacionamiento, y la recepcionista no es muy amable. La habitación es limpia, pero la cama no es cómodo (sólido duro) que apenas podíamos dormir. El desayuno es gratuito, pero su comida precocinada y cuando nos pida en la recepción si nos puede solicitar nuestra propia selección de desayuno nos dijo que lo que no hay jefe y la cocina está todavía cerrado a esa hora, venga a imaginar su ya 8:00Más\nUSD 62 - USD 105 (Basado en tarifas promedio para una habitación estándar)\nVer los 29 hoteles cercanosVer los 440 restaurantes cercanosVer las 71 atracciones cercanas


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Cuatro muertos en Bocana de Paiwas en intento de robo\nLos hombres se dirigieron a la vivienda de Urcinia Orozco, a quien exigieron que les entregara las armas que tenían en casa y dinero\nAl menos cuatro personas murieron este miércoles en un asalto ocurrido al mediodía en Bocana de Paiwas, Caribe Sur de Nicaragua.\nEl hecho ocurrió cuando sospechosos que se movilizaban en motocicletas sin placa incursionaron en el poblado.\nLea también: Demandan justicia en caso de asesinato\nLos hombres se dirigieron a la vivienda de Urcinia Orozco, a quien exigieron que les entregara las armas que tenían en casa y dinero.\nAl estacionarse frente a la casa de Orozco, los hombres les pidieron que les abrieran la puerta.\nLa reacción del yerno de la propietaria de la casa, identificado como Raúl Miranda, fue disparar contra los desconocidos.\nVea también: Tranques en Río Blanco, Matiguás y Mulukukú permiten paso de vehículos cada tres horas\nSin embargo, los hombres también reaccionaron accionando sus armas de fuego “y le pegaron dos balazos”, aseguró el informante.\nSorprende a vecinos\nLea también: Policía detiene ilegalmente a cinco miembros del Movimiento 19 de Abril en Matagalpa\nFue una balacera, dijo Ortiz, pues los vecinos salieron en respaldo de Miranda, quien ya herido continuó defendiéndose de los sospechosos.\nLa vivienda de Orozco, una fuerte ganadera del sector, está ubicada en el centro de la localidad, cerca de la filial de la Alcaldía de ese municipio.\nEl hecho mantiene sorprendida a la población de Bocana de Paiwas, sobre todo porque pasó a plena luz del día.\nLa comunidad en los últimos días vivía en una aparente calma. Es de resaltar que la delegación policial y las oficinas administrativas están ubicadas en Ubú Norte.\nPuede leer: Mueren dos policías y otros dos desaparecen tras ataque a puesto policial en Mulukukú\n“Esto no sucedía aquí”, manifestó un vecino de Paiwas, quien presume que los hombres proceden de Río Blanco, de acuerdo con el sector por donde ingresaron.\nArmados\tBocana de Paiwas\trobo\ttiroteo\tarchivo


Estos son los beneficios de los tratamientos de belleza no quirúrgicos\nLa medicina estética tiene como objetivo observar, prevenir e incluso revertir el proceso de envejecimiento\nRedacción Oink-Oink 12 marzo, 2020\n¿Te gustaría lucir bien, sin la necesidad de pasar por un quirófano? Debes saber que los avances de la medicina estética hoy en día ofrecen alternativas para lograr los resultados esperados sin tener que tomar días de reposo o soportar el dolor de una operación, por eso te contamos de los beneficios que ofrecen los tratamientos de belleza no quirúrgicos.\nLa medicina estética tiene como objetivo observar, prevenir e incluso revertir el proceso de envejecimiento en los pacientes, al mismo tiempo que se mantiene y potencia la belleza natural de las personas que recurren a esta especialidad.\nDe acuerdo con la Sociedad Internacional de Cirugía Estética y Cosmética, nuestro país se encuentra en el tercer lugar a nivel mundial, después de Estados Unidos y Brasil, en la realización de tratamientos de belleza no quirúrgicos; las cifras estiman que se realizan aproximadamente 397 mil 854 procedimientos no invasivos al año.\nLos tratamientos de rejuvenecimiento facial se hacen a base de inyectables de ácido hialurónico o toxina botulínica, también es posible conseguir excelentes resultados a través de tratamientos de tensado facial; mientras que los corporales logran el objetivo esperado a través de radio frecuencia o distintos tipos de aparatología.\nLa doctora Nathania Cárdenas, Directora de ´The Youth Conspiracy´ destaca que los principales beneficios de estos tratamientos son, que no hay tiempo de recuperación; además son procedimientos más asequibles y se obtienen excelentes resultados, incluso hay cosas que se logran hacer con estos procesos que no se logran con la cirugía.\nEs importante mencionar que estos tratamientos de belleza no son mágicos, pero sí son una excelente opción para los pacientes que no quieren una cirugía o que no la necesitan, por eso los especialistas deben tomar en cuenta las expectativas del paciente y conocer el límite de los procedimientos que una persona se puede realizar.\nLas personas deben tener cuidado con las ofertas que encuentras en plataformas digitales o en cualquier otro medio, pues hay muchas estafas y charlatanerías en estos tratamientos que pueden poner en riesgo su salud, debido al tipo de materiales que utilizan, la falta de ética profesional, higiene y otras razones más que pueden resultar contraproducentes.\n“Que lo hagan por quererse sentir bien ellos o por quererse sentir bien uno mismo, no por querer agradar a alguien más o no por buscar un objetivo estético con la finalidad equivocada”, señaló la doctora Cárdenas.\nCabe destacar que estos tratamientos no son exclusivos para las mujeres, pues los hombres también pueden mejorar su apariencia, moldear su cuerpo o conservar su estética, recuerda que la belleza no es exclusiva para un género y menos cuando se trata del bienestar personal.\nEste país cobra más barato por aumentarte los senos\nTe decimos cómo puedes recibir donas gratis por un año\nAsí es la mascarilla más cara del mundo, cuesta 1.5 mdd y está hecha de oro y diamantes\n¿Tienes esta moneda de Sor Juana? Ahora vale miles de pesos