Generación de líneas transgénicas de pez cebra como herramienta para el estudio del tejido adiposo blanco\nGeneración de líneas transgénicas\nde pez cebra como herramienta para\nel estudio del tejido adiposo blanco\nFlorencia Levin – 180391\nTutores: José Badano, Paola Lepanto\nYo, Florencia Levin, declaro que el trabajo que se presenta en esa obra es de mi propia mano. Puedo asegurar que:\n• La obra fue producida en su totalidad mientras realizaba el Trabajo final de carrera;\n• Cuando he consultado el trabajo publicado por otros, lo he atribuido con claridad;\n• Cuando he citado obras de otros, he indicado las fuentes. Con excepción de estas citas, la obra es enteramente mía;\n• En la obra, he acusado recibo de las ayudas recibidas;\n• Cuando la obra se basa en trabajo realizado conjuntamente con otros, he explicado claramente qué fue contribuido por otros, y qué fue contribuido por mi;\n• Ninguna parte de este trabajo ha sido publicada previamente a su entrega, excepto donde se han realizado las aclaraciones correspondientes.\nEn primer lugar, deseo expresar mi agradecimiento a todo el equipo del laboratorio de Genética Molecular Humana del Institut Pasteur de Montevideo por darme la oportunidad de formar parte del que hoy considero un excelente grupo humano y de investigadores. Particularmente quería agradecerles a mis tutores, PhD José Badano y PhD Paola Lepanto por apoyarme y guiarme durante toda esta trayectoria, por la enorme paciencia y disposición al enseñar y compartir su conocimiento, por la confianza que depositaron en mi, por la ayuda y el espacio de discusión y propuestas brindado y por hacer de este año tan especial para mi.\nAgradezco también a todas aquellas personas del instituto que me ayudaron en distintas etapas, por su disposición y paciencia. Al Mag. Gonzalo Aparicio del laboratorio de Biología Celular del Desarrollo Neural por las horas y paciencia dedicadas a enseñarme técnicas que fueron de suma importancia para llevar a cabo este proyecto.\nY porque este trabajo no solamente es fruto de años de estudio y esfuerzo, sino que también es el reflejo del apoyo incondicional de las personas que me rodean, quería agradecerles a:\nMis padres que son uno de los mayores pilares de mi vida, por la paciencia inagotable, por la contención, por el inmenso amor que me transmiten día a día, por haberme educado libre y apoyarme en cada decisión. Por darme la energía y las fuerzas necesarias para crecer tanto personal como profesionalmente.\nA mi prima, quien admiro muchísimo, por haberme sabido entender en momentos de tensión, por siempre encontrar las palabras para sacarme una sonrisa, por ser ella.\nMis amigas, con quienes comparto mi día a día, quienes me llenan de alegría, quienes me entienden como nadie, les agradezco por su empatía, su inmenso apoyo, por las palabras justas, por el amor que me transmiten y, sobre todo, por su autenticidad.\nTAS: tejido adiposo subcutáneo TAV: tejido adiposo visceral TAI tejido adiposo interno\nTAVP: tejido adiposo visceral pancreático TAVA: tejido adiposo visceral abdominal dpf: días post fecundación\nhpf: horas post fecundación\nSL: largo estándar, del inglés standard length\nwt: salvaje, del inglés wildtype\nBAC: del inglés bacterial artificial chromosome\nOCT: del inglés, optimum cutting temperature\nNH3/NH4+: amonio/amoníaco NO2: dióxido de nitrógeno NO3: nitrato\nrpm: revoluciones por minuto ppm: partes por millón\nμS/cm2: siemens por centímetro cuadrado (conductividad) ON: del inglés over night\npsi: libra por pulgada cuadrada, del inglés pounds per square inch\nDAPI: 4 ',6-diamidino-2-fenilindol AN: apertura numérica\nBSA: sueroalbúmina bovina, del inglés bovine serum albumin\nPBS: buffer fosfato salino, del inglés phosphate buffered saline\nPBS-T: buffer fosfato salino con surfactante Triton X-100 PBST-Tw: buffer fosfato salino con surfactante Tween 20\nPMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo, del inglés phenylmethylsulfonyl fluoride\nEDTA: ácido etilendiaminotetraacético LB: Luria - Bertani\nWISH: Hibridación in situ del embrión entero, del inglés whole-mount in situ hibridization\nPH3: fosfo histona H3, del inglés phosphohistone H3\nHRP: peroxidasa de rábano, del inglés horseradish peroxidase\nGFP: proteína verde fluorescente, del inglés green fluorescent protein\n1. INTRODUCCIÓN________________________________ 12\n1.1. ESTUDIO DEL TEJIDO ADIPOSO: RELEVANCIA BIOMÉDICA _ 12\n1.2. TEJIDO ADIPOSO: GENERALIDADES _____________________ 14\n1.3. PEZ CEBRA COMO SISTEMA EXPERIMENTAL PARA EL\nESTUDIO DEL TEJIDO ADIPOSO ____________________________ 18\n1.3.1. Generalidades del modelo _____________________________________18\n1.3.2. Tejido adiposo en el pez cebra: generalidades y homología con mamíferos\n1.3.3. Morfogénesis del tejido adiposo en pez cebra ______________________26\n1.4. CONTRIBUCIÓN DEL MODELO DE PEZ CEBRA PARA EL\nESTUDIO DE LA OBESIDAD Y EL TEJIDO ADIPOSO ____________ 28\n2. OBJETIVOS ___________________________________ 30\n2.1. OBJETIVO GENERAL __________________________________ 30\n2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS _____________________________ 30\n3. METODOLOGÍA ________________________________ 31\n3.5. CLONADO DE LAS REGIONES PROMOTORAS EN VECTOR\nPCRII-TOPO _____________________________________________ 35\n3.5.1. Amplificación de promotores ____________________________________35\n3.5.2. Adición de residuos de adenina a productos de PCR (A-\n3.5.3. Ligación en el vector pCRII-TOPO _______________________________37\n3.5.4. Transformación y selección _____________________________________37\n3.5.4.1. Colony PCR __________________________________________________ 38\n3.5.4.2. Digestión enzimática ___________________________________________ 39\n3.5.4.3. Secuenciación ________________________________________________ 39\n3.6. SUBCLONADO DE PROMOTORES EN VECTOR P5E-MCS ___ 40\n3.6.1. Liberación del inserto del vector pCRII-TOPO y digestión del vector\n3.6.2. Ligación de promotores con vector p5E-MCS _______________________41\n3.6.3. Transformación en bacterias competentes _________________________42\n3.7. GENERACIÓN DEL VECTOR DE TRANSGÉNESIS __________ 43\n3.8. CRÍA Y MANTENIMIENTO DE PEZ CEBRA _________________ 45\n3.9. GENERACIÓN DE LÍNEAS TRANSGÉNICAS _______________ 47\n3.9.1. Microinyección de embriones ___________________________________47\n3.9.2. Selección de embriones inyectados y larvas con patrones fluorescentes de\n3.9.2.1. Observación in vivo ____________________________________________ 48\n3.10. ANÁLISIS Y VERIFICACIÓN DE LOS PATRONES DE\nEXPRESIÓN _____________________________________________ 48\n3.10.1. Permeabilización para procesamiento\n3.10.3. Montaje de embriones y larvas _________________________________50\n3.10.4. Criocortes e Inmunofluorescencia _______________________________51\n3.10.4.1. Inclusión en OCT _____________________________________________ 51\n3.10.4.2. Inclusión en gelatina __________________________________________ 52\n3.10.5. Observación de embriones y cortes _____________________________53\n3.11. TINCIÓN CON NILE RED ______________________________ 54\n3.12. WESTERN BLOT _____________________________________ 54\n3.12.1 Preparación de muestras para Western blot _______________________55\n4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN _____________________ 56\n4.1. SELECCIÓN DE MARCADORES MOLECULARES DE TEJIDO\nADIPOSO E IDENTIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE SUS REGIONES\nPROMOTORAS __________________________________________ 56\n4.1.1. Selección de genes candidatos en pez cebra _______________________56\n4.1.1.1. Pparγ ________________________________________________________ 56\n4.1.1.2. Fabp11a ______________________________________________________ 57\n4.1.1.3. C/ebpα _______________________________________________________ 58\n4.1.1.4. Adiponectina _________________________________________________ 59\n4.1.1.5. Adipsina _____________________________________________________ 60\n4.1.2. Identificación de regiones de interés ______________________________61\n4.1.3. Clonado de regiones de interés __________________________________63\n4.2. GENERACIÓN DE LAS CONSTRUCCIONES DE TRANSGÉNESIS\n4.3. GENERACIÓN DE LAS LÍNEAS TRANSGÉNICAS DE PEZ CEBRA\nREPORTERAS DE TA _____________________________________ 72\n4.3.1. Inyección de las construcciones de transgénesis y selección de embriones\n4.3.2. Seguimiento de embriones inyectados y evaluación de individuos CG2_\n:EGFP por inmunofluorescencia _________________________________74\n4.3.2.1. adipoqb:EGFP y CG2_adipoqb:EGFP _____________________________ 74\n4.3.2.2. CG2_cfd:EGFP ________________________________________________ 80\n4.3.2.3.1. Evaluación de la expresión de EGFP en larvas inyectadas (F0) ______________ 83\n4.3.2.3.2. Evaluación de la expresión de EGFP en embriones F1 (F0 x wt) _____________ 86\n4.3.2.3.3. Evaluación de la expresión de EGFP en larvas F1 (F0 x wt) por estereomicroscopía _________________________________________________________________________ 94\n4.3.2.3.4 Evaluación del patrón de expresión de c/ebpα:EGFP en larvas F1 por\ninmunomarcado ____________________________________________________________ 97\n4.3.2.3.4.1 Puesta a punto de la inmunofluorescencia in toto para larvas de hasta 16\ndpf ____________________________________________________________________ 97\n4.3.2.3.4.2 Puesta a punto de la criopreservación e inclusión para criocortes de larvas\ne inmunofluorescencia _________________________________________________ 105\n4.3.2.3.4.3 Prueba de un anticuerpo comercial anti-C/ebpα ____________________ 113\n5. CONCLUSIONES ______________________________ 125\n5.1 PERSPECTIVAS A FUTURO ____________________________ 126\n6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ________________ 128\n1.1. ESTUDIO DEL TEJIDO ADIPOSO: RELEVANCIA\nLa Organización Mundial de la Salud (OMS) define a la obesidad y el sobrepeso como una acumulación anormal o excesiva de grasa que puede ser perjudicial para la salud. Ambas condiciones suelen ser diagnosticadas a través del índice de masa corporal (IMC), considerándose sobrepeso a un IMC mayor a 25 kg/m2, mientras la obesidad se diagnostica con un IMC mayor a 30 kg/m2.\nLa prevalencia de la obesidad y el sobrepeso en la población mundial ha aumentado de manera alarmante en las últimas décadas, tanto es así que en la actualidad el número de personas obesas duplica el número de personas con bajo peso (5) y de mantenerse esta tendencia, para el año 2030 se estima que más del 40% de la población del planeta tendrá sobrepeso y más de la quinta parte será obesa (6).\nLa obesidad es un factor de riesgo importante para el desarrollo de enfermedades no transmisibles, que son las de mayor carga de morbimortalidad mundial (6). Entre estas enfermedades se encuentra la diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares y de hígado graso (7), contribuyendo además, al desarrollo de trastornos del aparato locomotor como osteoartritis y algunos tipos de cáncer (8). A su vez, el riesgo de presentar estas patologías asociadas aumenta con un IMC mayor a 21 kg/m2, lo que reduce la esperanza de vida impactando tanto a nivel personal como en la economía de los sistemas de salud (9). Sin embargo, a pesar de su impacto socioeconómico, la OMS lo describe como uno de los problemas de salud más evidente y desatendido en la actualidad.\ndel TA que pueden contribuir al desarrollo de obesidad (11); estos casos son denominados “obesidad poligénica”. Por otro lado, existe la llamada “obesidad monogénica”. En esta condición de baja prevalencia (por ejemplo, hasta el año 2005 se habían reportado 200 casos) la obesidad está asociada a la mutación de un solo gen y se caracteriza por fenotipos severos que se presentan en la infancia y, a menudo, se asocian con trastornos endócrinos adicionales, problemas de desarrollo y comportamiento (11). A su vez la obesidad puede aparecer como un componente más en el espectro de manifestaciones clínicas de un síndrome, la “obesidad sindrómica”. Estos síndromes surgen como consecuencia de mutaciones genéticas puntuales o anomalías cromosómicas, y pueden ser trastornos autosómicos o ligados al cromosoma X (11). Un ejemplo son las ciliopatías, desordenes causados por defectos en un organelo celular, la cilia primaria (12). Las cilias primarias desempeñan un rol central en el procesamiento de múltiples vías de señalización entre las que se encuentran la vía de Hedgehog, Wnt y PDGF, y por lo tanto defectos en estos organelos causan un número de patologías, entre ellas, obesidad, como por ejemplo en el Síndrome de Bardet-Biedl (BBS; principal modelo de estudio de nuestro laboratorio) o el Síndrome de Almström (ALMS) (12).\n1.2. TEJIDO ADIPOSO: GENERALIDADES\nEl TA es un órgano dinámico y metabólicamente activo, cuya principal función es el almacenamiento de lípidos en forma de triacilglicéridos (TAG) (15). Además de su importancia en la metabolización de lípidos, el TA es considerado un órgano endócrino dada su capacidad de secretar proteínas metabólicamente activas denominadas adipoquinas (adiponectina, leptina y factor de necrosis tumoral α (TNF-α), por ejemplo). Estas moléculas actúan sobre el sistema nervioso central y tejidos periféricos regulando procesos como el apetito, la homeostasis de glucosa y el metabolismo lipídico (16). Por otro lado, el TA está involucrado en una variedad de procesos y sistemas cumpliendo funciones asociadas a la regulación de la presión sanguínea, inflamación y angiogénesis (17), así como funciones mecánicas al proteger órganos y regiones del organismo sujetas a altas presiones (18), además de ser importante en la regulación de la función reproductiva (19).\nEl TA está compuesto por varios tipos celulares, que a grandes rasgos pueden ser categorizados en dos grupos: adipocitos y no adipocitos. Estos últimos incluyen fibroblastos, células endoteliales y una diversidad de células inmunes, que en conjunto conforman la fracción estromal del TA. Los adipocitos, que forman la mayor parte de este tejido, son fibroblastos diferenciados capaces de almacenar grandes cantidades de TAGs (20). En lo que refiere a la formación de este tejido, es decir la adipogénesis, puede dividirse en dos etapas. La primera etapa es la determinación, en donde células madre pluripotenciales se determinan hacia células madres mesenquimales con una capacidad limitada para formar adipocitos, células musculares, condrocitos u osteocitos. En una segunda etapa, las células mesenquimales se comprometen al linaje de adipocitos tras formar preadipocitos que se diferenciarán finalmente en adipocitos maduros adquiriendo diferentes propiedades como la sensibilidad a la insulina, la capacidad de almacenar lípidos, y la habilidad de secretar proteínas y adipoquinas (16,17). La mayoría del conocimiento sobre la diferenciación de adipocitos se obtuvo a partir de estudios de cultivo de células utilizando las líneas C3H10T1/2 (células madres pluripotentes derivadas de embriones de ratón, que imitan las características funcionales de las células madres mesenquimales, siendo posible inducirlas a que se comprometan con los linajes adiposo, muscular, cartilaginoso y óseo) y 3T3-L1 (línea de preadipocitos derivada de embriones de ratón) (23). La regulación molecular de la adipogénesis está estrechamente controlada por múltiples moléculas de señalización y una red de factores de transcripción que se regulan de forma secuencial e impulsan el proceso terminal de diferenciación. En el centro de esta red, las proteínas de unión C/EBPß (CAAT/ enhancer binding protein ß) y C/EBPδ se activan primero y, a su vez, activan a C/EBPα y\nenzima ácido graso sintasa, la proteína de unión a ácidos grasos (FABP4), adiponectina y adipsina (21,22). La generación de modelos animales deficientes en genes específicos (knock-out)en tejidos específicos también ha atribuido a la compresión del rol de las distintas moléculas involucradas en la diferenciación de adipocitos. Por ejemplo, un sistema de knock-out inducible por doxicilina específico de TA aplicado en el modelo murino, sirvió para demostrar que si bien PPARγ es un factor crucial para la adipogénesis en todas las condiciones, C/EBPα es indispensable para la diferenciación terminal de TA blanco en ratones adultos, pero no durante la adipogénesis del TA subcutáneo durante la fase embrionaria (25). Sin embargo, si bien la diferenciación de adipocitos ha sido estudiada de manera extensiva in vitro, poco se sabe sobre este proceso in vivo.\nEn mamíferos, pueden distinguirse dos tipos de TA: blanco y marrón. El TA marrón se caracteriza por contener adipocitos con pequeñas gotas lipídicas multiloculares y ricos en mitocondrias. Este tipo de adipocito se especializa en la producción de calor a través del gasto de energía (grasa), en un proceso denominado termogénesis adaptativa; mecanismo que se activa en respuesta al frío o dietas hipercalóricas con la finalidad de proteger al organismo (26). Por otro lado, el TA blanco se especializa en el almacenamiento del exceso de energía en forma de TAGs y sus células se caracterizan por contener una única gota lipídica de hasta ~100 µm de diámetro. Este tejido se encuentra además en otros vertebrados (peces, anfibios, reptiles y aves) y es considerado el principal sitio de almacenamiento de energía de este taxón; aunque la grasa también puede almacenarse en otro tipo de células, mayormente en forma de ésteres de colesterol (27).\nFigura 1. Principales depósitos de grasa en el ser humano.\n1.3. PEZ CEBRA COMO SISTEMA EXPERIMENTAL\nPARA EL ESTUDIO DEL TEJIDO ADIPOSO\n1.3.1. Generalidades del modelo\nEl pez cebra (Danio rerio) es un teleósteo de agua dulce perteneciente a la familia Cyprinidae. Es originario de las cuencas del Rio Ganges y Brahmaputra en el noreste de India, de Bangladesh, Nepal y norte de Myanmar (30). Esta especie se caracteriza por su tamaño pequeño, con un promedio de 3-5 cm de largo y 1 cm de ancho en peces adultos, y su patrón de rayas longitudinales alternantes en brillantes y oscuras (31). Otra de las características es su dimorfismo sexual: los machos se caracterizan por tener una coloración dorada y ser delgados, mientras que las hembras suelen presentar una coloración plateada y tienen un vientre prominente, que se vuelve más evidente en la época de desove.\nFigura 2. Número de publicaciones científicas conteniendo la palabra “Zebrafish” entre los\nEste gráfico se construyó utilizando la herramienta “Medline trend” (33). Representa el número de publicaciones científicas halladas en PubMed utilizando como palabra clave “Zebrafish”.\nLa investigación en este modelo prometía la posibilidad de una mayor comprensión de los roles de genes asociados a distintas enfermedades humanas. Para esto, resultaba esencial la obtención de un genoma de alta calidad y una anotación completa del exoma con la correspondiente identificación de genes ortólogos en humanos. Fue por ello, que en el año 2001 comenzó la secuenciación del genoma completo del pez cebra en el Instituto Wellcome Trust Sanger en Cambridge, en donde se generaron varios ensamblajes de la cepa Tübingen. Se eligió esta cepa dado su uso extensivo en la identificación de mutaciones relacionadas a la embriogénesis. Luego del lanzamiento del ensamblaje Zv9, el proyecto de secuenciación del genoma de pez cebra se unió al Genome Reference Consortium (GRC) para la mejora y el mantenimiento del mismo. Este último, ha lanzado el ensamblaje más reciente GRCz11 (34).\nEl análisis del genoma de pez cebra ha mostrado que existe un alto porcentaje de homología con el humano. Si bien el ancestro común entre el pez cebra y los humanos divergió hace 450 millones de años, el 71% de las proteínas humanas (y el 82% de las proteínas causantes de enfermedades en humanos) tienen un ortólogo identificado en pez cebra (35). Sin embargo, en comparación con otras especies de vertebrados, el antepasado común de los Teleósteos tuvo una ronda adicional de duplicación del genoma, llamada “duplicación del genoma específico de Teleósteos”. Por lo tanto, los genes de mamíferos potencialmente presentan dos copias en el pez cebra. En muchos casos ambas copias del gen en pez cebra mantienen la función original. En otros casos, sólo una representa el ortólogo del gen de mamíferos mientras que la otra copia pudo haber retenido la función parcialmente, perderla totalmente, o inclusive adquirir una nueva función (36). Por otro lado, además de la homología genética, el pez cebra tiene un alto grado de conservación de muchas características fisiológicas y anatómicas a nivel del sistema cardiovascular, nervioso y digestivo.\ndespués de la fecundación e implica la pérdida del pliegue de la aleta larvaria, la remodelación de los sistemas intestinal y nervioso, la adquisición de escamas y características sexuales secundarias (38). Después de alrededor de tres meses, el crecimiento disminuye a medida que los peces adultos alcanzan la madurez reproductiva y comienza la gametogénesis (Figura 3).\nFigura 3. Desarrollo de pez cebra.\nEstas características hacen que el mantenimiento de los adultos sea más barato y la obtención de embriones más sencilla en comparación con los modelos de mamíferos. Por ejemplo, la colección de embriones de ratón implica el sacrificio de la hembra. En el caso de un estudio farmacológico se debe aplicar el fármaco a cada individuo, y en caso de que sea inhalado debe ser en un ambiente hermético, mientras que en el caso de los peces solo basta con adicionar la droga al agua (39). Los bajos costos sumados al gran número de embriones que se obtienen por puesta, permiten además su uso como herramienta en estudios a gran escala de distintos compuestos (drogas, contaminantes) en pequeños volúmenes. Los compuestos se adicionan al agua, y son absorbidos o ingeridos una vez que los embriones adquieran la capacidad de tragar. Es por ello, que el uso del pez cebra como modelo de toxicidad es uno de los más prevalentes a nivel industrial, siendo utilizado por la mayoría de las grandes farmacéuticas e incluso existen empresas que ofrecen servicios de estudios toxicológicos tercerizados (por ejemplo, Atoxigen)(40).\nAdemás de las características ya mencionadas, los embriones y las larvas son transparentes, lo que quiere decir que sus órganos, células y tejidos pueden ser visualizados in vivo. Esto sumado a la capacidad de modular la expresión génica (knock-downs y knock-outs) así como la de generar líneas reporteras con la expresión de proteínas fluorescentes aumenta la capacidad de análisis de procesos a nivel celular y tisular (36,37).\n1.3.2. Tejido adiposo en el pez cebra: generalidades y homología con\nEl pez cebra representa un buen modelo sobre el cual estudiar enfermedades metabólicas dado que posee los mismos sistemas utilizados en el control metabólico en humanos, desde los circuitos hipotalámicos que regulan el apetito, hasta el páncreas y los órganos sensibles a insulina (hígado, músculos y TA blanco) (41). Además las bases fisiológicas de estos sistemas como el metabolismo de lípidos, la biología del TA y la homeostasis de la glucosa también son semejantes a las presentes en humanos (42). Por todo esto el pez cebra se ha utilizado para el estudio de la obesidad, diabetes tipo II, diabetes neonatal, hígado graso no alcohólico y aterosclerosis (41).\nEn este modelo, al igual que en mamíferos, el exceso de nutrientes se almacena en forma de TAGs en gotas de lípidos uniloculares en los adipocitos blancos. A su vez, éstos pueden ser hidrolizados frente a la escasez de nutrientes para ser utilizados como energía (43). La deposición de grasa en los peces, también es sensible a la disponibilidad de nutrientes, y la maquinaria enzimática responsable del almacenamiento y movilización de las grasas es similar a la reportada en mamíferos (42), sugiriendo que las funciones del TA se han conservado entre ambas especies.\ncabeza) y apendicular (asociada a las aletas) (Figura 4). A su vez, la información de este modelo de clasificación fue utilizada en estudios posteriores, para realizar un análisis fenotípico más profundo en diferentes situaciones experimentales (mutantes, dieta) (45).\nFigura 4. Sistema de clasificación de depósitos de TA de pez cebra creado por Michin y Rawls.\nA nivel histológico también se ha observado una alta conservación de distintas estructuras, entre las que se incluyen las gotas lipídicas citoplasmáticas, caveolas y asociación del TA con el tejido conectivo a través de una red vascular (42). Desde el punto de vista molecular, en el pez cebra se expresan genes homólogos a los marcadores de adipocitos conocidos en mamíferos (por ejemplo fatty acid binding protein 11a, fabp11a; peroxisome proliferator-activated receptor gamma, pparγ; y CAAT/enhancer bining protein alpha, c/ebpα), y genes asociados a la lipolisis (lipoprotein lipase, lpl) y funciones endócrinas (leptina, lep;\nadiponectina, adipoqa y adipoqb; adipsina, cfd) (46). De hecho, el pez cebra ha sido utilizado como un modelo de obesidad inducida por dieta el cual promete ser útil para la identificación de posibles blancos farmacológicos y testeo de drogas para el tratamiento de esta enfermedad en humanos (47). Finalmente, al igual que en mamíferos, este modelo animal también posee precursores adipogénicos en la fracción vascular estromal.\nSi bien presenta muchas similitudes, también existen diferencias con respecto a mamíferos. Una de las principales es la ausencia de TA marrón. Por lo tanto, el uso de este modelo se restringe al estudio del TA blanco. Sin embargo, más que una desventaja esta diferencia podría ser una ventaja permitiendo evitar las desviaciones en resultados de estudios de obesidad reportadas hasta el momento como consecuencia de la termogénesis en mamíferos (48).\n1.3.3. Morfogénesis del tejido adiposo en pez cebra\nPara entender la dinámica del desarrollo del TA primero es necesario mencionar algunos aspectos de cómo se determina el estadio de desarrollo en pez cebra. El período embrionario del pez está comprendido entre los 0-5 dpf, luego del cual las larvas se convierten en juveniles aproximadamente a los 30 dpf, y alcanzan la madurez sexual alrededor de los 3 meses. El desarrollo post-embrionario (5-30 dpf) está influenciado por factores ambientales y metabólicos que hacen que el avance de desarrollo de los individuos no se correlacione perfectamente con su edad. Sin embargo, si hay una correlación entre el estadio de desarrollo y el largo estándar (del inglés standard length, SL), definido como el largo entre el extremo de la boca y el principio de la aleta caudal (pedúnculo caudal) o la punta posterior de la notocorda en caso de que las larvas aun no hayan desarrollado el pedúnculo (Figura 5) (49).\nFigura 5. Modelo de largo estándar propuesto por Parichy et al.\nBasándose en la hipótesis anterior, Minchin y Rawls utilizaron un modelo de regresión lineal que predijo el SL en que cada depósito de TA tiene la probabilidad de aparecer (4). Recordando los diferentes depósitos de TA en pez cebra, existen dos grandes categorías: TAI y TAS. Según las dinámicas descritas en este trabajo, el TAI es el primer depósito de TA en desarrollarse. Más específicamente, los dos primeros depósitos en aparecer pertenecen a la región visceral del pez cebra, desarrollándose en primer lugar el TAVP (tejido adiposo visceral pancreático) en peces con un SL ~ 4.2 mm y el TAVA (tejido adiposo visceral abdominal) a partir de un SL ~ 5.5 mm, donde la expansión del primero de ellos no se detuvo hasta un SL aproximado de 8 mm. Por otro lado, el desarrollo del TAS se observó luego de la aparición de la aleta dorsal (SL ~ 6,6 mm), el cual siguió expandiéndose hasta el final del ensayo. En definitiva, el TAS representó gradualmente una mayor proporción del TA total, hasta que el TAI y TAS constituyeron cada uno aproximadamente el 50% del TA total en animales adultos. En resumen, estos datos indican que el desarrollo de TA blanco en diferentes sitios ocurre de manera gradual, con el TA pancreático apareciendo primero, el abdominal segundo y el subcutáneo tercero. Si bien en esta oportunidad no describiremos el desarrollo de cada depósito en detalle, en el trabajo citado puede encontrarse un resumen en formato de tabla.\n1.4. CONTRIBUCIÓN DEL MODELO DE PEZ CEBRA\nPARA EL ESTUDIO DE LA OBESIDAD Y EL TEJIDO\nHasta el momento la adipogénesis, el TA y su rol en el desarrollo de obesidad se han estudiado principalmente en células en cultivo, modelos murinos de obesidad y el análisis histológico de muestras de pacientes. Los datos provenientes de estos modelos indican que la adipogénesis involucra la interacción de los progenitores con su entorno inmediato y a la vez con los procesos que ocurren en el organismo. Si bien los sistemas experimentales utilizados hasta el momento han permitido develar los factores moleculares involucrados en estos procesos, la información que aportan sobre la dinámica e interacción entre las diferentes células del tejido y con el organismo es limitada, sobre todo, en etapas tempranas del desarrollo, ya sea porque se trata de células aisladas y por la dificultad en acceder a los individuos en etapas embrionarias (46). Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos sistemas experimentales para el análisis de la formación y función del TA in vivo. Esto permitiría el estudio de enfermedades metabólicas sin interrumpir la comunicación entre los distintos órganos y arquitectura de los tejidos, siendo estos componentes esenciales para la compresión de la etiología de la enfermedad y la identificación de drogas que permitan modificar su progresión.\nEl modelo de pez cebra representa una alternativa interesante para satisfacer las demandas anteriormente mencionadas. Las características de este sistema experimental proporcionan nuevas oportunidades para investigar las primeras etapas de la morfogénesis de TA, un proceso poco explorado in vivo, con una relevancia potencialmente alta para la obesidad y enfermedades metabólicas. Además, dadas las herramientas de manipulación génica y de fenotipado que se han desarrollado en el pez cebra, este modelo es una opción atractiva para testear la relevancia de distintos genes candidatos de enfermedades, tales como los genes BBS o ALMS1 que mencionábamos en el caso de las ciliopatías (35).\nmolecular de la adipogénesis está controlada por múltiples moléculas de señalización y factores de transcripción. Teniendo en cuenta que éstas se expresan diferencialmente en adipocitos, los promotores de cada una de ellas podrían ser utilizados para generar una línea transgénica reportera del TA.\nEl desarrollo de este tipo de líneas transgénicas tendría varios impactos interesantes. Una línea transgénica reportera para el TA sería una herramienta sumamente útil para el estudio de su biología y, en combinación con dietas ricas en grasas, podría representar un excelente recurso para el estudio a gran escala de potenciales drogas que afecten su desarrollo/mantenimiento. A su vez, servirán para estudiar el rol de genes de interés, como los relacionados a ciliopatías que mencionábamos. Además, la caracterización de promotores de genes de TA representa un paso fundamental para poder generar mutantes tejido específicos valiéndose, por ejemplo, de la tecnología CRISPR y dirigiendo la nucleasa CAS9 a adipocitos.\nEn el marco del problema planteado el objetivo general de este trabajo es generar líneas transgénicas reporteras de TA en pez cebra.\n1. Seleccionar genes candidatos marcadores de adipocitos de pez cebra.\n2. Identificar y clonar las posibles regiones promotoras de los genes seleccionados en el vector p5E-MCS.\n3. Generar construcciones para transgénesis que permita la expresión de EGFP-CAAX bajo la regulación de las regiones promotoras seleccionadas (pTol2CG2_promotor :EGFP-CAAX_pA)\n4. Inyectar las construcciones de transgénesis en embriones de pez cebra e identificar individuos fundadores.\n5. Poner a punto protocolos de inmunofluorescencia e inclusión para criocortes, para evaluar líneas transgénicas.\n3.1. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL\nTras haber identificado la necesidad de nuevas herramientas para el estudio del TA, se plantea la generación de una línea transgénica de pez cebra reportera para este tejido.\nEn este trabajo el marcado in vivo de las células del TA se abordó a través de la expresión de genes reporteros fluorescentes bajo el control transcripcional de diferentes regiones promotoras que permitan la expresión restringida en tiempo y espacio del transgen. En primer lugar, realizamos una búsqueda bibliográfica para seleccionar aquellos factores cuya expresión estuviese reportada previamente en el TA de pez cebra y que mostraran un patrón espacial y temporal lo más restringido posible. Luego, intentamos identificar los promotores de estos factores por métodos bioinformáticos (sección 3.2). Con la información obtenida, definimos la extensión y ubicación de las regiones genómicas a ser utilizadas para la generación de las construcciones.\nLas regiones genómicas seleccionadas fueron clonadas por medio de PCR con cebadores que contenían en los extremos 5’ sitios de corte para enzimas de restricción (sección 3.3) a partir de ADN genómico de pez cebra (sección 3.4). Seleccionamos los sitios de corte considerando su compatibilidad con el sitio múltiple de clonado del vector destino (p5E-MCS), la direccionalidad deseada y que no se encontraran dentro de la secuencia de nuestras regiones de interés. Luego de la amplificación de la región genómica, ligamos el producto de PCR en el vector pCRII-TOPO, lo cual nos permitió mejorar la eficiencia de corte con las enzimas de restricción (sección 3.5). Los promotores clonados en pCRII-TOPO fueron luego subclonados en el p5E-MCS por corte con enzimas de restricción y ligación (sección 3.6).\nniveles, ya sea por observación directa de embriones vivos a bajo y mediano aumento, así como luego de la fijación y corte del tejido a través de inmunofluorescencia.\n3.2. IDENTIFICACIÓN DE REGIONES\nRealizamos la identificación de los promotores utilizando una versión de prueba del software\nGene2Promoter de Genomatix (versión 3.10) (51). El algoritmo cerrado del programa tiene acceso a todas las bases de anotación de genomas e identifica regiones promotoras ortólogas conservadas entre organismos, tanto a partir de reportes bibliográficos como a través de predicciones. De esta forma delimita las regiones 5` del sitio de inicio de la transcripción que podrían corresponder al promotor del factor de interés. Para el manejo de secuencias utilizamos el software Serial Cloner, versión 2.6 (52).\n3.3. DISEÑO DE CEBADORES\nPara el diseño de cebadores utilizamos la herramienta “Primer-BLAST” (53) y se detallan en la siguiente tabla:\nTamaño de amplicón (pb) Temperatura de hibridación (°C) Prom_Adipoqb_XhoI_Fwd ACGTCTCGAGCCAGCTGT TCTTGTGTAAATCC\nProm_Adipoqb_BamHI_Rev ACGTGGATCCTCAAAGAT TCTATATTAGCACAATCAA\nGGGTAAATAAAGA 2010 62\nProm_Cebpa_BamHI_Rev ACGTGGATCCAGCAACCT GTCGTGACTGTG\nNEW3_Fabp11a_SalI_Fwd ACGTGTCGACGTGGTGTT TTGCAGTGGATG\n3.4. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE\nRealizamos la extracción de ADN genómico de 50 embriones (20 mg aproximadamente). Los embriones fueron colectados en tubos Eppendorf a las 48 hpf, retirando el exceso de medio de mantenimiento y congelándolos a - 80 °C hasta ser utilizados. Llevamos a cabo la extracción siguiendo el protocolo descrito en el capítulo 9 del libro “TheZebrafishBook” (54).\nElegimos un protocolo de condiciones suaves con el fin de mantener la integridad del ADN genómico y conservar las regiones promotoras de interés. En primer lugar, añadimos buffer de extracción (10 mM Tris pH 8, 100 mM EDTA pH 8, 0,5 % SDS, 200 g/mL de Proteinasa K (Life, AM2548)) a los embriones previamente homogeneizados utilizando un micro-homogeneizador (micropestle) e incubamos esta solución ON (del inglés Over Night) a 50 °C. Realizamos la extracción de ADN con fenol equilibrado (fenol equilibrado a pH 8 con Tris-HCl y EDTA) centrifugando durante 10 minutos a 5000 g y conservando la fase acuosa. Realizamos este paso dos veces. Posteriormente hicimos una tercera extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) centrifugando por 10 minutos a 5000 g y conservando la fase acuosa a la cual le añadimos NaCl a una concentración final de 200 mM. Luego, precipitamos con dos volúmenes de etanol 96 %. Tras retirar el agente precipitante, lavamos el ADN con etanol 70 %, retiramos el alcohol y dejamos que el remanente se evapore. Finalmente, resuspendimos el ADN en buffer TE (Invitrogen) y determinamos su concentración utilizando un NanoDrop. Conservamos el ADN a 4 °C.\n3.5. CLONADO DE LAS REGIONES PROMOTORAS\nEN VECTOR PCRII-TOPO\nEl clonado de los distintos promotores (fabp11a, c/ebpα, cfd y adipoqb) en el vector pCRII-TOPO se llevó a cabo utilizando el kit de clonado pCRII-TOPO® TA según las instrucciones del proveedor (Invitrogen). Este kit se conforma, entre otros elementos, por un vector abierto con residuos de timidina en los extremos 3’ que permite el clonado rápido y eficiente de cualquier producto de PCR que contenga residuos de adenina en sus extremos. Los pasos a seguir para la generación de construcciones utilizando este kit son: (I) la generación del producto de PCR con los respectivos residuos de adenina, (II) la reacción de ligación entre el producto de PCR y el vector pCRII-TOPO, (III) la transformación de células competentes y (IV) posterior selección, y (V) confirmación de colonias positivas.\n3.5.1. Amplificación de promotores\nPara amplificar las regiones promotoras de interés llevamos a cabo distintas reacciones de PCR estándar (del inglés Polymerase Chain Reaction) con los cebadores específicos mencionados anteriormente.\nUtilizamos la polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion (Finnzymes, F-530S) en reacciones de 50 μL con las siguientes condiciones:\nDesnaturalización inicial 98 °C – 30 s 1 ciclo Desnaturalización 98 °C – 10 s\n30 ciclos Hibridación Indicada anteriormente – 30 s\nExtensión (30 s/kb) 72 °C – 1 min\nExtensión final 72 °C – 10 min 1 ciclo\nFinalmente, visualizamos los productos de PCR en geles de agarosa 0,8 %.\nDado que la enzima Phusion genera productos con extremos romos, realizamos un paso de amplificación con Taq polimerasa para añadir nucleótidos de adenina en los extremos 3` de los productos de PCR y así poder clonar el inserto en el vector pCRII-TOPO.\nLlevamos a cabo la reacción utilizando Taq polimerasa (Invitrogen, EP0402) en un volumen final de 10 l con las siguientes condiciones:\nProducto de PCR 7 l Buffer con MgCl2 1 X\ndATP 0,2 mM\nTaq polimerasa (5U/μl) 5 U\nIncubamos la reacción por 30 minutos a 70 °C.\nBuffer HF 1 X\ndNTPs 200 m c/u\nCebadores 0,5 m c/u Molde (ADN genómico)\n3.5.3. Ligación en el vector pCRII-TOPO\nLa ligación en pCRII-TOPO sucede como consecuencia de la actividad ligasa de la enzima topoisomerasa I que se encuentra unida en cada uno de los grupos fosfato 3’ del vector linealizado. Una vez que el producto de PCR se encuentra dentro del vector, la enzima se libera.\nRealizamos la reacción de ligación utilizando el producto de PCR con los residuos de adenina en sus extremos, la solución salina y el vector contenidos en el kit, de acuerdo a las siguientes especificaciones:\nSal 1 l\nVector 1 l Producto de PCR 4 l\nIncubamos la reacción durante 30 minutos a 37 °C.\n3.5.4. Transformación y selección\nTransformamos la construcción pCRII-TOPO-promotor en células de E.coli competentes NEB 10-ß (NEB, C3019H) a través de shock térmico. Estas células y esta construcción permiten la selección de clones positivos por screening de colonias azules y blancas. Para ello se debe plaquear las células transformadas en un medio que contenga IPTG y X-gal, inductor y sustrato de la enzima ß-galactosidasa cuyo péptido α se encuentra codificado en el vector de clonación. Si el producto de PCR logró clonarse correctamente dentro del vector, sustituirá el gen de ß-galactosidasa y las células no serán capaces de metabolizar X-gal, dando como resultado colonias blancas. En cambio, si la clonación no fue exitosa, se producirá la enzima activa y las colonias serán azules.\nCon el fin de confirmar si las colonias positivas (blancas) contienen efectivamente la construcción correcta, las analizamos a través de digestión enzimática, colony PCR y/o secuenciación.\nPrevio al chequeo, iniciamos cultivos ON de distintas colonias de color blanco en medio LB suplementado con ampicilina (100 g/mL) a 37 °C y 225 rpm. Al día siguiente, purificamos los plásmidos (Minipreps) de los cultivos utilizando el kit “Nucleospin plasmids”\n(MACHEREY-NAGEL) y medimos sus concentraciones con un NanoDrop. Preparamos stock en glicerol 15 % de las colonias positivas y las almacenamos a - 80 °C.\n3.5.4.1. Colony PCR\nCorroboramos que las construcciones pCRII-TOPO-adipoqb y pCRII-TOPO-c/ebpα fueran las correctas a través de un colony PCR a partir de distintas colonias blancas. Realizamos reacciones de PCR de 25 l utilizando Taq polimerasa (Invitrogen, EP0402) según las siguientes condiciones:\nComo cebadores utilizamos los mismos con que amplificamos los promotores a partir del ADN genómico y el molde constó de la resuspensión de cada una de las colonias en 20 l de agua\nDesnaturalización inicial 94 °C – 3 min 1 ciclo Desnaturalización 94 °C – 45 s\n30 ciclos Hibridación\n(adipoqb / c/ebpα)\n56 °C/ 55 °C – 30 s\nExtensión (1 min/kb) 72 °C – 2 min y 30 s\nMantenimiento 4 °C ∞\ndNTPs 200 m c/u Cebadores 0,25 m c/u Molde (ADN) 5 l\nGibco™ (Fisher Scientific). Como control positivo de amplificación realizamos una PCR utilizando como molde ADN genómico y como control negativo utilizamos agua en lugar de ADN. Por último, visualizamos los resultados a través de una electroforesis en gel de agarosa 0,8 % empleando el marcador de peso molecular GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific, SM1331).\n3.5.4.2. Digestión enzimática\nVerificamos las construcciones pCRII-TOPO-fabp11a y pCRII-TOPO-cfd a través de digestión enzimática con EcoRI HF. Con este propósito digerimos 300 ng de ADN a razón de 5-10 U enzimáticas por µg de ADN en buffer CutSmart 1 X (NEB, B7204S). Elegimos esta enzima dado que sus sitios de restricción se encontraban tanto dentro del vector pCRII-TOPO como del inserto (promotor). Incubamos la reacción ON a 37 °C. Finalmente, visualizamos el resultado de la digestión a través de una electroforesis en gel de agarosa 0,8 % empleando el marcador de peso molecular GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific, SM1331). Como control corrimos 300 ng de las mismas Minipreps sin digerir.\n3.6. SUBCLONADO DE PROMOTORES EN VECTOR\nUna vez clonados los promotores dentro del vector pCRII-TOPO, fue necesario subclonar cada uno de los insertos en el vector p5E-MCS como paso previo para la generación de los vectores de transgénesis. El p5E-MCS es parte del kit Tol2, tiene resistencia a kanamicina y presenta un sitio múltiple de clonado.\n3.6.1. Liberación del inserto del vector pCRII-TOPO y digestión del\nComo paso previo a la subclonación, liberamos cada uno de los promotores del vector pCRII-TOPO mediante digestión enzimática (ver sección 3.5.4.2), excepto en el caso de fabp11a\nque se menciona más adelante en esta sección. Para ello, digerimos 3 g de cada construcción. Como ya fue mencionado (sección 3.3), los sitios de restricción fueron adicionados a la secuencia de los promotores a través de los cebadores utilizados para amplificarlos en primera instancia.\nPromotor Enzimas de restricción utilizadas\nCompañía y código\nadipoqb XhoI /BamHI Roche, 10899194001/ Fermentas, ER0051\nSalI HF/BamHI HF NEB, R3138/ R31365\ncfd XhoI /BamHI HF Roche, 10899194001 / NEB R31365\nA excepción de la sección 3.5.4.2, en el caso de adipoqb utilizamos el buffer BamHI 1 X. Como paso siguiente, realizamos una corrida electroforética en gel de agarosa 0,8 % con el fin de purificar el inserto liberado. Recortamos la banda correspondiente al tamaño de cada inserto bajo luz ultravioleta utilizando un bisturí estéril, y purificamos el ADN utilizando el kit “Nucleospin Gel and PCR Clean up” (MERECHEY-NAGEL). A diferencia de los demás\ntres reacciones de digestión del vector p5E-MCS (3 g) con las mismas enzimas de restricción y condiciones utilizadas para liberar los distintos insertos del vector pCRII-TOPO. De esta manera, logramos que se generen los mismos cortes en el inserto y vector permitiendo que ambas moléculas de ADN se liguen.\nEs necesario aclarar que la secuencia del cebador forward para amplificar el promotor de cfd\ntiene un error en el sitio de restricción que hizo que no fuera posible digerir la construcción pCRII-TOPO-cfd con KpnI. En su lugar, digerimos el plásmido con XhoI. La ubicación del sitio de restricción de esta enzima en el vector pCRII-TOPO y p5E-MCS permitieron insertar direccionalmente al promotor de cfd dentro de este último. Como consecuencia se adicionaron 40 pb extra pertenecientes al vector pCRII-TOPO dentro del vector p5E-MCS.\nPrevio a la reacción de ligación, tratamos el vector p5E-MCS digerido con fosfatasa alcalina (Thermo Scientific, EF0654) con el fin de evitar la religación del mismo. La reacción constó de:\nADN (p5E-promotor) 3 g\nBuffer Fast AP 1 X\nFosfatasa alcalina “Fast AP” 3 U\nIncubamos la reacción durante 30 minutos a 37 °C e inactivamos la enzima a 75 °C durante 5 minutos. Finalizamos con la purificación del vector empleando el kit “Nucleospin Gel and PCR Clean up” (MERECHEY-NAGEL) y medimos su concentración utilizando el NanoDrop.\n3.6.2. Ligación de promotores con vector p5E-MCS\n3.6.3. Transformación en bacterias competentes\nTransformamos cada una de las construcciones y controles de ligación en bacterias E.coli\ncompetentes NEB 5-alpha (NEB, C2987H) a través del método de shock térmico. Las condiciones de transformación son las mismas que las descritas para las construcciones del vector pCRII-TOPO a excepción de que, en este caso, las bacterias son plaqueadas en LB agar suplementado con kanamicina (50 g/mL) para su selección.\nAl igual que las construcciones generadas con el kit TOPO® TA, corroboramos que cada uno de los vectores plasmídicos generados contuviera el promotor correctamente clonado. Esto lo confirmamos a través de digestión con enzimas de restricción, colony PCR y/o secuenciación.\nEn el caso de las construcciones p5E-adipoqb, p5E-c/ebpα y p5E-fabp11a realizamos tanto una digestión enzimática como colony PCR, y en el caso de p5E-cfd solamente verificamos a través de digestión enzimática. Realizamos ambas técnicas según las indicaciones descritas en las secciones 3.5.4.1 y 3.5.4.2.\nLas enzimas de restricción utilizadas para la digestión de cada vector se muestran en la siguiente tabla:\nVector Enzimas de restricción utilizadas\np5E-adipoqb BamHI FD /KpnI FD Thermo Scientific, FD0054/FD0523 p5E-c/ebpα ASisI FD/KpnI FD Thermo Scientific, FD2094/FD0524 P5E-fabp11a PvuII HF NEB, R3151S\np5E-cfd EcoRI HF NEB, R31015\nEn el caso de las enzimas Fast Digest (FD), utilizamos 1 l por cada g de ADN y utilizamos el buffer FD 1 X (Thermo, Scientific, B64).\n3.7. GENERACIÓN DEL VECTOR DE\nEl kit Tol2 es una colección de plásmidos que permite la generación de construcciones por medio de recombinaciones basadas en el sistema Gateway (Figura 6) (56). Este kit se conforma por cuatro tipos de vectores (Destination Vector, 5 ́Entry, Middle-entry y 3 ́Entry) cada uno de ellos con sitios de recombinación específicos, que permiten el ensamblaje modular y direccional de forma eficiente. Luego de la reacción de recombinación, la construcción de transgénesis se recupera por transformación y selección utilizando ampicilina.\nFigura 6. Kit Tol2.\nNosotros utilizamos este sistema para crear cinco construcciones:\n1 pDestTol2_adipoqb:EGFP-CAAX_pA 2 pDestTol2CG2_adipoqb:EGFP-CAAX_pA 3 pDestTol2CG2_c/ebpα:EGFP-CAAX_pA 4 pDestTol2CG2_fabp11a:EGFP-CAAX_pA 5 pDestTol2CG2_cfd:EGFP-CAAX_pA\nPara la generación de las construcciones 2 - 5 utilizamos los vectores pDestTol2CG2, p5E-MCS conteniendo la secuencia de cada uno de los promotores, pME-EGFP-CAAX y p3E-polyA, mientras que en el vector número 1 el plásmido destino que utilizamos fue el pDestTol2pA2. La diferencia principal entre ambos vectores destino radica en que pDestTol2CG2 además de contener todos los elementos de pDestTol2pA2, también contiene la secuencia codificante para EGFP bajo la regulación del promotor de miosina cardíaca cmlc2\nque permite la selección temprana (24 hpf) de animales que hayan adquirido la construcción.\nPara generar estas construcciones seguimos las instrucciones descritas en la página web del kit (57). Las reacciones de recombinación constaron de:\nVectores 20 fmol c/u\nBuffer TE 1 X\nEnzima LR Clonase Plus II (Invitrogen) 0,25 m c/u\nIncubamos la reacción a 25 °C ON. Al otro día la finalizamos adicionando 1 l de Proteinasa K (Life, AM2548) e incubando 10 minutos a 37 °C. Una vez finalizada la reacción, transformamos bacterias E.coli competentes NEB ß-10 (NEB, C3019H) con cada construcción a través del método de shock térmico. El procedimiento fue el mismo utilizado para la transformación de las construcciones generadas con el vector pCRII-TOPO, con la excepción de que en este caso transformamos directamente con 3 l de reacción sin diluir y el tiempo de recuperación de las bacterias en medio SOC fue de 1 hora y media. Finalmente, plaqueamos a las bacterias en medio LB agar suplementado con ampicilina (100 g/mL) y las cultivamos ON en estufa a 37 °C.\nPara identificar colonias transformadas con la construcción de transgénesis correcta realizamos Minipreps utilizando el kit “Nucleospin plasmids” (MACHEREY-NAGEL) y\nque digirieran tanto el vector como el promotor. Las reacciones se llevaron a cabo al igual que en la sección 3.6.3 previamente descrita. Las enzimas utilizadas se describen en la siguiente tabla:\nConstrucción de transgénesis Enzimas de restricción utilizadas\npDestTol2_adipoQb:EGFP-CAAX_pA NotI HF NEB, R31895\npDestTol2CG2_adipoQb:EGFP-CAAX_pA NotI HF/EcoRI HF\npDestTol2CG2_cfd:EGFP-CAAX_pA NotI HF/EcoRI HF\npDestTol2CG2_fabp11a:EGFP-CAAX_pA PvuII HF NEB, R3151S\npDestTol2CG2_c/ebpα:EGFP-CAAX_pA BglI FD y SacI Fermentas,FD0083/ Invitrogen,15240201\nPara el caso de SacI utilizamos el buffer L (Invitrogen, 15241) 1X. Finalmente, los clones positivos fueron almacenados en glicerol 15 % a - 80 °C.\n3.8. CRÍA Y MANTENIMIENTO DE PEZ CEBRA\nEn este trabajo utilizamos como modelo experimental el pez cebra (Danio rerio), específicamente la línea salvaje TAB-5 y la línea transgénica tg (actb2:Arl13b-GFP) hsc5 (de ahora en más mencionada como Arl13b-GFP) que expresa la proteína de fusión Arl13b-GFP bajo el control transcripcional de la región promotora del gen bactin2, codificante para β-actina\nLa cría de pez cebra comprende tres etapas: (I) el mantenimiento de embriones en placas de 10 cm hasta los 5 dpf, (II) crecimiento de larvas en recipientes con agua estática hasta los 9 dpf y (III) traspaso de larvas al sistema de acuario. Durante la primera etapa mantuvimos los embriones en estufa a 28 °C en placas de 10 cm con agua de acuario suplementada con 0,0001% de Azul de Metileno durante 5 días. Entre las 10-28 horas post fecundación desinfectamos los embriones en un proceso conocido como “bleaching”. Este proceso es\nA los 5 dpf, traspasamos las larvas a recipientes con 1 cm de agua aproximadamente que recambiamos a diario. Durante este período, alimentamos las larvas con espirulina (Zeigler, Larval AP100 tamaño de micropartícula < 50 m) y larvas nauplio de Artemia salina de 24 horas post-eclosión (en adelante, Artemia), tres veces al día. Finalmente, a los 9 dpf trasladamos las larvas al sistema de acuario. A partir de este momento y hasta el mes post fecundación, alimentamos a las larvas con espirulina, Artemia y Golden Pearl Reef and Larval\nFish (Brine Shrimp Direct, tamaño de micropartícula 100-200 m) de dos a tres veces por día.\nMantuvimos las larvas hasta estadio de adultos en el sistema ZebTec Stand Alone o Active Blue de Tecniplast (Italia), con el agua a 28 °C (máximo 30 °C, mínimo 26 °C), conductividad de 500 S/cm2 (máximo 600 S/cm2, mínimo 400 S/cm2) y pH 7.5 (máximo 8.5, mínimo 6.5). También controlamos la concentración de NH3/NH4+ (máximo 0.5 ppm), NO\n3.9. GENERACIÓN DE LÍNEAS TRANSGÉNICAS\n3.9.1. Microinyección de embriones\nColocamos los embriones a ser inyectados en el ángulo generado por un portaobjetos en la tapa de una placa de 10 cm manteniendo una mínima cantidad de agua. Para realizar la microinyección utilizamos agujas estiradas en un puller sutter (P- 97) a partir de capilares de borosilicato con filamento (WPI #1B100F-4), micromanipulador y un microinyector neumático, utilizando aire comprimido a aproximadamente 50 psi (ASI, modelo MPPI-3). Coinyectamos 0,5 nl de las construcciones de transgénesis generadas y ARNm codificante para la enzima transposasa en el citoplasma de embriones en estadio de una o dos células. La síntesis de ARNm fue llevada a cabo utilizando el kit mMessage mMachine (Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del proveedor. Luego de la síntesis purificamos el ARNm utilizando columnas G-50 (GE, 27-5330-01). Mantuvimos los embriones en placas de 10 cm con medio de mantenimiento (0,0001% de Azul de Metileno en agua de acuario) en estufa a 28 °C.\n3.9.2. Selección de embriones inyectados y larvas con patrones\nfluorescentes de interés\n3.9.2.1. Observación in vivo\nObservamos los embriones y larvas en distintos estadios de su desarrollo durante un período de 27 dpf aproximadamente. Durante este período se espera que las larvas desarrollen TA y continúen siendo transparentes. Para observar las larvas, las anestesiamos previamente con 0,004 % tricaína (MS222) (Sigma, A5040) y luego las montamos en metilcelulosa 3 % (Sigma, M0387). Aquellas larvas con expresión de GFP en zonas donde se esperaba la aparición de TA las mantuvimos en el sistema hasta su adultez.\n3.10. ANÁLISIS Y VERIFICACIÓN DE LOS\nEl análisis de los diferentes patrones de expresión fue realizado tanto por medio de observaciones in vivo (mencionado anteriormente) como en individuos fijados. La fijación de embriones y larvas fue llevada a cabo en 4 % PFA/PBS a 4 °C ON. Luego de este lapso, realizamos tres lavados en PBS-T (PBS 1X, 1% Triton X-100) con agitación a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno.\nLos protocolos de permeabilización utilizados difirieron dependiendo del estadio de los peces. Para embriones (hasta 5 dpf) utilizamos el protocolo de permeabilización con tripsina - adaptación de “Whole-mount inmunofluorescence of Zebrafish embryos” - Flavio Zolessi (protocolo I)(59), y para larvas (6-16 dpf) probamos una variación del protocolo anteriormente mencionado y “General Whole-mount Inmunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol” (protocolo II) (60).\nProtocolo I. Tras un lavado con PBS-T permeabilizamos los embriones con 0,25 % tripsina-EDTA en hielo. El tiempo de permeabilización varía según el estadio del animal, siendo de 5, 15 y 30 minutos para embriones de 24, 48, 72 hpf respectivamente y 45 minutos para larvas. Una vez permeabilizadas las muestras, lavamos con PBS-T en hielo durante 10 minutos.\nconcentración a menor concentración de metanol. Posteriormente, tras realizar tres lavados de 5 minutos con PBS-T (PBS 1X, 1% Triton X-100) recuperamos el antígeno lavando durante 5 minutos y luego incubando las larvas/embriones con buffer Tris (150 mM Tris-HCl, pH 9) a 70 °C durante 15 minutos. Completamos la permeabilización incubando las larvas tres veces con agua destilada durante 5 minutos en hielo, seguido del agente permeabilizante (acetona a -20 °C o tripsina) y otra incubación con agua destilada durante 5 minutos. Posteriormente realizamos dos lavados de 5 minutos cada uno con PBS-T a temperatura ambiente.\nEn ambos protocolos, como control de tinción inespecífica de anticuerpo secundario, incubamos las mismas muestras solamente con anticuerpo secundario.\n3.10.3. Montaje de embriones y larvas\nPor último, previo al montaje incubamos las larvas/embriones en medio de montaje (Glicerol 75 %/Tris-HCl 0,1 M pH 8) al menos durante 20 minutos a 4 °C. Montamos las larvas/embriones en una cámara casera creada a partir de un portaobjeto, cinta aisladora y cubreobjetos (Figura 7). Utilizamos agarosa de bajo punto de fusión para posicionar los peces, los recubrimos con medio de montaje, colocamos el portaobjetos por encima y sellamos. A la hora de montar embriones procuramos quitarle la mayor cantidad de vitelo posible, ya que éste interfiere con la toma y procesamiento de imágenes.\nFigura 7. Montaje de larvas y embriones de pez cebra para inmunofluorescencia.\n3.10.4. Criocortes e Inmunofluorescencia\nLos embriones tempranos de pez cebra (hasta las 24 hpf) son transparentes. A medida que avanza el desarrollo van adquiriendo pigmentación además de que el espesor de los individuos aumenta. Esto dificulta el análisis de individuos in toto por medio de microscopía. Es por ello, que para el estudio de animales mayores a 16 dpf acudimos a realizar secciones histológicas (criocortes) y realizamos inmunofluorescencia sobre ellas. Para realizar los criocortes, incluimos las larvas fijadas en Tissue-Tek® OCT (del inglés optimum cutting temperature) o gelatina (SERVA – 22151). Ambos protocolos de inclusión incluyen un paso de fijación previa con 4 % PFA/PBS a 4 °C ON.\n3.10.4.1. Inclusión en OCT\nPara incluir los peces en OCT utilizamos dos protocolos distintos: Wittbrodt e Inoue (61) y otro utilizado por UCL (University College London) (62).\nSiguiendo el protocolo descrito por UCL, incubamos los peces en un gradiente de sacarosa 10 % a 4 °C ON y posteriormente realizamos lo mismo en sacarosa 20 %.\n3.10.4.2. Inclusión en gelatina\nPara la inclusión de larvas en gelatina primero las crioprotegimos en una solución de 5 % sacarosa/PBS a 4 °C en un tubo Falcon hasta que la solución infiltró (los peces decantan). Luego, los transferimos a una solución 20 % sacarosa/PBS ON a 4 °C. Precalentamos esta última solución con los peces a 38 °C y los transferimos a una solución de gelatina 7,5 % (p/v) en 15 % sacarosa/PBS con azida de sodio 0,02 % a la misma temperatura ON. Previo a esto realizamos una incisión en la cola de los peces con bisturí estéril para mejorar la infiltración de la solución de gelatina. Finalmente, colocamos la solución de gelatina con las larvas en placas de 6 cm hasta que solidificó, procurando posicionar al pez de forma adecuada con ayuda de tips. Conservamos los peces a 4 °C hasta su uso.\nFinalmente, en ambos casos tras procesar las muestras las congelamos de forma indirecta utilizando nitrógeno líquido. Asimismo, realizamos cortes en criostato de entre 10-20 m de espesor entre - 25 °C y - 30 °C, que colocamos en portaobjetos cubiertos con gelatina.\n3.10.4.3. Inmunofluorescencia en criocortes\nPara la inmunofluorescencia procedimos de igual forma independientemente del medio de inclusión de los peces. Previo al comienzo, es recomendable señalar la posición de los cortes con un marcador permanente, dado que durante el procesamiento las muestras se vuelven transparentes.\nla unión inespecífica de anticuerpo secundario sustituyendo la incubación con anticuerpo primario por una incubación con solución de bloqueo.\nLos anticuerpos que utilizamos así́ como las tinciones secundarias y las diluciones de trabajo para ambos tipos de inmunofluorescencia fueron los siguientes:\nMarcador Compañía y número\nDilución de trabajo Inmunofluorescencia\nDilución de trabajo Inmunofluorescencia en criocortes\nAnti-p-Histona H3 Santa Cruz\n(sc-8656-R) 1/300 1/500\nAnti-tubulina acetilada Sigma (T7451) 1/750\nAnti-GFP Invitrogen (A11122) 1/500 1/100, 1/500\nDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB-GFP-12E6)\nAnti-C/ebpα Abcam (ab140479) 1/200, 1/400 1/500, 1/250 Anti-IgG1 ratón-488 Invitrogen (A21121) 1/1000 1/1000\nAnti-igG conejo- TMR Invitrogen (T2769) 1/1000\nAnti-IgG2b ratón-568 Invitrogen (A21144) 1/1000\nAnti-IgG conejo-647 Invitrogen (A31573) 1/1000 1/1000 Anti-IgG conejo-488 Invitrogen (A21202) 1/1000 1/1000\nVerde de metilo (63) 1/2000 1/2000\nFaloidina-TRITC Sigma (P1951) 1/100 1/500\nDAPI Invitrogen (D1306) 1/2500\n3.10.5. Observación de embriones y cortes\na cada situación. El procesamiento de imágenes lo realizamos con el software Fiji versión 2.0.0 (64).\n3.11. TINCIÓN CON NILE RED\nPara observar los depósitos de lípidos neutros utilizamos la tinción lipofílica Nile Red. Como primer paso, lavamos los peces con agua del sistema. Luego los incubamos en agua de acuario suplementada con 0,5 g/mL de Nile Red (Sigma, 72485) durante dos horas. Es recomendable no alimentar a los peces la noche anterior para que la fluorescencia del alimento no interfiera con la de Nile Red.\nPrevio a la observación de los peces bajo la lupa con el filtro Endow GFP Bandpass, los tratamos con epinefrina que contrae los melanocitos de los peces adultos, mitigando en parte la interferencia de la pigmentación. Para ello, incubamos a los peces durante 5 minutos en una solución de agua de acuario con 10 mg/mL epinefrina (Sigma, E4375). Finalmente, observamos los peces bajo la lupa utilizando metilcelulosa 3 %.\n3.12.1 Preparación de muestras para Western blot\nEs necesario aclarar que las muestras utilizadas para llevar a cabo el Western blot ya estaban preparadas en el laboratorio.\nExtracción de proteínas total de pez cebra de 30 hpf: la extracción de proteínas fue llevada a cabo utilizando el protocolo Western Blots of Zebrafish Embryos en el libro The Zebrafish Book (65). Como primer paso se decorionaron los embriones de forma manual. Como paso siguiente, extrajeron el vitelo de los embriones de forma mecánica pasándolos por una pipeta Pasteur estirada en solución de Ringer fría suplementada con 1 mM EDTA y 0,3 mM PMSF. Luego, se lavaron los embriones dos veces en solución de Ringer, se transfirieron a un tubo Eppendorf retirando la mayor cantidad de líquido posible y se congelaron utilizando nitrógeno líquido por 5 minutos conservándolos a – 80 °C. Para la preparación de la muestra se centrifugaron los embriones, se retiró el exceso de líquido y se adicionó buffer de muestra para SDS-PAGE. Luego, se homogeneizó la muestra de forma mecánica hasta lograr una consistencia uniforme y se hirvió durante 5 minutos en un baño de agua. Finalmente, se centrifugó la muestra durante 1- 2 minutos y transfirieron el sobrenadante a un nuevo tubo. Esto es lo que finalmente cargamos en el gel.\nDescargar (PDF - 144 página - 5.25MB)\nRelated subjects : Pez cebra Tejido adiposo blanco Tejido adiposo blanco (TAB)\nRol de los receptores Cxcr2 y Gcsfr en la migración de neutrófilos desde el teji...\nMicrosoft Word Tesis KBT apagñon nov 27 CGF docx Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Biológicas Escuela de Ingeniería en Biotecnología “Rol de los receptores Cxcr2 y Gcsfr en la\nTítuloToxicidad de nanotransportadores basados en ácido hialurónico en embriones...\nToxicidad de nanotransportadores basados en ?cido hialur?nico en embriones de pez cebra 1 Toxicidad de nanotransportadores basados en ?cido hialur?nico en embriones de pez cebra Toxicidade de\nde científicos que quisieron favorecer el uso de Danio rerio como organismo biológico y modelo para investigaciones científicas (especialmente las biomédicas).La recomendación para\nEn relación a la frecuencia de inducción de micronú- cleos en células branquiales, al final de los 180 días en el control negativo hubo una generación espontánea de 0,8\nA las concentraciones de 100 y 1000 µg/l de BPA, observamos un gran aumento del porcentaje de folículos atrésicos con respecto al control, estando la atresia por encima del 10% del\nEl presente trabajo de tesis se inscribe en una línea de investigación desarrollada en el Grupo SINPOS del Departamento de Morfología y Biología Celular de la Universidad de Oviedo, en\nEl mercado del Pez Espada en España PEZ ESPADA\nEn el año 2015, la exportación de la presentación “filetes y carnes de pez espada fresco o refrigerado” va destinada casi en un 98% a la Unión Europea, entre los países\nAgente anticancerígeno inhibe la división celular en embriones de pez cebra\nEs ampliamente usado en estudios de procesos dependientes de microtúbulos por que posee habilidad de despolimerizar rápidamente microtúbulos en diversos sistemas, por lo\nNosotros experimentamos con larvas de pez cebra a las cuales previamente se les decoreono o sea se les retiro el corion, por lo cual estuvieron en contacto directo con\nTítuloEstudio inmunohistoquímico de la expresión de Met/Leu encefalina en el enc...\nTítuloEstudio neuroanatómico de la región preóptica en el pez cebra\nPROYECTO ALAS DEL PEZ\nCONCENTRACIONES DE ARSÉNICO EN AGUA POTABLE Y SUS IMPLICACIONES DE BIOACUMULACIÓ...


Pisos y apartamentos en alquiler (CP 35210) (1 Inmuebles)\nCOVID-19: Lo + importante es tu seguridad; por eso, hemos desarrollado un nuevo protocolo de visita para todas nuestras propiedades que incluye material de protección individual. Por favor, pregunta a tu agente de confianza. LA HERRADURA (TELDE). - Se alquila piso en el barrio de La herradura. Zona tranquila pero con todos los servicios a su alcance: supermercados, farmacias, panaderias etc. La vivienda se encuentra en un edificio muy tranquilo....


Hardaware: sistemas de movimiento de cortinas y suministros de teatro y eventos\nShowTex presenta la última tecnología en sistemas de movimiento de cortinas. Nuestra gama incluye railes para telones de todos los gramajes, sistemas de caída de kabuki, "roll ups", soluciones económicas y sistemas de revelado para presentaciones de producto.\nDesde remates para cortinas a abrazaderas y sistemas de tensado de telas. Nuestra guía de accesorios es un gran recurso para su taller de escenografía, costura o producción y está repleta de componentes esenciales que no deben faltar en la caja de herramientas de tu equipo de instalación.\nLos raíles para telones están fabricados a partir de la experiencia y los encargos a medida. Los raíles para telones de todos los gramajes, pueden ser hechos a medida y curvados según sus necesidades.\nLa apertura de telones se ha vuelto más emocionante con los controles de apertura de ShowTex. Los motores del rail son esenciales en el escenario para un movimiento preciso de la cortina durante un espectáculo en directo.\nDesde el Kabuki de ShowTex, al sistema roll up más rápido, el HiSpeed Roll Up. Crear un elemento sorpresa en el escenario o desplegar, bajar telones y pantallas nunca ha sido tan fácil.\nUsa nuestro sistema EasyDrape, fácil de manejar, basado en el sistema pipe&base para un montaje rápido de paredes efímeras en cualquier forma o empieza a utilizar nuestro sistema de cerramiento revolucionario de AV Drop.


sesión 4. vamos a jugar con los papeles de acuarela. – acuarelasbarlo\n17 enero, 2022 admin Comentarios 0 comentarios\nLapiceros normales de grafito: 1 muy blando de dureza B y 1 blando de dureza 2H.\nGoma de borrar tipo staedtler. Un pincel para retirar las virutas de goma.\nUtilizar papel para acuarelas de 240 grs ó 370 grs para que no se nos arrugue al recibir las acuarelas.\nY nuestros 3 colores primarios azul cerúleo, carmín alizarina y amarillo, también los 3 colores secundarios y los otros colores compuestos en nuestra paleta.\nRecordad siempre debemos disolver las acuarelas con agua limpia.\nDivertiros ahora mezclando primarios con secundarios y haced terciarios\nConseguimos los colores secundarios mezclando los primarios adyacentes. Ahora que ya tenéis los secundarios, cogéis por ejemplo amarillo y ponéis dos cantidades entre el amarillo el secundario rojo-anaranjado, luego ponéis una cantidad entre el amarillo y el secundario verde (poned las dos cantidades hacia el centro del plato). Limpiáis el pincel y cogéis otro color por ejemplo rojo.\nPero es muy importante que cada vez que cambiéis de color tanto sean primarios, como secundarios o terciarios siempre limpiéis el pincel para que vuestros colores sean limpios y transparentes que es la característica de la pintura de acuarela. El color blanco en la acuarela es el papel, (es la ausencia de color) no pintamos el espacio que queremos dejar en blanco.\nAprovechad los colores creados en la sesión anterior\nRecordad disolver siempre las acuarelas con agua limpia.\nPara la aplicación de las acuarelas os propongo el dibujo del gnomo, el farolillo, el tarro de lapiceros y la manzana. Haced el dibujo que os guste y que queráis hacerlo en acuarelas. Es un paso más hacia el aprendizaje de la técnica.\nProcedimiento sencillo cuando no tenemos mucha soltura en realizar los dibujos directamente sobre el papel de acuarela:\n“en la ventana”, le damos la vuelta al dibujo y apoyándolo en la ventana remarcamos el dibujo con el lápiz más blando o carboncillo.\n“remarcamos lo que nos interesa”. Volvemos a darle la vuelta y ahora sobre el papel remarcamos los trazos del dibujo que queremos estén en nuestra acuarela.\n“comprobando lo que vamos pasando” nos permite valorar si cambiamos alguna figura o elementos del dibujo previo.\n“en el papel”, ya tenemos el dibujo en el papel de acuarela.\nAhora a pintar con vuestras acuarelas, toda acuarela que hagáis es buena para ir progresando, lo importante es no desanimarse nunca, los principios son difíciles pero este dibujo está a vuestro alcance con todo lo que habéis aprendido hasta ahora.\ny recuerda algo muy importante aprenderemos paso a paso… y sobre todo, no dejes de practicar un poco cada día.\nTécnica que es importante conocer.- Como preparar el papel de acuarela para que soporte mayor cantidad de agua. De esta forma al haber estado empapado, se arrugará menos cuando apliques las acuarelas.\nPracticarlo porque en la sesión 5 será muy importante conocer este proceso\nTodas las sesiones del curso de #barlo “navegan libremente en internet” en dos sitios web:\ncomo siempre el curso es gratuito, como hasta ahora han sido todos los cursos de acuarelasbarlo. Si tuvieseis algún problema para acceder al curso o alguna duda puedo ayudaros más directamente, enviadme un correo a:\njoaquinbarlo@gmail.com y me comprometo a contestaros en el menor tiempo posible.\nSesión 05, … nuestra primera acuarela personal.\n30 enero/ 2022\n… aprovecha cualquier ocasión…\nTotal visitantes: 4.260


Las instituciones desarrollan acciones en los municipios afectados por el huracán Eta.\nLa vicepresidenta compañera Rosario Murillo, hizo un llamado a las familias nicaragüenses a permanecer vigilantes y alertas ante la continuidad de las lluvias en el territorio nacional.\n“Queremos seguir compañeros insistiendo en la importancia de continuar vigilantes con las lluvias. Debemos seguir vigilantes, debemos mantener la alerta y cuidarnos y protegernos como sabemos hacerlo”, indicó este mediodía.\nLa compañera Rosario Murillo también informó que en algunos lugares afectados por Eta, las familias están regresando a sus viviendas luego de haber permanecido bajo resguardo en centros de albergue.\n“Estamos en algunos lugares ya empezando el retorno, ya en condiciones seguras, de familias a sus hogares en el Triángulo Minero, en las comunidades allá cerca de Bilwi. Y bueno sabemos que hay destrozos, lo importante ha sido que hemos tenido la capacidad como pueblo organizado, que ha aprendido, porque hemos aprendido las familias nicaragüenses, hemos tenido la capacidad de protegernos y de salvar vidas, de ir a familias a casas de familias o a las escuelas o a las iglesias que nos han abierto sus puertas en todas las zonas de peligro, a las casas comunales y a los refugios, hemos acudido con disciplina y con confianza. Esa es la mejor demostración de cómo hemos crecido en una cultura de prevención, de cuido, de protección de nuestras vidas”, indicó.\n“Sabemos que debemos permanecer vigilantes todavía. Porque bueno está la lluvia, están las incidencias, están las influencias que permanecen después de estos fenómenos y sobre todo la preocupación que mantenemos por la saturación del suelo, de los suelos, las incidencias, la humedad excesiva, la tierra empapada y todo eso puede significar deslaves, puede significar deslizamientos y tragedias. Gracias a Dios que en esos mapas de riesgo tenemos identificados esos puntos, los puntos críticos les llamamos, los puntos vulnerables. Y ahí vamos a hablar, a platicar, a visitar y a movilizar a las familias en cuanto se vuelve urgente y necesario”, agregó.\nInformó que “no podemos pasar en este momento por el río Wawa, pero estamos preparándonos, tenemos los planes techos para ir a entregar a las familias que perdieron parte de sus viviendas”.\n“Hemos visto las tomas, hemos visto las fotos en las comunidades del Caribe Norte y de las Minas, también de Nueva Segovia, porque también en algunas zonas de Nueva Segovia se afectaron, subieron los ríos. Precisamente aquí también el Ministerio de Salud nos informa que hemos estado cubriendo, cubriendo esas zonas también de riesgo”, expuso.\nNacieron gemelitas de madre hondureña\nLa compañera Rosario Murillo, hizo referencia a que una madre hondureña dio a luz a gemelitas en nuestro país.\n“Incluso ayer se dio otro nacimiento, pero esta vez fue de unas gemelitas, niñas, que llegaron porque el embarazo o el parto iba a ser de alto riesgo, desde Los Trojes, en el departamento del Paraíso en Honduras, fronterizo con los municipios de Nueva Segovia. Llegó la madre Griselda González Domínguez. Y hubo que hacer cesárea, venían las dos muchachitas que nacieron, aquí pone el Ministerio de Salud, ambas con llanto vigoroso. Otra muestra, otra señal poderosa de vida y milagros. Y en este caso también otra señal poderosa de hermandad entre nuestros pueblos centroamericanos”, comentó.\nInformes de Ineter y Sinapred\nLa vicemandataria presentó los informes del Ineter y Sinapred sobre la situación.\n“El Ineter nos informa que hay abundante humedad y lluvias ligeras en Matagalpa, Jinotega, Madriz, Estelí y Nueva Segovia. Y que se recomienda vigilar cercanamente el istmo de Rivas, incluyendo Cárdenas y también Chinandega”, dijo.\n“Desde el Sinapred nos reporta el doctor González todas las videoconferencias que continúa realizando en todo el país. Aquí también tenemos que reseñar la frenética actividad de todas las brigadas de limpieza de todas las instituciones de los comunitarios, las brigadas comunitarias en Las Minas, en Bilwi y en las comunidades aledañas, el respaldo y el apoyo permanente en esa unión pueblo policía, ejército, gobernación, alcaldías”, comentó.\nOtros informes de instituciones\nEn relación a otras acciones que las instituciones desarrollan en los municipios afectados por el huracán Eta, se dio a conocer detalles del trabajo de Enatrel\n“A retornado también la energía eléctrica en la mitad de Bilwi y en Waspam el huracán gracias a Dios fue benévolo y ya gracias a Dios las familias retornando a sus hogares, las que ameritaron ponerse a resguardo saliendo precisamente de los lugares seguros iglesias, escuelas, esta mañana comenzaron a retornar a sus casas”, indicó.\nTambién informó que está concluyendo tarea de escombreo en centros urbanos de Prinzapolka, Rosita, Siuna y Bonanza.\n“Se llevó más avituallamento de lo que teníamos ya allá porque uno: hay una reserva allá y dos: enviamos más en los días previos al fenómeno y pudimos cubrir a las familias albergadas, aunque todavía tenemos 3 mil 200 personas en 25 albergues que hoy iban las personas trasladarse, los albergues a desocuparse en el municipio de Prinzapolka”, detalló.\nAgregó que “en San José de Bocay y Wiwilí, las familias movilizadas están retornando, esperábamos la salida del fenómeno por ese punto y tomamos todas las medidas de protección”.\nEn este punto resaltó que en Honduras, en El Salvador y en Guatemala, están viviendo estas circunstancias difíciles y nosotros siempre solidarios con los hermanos Centroamericanos.\nHizo mención de que los ríos están empezando a bajar de nivel, sin embargo se denen mantener los cuidados orientados.\nComentó que el MTI “nos reporta todo el trabajo que está haciendo restableciendo el tránsito en toda la Región Autónoma. Se ha restablecido ya en la Costa Caribe Norte, del triángulo minero, y falta por supuesto que bajen los niveles del caudal del río Wawa”.\nPor parte del Minsa destacó “todo el plan y las acciones desarrolladas en todo el país atendiendo a hermanos, hermanas en Nueva Segovia, Managua, Jinotega, Las Minas y el Caribe Sur”.\nPrecisó que en Managua, en el municipio de San Rafael del Sur, con el apoyo del ejército se evacuó a familias que estaban en peligro cerca de uno de los ríos.\nDesde Telcor informó que hay servicio de telecomunicaciones en 39 de los puntos afectados. Y destacó que el 60% de la población de Bilwi ya tienen restablecido el servicio de la energía.\n"Obra gigantesca también. Y todos los compañeros que están ahí trabajando duro, como merece nuestro pueblo, junto a nuestro pueblo, trabajando sin descanso, para eso somos gobierno, para eso fue electo nuestro comandante Daniel para servir a nuestro pueblo como corresponde en todo momento”, valoró.\nAdemás, refirió que las alcaldías reportan que están sus trabajadores, de los lugares afectados, apoyando en todo, puestos de mando, funcionamiento de albergues, traslado de familias, escombreo, limpieza y destacan la labor del ejército de Nicaragua, Policía Nacional, Bomberos Unificados, Ministerio de Gobernación, el MTI, el Minsa.\n“Ya dijimos: pueblo, policía, ejército, gobierno, gobierno local, gobierno nacional, unidad, garantía de las victorias”.\nEn el caso de Enacal, indicó que está trabajando en la rehabilitación de los sistemas de agua potable en todas partes.\nEl Invur presentó un informe preliminar en el que contabiliza 1 mil viviendas afectadas, sin embargo aclaró que el lunes se tendrán datos completos.\nEl Nuevo Fise está trabajando con todos los temas de agua y saneamiento para el campo.\nMientras que Inafor y Marena se empeñan en la protección de nuestra naturaleza. “Tenemos más de 300 observadores ambientales que trabajan con el Marena desde las reservas silvestres, los zoocriaderos y al día de hoy no reportan graves daños en esas preciosas reservas naturales”, dijo la compañera Rosario Murillo.


Hombre critica la religión y se encuentra recluido en Egipto | Derechos Ahora\n« Una epidemia de tortura en México\nLa República Dominicana tiene una oportunidad para despenalizar el aborto »\nHombre critica la religión y se encuentra recluido en Egipto\nEgipto | Publicado por: Editores, October 17, 2012 a las 9:21 AM\nLas autoridades egipcias deben poner en libertad inmediatamente al hombre enjuiciado por publicar unos vídeos en los que se critican las religiones y retirar todos los cargos formulados contra él.\n“La crítica de las religiones y de otras creencias e ideas es un elemento vital del derecho a la libertad de expresión. Las leyes que, como las leyes sobre blasfemia, penalizan estas críticas violan los derechos humanos.\n“Las críticas, insultos y burlas no interfieren en la libertad de religión de cada creyente, por ofensivos que sean.”\nAlber Saber Ayad dijo a sus abogados que mientras estaba recluido, un policía de la prisión de El Marg incitó a otros reclusos a que le agredieran.\nLos internos le dieron una paliza y le cortaron en el cuello con una cuchilla de afeitar. Después lo llevaron a otra sala donde 20 presos le dieron una paliza y le obligaron a permanecer de pie toda la noche.\nSus abogados temen por su seguridad tanto en prisión como fuera de ella, si es excarcelado. También temen por la seguridad de su madre y de su hermana, que han recibido amenazas y se han visto obligadas a abandonar su casa, que fue rodeada por una multitud enfurecida.\nAhmed Ezzat, abogado defensor de Alber Saber Ayad y director de la unidad jurídica de la Asociación para la Libertad de Pensamiento y de Expresión, ha declarado: “Me preocupa la actitud de un juez religioso que no puede separar sus opiniones personales de las salvaguardias legales de los procesados.”\n“Las autoridades egipcias deben realizar una investigación exhaustiva, independiente e imparcial sobre el trato recibido por Alber Saber Ayad en detención y hacer que los responsables rindan cuentas de sus actos ante la justicia. También deben asegurarse de que tanto él como su familia reciben protección de nuevos actos de hostigamiento y de las amenazas”, afirmó por su parte Hassiba Hadj Sahraoui.\nAlber Saber Ayad fue detenido en su casa en El Cairo el 13 de septiembre, al día siguiente de que grupos de hombres enfurecidos rodearan su casa e intentaran entrar ella, pidiendo su muerte, acusándole de herejía y ateísmo y de promover la “La inocencia de los musulmanes”, un cortometraje considerado ofensivo por muchas personas.\nSu madre llamó a la policía pidiendo protección, pero cuando ésta llegó finalmente, al día siguiente, detuvieron a Alber Saber Ayad y confiscaron su ordenador personal y sus discos compactos.\nKariman Masihah Ghali, la madre de Alber Saber Ayad, dijo que el fiscal encargado de la investigación la había presionado en relación con su fe, preguntándole si era cristiana y qué pensaba del cristianismo y del islam. Cuando ella respondió que sería juzgada por Dios sobre estas cuestiones, el fiscal ordenó que constara que se había negado a responder.\nAlber Saber Ayad ha sido acusado formalmente de “difamación del islam y del cristianismo”, “insultar lo sagrado” y “satirizar rituales religiosos y símbolos sagrados y profetas” en aplicación de los artículos 98(f), 160 y 161 del Código Penal egipcio.\n“Hay muchas otras personas en Egipto como Alber Saber Ayad enjuiciadas por blasfemia. Estos casos sientan un precedente peligroso para la tolerancia de las autoridades egipcias hacia la libertad de expresión en el país”, declaró Hassiba Hadj Sahraoui.\n“Hay que tomar medidas inmediatas para poner fin a la detención de más presos de conciencia. Las autoridades deben abolir las disposiciones sobre ‘blasfemia’ contenidas en la legislación egipcia, que se están usando cada vez más para reprimir la legítima libertad de expresión.”\nEtiquetas: censura, Egipto, libertad de expresión, libertad de religión\nWednesday, October 17th, 2012 a las 9:21 am\thoras y está guardada bajo Egipto.\nGovind Acharya See all »


¿QUÉ ES EL BULLYING FAMILIAR? CONSECUENCIAS EN CASA\nNo solo en la escuela existe maltrato, sino que hay una variedad de bullying en el mundo, y uno de ellos es el bullying familiar. Descubre todo sobre este tema, y algunos consejos que puedes poner en práctica para ti o tu familia.\n1 Bullying familiar\n1.1 Cuando tu acosador es tu hermano\n2.1 Cuando comienza en casa\n2.2 Consejos para el hogar\nEl maltrato o también conocido popularmente como Bullying, puede ocasionarse en todos lados, y la familia no está exenta de esta situación. Este tipo de Bullying familiar es muy difícil de detectar, ya que es algo que sucede dentro de un núcleo familiar, y puede ser generada por violencia entre hermanos, entre padres o incluso, entre padres e hijos.\nMuchas veces, los mismos padres no logran identificar esta problemática, y más aún cuando son peleas entre hermanos, ya que no saben si es rivalidad normal o traspaso la línea del abuso.\nExisten muy pocos estudios al respecto, a pesar de lo loco que suene, pero según un profesor de psicología de Pensilvania el maltrato entre hermanos es el más común de todos dentro de la sociedad occidental, incluso más que el doméstico y el infantil; pero más adelante desarrollaremos un poco este tipo de Bullying.\nEl bullying intrafamiliar, también como se conoce, puede ser generada por un matrimonio disfuncional. ¿y cuando puedo saber que un matrimonio es de este tipo? cuando la pareja se la pasa constantemente peleando, gritando, existen amenazas de cualquier tipo, agresiones físicas, chantaje, etc.\nEste tipo de matrimonios puede crear un ambiente familiar negativo, y muchas veces los padres en el calor del momento pueden dañar o lastimar física o verbalmente a los niños. Las personas dentro de estas relaciones, es decir los padres, pueden tener este tipo de conducta desde el noviazgo, y muchas veces es causado por la mentira\nEs necesario tener claro, que muchas personas dicen cosas para impresionar a alguien, y mienten sobre su verdadera forma de ser. Algunos matrimonio generan conflicto dentro del núcleo familiar, a causa de esto, y son los niños que al final reciben la peor parte.\n¿Bullying familiar? Si existe\nEs necesario que los padres se eduquen, y enseñen a los hijos sobre estos tema, y más aún si vivieron o están viviendo una difícil separación. Debemos recordar, que muchas veces un matrimonio fracasado, es un fracaso en la formación de la familia.\nY esto se debe, que los hijos al convivir en un hogar lleno de conflictos no saben cómo expresar lo que sienten, y lo que hacen es imitar a los padres para dejar salir esas frustraciones. La falta de formación adecuada para los niños, puede crear en un futuro que ellos reflejen los problemas de sus padres, y tengan también matrimonios fallidos.\nY estos problemas muchas veces debe ser arreglado por los psicólogos, quienes tratan de hacerle ver al niño o adolescente que su conducta no es adecuada.\nComo podemos notar, la desintegración familiar, violencia en la familia, el abandono, el mal ejemplo, el tener un hogar sin normas; todas ellas son detonadores y causantes de muchos de los problemas de la sociedad de hoy día, como por ejemplo: bullying, la drogadicción, pandillerismo y narcotráfico.\nLa psicóloga Pilar Sordo, destaca que los padres modernos son también un ejemplo de malos padres, ya que muchos de ellos son demasiados permisivos y realmente no le dedican el tiempo a los hijos, dándole teléfonos, Internet u otros aparatos de entretenimiento, para que ocupen su tiempo en casa sin supervisión alguna.\nEsta era moderna es llamada globalización, y es una era donde la tecnología y las pantallas lo son todo. De hecho, es hasta considerado la Santísima trinidad moderna cuyos elementos son: computadora, televisión y celular.\nEs incluso sorprendente de ver, que actualmente en los hogares ya no se conviven, sino que solo conviven como huéspedes. Cada miembro está sumergido en sus propios asuntos, no existe casi o ninguna comunicación; los padres no saben las cosas que preocupan a sus hijos o viceversa.\nMuchas veces los niños u adolescentes manifiestan acciones de violencia o malos comportamientos, para tratar de desahogarse o incluso para tratar de llamar la atención de los problemas que tiene el hogar. Debemos recordar que los niños y adolescentes no tienen la madurez para enfrentar este tipo de situaciones, y la única solución que encuentran es la de aliviar un poco la presión que tienen dentro a través de dichos comportamientos.\nEl bullying familiar es un tema delicado, y de hecho el bullying mismo se origina en casa, por lo tanto es necesario que todos los padres presten atención a lo que sucede a su alrededor.\nSi el hogar se encuentra conformado por abuelos, tíos, primos, etc, es necesario que presten atención a las señales que los más pequeños presentan. Pero es necesario aclarar, que no solo el bullying en la familia se genera por conflictos en la pareja, también puede formarse por la integración de otro miembro al núcleo familiar.\n¿Cómo es esto? Cuando en un matrimonio solo existe un hijo único y van a tener a su segundo bebé, si los padres no tratan de forma progresiva este tema en el hijo mayor, puede crear celos y deseos en éste niño, creando a largo plazo deseos de querer expulsarlo.\nComo podemos observar nuevamente, los padres son los garantes de educar correctamente a los hijos, y por ello muchas veces el bullying familiar crece y se alimenta de los ambientes disfuncionales.\nTener un hogar donde no existen límites, donde los padres permiten a los hijos excesos para demostrarles su amor, es un concepto erróneo de la realidad.\nAsí mismo, donde existen depravaciones, carencias de lazos afectivos, abusos; e incluso la misma sociedad son creadores de esta situación, ya que con sus películas, noticias y otras fuentes de comunicación y entretenimiento hacen ver que la violencia es cool y genial; premian a las personas que viven con excesos.\nCuando tu acosador es tu hermano\nYa mencionamos el origen del bullying familiar, y el mayor causante de esta situación, pero es necesario conocer más de cerca el maltrato y abuso entre hermanos.\nY aunque suene un poco loco, de hecho este tipo de acoso es considerado el más frecuente de todos, incluso del abuso infantil. Según Mark Kiselica, un profesor de Pensilvania señala que estadísticamente, cada tercio hasta la mitad de los infantes que son menores de edad, sufren o se involucran en algún tipo de acoso fraternal, y que de hecho ocurre mucho más que el bullying escolar.\nSeguro estos números los pueden sorprender, e incluso ser algo escépticos al respecto, ya que los hermanos son conocidos por llevarse como perros y gatos. Y realmente es verdad, pero existe cierto límite que muchas veces las personas pasan por alto, al considerarlo algo “normal de hermano”.\nLos pellizcos, el jalar el cabello del otro y hasta lanzarse patadas de vez en cuando tipo bruce lee no es indicativo del maltrato o acoso entre hermanos. Muchas veces los hermanos poseen personalidades muy diferentes, y hasta pueden generar una rivalidad o competitividad sana entre ellas.\nHasta los celos y el querer llamar la atención de los padres es normal, odiarse y amarse es algo muy representativo de hermanos, e incluso dentro entre otros miembros de la familia. Pero ¿que sucede cuando el comportamiento crece, y se convierte en algo constante y cruel?\nEs su mayoría, muchas veces cuando los hermanos discuten o pelean no es una señal de verdadera alarma, ya que este tipo de conducta es bastante normal a esa edad y que van superando a medida que van creciendo.\nDe hecho, estos mismos conflictos ayudan a moldear la personalidad del niño, y le ayudan a afrontar problemas que surjan en su vida. Las peleas por saber de quién es el juguete, quien le toca primero probar un juguete nuevo o quien fue el culpable de una situación, son conflictos que se solucionan hablando, disculpándose y ya.\nPero el bullying entre hermanos no se compara con estas situaciones, no son peleas triviales ni mucho menos, ya que una pelea normal debe ambos estar en el juego y no uno solo.\nCuando se presencia el abuso continuo de uno de los hermanos hacia el otro, aprovechando su edad y su tamaño, ya no estamos en una relación sana, y que muchos padres comparan con los comportamientos anteriores.\nEs erróneo pensar que un hijo que constantemente moleste y abuse del otro sea normal, los padres deben detener cualquier conducta del hijo abusador, porque de lo contrario ellos creerán que su forma de actuar está bien y lo reflejaran en otras relaciones que tengan.\nLa violencia e insultos causan daños psicológicos en el hermano abusado, e incluso las ofensas verbales son mucho más dañina que las físicas, ya que se impregnan en la personalidad y autoestima del niño.\nOtras conductas que reflejan maltrato son el de tratar de anular o eliminar al hermano, ya sea por medio de la ridiculización entre amigos y familia. E incluso más de un hermano puede involucrarse en este tipo de agresiones, llamadas como ganging, y que su propósito es el de aislar y hacer sentir solo al hermano no deseado.\nAnteriormente mencionamos algunos de los causantes que generan el bullying familiar, pero vamos a describirte otros más, para que los tengas en cuenta y puedas detenerlo a tiempo.\nGeneralmente este tipo de maltratos son originados por personas con baja autoestima, que se originaron de un hogar conflictivo.\nOtras veces puede ser causado por un hermano o varios, que han tenido una relación abusiva con uno de los hermanos de la familia.\nOtro catalizador para que los niños propicien el bullying, es la carencia de valores, causado por padres desinteresados o la ausencia permanente de uno de ellos.\nEl ser educado por padres indiferentes o por lo contrario, exigentes y controladores también son detonadores de este comportamiento.\nEs necesario educar a los niños y a las personas en general, que el bullying no está bien ni es correcto, sin importar el tipo que sea. Es necesario fomentar en los hogares 4 pilares esenciales que son: la obediencia, respeto, libertad y responsabilidad.\nCuando comienza en casa\nEl bullying es un fenómeno que actualmente se ve en las escuelas, pero algo que muy pocos saben, es que su origen proviene del hogar.\nAhora, hemos mencionado la palabra bullying ¿pero aún no sabes qué significa? este término se le define como acoso físico o mental de un individuo o un grupo de personas a otra, de manera consciente. Pero con esto no queremos decir que el hogar sea el único lugar donde surge, ya que la escuela es uno de los ambientes más propicios para surgir.\nTeniendo eso claro, queda bastante claro que el acoso no es un instituto ni lugar, sino las personas que la rodean y lo habitan, que provienen en su mayoría de un ambiente familiar inestable.\nUn matrimonio inestable, actos de agresividad de los padres, problemas económicos y otros factores, son los alimentos perfectos para generar agresividad en los infantes. Además, si los padres no le dan la importancia debida a las tareas o responsabilidades, e incluso los valores como el respeto y obediencia; puede crear un ambiente bastante negativo en el que vivir.\nSi los padres usan el castigo físico frecuentemente, el niño o el adolescente puede crecer resentido y con una personalidad hostil y conflictiva, que es liberado en la escuela por medio del acoso. Y también puede suceder en el caso contrario, en donde los niños se le reprima tanto que no tienen el autoestima de defenderse.\nLa solución inmediata para el bullying familiar no existe, ya que es un problema que se debe resolver de a poco, pero te damos algunos consejos que puedes poner en práctica en tu hogar:\nLos padres o el tutor responsable de los niños, deben ser garantes de establecer un ambiente emocional equilibrado, lejos del conflicto de pareja o de otro tipo.\nEscucha a tus hijos, no juzgues sus sueños o anhelos; si lo haces, él te verá como una fuente para filtrar sus pensamientos y sus temores.\nNo desprecies los sentimientos de ellos, siempre se abierto para escuchar lo que te van a decir.\nLos padres deben garantizar un ambiente de amor, respeto e independencia en el núcleo.\nNo seas sobre protector o por el contrario, indiferente hacia el interés de tus hijos; no generes un ambiente sin libertad y opresión.\nEl bullying familiar y el bullying en general, no es solo de los padres, de los psicólogos o de los profesores. Este fenómeno es un cáncer que afecta a todos, y por ende es un problema que entre todos debemos atacar.\nEn el caso del hermano abusivo, los padres deben darse cuenta que él solo reproduce lo que presencio, y en muchos casos, lo que sufrió en persona. Para solventarlo, los padres pueden tratar de ponerse en los zapatos del niño y entender su forma de comportarse.\nEn el caso de la víctima, es decir el hermano acosado, los padres deben ofrecerle soporte emocional para tratar de levantarle el autoestima, y demostrarle que no está solo.\nNo es correcto normalizar el acoso entre hermanos, y según la revista The Journal of Family Violence son los casos más frecuentes. Según una encuesta realizada a grupos familiares, cuando los hijos le confesaban a los padres de los abusos del hermano, los padres sencillamente respondían que era normal.\nDicha actitud de los padres ante la situación real de la casa, es una clara señal de desinterés en los hijos, y es algo que no debería aceptarse sino corregirse.\nLos niños esperan estar seguros en el hogar\nUna de las investigaciones realizar por la revista Developmental Psychology, detalla que los abusos entre hermanos se generan mucho más en familias que tengas más de tres hijos, y los mayores son los que se encargan de generar la intimidación.\nY de hecho, mucho de estos factores se generan por instinto primitivo, aunque suene una locura. Un hijo que convive solo con sus padres, y que tiene la atención de ellos solo en él, puede sentirse amenazado con la llegada de un nuevo integrante a su núcleo familiar, ya que el afecto y atención se ve reducida a la mitad.\nEl sentir celos y egoísmo es algo bastante normal y natural, y es allí donde los padres deben intervenir y tratar el asunto antes de que éste pueda generarse. Los niños esperan crecer en un ambiente de cariño y seguridad, y los padres deben ser garantes de esto, porque de lo contrario los niños crecerán con graves problemas emocionales.\nPara complementar la información leída, te recomendamos otros artículos de interés:\nExamen de conciencia para niños.\n(Visited 1.146 times, 2 visits today)