Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants | Protocol (Translated to Spanish)\nLos efectos trans y multigeneracionales de los productos químicos persistentes son esenciales para juzgar sus consecuencias a largo plazo en el medio ambiente y en la salud humana. Proporcionamos métodos detallados novedosos para estudiar los efectos trans y multigeneracionales utilizando nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans.\nLa información sobre las toxicidades de los productos químicos es esencial en su aplicación y gestión de residuos. En el caso de los productos químicos a bajas concentraciones, los efectos a largo plazo son muy importantes para juzgar sus consecuencias en el medio ambiente y en la salud humana. Al demostrar influencias a largo plazo, los efectos de los productos químicos a lo largo de generaciones en estudios recientes proporcionan nuevos conocimientos. Aquí, describimos protocolos para el estudio de los efectos de los productos químicos a lo largo de varias generaciones utilizando nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans. Se presentan dos aspectos: (1) estudios de efectos transgeneracionales (TG) y (2) multigeneracionales, el segundo de los cuales se separa en estudios de efectos de exposición multigeneracional (MGE) y residual multigeneracional (MGR). El estudio de efecto TG es robusto con un propósito simple de determinar si la exposición química a los padres puede resultar en consecuencias residuales en la descendencia. Después de que los efectos se miden en los padres, las soluciones de hipoclorito de sodio se utilizan para matar a los padres y mantener la descendencia con el fin de facilitar la medición del efecto en la descendencia. El estudio de efecto TG se utiliza para determinar si la descendencia se ve afectada cuando su padre está expuesto a los contaminantes. El estudio de efectos MGE y MGR es sistemático utilizado para determinar si la exposición generacional continua puede dar lugar a respuestas adaptativas en descendencia a lo largo de generaciones. La recogida y la transferencia cuidadosas se utilizan para distinguir las generaciones para facilitar la medición del efecto en cada generación. También combinamos protocolos para medir el comportamiento de la locomoción, la reproducción, la vida útil, los cambios bioquímicos y de expresión génica. También se presentan algunos experimentos de ejemplo para ilustrar los estudios de efectos trans y multigeneracionales.\nLa aplicación y la gestión de residuos de productos químicos depende en gran medida de la información de sus efectos en determinadas concentraciones. En particular, el tiempo es otro elemento esencial entre los efectos y las concentraciones. Es decir, los productos químicos, especialmente aquellos a bajas concentraciones en los entornos reales, necesitan tiempo para provocar efectos mensurables1. Por lo tanto, los investigadores organizan diferentes longitudes de la duración de la exposición en experimentos con animales, e incluso cubren todo el ciclo de vida. Por ejemplo, los ratones estuvieron expuestos a la nicotina durante 30, 90 o 180 días para estudiar sus efectos tóxicos 2. Sin embargo, esas duraciones de exposición todavía no son suficientes para dilucidar los efectos a largo plazo de los contaminantes (por ejemplo, contaminantes orgánicos persistentes [POP]) que pueden durar a lo largo de generaciones de organismos en el medio ambiente. Por lo tanto, los estudios sobre los efectos a lo largo de las generaciones están ganando cada vez más atención.\nHay dos aspectos principales en los estudios de efectos generacionales. El primero es el estudio del efecto transgeneracional (TG) que puede probar con firmez si la exposición química a los padres puede resultar en consecuencias en la descendencia3. El segundo es un estudio de efectos multigeneracional que es más sistemático con consideraciones tanto en la exposición como en los efectos residuales. Por un lado, los efectos de exposición multigeneracional (MGE) se utilizan para ilustrar las respuestas adaptativas en los animales a los entornos desafiantes a largo plazo. Por otro lado, los efectos residuales multigeneracionales (MGR) se utilizan para demostrar las consecuencias residuales a largo plazo después de la exposición, ya que la exposición materna se acompaña de la exposición de embriones a la primera descendencia y la exposición a la línea de gérmenes a la segunda descendencia que hace que la tercera descendencia como la primera generación completamente fuera de la exposición4.\nAunque los mamíferos (por ejemplo, ratones) son organismos modelo en estudios de toxicidad, especialmente en relación con los seres humanos, su aplicación en el estudio de los efectos generacionales es bastante lenta, costosa y éticamente preocupante 5. En consecuencia, organismos como el crustáceo Daphnia magna6, el insecto Drosophila melanogaster7 y el pez cebra Danio rerio8, ofrecen opciones alternativas. Sin embargo, estos organismos carecen de similitudes con los seres humanos o requieren equipos específicos en los estudios.\nCaenorhabditis elegans es un pequeño nematodo de vida libre (aproximadamente 1 mm de longitud) con un ciclo de vida corto (aproximadamente 84 h a 20 oC)9. Este nematodo comparte muchas vías biológicas conservadoras para los seres humanos, y por lo tanto se ha empleado ampliamente para ilustrar los efectos de diversas tensiones o tóxicos10. En particular, el 99,5% de los nematodos son hermafroditas por lo que estos organismos son extremadamente adecuados en el estudio de los efectos generacionales, por ejemplo, los efectos TG de metales pesados y sulfonamidos3,11, MGE efectos de nanopartículas de oro y pesadas metales12 y temperatura13, efectos MGR de sulfonamida14, y tanto MGE como MGR efectos de irradiación gamma15 y lindano4. Además, se encontraron resultados comparables entre los efectos de los productos químicos (por ejemplo, zearalenona) en el desarrollo y la reproducción de ratones y C. elegans16,17, lo que proporcionaría una ventaja para extrapolar efectos de este pequeño animal a los seres humanos.\nLos estudios de efectos TG y MG consumen mucho tiempo y necesitan un diseño y un rendimiento cuidadosos. En particular, existían diferencias en las opciones en etapa de vida, las condiciones de exposición y los métodos de separación de generación en los estudios antes mencionados. Esas diferencias obstaculizaron la comparación directa entre los resultados y obstaculizaron una interpretación ulterior de los resultados. Por lo tanto, es imperativo establecer protocolos uniformes para guiar los estudios de efectos TG y MG, y también proporcionar un panorama más amplio para revelar patrones similares de diversos tóxicos o contaminantes en consecuencias a largo plazo. El objetivo excesivo de los protocolos actuales demostrará procesos de operación claros en el estudio de los efectos trans y multigeneracionales con C. elegans. Los protocolos beneficiarán a los investigadores interesados en estudiar los efectos a largo plazo de los tóxicos o contaminantes.\nPreparar 1 M de solución de hidróxido sódico disolviendo 4 g de hidróxido de sodio en agua de 100 ml.\nPreparar el caldo de lisógenia (LB) medio disolviendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro de sodio con 1 L de agua ultrapura en un matraz cónico de 1 L. Ajuste el pH a 7,0 con 1 M de solución de hidróxido sódico.\nAliquot el medio líquido LB de step1.2 a 20 matraces cónicos (volumen máximo permitido: 100 mL) con medio de 50 ml en cada uno. Cubra los matraces cónicos con papel kraft.\nEsterilice el medio líquido LB a 121 oC y 0,105 MPa durante 20 minutos.\nPipetear 200 l de las suspensiones bacterianas (ver paso 1.8) o recoger una pequeña colonia de agars (en el paso 2.14) utilizando un bucle inoculante, colóquela en medio LB.\nIncubar el medio LB con agitación a 150 rpm a 37oC durante 24-48 h. El medio LB cambiará de un líquido transparente marrón a una suspensión de color caqui turbia.\nUtilice las suspensiones bacterianas del 80% del total de matraces para proporcionar E. coli OP50 como alimento de nematodos que se utilizará en el paso 2.11.\nAlmacene el resto de los matraces que contienen las suspensiones bacterianas en un frigorífico a 4oC. Pipetear 200 l de las suspensiones LB en la parte superior del medio nuevo LB (paso 1.4) y repetir el paso1.6 para su posterior incubación.\nNOTA: Cultura C. elegans utilizando según los pasos 2.1 a 2.11 basados en los métodos estándar18.\nDisolver 22,8 g de K2HPO4•3H2O en 100 ml de agua destilada estéril.\nDisolver 6,8 g de KH2PO4 en 50 ml de agua destilada estéril.\nMezclar soluciones de los pasos 2.1 y 2.2, para preparar 1 M K2HPO4-KH2PO4 buffer (pH 6.0, 150 mL en total).\nPreparar 1.0 M MgSO4 disolviendo 1.232 g de MgSO4•7H2O en 5 ml de agua destilada estéril, y esterilizarla filtrando la solución a través de un filtro de membrana estéril desechable de 0,22 m en un recipiente estéril.\nPreparar 1 M CaCl2 disolviendo 0,554 g de CaCl2 en 5 ml de agua destilada estéril, y esterilizarlo filtrando las soluciones a través de un filtro de membrana desechable estéril de 0,22 m en un recipiente estéril.\nPreparar 1 M de solución de colesterol disolviendo 0,025 g de colesterol en 5 ml de etanol absoluto, y esterilizarla filtrando la solución a través de un filtro de membrana desechable estéril de 0,22 m en un recipiente estéril.\nPreparar el agar medio de crecimiento de nematodos (NGM) añadiendo 17 g de agar en polvo, 2,5 g de peptona y 3 g de cloruro de sodio a un matraz cónico de 1 L que contenga 1 L de agua ultrapura. Añadir 25 ml de K2HPO4-KH2PO4 solución del paso 2.3.\nEsterilice el agar NGM desde el paso 2.7 a 121oC con 0,105 MPa durante 20 min.\nEnfriar el agar NGM a unos 50 oC, añadir 1 mL de 1 M MgSO4, 1 M CaCl2y 5 mg/ml de solución de colesterol-etanol de los pasos 2.4 a 2.6 en el medio y mezclarlos a fondo.\nVierta el medio de agar NGM de 10 ml por plato en 100 platos estériles de Petri (6,0 cm de diámetro). Enfriar el medio en los platos Petri a temperatura ambiente para formar agar sólido.\nPipetear 170 l de las suspensiones bacterianas del paso 1.7 sobre el agar NGM antes mencionado utilizando una punta estéril. Agitar ligeramente el agar NGM para distribuir el medio LB uniformemente sobre la superficie del agar NGM.\nInocular el agar NGM con la parte superior hacia arriba a 37 oC durante 8-12 h para formar un césped bacteriano.\nUtilice la mayor parte del agar con césped bacteriano del paso 2.12 para cultivar nematodos en los pasos 2.15 o 2.19.\nAlmacene 1 o 2 agars boca abajo para evitar la evaporación del agua y la contaminación en los refrigeradores a 4 oC para mantener las bacterias en la contaminación.\nCuando haya menos de 2.000 nematodos en los agars NGM de siembra (de experimentos anteriores o dotados de otros laboratorios), corte una sexta parte del agar NGM que contiene C. elegans con una punta estéril y transfiérala a agars NGM recién preparados con agars bacterianos césped (del paso 2.13). Mantenga los agars NGM boca abajo en una incubadora de 22 oC para el cultivo posterior.\nCuando haya más de 2.000 nematodos en el agar NGM de siembra, enjuague los nematodos del agar NGM con 2 ml de agua estéril en tubos de centrífuga. La entrada de 2 ml de agua dará como resultado una salida de aproximadamente 1,5 ml.\nDeje que los nematodos se asienten en los tubos centrífugos desde 30 min. Deseche 1 ml de los sobrenatos pipeteando y agregue 1 ml de agua estéril en cada tubo para lavar los pellets (es decir, los nematodos).\nAsentar los nematodos en los tubos centrífugos durante 30 min. Deseche 1 ml de los sobrenados pipeteando. Añadir 1 ml de agua estéril en cada tubo para resuspender los nematodos.\nDistribuir las suspensiones de nematodos (aproximadamente 1,5 ml en total) pipeteando 150 l en cada nuevo agar NGM con césped bacteriano (del paso 2.13), haciendo 8-10 nuevos agares NGM en total.\nMantenga los agars NGM del paso 2.19 hacia arriba en una incubadora de 20 oC durante la noche y luego al revés para el cultivo posterior.\nRepita el paso 2.15 o el paso 2.16-2.20 cada tres días.\n3. Preparar huevos sincronizados y larvas L3 de C. elegans\nEnjuague los nematodos gravid y los huevos recién producidos de los agars NGM en tubos estériles de centrífuga, con 2 ml de agua estéril en cada agar NGM dando como resultado aproximadamente 1,5 ml de salida.\nAsentar los nematodos en los tubos de centrífuga durante 30 minutos, y luego desechar el 85% de los sobrenatos mediante pipeteo.\nPreparar soluciones de hipoclorito de sodio mediante la disolución de 0,6 g de NaOH y 5 ml de NaOCl (4-6% gradientes activos, ver la Tabla de Materiales para más detalles) con 25 ml de agua para llevar el NaOH a 0,5 M y NaOCl al 1%.\nMezclar los pellets del paso 3.2 (marcar el volumen como V0) con 7 veces V0 de soluciones de hipoclorito sódico de (paso 3.3, es decir, relación de volumen de 1:7)19.\nAgitar los tubos de centrífuga cada 2 minutos durante 10-15 minutos para blanquear las larvas y los nematodos adultos; el color de las suspensiones de nematodos pasará de turbenses a claros.\nCentrifugar los tubos a 700 x g durante 3 min a 20 oC, y luego desechar los sobrenadores pipeteando.\nResuspenda los pellets en 5 v0 de agua estéril para lavar los huevos sincronizados con la edad. Centrifugar a 700 x g durante 3 min a 20 oC, y luego desechar los sobrenadores.\nRepita el paso 3.7 dos veces.\nAñadir 1 plegado V0 de agua estéril en los tubos para resuspender los huevos sincronizados con la edad.\nDistribuya las suspensiones de los huevos pipeteando 50 ml en cada nuevo agar NGM con césped bacteriano del paso 2.13. Mantenga los agars NGM de arriba en una incubadora de 20 oC durante 30 minutos, lo que permite que el agua se evapore o se absorba por el césped bacteriano. Luego, haga los agars NGM al revés para la cultura posterior. Marque el tiempo como eltiempo del huevo (huevo T).\nPreparar K-medio disolviendo 3 g de NaCl y 2.36 g de KCl en 1 L de agua. Esterilice el medio a 121 oC y 0,105 MPa durante 20 minutos y enfríe a temperatura ambiente.\nCuando el tiempo alcanza las 36 h después delhuevoT, los nematodos alcanzarán la etapa de larvas L3 (nematodos L3)20. Enjuague los nematodos de los agars NGM en tubos centrífugos, con 2 ml de agua estéril en cada agar NGM, lo que resulta en aproximadamente 1,5 ml de salida.\nDespués de un asentamiento durante 30 minutos, reemplace el 85% de los supernatantes (por pipeteo) por k-medio de 2 h para digerir el alimento en las tripas3.\nDescarta los supernatantes. Utilice K-medium (del paso 3.11) para ajustar las suspensiones de nematodos a unos 200 nematodos por 100 oL para experimentos posteriores.\n4. Utilice C. elegans para el estudio de efectos transgeneracionales\nPreparar soluciones químicas con 5 niveles de concentración y un disolvente o control absoluto, es decir, 6 grupos en total.\nAñadir 100 l de soluciones químicas o de control con 10 pozos y réplicas en cada grupo (es decir, 60 pozos en total) en el área media de una microplaca estéril de 96 pocillos para evitar efectos en los bordes.\nDiluir las suspensiones de nematodos del paso 3.14 con K-medio del paso 3.11 por 10 veces. Añadir suspensiones de nematodos de 100 l a cada uno de los 60 pozos del paso 4.2. Marque la hora como t0.\nCuando el tiempo llegue a24 h después de t 0, contar los nematodos vivos y muertos en los pozos. Calcular la mediana de concentración letal (LC50).\nPreparar una serie de 5 concentraciones por debajo del 10% de los valores de LC50.\nAñadir 100 l de soluciones de control o químicas (del paso 4.5) con 10 pozos y réplicas en cada grupo (es decir, 60 pozos en total) en el área media de una microplaca estéril de 96 pocillos para evitar efectos en los bordes.\nAñadir 100 l de k-medio que contenga aproximadamente 200 nematodos L3 (del paso 3.14) a cada uno de los 60 pozos del paso 4.6. Marque la hora como T0.\nRealice la exposición de 24 a 96 h desde T0.\nDespués de la exposición, recoja los nematodos de cinco pozos de cada grupo en tubos centrífugos de 1,5 ml mediante pipeteo (es decir, 6 tubos en total).\nAsentar los nematodos durante 30 minutos, desechar los sobrenadores pipeteando, y resuspender y lavar los nematodos en la parte inferior con 1 ml de agua esterilizada.\nResuelva los nematodos durante 30 minutos, deseche los sobrenados pipeteando y utilice los nematodos en la parte inferior para las mediciones del indicador (ver sección 7) de la generación primaria expuesta marcada como F0.\nRecoger, asentar y lavar (por resuponiendo) los nematodos de los cinco pozos restantes en cada grupo en el paso 4.9 según el paso 4.10.\nAsentar los nematodos del paso 4.12 durante 30 min. Deseche los sobrenatos pipeteando y agregue 100 l de agua estéril para resuspender los nematodos. Transfiera las suspensiones de nematodos uniformemente a tres agars NGM recién preparados con césped bacteriano del paso 2.13.\nIncubar los nematodos durante 36 h para que se vuelvan gravitos y realizar la sincronización de la edad de acuerdo con los pasos 3.1-3.9. Incubar los huevos sincronizados en los respectivos agars NGM con césped bacteriano del paso 2.13 durante 36 h.\nEnjuague los nematodos de los agars NGM del paso 4.14 en seis tubos de centrífuga.\nLiquidar los nematodos durante 30 minutos, y desechar los sobrenatos pipeteando. Resuspender y lavar los pellets con 1 ml de agua esterilizada.\nLiquidar los nematodos durante 30 minutos, y desechar los sobrenatos pipeteando. Utilice los nematodos en la parte inferior para las mediciones del indicador (ver sección 7) de la generación de descendencia marcada como T1.\n5. Utilice C. elegans para el estudio de efectos de exposición multigeneracional (MGE)\nMezclar 99,0 mL de agars NGM (del paso 2.9) con 1 ml de soluciones de control o químicas (bajas y altas concentraciones en el protocolo actual como ejemplos, es decir, tres grupos en total).\nVierta los aproximadamente 10 ml de medio de agar NGM por plato desde el paso 5.1 en 100 platos estériles de Petri (6,0 cm de diámetro). Enfriar el medio en los platos Petri a temperatura ambiente para formar agar sólido.\nPipetear suspensiones bacterianas en el agar según el paso 2.11.\nDeje a un lado los párpados superiores de los platos De Petri y exponga el césped bacteriano a la luz UV (145 W/cm2) en el gabinete de bioseguridad durante 15 min.\nElija una pequeña colonia usando un bucle inoculante, colóquela en medio LB de los agars en el paso 1.4. Incubar el medio LB con agitación a una velocidad de 150 rpm a 37 oC durante 24 h para confirmar el crecimiento bacteriano de la negación, validando el paso de matanza 5.4.\nPipetear los huevos sincronizados por la edad del paso 3.9 sobre los agars (del paso 5.4). Marque el inicio de la exposición a la generación padre F0 y marque el día 0 (D0).\nIncubar los agars durante 3 d a 20oC. A continuación (es decir, en D3), utilice los nematodos maduros para medir los efectos en F0 (ver sección 7).\nTambién en D3, recoger los nematodos maduros F0 en los nuevos agars NGM (del paso 5.4) usando una varilla de vidrio, cuyo extremo está equipado con un alambre de fibra artificial doblado en un anillo.\nEn D4, elija y deseche los nematodos F0 maduros de los agars NGM. Marque los nematodos de descendencia recién eclosionados dentro de estas 24 h (de D3 a D4) como F1 para experimentar la exposición de segunda generación.\nEn D6, mida los índices (ver sección 7) de los nematodos maduros F1 que han experimentado exposición durante 3 días.\nEn D9, repita los pasos 5.8-5.10, utilice nematodos F1 para reproducir gusanos F2 y medir los efectos sobre los nematodos F2.\nEn D12, repita el paso 5.11, utilice nematodos F2 para reproducir gusanos F3 y medir los efectos sobre los nematodos F3. De la misma manera, reproducir la descendencia y medir los efectos MGE en la na generación de descendencia (Fn).\n6. Utilice C. elegans para el estudio del efecto residual multigeneracional (MGR)\nRepita los pasos 5.1-5.7. En D3, recoja los nematodos maduros F0 en los nuevos agars NGM sin productos químicos añadidos (del paso 2.13).\nEn D4, escoja y deseche los nematodos F0 maduros. Marque los nematodos de descendencia recién eclosionados dentro de estos 24 h como nematodos T1.\nEn D6, mida los índices (ver sección 7) de los nematodos maduros T1 que han crecido durante 3 días.\nEn D9, repita los pasos 6.2-6.3, utilice nematodos T1 para reproducir nematodos T2 y medir los efectos en los nematodos T1.\nEn D12, repita los pasos 6.4, utilice nematodos T2 para reproducir nematodos T3 y medir los efectos en nematodos T2. De la misma manera, reproduce la descendencia y mide los efectos de la simm EN los nth de generación de crías (Tn) de F0, o los nth offspring (Tn') nematodos de Fn del paso 5.12.\n7. Medir indicadores\nMida el comportamiento de la locomoción.\nTire los nematodos de los agars NGM con agua estéril y recójalos en tubos de centrífuga. Liquidar los nematodos durante 30 minutos, desechar los sobrenatos y utilizar los nematodos en los pellets para la medición del efecto.\nResuspender los nematodos en los pellets con 1 ml de agua estéril y pipetearlos en agars NGM sin césped bacteriano del paso 2.10.\nUtilice un microscopio de disección para puntuar los nematodos para la (número de) frecuencia de flexión corporal (BBF) que se refiere a las veces que la bombilla posterior de la faringe cambia de dirección a lo largo de la dirección vertical de la ruta de desplazamiento dentro de un intervalo de 60 s.\nUtilice el microscopio de disección para puntuar el movimiento de inversión (RM) que se refiere a los tiempos en que la dirección de viaje cambia más de 90o, incluidos giros hacia atrás y giro Omega (OT) en un intervalo de 60 s. El OT se refiere al movimiento cuando la cabeza del nematodo toca o casi toca su cola haciendo la forma del nematodo como la letra griega Omega.\nNOTA: Se examinaron al menos 6 nematodos para cada tratamiento en cada réplica experimental.\nEjemplos de mgE (F0 a F3) efectos en la reproducción y la vida útil con 3 grupos (un control y dos tratamientos de exposición).\nDía Número de agar NGM para el estudio MGE Explicación\nVida útil Reproducción\n0 30 (exposición F0) 10 réplicas para cada grupo, marcadas como F0-1-1-0 a F0-3-10-0, con el último dígito para mostrar los días de supervivencia.\n1 30 (F0 sobrevivir 1 d) F0-1-1-0 a F0-3-10-0 debe cambiarse a F0-1-1-1 a F0-3-10-1.\n2 30 (F0 sobrevivir 2 d) F0-1-1-1 a F0-3-10-1 debe cambiarse a F0-1-1-2 a F0-3-10-2.\nNo es necesario transferir nematodos F0 hasta 3 d.\n3 30 (F0 sobrevivir 3 d, despejado después de la transferencia y recolección de nematodos) Después de 3 d, los nematodos F0 son maduros y 36 nuevos agars NGM (con 2 nematodos en cada agar) se utilizan para observar su supervivencia y reproducción.\n36 (F0-1-1-3 a F0-3-12-3) Se deben realizar experimentos preliminares para organizar el número de nematodos F0, asegurando al menos 200 crías para las operaciones multigeneracionales que se realizan correctamente.\nEn particular, si se estudian los efectos de la MGR, los nematodos F0 deben transferirse a agars NGM claros sin exposición química, y debe observarse como inicio De 1.\nLa mayoría de los nematodos F0 se recogen para medir índices químicos y genéticos y los 30 agars en F0 se eliminan.\n4 36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 a F1-3-12-1) La medición de la vida útil y la reproducción requiere transferencia todos los días.\nLos nematodos de los padres en F0-1-1-3 a F0-3-12-3 se recogen en los nuevos agars NGM marcados como F0-1-1-4 a F0-3-12-4.\nLos nematodos de descendencia restantes (es decir, F1 en MGE, o T1 en MGR) en F0-1-1-3 a agars F0-3-12-3 han crecido para 1 d, y los marcadores se cambian a F1-1-1-1 a F1-3-12-1. Estos agars también se utilizan para monitorear la vida útil de La F1 con transferencia diaria.\n5 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 a F1-3-12-2) Los nematodos en los agars F1-1-1-1 a F1-3-12-1 han crecido durante 2 d y se vuelven fácilmente observables y los nematodos se cuentan, y los marcadores se cambian a F1-1-1-2 a F1-3-12-2.\n36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4) Los nematodos de descendencia en f0-1-1-4 a Agars F0-3-12-4 han crecido durante 1 d.\n6 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4, despejado después de contar) Los nematodos en los agars F1-1-1-2 a F1-3-12-2 han crecido durante 3 d y los marcadores se cambian a F1-1-1-3 a F1-3-12-3. En particular, los nematodos F1 comienzan a reproducir F2 en este día, los nematodos F1 deben transferirse a nuevos agars NGM haciendo F2-1-1-0 a F1-3-12-0. Para los estudios MGR, T2 comienza hoy.\n36 (F1-1-1-3 a F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5) Esto puede retrasarse por la exposición química, y por lo tanto se deben realizar cambios flexibles en cada experimento para asegurar suficientes nematodos para las generaciones posteriores.\n36 (F2-1-1-0 a F1-3-12-0) Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-4 a F0-3-12-4 han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\nLos nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-5 a F0-3-12-5 han crecido durante 1 d.\n7 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-5 a F0-3-12-5 han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6) El número total de nematodos en agars F1-1-1-1 a F1-3-12-1, F0-1-1-4 a agars F0-3-12-4 y F0-1-1-5 a F0-3-12-5 se utilizan para calcular la reproducción inicial de F0.\n36 (F2-1-1-1 a F2-3-12-1) Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-6 a F0-3-12-6 han crecido durante 1 d.\nLos nematodos F2 en F2-1-1-0 a F1-3-12-0 han crecido durante 1 d y sus marcadores se cambian a F2-1-1-1 a F2-3-12-1.\n8 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia en los agars F0-1-1-6 a F0-3-12-6 han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-7 a F0-3-12-7 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-2 a F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-4 a F1-3-12-4 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-1 a F2-3-12-1, cambiado a F2-1-1-2 a F2-3-12-2 después de contar) Los nematodos F2 en F2-1-1-1 a F2-3-12-1 han crecido durante 2 d, los nematodos se cuentan y sus marcadores se cambian en F2-1-1-2 a F2-3-12-2.\n9 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-7 a F0-3-12-7 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-4 a F1-3-12-4 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-3 a F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-8 a F0-3-12-8 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-0 a F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-5 a F1-3-12-5 agars han crecido durante 1 d.\nLos nematodos F2 en F2-1-1-2 a F2-3-12-2 han crecido durante 3 días y sus marcadores se cambian a F2-1-1-3 a F2-3-12-3. Los nematodos F2 comienzan a reproducirse hoy en día y se transfieren a 36 nuevos agars NGM son necesarios y marcados como F3-1-1-0 a F3-3-12-0. Para los estudios MGR, T3 comienza hoy.\n10 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-8 a F0-3-12-8 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-5 a F1-3-12-5 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9) El número total de nematodos en F2-1-1-1 a F2-3-12-1, F1-1-1-4 a agars F1-3-12-4 y F1-1-1-5 a F1-3-12-5 se utilizan para calcular la reproducción inicial de F1.\n36 (F3-1-1-1 a F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-9 a F0-3-12-9 agars han crecido durante 1 d.\nLos nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-6 a F1-3-12-6 agars han crecido durante 1 d.\nEl nematodo de descendencia en los agars F3-1-1-0 a F3-3-12-0 ha crecido durante 1 d y los marcadores se cambian en F3-1-1-1 a F3-3-12-1.\nEn particular, la reproducción de nematodos F0 disminuirá significativamente después de los primeros días. Por lo tanto, la transferencia de nematodos no está estrictamente obligada a ser diaria después de D10 y se puede realizar cada 2 días. Sin embargo, la supervivencia todavía requiere observación diaria.\nLa misma regla también se aplica en F1 (T1, T1'), F2 (T2, T2') y F3 (T3, T3').\n11 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-9 a F0-3-12-9 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-6 a F1-3-12-6 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-10 a F0-3-12-10 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-2 a F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-7 a F1-3-12-7 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-4 a F2-3-12-4 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-1 a F3-3-12-1, cambiado a F3-1-1-2 a F3-3-12-2 después de contar) Los nematodos en los agars F3-1-1-1 a F3-3-12-1 han crecido durante 2 d, los nematodos se cuentan y los marcadores se cambian en F3-1-1-2 a F3-3-12-2.\n12 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-10 a F0-3-12-10 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-7 a F1-3-12-7 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-4 a F2-3-12-4 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-3 a F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-11 a F0-3-12-11 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F4-1-1-0 a F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-8 a F1-3-12-8 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-5 a F2-3-12-5 agars han crecido durante 1 d.\nLos nematodos en los agars F3-1-1-2 a F3-3-12-2 han crecido durante 3 d y los marcadores se cambian en F3-1-1-3 a F3-3-12-3. Los nematodos F3 comienzan a reproducirse hoy en día y se transfieren a 36 nuevos agars NGM son necesarios y marcados como F4-1-1-0 a F4-3-12-0. Para los estudios MGR, la descendencia de F3 (es decir, T1') comienza hoy.\n13 36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-11 a F0-3-12-11 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-8 a F1-3-12-8 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-5 a F2-3-12-5 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12) El número total de nematodos en F3-1-1-1 a F3-3-12-1, F2-1-1-4 a agars F2-3-12-4 y F2-1-1-5 a F2-3-12-5 se utilizan para calcular la reproducción inicial de F2.\n36 (F4-1-1-1 a F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-12 a F0-3-12-12 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-9 a F1-3-12-9 agars han crecido durante 1 d.\nLos nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-6 a F2-3-12-6 agars han crecido durante 1 d.\nLos nematodos de descendencia de F3 en F4-1-1-0 a F4-3-12-0 han crecido durante 1 d, y los marcadores se cambian en F4-1-1-1 a F4-3-12-1.\n14 36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-12 a F0-3-12-12 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-9 a F1-3-12-9 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-6 a F2-3-12-6 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 a F4-3-12-1, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F4-1-1-1 a F4-3-12-1 han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos. Para los estudios mgr, los nematodos T1' han crecido durante 2 d, y comenzarán a reproducir T2' al día siguiente (D15), y T2' comenzará a reproducirT3' en D18. La vida útil del tipo salvaje C. elegans se muestra como 15 días. Entonces, el final de la vida útil de T3' será en D33.\n36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-13 a F0-3-12-13 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-10 a F1-3-12-10 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-7) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-7 a F2-3-12-7 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-4 a F2-3-12-4 agars han crecido durante 1 d.\n15 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-13 a F0-3-12-13 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-10 a F1-3-12-10 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-7, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-7 a F2-3-12-7 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-4 a F3-3-12-4 agars han crecido para 2d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-14 a F0-3-12-14 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-11 a F1-3-12-11 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-8 a F2-3-12-8 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-5 a F2-3-12-5 agars han crecido durante 1 d.\n16 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15, over) 36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14, despejado después de contar) La vida útil del tipo salvaje C. elegans se muestra como 15 días. Por lo tanto, F0 debería haber muerto antes del día 16 desde la exposición.\n36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-14 a F0-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-11 a F1-3-12-11 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-8 a F2-3-12-8 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-5 a F3-3-12-5 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12) El número total de nematodos en F4-1-1-1 a F4-3-12-1, F3-1-1-4 a agars F3-3-12-4 y F3-1-1-5 a F3-3-12-5 se utilizan para calcular la reproducción inicial de F3.\n36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-15 a F0-3-12-15 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-12 a F1-3-12-12 agars han crecido durante 1 d.\nLos nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-9 a F2-3-12-9 agars han crecido durante 1 d.\nLos nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-6 a F2-3-12-6 agars han crecido durante 1 d.\n17 36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15, despejado después de contar, más) Los nematodos de descendencia de F0 en F0-1-1-15 a F0-3-12-15 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos. No habrá más descendencia F0.\n36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-12 a F1-3-12-12 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-9 a F2-3-12-9 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-6 a F3-3-12-6 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-13 a F1-3-12-13 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-10 a F2-3-12-10 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-7 a F2-3-12-7 agars han crecido durante 1 d.\n18 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-13 a F1-3-12-13 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-10 a F2-3-12-10 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-7 a F3-3-12-7 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-11 a F2-3-12-11 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-8 a F2-3-12-8 agars han crecido durante 1 d.\nEn los estudios mgr, T2' comenzará a reproducir T3' hoy en día. La vida útil del tipo salvaje C. elegans se muestra como 15 días. Entonces, el final de la vida útil de T3' será en D33.\n19 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15, over) 36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-11 a F2-3-12-11 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-8 a F3-3-12-8 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-15 a F1-3-12-15 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-12 a F2-3-12-12 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-9 a F2-3-12-9 agars han crecido durante 1 d.\n20 36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F1 en F1-1-1-14 a F1-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos. No habrá más descendencia de F1.\n36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-12 a F2-3-12-12 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-9 a F3-3-12-9 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-13 a F2-3-12-13 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-10 a F2-3-12-10 agars han crecido durante 1 d.\n21 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-13 a F2-3-12-13 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-10 a F3-3-12-10 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-14 a F2-3-12-14 agars han crecido durante 1 d.\n36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-11 a F2-3-12-11 agars han crecido durante 1 d.\n22 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15, over) 36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-14 a F2-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-11 a F3-3-12-11 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-12 a F2-3-12-12 agars han crecido durante 1 d.\n23 36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F2 en F2-1-1-15 a F2-3-12-15 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos. No habrá más descendencia F2.\n36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-12 a F3-3-12-12 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-13 a F2-3-12-13 agars han crecido durante 1 d.\n24 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-13 a F3-3-12-13 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-14 a F2-3-12-14 agars han crecido durante 1 d.\n25 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15, over) 36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-14 a F3-3-12-14 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\n36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-15 a F2-3-12-15 agars han crecido durante 1 d.\n26 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15, despejado después de contar) Los nematodos de descendencia de F3 en F3-1-1-15 a F3-3-12-15 agars han crecido durante 2 d, y los agars se limpian después de que se cuentan los nematodos.\nEn particular, en los estudios de MGR, la primera descendencia no expuesta de F3 (es decir, T3') nacería en D18. La vida útil del tipo salvaje C. elegans se muestra como 15 días. Entonces, el final de la vida útil de T3' será en D33.\nTanto los estudios MGE como MGR cubrirán más días cuando la vida útil del nematodo sea más larga.\nTabla 1: Lista de marcadores y sus definiciones.\nMida la reproducción y la vida útil en estudios de efectos MGE.\nEn D0, repita el paso 5.6. Marque los agars (3 grupos con 10 réplicasen cada uno) como Fx- a -b-c, donde x se refiere al número de generación, a se refiere al número de grupo (1 para el control, 2 para la baja concentración y 3 para la alta concentración ); b se refiere a la réplica de 1 a 10; y c se refiere a la duración de la exposición (0 indica el inicio). Para D0, marca los agars como F0-1-1-0 a F0-3-10-0. Los lectores pueden consultar la Tabla 1 para obtener información detallada.\nEn D1, compruebe el crecimiento del nematodo en los agars y cambie los marcadores de F0-1-1-0 a F0-3-10-0 a F0-1-1-1 a F0-3-10-1.\nEn D2, compruebe el crecimiento del nematodo en los agars y cambie los marcadores F0-1-1-2 a F0-3-10-2.\nEn D3, elija 24 nematodos F0 de cada grupo en 12 nuevos agars NGM con dos agar NGM del paso 5.4. Marque los agars como F0-1-1-3 a F0-3-12-3.\nEn D4, transfiera los dos nematodos principales de F0-1-1-3 a F0-3-12-3 recogiendo nuevos agars NGM del paso 5.4. Marque los nuevos agars NGM como F0-1-1-4 a F0-3-12-4. Cambie los marcadores de F0-1-1-3 a F0-3-12-3 a F1-1-1-1 a F1-3-12-1 para representar la descendencia de F0 (es decir, F1) dentro del primer día desde que F0 comienza a reproducirse.\nEn D5, utilice un microscopio de disección para contar los nematodos en los agars F1-1-1-1 a F1-3-12-1 donde los nematodos han crecido 2 días. Permita que F1-1-1-1 a los agars F1-3-12-1 reproduzcaN F2 para generaciones sucesivas.\nTransfiera los dos nematodos principales de F0-1-1-4 a agars F0-3-12-4 recogiendo nuevos agars NGM del paso 5.4. Marcos NGM agars como F0-1-1-5 a F0-3-12-5. Cambie las marcas de F0-1-1-4 a F0-3-12-4 a F1-1-1-2 a F1-3-12-2 para representar la descendencia de F0 (es decir, F1) dentro del segundo día desde que F0 comienza a reproducirse.\nEn D6, cuente los nematodos en los agars F1-1-1-2 a F1-3-12-2. Transfiera los nematodos primarios de F0-1-1-5 a agars F0-3-12-5 a F0-1-1-6 a F0-3-12-6. Cambie los marcadores de F0-1-1-5 a F0-3-12-5 a F1-1-1-3 a F1-3-12-3 para representar la descendencia de F0 (es decir, F1) dentro del tercer día desde que F0 comienza a reproducirse.\nLos nematodos en los agars F1-1-1-1 a F1-3-12-1 han crecido durante 3 días. Utilícelos para reproducir F2 en estudios de efectos MGE sucesivos. De la misma manera, utilice nematodos F2 para reproducir F3 para continuar con los estudios de efectoMGE.\nDe la misma manera, transferir los dos nematodos principales diariamente y contar los nematodos de la descendencia al día siguiente, hasta que los nematodos primarios en 6 agars NGM (es decir, la mitad del total de agars en cada grupo) detengan la reproducción.\nCalcule el número total de crías durante toda la duración de la reproducción como el tamaño total de la cría. Utilice el número de descendencia dentro de los primeros 3 días para representar la reproducción inicial de los padres.\nUtilice el día en que la reproducción de nematodos padre se detenga en 6 agars NGM para estimar la duración de la reproducción. Utilice los días que cada padre ha sobrevivido como su vida útil.\nObtener la reproducción inicial, la duración de la reproducción, el tamaño total de la cría y la vida útil de F1 de la misma manera que se hace para F0. Del mismo modo, repitiendo el procedimiento antes mencionado, se puede obtener información de reproducción y vida útil de F2 (a Fn).\nMida la reproducción y la vida útil en estudios de efectos MGR.\nRealice el paso 7.2.4 con los agars NGM del paso 5.4 cambiadoa a los del paso 2.13.\nMida los índices bioquímicos.\nTire los nematodos de los agars NGM con agua estéril y recójalos en tubos de centrífuga. Liquidar los nematodos durante 30 minutos y desechar los sobrenatos. Utilice los nematodos en los pellets para la medición del efecto.\nAñadir 1 ml de solución salina tamponada de fosfato frío por hielo (PBS, pH 7.0) en los nematodos (pellets) en los tubos de centrífuga de 1,5 ml para lavar los nematodos.\nCentrifugar a 10.000 x g durante 5 min a 4 oC, y desechar cuidadosamente los sobrenadores con una pipeta.\nCongele los pellets con nitrógeno líquido o en un congelador de -80 oC.\nHomogeneizar los pellets utilizando pestillos en un baño de hielo. Utilice PBS helado de 200 l para lavar los líquidos residuales del pestillo en el tubo de centrífuga antes de sacar el pestillo.\nCentrifugar a 10.000 x g durante 5 min de nuevo a 4 oC de nuevo, y utilizar los sobrenadores para determinar las actividades o cantidades de bioquímicos con los kits comerciales (ver la Tabla de Materiales para más detalles).\nMida las cantidades de la proteína total (TP) en las muestras y utilice los resultados como denominador en la representación de otros indicadores bioquímicos, de modo que se pueda eliminar la diferencia entre los números de nematodos entre las muestras.\nMida la expresión génica.\nRepita los pasos 7.4.1 a 7.4.4. Aísle el ARN total de las muestras de nematodos utilizando un kit de extracción de ARN comercial (consulte la Tabla de materiales para más detalles) de acuerdo con las instrucciones21del fabricante.\nUtilice el ARN para sintetizar el ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante21.\nAnalizar la muestra de ADNendo en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) utilizando kits Rt-PCR sin fin de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales)21.\nCuantifique los niveles de expresión relativos de los genes elegidos por el método 2- CT22, y trate los niveles de expresión de gdp-2 (u otro gen de referencia) como referencia negativa.\nAquí, describimos protocolos para estudiar los efectos de los productos químicos a lo largo de generaciones utilizando C. elegans en estudios de efectos transgeneracionales (TG), exposición multigeneracional (MGE) y residuos multigeneracionales (MGR). Nuestros propios resultados de investigación se presentan como ejemplos. Un estudio presenta los efectos TG de los metales pesados en el comportamiento de la locomoción3. Los otros dos estudios presentan los efectos MGE y MGR del sulfometoxazoly el lindano en las mediciones de reproducción e índices bioquímicos y genéticos 4,14.\nEfectos tG de metales pesados en el comportamiento de locomoción de C. elegans\nLos efectos TG del cadmio (Cd), cobre (Cu), plomo (Pb) y zinc (Zn) en la frecuencia de flexión corporal (BBF) se estudiaron en el nematodo padre (F0) después de la exposición materna y su progenie (T1)3. Los efectos de los metales en BBF mostraron que las inhibiciones en T1 eran mayores que en F0, demostrando toxicidades más severas de metales pesados en el comportamiento de la locomoción en la descendencia expuesta al embrión que en el padre directamente expuesto. Los efectos TG de los metales pesados a concentraciones ambientalmente realistas demostraron que la exposición materna puede multiplicar los peligros de la contaminación por metales pesados en las generaciones venideras. Vea la figura1.\nFigura 1 : Los efectos del cadmio (Cd), cobre (Cu), plomo (Pb) y zinc (Zn) en la frecuencia de flexión corporal del padre nematodo (F0, en blanco) después de la exposición prenatal y su progenie (T1, sombreado). Barra de error: error estándar; * - significativamente diferente del control, p < 0.05; • - significativamente diferente de la concentración más baja, p < 0.05; + implica efectos significativamente diferentes en F1 que en F0, p < 0,05. Esta cifra ha sido modificada de Yu et al.3 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nEfectos del MGR del sulfametoxazol (SMX) en la vida útil y reproducción del nematodos\nLos efectos mgr de sulfametoxazol (SMX) en la vida útil del nematodo y la reproducción14 se estudiaron en el padre gestante (F0), descendencia expuesta a embrionarios (T1), descendencia expuesta a la línea germinal (T2), la primera descendencia no expuesta (T3) y las tres las siguientes generaciones (T4-T6). Los resultados mostraron que la reproducción (un tamaño total de la cría en el 49% del control) se vio significativamente afectada en la exposición a la línea germinal (T2), y las toxicidades persistieron en generaciones no expuestas de las generaciones T3 a T6 (Figura2). Nuestros hallazgos plantearon nuevas preocupaciones con respecto a las influencias a largo plazo de los propios antibióticos además de sus efectos sobre la resistencia a los antibióticos.\nFigura 2 : Tamaño de la cría (en (A), expresado en porcentaje de control) y reproducción inicial (en (B)) de C. elegans en el padre expuesto y su descendencia (F0, T1 a T6, de izquierda a derecha en cada concentración). Barra de error: error estándar; a - significativamente diferente del control por ANOVA (p < 0.05); b - significativamente diferente del control y de la generación anterior a la misma concentración (p < 0.05); c - significativamente diferente del control y de la menor concentración en la misma generación (p < 0.05); d - significativamente diferente del control y de la generación anterior a la misma concentración y la menor concentración en la misma generación (p < 0.05); e - significativamente diferente de la generación anterior a la misma concentración y la menor concentración en la misma generación (p < 0.05); f - significativamente diferente de la generación anterior a la misma concentración (p < 0.05). Esta cifra ha sido modificada de Yu et al.14 con permiso.\nEfectos MGE y MGR del lindano en los índices bioquímicos y genéticos del nematodos\nLos efectos MGE y MGR del lindano (un contaminante orgánico persistente [POP]) se estudiaron en los bioquímicos clave en los metabolismos lipídicos y los cambios en la expresión genética en la vía similar a la insulina4. Los resultados mostraron que el lindano mostró efectos obesogénicos con alteraciones en la regulación de la señal de insulina (Figura3). Además, los cambios entre la señalización sgk-1 (F0, F3, T1' y T3') y akt-1 (T1 y T3) indicaron que los nematodos de diferentes generaciones de exposición mostraban diferentes estrategias de respuesta para la tolerancia y la evitación.\nFigura 3 : Cambios de los niveles de expresión de genes clave en la vía de señal similar a la insulina en nematodos con diferentes experiencias de exposición. • Regulación positiva; : regulación negativa; :expresión up-regulation; :expresión down-regulation. Esta figura ha sido modificada de Chen al.4 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nCon el fin de llevar a cabo con éxito el protocolo descrito, se deben tener en cuenta las siguientes sugerencias. Realizar las operaciones experimentales generales en un entorno estéril. Un funcionamiento inadecuado puede dar lugar a la contaminación de las cepas de E. coli, por ejemplo, hongos y ácaros pueden obstaculizar el crecimiento normal de C. elegans y, por lo tanto, afectar a los resultados experimentales. En la sección que describe el cultivo de C. elegans, observe la escala de crecimiento de C. elegans en los agars NGM por ojos desnudos o microscopios. Cuando la escala de C. elegans en el agar supere el 75% en el área, o el tiempo de cultivo supere una semana, realice una nueva ronda de inoculación para evitar el crecimiento excesivo o la disminución de la población de C. elegans. Antes del proceso de sincronización, utilice un microscopio para observar el crecimiento de C. elegans,y continúe el proceso cuando los huevos de nematodos se distribuyen ampliamente en el agar. Además, si se utilizan disolventes (p. ej., dimetilsulfóxido [DMSO]), sus concentraciones en las soluciones de stock deben ser inferiores al 1 % para garantizar que sus concentraciones finales no superen el 0,5% (v/v) para evitar los efectos adversos de los propios disolventes. En los estudios de efecto TG, la duración de la exposición superior a 24 h es necesaria para garantizar que el tiempo de exposición cubra la formación embrionaria de la siguiente generación, y la duración debe ser dentro de 96 h para facilitar la separación de la generación posterior. Utilice pequeñas cantidades de nematodos (generalmente dentro de 20) para medir la vida útil y la reproducción. Por otro lado, utilizar grandes cantidades de nematodos (generalmente más de 500) para medir índices de regulación bioquímica y genética. Por lo tanto, con el fin de asegurar un número suficiente de muestras, realizar experimentos preliminares para estimar aproximadamente cuántos descendientes pueden reproducirse los nematodos F0 maduros dentro de las primeras 24 horas desde que comienzan la reproducción. A continuación, determine el número de nematodos F0 necesarios para asegurarse de que hay al menos 200 crías para los estudios multigeneracionales que proceden.\nEn comparación con los informes anteriores de estudios de TG con C. elegans,el protocolo experimental actual era más considerado de la elección de la etapa de la vida. En C. elegans,los espermatozoides se forman en la etapa L4 para fertilizar los ovocitos formados posteriormente23. En consecuencia, la exposición que cubre el período de espermogénesis y ootogénesis proporcionará una ventana particular para estudiar los efectos de TG en la descendencia. Los huevos sincronizados con la edad se utilizan para estudios de efectos multigeneracionales para garantizar que la exposición cubra el período global desde el comienzo de cada ciclo de vida. En comparación con estudios multigeneracionales anteriores, el protocolo experimental actual facilitó la medición de efectos a lo largo de varias generaciones en lugar de sólo 1-2 generaciones. Además, el presente protocolo consideró los efectos MGE y MGR, que es más sistemático que los estudios anteriores que sólo midieron los efectos MGE o MGR.\nEn particular, todavía hay algunas cuestiones que deben tenerse en cuenta en el actual protocolo experimental. El protocolo actual emplea C. elegans de tipo salvaje cuyo tiempo de generación es de alrededor de 60 h y la vida útil es de 20 días. Esto hace que la duración total del experimento sea bastante larga (por ejemplo, el estudio de efectos MGE sobre la vida útil durante 3 generaciones requiere al menos 30 días). Con el fin de acortar el tiempo, los investigadores pueden elegir mutante C. elegans, como los nematodos mutantes de corta duración. Otro problema es el tratamiento de matar a las bacterias, cuyo estado vivo es necesario para mantener los nematodos sanos 24. Además, el proceso de matanza UV podría introducir cambios en los productos químicos25. Por lo tanto, se deben considerar otros tratamientos en las bacterias, y puede ser necesario un control cuidadoso de los cambios químicos durante el proceso de preparación o exposición, especialmente para compuestos inestables. Al mismo tiempo, hay limitaciones en el estudio de las diferencias sexuales en los efectos tóxicos porque la mayoría del hecho de que C. elegans es hermafrodita. Se necesitan más mejoras para investigar la contribución sexual en los efectos TG, MGE o MGR. En resumen, anticipamos que el protocolo propuesto será un gran significado para el uso de C. elegans para estudiar los efectos TG, MGE y MGR de los tóxicos.\nLos autores agradecen los apoyos financieros del Proyecto Principal Nacional de Ciencia y Tecnología para el Control y Tratamiento de la Contaminación del Agua (2017ZX07201004), y el Programa Internacional de Cooperación Científica y Tecnológica de China (No 2016YFE0123700).


Compartir Así serán las tiendas Ikea del futuro: en el centro de la ciudad, con jardín público en vez de parking y hotel integrado en sus instalaciones\nRenovarse o morir es, más que un dicho, un mandamiento en el mundo de los negocios. Anticiparse a los cambios en el comportamiento y demandas de los consumidores es lo que marca la diferencia entre la supervivencia y la quiebra. En ese sentido, las tiendas Ikea situadas a las afueras de las ciudades están empezando a convertirse en un modelo vintage de la cadena sueca.\nDesde que en 2016 la multinacional permitiera comprar a distancia a través de su tienda online, y tras la apertura de puntos de venta más reducidos en el centro de grandes ciudades como los Ikea de Goya y Serrano en Madrid, la estrategia pasa por acercar sus productos a los clientes que viven lejos de sus grandes tiendas y hacerlos más accesibles.\nEn estos establecimientos ya es posible pedir y recoger muebles y artículos de decoración, aunque solo están disponibles para comprar en el momento una selección reducida de los mismos. No obstante, con el modelo de tienda que Ikea está construyendo en el centro de Viena, da un paso más allá y sitúa el concepto en un lugar intermedio entre su antigua y nueva estrategia.\nCon siete plantas y ni una plaza de aparcamiento, la idea es que los clientes se desplacen hasta las inmediaciones a pie o en transporte público. Por lo tanto, las compras de mayor volumen tendrán que entregarse a domicilio desde uno de los almacenes cercanos. Eso sí, mediante vehículos eléctricos. Aunque en algunas ciudades como Burbank, California, ya se está probando este nuevo planteamiento, será en Viena donde se introduzca en Europa.\nAdemás, el espacio se vuelve más urbano y pasa a incluir características que se salen del uso comercial como un jardín público en su azotea. Un espacio abierto que permanecerá abierto a los ciudadanos incluso fuera del horario comercial de Ikea. Por otro lado, tampoco será la única vegetación que aportaría al paisaje ya que su estructura semiabierta está pensada para dar cobijo a alrededor de 160 árboles.\nNo obstante, más fuera aún de lo común resulta que sus dos últimas plantas vayan a estar ocupar por un híbrido entre hostal y hotel. Se trata de un Joe&Joe con 345 camas, restaurante, bar y una amplia programación de eventos. Las obras comenzaron el pasado 7 de enero y se espera que estén terminadas para 2021.


LAS ATERRADORAS HISTORIAS DE NUESTRAS PRINCESAS DISNEY\nPor TuCOSMOPOLIS · Publicado el 27/01/2018 · Actualizado enero 27, 2018\nLAS ESCALOFRIANTES HISTORIAS DETRÁS DE NUESTRAS ADORADAS PRINCESAS DE DISNEY\nWalt Disney nos vendió la idea de un mundo feliz, infantil y dulce, en donde todo se encuentra pintado de rosa, pero sus ideas en realidad están basadas en cuentos escalofriantes y que no eran aptos para un público infantil precisamente. Las princesas de Disney esconden orígenes más obscuros de lo que imaginas.\nEn la verdadera historia escrita por los hermanos Grimm cuenta que una de las hermanastras de cenicienta se cortó parte de los talones y la otra se mutiló parte de sus dedos en un desesperado intento de que el pie de una de ellas pudiera entrar en la zapatilla de cristal.\nAfortunadamente Cenicienta logra demostrar que ella es la verdadera elegida. Sin embargo no todo es un final feliz, sus hermanastras acuden a su boda y unos pájaros les sacan los ojos. Los hermanos Grimm siempre le ponían un toque macabro y sangriento a sus cuentos, ¿Verdad?\n*BLANCA NIEVES Y LOS SIETE ENANITOS.\nDe nueva cuenta tenemos una historia escrita por los hermanos Grimm, las cosas resultan bien para Blanca Nieves, pero su malvada madrastra sufre una muerte espeluznante. Los enanitos la obligan a usar unos zapatos de hierro hirviendo al rojo vivo y la hacen bailar hasta que muera. Lo dicho, los hermanos Grimm tenían un humor bastante extraño y retorcido.\nLos hermanos Grimm también son la mente creativa detrás de esta historia, pero la idea de que Rapunzel lograra escapar de la torre no fue de ellos. En el cuento original Rapunzel es prisionera, aparece un caballero andante con la intensión de rescatarla, pero no lo consigue ya que la bruja que mantiene cautiva a Rapunzel lo hace caer sobre unas espinas. Queda ciego y para su fortuna las lágrimas de Rapunzel lo curan, pero no logran salir de la torre, se quedan a vivir ahí por siempre alimentándose de aves que cazan. Hay quienes podrían pensar que es un final feliz, pero ¿Quedarse encerrados de por vida en una torre? Seguro terminaron odiándose.\n*LA SIRENITA, UNA DE LAS HISTORIAS MÁS TRISTES.\nAriel siempre ha anhelado salir a la superficie y conocer el mundo humano, una bruja concede su deseo: le dará piernas pero a cambio de su voz, y eso no es todo: caminar tendrá un costo muy alto para ella, será como andar sobre cristales afilados. Ella salva al príncipe, sin embargo, él jamás logra recordarla y se casa con otra mujer, quien cree fue su salvadora. En su condición de muda\njamás puede hacerle saber la verdad. Lo sé, es demasiado frustrante. La única forma en la que podría volver a ser una sirena sería matando al principie, pero ella prefiere arrojarse al mar, encontrando así su final, convertida en espuma.\nLa versión de los hermanos Grimm es muy sombría y cruel, deja de lado cualquier toque de romanticismo. Aquí no hay nada de valientes caballeros andantes. La princesa dormida es encontrada por un cazador que la viola y se marcha. No es lo que esperabas, ¿cierto?\nSorprendente, ¿Alguna vez te imaginaste cómo eran estos cuentos originalmente? No cabe duda que Disney ha sabido convertir estas historias en dulces e inocentes y que la versión moderna, carente de todo ese fondo descarnado, siempre será nuestra favorita.\nLAS 6 PEORES PELÍCULAS DEL 2017\nSiguiente Historia ESCENAS MAS DIFÍCILES DE GRABAR EN LA HISTORIA DEL CINE\nHistoria anterior 15 DATOS CURIOSOS QUE DE SEGURO NO SABIAS DE MI POBRE ANGELITO\nCosas que sabias y no sabias de fairy tail ( ͡≖ ͜ʖ ͡≖ )


21 febrero 2019 ¿Qué opinas sobre la actualización? — Big Farm - Forum\n21 febrero 2019 ¿Qué opinas sobre la actualización?\n19.02.2019 editado 19.02.2019 en ¿Qué opinas?\nMuy pronto tendremos una actualización y nos gustaría saber vuestra opinión sobre su contenido. Para acceder a toda la información de la nueva actualización puedes hacerlo desde aquí\nPost edited by Maty on 19.02.2019\nhola... todo se ve muy bonito, los perfiles de los musicos me encantan , las decoraciones se ven increibles pero para mi el juego sigue un poco lento y asi se que no voy a ganar nada de eso porque me lleva mucho tiempo recoger y tengo una vida y no puedo dejarla por el juego... pero todo se ve super...\nHola Maty, disculpe a qué se refiere "paquete de suscripción" , por lo que entiendo ya existe , me lo aclararía así estar al tanto de ello, gracias.\n19.02.2019 editado 20.02.2019\nSobre la lentitud que comentas, pincha esto, y posiblemente eso te ayude a facilitarte la acción del juego y ¿qué me dices de las nuevas decoraciones y avatares, descubriste quien son cada uno de ellos?\nPost edited by Maty on 20.02.2019\n19.02.2019 editado 19.02.2019\nΔ Zafiro Δ (HIS1) dijo:\nHola Δ Zafiro Δ (HIS1):\nLos paquetes de suscripción son una de las últimas novedades de Big Farm y para acceder a toda la información sobre ese tema puedes pinchar esto y también esto amigo Δ Zafiro Δ\nDe mi lado todo son preguntas.\nAunque no soy del nivel de competir por el primer lugar del campeonato mundial me gustaría saber lo siguiente sobre estas decoraciones que se ganara el primer lugar mundial. Hago estas preguntas porque me imagino que después las pondrán en venta por una módica cantidad de apenas unos 500 oros.\nDespués del fracaso rotundo con la idea de los cometas y que tuvieron que cambiar la visión después de casi un año, perjudicando a jugadores que habían invertido dinero real en comprar no 1 ni 2 sino algunos hasta 15, 20 o mas (lo vi en algunos servidores en el hispano por supuesto no), cual es el plan con estas decoraciones. ¿Son acumulables sus beneficios?, ¿Solo se puede tener una por cada tipo de beneficio?.\nHablemos de cada una de ellas.\nAumento de combustible +20.... OK esta parece fácil de entender, actualmente en las competiciones de caballos se pueden tener +10 por cada hora y +11 si pagas el bidón pequeño y hasta +13 si pagas el bidón grande. Entonces: Si colocas esta decoración ahora ¿Podrás tener... +20, +21 y +23 respectivamente?\nAgrega un 10% alijo de Lester... Es decir el porcentaje que tienes -10%...por ejemplo alguien que ahora se ahorra un 15% se podrá ahorrar 25% en una de las lineas de su pedido, ¿Es correcto?.\nReduce el tiempo de producción del Bahía sirena en un 10%.... Simple...recetas de 8 horas en 7 horas y 12 minutos. No creo que necesite confirmación.\nEstablece el medidor de amistad en el barco del contrabandista siempre en el nivel 1. Bueno, quien no quiere estar bien con Yarnacle.\nDesbloquea la ranura de construcción adicional (slot) para la granja temporal Doble de velocidad de construcción en las temporales. Lo quiero ya, solo esperare que salga su gran oferta de 500 oros por cada una de estas decoraciones\nSteve dice: ¡Ciao por ahora! ¿Quiere decir que no es definitivo las construcciones sin arquitecto?, ¿Steve volverá a las granjas?\nDe las fichas de construcción ¡Bien!, de la temporada de caballos, ¡Bien!, Manuales para el Bahía, No se, ¿Vale la pena?, Prime Day escalonados, ni idea, seguramente les interesara a algunos.\nCorrección de errores, ojala se enfoquen en optimizar la velocidad del juego, es lo que mas esta haciendo huir a la gente y buscarse otras opciones para relajarse.\nSaludos jugadores. @Maty espero algunas respuestas concretas.\nFelices [email protected]\nAh !! Bien , no conocía dicha información , gracias por el alcance ,Maty.\nOjala le sea brindada esa información a Maty y así llegada hacia nosotros.\nYa que aunque las actualizaciones mantienen su factor sorpresa , y se entiende.\nCierta información debe ser proporcionada, dudo mucho ésta aparezca en el icono de información de cada decoración, si es acumulable ayudaría conocer, pero me amparo y desearía ofrezcan solo una.Pues si no hay filtros , digo que de llegado al 100 % en lester , no creo exista un 110 % de descuento, sería extraño así que algo de lógica ahí viene bien, incluso la mecánica de que quienes ya tengan 1,2,3,4,5 por ciento , en serio , el lío que se van a armar, y el lío para aquellos nosotros que como comunidad apuntaremos a desear pues alguna de estas decoraciones.\nUna de cada una lo considero perfecto.\nSean obtenidas con algún tipo de cambio, no, al menos antes de sea proporcionada buena información.\nPor otra parte,ese evento difiere de las cometas, esas se compraban abiertamente, estas imagino por parámetros brindaran para cada limite de nivel al año menos de 12,sin confirmar algún otro modo de obtención. No se la periodicidad , pero dado las frecuentes errores,un poco de prudencia para quienes ejecutan la mecánica de esos eventos y nos invitan a participar en ella.\nPara nosotros cautela y a la espera .\nY también más información de cada decoración viene bien para los jugadores tengan en cuenta al momento de elegir,así nos brindan "cero titubeo" al definir nuestras acciones.\nOjala le sea llegado más información ,Maty.\nDejad constancia, en este tema, de todas las dudas y preguntas que tengáis sobre la nueva actualización pues nos han pedido un informe con vuestras impresiones, dudas, comentarios, etc una vez finalice la actualización y hayan recogido vuestras dudas y preguntas, será el momento de poder darles respuesta.\nNecesito que sigáis aportando vuestras dudas y comentarios sobre estas novedades ¿me ayudáis?\nCoincido con las exposiciones /preguntas de Aleydy y Zafiro.\nPor el momento la nueva actualización parece atractiva.\n¿Tienes alguna duda o pregunta sobre las novedades que desees compartir con todos, tú también?\nHola Maty ,gracias por el enlace, ya lo habia visto,hice lo que dicen alli y pues no funciono mucho, pero espero que ha medida que evoluciona el juego se agilise cada vez mas... por otra parte me gustaria ganarme el perfil de Michael Jackson me encanta ese.. el peinado de Amy Winehouse es imperdible\nGracias ... saludos desde Colombia...\nA mí también me gustan mucho los nuevos avatares con temática musical y si tuviera que elegir uno, no sabría cual elegir, son todos tan originales ¿a que sí? .\n20.02.2019 editado 21.02.2019\n.... me autocito.....\nde momento no hay preguntas o dudas, aclarar un poco más los "reductores" y "aumentadores" con sus porcentajes de ventajas que comentan los farmer que he citado más arriba.\nEDITO: Señores de GGS, ¿Tendremos que hacer multicaptura de pantalla de todas las granjas, inventario etc, antes de la actualización, por si acaso nos encontremos el inventario a 0 o cualquier otra sorpresa?\n21.02.2019 editado 21.02.2019\nPrimera opinion,la sembradora esa es una caca,una caca grande.\nVan a hacer algo en este juego k no suponga tener k gastar oros para todo?\nPost edited by FarmerMARGUI (ES1) on 21.02.2019\nel boton es cojonudo!!!!!\nVaya desastre de con la sembradora, para que quieres una sembradora que te plante lo ultimo que has recogido en vez de lo ultimo que has plantado y encima te pone rinconeras para que te guarree los campos, jajjajaj soy una calamidad esto cada vez va a peor\nen vez de hacernos cosas para adelantar trabajo nos haceis atrasar, sois unos crack\nsembradora automatica!!! claro, siempra lo que le sale del moño jajjajajajaj y encima variadito para que tengas de todo en el almacen, a tomar pol saco la sembradora\nGracias por nada, no actualiceis nada mas !!! por DIOS!!!\n¿que le han hecho al juego? resulta imposible jugar, cada vez que cambio de granja, se cuelga, los productos los recoge a veces si y a veces no. Y ahora no me digan limpia cookies, porque la he dejado impecable, vamos que se puede comer en los establos, de lo limpita que ha quedado.\nHan mejorado la nitidez mucho, tanto en Opera como Basilisk (variante de FF), eso si, en Basilisk es imposible jugar por la lentidtud . Y lo del arquitecto divinamente, esperemos que lo dejen asi.\nTienes razón, cuando finalizó la actualización de hoy, se encontró un problema con la cosechadora veloz. En lugar de la cantidad real "cosechada" previamente, planta solamente la cantidad más baja disponible. Esto sucede porque la nueva característica no detecta correctamente la última cantidad cosechada pero sólo sucede la primera vez. Cuando prepares otra producción con la cantidad real que desees comenzar con el próximo uso de la cosechadora veloz, verás que se inicia la cantidad correcta.\nLa idea de la sembradora veloz es un intento solo eso, tiene varios errores pero el peor que veo es el que al tener un edificio como el vivero que si no tiene sus elementos completos para reiniciar la producción se puede reiniciar con oro, muchos dejamos esos edificios sin producir hasta que llegan las cajitas que saltan muy de vez en cuando y que son difíciles de conseguir sobre todo en la granja de flores.\nEntonces si yo quiero sembrar por ejemplo mis colmenares y ahorrarme los clicks, han inutilizado el botón, porque no me voy a gastar lo que me hace falta para activar el vivero en oros, si es un edificio que por estrategia esta detenido. Acá si les hace falta la opción de gastar oros, no gastar oros. Pero claro....igual los que pagan esas opciones están dispuestos.\nDejo una imagen para dejarlo mas claro.\nCreo que la idea de todos respecto a esta herramienta y sobre todo pensando en los campos era (me dicen si me equivoco).\nEstoy jugando Desafió de cooperativas, tengo mis campos vacíos y me salta una misión de por ejemplo maíz. Voy y siembro mi primer campo de maíz y después click a la sembradora y todo ha quedado resuelto...tengo todos mis campos sembrados.\nEn lugar de eso, cada campo es un ente individual, entonces lo que debo hacer es ir y sembrar los 10,20 o 30 campos y después usar la sembradora, que de nada sirve porque si ya pague una suscripción, mejor me doy otra vuelta por todos los campos y los pongo en repetición con la cosechadora trepidante, ¿Porque?, porque ahí no necesito estar viendo cuando sale mi próxima cosecha para levantar y volver a dar click a la sembradora.\n@Maty te dejo esta reflexión muy personal, pero que emana del conocimiento del juego, hace 4 años cuando llegue opinaba y nadie me hacia caso porque era [email protected] ahora conozco cada detalle del juego y me sigue gustando, pero a los programadores les falta algo para entenderlo, QUIZÁS JUGAR.\nEDICIÓN. Pongan un botón en cada edificio y que cada cual decida que edifico usa con las herramientas y cual no.\nReitero mis saludos a la comunidad.\nPost edited by Ooo SergiO ooO (HIS1) on 21.02.2019\nPues tienes razon Maty la segunda vez, te planta sin rinconeras, pero de todos modos, estoy con lo que comenta aleydy, de que te sirve tener un boton rapido para sembrar y recoger, previo pago de su importe, si no puedes recoger y sembrar lo que quieres selectivamente, es decir yo tengo todo plantado y le doy a la recogedora, pues me fatisdia todo, por que siendo silo, competicion o evento no me da la opcion de recoger solo lo que me hace falta, con lo cual me vacia la granja entera, no es de logica esto, con la sembradora ocurre lo mismo, que no te de la opcion de sembrar solo donde quieres es otra incoherencia, por que como dice aleydy si tienes algo parado, como en este caso el vivero, no la puedes usar por que te consume oros, igual aleydy tiene razon que les pongan a las programadores una salita donde prueben las cosas antes de ponerlas a funcionar ya que nos quitaron el tets server, y que juegen un rato y vean ellos mismos los fallos que cometen, seria una buena forma de que esto funcionara de una vez por todas\nOtro fallo que le encuentro al boton es el siguiente:\nSi has plantado plantas de borde y tienes los campos penalizados el boton te plantara de nuevo el producto que recogiste mas las plantas de borde , y lo que yo quiero es despenalizar los campos.\nTotal otro boton que se añade a tenerlo de decoración junto al de regar y a la turbocosechadora.\nSrs. de GGS déjense de botones innovadores que no sirven de nada, y arreglen los fallos que el juego tiene.\nHola aleydy y Liadark:\nLo del vivero es un tema que deberá analizar el equipo y lo de implementar un botón en cada edificio para decidir qué proceso se tiene en cuenta y cual no, podría ser una solución. Yo he pasado las ideas al equipo y veremos como prosigue el tema.\nPues me alegro de que sea asi, a ver si hay suerte\nY con chrome lo has probado?\nPost edited by Maty on 21.02.2019\nEl anuncio de la actualización, hablaba sobre nuevos manuales para el Restaurante Bahia Sirena, he mirado por curiosidad en la Biblioteca y ¡sorpresa!, cada manual vale 1.200 oros, para producir, en determinados manuales, una unidad más de producto\nNo suelo abrir mucho la Biblioteca, pero hoy me encuentro que el manual para producir 2 gorras más de capitán, para el Barco de Yarnacle, cuesta la módica cifra de 257.000 oros.\nPost edited by yomismo1 (ES1) on 21.02.2019\nCon opera, que tiene el mismo motor que chrome (de google no quiero nada ) si va bien y ya se ve nitido por fin.\nPor lo menos se debería poder seleccionar lo que queremos plantar o recoger.\nHola buenas noches, querria hacer una consulta, pero no quiero ir a soporte, porque la atencion, a mi entender, es bastante deficiente. La cooperativa terranova en el ultimo silo terminamos en quinta posicion y nos corresponde por esa clasificacion entre otros premios una patera, hay varas granjas de la cooperativa que no la han recibido, me pueden indicar la solucion ?\nPor descontado que al entrar se ha seleccionado la opcion de patera\nUn saludo ANGEL85\nANGEL85 (ES1) dijo:\nRevisaron los edificios temáticos estando en la granja Gourmet.\nDigo, no esta de mas preguntar.\nMuchas gracias aleydy, solucionado


Así me acosté el sábado anterior con la aprensión de escuchar un fuerte aguacero al otro lado de la ventana. Cuando desperté a las cinco de la mañana para desayunar e ir al Puerto Viejo para coger el autobús que me llevaría a la salida me llevé la grata sorpresa de que no llovía. Daba la sensación de que lo había estado haciendo toda la noche pero en ese momento daba una tregua que me vino de cine para ir al trote al lugar de recogida de los autobuses. A las seis de la mañana con muchos noctámbulos regresando de la fiesta abrigados para combatir el relente de la madrugada cruzarte con ellos al trote en pantalones cortos, descalzo y chapoteando por los charcos de la calle supongo que era una experiencia algo alucinante. De ahí la sencilla explicación de algunos gritos y risas que me hacían eco en mi camino hacia el puerto.\nVieux Port, 13001 Marseille, Francia


Studio 21 a1 libro profesor - Librería Nevada\nStudio 21 a1 libro profesor.\nEl libro del professor incluye información completa del concepto del método, comentarios y sugerencias didácticos para el desarrollo de la clase, información cultural adicional, así como formas de proceder alternativas para la atención a la diversidad. En el apéndice encontrará para cada unidad plantillas para hacer fotocopias y tests, los textos de audio del test modelo, así como las soluciones de los ejercicios de las unidades y de los tests.\nEl CD-ROM incluido -el generador de hojas de ejercicios-, le facilita la preparación de la clase. Con distintas herramientas podrá crear rápida y fácilmente hojas de ejercicios. Para ello dispondrá en cada unidad de las transcripciones de audio y video, así como textos de lectura escogidos, las frases clave y las listas de vocabulario de studio . Además le será de ayuda el Analysetool para adaptar textos propios al nivel de aprendizaje de su curso.


Como definir el lienzo y etapas del modelo de negocio | @tristanelosegui\nBusiness Model Canvas o el lienzo de modelo de negocio\nEn varias ocasiones he hablado de la metodología y marketing plan canvas: definir un perfil de audiencia, definir una estrategia de contenidos, alinear la estrategia de marketing con la empresa, e incluso os he mostrado una versión inicial sobre cómo aplicar un business model canvas a un plan de marketing. Pero nunca he descrito cómo se define y cuáles son sus aplicaciones en el contexto de una estrategia de marketing.\nEl éxito de una estrategia de marketing depende de la fortaleza de la relación entre los objetivos del negocio y los objetivos de la acción.\nEs decir, que negocio – estrategia – plan táctico – acciones/campañas, deben estar perfectamente alineadas para que estas tengan valor, para que realmente aporten al negocio.\nSi lo que vayas a poner en marcha, sea a nivel táctico o estratégico, no aporta valor a los objetivos de negocio, directamente NO LO HAGAS. Es así de sencillo.\nLa acción puede ser fantástica, la estrategia innovadora, etc. pero si el retorno que vamos a obtener, no me ayuda a conseguir los objetivos de negocio, no deberíamos ponerla en marcha.\nPor este motivo cuando defino una estrategia de marketing siempre empiezo por explicar como definir el modelo de negocio.\nEl Business Model Canvas, marketing plan canvas o Lienzo de Modelo de Negocio en definición creado por Alex Osterwalder es una forma sencilla de representar, a modo de cuadro de mandos, las variables más importantes de un modelo de negocio.\nEmpiezo por dejaros un vídeo explicativo y luego os comento las cosas a tener en cuenta para definirlo correctamente.\nCómo habéis visto el lienzo del modelo de negocio se compone por nueve variables que nos dan una visión completa del negocio y sus fortalezas y debilidades.\nA estas 9 etapas de un modelo de negocio yo le añado dos más que me permite ligarlo más directamente con la estrategia de marketing.\nPara ayudaros en su definición he añadido unas pequeñas instrucciones y un número, junto a cada uno de los elementos del lienzo de modelo de negocio.\nCon estas pequeñas instrucciones y el vídeo os sugiero que hagáis un primer ensayo con la empresa en la que trabajéis para entender por completo su utilidad.\nPara no insistir sobre lo que ya dicen las instrucciones, voy a destacar alguna de las etapas de un modelo de negocio:\nEs una herramienta para hacernos pensar: además de representar o crear nuestro modelo de negocio, nos va a ayudar a detectar sus puntos débiles, pero sobre todo, nos va a hacer reflexionar y mucho. Nada más sano para nuestra empresa que una parada en el camino para tomar un nuevo impulso.\nEste modelo de business canvas o estrategia de negocios canvas por definición, es especialmente interesante para empresas que ya están en funcionamiento. Existen otras modalidades más centradas en la validación de productos o startups.\nPara su definición partimos de una sesión de trabajo con las personas más directamente implicadas en la gestión de la empresa, para a continuación completar los datos concretos que sean necesarios.\nEs un documento vivo. Además de ser una referencia a consultar con cierta frecuencia, debemos revisarlo para actualizarlo.\nAl modelo original le he añadido: objetivos por etapa del purchase funnel y estrategia de marketing.\nAl obligarme a comparar los objetivos de mi estrategia de marketing y un esbozo de la propia estrategia, con el modelo de negocio, me aseguro de que ambas están alineadas.\nPara aumentar la efectividad del análisis os recomiendo completar este documento con la definición del perfil de audiencia, la propuesta de valor y el customer journey. Pilares del modelo de negocio y de la estrategia de marketing.\nbusiness model canvas, estrategia marketing\nEduardo Toledo Contestar 2017-06-13 a las 12:25 pm\nEstoy de acuerdo. Canvas, primero, y Mapa de empatía, después. Tanto para Marketing como para Comunicación.\nTristán Elósegui Contestar 2017-06-13 a las 12:34 pm\n¿A qué te refieres con el mapa de empatía? No lo había oído nunca.\nEduardo Toledo Contestar 2018-08-19 a las 1:24 am\nHola Tristán. Perdona por el retraso en contestar, pero no me saltó la alarma. Con mapa de empatía me refiero a conocer las necesidades reales del cliente: https://innokabi.com/mapa-de-empatia-zoom-en-tu-segmento-de-cliente/\nTristán Elósegui Contestar 2018-08-24 a las 5:03 pm\nEstá muy bien. Me gusta mucho la idea para definir el cliente ideal de una futura empresa, pero menos para una que esté ya en marcha, porque puedes caer en la idealización. Yo uso una combinación de dos metodologías: https://tristanelosegui.com/2017/05/16/como-definir-la-propuesta-de-valor-para-tus-clientes/ y https://tristanelosegui.com/2016/02/08/como-definir-un-perfil-de-audiencia-o-buyer-persona/, que creo que también funcionan.\nMiguel Macías Contestar 2017-06-16 a las 11:16 am\nMuy bueno el post Tristán!\nTrabajo con agencias de marketing cuando sus clientes necesitan antes replantearse muchas cuestiones de su modelo de negocio.\nEn ese sentido te quería presentar http://bevator.com donde puedes trabajar el modelo de negocio en tres etapas: entender, definir y validar. Tienes más de 20 herramientas actualmente disponibles y la posibilidad de diseñar tu propio itinerario de innovación y creatividad.\nCuando quieras lo hablamos para explorar sinergias 😉\nTristán Elósegui Contestar 2017-06-20 a las 7:56 pm\n¡He echado un vistazo a vuestra web y tiene muy buena pinta! Estamos bastante alineados.\nEva Contestar 2017-09-12 a las 5:25 pm\nGracias por el post. Toda la información muy útil. Quería saber si puedes comentarme sobre los modelos centrados en la validación de productos que has mencionado, ya que estoy comenzando con mi proyecto y podría ser muy interesante.\nTristán Elósegui Contestar 2017-09-12 a las 5:56 pm\nMe refiero a modelos tipo ‘lean canvas’. Te paso un par de enlaces que he encontrado buscando en Google:\nMargarette Contestar 2018-04-23 a las 4:59 pm\nBuenas es la tercera ocasion que visito esta\nwebsite y me he decido a comentar. fascina este\nblog. Que ¿temautiliza? me gustaria poder usarlo para mi sitio pero\nTristán Elósegui Contestar 2018-04-23 a las 5:14 pm\nHola! El tema se llama SimpleMag. un saludo!


Tenerife Design Week: Living Design Lab\n¡Hola! Este pasado mes de marzo se inauguro la 9ª edición de Tenerife Design Week, que fue dedicada a la Interacción y la Cultura Digital, planteando la entrada de lo digital en el ambito del diseño. Mi hermana y yo participamos en un taller del proyecto llamado Living Design Lab que se desarrolló en el Circulo de Bellas Artes de S/C de Tenerife.\nDurante numerosos fines de semana hemos ido al coworking del circulo a trabajar para finalmente exponer nuestro proyecto. Fue muy alegre y divertido, conocí a muchas personas y todo gracias a mi hermana, por la cual me uní en los últimos dos meses del proyecto (parecía que se lo estaba pasando muy bien y finalmente mi curiosidad pudo contra la pereza, hehe).\nEscrito por Aygul Akhunova en 0:53 No hay comentarios:\nEtiquetas: Diseño de Interiores, eventos y convenciones\nOrganizando y tirando productos de maquillaje\nHola! Hace un par de semanas pude ver este vídeo de Penelope Pop, en el que hablaba acerca de su colección de maquillaje y como solo usa lo básico. Su idea es que al ser ''Básica'' sabes lo que quieres y lo que necesitas. En el vídeo cuenta que hay tres preguntas que se hace a la hora de comprar maquillaje:\nEscrito por Aygul Akhunova en 15:07 3 comentarios:\nEtiquetas: Decluttering, Maquillaje


Madrid le "perdona" a Shakira su romance culé – xposedmagazinenews\nPosted by xposedmagazinenews on June 4, 2011 August 18, 2016\nAlgo menos de media hora después de lo previsto la artista de Barranquilla saltó al escenario del estadio Vicente Calderón enfundada en una cazadora de cuero metalizada, leggings negros y un pañuelo escarlata, al grito de “¡buenas noches Madrid!”. Shakira brindó al respetable nada más salir uno de sus temas emblemáticos, “Te dejo Madrid”, y aunque su gira se titula “Sale el sol” en honor a su último trabajo, no cantó más de tres temas de su nuevo disco, sino que optó por ofrecer un concierto ceñido a la seguridad que da ir enhebrando un antiguo éxito detrás de otro.\n“Estoy encantada de volver a Madrid, una ciudad que desde los inicios de mi carrera tanto cariño me ha dado. Esta noche, Madrid, soy toda tuya. ¡Te quiero, Madrid!”, ha exclamado la artista para, a continuación, cantar uno de sus clásicos, esa oda a la amante abandonada que es “Si te vas”.\nA los acordes de “Suerte” Shakira ha abierto su recatado atuendo para mostrar su célebre serpenteante ombligo enfundado en un dorado corpiño metálico, y ha preguntado al público quién quiere subir con ella al escenario.\nCinco adolescentes se han encaramado al escenario y han disfrutado del privilegio de recibir una clase práctica del arte de mover las caderas de la mano de Shakira, que a continuación ha agarrado una guitarra para tocar otro de sus clásicos, “Inevitable”.\nAl igual que hizo en anteriores conciertos, también en Madrid ha versionado Shakira la canción de Metallica “Nothing else matters”, aunque a su estilo, con bongos y enfundada en una falda roja de volantes con la que ha dado paso, descalza y mezclando palmas flamencas con su archifamoso contoneo de caderas, a “Gitana”.\nLa colombiana ha terminado de meterse en el bolsillo a los casi 40.000 madrileños que han ido a verla con éxitos como “La tortura” o “Loca, ciega, sordomuda”, y tras presentar a su banda internacional, por fin ha interpretado un tema de su último disco, “Sale el sol”, que además fue banda sonora de una conocida marca de cava las pasadas navidades.\nY de anuncio en anuncio, Shakira ha levantado a todo el estadio con “Las de la intuición”, una canción que también tuvo a toda España meneando rítmicamente la cabeza hace unos años gracias a la pegadiza publicidad de una marca de automóviles.\n“Loca” y “Loba”, dos de sus éxitos más recientes, han seguido caldeando el ambiente, para continuar con “Ojos así”, un tema antiguo con el que desde hace años Shakira rinde tributo a sus raíces libanesas a la vez que hipnotiza a sus seguidores con sus cimbreantes caderas.\nLa artillería pesada, al menos en lo que se refiere al vestuario, la ha dejado la colombiana para los bises, que no se han hecho esperar.\nUn vestido azul eléctrico con vuelo ha sido el atuendo que Shakira ha elegido para saltar de nuevo al escenario, aunque inmediatamente lo ha cambiado por las gasas de un traje beige con el que ha cantado “Hips don’t lie” (Las caderas no mienten), una de sus canciones más famosas y que originalmente cantaba con Alejandro Sanz.\nSea porque su novio es futbolista, porque actuaba en un estadio de fútbol o porque España ganó el Mundial de Sudáfrica, Shakira ha cerrado su concierto con el celebérrimo “Waka, Waka”, la canción oficial de la Copa del Mundo, y la que todo el mundo estaba esperando.\nPrevious Post Jacqueline Bracamontes usará varios vestidos de novia en su boda\nNext Post Se canta víctima Ojani Noa


Servicio Oficial Citroën, taller mecánico y venta de coches de ocasión\nCon una amplia experiencia al servicio de nuestros clientes, Ireauto 2000 se ha consolidado como la referencia en distribución, comercialización y reparación oficial Citroën, DS en Santa Cruz de Tenerife.\nDesde la creación de Ireauto 2000 en 1998 hemos dedicado todos nuestros esfuerzos a la mejora continua, si bien somos conscientes de lo importante que es un cliente satisfecho. Tu fidelidad es nuestro objetivo y la satisfacción es el motor que mueve el día a día de esta empresa.\nTe ofrecemos un taller de confianza donde reparar o realizar el mantenimiento de tu coche o tu vehículo industrial, con servicios de mecánica, carrocería y chapa y pintura, contamos con todos los servicios necesarios para que tu vehículo esté siempre como nuevo.\nRecogemos tu coche en tu domicilio, lo traemos al taller para su mantenimiento o reparación, y lo llevamos de nuevo hasta la puerta de tu casa, en perfecto estado y listo para la carretera.\nAdemás en En Ireauto 2000 disponemos de un área de venta de coches de ocasión, realizamos una inspección y comprobación exhaustivas de cada uno de los coches segunda mano que tasamos. Revisamos uno a uno todos los puntos sensibles del vehículo, y de igual manera, utilizamos un sistema informático que nos permite conocer el historial del vehículo. Todos los coches segunda mano ofertados pasan además por un completísimo proceso de preparación personalizado y puesta a punto en base a los mejores estándares de calidad.\nEn Ireauto 2000 colaboramos con la empresa Aivalau Canarias, en la que ofrecemos un servicio de alquiler de turismos y vehículos mixtos de todos los tipos y precios, nos ajustamos a tus necesidades de alquiler, podrás alquilar por días o semanas.\nVen conocernos a nuestras instalaciones de 1500 m², nuestro personal es un equipo profesional y preparado para atenderte a ti y a tu vehículo con la mejor atención y servicio personalizado.\nTeléfono 922 23 50 64cómo llegar\nNuestra sede para la reparación de vehículos industriales se encuentra en la calle Subida al Mayorazgo, 8. En el Polígono Industrial El Mayorazgo de Santa Cruz de Tenerife.\nEn esta sede se trabaja con todo tipo de vehículos industriales pesados, camiones y autobuses, entre otros.\nNos comprometemos con las fechas de entrega de los vehículos para causar el menor desajuste en nuestro cliente, a la vez que realizamos un servicio óptimo con las mejores herramientas y técnicas aplicadas por el personal altamente cualificado que compone nuestro equipo de trabajo. Nuestros precios ajustados junto con las anteriores características, nos convierten en una de las empresas líderes del sector en Canarias.\n¡No dudes en contactar con nosotros y pedir presupuesto sin compromiso!\nDiagnosis electrónica del estado del Vehículo