mejoramiento cepas | ADN | Mutación\nsalvarSalvar mejoramiento cepas para ler mais tarde\nCaptulo 3 SELECCION, MANTENIMIENTO Y MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL Seleccin\nDebido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado, en la eleccin del mismo se deberan tener en cuenta ciertos criterios generales que se indican a continuacin: 1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable. 2 Su velocidad de crecimiento debera ser alta. 3. La cepa debe estar libre de contaminantes, includos fagos. 4. Sus requerimientos nutricionales deberan ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo reducido. 5. Debe -ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo, sin prdida de sus caractersticas particulares. 6. Debera llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto. 7. Si el objetivo del proceso es un producto, ste debera ser de alto rendimiento y de fcil extraccin del medio de cultivo. Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. A nivel industrial, en general, cada firma posee su propia coleccin de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados a travs de tcnicas clsicas de mutacin o de ingeniera gentica. Sin embargo, estas cepas slo son empleadas por la industria que las posee, debido al gran valor comercial de las mismas. En algunos casos se dispone de organismos modificados genticamente para llevar a cabo reacciones especficas de biosntesis, degradacin o biocatlisis, los cuales estn protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos aislados o modificados no son disponibles para uso general en laboratorios. Existen en el mundo un gran nmero de colecciones depositarias de cultivos. Entre la diversidad de colecciones se destacan: "American Type Culture Collection", USA, la cual mantiene bacterias, levaduras, algas, actinomycetes, mohos, protozoos, virus y lneas celulares; "Colletion Nationale de Cultures de Microorganismes" del Institut Pasteur, Francia; "Northern Regional Research Laboratory" (NRRL), de Peoria, USA, y "National Collection of Type Cultures", Londres, Inglaterra. Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales como agua, suelo, plantas y desechos, la eleccin del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son de inters. Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas se podran encontrar organismos adaptados a la degradacin de estos productos qumicos; o en larvas de insectos muertos agentes causales de la muerte. Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica elegida para el mismo; en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, o b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra. 13\nUna vez efectuado el muestreo y seleccin (screening) para el aislamiento de una cepa de inters, la misma deber ser caracterizada. En este procedimiento se debe tener en cuenta que la composicin qumica del material a partir del cual se va a realizar el aislamiento comienza a variar a partir del momento en que es tomada la muestra, por lo tanto sta se debe procesar rpidamente, tratando de evitar alteraciones que afecten a la poblacin de inters. a) Aislamiento directo: en este caso es deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento permita la mxima expresin del material gentico del organismo. Si se busca por ejemplo un organismo con accin antimicrobiana, se puede crecer al potencial productor, en una caja de petri en presencia del o los organismos contra los cuales se requiere la accin antimicrobiana, observndose la produccin del inhibidor por las zonas de inhibicin de crecimiento. Para la deteccin de productores de factores de crecimiento tales como aminocidos y necletidos se utiliza la estimulacin del desarrollo de bacterias auxtrofas por un lisado del organismo. Esto se puede llevar a cabo en medios slidos. En este caso se debe tener una "rplica" de la caja a ensayar. Una vez obtenido el crecimiento en la primer caja, se replica a una segunda, antes de "matar" las colonias con luz. U.V., por ejemplo. Esta caja es luego cargada con agar conteniendo una suspensin del organismo auxtrofo al producto buscado. Despus de un perodo de incubacin se observa crecimiento en forma de halo alrededor de las colonias productoras, lo que permite el aislamiento de este organismo de la placa rplica. b) Enriquecimiento del cultivo: esta tcnica consiste en incrementar en una poblacin mixta el nmero de organismos de inters en relacin al resto. De esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos me diante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratos espe-cficos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos peridicos en medio fresco. Esto lleva a que el organismo de inters sea el dominante de la poblacin, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio slido. Se debe considerar en este caso el efecto del medio sobre la velocidad especfica de crecimiento (u). La seleccin de un organismo por este procedimiento depende de su valor de u comparado con los de los otros organismos. Evidentemente el dominante de la poblacin ser el que posea el mayor valor de u para las condiciones de cultivo empleadas. Sin embargo no necesariamente sera mas til un organismo de u ms alto; puede ser deseable uno con mayor afinidad por el sustrato. El problema de seleccin puede ser superado empleando el sistema de cultivo continuo, tema que se trata en el captulo 7, donde la fuerza de seleccin se mantiene a un nivel constante y el organismo dominante ser seleccionado por su afinidad por el sustrato, ms que por su u mxima En la Fig. 3 se muestra un modelo de competicin entre dos organismos capaces de crecer en un cultivo continuo enriquecido.\nEn cultivo continuo el valor de um est determinado por la concentracin de sustrato y es igual en estado estacionario a la velocidad de dilucin (D). A valores de u = D < uz se tiene que uA > uB y por lo tanto el organismo A podr ser seleccionado a pesar de que umA < umB (uz = valor de u a partir del cual uB > uA). Mantenimiento o conservacin de los cultivos Los objetivos de la conservacin de los cultivos se podran resumir en los siguientes aspectos: a) preservar la pureza gentica del cultivo sin prdida de ninguna de sus propiedades bioqumicas; b) preservar los niveles de su productivi dad inicial; c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Esto ltimo puede ser un factor esencial en la seleccin de un mtodo de preservacin. En todo trabajo de Microbiologa se deben conocer las caractersticas de la poblacin con la cual se va a trabajar (propiedades morfolgicas y bioqumicas). En este sentido, tanto en la conservacin como en el desarrollo del cultivo, ya sea el que suministra o el que recibe la cepa, deberan usar las mismas tcnicas metodolgicas. Tanto para el mantenimiento, preparacin y propagacin de inculos se deben usar mtodos reproducibles que no produzcan variaciones o prdidas de las caractersticas de la cepa empleada. No hay mtodos de mantenimiento en procesos industriales que sean comunes a todas las industrias, emplendose en algunos casos mtodos especficos secretos. El conocimiento de las caractersticas del cultivo es esencial en la eleccin de un mtodo de preservacin. La identidad del cultivo puede conocerse en base a sus caractersticas de crecimiento en uno o ms medios especficos, tomando en consideracin propiedades macro y microscpicas exhibidas, o en base a una evaluacin ms exhaustiva empleando muchos ensayos bioqumicos, biolgicos, inmunolgicos y genticos. En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibilidad de determinar en cada etapa si ha habido o no alteracin gentica. En la. mayora de las situaciones solamente se pueden notar cambios mensurables u observables tales como pigmentacin, morfologa, reacciones fermentativas, propiedades microscpicas, etc. El anlisis de estos parmetros junto con la determinacin cuantitativa del recuento de colonias antes y despus del proceso de mantenimiento brindan la informacin necesaria para la correcta evaluacin de la tcnica de conservacin a elegir. Los mtodos de preservacin o mantenimiento ms importantes son los siguientes: Subcultivos Es un mtodo comn de conservacin, que consiste en el repique peridico del cultivo en un medio nutritivo fresco. El intervalo de transferencia vara con el microorganismo, debiendo considerarse el medio adecuado para cada especie. Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 C durante lapsos que oscilan entre 15 das y 2 meses. Los inconvenientes que presenta son varios: a) incremento de la posibilidad de mutacin con cada transferencia, con prdida de las caractersticas del organismo; b) riesgo de contaminacin; c) alteraciones en el medio de cultivo, durante la estada en fro, en la cual se produce una desecacin gradual del mismo. 15\nEs una tcnica simple y efectiva para prolongar la conservacin de muchos organismos y consiste en cubrir completamente el cultivo despus de su desarrrollo en medio slido, con una capa de aceite mineral o vaselina estril. Los cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o an mejor en heladera por perodos de varios aos. Algunos autores sostienen que en estas condiciones los microorganismos pueden continuar reproducindose, con posibilidades de aparicin de mutantes; sin embargo se acepta que estas alteraciones no se observan hasta los tres aos de mantenimiento.\nDebido a que la actividad metablica de una clula se reduce considerablemente por mantenimiento a muy baja temperatura, la congelacin es una tcnica de eleccin, ya sea para cortos o largos perodos de tiempo. A esto ha contribuido tambin la mayor disponibilidad de nitrgeno lquido (-196 C) y el mejoramiento de los equipos de refrigeracin. La tcnica involucra el crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa las clulas son ms resistentes a los daos por congelacin y descongelacin, que las de fase exponencial. Tambin es aconsejable utilizar una densidad celular elevada en la congelacin, debido a que, cuando parte de las clulas se lisan se liberaran sustancias crioprotectoras que aumentaran el porcentaje de clulas sobrevivientes. Las clulas a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. El ms empleado es glicerol al 10%, aunque otros agentes como dimetilsulfxido, glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo, lactosa y extrato de malta, han sido tambin empleados. La suspensin celular es colocada en ampollas (vidrio o plstico) y sellada antes de colocarla bajo nitrgeno lquido. Uno de los problemas de esta tcnica se refiere a la velocidad de congelacin. Muchos estudios son coincidentes en sealar que una velocidad de congelacin lenta y una rpida descongelacin rinden los mayores nmeros de clulas viables. Se encontr que dependiendo de la naturaleza de las clulas, existe una velocidad de congelacin ptima en cada caso para obtener una mxima sobrevida. Como criterio general se puede decir que, lo ms ampliamente usado es el enfriamiento a 1 C min -1 (ya que una rpida congelacin causa ruptura de membranas) hasta -20 C y luego un rpido descenso. En cuanto a la temperatura de conservacin, la ms baja recomendada es -70 C, ya que a temperaturas ms altas ocurren algunas recristalizaciones, las cuales si son intracelulares son letales para las clulas. En caso de nitrgeno lquido, la conservacin podra prolongarse por aos, asegurando una buena provisin del mismo y disponiendo de equipos con sistemas de alarma en caso de fluctuaciones de temperatura.\nLa tierra estril puede ser inoculada con un cultivo e incubada varios das para inducir esporulacin de bacilos aerobios y anaerobios. Una vez que la misma se manifiesta, la tierra es secada (desecador) y el cultivo mantenido de esta forma en una atmsfera seca o en refrigerador. El mtodo ha sido utilizado ampliamente con hongos y actinomycetes, los cuales han sido mantenidos en estas 16\ncondiciones varios aos. Tambin se puede utilizar tierra para la conservacin directa de suspensiones de esporos.\nPreservacin en celulosa\nEl empleo de un soporte de papel para el mantenimiento de clulas en condiciones de ausencia de agua es un procedimiento adecuado y sencillo, para conservar cepas. La tcnica consiste en embeber tiras de papel de filtro con una suspensin densa de organismos en suero, glutamato de sodio u otro agente, las mismas son posteriormente colocadas en tubos para su posterior secado bajo vaco. De esta forma se han logrado conservar cepas de Streptomyres y Salmonella por perodos de hasta 2 aos a temperatura ambiente.\nLa liofilizacin est considerada como el mtodo ms adecuado para la preservacin de microorganismos. La tcnica involucra el congelamiento de un cultivo seguido por un secado bajo vaco, lo cual resulta en la sublimacin de agua de la suspensin celular. La ventaja es que la mayora de los organismos sobreviven al secado y el cultivo es fcilmente mantenido an a temperatura ambiente sin prdida significativa de viabilidad. La liofilizacin es apropiada para la conservacin de la mayora de las bacterias, encontrndose que las Gram-positivas sobreviven mejor que las Gram-negativas cuando se las liofiliza y mantiene en condiciones similares. Tambin se emplea en la conservacin de esporos, actinomycetes y muchos hongos incluidas levaduras. Sin embargo, no es adecuada para clulas animales, algas y hongos en fase de micelio. La tcnica consiste en partir de un cultivo de fase estacionaria (donde las clulas son usualmente ms resistentes) resuspendiendo las clulas con un medio crioprotector, en el cual se obtenga una alta densidad celular. Unas pocas gotas de suspensin celular son transferidas a una ampolla, la cual es congelada a aproximadamente -40 C y deshidratada mediante una sublimacin en vaco. Este debe ser mantenido en 5-10 um mediante una bomba. El secado contina hasta llegar a valores de humedad del orden del 1%; luego, la ampolla es sellada bajo vaco. Se debe evitar la formacin de radicales libres que se producen por exposicin de las clulas al oxgeno, ya que estn asociados con prdida de viabilidad; de all la importancia de mantener el vaco. El medio empleado en la liofilizacin es un factor importante en el proceso. Entre los agentes recomendados estn la leche descremada en concentraciones del 10 al 20%; suero equino, mezclas de suero, glucosa y extrato de levadura; suero fetal bovino, etc. En algunos casos el efecto protector de la leche descremada es mejorado por el agregado de solutos tales como cido ascrbico o tiourea. La sacarosa se ha empleado para reemplazar la leche descremada, y para mejorar su performance se le adiciona glutamato de sodio y bacto casitone u otro componente nitrogenado. Normalmente la liofilizacin produce daos en las clulas, siendo los mismos en algunas casos reversibles, por lo cual stas necesitan un tiempo de recuperacin que es variable en funcin del tipo de dao producido. En la reconstitucin de un tubo liofilizado se logra incrementar la sobrevida de los microorganismos si en lugar de agua destilada se agrega caldo nutritivo o el mismo medio que se us para el crecimiento inicial de las clulas; de esta forma al mantenerse elevada la presin osmtica durante la rehidratacin se logra que la misma proceda en forma lenta. 17\nSe encuentra con frecuencia que el crecimiento despus de la rehidratacin tiene una fase de retardo extendida. Se puede reducir esta fase si se emplea para el crecimiento un medio de igual composicin que el que da ptimo desarrollo pero disminuyendo su concentracin original entre un 25 y un 50%. En general no es posible determinar para cada grupo de organismos el mtodo de conservacin ideal, por lo que se trata de emplear el ms adecuado. De todos, la liofilizacin es el ms utilizado, aunque algunos organismos muestran al tas tasas de mortandad. En este caso la alternativa es la congelacin, a pesar de que las cepas mantenidas de esta forma son difciles de transportar. Mejoramiento de microorganismos industriales En general los organismos aislados de la naturaleza productores de metabolitos de inters industrial producen a los mismos en niveles muy bajos, por lo tanto se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los procesos. Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimizacin del medio de cultivo y de las condiciones de operacin, pero esto est limitado por la capacidad de sntesis mxima del producto deseado que tiene el organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento gentico de la cepa. Como ya se dijo, la productividad potencial de un organismo es controlada por su genoma, pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos. Con el organismo modificado, se reexaminan las condiciones del cultivo para lograr nuevamente la mxima productividad. Por lo tanto los programas de desarrollo involucran una continua modificacin gentica del microorganismo, seguida por una readaptacin del medio de cultivo a los nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operacin y tambin de los procesos de extraccin y purificacin. La obtencin de cepas modificadas genticamente se puede realizar por 1) Seleccin natural de variantes, 2) Mutacin inducida, y 3) Recombinacin gentica. 1. Seleccin natural Se debe tener en cuenta que en cada divisin celular hay una pequea probabilidad de que ocurra un cambio gentico, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa celular la poblacin sea heterognea. Esta distribucin puede presentar problemas de rendimientos debido a que en general las variantes tienen menores niveles de produccin que la poblacin parental. Estos cambios definitivos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotpicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las clulas de la poblacin que expresan la misma modificacin fisiolgica, dentro de las variaciones permitidas por su genotipo. En las mutaciones espontneas el elemento responsable de la mutacin no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor mutagnico se conoce) son estables y hereditarias y tienen una frecuencia estadsticamente medible (tasa de mutacin). La frecuencia de mutaciones espontneas vara entre 10 -6 a 10-9 mutaciones por genoma y por generacin. Por lo tanto si se considera un valor de 10 -7 se debern estudiar un gran nmero de organismos (> 10 7 ) en la bsqueda del tipo deseado. En la seleccin de variantes naturales, una prctica que todava es utilizada se refiere a la observacin de las caractersticas morfolgicas de las colonias, las cuales, en manos de un operador avezado, se asocian con mayor o menor productividad, lo que permite seleccionar y posteriormente estudiar los clones aislados. 18\nEstos estudios involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluacin del producto. En estos casos es ms adecuado realizar las experiencias en erlenmeyers de hasta 500 ml, ya que si bien demanda una considerable mano de obra, los resultados de ensayos en tubos o pequeos frascos son menos confiables. A veces es posible el diseo de un procedimiento simple de "screening" selectivo para un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, clulas no mutadas que mueren en un plaqueo por seleccin de mutantes resistentes a drogas, metales, etc. En estas condiciones se aslan mutantes con un esfuerzo mnimo an de poblaciones donde la tasa de mutacin es menor a 1 x 106 . Cuando se comparan los incrementos en los rendimientos de cepas obtenidas por mutaciones naturales como las que resultan del empleo de un agente tal como la luz ultravioleta se observa, en general, que con agentes como el mencionado los incrementos en productividad son superiores y con una mayor tasa de mutacin. 2. Mutacin inducida. El procedimiento de mutacin mediante el empleo de un agente determinado implica dos etapas, el tratamiento de la poblacin con el mutgeno elegido y luego el aislamiento de los mutantes para su posterior ensayo y seleccin. Empricamente el empleo de diferentes agentes resulta en el aislamiento de distintos "espectros" de mutantes. La eleccin de un agente mutagnico depende en general de consideraciones prcticas. En algunos de los casos es ms conveniente el empleo de ms de uno en lugar del uso masivo de uno solo. La tcnica a emplear puede producir una alta tasa de mutacin o puede favorecer la separacin de un nmero reducido de tipos deseables de un gran nmero de productores mediocres. Hasta donde sea posible el aislamiento del mutante debera utilizar la caracterstica mejorada del mismo como factor de seleccin. El incremento de su productividad podra ser el resultado de una modificacin en los mecanismos de control que limitan el nivel de produccin y/o de una variacin en los precursores que llevan al producto. En este sentido el conocimiento de las rutas y mecanismos de control de la biosntesis de un producto facilitan la estrategia a seguir en el aislamiento. Es importante en los programas de bsqueda y seleccin, tener una alta proporcin de mutantes entre la poblacin sobreviviente al tratamiento, debido a que slo estos individuos son los estudiados. Con el aumento de la dosis del mutgeno en general se incrementa esta proporcin, aunque para cada mutgeno y cada organismo hay una dosis ptima. Los agentes mutagnicos pueden ser agrupados en: 1) Fsicos, como la luz ultravioleta, que es un mutgeno muy conveniente. La longitud de onda puede variar de 200 a 300 nm y el tiempo de exposicin entre 0.5 y 20 minutos, dependiendo de la sensibilidad del organismo y tratando de lo grar un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes como rayos X y rayos v son actualmente poco utilizados. 2) Qumicos: Estos agentes se emplean en concentraciones del orden de 0.05 M con exposiciones de 0.5 a 12 horas. Como muchos de ellos son no txicos, el grado de mortandad no es empleado como dato de eficiencia. El tratamiento se realiza adicionando el mutgeno a una suspensin de clulas, la cual es incubada a temperatura constante un determinado tiempo. Estas manipulaciones requie19\nren personal con experiencia debido a las lesiones que pueden ocasionar. Entre estos agentes se destacan los siguientes: a) Acido nitroso. Este agente induce transiciones A-T --- G-C y/o deleciones por uniones cruzadas en el interior de la cadena. b) N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Es uno de los mutgenos ms potentes, produciendo una alta tasa de mutacin con bajo porcentaje de mortandad. Requiere de un manejo sumamente cuidadoso. c) Anlogos de base. Producen transiciones, como el 5-bromuracilo y la 2-aminopurina, siendo otros anlogos menos efectivos. Sus modos de accin dependen de sus incorporaciones al nuevo ADN formado y del lugar que ocupen al sustituir a la base normal. d) Mutgenos estructurales, como la proflavina o naranja acridina que no son incorporados covalentemente al ADN, sino que actuan como agentes de intercalado en la estructura, promoviendo adiciones o deleciones simples durante la sntesis. Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primarios Metabolitos primarios son aquellos esenciales para la vida de un microorganismo como por ejemplo, aminocidos, nucletidos, vitaminas, cidos orgnicos. Antes de considerar la seleccin de este tipo de mutantes, es necesario conocer los mecanismos de control involucrados en la biosntesis de estos metabolitos. Las concentraciones de los mismos estn reguladas por sistemas de control por retroalimentacin ("feed back). Los dos principales sistemas involucrados son inhibicin y represin "feed back". En la inhibicin, el producto final de una va metablica inhibe la actividad de una enzima (normalmente la primera) de su va de formacin, cundo se ha sobrepasado un valor mximo de concentracin intracelular de dicho producto (caso de biosntesis de aminocidos). La primera enzima de la va es de tipo "alostrica", lo que significa que en este caso el producto final se une a ella en el centro regulador (no compite con el sustrato por el centro activo, como en la llamada inhibicin competitiva), afectando la unin de la enzima al sustrato. Es un control fino y casi instantneo. La represin es aquella donde el producto final de una va metablica previene la sntesis de una enzima o de todas las que catalizan la va mencionada. Esto ocurre a nivel de cido desoxirribonucleico (ADN), impidiendo la transcripcin del gen a cido ribonucleico mensajero (ARNm). Este mecanismo es de accin ms lenta que el anterior, ya que permite actuar a las enzimas preformadas. Los mecanismos de regulacin son ms complejos en caso de vas biosintticas ramificadas donde los productos de cada brazo son raramente requeridos por el organismo en igual proporcin. Los procesos de control de estos son los siguientes: a) por isoenzimas; b) concertado o multivalente; c) cooperativo; d) acumulativo; e) secuencial. Para un conocimiento detallado de estos mecanismos de control se remite al lector a la bibliografa. Como se ve, la concentracin de un metabolito microbiano es controlada por una variedad de mecanismos. El conocimiento de la va metablica y su control facilita la construccin del mutante deseado. Estos pueden tener distintas modificaciones: a) el mutante no reconoce la presencia del inhibidor o represor; b) no se produce producto final, que es el que controla la enzima clave de la va metablica; c) el producto final es eliminado de la clula debido a una modificacin en la permeabilidad de la membrana celular. Los mutantes que no producen inhibidores o represores por producto final pueden ser empleados para la produccin de intermediarios en caminos no ramificados, o de intermediarios y productos finales en caminos ramificados. 20\nAl no producirse el producto final de la ruta, el control de la misma es eliminado, pero como estos productos son esenciales para el crecimiento, los mismos se deben incorporar al medio en concentraciones tales que permitan el desarrollo, pero que no ejerzan el control normal por inhibicin o represin. En este caso los mutantes son auxotrficos para uno o ms productos finales. El aislamiento d estos mutantes puede resultar en la obtencin de un cepa altamente productora, si la mutacin ocurre en el sitio correcto. La seleccin de auxtrofos se puede realizar empleando tcnicas de enriquecimiento o mediante la identificacin visual de mutantes. Por ejemplo, la separacin mecnica de esporos auxtrofos y prototrficos de organismos filamentosos ha sido alcanzada por el mtodo de "enriquecimiento por filtracin". Se ha aplicado a Aspergillus, Neurospora, etc.. El procedimiento implica la incubacin de una suspensin de esporos mutada, en un medio lquido mnimo; los prottrofos desarrollan en tanto que los auxtrofos no. La suspensin es luego filtrada a travs de un filtro adecuado, obtenindose un filtrado enriquecido en auxtrofos, debido a que los esporos germinados por su mayor tamao son retenidos en el filtro. Si bien los mutantes auxotrficos se utilizan para producir grandes cantidades de muchas sustancias de inters, los mismos no son adecuados para la obtencin de productos que controlan independientemente su sntesis. Un caso tpico es el que figura a continuacin, donde se sintetiza un producto P.\nLas letras minsculas indican las enzimas que intervienen en el proceso. En este caso si P es el producto requerido, no es apropiado tener un auxtrofo. La solucin es modificar el organismo de tal forma que la primer enzima (a) no reconozca la presencia de niveles inhibidores de P. El aislamiento de tales mutantes se puede alcanzar a partir de mutantes resistentes a metabolitos anlogos y/o de revertantes. Los metabolitos anlogos (compuestos similares a otros en su estructura) han ampliado el rango de inhibidores para los cuales se obtienen mutantes resistentes. En el ejemplo de la va metablica anteriormente presentado si P* es un anlogo txico de P, un mutante puede ser aislado en presencia de P* si por ejemplo, la primera enzima de la va no es suceptible a la inhibicin por el anlogo. Esta enzima tambin podra ser resistente al efecto de control de P, por lo cual habra una produccin no inhibida. Para el aislamiento de este tipo de mutantes se puede emplear la tcnica de gradiente en placa, en la cual existe una variacin en la concentracin del anlogo en un sentido de la placa, presentando la misma, zonas de escaso crecimiento por altos niveles del anlogo txico desde donde es posible aislar los mutantes resistentes. Estos debern ser posteriormente estudiados en relacin a la produccin de P. Otra posibilidad de mejorar los rendimientos de este tipo de productos es el empleo de revertantes. En este caso un mutante auxotrfico para P (no produce la enzima "a") es sometido a una segunda mutacin con el objeto de obtener revertantes que elaboran el producto final en mayores niveles (la enzima "a" producida no reconoce en control de P). 21\nMutantes resistentes a anlogos de aminocidos han sido empleados en procesos de mejoramiento de cepas, para la obtencin de antibiticos. El mejor ejemplo de mutantes modificados en la permeabilidad es el caso de la fermentacin de cido glutmico. Se ha aislado un mutante de Corynebacterium glutamicum, cuya permeabilidad puede ser modificada por el nivel de biotina. O sea la permeabilidad celular es controlada por la composicin del medio de cultivo; de esta forma el organismo puede excretar glutamato (50 g l -1 ) con bajas concentraciones de biotina (5 ug l-1 ). Esto sugiere la posibilidad de modificar genticamente la permeabilidad celular para incrementar la productividad. Mutantes productores de enzimas de inters industrial Solamente se tendrn en cuenta las enzimas degradativas, cuya produccin puede ser controlada por induccin, represin "feed back" y/o represin catablica. Las tcnicas de mutacin en este caso pretenden alterar los mecanismos de control para obtener mutantes que puedan producir enzimas en ausencia de inductor y an en presencia de represores. Las mutaciones pueden tener lugar en un gen regulador, eliminando la produccin de un represor activo, o si se producen en el operador, se podra evitar la unin del represor. Los mutantes que producen enzimas inducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes constitutivos. Los mismos pueden ser aislados a partir de un cultivo continuo en el cual el sustrato inductor est en concentraciones limitantes, lo cual favorece el desarrollo de los mutantes constitutivos sobre la poblacin inducible; empleando inductores dbiles o utilizando ciclos con y sin inductor, tratando de favorecer el enriquecimiento en la poblacin del mutante constitutivo, ya que al transferir a un medio con inductor el tipo inducible requiere un tiempo de induccin que no lo requiere el constitutivo. Para la seleccin de mutantes resistentes a la represin catablica pueden aprovecharse las posibilidades del sistema continuo empleando un medio de cultivo con el sustrato de la enzima y el represor catablico. En estas condiciones el organismo capaz de emplear ambos sustratos tendra una ventaja competitiva y podra ser seleccionado a una determinada velocidad de dilucin. Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos secundarios Metabolitos secundarios son sustancias no imprescindibles para las funciones vitales como por ejemplo alcaloides, toxinas, antibiticos, giberelinas, etc. La relacin entre metabolito primario y secundario presenta todava numerosos interrogantes con relacin a los mecanismos que controlan la sntesis de estos ltimos. Se deben hacer algunas consideraciones, ya que en ciertas fermentaciones de antibiticos la velocidad de crecimiento regula la formacin de enzimas biosintticas. En el caso de la gramicidina S ( GS), las GS sintetasas se forman en la ltima parte de la fase de crecimiento exponencial. Las enzimas despus de alcanzar un pico en sus actividades especficas desaparecen rpidamente al entrar la poblacin en fase estacionaria. Los estudios de este producto en cultivo continuo permitieron establecer una relacin inversa entre la velocidad especfica de crecimiento y la produccin de sintetasa. Si bien el mecanismo no es conocido, se estableci que los picos de actividad especfica en funcin de u varan de acuerdo a la naturaleza del sustrato limitante de crecimiento (C, N, S y P). Otro factor del proceso de control es la regulacin "feed back" lo que significa que la acumulacin de metabolitos secundarios (penicilina, cloranfenicol, cicloheximida, cte.) es lo que limita su propia sntesis. En el caso de caminos ramifica22\ndos como el de penicilina, la acumulacin intracelular de lisina disminuye su produccin, efecto que se revierte por el agregado de a-aminoadipato. Algunos tipos de regulacin "feed back" involucran a fosfato inorgnico, el cual regula la actividad de fosfatasas. En algunos casos la adicin del fosfato al medio de cultivo limitado se asocia con un incremento de ATP con disminucin de la formacin de antibitico. Como ya se dijo, la glucosa y la fuente de nitrgeno (en especial amonio) si es rpidamente metabolizada ejerce represin catablica. Un ejemplo es la produccin de cafalosporinas por Streptomyces clavuligerus, la cual es suprimida por amonio. Debido a que la produccin de estos metabolitos es afectada por mecanismos de control genticamente determinados, las mutaciones pueden tener efectos importantes en el mejoramiento de cepas. Los programas iniciales en la industria de antibiticos inducan mutaciones sobre clulas o esporos mediante el empleo de agentes fsicos y qumicos. Si uno repasa el caso tpico de la penicilina en el cual las primeras cepas de Penicill um chrysogenum producan alrededor de 20 unidades ml -1 ,(20 U ml -1 ), se observa que las tcnicas de mutacin clsica han permitido obtener mutantes adecuados para la aplicacin posterior de tcnicas ms recientes como la fusin de protoplastos y las de clonaje de genes. Se pueden emplear dos tcnicas de seleccin al azar, de mutantes obtenidos despus de un tratamiento como se indica en la Fig. 4. Los procedimientos en medios lquidos son en general largos y requieren gran cantidad de material. La ventaja es que el proceso es controlado en condiciones relativamente comparables a las de produccin en relacin a agitacin y aeracin. El test en placas es ms rpido, permite controlar un mayor nmero de colonias con menor material pero en condiciones que no reproducen la fermentacin en medio lquido. Se trata aqu de evaluar la cantidad de antibitico excretado por una colonia. Una variante consiste en cubrir la placa con un celofn estril y agregar sobre el mismo una capa de agar conteniendo el organismo 23\nindicador, incubando luego la placa toda la noche. De esta forma, las colonias de los mutantes son mantenidas libres de contaminacin por el organismo sensible. En este caso el tamao de la zona de inhibicin es controlado por el espesor de la capa. Evidentemente, como se mencion anteriormente, el programa de mejoramiento debe incluir una mejora en el medio de produccin. Se observa, en general, en un programa de mejoramiento, que los saltos en la produccin al inicio del programa son importantes, pero despus la seleccin de mutantes superproductores se vuelve cada vez ms difcil. Con referencia a los estudios de "screening" en placas, un factor importante es la composicin del medio slido para lograr que la cepa pueda expresar toda su capacidad productora. En algunos casos las condiciones de limitaciones de nu trientes, que favorecen el comienzo de la produccin de antibiticos en medio lquido no son alcanzadas en medio slido, sin embargo esto se puede corregir suprimiendo la principal fuente de carbono y reduciendo, por ejemplo, el contenido de agua de macerado de maz, como en el caso de penicilina. Es posible en base a la experiencia adquirida en el curso de los trabajos de mutagnesis-seleccin, establecer una correlacin entre los caracteres fisiolgico o bioqumicos y la produccin del microorganismo. En este sentido pueden a ve ces intervenir en la seleccin en medios slidos criterios morfolgicos, pigmentacin de colonias, resistencia al antibitico producido, etc. 3. Recombinacin gentica El mejoramiento de una cepa industrial empleando tcnicas de mutagnesisseleccin conduce a la creacin de lineas divergentes. Una estrategia ms lgica en tal programa de mejoramiento sera reagrupar las potencialidades de distin tas variantes con el objeto de seleccionar la mejor combinacin de genes responsables de codificar la produccin de determinado metabolito. A partir de 1977 con los trabajos de Hopwood se muestra que es posible lograr la recombinacin gentica, definiendo por tal a cualquier proceso que genere nuevas combinaciones de genes los cuales estaban originalmente en individuos diferentes. Todos los procesos no meiticos en clulas vegetativas que llevan a recombinacin son llamados parasexuales y aparecen tanto en organismos procariotes como eucariotes. Los virus pueden intercambiar material gentico entre cepas heterognicas despus de una infeccin mixta en el mismo husped. En bacterias el fenmeno de recombinacin se observa en: 1) conjugacin, en donde la transferencia de material gentico se realiza a travs de pilis, teniendo algunas caractersticas de un proceso sexual; 2) transduccin, en el que la transferencia de ADN de una clula a otra se realiza mediante una partcula viral que acta como vector; y 3) transformacin, donde la recombinacin puede ocurrir despus de la insercin experimental de un ADN aislado, a una bacteria receptora. El intercambio de material gentico entre diferentes especies puede tambin ser alcanzado por fusin celular. El primer paso en este caso es la preparacin de protoplastos, los cuales son clulas que han perdido su pared celular externa y son limitadas solamente por su membrana. Se los prepara sometiendo una suspensin celular a la accin de enzimas degradativas de la pared (lisozima) en un medio isotnico, para minimizar la ruptura por efectos osmticos. Los protoplastos de los cultivos que se desea fusionar, son mezclados y fusionados en presencia 24\nde un agente inductor (polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfxido en algunos casos, luego de lo cual se los siembra rpidamente en un medio completo para regenerar las clulas. La incubacin de protoplastos resulta en regeneracin de la pared celular y reversin a una clula de morfologa normal, lo cual es una propiedad crtica, ya que despus de la fusin se desea recuperar un organismo, el cual pueda ser cultivado normalmente en pequea y gran escala. La fusin celular es seguida por fusin nuclear. La tcnica de fusin celular se emplea en la obtencin de hibridomas que son clulas que se obtienen por fusin de linfocitos con clulas de mieloma (cncer de piel) de ratn u otro animal. Cada clula de hibridoma sintetiza una sola especie molecular de anticuerpo. El cultivo de este tipo de clulas produce anticuerpos monoclonales, los cuales tienen una enorme importancia en reactivos de diagnstico, en la purificacin de molculas por su alta afinidad especfica y como vectores de drogas u otros reactivos para combatir tumores. Obtencin de nuevas cepas por ingeniera gentica La dcada de 1970 marca el comienzo de la unin entre las tcnicas bioquimicas para manipular el ADN in vitro con las tcnicas genticas para transferir el ADN de una clula a otra. La nueva metodologa resultante conocida con el nombre de ingeniera gentica ha revolucionado el campo especfico de la Biotecnologa. A travs del procedimiento de clonado de ADN, genes de cualquier tipo pueden ser tomados de su ambiente natural, analizados, alterados y reinsertados en el mismo tipo de organismo o en otro diferente. Es as que la produccin de solventes, productos qumicos, hormonas, antgenos, enzimas y otras sustancias de inters farmacolgico puede realizarse en grandes cantidades, a travs del clonado de genes especficos en organismos que pueden ser desarrollados en escala industrial. Gran parte del xito de una fermentacin, como incrementar el rendimiento de un producto, aumentar su velocidad de formacin, eliminar productos indeseables o la inhibicin por un producto final, se puede alcanzar, al menos en principio, mediante el empleo de tcnicas genticas y estrategias que involucran metodologa de ADN recombinante in vitro. Esta metodologa ha contribudo adems al conocimiento de las funciones del ADN, a la organizacin de los genes, a la regulacin de la expresin y a la estructura primaria de protenas. El aspecto principal del clonado es la propagacin de un fragmento determinado de ADN en una lnea celular en crecimiento. Este fragmento, para poder propagarse debe ser unido a una molcula transportadora o vector el cual s es capaz de multiplicarse en el husped. El clonado de genes ha sido posible gracias a una serie de descubrimientos fundamentales. En primer lugar la puesta en evidencia de enzimas denominadas endonucleasas de restriccin, las cuales reconocen y cortan el ADN en sitios bien definidos, generando fragmentos de distintos tamaos, determinados por la distancia que separa cada sitio de restriccin ubicado al azar sobre el genoma. Existen distintos tipos de enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin de tipo II, catalizan la ruptura de dobles hebras en sitios donde reconocen secuencias de 4 o 6 bases de longitud. Se ha encontrado que los sitios de reconocimiento se leen igual en ambas hebras de ADN. En algunos casos la ruptura del ADN se produce en sitios opuestos de las dos hebras rindiendo fragmentos romos ( Hae III), mientras que en otras ocasiones la ruptura se produce en forma de escalones, dejando extremos "cohesivos" (Eco RI) como se observa en la Fig. 5. En todos los casos la enzima hidroliza enlaces fosfo-diester en el lado 3' dejando extremos libres 3' -OH y 5' -fosfatos. Los extremos romos resultantes de un corte pueden transformarse en cohesivos aadiendo a los extremos 3', nucletidos (poli A a uno y poli T al otro) por accin de una transferasa terminal. 25\nFigura 6. Secuencias y cortes de enzimas de restricin. A: Adenina. G: Guanina. T: Timina. C; Citosina. Otro de los avances fundamentales en esta tecnologa fue el descubrimiento de enzimas que pueden unir extremos libres de hebras de ADN. As molculas separadas de ADN de doble hebra pueden ser ligadas ya sea por la ADN ligasa del bacterifago T4 si los extremos son romos, o por la accin de la ligasa de E. coli o de T4 si son cohesivos.\nPara la transferencia y expresin de un ADN "extrao" en una clula husped, se requiere de un vector de expresin, el cual debe ser capaz de entrar y replicarse dentro de ella. Un vector ideal debera ser pequeo, de fcil preparacin y replicacin en la clula husped, no generar productos txicos para la misma, poseer uno o ms marcadores (resistencia a drogas, etc.) para facilitar una rpida y positiva seleccin y contener al menos un sitio donde se pueda integrar el ADN extrao sin destruir una funcin esencial (replicacin). Los plsmidos son muy empleados como vectores. Son molculas de ADN circular extracromosomal que se replican independientemente. Los que poseen genes para resistencia a antibiticos son de gran utilidad debido a que su adquisicin por bacterias "competentes" es fcil de detectar. Uno de los ms conocidos, el pBR322 posee sitios nicos de restriccin y lleva genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina. Estos genes poseen sitios de restriccin para la insercin de fragmentos de ADN, resultando luego de esta insercin en una inactivacin del gen. En este caso la bacteria que reciba este plsmido, adquirir la resistencia especificada por el otro gen intacto. Los plsmidos que presentan un gran nmero de copias por clula, son los ms empleados como vectores, debido a que al amplificar muchas veces el nmero de segmentos del ADN de inters, permiten incrementar los rendimientos del producto del o los genes que transportan. En una clula la informacin gentica est presente en dos formas diferentes, el ADN genmico y el cido ribonucleico mensajero (ARNm), que posee la parte codante del gen sin el promotor. Estas dos formas pueden ser clonadas empleando dos estrategias distintas. El primer caso es el mostrado en la Fig. 6, donde el conjunto de colonias resultantes de la transformacin representa la "biblioteca genmica" o "genoteca", de la cual habr que extraer los clones de inters. En el segundo caso a partir del ARNm se obtiene un ADN complementario (ADNc), como se observa en la Fig. 7 para un ARN eucaritico. Este ADNc se puede insertar posteriormente en un plsmido u otro vector. 26\nEn la formacin de una genoteca para la expresin de genes de un organismo eucaritico, se debe tener en cuenta que en este caso el ADN genmico contiene secuencias que estn ausentes en el ARN correspondiente. Los genes eucariticos estn constitudos por secuencias o regiones que no aparecen en el ARNm, denominadas "intrones" o "secuencias intervinientes" y por regiones presentes en el ARNm llamadas "exones". El nmero y tamao de los intrones vara de un gen a otro, pudiendo encontrarse genes que carecen de ellos. En el proceso de transcripcin, se obtiene un ARNm primario (localizado en el ncleo) que contiene tanto las secuencias de los exones como de los intrones, por ste sufre luego un proceso de "maduracin" o modificaciones post-transcripcionales que involucran desde alteracin qumica de bases individuales (metilaciones), adiciones al 5' ("caping") o 3' del transcripto (poliadenilacin), hasta la forma ms grande de procesamiento que involucra la separacin de los intrones ("splicing"). Como consecuencia de estas modificaciones y procesamiento se obtiene como producto un ARNm funcional que ser traducido a nivel ribosomal. Por lo tanto si se quiere obtener una protena eucaritica en bacterias, es imprescindible obtener un ADNe al ARNm en cuestin, a partir del cual se llevar a cabo el donado. El proceso de transformacin por plsmidos se caracteriza en general por ser de baja eficiencia; por lo tanto para incrementar la misma se deben tener en cuenta una serie de factores: a) eleccin de una cepa husped adecuada; en el caso de E. coli existen varias recomendadas (la mayora de las cepas K12, MC 1061, C 600, DH 1, DH 5, I M 109, HB 101, etc); b) etapa de crecimiento, ya que la frecuencia de transformacin es mayor cuando el cultivo de E. coli est en la mitad tarda de la fase exponencial; c) procedimiento de transformacin empleado. En general existe un modelo lo que implica la obtencin en un primer paso de clulas "competentes" mediante un tratamiento con una solucin de CaCl 2 (50 mM) en fro, luego de lo cual las clulas se ponen en contacto con la solucin del plsmido purificado incubando en hielo de 10 a 60 min. El porcentaje de clulas 27\nFigura 7. Obtencin de cido desoxiribonucleico complementario (ADNc) a partir de cido ribonucleico mensajero (ARNm). competentes en una poblacin tratada, oscila entre 0,01% y 10% de las clulas viables. La frecuencia de la transformacin o eficiencia se puede determinar empleando un ADN standard (como pBR322) y puede oscilar entre 1 x 106 a 1 x 108 unidades formadoras de colonias mg-1 de ADN. Una aclaracin especial es la referida a la calidad de las drogas a emplear (en general reactivos para biologa molecular) y los cuidados del operador para no "contaminar" las soluciones. Otros vectores del clonado incluyen a los faltos k, los cuales poseen un nmero de ventajas que los hacen atractivos para el clonado. El cromosoma de este bacterifago es una molcula de ADN lineal de 49 Kb de longitud, en el cual cer ca del 40% no es esencial para su propagacin. Fragmentos de ADN extrao de hasta 24 Kb pueden ser propagados empleando este vector, ubicando estos fragmentos en la regin central del genoma, la cual contiene genes no esenciales. El reemplazo de estos es fundamental debido a que slo genomas de 40-52 Kb pueden ser empaquetados dentro de las partculas del fago con alta eficiencia. Si slo se ligan los dos extremos o brazos, la molcula de ADN obtenida es muy pequea para ser empaquetada. La molcula de ADN recombinante del fago puede ser introducida como tal en la clula bacteriana (transfeccin) con una eficiencia de 10` 1 clones recombinantes ug-1 ADN o puede superar a 10 6 clones u g-1 si se realiza por infeccin, empaquetando previamente in vitro al DNA recombinante. Si el objetivo es clonar grandes fragmentos de ADN pueden emplearse como vectores los csmidos, que son elementos genticos equivalentes a plsmidos de gran tamao y encapsulados dentro de la cabeza de un fago para ser introducidos en las clulas. En los csmidos se pueden introducir fragmentos de hasta 45 Kb, lo cual reduce el nmero de clones a obtener para disponer de una genoteca re28\npresentativa. Como llevan el origen de replicacin de un plsmido, se replican como tal dentro de la clula. Su desventaja es que por su gran tamao su nmero de copias (como plsmido) en la clula es reducido. Tamao de la genoteca Este es uno de los aspectos ms importantes y que consiste en determinar aproximadamente cuntos clones es necesario disponer para tener una probabilidad p de contener una secuencia determinada de ADN. Se debe asumir una representacin de secuencias al azar, que cada inserto es de igual tamao y que el tamao genmico del organismo sea conocido. As, si "a" es el tamao del inserto y "b" es el tamao del genoma (en las mismas unidades), luego una genoteca de N clones tendr una probabilidad p de contener determinada secuencia:\nAs por ejemplo para E. coli con un geoma de 4.2x10 3 Kb y si a = 20 Kb, si se fija p = 0.99 (99% de2 probabilidad de contener determinada secuencia), el valor de N ser de 9.6 x 10 clones. Identificacin de clones de inters La identificacin de los clones de inters entre cientos o miles de clones representa un problema que demanda tiempo y que depende de la sensibilidad y especificidad del sistema de deteccin. Muchos mtodos utilizan sondas radiactivas de gran especificidad que contienen secuencias complementarias al ADN de inters. La identificacin puede hacerse obteniendo una rplica de las colonias en un filtro, las cuales son posteriormente lisadas, el ADN fijado al filtro, hibridizado con la sonda y detectado por autoradiografa. En otros casos se puede utilizar un vector de expresin que posea un opern dentro del cual se inserta al ADN. Si se dispone de un plsmido con un opern lactosa (lac) inducible, se puede insertar en fase el fragmento de ADN dentro del gen lac Z, obtenindose as una protena de fusin de la B=galactosidasa. Si la protena de inters a producir es txica para la clula, esto se supera empleando clulas que elaboren represores del opern lac. Cuando la concentracin celular del cultivo es elevada, se induce la expresin con isopropil-B-D-tiogalactopiransido (IPTG), detectndose la presencia de la protena de inters por mtodos inmunolgicos. Finalmente para aumentar la estabilidad de la protena a producir, a la cual contribuye la estructura de la B-galactosidasa, se usan huspedes deficientes en proteasas. Perspectivas de la ingeniera gentica Adems de E. col como organismo husped de genes extraos, se han utilizado Bacillus subtilis y levaduras como Saccharomyces cereuisiae y Schizosaccharomyces pombe, distintos Streptoinyces y Agrobacterium tuinefaciens. Finalmente tambin otras clulas como las vegetales pueden ser empleadas para la insercin de genes extraos. Desde el punto de vista tecnolgico se trata de favorecer la sntesis del producto del gen clonado, incrementando el contenido de copias del gen en la clula. En el caso de genes clonados en plsmidos, esto se logra aumentando el nmero de plsmidos, cuyo nmero de copias es regulado a travs de funciones codificadas en su genoma; sin embargo esto tiene un lmite. Numerosos estudios experimentales de recombinantes de E. coli y S. cereuisiae han demostrado que la presencia de plsmidos reduce la velocidad de crecimiento de la clula husped y 29\nconcomitantemente la actividad de sntesis total de protenas. Esto probablemente ocurra debido a una competicin entre las actividades dirigidas por el plsmido y la clula husped por precursores comunes, energa qumica, represores y activadores, enzimas, etc.. Esto se ha superado con el empleo de promotores regulables y controles sobre la replicacin del plsmido, los cuales se manejan a travs del medio de cultivo. Se ha observado en muchos procesos que el producto del gen clonado en E. coli exhibe un mximo con respecto a un valor de u. Esto implica que existe un u ptimo para maximizar la produccin en sistema continuo, dependiendo de la naturaleza del plsmido y la estabilidad del producto del gen. Es evidente que el futuro es sumamente alentador. Como ya se mencion, la combinacin de la ingeniera gentica con eficientes procesos fermentativos en gran escala, pueden suministrar un gran nmero de productos de inters industrial, los cuales pueden ser difciles o imposibles de obtener a partir de sus fuentes naturales. As es posible obtener hormona de crecimiento humano, intefern, interleukina humana, insulina, la expresin en plantas de genes bacterianos para el control de plagas, antgenos para nuevas y ms efectivas vacunas con menor reactogenicidad, como es el caso en hepatitis B, aftosa, etc.. Tambin las manipulaciones genticas se han empleado en el mejoramiento de la productividad en fermentaciones. Un ejemplo es la produccin de treonina por un mutante de E. col resistente a anlogos, donde el opern entero de treonina fue introducido en un plsmido, el cual se incorpora al organismo por transformacin. Su nmero de copias fue de aproximadamente 20 y la actividad de las enzimas del opern se increment de 40 a 50 veces. La cepa obtenida produce 30 g l-1 ms que la original. Otro avance importante se logr mediante manipulaciones en Streptomyces, las cuales han permitido mediante la introduccin de genes, la obtencin de nuevos antibiticos. Un aspecto fundamental de la tecnologa es la seleccin de cepas estables, debido a que mutantes espontneos que pueden aparecer tienen en general menores rendimientos y mayores valores de velocidad decrecimiento, por lo cual en fermentaciones largas ("batch" alimentado, continuo) podran desplazar a la cepa original. Evidentemente las nuevas cepas obtenidas debern ser estudiadas en su comportamiento en gran escala, especialmente en lo relacionado con la estabilidad y niveles de produccin. Habiendo tratado ya los aspectos fundamentales referidos a los microorganismos consideraremos en el prximo captulo los correspondientes a los medios empleados en las industrias de fermentacin. Lecturas recomendadas 1. 2. 3. 4. 5. 6. ADN recombinante. Introduccin a la ingenieria gentica. J.D. Watson, J. Tooze, D.T.Kurtz. Ed. Labor, 1986. Biotechnology. Vol. 1. Microbial Fundamentals. Ed. H.J. Rehm, G. Reed, Verlag Chemie, 1981. DNA cloning. Volume I. A practical approach. Ed. D.M. Glover. IR L Press Limited 1985. Genetics. Geoffrey Zubay. Ed. The Banjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987 Methods in Microbiology. Ed. J.R. Norris, D.W. Ribbons. Vol. 3A. Academic Press 1970. Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1984\nDocumentos semelhantes a mejoramiento cepas\nGinelly Marilyn Jimenez Villalta\nMais de Tatiana Melina Caballero Maldonado\nPopulares em Enzyme Inhibitor\nDesarrollo de Un Bioinsecticida a Partir De\nComprobacion de La Actividad Terapeutica de Las Plantas


Juego de hoy: 10′ to kill – Jugando en Pareja\nJuego de hoy: 10′ to kill\n1 febrero, 2017 | Farko\nVolvemos a la carga con asesinos y asesinados, agentes encubiertos y un tiempo de juego breve, breve, tan breve que en 10 minutos o menos está todo el pescado vendido… o mejor dicho, están nadando con los peces. Hoy jugamos a 10 minutes to kill.\nCreador: Benoit Bannier\nIlustrador: Pauline Detraz\nEmpaquetado: La caja cuadrada es muy mona, pero nos ha desestabilizado la zona de mini-juegos. Pero la verdad es que no hay queja, es necesario para las peanas que incluye de los personajes.\nEn 10 minutes to kill interpretamos el papel de un asesino a sueldo, contratado para acabar con tres transeúntes anónimos, personas despreciables sin duda. Lo malo, es que hay de uno a tres asesinos más contigo, también anónimos, y que están deseando acabar el trabajo e irse a casa antes que tú, y si para acabar con el trabajo tienen que acabar contigo, pues bienvenido sea.\nEn el juego, tenemos 16 personajes animales (animales en el sentido de tener cara de animal, luego el cuerpo es de humano, es como en Blacksad o Zootropolis… un momento… ¿está Blacksad ambientada en Zootropolis? ¡Cómo molaría eso! La detective Hops y Weekly… voy a escribir un fanfic, ahora nos vemos). Tú eres uno de ellos, aunque el resto de jugadores desconoce tu identidad. Para ganar el juego, necesitas acabar con tus tres objetivos, o el resto de jugadores, y ganar más puntos antes que tus compañeros. Si además los descubres, los enchironas o acabas con su vida, mejor que mejor.\nPrimero de todo, montamos un tablero con las 16 losetas de ciudad. Las losetas son idénticas a excepción de que algunas cuentan con puntos de francotirador, desde donde se podrá disparar a distancia. Lo montamos como nos de la gana, aunque un cuadrado 4×4 es la mejor manera de empezar las primeras partidas. Colocamos un animal por loseta, así como un policía. Sí, el juego incluye tres policías que van a ir haciendo de las suyas, es decir, proteger a los inocentes, durante el juego.\nEn tu turno tienes dos acciones, o una si es matar. En tu acción puedes:\n–Mover CUALQUIER personaje a CUALQUIER otra loseta, sin necesidad de que haya adyacencia ninguna. También puedes mover a la policía, que son testigos absolutos e impiden cualquier tipo de asesinato.\n–Atacar a otro personaje. Puedes matarlo con cuchillo (si estás en la misma loseta), pistola (loseta adyacentes y si no hay nadie en tu misma loseta) o con un disparo de francotirador (loseta a cualquier distancia en línea recta, si no hay nadie en tu misma loseta). Al atacar, señalas el personaje que ha muerto, pero no la razón (pistola, cuchillo o francotirador), ni, obviamente, quién lo ha hecho. Intenta ocultar tu personaje al máximo, incluyendo cuantas más opciones mejor.\n–Preguntar a un personaje. SI hay un policía, puedes preguntar a un personaje en la misma loseta si son asesinos. Si es así, el personaje queda eliminado de la partida, aunque puede seguir haciendo preguntas, no te quedas de brazos parados aunque te eliminen.\nGanas puntos, que es lo que te hace ganar al final, por acabar con tus objetivos, por descubrir a otros asesinos y por matarlos. Te quitan puntos por acabar con objetivos que no eran tuyos (al intentar matar un asesino y equivocarte, por ejemplo), o al matar a un policía, que te descalifica para ganar y encima te hace parecer mala persona.\nAsí se juega más o menos. El 10 minutos tienes la partida echada, sencillo de jugar sin duda.\nEstamos ante un juego de deducción sencillo, donde, si los jugadores se esfuerzan, las opciones serán múltiples, pero no será difícil hacer conexiones para poder descubrir quien es quien, sobre todo para el final de la partida, que no suele tardar mucho (unos 10 minutos).\nLa mecánica es muy sencilla y desde el minuto uno puedes comenzar a jugar correctamente, si bien un jugador más ducho claramente sabrá ocultar mejor sus movimientos y tardará menos en pensar sus acciones. Eso sí, muchas veces la suerte, el azar de donde hayan caído los personajes o cómo esté colocado el tablero ayudará a un jugador u a otro, dejándole más accesibles ciertos personajes para acabar con ellos.\nSi bien nos encantan las ilustraciones, las peanas son algo incómodas para jugar. O ambos jugadores se sientan uno en frente del otro, o hay que estar girando y dando vueltas para poder verlos a todos correctamente. Con cuatro jugadores es un poco fastidio, y unas fichas planas, aunque menos vistosas, ayudarían más. O miniaturas, pero tampoco vamos a pedir la luna.\nEl juego nos ha gustado, los juegos de deducción siempre suelen hacerlo, pero jugando a este nos fijamos es que, contando el número de personajes, con dos jugadores no tienes la experiencia completa. Sí, funciona, sí, es divertido, pero nos imaginamos una partida en la que cada personaje del tablero pertenece a alguien, y cada acción que tomas ayuda o fastidia a alguien, aun no sabiendo a quién. Esto puede resultar en una experiencia algo más caótica que con dos jugadores, cosa que permite tener más control sobre lo que ocurre, y preparar asesinatos con mejores tapaderas, pero con cuatro las risas que puede generar, los odios y caras de póker tiene pinta de ser muchos más y bastante mejores. El juego funciona a dos, pero seguro funciona mejor a cuatro.\nPublicado en Cosas que no son juegos\n< Juego de hoy: El Soneto\nComparativa «Escape the Room» y «Escape room: The game» >\n4 comentarios en “Juego de hoy: 10′ to kill”\nMario L. Menés dice:\n2 febrero, 2017 a las 3:37 pm\nUno de mis juegos estrella, y sí, funciona mucho mejor con más jugadores. Yo tengo la edición de KickStarter y jugar a 5 es realmente divertido. Bastante diferente a la mayoría de los juegos que tengo en la ludoteca, y apto para todo el mundo (y más con esos animalillos).\nYo lo he jugado a 2 y a 4 y no hay color. A 4 es más divertido. Eso sí, te pasas toda la partida partiéndote el cuello para ver los personajes porque entre que son «raros» y la peana…\nEstoy con vosotros que una ficha habría sido más efectiva, aunque menos vistosa.\nAún así es un buen juego!\nYo lo tengo y vengo a decir que me ha gustado más 2, sin embargo. Le echamos varias partidas en su día a 3 y 4 jugadores. Aunque no estuvo mal y en general gustó, acabó mordiendo el polvo en la estantería mucho tiempo (la competencia de juegos a ese rango es muy dura). Las pegas que le vimos a 4 jugadores:\n-De 10 minutos nada. Convences a los no jugones de que lo prueben porque es «rápido» y al final acaban siendo partidas de media hora para arriba.\n-A 4 jugadores es muy complicado planificar un asesinato, ya que hay muchos movimientos desde que juegas y te vuelve a tocar, y normalmente te acaban quedando situaciones poco óptimas en las que si matas te expones mucho. Por ese motivo en la partida se suceden los turnos y turnos donde todos intentan buscar algún hueco para matar medianamente ocultos, pero cuando les vuelve a tocar se les ha estropeado el plan y vuelta a buscarlo. En cuanto te cansas de buscar ese asesinato perfecto, te acabas viendo obligado a matar en condiciones suboptimas, y en uno o 2 a asesinatos seguro que alguno de los otros 3 jugadores ya te tiene medio calado. Y no tanto por deducción, si no por evidencias clamorosas. Por lo que al final, se vuelve viable jugar a ser un culo duro y limitarse a esperar a que maten otros y pillarlos. Y como todos hagan así, apaga y vámonos, la partida no termina nunca.\nEn nuestras partidas el final se disparó más por arrestar/matar a los asesinos rivales que por completar todos los objetivos, tarea casi imposible en nuestra experiencia al menos en los mapas que diseñamos (que influye bastante).\nEn resumen, pocos asesinatos, poca deducción (pillas a los asesinos rivales por evidencias clamorosas casi sin que las busques), partida que no cumple con los 10 minutos que promete. No era lo que esperabamos y se quedó en la estantería.\nAhora con el tema del confinamiento lo recuperamos para probarlo a 2 jugadores y sin embargo nos encantó, porque desaparecieron todas esas pegas que le vimos en su días:\n-Partidas que son realmente de 10 minutos (menos incluso), por lo que se facilita el pique sano encadenando varias seguidas. Ayer nos debimos echar unas 5 en poco menos de una hora.\n-Posibilidad de planificar mejor los asesinatos, con más sospechosos (ya que juegas y te vuelve a tocar rápido otra vez) por lo que ambos jugadores se animan a matar con más facilidad. Se vuelve una posibilidad muy real conseguir los 3 objetivos y tienes que esforzarte más por deducir el asesino rival, ya que no se ve tan claro si el otro mide bien sus movimientos (más deducción y menos evidencias clamorosas, salvo por asesinatos imperfectos). De echo, de las 5 partidas de ayer 2 de ellas se terminaron por completarlos.\nEn resumen, a dos jugadores: más asesinatos, más deducción, partidas que sí que son de 10 min.\nCon esto no quiero decir que sea malo a 4 jugadores, si no que en nuestro caso a 2 jugadores es como más nos encajó con esas expectativas. A 4 jugadores es otro tipo de juego, con asesinatos complicados y muchas vueltas en el tablero, si estás buscando eso al sacarlo mesa, perfecto.


Imagenes: Fiesta del Libro 2016 en Medellín\nLITERATURA | 2016-09-16\nAsí ha sido la fiesta del libro en Medellín\nLa capital paisa está a punto de despedir una feria llena de eventos, presentaciones , conversatorios, actividades para niños y encuentros de víctimas. Conozca los pormenores.\nLa exposición fotográfica de Daniel Mordzinski que está en la entrada a la Fiesta del Libro de Medellín, sobre la calle Carabobo, es como una invitación. Algunas fotos muestran a los escritores detrás de escena, en segundo planos, a Héctor Abad se le ve sobre un caballo y en primer plano un campesino mexicano; a Alberto Salcedo Ramos se le descubre apenas detrás de dos boxeadores; Sergio Ramírez es minúsculo por el poder un volcán; Roberto Bolaño sale de un jardín bien cuidado; Francisco Goldman es un pistolero.\nEsta es una Fiesta que ha estado llena de eventos, presentaciones de libros, conversatorios, actividades de lecturas para niños, encuentros de víctimas, foros sobre el plebiscito y en su último fin de semana no será la excepción: este sábado estarán en conversación Pablo Montoya, Eduardo Lalo y Mempo Giardinelli, ganadores del prestigioso premio Rómulo Gallegos; Yolanda Reyes y María Cristina Restrepo hablarán con la secretaria de Cultura de Medellín, Amalia Londoño, sobre la importancia de recordar el pasado e imaginar el futuro en la literatura. El domingo la Alta Consejería Presidencial para la Paz hablará del “nuevo mundo de la paz” y Patricia Nieto y Patricia Lara conversarán con Daniela Gómez sobre “miradas de mujeres a las guerras de los hombres”.\nAlgo que diferencia a este Fiesta del Libro de las grandes ferias es que es gratuita gracias a la inversión de la Alcaldía de Medellín y al compromiso de la empresa privada, que en este caso patrocina eventos y publicaciones, “cuando la gente visita la Fiesta del Libro está disfrutando de los impuestos que paga, por eso hago un llamado para que vengan en familia y hagan parte de las lecturas y los conciertos que este fin de semana habrá en las tardes”, dijo Amalia Londoño.\nLa Fiesta se ha convertido en el escenario de encuentro de grandes escritores que, para ser invitados, no tienen que tener en su recorrido grandes premios, dijo Juan Diego Mejía, su director: “Muchas veces nos han ofrecido la visita de premios Nobel que nos cobran algunos miles de dólares, pero con ese dinero podemos contar con otro escritores también muy buenos, que publican en grandes editoriales, que tienen un mundo propio y pueden tener conversaciones con escritores locales también dueños de obras sólidas. Tenemos a veces esa mirada de extraña de creer que lo ajeno es mejor, pero no es así”.\nEse espíritu que parece contracorriente se ve en varios espacios, uno de ellos El salón del libro independiente, que se realizó en alianza con la librería Grammata, donde se pueden encontrar más de 300 sellos de todo Latinoamérica que traen consigo lo mejor de las letras de su país y hasta ediciones raras con firmas de escritores que gozan de fama y quieren reunir algunos trabajos que grandes editoriales no encuentran tan rentables. Así mismo, está El salón del libro infantil, una colección con más de quinientos títulos de libros ilustrados y libros álbum escogidos cuidadosamente por la librería Al pie de la letra.\nLa Fiesta del Libro termina este domingo, hay que aprovechar los precios bajos de las librerías de viejo, los lanzamientos de los grandes sellos y las novedades de los independientes.


julio | 2017 | APEHI\nPublicado el 27 julio, 2017 por Fernando\nHola a todos! Una buena actitud es muy importante para sobrellevar como corresponde un diagnóstico y el consecuente tratamiento. Les acompañamos un artículo extraído de mejorconsalud.com que se refiere a este tema. #apehi #alianzahipofisislatinoamerica #acromegalia #cushing #enfermedadeshipofisarias Aunque no lo … Seguir leyendo →\nAPEHI en Calidad y Calidez\nPublicado el 24 julio, 2017 por Fernando\nHola a todos! Les acompañamos el video con el bloque dedicado a APEHI que se emitió en el programa Calidad y Calidez, que se emite por el Canal Metro. Muchas gracias Calidad y Calidez por ayudarnos a difundir estas patologías! … Seguir leyendo →\nAPEHI en canal Metro!\nPublicado el 20 julio, 2017 por Fernando\nHola a todos! Este próximo sábado 22 de julio a las 11 hs. APEHI estará en el programa «Calidad y Calidez», que se emite por canal Metro. Se repite el domingo 23 a las 15:30 hs. y el miércoles 26 … Seguir leyendo →\nPublicado el 19 julio, 2017 por Fernando\nHola a todos! Permanentemente se publican avisos de los diferentes centros de salud y organismos donde recalcan la problemática, por ejemplo, de las bacterias resistentes a los antibióticos generadas por la automedicación. Es muy importante que, antes de tomar cualquier … Seguir leyendo →\nPublicado el 4 julio, 2017 por Fernando\nHola a todos! Les informamos que APEHI cambió el número telefónico, el nuevo número es 011-4011-5511. Agéndenlo!


Tus Preguntas sobre los Santos: El Bautismo de Jesús\nBautismo de Cristo. Giotto. Siglo XIV.\nQuizás a alguna persona que rezara la Liturgia de las Horas del día de Epifanía le causara cierta extrañeza la antífona al Cántico Evangélico del Benedictus en Laudes:\n“Hoy la Iglesia se ha unido a su celestial Esposo, porque en el Jordán, Cristo la purifica de sus pecados; los magos acuden con regalos a las bodas del Rey, y los invitados se alegran por el agua convertida en vino. Aleluya”.\nE igualmente, para el Cántico del Magníficat en Vísperas, ésta es la antífona:\n“Veneremos este día santo, honrado con tres prodigios: hoy, la estrella condujo a los magos al pesebre; hoy, el agua se convirtió en vino en las bodas de Caná; hoy, Cristo fue bautizado por Juan en el Jordán, para salvarnos. Aleluya”.\nA simple vista, puede parecernos una mezcla inconexa la alusión, incluso sin respetar el orden cronológico, a estos tres acontecimientos de la vida de Jesús: La adoración de los Magos, el Bautismo en el río Jordán y el milagro acontecido en las bodas de Caná. La explicación es que en los tres momentos se produce una Epifanía, esto es, una manifestación de Jesús, manifestación de su mesianismo y su divinidad.\nCiertamente, el 6 de enero la Iglesia celebra especialmente la manifestación a los Magos que, como primeros representantes de los pueblos paganos, guiados por la estrella de la fe, llegan hasta Jesús. Pero no podemos olvidar que al siguiente domingo, que litúrgicamente sigue formando parte del tiempo de Navidad, celebramos el Bautismo de Jesús. Al otro domingo, que es ya el segundo “durante el año” o “de tiempo ordinario”, en el ciclo C, que es el que nos encontramos en el presente año, se proclamará el texto evangélico de la conversión del agua en vino como mueva “manifestación” de Jesús como Mesías en las bodas de Caná. (Aunque en los otros ciclos litúrgicos sean otras las lecturas joánicas que se leen en dicho domingo).\nEl Bautismo de Juan, que no era sino un signo de conversión, al bajar Jesucristo a las aguas del Jordán, da paso al Bautismo cristiano, por lo que esta fiesta del Bautismo de Jesús es ocasión propicia para reflexionar sobre nuestro propio bautismo y los compromisos de vida que entonces adquirimos. Pero preferimos que sea Dom Próspero Guéranger quien (al igual que ya hicimos en las Ferias Mayores del Adviento) nos acompañe con sus profundas y piadosas reflexiones en su Año Litúrgico, que, sin más, pasamos a compartir:\nEL BAUTISMO DE CRISTO:\nHoy ocupa de una manera especial la atención de la Iglesia, el segundo Misterio de la Epifanía, el Misterio del Bautismo de Cristo, en el Jordán. El Emmanuel se ha manifestado a los Magos después de haberse mostrado a los pastores; pero esta manifestación ha ocurrido en el angosto recinto de un establo de Belén, y los hombres de este mundo no han podido conocerla. En el Misterio del Jordán Cristo se manifiesta con mayor aparato. Su venida es anunciada por el Precursor; la multitud que se agolpa en torno al Bautismo de agua, es testigo del hecho; Jesús va a comenzar su vida pública. Más ¿quién será capaz de describir la grandeza de los detalles que acompañan esta segunda Epifanía?\nEL MISTERIO DEL AGUA:\nLa segunda Epifanía tiene por objeto, lo mismo que la primera, el bien y la salvación del género humano; pero sigamos el curso de los Misterios. La Estrella condujo a los Magos a Cristo; antes, aguardaban, esperaban; ahora creen. Comienza en el seno de la Gentilidad la fe en el Mesías. Pero no basta creer para salvarse; hay que lavar en el agua las manchas del pecado. "El que creyere y fuere bautizado, será salvo"(Mc 16, 16): Es, por tanto, tiempo de que ocurra una nueva manifestación del Hijo de Dios, con el fin de inaugurar el gran remedio que debe dar a la Fe, el poder de causar la vida eterna. Ahora bien, los designios de la divina Sabiduría habían escogido el agua como instrumento de esa sublime regeneración de la raza humana. Por eso, al principio del mundo, se nos muestra al Espíritu divino caminando sobre las aguas, para que la naturaleza de estas concibiese ya en su seno un germen de santificación, como canta la Iglesia en el Sábado Santo. Pero las aguas debían servir a la justicia castigando a un mundo culpable, antes de ser llamadas a cumplir los designios de su misericordia. Todo el género humano, a excepción de una sola familia, desapareció, por un terrible decreto, bajo las olas del diluvio. Sin embargo de eso, al fin de aquella espantosa escena apareció un nuevo indicio de la futura fecundidad de este predestinado elemento.\nLa paloma que salió un momento del arca de salvación, volvió a entrar en ella, trayendo un ramo de olivo, símbolo de la paz devuelta a la tierra, después del diluvio. Pero la realización del misterio anunciado estaba todavía lejana. En espera del día en que se había de manifestar este misterio, Dios multiplicó las figuras destinadas a mantener la esperanza de su pueblo. Así, hizo que este pueblo no llegara a la Tierra prometida, sin haber atravesado las olas del Mar Rojo; durante el misterioso paso, una columna de humo cubría a la vez la marcha de Israel y las benditas olas a las que debía la salvación. Pero, sólo el contacto con los miembros humanos de un Dios encarnado podía comunicar a las aguas la virtud purificadora por la que suspiraba el hombre culpable. Dios había dado su Hijo al mundo, no sólo como Legislador, Redentor y Víctima de salvación, sino para ser Santificador de las aguas; en el seno, pues, de este sagrado elemento debía darle un testimonio divino y manifestarle por segunda vez.\nEL BAUTISMO DE JESÚS:\nSe adelanta, pues, Jesús de treinta años de edad, hacia el Jordán, río célebre ya por los prodigios proféticos operados en sus aguas. El pueblo judío, reanimado por la predicación de Juan Bautista, acudía en tropel a recibir aquel Bautismo, que si podía excitar al arrepentimiento del pecado, no conseguía borrarlo. También nuestro divino Rey se dirige hacia el río, no para buscar la santificación, pues es principio de toda santidad, sino para comunicar a las aguas la virtud de engendrar una raza nueva y santa, como canta la Iglesia. Desciende al lecho del Jordán, no como Josué para atravesarlo a pie enjuto, sino para que el Jordán le envuelva con sus olas y reciba de El, para luego comunicarla a todo el elemento, esa virtud santificadora que ya no volverá a perder nunca. Animadas por los rayos divinos del Sol de justicia, se hacen fecundas las aguas, cuando la cabeza augusta del Redentor se sumerge en su seno, ayudada por la mano temblorosa del Precursor. Más, es necesario que intervenga toda la Trinidad en este preludio de la nueva creación. Se abren los cielos; baja la Paloma, no ya simbólica y figurativa, sino anunciadora de la presencia del Espíritu de amor que da la paz y transforma los corazones. Se detiene y descansa en la cabeza del Emmanuel, cerniéndose a la vez sobre la humanidad del Verbo y sobre las aguas que bañaban sus sagrados miembros.\nEL TESTIMONIO DEL PADRE:\nPero, aún no había sido manifestado con suficiente realce el Dios humanado; era preciso que la voz del Padre resonase sobre las aguas y removiese hasta lo más profundo de sus abismos. Entonces, se dejó oír aquella Voz que había cantado David: Voz del Señor que retumba sobre las aguas, trueno del Dios majestuoso que derrumba los cedros del Líbano (orgullo de los demonios), que apaga el Juego de la ira divina, que conmueve el desierto y anuncia un nuevo diluvio (Salmo 28), un diluvio de misericordia; esta voz clamaba ahora: "Este es mi Hijo muy amado, en quien tengo puestas mis complacencias". De este modo se manifestó la Santidad del Emmanuel con la presencia de la celestial Paloma y con la voz del Padre, como lo había sido su realeza con el mudo testimonio de la Estrella. Realizado el misterio, dotado el elemento del agua de su nueva virtud purificadora, sale Jesús del Jordán, y sube a la orilla, llevando tras de sí, según opinión de los Padres, a la humanidad regenerada y santificada y dejando allí sumergidos todos sus crímenes y pecados.\nSin duda es importante la fiesta de Epifanía, cuyo objeto es honrar tan altos misterios; no debemos admirarnos, que la Iglesia de Oriente hiciera de este día una de las fechas para la solemne administración del Bautismo. Los antiguos monumentos de la Iglesia de las Galias indican que esta era también la costumbre de allí; más de una vez, en Oriente, según cuenta Juan Mosch, se vio llenarse el sagrado Baptisterio, con un agua milagrosa, el día de esta festividad, y vaciarse por si mismo después de la administración del Bautismo. La Iglesia Romana, desde tiempos de San León, insistió en que se reservase a las fiestas de Pascua y Pentecostés el honor de ser los únicos días consagrados a la solemne administración del primero de los Sacramentos; pero, en muchos lugares de Occidente, se conservó y conserva aún la práctica de bendecir el agua con una solemnidad especial, el día de Epifanía. La Iglesia de Oriente guardó celosamente esta costumbre.\nLa función se desarrolla ordinariamente en la Iglesia; pero, a veces, el Pontífice se traslada a orillas de un río, acompañado de los sacerdotes y ministros revestidos de sus más ricos ornamentos, y seguido de todo el pueblo. Después de recitar oraciones de una gran belleza, que sentimos no poder citar, el Pontífice sumerge en las aguas una cruz engastada en pedrería que representa a Cristo, imitando de esta suerte la acción del Precursor. En San Petersburgo, la ceremonia se realizaba en otros tiempos sobre el Neva, introduciendo el Metropolitano la cruz en las aguas, a través de una abertura practicada en el hielo. Este rito se observa de manera parecida en las Iglesias de Occidente que han conservado la costumbre de bendecir el agua en la fiesta de Epifanía. Los fieles se apresuran a extraer del río el agua santificada, y San Juan Crisóstomo, en su Homilía veinticuatro sobre el Bautismo de Cristo afirma, poniendo por testigos a sus oyentes, que esta agua no se corrompía. Idéntico prodigio fue muchas veces observado en Occidente.\nDemos, pues, gloria a Cristo por la segunda manifestación de su carácter divino, y agradezcámosle con la Iglesia el habernos dado junto con la Estrella de la Fe que nos ilumina, el Agua capaz de borrar nuestras culpas. Admiremos, agradecidos, la humildad del Salvador que se inclina bajo la mano de un mortal, para realizar toda justicia, como El mismo dice: porque, habiendo tomado consigo la forma de pecador, era necesario que asumiese también las humillaciones para levantarnos de nuestra postración. Agradezcámosle la gracia del Bautismo que nos ha abierto las puertas de la Iglesia de la tierra y de la Iglesia del cielo. Finalmente, renovemos los compromisos contraídos en la sagrada fuente, y que fueron condición del nuevo nacimiento.\nMEDITACIÓN PARA ESTE DÍA:\nIglesia de Calañas, Huelva.\n¡Oh celestial Cordero! bajaste al río para purificarle; la divina Paloma vino desde el cielo a unir su dulzura a la tuya y luego saliste a la orilla. Mas ¡oh prodigio de tu misericordia! los lobos han bajado después de ti a las aguas santificadas y han salido transformados en corderos. Todos nosotros, manchados con el pecado, nos volvemos al salir de la fuente sagrada, tan blancos como las ovejas de tu divino Cántico, que ascienden del baño fecundas todas y ni una sola estéril; como esas puras palomas que parecen bañadas en leche, y que han puesto su nido junto a las cristalinas fuentes. ¡Tal es la poderosa virtud purificadora dada por tu divino contacto a estas aguas! Conserva en nosotros, oh Jesús, esa blancura que de ti viene, y si la hemos perdido, devuélvenosla por el Bautismo de la Penitencia, único que puede restituirnos el candor de nuestra primera vestidura. ¡Ensancha aún más este río de amor, oh Emmanuel!\nVayan sus olas a buscar, hasta el fondo de sus salvajes desiertos, a los que todavía no han gozado de su contacto; inunda la tierra como lo prometiste. Acuérdate de la gloria con la que fuiste manifestado en el Jordán; olvida los pecados que desde hace mucho tiempo impiden la predicación de tu Evangelio en esas regiones desoladas; el Padre de los cielos manda a todas las criaturas que te escuchen: ¡Habla, pues, a todos, oh Emmanuel!\nTranscripción de Ángel Luis Estecha González, pbro.\nPublicado por Ramon Rabre en 13:19\nEtiquetas: agua, Año Litúrgico, Bautismo, Bautista, Caná, Epifanía, estrella, Guéranguer, Jordán, liturgia, manifestación, Navidad, Preguntas, Próspero, Reyes, santoral, santos, Señor


SAT, Sistema Administrativo para Talleres - Opiniones, precios y demo\nSAT, Sistema Administrativo para Talleres\nComparar gratisSAT, Sistema Administrativo para Talleres\nDescargar guía gratisde SAT (Servicio de Asistencia Técnica)\nSistema de gestión para talleres de reparación de todo tipo\nConsejos de expertos para escoger software de SAT (Servicio de Asistencia Técnica)\nSAT, o Sistema Administrativo para Talleres, es un software de gestión que está enfocado en las necesidades de los talleres de reparación prácticamente de todo tipo. En la copia de prueba podrá seleccionar entre talleres de artículos electrónicos, electrodomésticos, computación, motos, automóviles, fotografía, telefonía, relojería, máquinas y herramientas, aeronáutica, naval, fotocopiadoras y electro medicina. Si su especialidad no se encuentra entre las citadas, deberá configurar las prestaciones del programa ajustándolas a sus necesidades.\nEl objetivo del programa es que el usuario agilice la obtención de materiales para las reparaciones y acelere la reparación mediante el aprovechamiento de los recursos técnicos de su taller. Además, el programa guarda copia del historial de reparaciones finalizadas, ofrece la posibilidad de elaborar informes de todo tipo y de hacer inventario de ventas y repuestos.\nAlgunas de las aplicaciones genéricas del sistema SAT giran en torno a la gestión integral del taller y el control de inventario, la consulta y exportación del historial de servicios, la agenda de clientes y la carga y emisión de las órdenes de reparación, los pedidos y presupuestos, las citas para servicios a domicilio, los proveedores, la clasificación y administración de perfiles de usuario, el sistema de mailing y SMS automatizados y el libro de IVA y ventas, entre otras funciones.\nEl programa está disponible en español y catalán, y también en portugués, inglés e italiano. Además ofrece una serie de módulos adicionales que se pueden agregar al programa, como es el de venta y facturación, equipamiento y alquileres, E-commerce, consulta de estados y carga de órdenes en Internet, productos ensamblados, encuesta sobre la satisfacción al cliente, abonados al servicio de mantenimiento y ranking SAT (que consiste en una visualización mediante tablas y gráficos de las operaciones más destacadas realizadas en el taller, puede exportarse a Excel).\nMejor software de SAT (Servicio de Asistencia Técnica) para tu tamaño de empresa\nValoraciones sobre SAT, Sistema Administrativo para Talleres\nLimitaciones: - 100 registros máximo\nAlternativas a SAT, Sistema Administrativo para Talleres\nLensesPro VPF es el software más completo en la gestión de empresas que se dedican a la fabricación y venta de lentes oftálmicas del mercado. Controle cada uno de los departamentos (RRHH, Almacén, contabilidad, soporte) de manera ágil.\nCompleto ERP para mediana y pequeña empresa que consigue empresas más ágiles y productivas. Flexible y adaptable a las necesidades más específicas, con última tecnología en Bots empresariales. Más de 29 años en el mercado.\nVer más software de SAT (Servicio de Asistencia Técnica)\nCompara los 29 mejores sistemas SAT (Servicio de Asistencia Técnica)\nVer compartivaDescargar guía SAT, Sistema Administrativo para Talleres


China: Alumnos que copien en exámenes irán a prisión. - MAGISTERIO PERUANO\nVistazo » Inicio » Educación » China: Alumnos que copien en exámenes irán a prisión.\nChina: Alumnos que copien en exámenes irán a prisión.\nLas trampas en los exámenes ahora serán consideradas como crímenes en China.\nLas trampas en los exámenes ahora serán consideradas como crímenes en China, ya que aquel alumno que sea descubierto copiando será condenado hasta con siete años de cárcel.\nEsta rigurosa medida se tomó luego de presentar excesivos casos de plagio en los exámenes. Estudiantes que copian, utilizan sustitutos en las pruebas o forman parte de la trama sufrirán multas y penas de cárcel desde tres hasta siete años. Esto también incluye a los padres, según informó El Periódico.\nLos alumnos utilizan material de alta tecnología para poder cumplir su objetivo. Micrófonos camuflados en los oídos, minicámaras en las gafas o dispositivos de escucha atados a una camiseta forman parte de su artillería.\nFuente: El Capital


¿Cómo describir un león para niños?\nPesa entre 200 y 300 kg y mide entre 2 metros y 2 metros y medio), y por su gran rugido (puede escucharse a varios kilómetros de distancia). Además, tiene unas enormes garras y unos colmillos que pueden medir hasta 9 centímetros. Los machos se distinguen por su gran melena de color castaño.\n¿Cuál es la característica principal de los leones blancos?\nLos leones blancos están totalmente adaptados a la caza y es para ello por lo que muchas personas los utilizan. Pueden atacar al hombre como todos los leones. Suelen correr y saltar para coger bien a sus presas. Como características señalar que los machos pesan entre 180 y 251 kg pero las hembras unos 180 kg de medida.\n¿Qué cosas pueden hacer los leones?\nEl rugido del león puede ser escuchado hasta en 9 kilómetros de distancia. Esto les sirve para encontrar a otros leones y para proclamar su territorio. Un león macho puede copular entre 20 y 40 veces al día cuando la hembra está en celo. De hecho, algunos leones incluso pueden dejar de comer durante ese periodo.\n¿Dónde habitan los leones en México?\nCoordenadas 19°18′59″N 99°18′22″OCoordenadas: 19°18′59″N 99°18′22″O\nLos leones son mamíferos carnívoros. La alimentación de los leones se basa en la carne que obtiene de los animales que caza, principalmente herbívoros como los ñus, las cebras, los impalas, las gacelas o los antílopes, por ejemplo.\n¿Qué tamaño tiene un león adulto?\nMacho: 1.8 – 2.1 m\nHembra: 1.6 – 1.8 m\nUn león puede comer más de 20 kg de carne en una sola caza y aniquilar entre 10 y 15 animales al año, completando su dieta con carroña y sobras de otros animales. En la naturaleza no se desperdicia nada. Es muy poco probable que un león atrape a un animal mucho más grande que él como el elefante o un gran rinoceronte.\nLos leopardos deben competir por alimento y refugio con otros depredadores grandes como el tigre, leones, guepardos, hienas manchadas, hienas rayadas, hienas marrones, y hasta cinco especies de osos y perros salvajes africanos y asiáticos.\n¿Qué alimentos consumen los leopardos?\nPara los leopardos del Parque Nacional de Tsavo, en África, los ungulados medianos de 20-80 kilogramos de peso forman parte preponderante de la dieta. Los individuos jóvenes y especialmente las hembras incluyen mayor cantidad de mamíferos pequeños que los adultos machos.\n¿Por qué el leopardo de Arabia está en peligro de extincion?\n«Las serpientes que se comen otras serpientes (como la Rey y la Rata) confunden su propia cola con la de otro ofidio y terminan comiéndose a sí mismas», indica el experto John Allen Gordon-Levitt Gerlach.\nDesde tiempos inmemoriales, se conocen a los mantidos como seres que se alimentan de su pareja. Concretamente se cree que la mantis hembra se come al macho tras la cópula.\nCaracteristicas de un leon\n20 Características del León


Mano fuerte compradora = valor alcista de medio plazo | FinancialRed\nQue los valores que justamente compra la mano fuerte sean los que más suben no es algo que debe sorprender a nadie, y si no mirad el cuadro de la selección de los valores USTECH150. Si, el índice subió más de un 1% (nasdaq) pero es que si hacemos una media de los avances sobre los listados aquí donde la mano fuerte entra, superaríamos el 2% de media, el doble que el promedio. Comprar lo que la mano fuerte compra es una táctica sencilla e inteligente.\nEste screener está disponible en PRT y para los usuarios de Aguila Roja sistemas de trading y sencillamente miramos los avances relativos de la acumulación de mano fuerte en los valores. Se podría incluso ser más restricitvos y admitir valores con un nivel de mano fuerte mayor a cierto nivel, o incluso que la tendencia alcista de la mano fuerte fuera de 3 ó 4 semanas. PRT nos da muchas posibilidades, sólo hay que saber sencillas reglas de programación. Es posible que en Bolsalia 2010 haga un curso gratuito y sencillo sobre la programación de screeners, vereis lo fácil que resulta.\nPrácticamente valor que miramos donde la mano fuerte ha entrado de forma considerable, valor que muestra un aspecto sensacional, siempre cercano a máximos o rondándolos y con comportamientos relativos elevados. Por tanto, quizás la fórmula mfc(mano fuerte compradora) = vamp (valor alcista de medio plazo) tiene un significado más evidente y claro, y aunque la mano fuerte se pueda equivocar en algunos momentos, si revisais todos los gráficos que os he puesto en el buscador o screener, os dareis cuenta que son valores ganadores y con aspectos excelentes que en muchos casos invitan a comprar o a mantener sus acciones.\nContinuar leyendo en AccionesdeBolsa\n« El paro toca la puerta de todos\nEl problema de la temporalidad en España »


Los republicanos en el Senado bloquean la reforma de ley electoral | El Sol de la Florida\nInicio Actualidad EE.UU. Los republicanos en el Senado bloquean la reforma de ley electoral\nBiden arremete contra “el sólido muro republicano” que impide “proteger el derecho al voto”\nLos republicanos en el Senado han bloqueado este martes el proyecto de reforma de la ley electoral, una de las propuestas prioritarias del Partido del presidente de Estados Unidos, Joe Biden.\nEl texto, que ya fue aprobado en marzo en la Cámara de Representantes dominada por los demócratas, contempla una serie de reformas a la actual ley como la creación de comisiones independientes para evitar interferencias de los partidos, un aumento de los presupuestos para combatir la injerencia extranjera durante las campañas, un registro de los votantes, o la obligación de los estados a ofrecer el voto por correo al menos quince días antes del inicio de la votación anticipada.\nEl proyecto de ley no ha avanzado por una votación de 50-50 en la línea del partido, por debajo de los 60 necesarios, según recoge Bloomberg.\nEl proyecto ha cobrado especial relevancia para los demócratas, después de que se hayan estado aprobando en varios congresos estatales, como los de Arizona, Georgia, y Florida reformas legislativas impulsadas por el Partido Republicano que restringen el derecho al voto y en algunos casos incluso facilitan que se anulen los comicios.\nAl conocerse la noticia, el presidente norteamericano ha emitido una declaración en la que ha arremetido contra “el sólido muro republicano” que impide “debatir o considerar una legislación para proteger el derecho al voto y nuestra democracia”.\n“Fue la supresión de un proyecto de ley para acabar con la supresión de votantes y es otro ataque al derecho al voto que, lamentablemente, no tiene precedentes”, ha añadido.\nAsimismo, ha advertido que “la lucha está lejos de haber terminado” y que la próxima semana tendrá más que decir sobre este tema. “Llevo toda mi carrera dedicada a este trabajo, y vamos a redoblar nuestros esfuerzos para vencer de nuevo por el pueblo, por nuestra propia democracia”, ha concluido.\nArtículo AnteriorEric Adams encabeza las primarias demócratas para la Alcaldía de Nueva York\nPróximo ArticuloNuevo Trailer: The Suicide Squad del universo de DC