implementación de un laboratorio de microscopía confocal de\nDepartamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales e\nAutor: Miriam Inmaculada Gordillo Sánchez\nTutor en la Universidad: Francisco Javier Velasco López\nTutor en Repsol: Juan Miguel Jiménez Mateos\nLeganés, junio de 2014\nPUESTA A PUNTO DE UN LABORATORIO DE MICROSCOPÍA CONFOCAL DE MATERIALES\nTítulo: IMPLEMENTACIÓN DE UN LABORATORIO DE MICROSCOPÍA\nCONFOCAL DE MATERIALES\nDirector por la Universidad: Francisco Javier Velasco López\nDirector por Repsol: Juan Miguel Jiménez Mateos\nRealizado el acto de defensa y lectura del Proyecto Fin de Carrera el día 25 de Junio de\n2014 en Leganés, en la Escuela Politécnica Superior de la Universidad Carlos III de\nPensé que no llegaría nunca este día, pero finalmente llegó, y es este trabajo el que\npondrá punto y final a una etapa de mi vida, que no podría haber llevado a cabo sin el\napoyo de muchas personas, a las que quiero aprovechar para mencionar en las siguientes\nAgradezco a Juan Miguel Jiménez y a Francisco Velasco, directores de este\nproyecto, por la gran oportunidad que me dieron y por la confianza que depositaron en\nmí. Por mi parte, ha sido un verdadero placer trabajar con ellos y agradezco enormemente\ntodo lo que me han enseñado y el trato y la paciencia que me han dedicado.\nTambién agradezco a Irene y a Montse, por todo lo que me han enseñado dentro y\nA mis padres, que han trabajado mucho para que tanto mi hermana como yo\npudiéramos estudiar, dándonos siempre todo. Gracias también por sentir mis triunfos\nA mi hermana Marina, que a pesar de ser más pequeña he acabado preguntándole\ndudas de alguna asignatura. Gracias por hacerme reir, por tu ayuda y complicidad.\nA mis tías, que a pesar de que están lejos, siempre las he sentido muy cerca, ya que\nsiempre han estado ahí, detrás del teléfono cuando lo he necesitado.\nA mis suegros y cuñados, que son para mi como padres y hermanos y siempre me\nhan animado y tranquilizado en los peores momentos, subiéndome mucho el ánimo.\nA mi gran amiga y persona Alba, con la que he compartido muchos buenos\nmomentos y siempre ha estado ahí.\nY por supuesto, a mi novio, Carlos, gracias por el apoyo que me has dado siempre y\npor la confianza que siempre has tenido en mí, incluso cuando a mí misma me faltaba un\npoco. Gracias por tu paciencia para explicarme las cosas antes de los exámenes, que más\nde una vez, han hecho que aprobara. Gracias por estar siempre ahí, cuando he reido y\ncuando he llorado, gracias por tus consejos y sinceridad en todo momento.\nFinalmente quiero expresar mi gratitud a Repsol y al personal del Centro\nTecnológico de Repsol (CTR) por permitirme disponer de sus instalaciones y equipos,\npara poder desarrollar este proyecto.\nParte de que haya llegado este momento, y por tanto, de mi título ha sido gracias a\ntodos vosotros, muchas gracias a todos.\nLa microscopía confocal es una técnica basada en la observación de un único plano\nfocal, con un aporte mínimo de señal por el resto de los planos iluminados. Nació a\nmedidados del siglo XX, pero hasta muy recientemente no ha encontrado su lugar como\ntécnica de observación y medición en otros campos, distintos de los que le venían siendo\nEn 2013 se adquiere e implementa un sistema de microscopía confocal, formado por\ndos equipos de Leica (DCM 3D y TCS-SP8) en el Centro Tecnológico de Repsol, el cual\nno sólo permitirá observar y medir con precisión observables a los que antes era difícil\nacceder, sino que permitirá realizar nuevas tareas y descargar de trabajo algunas técnicas\nque tradicionalmente venían estando saturadas, como por ejemplo, el microscopio\nCon este proyecto, se pretende describir el proceso de implementación de los\nequipos, así como ilustrar para qué usarlos y qué puede esperarse de ellos en cuanto a\naplicaciones. También se describirá todo el trabajo realizado para la puesta a punto de\nmétodos e informes con los que cubrir diferentes necesidades del Centro Tecnológico de\nPalabras clave: Microscopía Confocal, aplicaciones, Centro Tecnológico de Repsol.\nConfocal microscopy is a technique based on the observation of a single focal plane\nwith a minimal input signal from the rest of the enlightened planes. Created in the mind20th century, it was not until recent years when this technique found its place as an\nobservation and measurement technique in fields, others than those in which its use was\nwidely spread (biomedical).\nIn 2013, the Repsol Technology Centre acquires and implements a confocal\nmicroscopy system, consisting of two Leica’s hardware (DCM 3D and TCS-SP8). This\niniciative will not only allow to observe and measure with great accuracy, observables\nwhose examination were difficult with previous approches, but also to perform new tasks\nand relieve some techniques traditionally saturated, as for example, the scanning electron\nThis project aims to describe the implementation process of the equipment as well as\nto illustrate how to use them and what can be expected of them in terms of applications.\nAll the work done for the development of methods and reports that cover different Repsol\nTechnology Centre needs are also described.\nKeywords: Confocal Microscopy, applications, Repsol Technology Centre.\nIntroducción y objetivos ............................................................................................................... 12\n1.1 Introducción ........................................................................................................................ 12\n1.2 Objetivos ............................................................................................................................. 13\n1.3 Estructura de la memoria .................................................................................................. 13\nMicroscopía Confocal ................................................................................................................... 15\n2.1 Introducción ........................................................................................................................ 15\n2.2 Principio Físico ................................................................................................................... 16\n2.3 Ventajas de la Microscopía Confocal ............................................................................... 18\nProcedimiento de Selección y Compra de los Equipos .............................................................. 19\nAdecuación del Laboratorio ........................................................................................................ 24\n4.1 Planos del laboratorio de microscopía.............................................................................. 24\n4.2 Equipos anteriormente instalados en el laboratorio de microscopía............................. 24\n4.3 Modificaciones y estado final del laboratorio de microscopía ....................................... 25\nInstalación de los Equipos ............................................................................................................ 26\n5.1 Sistema de microscopía confocal para materiales Leica DCM 3D ................................ 26\n5.1.1 Descripción del Equipo ................................................................................................. 26\n5.1.2 Componentes................................................................................................................. 28\n5.1.3 Condiciones de instalación ........................................................................................... 30\n5.1.4 Software LeicaSCAN .................................................................................................... 33\n5.1.5 Software Leica MAP ..................................................................................................... 35\n5.2 Sistema de microscopía confocal espectral TCS-SP8 con microscopio invertido\nDMI6000CS ............................................................................................................................... 37\n5.2.1 Descripción del equipo ................................................................................................. 37\n5.2.2 Componentes................................................................................................................. 38\n5.2.3 Condiciones de instalación ........................................................................................... 45\n5.2.4 Sofware LAS AF ........................................................................................................... 47\nAplicaciones desarrolladas en la Dirección de Tecnología de Repsol ...................................... 50\n6.1 Introducción ........................................................................................................................ 50\n6.2 Aplicaciones del Sistema de microscopía confocal para materiales Leica DCM 3D.... 53\n6.2.1 Medición de huellas de ensayo HFRR en rodamientos ................................................ 53\n6.2.2 Medición de huellas de cojinetes de biela debidas al efecto de la cavitación ............... 61\n6.2.3 Medición de distancia entre capas en polímeros multicapa. ......................................... 69\n6.2.4 Otras aplicaciones con el DCM 3D .............................................................................. 70\n6.3 Aplicaciones del Sistema de microscopía confocal espectral TCS-SP8 con microscopio\ninvertido DMI6000CS .............................................................................................................. 75\n6.3.1 Inclusiones Fluidas........................................................................................................ 75\n6.3.2 Polímeros multicapa...................................................................................................... 76\n6.3.3 Otras aplicaciones con el TCS-SP8 .............................................................................. 79\nConclusiones .................................................................................................................................. 81\nAnexo ............................................................................................................................................. 83\n8.1 Definiciones básicas ............................................................................................................ 83\n8.2 Planos del laboratorio de microscopía.............................................................................. 88\nReferencias .................................................................................................................................... 92\nOtra Bibliografía consultada ....................................................................................................... 93\nFigura 1. Esquema del principio de la microscopía confocal. .......................................... 17 Figura 2. Fotografía del DCM 3D ..................................................................................... 27 Figura 3. Vistas acotadas del equipo DCM 3D (todas las dimensiones en milímetros) ... 31 Figura 4. Configuración general del microscopio DCM 3D ............................................. 32 Figura 5. Pantalla de adquisición del microscopio............................................................ 33 Figura 6. Pantalla de visualización del microscopio. ........................................................ 34 Figura 7. Pantalla de configuración del microscopio. ....................................................... 34 Figura 8. Pantalla del software Leica Map. 1-visor de páginas, 2-documento, 3-lista de\nestudiables, 4-estudiables, 5-menú operadores, 6-menú estudios, 7-ilustraciones, 8recuadro. (Leica Microsystems) ................................................................................ 35 Figura 9. Fotografía del sistema de microscopía TCS SP8 con microscopio invertido\nDMI6000CS. ............................................................................................................. 37 Figura 10. Principio de trabajo de varios fotodetectores: fotomultiplicadores (izquierda) y\ndetectores híbridos (derecha). ................................................................................... 40 Figura 11. Dimensiones y espacio requerido por el microscopio. .................................... 46 Figura 12. Pantalla de configuración del software LAS AF. ............................................ 48 Figura 13. Pantalla de adquisición del software LAS AF. ................................................ 48 Figura 14. Pantalla de procesado de imágenes del software LAS AF. ............................. 49 Figura 15. Pantalla de cuantificación del software LAS AF. ............................................ 49 Figura 16. Ejemplo de dispositivo con movimiento alternativo de alta frecuencia. 1Recipiente del fluido, 2-Bola de ensayo, 3-Masa de ensayo, 4-Placa de ensayo, 5Baño de calentamiento, 6-Movimiento alternativo. .................................................. 53 Figura 17. Condiciones del aire en el laboratorio. ............................................................ 54 Figura 18. Ejemplo de una huella de desgaste con un contorno borroso. 1-Bola de ensayo\n(no está escalada), 2-Zona no rozada, 3-Zona rozada menos nítida, 4-Zona rozada. 55 Figura 19. Imagen de la capa topográfica nivelada (izquierda) y de la capa de la imagen\n(derecha). ................................................................................................................... 57\nFigura 20. Imagen topográfica con escala de alturas en pseudocolor (izquierda). Imagen\ntopográfica con supresión de forma (derecha). ......................................................... 57 Figura 21. Medidas de alturas en el perfil del diámetro menor de la huella del rodamiento.\n................................................................................................................................... 58 Figura 22. Medidas de áreas en el perfil del diámetro menor de la huella del rodamiento\n................................................................................................................................... 58 Figura 23. Volumen de la huella. ...................................................................................... 59 Figura 24. Componentes de una biela. .............................................................................. 61 Figura 25. Representación esquemática del fenómeno de nucleación y colapso de microburbujas y la emisión de ondas de choque. ............................................................... 62 Figura 26. Fotografía de las diferentes huellas producidas en los cojinetes, en función de\nla holgura. .................................................................................................................. 63 Figura 27. Imagen de la capa topográfica nivelada (izquierda) y de la capa de la imagen\n(derecha), realizadas ambas con un objetivo de 20x. ................................................ 65 Figura 28. Imagen topográfica con escala de alturas en pseudocolor (izquierda). Imagen\ntopográfica con supresión de forma (derecha). Realizadas ambas con un objetivo de\n20x ............................................................................................................................. 65 Figura 29. Medidas de alturas en un perfil de la huella del cojinete. ................................ 66 Figura 30. Medidas de áreas en un perfil de la huella del cojinete. .................................. 66 Figura 31. Volumen de una de la huellas del cojinete realizada con un objetivo de 20x. 67 Figura 32. Imagen de la huella completa de un cojinte, realizada con un objetivo de 10x,\nen la que se mide el volumen de una de las huellas laterales. ................................... 67 Figura 33. Perfil del espesor de un polímero bicapa (PE-PA). ......................................... 69 Figura 34. Perfil del espesor de las capas en un polímero bicapa (PE-PA). ..................... 70 Figura 35. Imagen de inyectores diesel ............................................................................. 70 Figura 36. Superficie de la cabeza de un inyector de diesel en pseudocolor (izquierda) y\ncon supresión de forma (derecha). ............................................................................ 71 Figura 37. Altura máxima y media de un orificio de un inyector diesel usado ................ 71 Figura 38. Área de un orificio de un inyector diesel usado............................................... 72 Figura 39. Volumen de un orificio de un inyector diesel usado. ...................................... 72 Figura 40. Junta de teflón y carbono (tipo gráfito y fibra de carbono) ............................. 73 Figura 41. Superficie de la junta sin usar .......................................................................... 74 Figura 42. Superficie de la junta usada ............................................................................. 74 Figura 43. Inclusión fluida observada con un microscopio óptico convencional. ............ 75 Figura 44. Inclusión fluida en tres dimensiones................................................................ 76 Figura 45. Imágenes de cortes en plano YZ de polímeros multicapa. .............................. 77 Figura 46. Vista del recubrimiento realizado a un polímero ............................................. 78 Figura 47. Imágenes de las nanopartículas tomadas con microscopía confocal por\nreflexión. ................................................................................................................... 79 Figura 48. Imágenes de la fluorescencia de las fibras de papel. ....................................... 80 Figura 49. Esquema del funcionamiento de una lente convergente. ................................. 86 Figura 50. Plano de las medidas generales del laboratorio de microscopía. ..................... 89 Figura 51. Plano del laboratorio de microscopia, especificando las medidas del\nmobiliario. ................................................................................................................. 90 Figura 52. Plano del laboratorio de microscopía especificando la colocación de los\nequipos disponibles en la sala. .................................................................................. 91 9\nTabla I. Características técnicas del perfilómetro ofertadas por Olympus, Leica y Zeiss. 20 Tabla II. Características técnicas del equipo másico ofertadas por Olympus, Leica y\nZeiss. ......................................................................................................................... 21 Tabla III. Soporte técnico y coste de los equipos.............................................................. 22 Tabla IV. Comparativa de los proovedores....................................................................... 22 Tabla V. Condiciones de operación del DCM 3D ............................................................ 30 Tabla VI. Láseres del TCS SP8......................................................................................... 43 Tabla VII. Objetivos del microscopio. .............................................................................. 44 Tabla VIII.Condiciones ambientales de funcionamiento. ................................................. 45 Tabla IX. Dimensiones y espacio requerido. .................................................................... 45 Tabla X. Condiciones de vibración máximas aceptables. ................................................. 46 Tabla XI. Especificaciones eléctricas................................................................................ 47 Tabla XII. Condiciones del ensayo. .................................................................................. 54 10\nEcuacion 1. Límite de resolución………………………………………………… ..81\nEcuación 2. Magnificación…………………………………………………….......109\nEcuación 3. Distancia focal………………………………………………………..110\nEcuación 4. Apertura numérica………………………………………………….. 110\nEcuación 5. Límite de resolución……………………………………………….... 111\nEcuación 6. Profundidad de campo………...……………………………….......... 112\nEl presente proyecto nace de la idea del departamento de Tecnologías Analíticas\n(TTAA) de la Dirección de Tecnología de Repsol, de adquirir un sistema de microscopía\nconfocal capaz de satisfacer nuevos requisitos planteados en diferentes áreas, tales como\nel Laboratorio de Motores y Lubricantes, Geología, Combustibles y Refino, Polímeros,\nLos nuevos requisitos que se plantean son tan diversos como las áreas donde son\nrequeridos, siendo algunos de ellos, la observación del interior de materiales\ntransparentes de forma no invasiva, sin contacto, y con una mínima interacción (la luz), la\nobtención de medidas muy precisas en las tres dimensiones espaciales, el calculo de áreas\ny volúmenes e incluso la reconstrucción de la superficie en tres dimensiones\nEsta nueva técnica, rápida, flexible y robusta, también plantea ventajas, como la\nposibilidad de observar la muestra en color real.\nPor todo ello, la microscopía confocal supone una mejora sobre otras técnicas, como\nla Perfilometría de contacto, el Microscopio Electrónico de Barrido (SEM) y la\nMicroscopía óptica convencional.\nEl objetivo fundamental del Proyecto consiste en la implementación de un sistema de\nmicroscopía confocal, que cuenta con dos microscopios (DCM 3D y TCS-SP8), ambos\nde Leica) en el Centro Tecnológico de Repsol (CTR), y el desarrollo de métodos para la\nobservación y el estudio de muestras procedentes de los proyectos de I+D+i en curso, así\ncomo de los Laboratorios de Asistencia Técnica de las diversas Empresas del Grupo.\nLos estudios provenientes del Laboratorio de Motores, donde se desarrollan los\ncombustibles y lubricantes de última generación de Repsol, tanto comerciales como de\ncompetición, recibirán en este Proyecto una atención particular.\nAdemás del objetivo principal, este Proyecto también recoje una serie de objetivos\npersonales que van implícitos en la consecución del mismo:\nAdquirir una visión global del funcionamiento de una empresa multinacional,\nen la que los diferentes departamentos están íntimamente relacionados,\nparticularmente su área de I + D + i.\nAmpliar los conocimientos teóricos adquiridos en la Universidad, así como la\nadquisición de conocimientos prácticos acerca de distintas tecnologías.\nEste documento se puede dividir en cinco bloques principales:\n1. El primer bloque comprende los capítulos uno y dos, en los cuales, por un\nlado, se realiza una introducción de los contenidos y objetivos del proyecto, y\npor otro, se describen los conceptos principales de la microscopía confocal,\nasí como sus ventajas más características.\n2. El segundo bloque muestra el procedimiento de compra que se llevó a cabo\nen el caso de los equipos de los que trata el proyecto.\n3. La tercera parte, se corresponde con los capítulos cuatro y cinco, en los que\nse desarrollan los procedimientos que se llevaron a cabo para adecuar el\nlaboratorio del Centro Tecnológico de Repsol, en el cual se iban a colocar los\nnuevos equipos. En este bloque también se describen los equipos\ndetalladamente (hardware y software).\n4. En el cuarto bloque (capítulo 6) se describen algunas de las aplicaciones\ndesarrolladas en los equipos para dar servicio a diferentes áreas del Centro\nTecnológico de Repsol.\n5. En el quinto y último bloque, se presentantan las conclusiones del proyecto,\nademás de un anexo donde pueden encontrarse definiciones que serán de\nayuda en la lectura y entendimiento del proyecto.\nEl concepto de microscopía confocal fue patentado en 1957, por Marvin Minsky,\nmatemático estadounidense, siendo introducidos los primeros microscopios en 1968 por\nPetran y colaboradores. Sin embargo, su gran aceptación y espectacular desarrollo ha ido\nde la mano del avance de los láseres y equipos de cómputo.\nLa microscopía confocal es una nueva técnica de observación, que está logrando\nexcelentes resultados en diversas ramas de la Ciencia, no sólo en el campo biomédico\n(Medicina, Biología y sus ramas), que es donde la técnica nace, sino también para las que\nhasta ahora eran ajenas, tales como las Ciencias relacionadas con los materiales (Física y\nQuímica de Estado Sólido, Ingeniería de Materiales, Electrónica, Mecánica, Geología,\nTribología y muchas más). Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a\nla microscopía óptica tradicional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor\nresolución vertical y horizontal, etc) y sobre todo a la posibilidad de obtener “secciones\nópticas” de la muestra, lo que permite su estudio tridimensional de forma no invasiva.\nLa mayor parte de las muestras observadas con microscopía óptica, son translúcidas,\no en el caso de ser opacas, su superficie de reflexión no es fácil que llegue a estar\nperfectamente pulida. En ambos casos, la luz interacciona con la muestra a varias\nprofundidades, por lo que la imagen que llega al observador presenta áreas borrosas\ndebidas a la luz procedente de zonas fuera del plano de enfoque, lo que produce una\ndegradación en el contraste y resolución de la imagen. Por otra parte, en la microscopía\nde fluorescencia convencional, el espécimen entero está sobresaturado de luz a partir de\nla fuente de iluminación. Debido a la conservación de la intensidad de la luz en su\nrecorrido, todas las partes del espécimen a lo largo de su ruta óptica serán excitadas y la\nfluorescencia detectada por un fotomultiplicador o una cámara.\nEl principio de la microscopía confocal se basa en utilizar una iluminación puntual y\nen la eliminación de la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco\npor medio de una apertura o diafragma, (pinhole, en el argot habitual de este campo).\nDado que sólo se ilumina una pequeña zona de la muestra, casi puntual, para poder\nvisualizarla se necesita un sistema de barrido que permita muestrear todos los puntos,\npixeles, de la zona a observar, y un sistema de formación de la imagen donde se recoja la\ninformación de cada uno de estos puntos y reconstruya la imagen.\nEste tipo de microscopio confocal en el que el haz del laser barre la muestra es\ndenominado Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM). Debido a que el laser\nnecesita un tiempo para barrer la imagen, ésta no puede ser visualizada de manera\nEl microscopio confocal trabaja con muestras que al incidir la luz sobre ellas,\nreflejan toda o parte de la luz incidente (microscopía de reflexión), o emiten luz en una\nlongitud de onda superior (microscopía de fluorescencia). El primer caso se suele utilizar\ncon muestras opacas, principalmente en estudios de materiales, mientras que la\nfluorescencia, hasta ahora, se utiliza principalmente con muestras biológicas.\n2.2 Principio Físico\nEl funcionamiento básico del microscopio confocal puede observarse en la Figura 1.\nParte de la luz procedente de la fuente de iluminación, atraviesa una primera apertura y es\nreflejada mediante un espejo dicroico (refleja la parte del espectro necesaria para la\nexcitación, transmitiendo el resto), y se enfoca en un punto del espécimen mediante la\nlente de un objetivo. La señal emitida por el punto iluminado (fluorescencia o luz\nreflejada) vuelve por el mismo camino óptico, pasa de nuevo a través del espejo dicroico\ny es enfocada en un detector o fotomultiplicador. Una segunda apertura es colocada\ndelante del detector para eliminar las señales procedentes de la zona fuera de foco (por\nencima del foco o por debajo de él).\nLa base para describir un microscopio confocal es la existencia de dos pinholes, uno\nentre la fuente de luz y el objetivo, y el otro entre el objetivo y el detector. Ambos\npinholes deben estar perfectamente alineados de forma que el segundo de ellos,\núnicamente deje llegar al detector la luz procedente del plano focal. La utilización de un\nláser como fuente de luz permite focalizar la iluminación en una región muy pequeña de\nla muestra y con una gran intensidad. La luz reflejada, o fluorescencia emitida por la\nmuestra es recogida en un detector, donde se transforma en una señal de vídeo que se\ndigitaliza y almacena en un ordenador, visualizándose a través de un monitor. La mayoría\nde los sistemas cuentan con varios detectores y un sistema óptico, que permite recoger en\ncada uno de ellos diferentes longitudes de onda.\nFigura 1. Esquema del principio de la microscopía confocal.\n(microscopía laser confocal)\n2.3 Ventajas de la Microscopía Confocal\nLas principales ventajas de la microscopia confocal frente a la microscopia óptica\ntradicional son las siguientes:\nMayor resolución: descrito en el apartado 8.1 (Anexo: Definiciones Básicas).\nMayor contraste: debido a que se elimina la luz procedente de las zonas fuera\nPosibilidad de realizar secciones ópticas: Variando el plano de enfoque, el\nsistema es capaz de tomar imágenes a diferente profundidad, lo que permite\nobtener información tridimensional de la muestra, que además llega a ser\nReconstrucción 3D. A partir de las secciones ópticas es posible aplicar\ntécnicas de reconstrucción 3D que nos permitan visualizar estructuras\ntridimensionales, además de poder calcular y medir no sólo longitudes y áreas\nen el plano XY sino también áreas en el espacio tridimensional y volúmenes.\nAdemás, es posible programar el equipo para obtener imágenes durante un\nImágenes Lambda. Si el equipo cuenta con un detector espectral podremos\ntomar imágenes a diferentes longitudes de onda (“lambda scan”) y a partir de\nellas, deducir el espectro de emisión o fluorescencia de un objeto, incluso\nbajo excitación de varias longitudes de onda.\nEl sistema de barrido punto a punto (scan) utilizado en los microscopios confocales\nde tipo CLSM, comporta una serie de ventajas adicionales como son:\nPosibilidad de obtener imágenes perpendiculares al plano XY tomando la\nmisma línea a diferentes profundidades.\nFijar el láser sobre un punto o una pequeña zona de la muestra y tomar\nimágenes a diferentes tiempos para observar los efectos del láser sobre esa\nAumentar la resolución mediante zoom del área a barrer tomando mayor\nnúmero de puntos en áreas más pequeñas.\nLa velocidad de formación de la imagen depende, por tanto, del número de puntos\nque tomemos por imagen (resolución), así como del tiempo que se dedique a registrar la\nseñal proveniente de cada punto (tiempo de residencia o “dwelling time”).\nProcedimiento de Selección y\nDebido a las nuevas necesidades existentes en la Dirección de Tecnología de Repsol,\nse decide implementar un laboratorio de microscopía confocal en el Centro Tecnológico\nde Repsol (CTR).\nPara evaluar diferentes opciones, se solicitan ofertas a diferentes proveedores. Los\nelegidos son: Olympus, Leica, Zeiss e Izasa (representante de Nikon en España), a los\ncuales se les demandará la presentación de una oferta técnica además de una\ndemostración en el CTR. Izasa no presenta propuesta, por lo que es descartada\nEl departamento de Tecnologías Analíticas de la Dirección de Tecnología de Repsol\nestudia y valora los equipos de los diferentes proveedores, teniendo en cuenta las\ncaracterísticas técnicas, las prestaciones y el servicio post-venta.\nUna vez propuestas unas recomendaciones técnicas, el Departamento de Compras,\nteniendo en cuenta las observaciones de Tecnologías Analíticas, negocia las propuestas\ncon los proveedores, teniendo en cuenta el precio, y termina por designar un proveedor.\nEn la tabla I y tabla II se muestra la comparación de las características técnicas de los\nequipos de los tres proveedores considerados, primero para el perfilómetro y después para\nel equipo másico (confocal “clásico”).\nEn la tabla III se muestran otras características de interés, tales como la formación y\nel soporte técnico prestado por los diferentes proveedores.\nLED B + LED 460\nalta resol. (px)\n15,4 X 15,4\nespacio trabajo vertical máx (cm)\ndimen. Pletina (cm)\nrango de trabajo en z (cm)\nresol. máx z (nm)\n0,08 - 10,7 PLAN\n0,15 - 20 PLAN\n0,3 - 11 PLAN\n0,4 -12 PLAN\n0,6 - 1 PLANAPO\n0,5 - 10,6 PLAN\n0,95 - 0,35\n0,8 - 3,4 PLAN\n0,15 - 12 PLAN\n0,13 -14,5 EPIPLAN\n0,3 -11 PLAN\n0,25 -9,3 EPIPNEOF\n0,5 - 1,27 PLAN\n0,22 - 12,1 EPIPNEOF\n0,55 - 8 PLAN\n0,5 - 2,1 EPIP-NEOF\n0,95 - 0,27 EPIPAPO\n0,95 - 0,25 PLAN\n0,95 - 0,23 EPIPAPO\nresol. vertical (um)\nrepetibilidad hor. %\nrepetibilidad ver. %\nexactitud (1 um) %\nTabla I. Características técnicas del perfilómetro ofertadas por Olympus, Leica y Zeiss.\nEl equipo ofertado por Leica ofrece la posibilidad de ver la superficie en campo\noscuro, aplicación muy útil ya que gran parte del espécimen queda a oscuras, mientras\nque las partículas, se ven brillantes por la luz que reciben y dispersan en todas las\ndirecciones, pudiendo diferenciarlas fácilmente.\nOtra de las ventajas que ofrece Leica es una robusta platina, capaz de soportar piezas\npesadas (hasta 20 kg) y de grandes dimensiones, ya que el cabezal es móvil.\nAdemás de esto, la resolución del equipo ofertado por Leica, es mejor que la de los\nequipos de las otras casas.\nred difrac galva + filtros\n1 PMT fluor.\n1 PMT trans.\nCCD 1X1,8" 2 Mpx\n0,13 - 17 PLAN\n0,15 - 13,7 PLAN\n0,3 - 10 PLAN\n0,45 -7,6 PLAN corrección\n0,7 - 2,4 PLAN APO seco\n0,75 - 0,6 PLAN APO inm\n1,3 -0,2 PLAN\n0,7 - 2,2 PLAN corrección\n1,42 - 0,15 PLANAPO inmersión\n1 HyD fluor.\n3 PMT fluor.\ndiodo 50 mW\ndiodo 15 mW\n1,4 - 0,14 PLANAPO (inmer.\ndiodo CW 50 mW\n0,45 - 2,1 PLAN\n0,8 - 0,55 PLAN\n1,3 - 0,2 PLAN APO\n1,4 - 0,19 PLAN\ndiodo 30 mW\nES 20 mW\nAr 25 mW\ndiodo 20 mW\nHeNe 5 mW\nTabla II. Características técnicas del equipo másico ofertadas por Olympus, Leica y Zeiss.\nEn este caso, se puede observar que la resolución del equipo de Leica es bastante\nmejor, además la oferta de objetivos de que dispone tienen mejores aperturas númericas\nque los que ofrece Olympus y muy similares a las de Zeiss.\nEn la tabla III se puede observar que Leica tiene más técnicos a disposición del\ncliente que Olympus y ofrece más horas de formación que Zeiss.\nSoporte técnicos Olympus 2 (Barna, Oporto) especialistas 1 5 3 80 48 32 formación (h) Leica 4 (1 Mad, Alicante, 2 Barna) Zeiss 4 Tabla III. Soporte técnico de los equipos\nTras observar las características técnicas de los equipos se realiza una valoración de\nlos proveedores, en base al precio, el equipo más moderno, el proveedor con mejor\ninfraestructura de servicio al cliente y las características técnicas de los equipos, teniendo\nen cuenta cuáles son los mejor optimizados para cumplir las necesidades del CTR. En la\ntabla IV, se muestran los resultados de la comparativa, obteniendo Leica los mejores\nTabla IV. Comparativa de los proovedores\nTecnologías Analíticas envía la valoración realizada al Departamento de Compras, a\nconsiderar junto con la oferta económica de los proveedores. Este departamento, inicia\nuna negociación con el proveedor preferido (en este caso Leica), en la que se tratan\ndiferentes puntos, tales como:\nAñadir accesorios al equipo solicitado por el usuario, que no estaban incluidos en\nlas ofertas iniciales recibidas. De esta forma se consigue equipar el laboratorio\ncon un sistema de mejores prestaciones.\nAprovechar la negociación para bajar precio en otras dos solicitudes de pedido\ngeneradas por otras áreas de Tecnología, y que se pretenden adquirir también a\nTras esta negociación con Leica, se acuerda la compra de los dos equipos confocales\n(DCM 3D y TCS-SP8), en cuyo presupuesto se incluyen una platina galvanométrica\n(Galvo stage) para el TCS-SP8 y un objetivo confocal (150 x) para el DCM 3D.\nAdecuación del Laboratorio\n4.1 Planos del laboratorio de microscopía\nLa sala de microscopía del CTR (laboratorio 08), presenta una estructura rectangular\nde 9,9 metros de largo y 3,2 metros de ancho. Se presentan los planos de dicha sala en el\napartado 8.2 (Anexo: Planos de la habitación de microscopía).\n4.2 Equipos anteriormente instalados en el\nAntes de la compra de los nuevos equipos, se disponía de:\n• Microscopio óptico de luz transmitida, incluyendo contraste interferencial\ndiferencial, Leica DM6000B, utilizado con muestras muy delgadas.\n• Microscopio de reflexión y luz polarizada (metalográfico), Leitz-Leica DM\nRXP, usado especialmente para observación de muestras por reflexión.\n• Microtomo (Reichert -actualmente Leica- Ultracuts): es un instrumento de\ncorte que permite obtener cortes muy finos (nanométricos) de un material,\nconocidos como secciones. Este tipo de equipos es importante en la\nmicroscopía ya que permite la preparación de muestras para ser observadas en\nmicroscopios de transmisión ópticos y electrónicos.\n• Lupa binocular (Leica MZ APO): usada para la observación estereoscópica de\n• Microscopio Electrónico de Barrido (FEI Quanta Feg 650): permite una mayor\nmagnificación, y en función del detector utilizado, se pueden obtener distintos\ntipos de imagen (de electrones secundarios o retrodispersados). Además\npermite realizar análisis elemental mediante la técnica EDS y análisis\ntopográfico (empleado para observar superficies constituidas por pequeños\nrelieves, depresiones, grietas y prominencias). También cuenta con un sistema\n• Metalizador: equipo que permite la deposición de capas conductoras finas y\nuniformes, por ejemplo, por impacto sobre una lámina metálica (usualmente\noro) por parte de un plasma de Ar (sputtering), con objeto de hacer conductora\nelectrónicamente la superficie de las muestras a observar por SEM, evitando\naberraciones debidas a efectos de carga en superficie y permitiendo mayor\ncalidad, resolución y magnificación.\n4.3 Modificaciones y estado final del\nLa instalación de los nuevos equipos de Leica requería ciertos requisitos de espacio, por\nlo que hubo que reorganizar la habitación. Se reubicaron varios equipos para disponer de\nmás espacio, y además se donó el metalizador a la Universidad Rey Juan Carlos, debido a\nsu obsolescencia. En el plano 3 del Anexo (Punto 8.2: Planos de la habitación de\nmicroscopía) puede verse la disposición final de la sala con todos los equipos reubicados.\n5.1 Sistema de microscopía confocal para\nmateriales Leica DCM 3D\n5.1.1 Descripción del Equipo\nEn el campo de la metrología sin contacto de superficies, existía en los últimos años,\nuna ardua competencia entre los interferómetros y los perfilómetros confocales, a pesar\nde que ambas tecnologías permiten realizar mediciones topográficas precisas y fiables en\nun rango que empieza por los milímetros y llega hasta los nanómetros.\nEl DCM 3D de Leica es un perfilómetro tridimensional, basado en la adquisición de\nimágenes confocales, es decir, permite la visualización tridimensional y la medición sin\ncontacto de superficies en tres dimensiones, siendo capaz de ofrecer en un solo equipo,\nun microscopio en color para aplicaciones de campo claro y campo oscuro, un sistema de\nadquisición y medición confocal de alta resolución y un perfilómetro óptico.\nEl DCM 3D es ideal tanto para la visualización como para la medida de forma y\nrugosidad de superficie y capas en la escala micrométrica y nanométrica.\nAdemás, resulta apto para la medida de superficies con pendientes locales muy\nelevadas, muestras de baja reflectividad o compuestas por materiales similares. También\nes capaz de realizar evaluaciones de forma muy rápida y sin contacto, lo que supone un\ngran ahorro de tiempo, y la posibilidad de observar la muestra sin que ésta sufra ningún\ntipo de modificación. En la figura 2 se muestra una fotografía de este equipo.\nFigura 2. Fotografía del DCM 3D\n(Leica DCM 3D Dual Core 3D Profiler combines Confocal Imaging and Interferometry)\nEl sistema DCM 3D, también es capaz de adquirir imágenes interferométricas, con\nsólo incorporar los objetivos adecuados para ello (interferométricos).\nUna de las características importantes del equipo es que posee un diseño muy robusto\ny compacto. A continuación se describen algunos de sus componentes y sistemas más\nEl cabezal del equipo, está soportado por una columna de granito, que permite su\ndesplazamiento vertical, lo que hace posible trabajar con piezas de muy distintas alturas\nde forma fácil y eficaz. Además dispone de un sistema de enfoque motorizado de alta\nresolución con un rango de trabajo de 40 mm, dotado de detección automática de final de\nrecorrido, tanto en la posición inferior como en la superior.\nLa platina que lleva instalada, está motorizada en X-Y, contando con un recorrido de\n154 × 154 mm, una resolución de 40 nm y una capacidad máxima de carga máxima de 20\nLos objetivos del equipo, están montados en un único porta-objetivos motorizado\nmúltiple de 6 posiciones; éstos son intercambiables y pueden ser actualizados. Los\nobjetivos que se adquirieron fueron todos confocales y compatibles con la visión en el\ncampo claro y campo oscuro:\nObjetivo Confocal 5× HC PL FL: es un objetivo de aumentos bajos, para medidas\nen el rango micrométrico. Permite el análisis con alta precisión de una amplia\nzona de la muestra gracias al sistema de seguimiento de enfoque e imágenes\npanorámicas con precisión metrológica. Tiene una apertura numérica de 0,15.\nObjetivo Confocal 10× HC PL FL: óptimo para la visualización y caracterización\nde superficies con rugosidad media a escala micrométrica. Su apertura numérica\n(0,3), permite realizar análisis de rugosidad equivalentes a los obtenidos con un\nsistema táctil, ya que su capacidad de resolver detalles es comparable a un\nperfilómetro/ rugosímetro con punta de 2 micras.\nObjetivo Confocal 20x HC PL FL: presenta un excelente compromiso entre\napertura numérica (0,5), distancia de trabajo y aumentos, lo que le convierte en un\nobjetivo óptimo para obtener gran definición en múltiples campos de la muestra a\nObjetivo Confocal 50 x HCX PL APO: objetivo de altos aumentos para observar\nmicroestructuras con mayor detalle gracias a su elevada apertura numérica, (0,9).\nObjetivo Confocal 50x N PLAN L Larga Distancia de Trabajo: objetivo de altos\naumentos y larga distancia de trabajo para adquisición topográfica sobre áreas de\ndifícil acceso, o con obstáculos físicos, para el enfoque a distancias normales de\ntrabajo. Su apertura numérica es de 0,5.\nObjetivo Confocal 150x HCX PL APO: objetivo de muy altos aumentos, con la\nmayor apertura numérica, (0,95), para la observación y medida de\nmicroestructuras con la máxima resolución al alcance de la tecnología confocal.\nLos objetivos de apertura numérica elevada (0,95) y gran aumento, facilitan la\nmedición de superficies lisas, que pueden presentar incluso desniveles con una\ninclinación de más de 70°.\nGeneralmente, un objetivo con una gran apertura numérica (NA) está ligado a un\nmayor aumento, lo que reduce el campo visual a unas pocas micras.\nPara superar esta limitación, el Leica DCM 3D ofrece una función para generar\nimágenes topográficas panorámicas (“stitching”). Dicha función, permite combinar las\nsecciones adquiridas en modelos tridimensionales, generando un área mucho más amplia\nque un campo visual individual. Los datos finales de la superficie muestran un modelo\ncontinuo de alta precisión en un área amplia de la muestra, manteniendo la textura\nenfocada y las propiedades originales de un campo individual.\nOtra de las características importantes de este equipo, es que cuenta con un sistema\nde autoenfoque, que permite trabajar con la muestra siempre enfocada. En el caso de\nmuestras irregulares con textura, este método permite obtener la mayor parte de la\nimagen siempre en foco.\nEl sistema de iluminación del DCM 3D, cuenta con un sistema dual, basado en leds.\nIncluye, integrado dentro del propio cabezal, una fuente de luz azul (460 nm) de corta\nlongitud de onda para medir con la máxima precisión, y una fuente blanca (imagen\nconvencional y confocal en color), para poder obtener iluminaciones homogéneas y\ncolores reales de la textura de la muestra. Ambas fuentes se controlan de forma\nelectrónica, sin ningún componente mecánico, estando así libres de vibraciones que\npuedan afectar a las medidas. Por otra parte, los leds tienen un tiempo de vida medio\nantes de fallo muy elevado (25.000 horas de trabajo continuo).\nEl sistema de captación de imagen, incluye dos dispositivos, cada uno con un\npropósito definido. El primero es una cámara en blanco y negro metrológica de alta\nvelocidad que permite obtener resultados metrológicos reproducibles. El segundo es una\ncámara en color específicamente diseñada para optimizar la reproducción de texturas y\ncolores de la muestra.\nEn cuanto al Software, el equipo incorpora dos, el LeicaScan que es un software\ngráfico interactivo para la adquisición, análisis, procesado y visualización de datos y el\nLeicaMap, para la realización de análisis, que dota al equipo de una gran cantidad de\nparámetros, estadísticas y posibilidades de preparación de informes.\nEl equipo dispone de seis tecnologías de inspección y medición que permiten\ncaracterizar un campo de visión con la técnica que mejor se adapte a la muestra. Sin\nembargo, debido a la configuración adquirida, solo se tiene la posibilidad de llevar a cabo\nlas que se describen a continuación:\nMicroscopia Convencional de Campo Claro: permite inspeccionar una superficie,\nobtener imágenes de la misma y seleccionar aquellas regiones de mayor interés en\nlas que deben realizarse medidas de topografías 3D.\nMicroscopía Convencional de Campo Oscuro: con este sistema es posible ver en\ntiempo real la muestra, e identificar los detalles más finos, ya que cuenta con un\npotente algoritmo de detección de bordes.\nMicroscopía Confocal Blanco y Negro (B/N), Color y Perfilometría: es ideal para\nla obtención de imágenes con el máximo contraste y para la medida de topografías\n3D en superficies pulidas y rugosas. Mediante la utilización de esta técnica la\nmuestra es escaneada verticalmente en una serie de planos predefinidos de manera\nque cada punto de la superficie pase a través del nivel del foco. Toda la\ninformación de la imagen que se encuentra fuera del foco es eliminada. Se obtiene\nla altura de la superficie en cada pixel, detectando el pico de la respuesta axial con\nresolución nanométrica. Dado que solo uno, o unos pocos puntos de la superficie\nestán iluminados en el mismo momento, también se realiza un escaneado en cada\nplano individual para la obtención de dicha respuesta axial, dando lugar a la\ncorrespondiente imagen confocal. La imagen confocal permite obtener la mayor\nresolución lateral posible en un sistema óptico, alcanzando resoluciones laterales\nmejores de 140 nm y resoluciones verticales mejores de 1 nm.\n5.1.3 Condiciones de instalación\nPara el buen funcionamiento de los equipos, se requieren unas condiciones\nambientales y de espacio adecuadas. Estas condiciones se presentan en la tabla V:\nEntre 5 ºC y 40 ºC\n< 2000 metros\nTabla V. Condiciones de operación del DCM 3D\nEstas condiciones se cumplen, ya que el laboratorio se encuentra siempre a una\ntemperatura de entre 20 y 22ºC y humedad relativa siempre menor al 80 %. Además las\ninstalaciones de Repsol se encuentran en la ciudad madrileña de Móstoles cuya altitud es\naproximadamente de 660 metros.\nEl equipo cuenta con tres tomas eléctricas de 220V (Monofásica), su peso\naproximado (con un objetivo) es de 16,5 kg y el espacio requerido, atendiendo a sus\ndimensiones, se muestra en la figura 3.\nFigura 3. Vistas acotadas del equipo DCM 3D (todas las dimensiones en milímetros)\nLa configuración general se presenta en la figura 4:\nFigura 4. Configuración general del microscopio DCM 3D\n5.1.4 Software LeicaSCAN\nEl software LeicaSCAN es con el que se realizan las adquisiones de las imágenes.\nTiene tres ventanas diferentes, la pantalla de adquisición, la de visualización y análisis y\nLa pantalla de adquisición es la que aparece al iniciar el programa. Se utiliza para\ncolocar la muestra bajo el microscopio en la posición más conveniente, ya que se podrá\ncontrolar la platina motorizada desde ella. Por otra parte, el área de visualización,\nmuestra la imagen en vivo, tomada por la cámara, por lo que se podrá enfocar, además de\nseleccionar los parámetros de adquisición (modo de operación, tipo de medida,\nobjetivo…) con los que se realizará la medida.\nA continuación, en la figura 5, se muestra un esquema de esta pantalla.\nFigura 5. Pantalla de adquisición del microscopio\nUna vez que se ha adquirido una imagen o se ha cargado una que ya se hubiera\nrealizado previamente, el software cambia automáticamente a la pantalla de análisis y\nvisualización. En esta pantalla, se pueden observar los resultados en dos o en tres\ndimensiones, con diferentes colores, zooms y escalas. También se puede invertir la\nmedida o aplicar un filtro para obtener rugosidad y parámetros de ondulación. En la\nfigura 6, se muestran los elementos de esta pantalla.\nFigura 6. Pantalla de visualización del microscopio.\nLa pantalla de configuración se utiliza para, seleccionar opciones de software y\ncomponentes de hardware, alinear y calibrar los objetivos. Los procedimientos de\nalineado y calibrado, se realizan con un espejo plano perfectamente pulido. En la figura 7,\nse pueden observar los elementos principales de esta pantalla.\nFigura 7. Pantalla de configuración del microscopio.\n5.1.5 Software Leica MAP\nEl software Leica Map está orientado al análisis detallado de las imágenes adquiridas\nen el software LeicaSCAN. Este software cuenta con una única ventana, cuyos elementos\nprincipales se muestran en la figura 8.\nFigura 8. Pantalla del software Leica Map. 1-visor de páginas, 2-documento, 3-lista de\nestudiables, 4-estudiables, 5-menú operadores, 6-menú estudios, 7-ilustraciones, 8-recuadro.\nA continuación se explica brevemente todas las partes de la figura 8.\n1. Visor de páginas: muestra todas las páginas del documento y da acceso directo a\nalgunas funciones relacionadas con estas páginas, tales como, insertar páginas, quitar la\npágina seleccionada o imprimirla. También se puede navegar por el documento y\nvisualizar el flujo de trabajo, que ofrece una vista de árbol, de todos los elementos del\ndocumento (superficies, perfiles, operadores analíticos y estudios) y muestra\ngráficamente las relaciones de dependencia entre esos elementos.\n2. Documento: designa el conjunto de las páginas en las que se van a generar,\nilustrar y compaginar estudios.\n3. Lista de estudiables: ventana donde se almacenan y visualizan todos los\nestudiables, tanto si se han creado desde un operador, como si se han cargado desde el\ndisco, o se han medido directamente.\n4. Estudiables mostrados como estudios en el documento: término que hace\nreferencia a todos los datos (perfiles, superficies…) que se pueden estudiar y almacenar\nen un archivo. En función de su paquete de software, se pueden estudiar distintos tipos de\nestudiables, tales como, series de perfiles, superficie en 3D, imagen en color real, imagen\n5. Menú operadores: permite modificar el estudiable medido (perfil, superficie…).\nUn operador es una transformación matemática aplicable a un estudiable, con objeto de\ngenerar otro, conservando el estudiable original. Los operadores disponibles, varian en\nfunción del tipo de estudiable seleccionado. Algunos de ellos son: rectificación,\nnivelación, rellenado de los puntos no medidos, crear una serie de perfiles, supresión de\n6. Menú estudios: permite visualizar y analizar el estudiable medido. Un estudio es\nuna representación gráfica de un estudiable (representación 3D de una superficie) o un\nanálisis realizado en un estudable (cálculo de un parámetro). Igual que en el caso de los\noperadores, los estudios cambian en función del estudiable seleccionado. Algunos de\nellos son: vista en 3D, sueperficie de un hueco, medida de distancias, volumen de un\n7. Ilustración: es un recuadro que contiene texto o graficos, que permiten presentar\nde un modo claro, los estudios realizados en un documento, es decir, con esta herramienta\npueden crearse cuadros de texto explicativos, así como escribir leyendas o poner límites\n8. Recuadro: se refiere a un marco dentro del documento. No puede contener un\nestudio ni una ilustración, tampoco se puede mover ni cambiar de tamaño. En los\nrecuadros hay varias opciones disponibles: botón paleta (permite seleccionar la paleta de\ncolores que se empleará para la presentación de alturas en las superficies), botones de\najuste de escala, editar escala de color, etc.\nEl programa dispone, además, de algunas opciones, que hacen más cómodo el\ntrabajo, y que además, pueden facilitar los trabajos futuros. Una de estas opciones es el\nuso de plantillas, que permiten automatizar los análisis y el modo en que se presentan.\nTambién cabe destacar, que las páginas del documento, están compuestas por dos\n“capas”, por lo que se podrá editar una página maestra, que será la primera de ellas y en\nla que únicamente se podrá colocar recuadros de tipo ilustraciones (ilustración, texto). La\npágina maestra es idéntica para todas las páginas de un mismo documento.\n5.2 Sistema de microscopía confocal espectral\nTCS-SP8 con microscopio invertido\n5.2.1 Descripción del equipo\nEl TCS-SP8 es un microscopio confocal de barrido laser (figura 9), principalmente\norientado a la fluorescencia, aunque también incorpora detectores para luz reflejada y\nFigura 9. Fotografía del sistema de microscopía TCS SP8 con microscopio invertido\nEl Leica TCS SP8 fue diseñado para microscopía confocal, con rendimiento fotónico\nóptimo y alta velocidad. Todos los componentes ópticos, se acoplan preservando la\nfluorescencia fotónica para el contraste de imagen. Respaldando esta detección sensible,\nhay un sistema de barrido punto a punto, de alta velocidad, con hasta 428 imágenes por\nsegundo, gran campo de visión, y apilamiento en Z acelerado. Esto hace que el\ninstrumento pueda adaptarse a las muestras más exigentes, con una velocidad máxima y\nuna resolución confocal completa.\nPor otra parte, sistema Leica TCS SP8, se basa en un concepto flexible, pudiendo ser\nadaptado a una amplia gama de aplicaciones, debido a su organización en módulos que\npueden ser adquiridos y agregados.\nMÓDULO CONFOCAL ESPECTRAL TCS SP8\nEl TCS SP8 es un módulo confocal de barrido punto a punto, dotado de\nun sistema de detección espectral, mediante análisis de la luz por prisma, y\npor tanto, carente de dicroicos secundarios o filtros barrera.\nTodos los elementos del módulo confocal están motorizados y\ncontrolados electrónicamente, siendo sus características principales las\n1. Sistema de Barrido FOV (Field of view)\nEl tamaño de la zona visible de una imagen microscópica, se\ndetermina por el campo de visión del microscopio. El diseño óptico,\nformado por las lentes del objetivo, la óptica y el sistema de barrido,\nafecta al campo de visión. Para poder obtener un gran campo de\nvisión, se intenta conseguir una iluminacón homogénea de la zona, sin\nperder resolución del centro al borde.\nEl sistema de barrido de Leica usa la configuración x2y (en lugar\nde la habitual xy), es decir, utiliza tres espejos de barrido, uno para la\ndimensión x y dos para la dimensión y. Uno de los espejos del sistema\nde barrido es sustituido por dos espejos conjugados, que se mueven de\nforma sincronizada, para conseguir que el rayo de luz se encuentre\nsiempre centrado en la pupila posterior de objetivo, obteniéndose una\niluminación tan homogénea que permite extender el campo de barrido\nal máximo, consiguiendo así, un campo de visión con una diagonal de\n22 milímetros, el mismo que en oculares.\n2. Sistema de barrido de alta resolución\nLa resolución máxima del equipo es de 8.192 x 8.192 pixeles.\nEsta gran resolución, permite el muestreo correcto de la imagen según\nel criterio de Nyquist, incluso en los objetivos de menos aumentos,\nsiendo de esta forma posible obtener imágenes panorámicas en alta\nresolución, sin pérdida de información. Además cuenta con un sistema\nde refrigeración que disminuye radicalmente el ruido electrónico, y\naumenta la calidad de la imagen.\nLa velocidad de barrido es variable entre 1 y 1.800 Hz,\nalcanzando hasta 3.600 Hz en modo bidireccional, para una frecuencia\nmáxima de 7 fps (imágenes por segundo) a 512 x 512 y de 70 fps a\n512 x 16.\nAdemás, con este sistema de barrido, se pueden adquirir imágenes\nde series multidimensionales: área de la imagen, altura, tiempo,\nlongitud de onda e intensidad.\n3. Deteccion espectral basada en prisma\nEl sistema de detección espectral de este microscopio permite el\najuste independiente de cada detector para adaptarse a las\nEl análisis de la luz emitida por la muestra, se realiza mediante\nprisma, con una transmisión de luz superior al 97 % desde 400 hasta\n800 nm, independientemente del plano de polarización de la luz.\nLa luz que no es recogida en el primer canal, es reflejada hacia el\nsegundo y tercer canal, y desde estos al cuarto y quinto, en un diseño\nque elimina los dicroicos secundarios y filtros barrera, asegurando así\nla máxima transparencia.\nEl ancho de banda de detección, es ajustable independientemente\npara cada canal entre 5 y 400 nm, con un paso mínimo de 1 nm y una\nresolución espectral mínima de 2,5 nm, con un rango de trabajo\nlibremente ajustable entre 400 y 800 nm.\nEl equipo cuenta con tres detectores, dos de ellos son\nfotomultiplicadores (PMT) de alta sensibilidad y bajo ruido,\nutilizándose uno para fluorescencia y reflexión y el otro para luz\ntransmitida. El tercer detector es un detector hibrido de alta\nsensibilidad (HyD) para fluorescencia y reflexión.\nEl objetivo del fotodetector es convertir la luz en señales\neléctricas. Por lo tanto, es una parte crítica del proceso de grabación\nde la imagen. No solo debe recoger la luz de fluorescencia de la forma\nmás eficiente posible, sino que también, debe tener un gran rango\ndinámico, rápida respuesta y escaso ruido, para producir imágenes\nnítidas y cuantificables. Durante mucho tiempo los tubos\nfotomultiplicadores (PMT) y sus derivados, como los conjuntos\nmultiánodos, han sido la norma en fotodetectores confocales. Su gran\nrango dinámico y su nivel razonable de ruido contribuían a este éxito.\nSin embargo, los PMT tienen limitaciones para la cuantificación y\nobtención de imágenes de poca luz, por la sensibilidad limitada y la\nlenta respuesta de los impulsos. Debido a esto, para la obtención de\nimágenes con poca luz, se emplean los foto-diodos de avalancha\n(APD). Sin embargo, debido a su escaso rango dinámico y a los largos\nestados oscuros, las APD sólo se utilizan como detectores, para fines\nAhora bien, los fotodetectores híbridos, como el HyD de Leica,\ncombinan elementos de ambos: PMT y APD. En lugar de una larga\ncascada de dínodos, como en PMT (figura 10 izquierda) con\nposibilidad de pérdida de fotones y propagación de ruido, utilizan una\ngeometría simple con un paso de bombardeo de electrones (figura 10\nderecha), que produce una gran ganancia (10³) en un solo paso.\nFigura 10. Principio de trabajo de varios fotodetectores: fotomultiplicadores (izquierda) y\ndetectores híbridos (derecha).\nAmbos detectores utilizan el efecto fotoeléctrico en el fotocátodo\npara convertir la luz en electricidad. Sin embargo, la amplificación\nposterior difiere en gran medida. Los PMT utilizan una cascada de\ndínodos para crear ganancia, mientras que los HyD usan un proceso\nde dos pasos que incluye un paso de bombardeo de electrones y\nganancia en avalancha. Por lo tanto, los HyD producen imágenes con\nbuen contraste, buena relación de señal-ruido y tienen excelentes\npropiedades de recuento de fotones para la cuantificación.\nAl usarse un detector para cada canal, el ajuste de la ganancia y el\noffset, también es independiente para cada canal, permitiendo adaptar\nla detección a las características de cada una de las emisiones.\n4. Divisor de haz\nUno de los desafíos de la microscopía de fluorescencia, incluida\nen la microscopía confocal, es conseguir separar la luz de excitación\n(procedente de los láseres) y la luz fluorescente que emite la muestra\ntras haber sido excitada. La señal de fluorescencia, es mucho más\ndébil que la de excitación (alrededor de 10-5 veces más débil), esto\nhace, que para la detección de la luz fluorescente, sin contaminación\nde la luz de excitación, el divisor de rayos sea un componente\nfundamental, para contrastar la imagen en la dirección del rayo.\nLos divisores de rayos dicroicos o espejos dicroicos, actúan como\nun espejo semitransparente que selecciona la longitud de onda, es\ndecir, la luz azul se refleja, mientras que la verde pasa a través de\nellos. Esto significa que los espejos dicroicos, se seleccionan según el\ndesplazamiento de las barras de un marcador fluorescente.\nLas propiedades espectrales concretas de un divisor de rayos, se\ndeterminan mediante una capa fina de recubrimientos ópticos en un\nsustrato de cristal. Los divisores de rayos dicroicos son filtros de\ninterferencia. El recubrimiento es fijo, por lo tanto, para cada\ncombinación de marcador/láser se requiere un divisor de rayos\nespecífico. Para ello se suele colocar un conjunto de filtros en un\ndisco o deslizador móvil, para situarlo dentro y fuera de la trayectoria\ndel rayo según sea necesario.\nEl diseño tradicional utiliza un ángulo de 45° para el espejo\ndicroico, lo que facilita la separación geométrica de la luz de emisión\ny excitación, al ser sus rayos ortogonales. Sin embargo, este diseño no\nes igual de permisivo en distintos ángulos de la luz polarizada. Como\nconsecuencia, se pierde una parte de la luz fluorescente; lo que ocurre\nes que su plano de polarización tiene la orientación inadecuada. La\nexplicación es el denominado ángulo de Brewster. Que la luz se\ntransmita o refleje en una interfase de aire-cristal depende de su\nángulo de incidencia. Para las interfases de aire-cristal, el ángulo de\nBrewster es, de alrededor de 56°, demasiado cerca de los 45° que se\nutilizan normalmente para los espejos dicroicos. Cuando el ángulo de\nla luz incidente es mucho menor que 45°, este efecto se elimina.\nEn la actualidad existen dicroicos de luz de baja incidencia, que\nmejoran el contraste y la sensibilidad en comparación con los\nanteriores divisores de rayos.\nSin embago, dado que los espejos dicroicos son filtros, siempre\npierden cierta luz fluorescente, y además, el hecho de que estén\nconfinados a una cierta longitud de onda limita mucho la flexibilidad\ndel instrumento confocal. La pérdida de luz en los dicroicos ocurre no\nsólo por la transmisión inferior al 100 % sobre la longitud de onda de\ndivisión, sino sobre todo, por las características de los filtros cerca de\nesta longitud de onda. Normalmente los divisores de rayos dicroicos,\nsuprimen una banda alrededor de la longitud de onda del láser de unos\n20 nm de ancho. Como esta región espectral suele contener el máximo\nde emisión del espectro de un marcador, se perderá luz.\nEl TCS SP8 resuelve este problema mediante el divisor de rayos\nacústico-óptico (AOBS), que introduce una tecnología divisora de\nrayos que actúa simultáneamente como multiplexor para varias\nEl AOBS, es un cristal fabricado con óxido de telurio (TeO2),\nhomólogo del cuarzo, que actúa como deflector específico de la\nlongitud de onda. Para ello, se acopla una onda acústica del rango de\nlos kHz en el cristal, cambiando así sus propiedades de dispersión.\nEste principio se aplica hasta a ocho longitudes de onda a la vez,\nsuperponiendo varias frecuencias acústicas. El principio físico\nsubyacente, se basa en deformaciones de la red cristalina que incluye\nsus electrones. Interactúan con el campo eléctrico de la luz incidente\ny, por lo tanto, lo guían de forma distinta en función del\ndesplazamiento respectivo de los electrones.\nEn la práctica, especialmente en la imagen multiespectral, el corte\npronunciado del AOBS divide el rayo de forma más eficaz al permitir\ndetectar más luz. Además, al utilizar espejos dicroicos, ciertas\ncombinaciones de marcadores, no pueden grabarse simultáneamente.\nPor lo tanto, no existe dicha combinación de filtro que limite la\nflexibilidad experimental para combinar libremente cualquier\nmarcador fluorescente, permitiendo grabar en paralelo bandas de\nemisión muy estrechas.\nEl AOBS se reprograma para una longitud de onda distinta en\nmicrosegundos, y se divide simultáneamente hasta en 8 líneas de\nláser. Por lo tanto, la exploración secuencial en línea permite más\ngrabación multicanal pseudosimultánea además de las simultáneas.\n5. Lectura digital de la señal\nEl TCS SP8 realiza un muestreo digital de la señal acumulada en\nlos fotomultiplicadores, a una frecuencia constante de 40 MHz, es\ndecir, cada 25 ns, realizándose un promedio de las lecturas realizadas\nen cada pixel.\nAsí, si el tiempo de pixel es de 250 ns, la señal se promedia 10\nveces. Este sistema ofrece grandes ventajas:\nEliminación de tiempos muertos: durante todo el tiempo de\npixel se está adquiriendo señal.\nEl promedio intrínseco de la imagen reduce mucho el ruido,\npermitiendo obtener imágenes más limpias, usar ganancias\nmuy altas en los PMT y/o por lo tanto, reducir la potencia de\nláser utilizada, disminuyendo de este modo la fototoxicidad y\nel fotoblanqueado de la muestra.\nDigitalización de la señal a 8 ó 12 bits.\nLÁSERES DEL SISTEMA\nLa calidad, estabilidad y precisión en el control de la iluminación láser,\nes esencial para conseguir la máxima resolución de imagen, y\ncuantificaciones fiables en microscopía confocal.\nEl equipo cuenta con cuatro láseres en estado sólido, cuyas características\npueden verse en la tabla VI.\nTabla VI. Láseres del TCS SP8.\nMICROSCOPIO INVERTIDO AUTOMÁTICO DMI6000CS\nEl DMI6000CS es un micróscopio invertido de investigación\nmotorizado, para luz transmitida y fluorescencia en luz incidente. Los\ncomponentes automatizados, dotan al instrumento de mayor estabilidad,\nrepetitividad y ergonomía.\nLos objetivos del equipo, están montados en un único porta-objetivos\nmotorizado múltiple de 5 posiciones; éstos son intercambiables y pueden ser\nactualizados. Los objetivos que se adquirieron se presentan el la tabla VII:\nHC PL APO CS2\nTabla VII. Objetivos del microscopio.\nLas técnicas de contraste disponibles en el microscopio son:\n1. Iluminacion de fluorescencia:\nLa fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que\ncaracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en\nforma de radiación electromagnética, y luego, emitir parte de esa\nenergía en forma de radiación electromagnética de longitud de\nPara realizar la iluminación por fluorescencia, se cuenta con una\nlámpara (EL6000), de metal de haluro de 120W, montada\nexternamente al microscopio, al que se conecta por fibra óptica\n2. Campo claro:\nPermite inspeccionar una superficie, obtener imágenes de la\nmisma y seleccionar aquellas regiones de mayor interés.\nLa platina, es motorizada, y puede controlarse mediante un joystick, o\ndesde el propio software del equipo. Cuenta con un rango de movimiento de\n127 x 83mm, con un paso mínimo de 50 nm, una reproducibilidad de 0,75\nmicras y una precisión de +/- 3micras.\n5.2.3 Condiciones de instalación\nPara el buen funcionamiento de los equipos se requieren unas condiciones\nambientales y de espacio adecuadas. Estas condiciones se presentan en las tablas VIII y\nEntre un 20% y un 60% (sin condensación)\n2 (sistema de protección contra el polvo en\ncaso de ser necesario).\nEntre 18 y 25 ºC\nComportamiento óptico óptimo a\nTabla VIII.Condiciones ambientales de funcionamiento.\ntemperatura de entre 20 y 22 ºC, y humedad relativa entre el intervalo permitido. Además\nlas instalaciones de Repsol se encuentran en la ciudad madrileña de Móstoles, cuya\naltitud es aproximadamente de 660 metros.\nDimensiones del sistema (longitud x\nEspacio mínimo requerido (longitud x\nPeso del sistema básico\nCapacidad de carga estática mínima\nEspacio libre a la derecha, izquierda y\nEspacio libre en frente del equipo\n253 x 110 x 140 cm\n373 x 280 cm\nMáximo 330 kg\nAl menos 100 cm\nTabla IX. Dimensiones y espacio requerido.\nComo se expuso en el apartado 4.3 se realizaron varias modificaciones del\nlaboratorio de microscopia antes de la llegada de los equipos, dejándolo todo preparado\npara su recepción y evitar de esta forma problemas de polvo o vibraciones.\nEn la figura 11, se muestra un esquema de las dimensiones y espacio requerido para\nla instalación y posterior manejo del equipo.\nFigura 11. Dimensiones y espacio requerido por el microscopio.\nLas vibraciones se deben reducir al mínimo, por esa razón se aconseja que el sistema\nesté alejado de fuentes de vibración, tales como centrifugas, bombas, compresores,\nrefrigeradores, ascensores, etc. A continuación en la tabla X, se muestran las condiciones\nMenos de 30 µm/s\nMenos de 60 µm/s\nRango de frecuencia [5 Hz - 30 Hz]\nRango de frecuencia [>30 Hz]\nTabla X. Condiciones de vibración máximas aceptables.\nLos cuatro láseres del sistema son de clase 3B/IIIb, es decir, la visión directa del haz\nes peligrosa, pudiendo causar daños oculares agudos o crónicos, siendo la visión de\nreflexiones difusas normalmente seguras.\nLas especificaciones eléctricas se muestran en la tabla XI.\nEntre 100 V y 240 V ± 10 %\nDos circuitos eléctricos independientes (uno para el suministro\nde alimentación de la unidad compacta y otro para el suministro\nde dispositivos periféricos), con voltaje de fuente de\nalimentación entre 100 V y 120 V y fusible de protección de 20\nA o voltaje de fuente de alimentación entre 200 V y 240 V con\nfusible de protección de 12 - 16 A.\nTabla XI. Especificaciones eléctricas.\n5.2.4 Sofware LAS AF\nLeica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF), es una plataforma de\nsoftware, para la investigación de materiales que pueden presentar fluorescencia mediante\nun sistema confocal.\nLAS AF permite un control completo del hardware del microscopío, y a la vez,\nreduce la necesidad de interacción del usuario mediante la automatización inteligente, por\nejemplo, permite abrir y cerrar obturadores según el método de contraste seleccionado, o\ncambiar los prismas al cambiar objetivos. Todos los parámetros del sistema se pueden\naplicar a otros experimentos para optimizar la reproducibilidad.\nEl software cuenta con cuatro ventanas diferentes, la de configuración, la de\nadquisición, la de procesado y la de cuantificación, que podrán seleccionarse en la parte\nLa pantalla de configuración (figura 12), dispone de un menú que permite encender\ny apagar los láseres, configurar los componentes que influyen en la trayectoria del haz,\nconfigurar los elementos del sistema que intervienen en la adquisición, visualización o\nalmacenamiento de imágenes, acceder a la base de datos de espectros de excitación y\nemisión de distintos fluorocromos, etc.\nFigura 12. Pantalla de configuración del software LAS AF.\nLa pantalla de adquisición (figura 13), es la que aparece por defecto al encender el\nequipo, ya que es con la que se realizará la adquisición de la imagen.\nFigura 13. Pantalla de adquisición del software LAS AF.\nEn esta pantalla se dispone de varios desplegables en los que se irán mostrando las\ndiferentes opciones para adquirir la imagen que más convenga en cada caso, ya sea una\nvista de la planta de la muestra (plano xy), una sección transversal (plano xz), una imagen\nen función del tiempo (t), o la visualización de los espectros de emisión de las muestras\n(λ). También permite realizar la adquisición de series de imágenes, pudiendo de esta\nforma, reproducir una imagen en tres dimensiones.\nEn esta ventana también se muestra la trayectoria del haz de forma esquemática,\npermitiendo seleccionar y ajustar los láseres y los componentes del sistema a lo largo de\nesta trayectoria, así como los detectores (dos de fluorescencia y luz reflejada, y uno de luz\ntransmitida, en el caso del equipo adquirido por Repsol) para realizar la adquisición de la\nLa pantalla de procesado (figura 14), es a través de la que se pueden editar\nimágenes o series de imágenes adquiridas previamente.\nFigura 14. Pantalla de procesado de imágenes del software LAS AF.\nLa pantalla de cuantificación (figura 15), permite realizar evaluaciones\ncuantitativas de las imágenes o series de imágenes adquiridas.\nFigura 15. Pantalla de cuantificación del software LAS AF.\nAplicaciones desarrolladas en la\nDirección de Tecnología de Repsol\nLas aplicaciones de la microscopía confocal son muy diversas, abarcando\nimportantes ramas de la ciencia, como ya se citó en el Capítulo 2 (Introducción).\nDentro del Centro Tecnológico de Repsol, existen diferentes áreas, con necesidades\nmuy diferentes, para las que esta técnica puede ser de mucha ayuda. A continuación se\npresentan algunas de estas áreas, con las respectivas necesidades que se pueden cubrir\ngracias a los nuevos equipos.\nLaboratorio de Motores y Lubricantes:\no observación y medida de huellas de desgaste en cojinetes u otros\nelementos sometidos a fricción;\no observación y medida de piezas de motor (camisas, pistones,\nsegmentos, etc.), incluso con geometrías y tamaños que dificulten el\nacceso a las zonas de interés;\no medida de perfiles de superficies y piezas en general (perfilometría);\no estudio de comportamiento de inyectores; oclusión de orificios,\nalteración de agujas, etc.\no medidas cuantitativas de dureza: determinación de volumen de\nrebabas, acuñaciones (“identaciones”), etc.;\no interacción de lubricantes con las superficies: interfases;\no dispersión de micelas u otros componentes en lubricantes;\no estudio de procesos de corrosión.\nEspecialidades y Asfaltos:\no diseño de tintas: seguimiento del tiempo de secado, impregnación del\no barnices, adhesivos, etc.: interacciones e interfases;\no medición de la capacidad de mojado y humectabilidad de líquidos.\no Estudio de emulsiones acuosas o en otros medios: medida “in situ” de\nmicelas, grado de dispersión, etc.\no medida de porosidades de áridos u otros sustratos.\no observación y cuantificación de la interacción de betunes y áridos u\nCombustibles y Refino:\no procesos de corrosión;\no formación de emulsiones o precipitación/cristalización de parafinas,\nFAME, asfaltenos, etc. “in situ” (sin eliminación de la matriz);\no observación de bacterias, algas u otros seres vivos “in vivo”.\no medida de poros en catalizadores.\no medición de multicapas, inclusiones, inhomogeneidades, etc. sin\no observación y medición de test de arañazos y otros efectos estéticos;\no materiales autorreparables: medición de entallas, impactos, vesículas\nde reparador, etc.\no interacciones e interfases en materiales compuestos (films de\npolímero sobre papel, metal, etc.; materiales reforzados…) sin corte.\no acabado (“finishing”) de superficies, polímeros adhesivos.\no interacciones roca-fluido: observación de interfases,\no observación y medición de porosidad de rocas;\no observación y medición de inclusiones fluidas o sólidas.\nEn los siguientes apartados, se hará especial mención a las aplicaciones más\nutilizadas en cada uno de los equipos, describiendo algunos de los ensayos realizados con\n6.2 Aplicaciones del Sistema de microscopía\nconfocal para materiales Leica DCM 3D\n6.2.1 Medición de huellas de ensayo HFRR en\nLa lubricidad es la capacidad de reducción de desgaste que puede proporcionar un\nlubricante. Puede medirse, entre otros métodos, por la huella producida en un rodamiento\n(bola) oscilante en contacto con una placa fija, sumergidas ambas en un fluido.\nEl objeto del ensayo HFRR (High Frequency Reciprocating Rig) es evaluar las\npropiedades lubricantes de los combustibles diésel y de diversos aceites, incluidos\naquellos que contienen aditivos mejoradores de lubricidad, con el objetivo de estimar la\ncapacidad del combustible o aceite, de minimizar el desgaste de los equipos de inyección,\nusados en automóviles y aplicaciones similares.\nEl procedimiento se realiza en un recipiente que se mantiene a una temperatura\nprescrita. Una bola de acero se sujeta en firme en un porta-bolas dispuesto en vertical y,\naplicando una carga, presiona sobre una placa fija de acero colocada en horizontal. La\nbola de ensayo se hace oscilar con una frecuencia y longitud de carrera determinadas,\nmanteniendo la superficie de contacto con la placa totalmente sumergida en el fluido. Se\nespecifican las características de la bola y de la placa, temperatura, carga aplicada,\nfrecuencia y longitud de carrera. Las condiciones ambientales de temperatura y humedad\ndurante el ensayo sirven para corregir a condiciones ambientales estándar el tamaño de la\nhuella de desgaste, producida en la bola de ensayo. El diámetro corregido de la huella de\ndesgaste es una medida de la lubricidad del fluido (ISO 12156-1).\nA continuación, en la figura 16 se muestra un esquema del sistema descrito, y en la\ntabla XII y figura 17, las condiciones en que debe realizarse el ensayo y las condiciones\ndel aire en la habitación respectivamente.\nFigura 16. Ejemplo de dispositivo con movimiento alternativo de alta frecuencia. 1Recipiente del fluido, 2-Bola de ensayo, 3-Masa de ensayo, 4-Placa de ensayo, 5-Baño de\ncalentamiento, 6-Movimiento alternativo.\nParámetro Volumen del fluido, ml Longitud de carrera, mm Frecuencia, Hz Temperatura del fluido, ºC Valor 1 ± 0,02 Masa de ensayo (masa total, incluyendo\nlos elementos de fijación), g 200 ± 1 Duración del ensayo, min 75 ± 0,1 2 ± 0,2 50 ± 1 60 ± 2 Área de la superficie del recipiente,mm 600 ± 100 Aire en el laboratorio Véase la figura 17 2\nTabla XII. Condiciones del ensayo.\nX--Temperatura del aire, ºC\nY-- Humedad relativa, %\n1--Intervalo de condiciones\ninaceptables (demasiado seco)\n2--Intervalo de condiciones\n3--Intervalo de condiciones\nFigura 17. Condiciones del aire en el laboratorio.\nEl aspecto de la huella de desgaste del rodamiento, puede variar con el tipo de\ncombustible, especialmente si contiene aditivos mejoradores de la lubricidad.\nNormalmente, la huella de desgaste aparece como una serie de rasguños en la dirección\ndel movimiento de la bola (considerado eje x).\nEn algunos casos, por ejemplo, cuando se ensayan fluidos de referencia de baja\nlubricidad, la separación entre la huella y la zona descolorida (pero no rozada) es clara, y\nes fácil medir el tamaño de la huella. En otros casos, la parte central arañada de la bola\nestá rodeada por una zona menos nítida, y no existe un límite definido entre las zonas\nrozada y no rozada de la bola. En estos casos, puede resultar más difícil distinguir o\nmedir la verdadera forma de la huella (ISO 12156-1). En la figura 18, se muestran las\nzonas de una huella de desgaste.\nFigura 18. Ejemplo de una huella de desgaste con un contorno borroso. 1-Bola de ensayo\n(no está escalada), 2-Zona no rozada, 3-Zona rozada menos nítida, 4-Zona rozada.\nHasta ahora, tras la realización del ensayo, sólo se medía el diámetro de la huella en\nlas direcciones X e Y. Con el DCM 3D, además de estos datos, se pueden obtener\nmedidas de área y volumen, y así calcular la cantidad de materia perdida.\nAdemás, el equipo es capaz de realizar una imagen 3D, gracias a lo cual se puede\nintuir visualmente cómo se ha ido produciendo la huella, y la relación entre la huella que\naparece en el rodamiento y la que aparece en el disco sobre el que roza.\nEl primer paso en el procedimiento seguido para el análisis de las huellas de\nrodamientos y de sus respectivos discos, es la limpieza de sus superficies mediante\nheptano, para garantizar que no contienen ningún resto de lubricante que pueda\ndistorsionar la medida.\nUna vez limpias, se colocan las piezas en la platina del microscopio, que se\ndesplazará en las direcciones X e Y para elegir la zona de la pieza en la que se desea\nrealizar la medida.\nTras tener la pieza colocada, se procederá a la elección del objetivo, que dependerá\nde varios factores. En principio, cuanto mayor sea la apertura númerica de éste, mejor\nserá la resolución de la imagen obtenida, sin embargo, la apertura numérica crece según\nva creciendo el aumento del objetivo y por tanto, reduciéndose el campo visual. Dado que\npara realizar las medidas es necesario obtener la imagen de la huella completa, si se\neligiera un objetivo de gran aumento, para visualizar la pieza en detalle, sería necesario\nrealizar un cosido de imágenes o “stitching”, que permitiera visualizar la huella completa,\nsuponiniendo este método un mayor tiempo de adquisición de la imagen. Por tanto, será\nnecesario llegar a un compromiso, dependiendo de las necesidades.\nLa observación adquirida debe ser topográfica, para que el programa pueda realizar\nuna reconstrucción en tres dimensiones, en la que posteriormente poder tomar medidas.\nComo ya se definió en el capitulo 5 (apartado 5.1.2), el sistema de iluminación del\nequipo cuenta con dos leds, uno azul y otro blanco, que se elegirán dependiendo de las\nnecesidades. El led azul tiene una longitud de onda (λ) menor que el led blanco, por lo\nque proporcionará mayor resolución, ya que según el criterio de Rayleigh, el límite de\nresolución será del orden de la longitud de onda utilizada en el proceso. La ecuación 1\nmuestra el valor del límite de resolución, siendo λ la longitud de onda y AN la apertura\nnumérica del objetivo.\n𝛆 = 𝟎, 𝟔𝟏\nSin embargo, a veces es necesario sacrificar algo de resolución para poder ver los\ncolores reales de las superficies, ya que estos solo se pueden observar con el led blanco.\nLa iluminación, también debe ser la adecuada. La imagen puede considerarse\ncorrecta cuando el número de puntos medidos sea superior al 80% (normalmente el\nsistema es incapaz de leer todos los puntos, debido a inclinaciones o falta de luz, por lo\nque se han de reconstruir por interpolación, de la forma más aproximada posible). Si\niluminamos demasiado la muestra, el microscopio será capaz de recoger más puntos de\nlectura, por lo que las medidas que después se realicen serán más fiables, ya que habrá\nmenos puntos que hayan tenido que ser interpolados por el programa, sin embargo, la\nfotografía se verá muy saturada (quemada).\nUna vez tomada la fotografía, ésta será transferida al software Leica Map para\nproceder a su análisis, en el que se deben seguir los siguientes pasos:\nSe debe extraer siempre la capa topográfica (figura 19, derecha), ya que es\ncon la que se trabajará posteriormente para extraer los datos. En el caso en el\nque se desee ver la superficie en color real, además de la capa topográfica se\nextraerá la capa de la imagen (figura 19, izquierda).\nFigura 19. Imagen de la capa topográfica nivelada (izquierda) y de la capa de la imagen\nNormalmente para obtener una imagen en tres dimensiones con escala de\nalturas habrá que realizar una rectificación de la forma de la pieza, es decir,\nEn el caso en el que la pieza presente una forma determinada, como es el caso\ndel rodamiento (forma esférica), es preciso proceder a la eliminación de la\nmisma, mediante un algoritmo matemático adecuado. De esta manera, se\nobtiene una imagen tridimensional correctamente preparada para realizar\nmediciones. Como se puede observar en la figura 20 (derecha), es fácil\napreciar la oquedad (huella) generado por el experimento.\ntopográfica con supresión de forma (derecha).\nA partir de esta última imagen se pueden obtener perfiles, con sus respectivas\nmedidas, tal y como se muestra en las figuras 21 y 22:\nFigura 21. Medidas de alturas en el perfil del diámetro menor de la huella del rodamiento.\nLos datos de alturas están referidos a la línea media (línea roja). En el perfil de la\nfigura 21, se aprecia que el material, debido al proceso de fricción, se ha desplazado a los\nbordes de la huella. Además, si se observa la fotografía de la huella (figura 19 derecha),\nse aprecia un rayado en la misma dirección en la que se ha medido este perfil, de lo que\nse puede deducir, que el movimiento de la bola sigue esta dirección en el ensayo.\nFigura 22. Medidas de áreas en el perfil del diámetro menor de la huella del rodamiento\nSe calcula el volumen de la huella, que se realiza perfil a perfil, considerando la\nsuperficie como una yuxtaposición de perfiles paralelos. Para cada perfil, se\nconsidera el área entre, por un lado, el fondo del hueco (huella) y, por otro, la\nrecta entre los puntos de intersección del perfil y el contorno alrededor de la\nhuella, dibujado manualmente con el ratón. La distancia a la que se dibuje este\ncontorno manual, siempre que se trace por el exterior del borde de la huella, no\nserá relevante para el cálculo del volumen, ya que tras haber realizado una\nrectificación y una supresión de forma de la pieza, todos los puntos exteriores a la\noquedad tienen aproximadamente la misma cota y por tanto las superficies del\ncontorno real y del contorno dibujado manualmente serán coincidentes. En la\nfigura 23, se muestra la medida del volumen de la huerra de un rodamiento. Figura 23. Volumen de la huella.\nHasta ahora, con los procedimientos que se venían realizando, se podía llegar a\ninferir que la longitud de la huella del rodamiento, no aumentaba progresivamente a\nmedida que se aumentaba el tiempo del ensayo, sino que llegaba un punto en el que más\no menos se mantenía constante, debido a que el rozamiento, cuando los componentes del\nensayo están nuevos es mayor que tras haberse producido la huella. Esto es debido a que,\na pesar de tratarse de superficies pulidas, presentan una rugosidad, que irá disminuyendo\ncon el rozamiento y facilitando de esta forma la fricción.\nTras realizar varios ensayos de rodamientos y discos que nos proporcionaron del área\nde lubricantes, se observó que los datos obtenidos de los análisis, podían proporcionar\nnueva información de interés, hasta entonces no conocida. A continuación se presentan\n1. La profundidad de la huella del disco es siempre mayor que la que se produce en\nel rodamiento, de lo que se deduce que el material del que está fabricado el\nrodamiento será más duro.\n2. Se observa que el proceso de fricción produce un desplazamiento de material,\ncreando una especie de montículos, rebabas, alrededor de la huella (apreciables en\nlos perfiles de ésta).\n3. Se aprecia una relación entre las huellas del rodamiento y del disco, coincidiendo\nlas medidas de la huella del rodamiento en su eje mayor, y la del disco en su eje\n4. Se puede conocer la cantidad de material desplazado por el rozamiento, ya que el\nprograma facilita datos de profundidades, áreas y volúmenes.\n5. Se puede observar la imagen de la superficie en color real, distinguiendo así, las\ndiferentes zonas (en la que se produce el rozamiento y la que ha sido afectada sólo\n6. Se puede extraer una imagen en tres dimensiones facilitándose, de esta forma, la\ncomprensión de la superficie.\n6.2.2 Medición de huellas de cojinetes de biela debidas\nal efecto de la cavitación\nLos cojinetes de biela, son casquillos alojados en la cabeza de la biela, sobre los que\nse soporta y gira la muñequilla del cigüeñal. Se utilizan para permitir la transmisión de\ncarga y par, además de reducir la fricción e inhibir el desgaste entre dos piezas que tienen\nmovimiento relativo entre sí. En los motores de combustión interna, su uso contribuye, de\nmanera substancial, a la mejora de la eficiencia, ya que se obtienen beneficios tales como,\nun mejor aprovechamiento de combustible, menor consumo de aceite, reducción de\nemisiones contaminantes y disminución en gastos de mantenimiento.\nA continuación, en la figura 24, se muestra la imagen de una biela con sus\ncomponentes principales, distinguiéndose entre ellos los cojinetes.\nFigura 24. Componentes de una biela.\n(Descripción del motor y su funcionamiento)\nEntre el eje y el cojinete se tiene una delgada película lubricante, la cual impide el\ncontacto entre metales, limitando la fricción. Dicha película también funciona como\nrefrigerante, al contribuir en la transferencia de calor, y como amortiguador, ya que\nabsorbe los impactos causados por vibraciones y cargas variables, las cuales son típicas\nen motores de combustión interna.\nEl laboratorio de motores quiere conocer qué diferencia existe en el desgaste de la\nsuperficie de estos cojintes debido al efecto de la cavitación, en función de lo que varía la\nholgura de paso de lubricante con el bulón.\nLa cavitación fue explicada por primera vez por Lord Rayleigh en 1917, y puede\ndefinirse como un efecto hidrodinámico que se produce cuando durante el flujo de un\nfluido existan caídas de presión que puedan alcanzar valores del orden de la presión de\nvapor del líquido en la temperatura de trabajo, provocándose de esta forma, la nucleación\nde pequeñas burbujas de vapor.\nEstas burbujas son llevadas por el flujo y al alcanzar regiones de mayores presiones\nsufren un colapso violento y caótico que genera altas presiones y velocidades en las\nregiones próximas al colapso. Estas altas presiones y velocidades que surgen del colapso,\nprovocan el desgaste de superficies sólidas próximas. Es decir, el desgaste por cavitación\nse puede definir como aquel daño que ocurre en los materiales debido al crecimiento y\ncolapso de pequeñas burbujas que surgen debido a las variaciones de presión durante el\nflujo de un fluido.\nEl colapso se da de manera tan rápida que parte del vapor presente en la burbuja no\ntiene tiempo suficiente de condensarse. Así, el vapor (y también cualquier gas disuelto)\nserá comprimido a una alta presión que, eventualmente, será suficientemente alta para\ninterrumpir el colapso y hacer que la burbuja crezca nuevamente de forma explosiva,\nemitiendo ondas de presión o de choque, conforme se esquematiza en la figura 25.\nFigura 25. Representación esquemática del fenómeno de nucleación y colapso de microburbujas y la emisión de ondas de choque.\n(Desgaste de materiales)\nLas ondas de presión emitidas durante el crecimiento explosivo de las burbujas son\nlas responsables del daño del material. Estas ondas de choque, que generan elevadísimas\npresiones, son capaces de alcanzar valores del orden de GPa, y actúan en un intervalo de\ntiempo muy corto, sometiendo al material a una tasa de deformación muy alta.\nCon la continuación del colapso, hay una aceleración de la burbuja y por\nconsiguiente la formación de un micro-chorro, siendo este otro mecanismo de daño\nposible además de las ondas de presión.\nEn la figura 26, se muestran los cojinetes correspondientes a holguras desde 29 µm\nhasta 59 µm, apreciándose claramente las diferencias de las huellas que aparecen en ellas.\nHuella de media\n(se junta con la\nde media luna)\nFigura 26. Fotografía de las diferentes huellas producidas en los cojinetes, en función de la\nSe realizan medidas a todas las huellas de los cojinetes, para lo cual, en primer lugar,\nse procede a la limpieza de las superficies, con heptano, para eliminar posibles restos de\naceite y garantizar de esta forma una medida correcta.\nUna vez limpios, los cojinetes se colocan en el sombrerete de una cabeza de biela,\nque a su vez, se sujeta mediante un banco de trabajo, asegurando así que no exista ningún\ntipo de movimiento o vibración que pueda desvirtuar la medida. El banco de trabajo se\ncoloca sobre la platina del microscopio, la cuál será desplazada en las direcciones X e Y\nhasta encontrar la zona de la pieza en la que se va a realizar la medida.\nEn el caso de los cojites, a diferencia de los rodamientos descritos anteriormente, las\nhuellas que presentan son grandes, y por tanto, no es posible recoger una imagen en la\nque aparezca toda la huella, ni siquiera utilizando el objetivo de menor aumento de que se\nPara recoger completamento el agujero o huella de desgaste, es necesario realizar un\ncosido de imágenes o “stitching”, seleccionando en el microscopio la opción de medida\ntopográfica extendida e introduciendo las dimensiones que se desean medir en la opción\nde enlazado, y realizando un barrido por la muestra para recoger diferentes planos\nverticales y poder reconstruir después la imagen en 3D.\nLa elección del objetivo es una tarea complicada, ya que los cojinetes presentan una\nforma semicilíndrica, haciendo muy dificil realizar medidas con objetivos superiores a 10\naumentos de corta distancia de trabajo. El problema que se presenta, es que la forma de la\npieza imposibilita el movimiento del objetivo para realizar la medida de forma correcta,\nya que éste puede chocar con la pared curvada del cojinte.\nExisten varias formas de subsanar este problema. La primera y más simple es utilizar\nobjetivos de pequeña magnificación (5x, 10x), cuya distancia de trabajo sea lo suficiente\npara que el objetivo pueda moverse por la pieza para realizar la medida, sin que choque\ncon los laterales de la ésta. Sin embargo, como ya se explicó en el caso de los\nrodamientos, cuanto menor es la magnificación, también menor será la apertura numérica\ny por tanto la resolución del objetivo.\nOtra opción es utilizar objetivos de mayor magnificación, pero de larga distancia de\ntrabajo (50x de larga distancia de trabajo). El problema que se presenta en este caso, es el\ntiempo que tarda en recoger la imagen, que aumentará bastante con respecto a los\nobjetivos de menor aumento, ya que el campo recogido en cada barrido es mucho menor.\nLos objetivos de larga distancia de trabajo, contienen lentes modificadas para poder\ntrabajar a bastante distancia de la muestra con aumentos elevados, sin embargo, al\nrealizar la modificación de la lente se pierde apertura numérica, y por tanto, este tipo de\nlente siempre tendrá peor resolución que su homóloga de corta distancia de trabajo.\nNormalmente, al trabajar con este tipo de lentes conviene saturar ligeramente la imagen,\npara que el número de puntos leidos por el microscopio sea mayor.\nEl objetivo (de los que se tienen disponibles en el CTR) que se adapta mejor para\nesta aplicación, es el de 20x (AN=0,5), con el que se obtiene una resolución aceptable, y\nlos aumentos no son excesivamente altos, por lo que no tardará demasiado en recoger la\nimagen, sin embargo, la distancia de trabajo de este objetivo es tan solo de 1,27 mm, por\nlo que en algunos casos será imposible utilizarlo.\nEn el caso de esta pieza, lo más importante son las medidas que se realizarán en el\nsoftware de análisis tras haber recogido la imagen, por lo que en este caso, puede ser\nbueno saturar la imagen, obteniendo una fotografía un poco “quemada”, pero también\nmayor número de puntos medidos, de esta forma, el programa tendrá que realizar menos\ninterpolaciones matemáticas y la medida será más exacta.\nEn los casos en los que no sea necesario visualizar la superficie de la pieza en color\nreal, será mejor utilizar el led azul, ya que su longitud de onda es menor que la del blanco\ny por tanto, se obtendrá mejor resolución.\nproceder a su análisis. De igual forma que en el caso de los rodamientos, se extraerá la\ncapa topográfica (figura 27, izquierda), ya que es sobre la que se trabajará para extraer los\ndatos. También se puede obtener la capa de la imagen (figura 27, derecha), para\nvisualizar una fotografía de la superficie en color real (sólo en los casos en los que en la\ncaptura de la imagen se haya realizado con el led blanco).\nFigura 27. Imagen de la capa topográfica nivelada (izquierda) y de la capa de la imagen\n(derecha), realizadas ambas con un objetivo de 20x.\nPara que la escala de alturas sea correcta, será necesario realizar una rectificación de\nla imagen, para nivelarla.\nDebido a los problemas, que se han descrito anteriormente, en la elección del\nobjetivo, en muchos casos, la imagen que recoja el software de captura (LeicaSCAN),\ntendrá bastantes puntos negros, o puntos donde el microscopio no es capaz de realizar una\nlectura (ya sea por la iluminación, por la existencia de pendientes…). Debido a esto, será\nnecesario completar estos puntos mediante aproximaciones matemáticas para obtener una\nimagen completa (sin huecos).\nLa pieza presenta forma de casquete semi-cilindrico, por lo que habrá que suprimir\nesta forma con un algoritmo matemático, para poder obtener así, una imagen\ntridimensional adecuada para realizar mediciones, (figura 28, derecha).\nFigura 28. Imagen topográfica con escala de alturas en pseudocolor (izquierda). Imagen\ntopográfica con supresión de forma (derecha). Realizadas ambas con un objetivo de 20x\nA partir de esta última imagen, se pueden obtener perfiles, con sus respectivas\nmedidas. En la figura 29, se muestran las medidas de profundidad, altura media y máxima\nde la huella, y en la figura 30, el área del agujero.\nFigura 29. Medidas de alturas en un perfil de la huella del cojinete.\nFigura 30. Medidas de áreas en un perfil de la huella del cojinete.\nEl volumen de la huella, se calcula de la misma manera que en el caso de los\nrodamientos, perfil a perfil, considerando la superficie como una yuxtaposición de\nperfiles paralelos. Para cada perfil, se considera el área entre, por un lado, el fondo del\nhueco y, por otro, la recta entre los puntos de intersección del perfil y el contorno\ndibujado manualmente con el ratón. En la figura 31, se muestra esta medida.\nFigura 31. Volumen de una de la huellas del cojinete realizada con un objetivo de 20x.\nEn las imágenes anteriores, no aparece la huella completa, debido a que la geometría\nde la pieza dificulta la captura, debido a la falta de espacio para desplazar el objetivo. A\ncontinuación, en la figura 32, se muestra la medida de volumen de una huella lateral\nrecogida con el objetivo de 10x, con el cual, es más fácil y rápido conseguir medidas de\nsuperficies mayores, aunque se sacrifica resolución.\nFigura 32. Imagen de la huella completa de un cojinte, realizada con un objetivo de 10x, en\nla que se mide el volumen de una de las huellas laterales.\nHasta ahora, la forma de conocer la cantidad de material desprendido en función de\nlas diferentes holguras de paso de aceite en los cojinetes, era haciendo estudios de la\nmasa que éstos perdían. De esta forma, sabían que para holguras menores, la masa\nperdida por los cojinetes era menor, por lo que deducían que las huellas eran menores.\nTras realizar los análisis con el nuevo microscopio confocal, se observó, que los\ndatos obtenidos de los análisis, podían proporcionar nueva información de interés, hasta\nentonces no conocida. A continuación se presentan las nuevas deducciones:\n1. Es posible observar perfiles, gracias a los cuales se puede conocer la profundidad\nmedia de cada una de las huellas. Gracias a este dato, se pudo observar que a\nmedida que se aumentaba la holgura de paso de aceite, las huellas eran más grandes,\npero no más profundas. La profundidad de las huellas no dependía de la holgura,\nsino que, en todos los casos, tenía valores similares, pudiendo llegar así a la\nconclusión de que se desprendía únicamente la capa superficial de los cojinetes.\n2. En algunas de las fotografías en color real realizadas a las huellas era posible\ndistinguir la orientación o patrón de la textura de la superficie, la cual, está\ndeterminada por el método de manufactura utilizado para crear la superficie. De\nesta forma, se corrobora la hipótesis anterior de que los cojinetes poseen un\nrecubriento, que es el que se pierde debido al efecto de la cavitación.\n3. La forma de la huella que aparece en el cojinete depende de la holgura. Cuando ésta\nes pequeña se aprecia más perdida de material en los extremos, mientras que cuando\nes grande la zona más dañada es la llamada “huella satélite”.\n4. Se puede conocer la cantidad de material perdido, ya que el programa facilita datos\nde profundidades, áreas y volúmenes.\n5. Se puede extraer una imagen en tres dimensiones facilitándose, de esta forma, la\n6.2.3 Medición de distancia entre capas en\nLos films y láminas multicapa, también denominados complejos, incluyen aquellos\nmateriales flexibles que se han obtenido por la combinación de dos o más películas de\nmateriales simples. Dichas estructuras multicapa pueden obtenerse por distintos procesos;\ncuando la estructura se compone sólo por materiales termoplásticos se utiliza una técnica\nde coextrusión de los distintos materiales polímericos. Otro proceso de obtención de films\ncomplejos multicapa, consiste en tecnología de laminación por adhesivos para combinar\nsustratos de diferente naturaleza, como por ejemplo films termoplásticos con papel o\nlámina de aluminio. (Sanz)\nEl diseño base de un film multicapa consiste en una estructura, generalmente\nsimétrica, formada por una capa externa de material que aporta propiedades estructurales\n(poliamidas, poliésteres), una capa central de material que constituye la capa barrera\n(etilen-vinil-alcohol, cloruro de polivinilideno), y una capa interna de material con buena\nsensibilidad (polietileno, ionómeros).\nEl caso de estudio, fue un polímero tricapa (polietileno-adhesivo sensible a la\npresión- polietileno) y otro bicapa (polietileno-poliamida), en los que se intentó medir el\nespesor de las diferentes capas, aprovechando las diferencias en el índice de refracción.\nLos picos que aparecen en el perfil de las figuras 33 y 34, muestran donde se produce\nun cambio en el índice de refracción, siendo el primero entre el aire y la muestra, el\nsegundo representa la interfase entre los dos polímeros, siendo por esto un pico más débil\nya que los índices de refracción de los polímeros son más similares, y el tercero\nrepresentaría el cambio de índice entre la última capa de polímero y el papel sobre el que\nestá apoyado para realizar la medida.\nFigura 33. Perfil del espesor de un polímero bicapa (PE-PA).\nFigura 34. Perfil del espesor de las capas en un polímero bicapa (PE-PA).\nComo se puede observar, se diferencian con claridad tres picos, siendo la distancia\nentre el primero y el tercero de aproximadamente 184 µm, (espesor total del film), y entre\nla primera y la segunda 56 µm (grosor de la primera capa). Siendo, por tanto, el espesor\nde la segunda capa aproximadamente de 128 µm.\nGracias a este estudio, se puede saber el número de capas y el espesor que existe\nentre ellas en un material lo suficientemente transparente como para que el equipo sea\ncapaz de penetrar a través de estas capas. La mayor ventaja, es que para conocer este tipo\nde datos, no es necesario modificar la muestra, por lo que los datos obtenidos serán muy\nfiables. El problema que se presenta es que el DCM 3D, sólo es capaz de diferenciar entre\ndos o tres capas, si el polímero tuviera más capas, sería necesario utilizar el SP8.\n6.2.4 Otras aplicaciones con el DCM 3D\nINYECTORES DE DIESEL\nEl inyector es parte del sistema de inyección de combustible, cuya función es\nintroducir una determinada cantidad de combustible, en forma pulverizada, en la cámara\nde combustión, distribuyéndolo lo más homogéneamente posible dentro del aire\ncontenido en la cámara. En la figura 35 se muestra una fotografía de inyectores diesel.\nFigura 35. Imagen de inyectores diesel\nEn muchos casos, los gasóleos presentan suciedad o residuos, por lo que los\ninyectores pueden ir acumulando suciedad, llegando incluso a producir la obstrucción de\nlos orificios de inyección. Esta obstrucción también puede producirse por inquemados.\nCon el DCM 3D es posible visualizar la superficie del inyector en tres dimensiones,\nen la que se pueden apreciar claramente los orificios de inyección, proporcionando una\nestimación del estado de los mismos. En la figura 36, se muestra una imagen en\npseudocolor de la cabeza de un inyector de diésel.\nFigura 36. Superficie de la cabeza de un inyector de diesel en pseudocolor (izquierda) y con\nsupresión de forma (derecha).\nAdemás se puede realizar un estudio, para cuantificar la profundidad de los orificios,\no su volumen, pudiendo realizar una comparativa entre un inyector nuevo y otro usado,\npara conocer el grado de obstrucción que se produce en éste al ser usado en determinadas\ncondiciones. En las figuras 37, 38 y 39, se se puede observar el perfil de algunos de estos\norificios, obteniendo su profundidad, su área y su volumen.\nFigura 37. Altura máxima y media de un orificio de un inyector diesel usado\nFigura 38. Área de un orificio de un inyector diesel usado.\nFigura 39. Volumen de un orificio de un inyector diesel usado.\nJUNTAS DE PIEZAS MECÁNICAS\nUna junta mecánica o de estanqueidad es un material adaptable que se utiliza para\nsellar adecuadamente la unión de las caras mecanizadas, y en general cualquier elemento\nhidráulico y/o neumático o en la conducción de cualquier otro fluido o sólido. En la\nfigura 40 se muestra una fotográfia de una junta de teflón y carbono.\nFigura 40. Junta de teflón y carbono (tipo gráfito y fibra de carbono)\nEn este caso, se realiza un estudio de una junta cuyos componentes son teflón y\ncarbono (tipo grafito y fibra de carbono). Se pretende realizar un estudio comparativo\nentre una junta nueva y otra usada, para ver si es posible explicar el motivo de la ruptura\nde éstas. A continuación, en las figuras 41 y 42, se muestran las superfies de las juntas\nnuevas y tras haber sido usadas. En la usada, se distingue claramente una de las fibras de\ngrafito y la grieta que presenta el material bajo esta.\nFigura 41. Superficie de la junta sin usar\nFigura 42. Superficie de la junta usada\nCon este estudio se pudo concluir, que la rotura del material se debía a las fibras,\npudiendo ser por un tamaño inadecuado de las mismas o por una mala inserción de éstas\nen el material base (teflón), provocando de esta forma grietas que llevan a la rotura del\n6.3 Aplicaciones del Sistema de microscopía\nconfocal espectral TCS-SP8 con microscopio\n6.3.1 Inclusiones Fluidas\nEl crecimiento de cristales a partir de un fluido hidrotermal puede llegar a atrapar\ngases o líquidos dentro de imperfecciones de la estructura cristalina, al formarse\ncavidades que se cierran y quedan selladas a medida que el cristal sigue creciendo.\nConsecuentemente, las inclusiones fluidas ocupan cavidades microscópicas que quedan\ndentro de minerales depositados a partir de una solución hidrotermal, pudiendo contener\ndistintas fases, líquidos, sólidos y/o gases.\nDe las inclusiones fluidas se puede obtener información como la temperatura y\npresión a la cual se formó el mineral que las contiene, así como el tipo y la densidad del\nfluido del cual están formadas.\nHasta ahora, la forma de estudiarlas era realizando secciones finas pulidas por ambos\nlados, para poder observarlas después en un microscopio óptico. Las fotografías que se\npodían obsevar eran similares a la que se presenta en la figura 43.\nFigura 43. Inclusión fluida observada con un microscopio óptico convencional.\nCon el nuevo equipo, se puede obsevar de forma única la inclusión que se quiera\nanalizar, mostrando ésta en tres dimensiones y pudiendo así cuantificar su volumen\n(volumen de líquido frente a volumen de gas). La parte interior de la inclusión, que puede\napreciarse en las fotografías 43 y 44, se corresponde con el gas ocluido, siendo la otra\nparte un compuesto orgánico (que presenta fluorescencia).\nFigura 44. Inclusión fluida en tres dimensiones\nLas inclusiones, son metaestables, es decir, pueden moverse a lo largo del tiempo,\npor lo que puede ser necesario sacrificar resolución para que el barrido en el eje Z sea lo\nmás rápido posible y evitar que puedan producirse variaciones en la inclusión.\n6.3.2 Polímeros multicapa\nHasta ahora, para conocer el número de capas y la distancia entre ellas en un film\nmulticapa el método más habitual era cortar el material transversalmente, tras haber sido\nembutido previamente entre dos láminas de algún polímero rígido que facilite su\nmanipulación, y observar dicho corte por microscopía óptica, empleando diferentes\ntécnicas de contraste (por ejemplo, polarización), de forma que llegue a ser posible\ndistinguir entre cada una de las capas componentes e incluso medir sus grosores.\nLos polímeros multicapa estudiados, no presentaban fluorescencia, por lo que los\nestudios se realizan con luz reflejada y basándose en las variaciones de índice de\nUna de las ventajas, ya comentada anteriormente, de este equipo, es que no precisa\nningún tipo de manipulación de la muestra, es decir, para ver las capas, no sería necesario\ncortar la muestra y observar su corte, sino que el equipo es capaz de penetrar en el plano\nXZ de la muestra, devolviendo la imagen de un corte en el monitor.\nFigura 45. Imágenes de cortes en plano YZ de polímeros multicapa.\nCada línea que se muestra en la figura 45, se corresponde con un cambio de índice de\nrefracción. Las primeras líneas que aparecen, son más uniformes, siendo éstas debidas a\nlos cambios de índice de refracción del vidrio del cubreobjetos, con el aire y con el\npolímero (es decir la distancia entre ellas proporciona el espesor del cubreobjetos). En\nalgunos casos, aparece una tercera línea muy cercana a la segunda, que puede deberse a\nuna capa de aire que haya quedado durante el montaje de la muestra.\nLas capas de polímero son menos uniformes debido a las imperfecciones que\npresenta este material y en muchos casos menos nítidas, ya que el índice de refracción de\nlos polímeros varia entre 1,4 y 1,6, estando en muchos de ellos la variación en la segunda\no tercera cifra decimal, lo que hace imposible para el equipo ser capaz de distinguir entre\ncapas con índice de refracción tan cercano.\nPor otra parte, el haz de luz llega perpendicular a la muestra, pero al hallar una\ninterfase en la que cambia el índice de refracción, el haz se desvía ligeramente, dejando\nde ser perfectamente perpendicular. Por este motivo, la distancia entre capas que nos\nproporciona el equipo debe corregirse, diviendo el resultado que proporcione, entre el\nvalor del índice de refracción de cada medio que el haz vaya atravesando.\nLas muestras estudiadas, en este caso, eran granza de un adhesivo sensible a la\npresión (PSA), basado principalmente en etilvinilacetato (EVA) y resina de colofonia. La\nsuperficie está recubierta con ceras de polietileno (PE) y de bis-estereamida de etileno\n(agente de dispersión, EBS), para evitar que se pegue la granza entre sí.\nEl objetivo es poder visualizar el recubrimiento para conocer su espesor, y si se ha\nextendido de forma uniforme. La importancia del recubrimiento radica, en que es esencial\npara evitar que el producto se pegue entre sí cuando sea dosificado al extrusor de film.\nLos polímeros citados anteriormente, no presentan ningún tipo de fluorescencia, por\nlo que las imágenes se toman con luz reflejada. A continuación, en la figura 46 se puede\nobservar la forma y el espesor de este recubrimiento.\nFigura 46. Vista del recubrimiento realizado a un polímero\nGracias a este método, es posible observar como está el recubrimiento repartido en la\nsuperficie, y medir su espesor, sin necesidad de cortar la granza y que se pueda producir\nuna distorsión en los resultados.\n6.3.3 Otras aplicaciones con el TCS-SP8\nEl análisis se realizó sobre un aditivo que contenía nanopartículas de cerio, para\nintentar observar la distribución, cantidad, y tamaño de éstas.\nUtilizando luz reflejada, es posible observar partículas en suspensión. Dado que el\nTCS-SP8 no es capaz de proporcionar la composición de dichas partículas, se utiliza\ntambién la técnica de fluorescencia de rayos X para confirmar que se trataba de cerio.\nLa observación de la muestra de aditivo sin ningún tipo de modificación (tipo\nsecado, necesario en otros análisis) permite detectar nanopartículas y aglomerados de\néstas, con tamaños que oscilan entre unos 100 nm y 1 µm (Figura 47).\nFigura 47. Imágenes de las nanopartículas tomadas con microscopía confocal por reflexión.\nLa observación de las fibras de papel en este equipo, no presenta mucha dificultad,\nya que éstas presentan fluorescencia intrínseca. La figura 48 muestra la distribución de\nlas fibras en una muestra de papel.\nEstas imágenes han sido recogidas utilizando dos detectores simultáneamente, para\npoder recoger dos tipos de fluorescencia (uno se muestra en verde y otro en rojo).\nFigura 48. Imágenes de la fluorescencia de las fibras de papel.\nEl objetivo de este proyecto, consiste en instalar y poner a punto dos equipos de\nmicroscopia confocal (DCM 3D y TCS-SP8) para poder cubrir con ellos las necesidades\nde las diferentes áreas del Centro Tecnológico de Repsol.\nEs importante destacar que aunque los equipos de microscopía confocal, son muy\nutilizados en algunas ramas de la ciencia, como la Biología y la Medicina, en el campo de\nla Tecnología de Materiales aún son relativamente escasas sus apliaciones.\nLas conclusiones tras los trabajos que se han realizando a lo largo de los nueve meses\nde desarrollo de este proyecto fueron:\n1. Se ha comprobado que los equipos DCM 3D y TCS-SP8 son\ncomplementarios uno del otro y de gran utilidad para resolver las necesidades\nEl DCM 3D está enfocado a la visualización y análisis de las superficies de\ndiferentes materiales, siendo capaz de proporcionar parámetros de rugosidad,\nisotropía, porosidad, espesores, volúmenes, etc.\nPor su parte el TCS-SP8 es un equipo orientado a la detección de\nfluorescencia de las muestras, o de los fluorocromos con los que se hayan\nteñido éstas, y también de mostrar secciones transversales de las muestras, sin\nque en ellas se haya practicado ningún corte físico, basándose en las\ndiferencias del índice de refracción. A diferencia del DCM 3D, este equipo\nno proporciona el color real de las superficies de las muestras observadas.\nLos dos equipos son confocales, por lo que sólo recogerán la parte de muestra\nque se encuentre enfocada, realizando un barrido en el eje Z de ésta, para\npoder devolver una imagen en tres dimensiones.\n2. Se han desarrollado varios métodos para el laboratorio de Tecnologías\nAnalíticas, en concreto, “Medición de huellas de ensayo HFRR en\nrodamientos por microscopía confocal” y “Medición de huellas de cojinetes\nde biela debidas al efecto de cavitación por microscopía confocal”. Estos\nmétodos se han descrito con anterioridad.\n3. Por otra parte he adquirido una visión general del funcionamiento de una\nmultinacional, en la que he tenido la suerte y el placer de trabajar para otros\ndepartamentos, como el de motores, intentando en la medida de los posible\nsatisfacer sus necesidades. Todos los departamentos dependen de los estudios\nde otras áreas, por lo que los avances de unos siempre son mejoras también\n4. Por último, he adquirido una experiencia general en el laboratorio de\nAnalítica, especialmente de Estado Sólido.\n8.1 Definiciones básicas\nPara un mejor entendimiento del texto, se proporcionan algunas definiciones de\nPíxel: se denomina pixel a cada uno de los puntos que forman la imagen.\nVóxel: es la unidad cúbica que compone un objeto tridimensional. Constituye la\nunidad mínima procesable de una matriz tridimensional y por tanto, es el\nequivalente del píxel en un objeto 3D.\nAberraciones. Las aberraciones son distorsiones de la imagen observada con\nrespecto a la imagen real, originadas por el sistema óptico empleado para la\nobservación, por lo que inevitablemente conllevan a una degradación de la\nimagen. Ocurren cuando la luz proveniente de un punto de un objeto, no converge\nhacia (o no diverge desde) un solo punto, después de transmitirse a través del\nsistema. Los instrumentos precisan corregir estas distorsiones para compensar las\naberraciones, ya que producen borrosidad en la imagen. Sin embargo es imposible\neliminar por completo todas las aberraciones, ademas muchos de los componentes\nde corrección también pueden introducir aberraciones adicionales. Las principales\n1. Aberración Cromática: la distancia focal de una lente depende del\níndice de refracción de la sustancia que la forma y de la geometría de\nsus superficies. Puesto que el índice de refracción de todas las\nsustancias ópticas varía con la longitud de onda, la distancia focal de\nuna lente es distinta para los diferentes colores. En consecuencia una\núnica lente no forma simplemente una imagen en un objetivo, sino\nuna serie de imágenes a distancias distintas de la lente, una para cada\ncolor presente en la luz incidente. Además, como el aumento depende\nde la distancia focal, estas imágenes tienen tamaños diferentes. La\nvariación de la distancia de la imagen con el índice de refracción se\ndenomina aberración cromática longitudinal y la variación del\ntamaño de la imagen es la aberración cromática lateral. La luz de\nlongitud de onda más corta (violeta) es más curvada que la luz de\nlongitud de onda más larga (rojo) de forma que la luz violeta llega a\nun foco más cercano de la lente que la luz roja. El efecto puede\nreducirse colocando dos lentes juntas. En la práctica, la aberración\ncromática longitudinal se entiende como el efecto de los bordes\ncoloreados alrededor de un objeto visto a través de una lente, causado\nporque la lente no desvía todos los colores al mismo foco. La\naberración cromática lateral genera una mayor proporción de blanco\nen la imagen. Los efectos causados son falta de definición de la\nimagen y una diferencia en el porcentaje de los de los distintos\ncolores. Para compensarlo, las lentes compuestas están hechas con\nvidrios con propiedades de dispersión diferentes.\n2. Aberración Esférica: es una distorsión en la imagen por defecto de los\nespejos y las lentes de un sistema óptico, que hacen que los rayos de\nluz que inciden paralelamente al eje óptico sean llevados a un foco\ndiferente, en función de la mayor o menor distancia a éste. Afecta de\nmanera diferente a cada longitud de onda. Este efecto es proporcional\na la cuarta potencia del diámetro de la lente o espejo e inversamente\nproporcional al cubo de la longitud focal; por tanto, esta aberración es\nmás intensa cuanto más corta es la longitud focal, como ocurre con\nlos microscopio. Como consecuencia, la nitidez de la imagen se ve\nafectada. Para compensar la aberración esférica en una lente\ncompuesta se pueden usar geometrías cóncavas o convexas de\nLente objetivo: Una lente objetivo es la parte del microscopio que recoge la luz\nproveniente del objeto y forma una imagen real magnificada e invertida en algún\nplano conveniente. La combinación de lentes en una lente de objetivo depende del\ntipo de fuente utilizado por el instrumento y el tipo de imagen que se requiere.\nHay tres tipos principales de lentes objetivo:\n1. Acromática: corrige la aberración cromática (por lo general del rojo\nal extremo violeta del espectro) y la aberración esférica (normalmente\nentre el extremo del amarillo al verde del espectro). El tipo más\ncomún de lentes acromáticas son las de doblete acromático,\ncompuestas por dos lentes individuales hechas a partir de vidrios con\ndistinta dispersión. Los elementos de la lente están montados uno\njunto al otro, de forma tal que la aberración cromática de uno se ve\ncontrarrestada por la del otro. Las lentes acromáticas son adecuadas\npara su uso tanto con luz blanca como con radiación monocromática.\n2. Semiapocromáticas: este tipo de lente tiene un alto grado de\ncorrección para la aberración cromática y curvatura de campo. Se\nhacen típicamente a partir de fluorita (u otros materiales sintéticos) y\ncon un alto contraste y transparencia. Las lentes semiapocromáticas\nse utilizan en microscopia de interferencia de contraste.\n3. Apocromáticas: estas, tienen un mayor grado de corrección de la\naberración cromática y esférica que las lentes acromáticas. Las lentes\napocromáticas se usan típicamente para fotografía en color y\nLente ocular: es la lente que enfoca la imagen en un detector. Hace la función de\n“lupa” sobre la imagen que produce la lente objetivo.\nMagnificación (aumento): la magnificación es el grado de amplificación o\naumento de tamaño de una imagen y viene dada por la ecuación 2.\n𝑴 = 𝐚\n Siendo “a” la distancia entre la lente y el objeto real y “b” la distancia de la lente a\nLa longitud focal “f” de la lente viene dada por la ecuación 3.\nFigura 49. Esquema del funcionamiento de una lente convergente.\nLa magnificación (aumento) de un microscopio compuesto\nproducto de la magnificación de la lente objetivo con la de\nmagnificación típica de instrumentos usados para medir la\nvaría entre 2,5 aumentos y 150 aumentos. En la figura\nfuncionamiento de una lente convergente.\nviene dada por el\nla lente ocular. La\n49 se muestra el\nApertura numérica: la apertura numérica o angular determina el ángulo de mayor\npendiente que se puede medir, afectando a la resolución óptica. El ángulo de\naceptación determinará las pendientes en la superficie que pueden reflejar la luz\nen la lente objetivo y por lo tanto medirse. La apertura numérica de un objetivo\nviene dada por la ecuación 4.\n𝐀𝐍 = 𝐧 ∙ 𝐬𝐞𝐧𝛂 \nSiendo “n” el índice de refracción del medio entre el objetivo y la superficie, y\n“α” la semiapertura del objetivo.\nEn microscopía la apertura numérica es importante porque indica el poder de\nresolución de una lente. El tamaño del detalle más pequeño que puede ser\nvisualizado es proporcional a 𝜆 𝐴! , donde λ es la longitud de onda empleada. Si\naumenta la apertura numérica podremos visualizar más detalles, además las lentes\ncon aperturas numéricas grandes aceptan más luz y dan una imagen más brillante.\nPoder de resolución (Resolución espacial): Cuando se ilumina un objeto, cada\npunto del objeto observado transmite o refleja las ondas luminosas. Dos puntos\npróximos del objeto se verán como distintos si la distancia que los separa es\ngrande comparada con la longitud de onda que reciben. Si la distancia que los\nsepara es inferior a la longitud de onda que los ilumina aparecerán a nuestra vista\ncomo dos puntos unidos. De nada sirve entonces aumentar el poder amplificador\ndel microscopio. Lo que lograríamos es aumentar de tamaño aparente esa mancha\ndifusa procedente de la unión de los dos puntos, pero sin conseguir verlos\nseparados. Así, el poder de resolución de un instrumento óptico se define como\ndistancia más pequeña entre dos puntos que permite observarlos como entes\nEl poder de resolución de un microscopio por lo general depende del diseño del\nobjetivo. Un objetivo capaz de aprovechar un gran cono de luz procedente de la\nmuestra, tendrá mejor poder de resolución que un objetivo limitado a un cono más\nPor otra parte, la imagen de un objeto puntiforme no es un punto, sino que, debido\nal fenómeno de difracción, se corresponde a una pequeña mancha de luz rodeada\nde aros luminosos. Este fenómeno fue investigado por primera vez por el\nastrónomo Sir George Airy en 1834, quien demostró que la distribución de la luz\nde esta forma (conocida por el nombre de disco de Airy) es tal que el radio del\nprimer aro oscuro es una medida de la distancia resoluble en la imagen.\nLa resolución espacial determina la distancia mínima entre dos elementos\nlaterales que se pueden distinguir en una superficie. Para un sistema óptico\nperfecto la resolución viene dada por el criterio de Rayleigh (ecuación 5).\n𝜺 = 𝟎. 𝟔𝟏\nEsta ecuación establece un valor mínimo para la resolución. Si el objetivo no es\nópticamente perfecto, o una parte del haz está bloqueado, la resolución disminuye.\nLa claridad de la imagen crece con el ángulo "α”, que se corresponde al de\nsemiapertura del objetivo.\nSe puede aumentar el poder de resolución de un objetivo aumentando el índice de\nrefracción, lo que se consigue trabajando con “objetivos de inmersión” en los\ncuales se aplica un líquido entre el cubreobjetos y la lente frontal del objetivo.\nOtras formas de aumentar el poder de resolución son usando lentes frontales\nplanas que dan un ángulo “α” mayor y disminuyendo la longitud de onda de la luz\nempleada, mediante filtros selectivos. Actualmente, el límite viene prácticamente\nimpuesto por la longitud de onda empleada para iluminar el objeto observado; a\néste se le denomina “límite de difracción”, y que corresponde al criterio de\nRayleigh (aproximadamente una semilongitud de onda de la radiación).\nPor esta razón, a fin de conseguir una alta resolución, se emplean longitudes de\nonda progresivamente más cortas (en el violeta o incluso el ultravioleta).\nCampo de visión: es el diámetro del círculo de la iluminación en la lente objetivo.\nCuanto mayor sea el campo de visión menor será la magnificación.\nProfundidad de campo y profundidad de foco: la profundidad de campo se\nentiende como el espacio por delante y por detrás del plano enfocado, eje Z, que\npuede ser visualizado de forma aceptablemente nítida.\nLa profundidad de campo “z” viene dada por la ecuación 6.\nSi la profundidad de campo aumenta, la resolución disminuye.\n8.2 Planos del laboratorio de microscopía\nA continuación, en las figuras 50, 51 y 52, se presentan los planos de la habitación de\nFigura 50. Plano de las medidas generales del laboratorio de microscopía.\nFigura 51. Plano del laboratorio de microscopia, especificando las medidas del mobiliario.\nFigura 52. Plano del laboratorio de microscopía especificando la colocación de los equipos\ndisponibles en la sala.\n(s.f.). Obtenido de www.leica-microsystems.com\n(s.f.). Obtenido de Leica DCM 3D Dual Core 3D Profiler combines Confocal\nImaging and Interferometry: www.leica-micrsystems.com\nDescripción del motor y su funcionamiento. (s.f.). Obtenido de\nDesgaste de materiales. (s.f.). Obtenido de\nInclusión fluida. (s.f.). Obtenido de\nISO 12156-1. (s.f.). Diesel fuel- Assessment of lubricity using the high-frequency\nreciprocating rig (HFRR) .\nLeach, R. (2011). Optical Measurement of Surface Topography. Springer.\nLeica Microsystems. Leica DCM 3D Condiciones de instalación.\nLeica Microsystems. Manual de usuaria DCM 3D.\nLeica Microsystems. Manual de usuario Leica Map.\nLeica-microsystemens. (s.f.). Obtenido de http://www.leicamicrosystems.com/es/productos/microscopios-confocales/leica-tcs-sp8-confocalconfigurable/tecnologia/hyd/\nLeica-microsystems. (s.f.). Obtenido de http://www.leicamicrosystems.com/products/confocal-microscopes/leica-tcs-sp8-configurableconfocal/\nLeica-microsystems. Leica TCS SP8 Compa con microscopio DMI6000.\nLeica-microsystems. Leica TCS SP8 unidad compacta.\nLeica-microsystems. Manual de usuario Leica TCS SP8.\nmicroscopía laser confocal. (s.f.). Obtenido de\nSanz, V. M. (s.f.). Obtenido de http://www.clippproject.eu/detalle_noticia.php?no_id=202\nLi-Piin Sung, Joan Jasmin, Xiaohong Gu, Tinh Nguyen, and Jonathan W.Martin:\n“Use of Laser Scanning Confocal Microscopy for Characterizing Changes in\nFilm Thickness and Local Surface Morphology of UV-Exposed Polymer\nCoatings”, JCT Research, vol.1, nº 4, pp. 267-276. (2004).\nD.B.Hovis and A.H.Heuer: “The use of laser scanning confocal microscopy\n(LSCM) in materials science”, Journal of Microscopy, vol.240, nº 3, pp173-180.\nNestor J.Zaluzec: “The Scanning Confocal Electron Microscope”, MicroscopyToday, Vol.6, pp. 8-12. (2003).\nN.Petford and J.A.Miller: “The study of fission track and the other crystalline\ndefects using confocal scanning laser microscopy”, Journal of Microscopy,\nVol.170, nº 3, pp. 201-212. (1993).\nMicroscopia Confoca l de Barrido Laser (MCBL)\nPETICIÓN DE SERVICIO MICROSCOPIA CONFOCAL Si desea\nLa materia se ordena en los llamados niveles de\nINSCRÍBETE AHORA: http://sct.uab.cat/microscopia/