High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing | Protocol (Translated to Spanish)\nUn protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.\nVIH sigue siendo incurable debido a la existencia de un reservorio de células que alberga de forma estable y latente del virus, que permanece invisible al sistema inmune y no está dirigido por la actual terapia antirretroviral (carro). Transcripción y splicing han demostrado reforzar la latencia del VIH-1 en la reclinación de las células T CD4 +. Revocación de la latencia por el uso de agentes de reversión de latencia (LRAs) en el enfoque de "choque y muerte" se ha estudiado extensivamente en un intento de purgar este embalse pero hasta ahora no ha mostrado éxito en ensayos clínicos debido a la falta de desarrollo de pequeños adecuada moléculas que eficientemente pueden perturbar este embalse. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente evaluación de agentes de reversión de latencia (LRAs) sobre la transcripción del VIH y empalme. Este enfoque se basa en el uso de un reportero de color dual basada en litros que puede medir simultáneamente el efecto de un LRA en transcripción y splicing mediante citometría de flujo. El protocolo descrito aquí es adecuado para células adherentes, así como las células en suspensión. Es útil para probar un gran número de medicamentos en un sistema de alto rendimiento. El método es técnicamente rentable y fácil de implementar. Además, el uso de citometría de flujo permite la evaluación de la viabilidad celular y así la toxicidad de la droga al mismo tiempo.\nA pesar de terapia antirretroviral a largo plazo eficaz, el VIH persiste en estado latente como un provirus integrado en la memoria de las células T CD4 +1. La estructura de la cromatina de los VIH-1 5' promotor de repetición terminal larga (LTR) y modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y desacetilación de ADN metiltransferasas (DNMT) e histona deacetilasas (HDAC) son mecanismos importantes que conducen a represión transcripcional y post integración latencia2,3. Una gran variedad de agentes de inversión de latencia (LRAs) ha sido investigada por su eficacia inducir la producción de virus in vitro y en vivo de latente infectados descanso CD4 + T células4,5,6,7 ,8. Entre las LRAs probado, HDACi (inhibidores de la HDAC) y apuesta bromodominios inhibidores (BETis) inducen la decondensation de la cromatina y la liberación de la transcripción positivo alargamiento factor b (P-TEFb) respectivamente, dando lugar a posteriores aliviar de la transcripcional represión en el LTR 5' y la activación del VIH expresión9,10,11,12,13. Sin embargo, la magnitud de reactivación alcanzada por estos LRAs fue limitada como sólo un modesto aumento en células asociadas unspliced VIH mRNA (RNA), indicativo de la transcripción viral, observó ex vivo14,15. Importante, estos LRAs también no pudieron inducir una reducción en la frecuencia de las células infectadas latente.\nExpresión de VIH puede ser más restringido por empalme ineficiente16 así como defectos en la exportación nuclear de multiplicar empalmado HIV RNA (RNA MS)17. Así, se necesitan identificables nuevas clases de LRAs que son más potentes y pueden afectar distintos aspectos de la integración después de la producción de virus. Además, se requiere el desarrollo de nuevos ensayos que ayudan a definir los compuestos óptimos para invertir eficientemente latencia.\nAquí, se presenta un protocolo, que utiliza un enfoque de alto rendimiento para la evaluación funcional del impacto de intervenciones basadas en LTR del VIH transcripción y splicing. En Resumen, un nuevo dual basada en LTR color reportero sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figura 1) se utiliza para evaluar reactivación de VIH mediante citometría de flujo. En este reportero fluorescente, la expresión de mRNA de VIH unspliced (4 kb) conduce a la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), mientras que la expresión de mRNA empalmado (2 kb) daría lugar a la expresión de la proteína fluorescente Discosoma SP rojo (DsRed). Brevemente, hemos utilizado una proteína fluorescente de fusión Env-EGFP, gp140unc. EGFP, donde la secuencia de codificación de EGFP fue colocada en el marco de forma truncada y no hendida de la envoltura (Env). Cambios fueron introducidos para ablar del sitio de la hendidura evitando la disociación de la Env gp120 y gp41-EGFP y truncar la proteína gp160 antes el dominio de la transmembrana creando un análogo soluble de la Env, que facilita el plegamiento correcto y expresión de EGFP. A la expresión dentro de una célula, Rev se localiza en el núcleo donde interviene en la exportación nuclear-citoplásmico de la env de 4 kb mRNA mediante la interacción con el elemento de respuesta rev (RRE). El truncamiento de la Env no comprometiera RRE, que se encuentra entre gp120 y gp41 y el A7 3' sitio del empalme. En este sistema, que empalma en el VIH-1 empalme donante 4 (SD4) y el empalme aceptador 7 (SA7) resultados en la producción de 2 kb mRNA que codifican una proteína Rev no funcional truncada en el aminoácido 38 unida a proteína fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed fue insertado en el exón 2nd de Rev en el aminoácido 38 por superposición extensión18. Para facilitar la exportación nuclear de mRNA unspliced, un vector de expresión mamífero codificación Rev (pCMV-RevNL4.3) fue co transfectado con el constructo de reportero fluorescente (figura 2). Esta construcción única reportera aquí descrita es útil en la evaluación de alto rendimiento de la transcripción del VIH y empalme, sin necesidad de usar vectores virales.\nNota: Procedimientos de clonación, transformación y la secuencia son discutidas en otra parte18,19. Los protocolos aquí a partir de la transfección de los vectores de expresión mamíferos (figura 3).\n1. construcción de transfección de células HEK293T con la reportera de Color Dual\nCultivar células HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Después de descongelar, los experimentos de células HEK293T de paso 2 - 3 veces antes de usarlos en la transfección. Esto le daría el tiempo de las células para recuperarse del procedimiento de descongelación.\nPRECAUCIÓN: Contaminación por micoplasma de cultivos celulares sigue siendo un grave problema. Buenas prácticas de laboratorio y la prueba rutinaria de cultivos celulares son esenciales para disminuir el riesgo de contaminación por micoplasma y evitar difusión20.\nDividir las celdas 1:2 un día antes de sembrar y transferirlas en medio DMEM fresco. Cultivar las células durante 24 h en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C.\nEl día antes de la transfección, quitarlo del medio del frasco de aspiración y lavar las células con tampón fosfato (DPBS) solución salina de Dulbecco libre de calcio (Ca2 +) y magnesio (Mg2 +) para eliminar los restos de suero.\nDispensar 5 mL de solución de tripsina-EDTA (0.05% - 10 m m en PBS) en el recipiente de la cultura y colocar a 37 ° C en un incubador 5% CO2 para 2 a 5 min.\nCuando las células son separadas, añadir 5 mL de DMEM suplementado con 10% (v/v) FBS para inhibir aún más la actividad de tripsina, que puede dañar las células.\nResuspender suavemente transfiriendo la suspensión de células hacia arriba y hacia abajo para romper los grumos.\nDiluir las células 1:10 en tinción de azul de tripán (0.4%).\nContar las células vivas que no toman trypan azules usando un microscopio (objetivo de 10 x) y una hematimetría.\nCalcular el número de células viables por mililitro tomando el promedio de lo recuento de células y multiplicando por 10.000 y por el factor de dilución (1:10) desde el trypan blue stain.\nPlaca de 2 x 104 células en 100 μL de medio DMEM suplementado con 10% de SBF sin antibióticos en una placa de 96 pozos de fondo plano para 24 h.\nPara cada bien, diluir 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng de pCMV-RevNL4.3 y 100 ng de pCMV Tat101AD8-bandera ADN en 50 μL de medio libre de suero. Mezclar suavemente. Para los experimentos sin Tat, use un vacío emparejado Tat vector pcDNA3.1 (-).\nNota: Se recomienda el uso de ADN libre de endotoxinas. Por eso, preparar ADN libre de endotoxina mediante un kit de purificación de ácidos nucleicos midi o maxiprep. Determine la pureza de ADN midiendo la relación 260/280 de OD, que debe estar entre 1.7 y 1.9.\nMezclar el reactivo de lípidos antes de su uso, luego diluir 0.65 μL en 50 μL de medio libre de suero. Mezclar suavemente e incubar 5 min a temperatura ambiente.\nCombinar el ADN diluido con el reactivo de lípidos diluidos.\nMezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. La solución puede aparecer turbia.\nNota: Proceda al paso 1.15. dentro de 30 minutos.\nDispensar 100 μL por pocillo de los complejos de ADN reactivo lipídico mediante goteo sobre las células.\nMezclar suavemente, meciendo la placa hacia adelante y hacia atrás.\nIncube la placa durante 5 h en una 5% CO2 humidificada incubadora a 37 ° C.\nCada mezcla de reacción es suficiente para la transfección de un solo bien (96 pocillos). Ajustar la cantidad y volumen de los componentes según el número de fármacos y la combinación que sería probado y cuentas para variaciones de pipeteo. Todas las condiciones se prueban generalmente en triplicado.\nTransfectar pozos adicionales con 100 ng de plásmido EGFP y DsRed-Express ADN CMV-conducido por compensación.\n2. tratamiento de HEK293T Transfected las células con latencia agentes de inversión\nNota: Antes de cada ensayo, determinar la condición fisiológica de cada LRA por la medición de la viabilidad de las células después de la exposición a dosis altas y bajas de la droga en ensayo de proliferación celular.\nDiluir cada ERS la concentración adecuada de trabajo con medio de cultivo (por ejemplo,, 1 μM para JQ1(+)).\nPRECAUCIÓN: Reconstituir los fármacos liofilizados con el solvente apropiado a una concentración de 10 mM. Guarde todo stock LRAs a-80 ° C en una alícuota de solo uso (5 μ) para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.\nCuidadosamente aspirar el medio de transfección con un multicanal y reemplace por 100 medio μL conteniendo ERS apropiado (tabla 1). Añadir medio muy suavemente junto a la pared del pozo para evitar el desprendimiento de las células HEK293T transfected, que desprenda fácilmente de la superficie de la placa de cultivo.\nIncube la placa durante 48 h en una 5% CO2 humidificada incubadora a 37 ° C.\n3. tinción de células Transfected con el tinte de viabilidad pueden corregir para el análisis de citometría de flujo\nPRECAUCIÓN: Eliminación de desechos y células muertas es esencial para eliminar los falsos positivos y obtener resultados de alta calidad.\nSeparar las células en los medios de comunicación con 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por pozo y transfiriendo suavemente hacia arriba y abajo (~ 5 veces) con un multicanal, evitando la formación de espuma de los medios de comunicación. Si es necesario, separar las células de la placa utilizando 35 μl por pocillo de solución de tripsina-EDTA (0.05% - 10 m m en PBS) e incubar 5 min a 37 ° C, antes de neutralizar con medio que contiene el suero.\nTransferir las células a una placa de 96 pocillos fondo V.\nGirar las células durante 5 minutos a 500 x g a 4 ° C, y luego aspirar con cuidado el medio/PBS sin tocar las células.\nLavar las células al menos 1 vez con 200 μL de PBS libre de suero, proteína.\nCentrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C, luego deseche el sobrenadante inclinando la placa y retirando el tampón de lavado sin tocar las células.\nPreparar una solución de trabajo de viabilidad pueden corregir tinte diluyendo la viabilidad tinte 1: 1000 en PBS libre de suero, proteína. Preparar 50 μl de la mancha diluida por pozo.\nNota: Tintes de viabilidad están disponibles en una gama de colores adecuadas para el uso con láser azul, rojo y violeta. Preparar una solución stock de viabilidad pueden corregir tinte resuspender un frasco de la tintura liofilizada (componente A) con 50 μL de DMSO anhidro (componente B). Conservar a-20 ° C en un solo uso alícuota (1 μL cada), protegido de la luz.\nAñadir 50 μL de colorante diluido viabilidad a cada pozo y mezclar las células pipeteando arriba y abajo con un multicanal.\nTinción para 10-15 min a 4 ° C, protegido de la luz.\nLavar 1 - 2 veces con 150 μL de tampón de lavado (PBS con 1% bovinos albúmina sérica y 2 mM EDTA).\nCentrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.\nFijar las células con 100 μL de formaldehído al 1% recién preparado en tampón de lavado durante 10-15 min a 4 ° C en la oscuridad.\nPRECAUCIÓN: El formaldehído es muy tóxico. Preparar la solución de formaldehído 1% en una campana de humos para evitar la inhalación mientras que usa guantes y gafas de seguridad para la protección.\nLavar las células 1 - 2 veces con 100 μL de tampón de lavado.\nResuspender el precipitado de células en 70 μL de tampón de lavado.\nNota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. Células fijas podrían ser almacenadas a 4 ° C en la oscuridad para el análisis al día siguiente en el citómetro de flujo.\n4. EGFP y mediciones DsRed por citometría de flujo y análisis de datos\nNota: Analizar la transcripción del VIH (% EGFP) y empalme (% DsRed) en un citómetro de flujo. Filtrar la muestra antes de la carrera con un celular-filtro 70 μm o 100 μm de malla de nylon para evitar la obstrucción de la boquilla.\nPoner en marcha el citómetro y la computadora por lo menos 10 minutos antes para calentar los láseres.\nAntes de correr las muestras y comenzar la adquisición de datos, llenar el depósito de la vaina con solución salina 0.9% y aseguran que una pastilla de hipoclorito de sodio se agrega al tanque de residuos.\nCompruebe la célula de flujo para las burbujas de aire.\nVerificar que los detectores y los filtros son adecuados para el experimento.\nNota: Para EGFP, uso del láser azul (488 nm) y 530/30 paso de banda, mientras que DsRed Express óptimo se detecta usando el laser amarillo (561 nm) y paso de banda de 610/20. Un láser azul (488 nm) y paso 610/20 también puede ser utilizado para detectar DsRed expresión.\nComprobar el funcionamiento del citómetro y sensibilidad a través de detectores ejecutando el cuentas de calibración.\nAjustar el avance (FSC-A) y voltajes de scatter (SSC-A) de lado con mancha muestra que la población principal es en la pantalla y claramente discernible.\nNota: FSC (luz dispersada hacia delante) es una medida de la luz difracción en un ángulo plano, que depende del volumen de la célula (célula superficie o tamaño), mientras que SSC (lado dispersada luz) es una medida de la difracción de la luz en un ángulo recto, que es proporcional a granularidad de la célula y complejidad interna.\nRealizar compensación manual o automática mediante las muestras teñidas solo asegurar mínimo contagio de EGFP + población en el detector DsRed y viceversa.\nPRECAUCIÓN: Por compensación, utilice una muestra de las células que expresan cada una de la proteína fluorescente de color único como células teñidas con el tinte de viabilidad pueden corregir individualmente. No utilice cuentas de compensación FITC y PE para compensaciones de proteínas fluorescentes de EGFP y DsRed debido a diferentes características espectrales. Controles de compensación deben ser lo suficientemente brillantes para resolver positiva y negativa de la población.\nCrear parcelas y fijar las puertas usando la fluorescencia menos uno controla (FMO).\nAdquirir y registrar un mínimo de 10.000 eventos de células viables por muestra. Ejecutar ejemplos a velocidad media o baja para evitar dobletes pasando por la intercepción de láser. Utilizar pulso de compuerta geometría como SSC-A frente a SSC-H para eliminar dobletes. Comprobar la estabilidad del funcionamiento mediante el trazado de tiempo versus SSC-A ver cómo incluso el flujo es durante el funcionamiento.\nAl final de la carrera, limpiar los fluidos de citometría de flujo con detergentes concentrados y agua durante 5 minutos.\nApagar el sistema, deseche la basura y volver a llenar el tanque de la vaina después de la adquisición.\nAnalizar los datos utilizando un software de análisis de datos de citometría de flujo. Excluyen restos celulares y mata (dobletes) basado en la dispersión hacia delante y lateral, a continuación, eliminar las células muertas con la mancha de tinte de viabilidad (negativa población = células vivas). Identificar las células que expresan EGFP y DsRed (figura 4), así como el porcentaje de producto empalmado DsRed /(DsRed + EGFP) (figura 5).\nDeterminar el efecto del LRA en la transcripción del VIH y empalmar mediante la comparación de las células no tratadas y las células expuestas al individuo o a una combinación de LRAs (figura 5).\nResultados representativos se muestran en la figura 5 para la expresión del VIH-1 unspliced (EGFP) y empalma (DsRed) productos después del tratamiento con el inhibidor de bromodominios JQ1. JQ1(+) y Tat aumentaron significativamente el porcentaje de células que expresan EGFP (FC 2.18 y 4,13 sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de unspliced transcripciones. Por otra parte, JQ1(+) aumentó significativamente el porcentaje de células que expresan DsRed (46,6 FC sobre DMSO) así como la proporción de producto empalmado (7,37 FC sobre DMSO) a un nivel similar como Tat (59,6 y 5.83 FC sobre DMSO, respectivamente) lo que confirma la capacidad de JQ1(+) para activar la transcripción del VIH y empalme. Por otro lado, el tratamiento con el control del stereoisomer JQ1(-) suprime JQ1(+) efecto sobre la transcripción del VIH y empalme confirmando el éxito del protocolo.\nEn una publicación reciente, hemos demostrado por análisis de ARN, una acumulación de VIH empalmado las transcripciones siguientes JQ1(+) tratamiento21. De hecho, nuestros datos revelaron cambios constantes en los niveles de transcritos de unspliced y empalmados que se reflejaban la expresión de proteína EGFP y DsRed en este modelo después del tratamiento con JQ1(+). Estos resultados indican que EGFP y DsRed expresando las células reflejan la capacidad de inducir la transcripción del VIH y empalme bromodominios del inhibidor de la JQ1(+).\nEn Resumen, hemos validado el uso de la pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed reportero en un montaje de alto rendimiento para la evaluación del efecto de LRAs en la transcripción del VIH-1 y empalme. Cantidad óptima de LRA o aumento de la toxicidad podría conducir a resultados de scud. Optimización de la cantidad de medicamento que se usa mientras que preserva la viabilidad de las células puede mejorar la exactitud de los resultados.\nFigura 1: esquema del modelo utilizado para determinar los efectos de latencia de inversión de los agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme. El expresa de construcción LTR a que o proteína (Env) unspliced fusionada mayor proteína verde fluorescente (EGFP) o empalma de la proteína Δ38rev con DsRed. Esta figura ha sido reimpreso de Khoury et al21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 2: construye diseño. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed reportero empalme permite la expresión de fundido a la EGFP (gp140-EGFP) y no funcional de la proteína Rev envolvente truncado en el aminoácido 38 fusionado a la proteína fluorescente DsRed (RevΔ38-DsRed). (B) Rev pCMVNL4.3 permite la expresión de la proteína Rev. (C) pCMV Tat101AD8-permite la expresión de la proteína Tat101(AD8) con una etiqueta C-terminal de la bandera. La plásmidos de expresión están construida con traslapos PCR y digestión de restricción. Todos los vectores mapas fueron creados utilizando el software SnapGene , versión 4.1.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 3: Análisis de diseño para la evaluación rápida de la latencia del VIH invertir agentes. El método actual para la evaluación del efecto de LRAs en la transcripción del VIH-1 y empalme incluye i) siembra de células HEK293T un día antes de la ii) transfección con vectores de expresiones seguidos por iii) ERS el tratamiento. IV) las células son analizadas por el flujo cytometry 48 h de post-treatment. Mediante este protocolo, 32 (por triplicado) a 96 condiciones podría probarse por placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nTabla 1: ejemplo de la configuración de la placa y controles necesarios. Columnas 1 a 3 corresponden a los controles negativos (-) con ninguna droga y el solvente solo (DMSO 1: 5000) así como controles positivo (+) tales como Tat (100 ng), PMA/PHA = forbol miristato acetato/fitohemaglutinina (10 nM PMA, 10 μg/mL de PHA), JQ1 (+-) (1 μM), VOR = (vorinostat 0,5 μM) y PAN = panobinostat (30 nM). LRAs desconocidos se analizan por triplicado en un rango de concentraciones (15.625 a 1000 nM). Por compensación, las células que expresan cada uno de la solo-color proteína fluorescente (EGFP + y DsRed +) así como de las células teñidas con el tinte de la viabilidad y células sin manchas están incluidas en cada serie. Haga clic aquí para descargar este archivo.\nFigura 4: estrategia que se utiliza en el análisis de citometría de flujo que bloquean. El primer paso en la estrategia bloquea se basa en la dispersión hacia delante y lateral, que permite la distinción de las células de interés basándose en las propiedades de tamaño y granularidad de estas células. Se recomienda que este control sea tan generoso como sea posible incluir todos los eventos, mientras que la eliminación de detritos celulares y células muertas, que se encuentran en la esquina inferior izquierda de la trama de la densidad. Luego eliminar dobletes del conjunto de datos con la geometría de pulso bloquea SSC-A frente a SSC-H y más estrecha en las células vivas utilizando el tinte de viabilidad. Por último, un canal de descarga (violeta) y EGFP o DsRed se utilizan para definir a las células de interés. El uso de fluorescencia menos uno controla (FMO) son críticos en la definición de la población de interés y abordar los problemas de contagio de otro fluorocromo en el canal de interés. Después de la adquisición, los datos se analizan usando software de análisis de datos de citometría de flujo. Esta figura ha sido reimpreso en forma adaptada Khoury et al21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 5: resultados representativos del efecto de inhibidores bromodominios en VIH transcripción y splicing. (A) ejemplos de dos parámetros doble color fluorescencia EGFP versus DsRed parcelas de densidad de las células untransfected (-Tat), las células transfected con 100 ng de pCMV Tat101AD8-bandera (+ Tat) y las células trataron con DMSO, JQ1 (+) o JQ1 (-). (B) la media de porcentaje (%) de las células que expresan EGFP, DsRed o producto empalmado (DsRed / DsRed + EGFP) aparece de 3 experimentos independientes. Se hicieron comparaciones de cada condición a DMSO utilizando la prueba ANOVA de 2 vías. Sólo se muestran las comparaciones estadísticamente significativas. p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001. Las líneas negras representan los ±SEM. DMSO (1: 5000), JQ1 (+) y JQ1(-) (1 μM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nDada la dificultad en la medición de la reactivación del virus ex vivo, una amplia gama de vitro se desarrollaron modelos sobre el tiempo para estudiar la latencia del VIH incluyendo latente infectados líneas de células T (J-Lats, ACH2, U1), modelos primarios de la infección latente de descanso) Modelos o ' Doherty, Lewin, Greene y espina) o pre-activado de células T CD4 + (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, modelos de Karn) sola ronda o replicación competente reportero virus22. Para modelar las condiciones fisiológicas de la latencia del VIH en la reclinación de las células T CD4 +, sistemas de doble fluorescente reportera sobrevinieron como el reportero RGH (rojo-verde-VIH) desarrollado por grupo de Ivan Sadowski con un marcador de basada en LTR Gag-eGFP y un mCherry impulsado por CMV en lugar de Nef23. Un similar virus reportero de color dual, Duo-Fluo, fue desarrollado por laboratorio E. Verdin con una expresión de EGFP impulsado por litro y un marcador fluorescente mCherry conducida por un promotor de EF1α24. En este sistema, la EGFP fue insertado en el extremo 3' de los provirus en lugar de Nef. La eliminación en la dotación en ambos sistemas previene múltiples rondas de infecciones. Por otra parte, la combinación de las dos proteínas fluorescentes permite la detección de manera productiva (eGFP mCherry +) y latente (eGFP - mCherry +) las células infectadas. Sin embargo, varias deficiencias de los virus de la reportera de color dual eran sensibles en células T CD4 + como la infección directa de las células infectadas latente es en gran parte dependiente en el estado de activación celular de los linfocitos T23,24. De hecho, observó muy baja tasa de infección con estos virus dos reportero en la reclinación de las células CD4 + T: 0.1% para RGH23 y 0.2% para el DuoFluo25. Además, como el CMV promotor se ha demostrado que se expresa en bajos niveles en células no activadas26,27,28, un CMV inactiva o promotor de EF1α daría lugar a la subestimación de la latente infectados poblaciones.\nHemos generado y caracterizado un nuevo vector reportero de VIH para estudiar el establecimiento de latencia y reactivación del virus en un ensayo de alto rendimiento. Ventajas de nuestro método de detección incluyen i) costo efectividad con la capacidad de evaluar la transcripción y splicing simultáneamente, ii) la capacidad de probar una gran cantidad de drogas o combinaciones en un solo experimento, iii) rápida evaluación de la efecto de LRAs por citometría de flujo (30-45 min típico tiempo de lectura para 96 placa bien independientemente del número de parámetros fluorescentes), iv) alto rango dinámico, v) conveniente para la transfección de alto rendimiento y citometría de flujo utilizando brazos de robot y plataforma HTS, automatizados de curado VI) rápida de los datos mediante una plantilla de área de trabajo de citometría de flujo, vii) óptima para la suspensión y las células adherentes, viii) la simplicidad del modelo y capacidad de adaptación a medidas de luminiscencia y placa lector (dual luciferasa de luciérnaga y Renilla) y ix) escalabilidad (formatos de pate de 96 y 384 pocillos).\nLa propensión de un LRA o una combinación de LRAs para activar la transcripción basada en el LTR del VIH y empalmar así expresión de proteínas fluorescentes de EGFP y DsRed podría ser examinada mediante citometría de flujo utilizando nuestro reportero que empalma del VIH. Sin embargo, antes de probar la sinergia de novela LRAs, es altamente recomendable para determinar las condiciones fisiológicas de cada LRA por la medición de la viabilidad de las células después de la exposición a una gama de concentraciones de la droga sola. Por lo tanto, es esencial para eliminar los falsos positivos y obtener resultados de alta calidad incluyendo un marcador de células vivas y muertas. Otro aspecto importante de análisis de citometría de flujo es los controles de compensación o FMO. Se recomienda utilizar muestras solo manchadas asegurando mínimo contagio de EGFP + población en la DsRed y viceversa. Además, es esencial a cuenta de la autofluorescencia de las células incluyendo las células sin manchas. Por último, un control regular del funcionamiento del citómetro y la sensibilidad a través de los detectores es fundamental sobre todo cuando mide las muestras para un estudio que abarca un largo período de tiempo.\nAunque no se discute en la sección de protocolo, hay varias limitaciones de nuestro sistema que empalma del reportero. Para una discusión más completa, por favor vea nuestra publicación anterior (Khoury et al., 2018). Exportación de la parcialmente o unspliced variantes del mRNA del VIH es facilitada por la proteína viral Rev y su asociación con elemento de respuesta Rev (RRE) en estos mRNA especie29,30,31,32. La sobreexpresión de Rev en nuestro sistema nos ha permitido sortear el mayor bloque de retención nuclear de multiply empalmado y mRNAs unspliced observado en latente infectados de células T17 y foco en la comprensión de cómo las LRAs inducen transcripción y splicing así la reactivación del virus. Además, dado que nuestro sistema requiere la transfección de 3 plásmidos, elegimos HEK293T células porque la eficiencia de transfección alta de estas células. Debido a la diferente disponibilidad temporal y espacial de factores celulares en células de T respecto a una línea celular de cáncer, es importante validar los resultados del empalme reportero adquirida en células HEK293T en líneas de células T y células primarias, que podría proporcionar gran problemas técnicos debido a su limitada transfectability. Por lo tanto, el uso de reactivos de entrega ADN alternativa para transfección como DMRIE-C, que se ha demostrado para ser particularmente eficaz para la transfección de células de suspensión (por ejemplo, Jurkat) o métodos nucleofection como Amaxa nucleofector o neón sistema de transfección que se han demostrado para facilitar la entrega eficiente y confiable de uno o varios plásmidos difícil para transfectar las células incluyendo primaria de células T CD4 +. Por otra parte, sería interesante probar este sistema de reportero en el contexto del virus de larga duración en un modelo de célula primaria de latencia mediante los métodos antes mencionados de la transfección. De hecho, las diferencias en la disponibilidad de host, alargamiento y transcripción factores en una celda de rCD4 + T de empalme pueden afectar la capacidad de una LRA para reactivar el provirus latente. Por último, nuestro modelo no responde a si puede afectar LRA transcripción y empalme de las células del espectador, y si puede inducir virus competentes de replicación. Sin embargo, sospechamos que al medir un aumento de células asociadas VIH U.S. y MS RNA, Esto conduciría a la producción de virus competentes de replicación en el sobrenadante de cultivo. Esto podía ser confirmado mediante la realización del patrón oro virus cuantitativo consecuencia ensayo (QVOA)33.\nDebido a la naturaleza compleja de latencia y reactivación del virus eficaz, una estrategia multifacética combinatoria puede ser necesario34. Tratamiento potencial necesita estimular múltiples vías incluyendo transcripción y splicing, que previamente se ha demostrado que desempeñan un papel esencial en el establecimiento de latencia16,35,36, 37. impulsado por litro nuestro reportero empalme permitiría una proyección de alto rendimiento de procesamiento de drogas que puede perfectamente ambos pasos, transcripción y splicing, aumentando la posibilidad de encontrar moléculas que pueden sinergizar de manera eficiente, que daría lugar a una menor niveles de dosis y toxicidad de cada droga.\nEste trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto APP1129320 y la beca del programa APP1052979 de la NHMRC de Australia. Agradecemos al Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson y Michelle Y. Lee para proporcionar asesoramiento y construcciones esenciales para la realización de este trabajo. También agradecemos al personal del establecimiento de flujo DMI para su asesoramiento y asistencia generosa para mantener el citómetro de flujo utilizado en este estudio.


5 consejos que debes seguir si deseas mudarte de casa – LOQUENOSABIAS.NET – Lo Mejor en Actualidad & Entretenimiento\n62 Vistos Antes de decidir, no olvides informarte lo mejor posible y pensar en formar de solventar los gastos que esta compra implica\n5.- RemodelaEn ocasiones comprar una casa que necesita algunas renovaciones sale más a cuenta que comprar una lista para mudarse. Tú puedes irle añadiendo de a poco todas las cosas que deseas tener sin endeudarte hasta el cuello o hacerlas tu misma si eres buena con los proyectos manuales, además de darle tu toque personal.\n4.- No seas muy exigenteSé razonable con toda las cosas que deseas tener en tu casa para que encajen en tu presupuesto. Todas queremos la casa perfecta pero a veces nuestros sueños están lejos de lo que el bolsillo puede desembolsar. Si te mudarás sola, no busques algo muy grande, en un distrito demasiado exclusivo o con acabados de última generación que le subirán el precio a la vivienda.\n3.-Evalúa compartirlaLa mejor forma de ganar dinero extra para el pago de los gastos de la casa es compartirla. Consigue alguna amiga que desee mudarse y ofrécele la oportunidad de alquilar una de tus habitaciones, de esa forma tendrás más ingresos y estarás bien acompañada de una persona que conoces y confías.\n2.- Infórmate bienComprar una casa es un gran paso que no debes tomarte a la ligera. Antes de hacerlo, averigua sobre el tema inmobiliario, precios, requerimientos, procesos, etc. Entre más informada estés, es menos probable que te estafen o que tomes una decisión que no te conviene.\n1.- PriorizaLo primero en lo que debes pensar es si en verdad estás en condiciones de comprar una casa o si es mejor seguir alquilando. Si decides embarcarte, ten en cuenta que deberás reducir algunos gastos para priorizar el pago del préstamo que vayas a pedir.


eBay aumenta sus ingresos, ayudado por el crecimiento de PayPal\nBárbara Bécares, 19 enero 2012, 11:05\neBay anunció unas ventas y unas ganancias durante el último trimestre del año pasado por encima de las estimaciones de los analistas, gracias su campaña de promoción de su oferta ampliada al por menor y a un mayor uso de su línea de pagos de PayPal.\nLos ingresos del cuarto trimestre de 2011 subieron un 35%, hasta los 3.380millones dólares (2.629 millones de euros), según datos publicados por la propia compañía de venta online. La estimación media de los analistas calculaba unos ingresos de 3.320 millones, de acuerdo a los datos recopilados por Bloomberg.\neBay se benefició del crecimiento del gasto online de los consumidores durante el periodo navideño de 2011, que aumentó en un 15%, según un estudio de ComScore. Además, el portal de subastas online estima unos ingresos de entre 3.050 millones a 3,150 millones de dólares durante este primer trimestre en curso.\nPayPal, fue la división de más rápido crecimiento de eBay durante el Q4 de 2011, cuando sus ingresos aumentaron un 28% y los usuarios registrados alcanzaron la cifra de 106,3 millones de personas. La unidad está ampliando su lista de socios comerciales y destacan los acuerdos con Visa y MasterCard. Según estimaciones de eBay, el volumen de pagos a través de PayPal llegará a 7 millones de dólares durante este año, frente a los cuatro millones de dólares el año pasado.\nPayPal quiere dominar también el mercado de los pagos offline y una de las últimas medidas tomadas fue un acuerdo con el minorista Home Depot para que los compradores utilicen el sistema de pago en la caja. La empresa anunció a principios de este mes que el método se probraría en cinco tiendas y se acaba de publicar que en un futuro se extenderá a 51 tiendas.\nAdemás, eBay anunció hace unas semanas que el año 2012 verá la aparición de otros proyectos de PayPal, entre los que habrá pruebas para el pago móvil.\nEl analista Collin Gillis de BGC Partners, ha declarado que eBay está cosechando los beneficios del dinero gastado para comenzar a reformar su marca, que los consumidores se han asociado históricamente con las subastas en línea y que ahora asemejan más a un portal de venta online, similar a Amazon.


Más flexibilidad con las MOTOmed Upgrades - MOTOmed\nMás flexibilidad con las MOTOmed Upgrades\nCon el fin de ofrecer a las compañías de seguros de salud, clínicas y minoristas especializados la máxima flexibilidad con la terapia de movimiento MOTOmed, hemos equipado diez modelos de la MOTOmed loop edition con una variedad de opciones de actualización (Upgrade).\nSea cual sea la razón para elegir un modelo concreto de la MOTOmed loop edition - las opciones de actualización le permiten añadir muchas funciones a su MOTOmed existente.\nMediante un software (memoria USB) y, dependiendo del Upgrade Bundle, componentes adaptables para el entrenador de brazos o piernas, su MOTOmed Upgrade (función de entrenador de brazos, función de entrenador de piernas, programas de terapia y motivación, función de Parkinson, ajuste de la masa del volante, ...) puede implementarse de forma rápida y sencilla.\nEn la lista de precios MOTOmed next generation nº 39, que hemos puesto a disposición para su descarga en el resumen de medios de la página web de MOTOmed, se puede encontrar una visión general de las diferentes opciones de actualización. ¿No tienes acceso a la zona protegida por contraseña? Sólo llámenos o envíenos un e-mail.


Guía sobre cuidados paliativos o de apoyo - Suanity\nGuía sobre cuidados paliativos o de apoyo\nLos cuidados paliativos son aquellos que se proporcionan a las personas con enfermedades graves y que se enfocan a aliviar el sufrimiento y mejorar la calidad de vida tanto de pacientes como de su entorno.\nLa atención paliativa se proporciona junto con el tratamiento curativo pero su objetivo no es curar la enfermedad en sí.\nEn definitiva, el fin de los cuidados paliativos es atender todas las necesidades de los pacientes, ya sean, físicas, emocionales, sociales o espirituales y apoyar tanto a estos como a sus familiares.\nA través de estos cuidados se trata aliviar los síntomas causados por enfermedades graves (náuseas, dolor, cansancio, dificultades respiratorias, etc.), ayudar al paciente a gestionar sus emociones y a comunicarse con su entorno cercano (y al entorno con el paciente) y conseguir que la persona se sienta bien consigo misma.\nDiferentes estudios han demostrado que los pacientes que reciben cuidados paliativos pasan menos tiempo en unidades de cuidados intensivos y tienen menos posibilidades de volver a ser hospitalizados después de regresar a casa.\nTambién se ha demostrado que las personas que reciben está atención de alivio tienen síntomas menos severos. Estos presentan una mejor calidad de vida, menos dolor, menos dificultad para respirar, menos depresión y menos náuseas.\nAdemás, la atención médica que reciben se ajusta a sus valores y preferencias y sus familiares también se sienten más satisfechos.\nAsimismo, los cuidados paliativos también pueden aumentar la esperanza de vida. Un estudio sobre el cáncer de pulmón realizado por la Amercian Cancer Society en 2010 demostró que los pacientes que recibieron cuidados paliativos junto al tratamiento del cáncer vivieron 3 meses más que los pacientes que no los recibieron.\nCualquier persona que sea diagnosticada con una enfermedad grave que presente síntomas debe recibir cuidados paliativos.\nPersonas con problemas médicos complejos como la insuficiencia cardíaca, diabetes o cáncer también deben recibir cuidados paliativos.\nEste tipo de cuidados se deben ofrecer desde el momento del diagnóstico hasta el final de la vida.


Reos - Ensayos universitarios - 803 Palabras\nPágina principal Ensayos Reos\nPáginas: 4 (803 palabras) Publicado: 3 de marzo de 2011\nCárceles Más Importantes del Ecuador\nEn el Ecuador como en todo país existen cárceles. Las cárceles tienen dos funciones: La disuasión para inducir a no cometer delitos y la rehabilitación de presospara ayudarlos con sus problemas psicológicos que los alienta a cometer un crimen.\nSegún la encuesta de FLACSO (Facultad Latinoamericana de Ciencias Sociales) Ecuador cuenta con 35 cárceles en 17provincias, 10 son cárceles de varones, 4 de mujeres, 20 son mixtas y una es de detención provisional, en total existe un aproximado de 12000 internos en todo el Ecuador. El 53% de los presos seencuentran en la sierra, el 45% en la costa y solo el 2% en el Oriente. La cárcel más grande es la de Guayaquil que hoy en día consta con 3106 presos mientras que la capacidad es solo para 2000 presos.\nElsistema de cárceles en el país, está atravesando un proceso de crisis institucional. La cárcel no cumple con los requisitos que debería, debería ser obligatorio rehabilitar a un preso. Las cárcelesmás importantes son:\nPrisión del Litoral de Guayaquil:\nPoblación: Consta con 3106 presos, pero su capacidad es para 2000, equivalente al 31 % de la población total.\n-Susinstalaciones y equipos están deteriorados.\n-No tienen ventilación adecuada para la cantidad de reos.\n-No son instalaciones higiénicas, no se efectúa una limpieza adecuada.\n-La norma mínimainternacional establece que el área mínima por interno es de 20 metros cuadrados, la prisión del Litoral sobrepasa esa norma.\n-Los servicios sanitarios están en pésimas condiciones.\n-Una trabajadora social tiene un grupo de personal capacitado el cual da temas de prevención de ITC/VIH a los detenidos y al personal de la prisión.\n-Se trabaja en varios talleres como:carpintería, ayuda en la cocina.\n- Juegos recreativos: fútbol, vóley y básquet.\n-El método APAC, tiene como objetivos inculcar los estudios bíblicos para que los presos mediten sus acciones y luego...\n... ASIGNATURA: Filosofía Helenística La carta a Meneceo PRESENTADO POR: José Wilmar González DOCENTE: John Larry Bogotá D.C diciembre 1 de 2014 Epicúreos Carta a Meneceo En el siguiente ensayo vamos a darle un análisis a la carta de Meneceo mirando si significado, su contexto y lo más importante de todo darle una relación a la filosofía helenística. La carta a Meneceo abre con una hermosa frase “Que...\n...Pauta de trabajo “cuentos chilenos de todos los tiempos” Acerca del autor 1. Titulo: El Arbol 2. Autor: Maria Luisa Bombal 3. Año de publicación: 1938 4. Breve biografía del autor: Nació en Chile 1910. Durante su juventud viajó a París, donde estudió en la Facultad de Letras de La Sorbona. De 1931 a 1940 radicó en Buenos Aires, donde conoció a importantes escritores y al pintor Jorge Larco, con quien se caso y trato de asesinar en una ocacion devido a una infielidad, pese a eso no...\n... POLICIA NACIONAL DEL PERÚ DIRECCIÓN EJECUTIVA DE EDUCACIÓN Y DOCTRINA ESCUELA DE EDUCACION SUPERIOR TÉCNICO PROFESIONAL PNP YUNGAY SÍLABO DESARROLLADO DE DERECHO PENAL I PROGRAMA REGULAR 2014 SILABO (ADECUACIÓN ACADÉMICA PROMOCIÓN 2009-II) DERECHO PENAL I (PROGRAMA REGULAR) I.\tDATOS GENERALES EJE CURRICULAR\t:\tFormación Técnico-Policial AREA\tEDUCATIVA\tFormación Básica AREA COGNITIVA\t:\tCiencias Jurídicas AÑO DE ESTUDIO...\n21661 Palabras 87 Páginas\n...El leon rendido En el año 1804, el joven Rodrigo( un niño de 12 años), a bordo de una fragata española, conoce al pirata John Wharton. El barco es vencido por la Armada Británica y ambos tripulantes caen prisioneros de los ingleses. En poco tiempo organizan la fuga de la prisión y viajan a Cuba como polizontes en un barco holandés. Tras una serie de aventuras en La Habana, dos años más tarde llegan a Santa María de los Buenos Aires, en los tiempos de la primera invasión inglesa. Allí,...\nENCUESTA REOS DEL PENAL Modificado\n...asesinado en la cárcel? ……………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………………. 2.- ¿Qué marco normativo protege a los reos en la carcel? …………………………………………………………………………………………. …………………………………………………………………………………………. 3.- ¿conductas que favorecen a los reos dentro de la carcel ? ……………………………………………………………………………………………….. ……………………………………………………………………………………………… 4.-¿Es necesario visitar a un reo que lleva...\nMetodos auxiliares en la medida de resistencias


Cuenca es la capital provincial en la que más subió el precio de la vivienda: un 4,91% en tres meses - Detalles - Voces de Cuenca\nImprimir Cuenca es la capital provincial en la que más subió el precio de la vivienda: un 4,91% en tres meses\nCuenca es la capital provincial en la que más subió el precio de la vivienda: un 4,91% en tres meses\nA pesar del incremento, la ciudad es la segunda cabeza de provincia con el precio medio más barato, con 1.050 euros por metro cuadrado\nCuenca fue la capital de provincia española en la que más subió el precio de la vivienda en el último trimestre, según los datos recopilados por el portal inmobiliario pisos.com. La ciudad ha visto cómo durante los últimos tres meses de 2016 la cantidad que se pide por los inmuebles a la venta se ha incrementado un 4,91% hasta alcanzar los 1.050 euros por metro cuadrado de media.\nEl ascenso supera porcentualmente el de urbes como Barcelona (4,37%), Pontevedra (3,27%), Huesca (3,24%) y Zaragoza (2,20%).\nA pesar de la subida trimestral experimentada, la conquense figura como la segunda capital provincial española con metro cuadrado más barato, siempre según este estudio. Solamente Ávila, con 979 euros, presenta medios más baratos.\nSi se tiene en cuenta cómo período de análisis el semestral, el informe de pisos.com cifra la subida en el último medio año en el municipio conquense en un 4,69%. Sin embargo, en diciembre se registró una bajada del 0,94%.


Belgrano lo tiene a Boca entre ceja y ceja | Club Belgrano de Córdoba | PortalCeleste\nBelgrano lo tiene a Boca entre ceja y ceja\nLa Voz del Interior | 21/07/2015\nPara Claudio Pérez, el partido del domingo a las 21.30, contra Boca, no es uno más. El defensor es hincha confeso del Xeneize, club al que debe volver cuando culmine su préstamo con Belgrano. “Es especial porque tuve dos años lindos y encima tengo que regresar. Ahora defiendo la camiseta de Belgrano y trato de hacer lo mejor posible. Después del partido seguiré alentando a Boca como siempre lo hago, pero primero está mi trabajo”, le contó el zaguero a Mundo D.\n“Quizá de nombre no tengamos un plantel tan largo como ellos. Pero tenemos muchos chicos jugando en reserva y lo hacen muy bien. No tienen lugar en primera porque estamos haciendo buenos partidos y llevando la línea de juego que queremos”, agregó.\n–¿Cómo se le juega a este Boca con Tevez?\n–Con Tevez, con Palacios, con Gago… y te puedo seguir nombrando. Boca siempre es candidato. Todos los torneos que juegan son candidatos: Libertadores, Sudamericana, Copa Argentina y el torneo local. “El Apache” es un gran jugador. Yo lo admiro mucho por la clase de futbolista que es y la humildad que demuestra. Ellos vienen primeros y esperamos bajarlos porque tenemos con qué.\nEn coincidencia con lo que planteó el DT Ricardo Zielinski, Pérez resaltó que no habrá marca persona para “Carlitos”: “No nos vamos a volver locos, nunca hicimos marca personal ni hincapié en un solo hombre. Si hacemos eso estamos perdidos. Vamos a seguir marcando como lo venimos haciendo, cubriéndonos las espaldas, que es lo que nos llevó hasta acá”.\nPor último, “el Chiqui” dijo que, si hace un gol, no lo gritará: “Por respeto no lo haría. A Belgrano le hice uno jugando para la reserva de Boca y tampoco lo grité”.\nCon “el Gringo”\nMario Bolatti no necesitó presentación en su primera práctica con el plantel de Belgrano. El volante, un hijo pródigo del club y que desde hace días se movía prácticamente en soledad en el predio de Villa Esquiú, se sumó ayer a los entrenamientos junto a sus nuevos compañeros.\n“El Gringo”, quien firmó por dos temporadas en la “B”, necesita recuperar ritmo futbolístico, por lo que aunque no estará de entrada tendría alguna chance de ir al banco de suplentes. Sobre cuándo estaría disponible, el volante no quiso dar precisiones: “Uno venía trabajando, pero no es lo mismo estar ya integrado a un grupo. Voy a trabajar en el día a día y el tiempo dirá cuándo estaré para estar a disposición”.\nAyer, Bolatti hizo fútbol en espacios reducidos y compartió equipo con Pablo Heredia, Pier Barrios, Claudio Pérez, Guillermo Farré, Gabriel Alanis, Maximiliano Zárate e Iván Paz.\nSalvo Sergio Escudero, Zielinski tiene a todo su plantel a disposición, por lo que es probable que no haga variantes. La “B” volverá a trabajar hoy por la mañana en el predio.\nDespertando al Gigante. Se siguen sumando aportes para la remodelación del estadio de Belgrano. Hasta ayer, se habían recaudado 324.800 pesos. Hoy, por la mañana, asistirá a la sede a oficializar su aporte el campeón mundial de automovilismo José María López, fanático del Pirata.\nValencia. El delantero colombiano quedaría desvinculado hoy de Independiente, que debe liberar un cupo de extranjero para sumar al uruguayo Cristian Rodríguez. En Belgrano interesa, pero se iría a Atlético de Rafaela.\n25350 usuarios registrados | Conectados: 1604


La importancia del tiempo - Juan Marín Pozo\nEstamos demasiado preocupados del dinero pues con él compramos productos y servicios, pero nos olvidamos frecuentemente de la importancia que tiene nuestro tiempo en la vida.\nTu tiempo, normalmente, es el que determina tu nivel de ingresos y eso….es un error.\nComo alguna vez he explicado, en mi época de empresario «tradicional» gané 21.000€ en mi mejor mes, casi el doble de lo que ganaba en un año un tiempo atrás, trabajando en una fábrica.\nDe todos modos, mi mejor momento fue sin duda en el que gané 60.000€ pero solo trabajé 20 días en todo el año.\nTodavía no había pensado de la importancia del tiempo, pero ya lo disfrutaba. Iba a esquiar los martes, a la estación de sky más pequeña de la provincia, pero que se presenta enorme cuando es solo para ti y pocas personas más.\nRecuerdo la anécdota de dejar una botella de cava enterrada en la nieve, arriba de las pistas, con dos copas, y disfrutar de ese momento de tener «el mundo a tus pies» y sentarnos un ratito a disfrutar cada vez que llegábamos a la cima.\n¿Esto es ser rico?\nRecuerdo cuando años atrás iba a esquiar los domingos. Realmente no esquiaba, hacía colas en los remontadores, y apuraba el día hasta que cerraban las pistas, mientras que cuando iba a esquiar los martes, al mediodía ya volvía para casa, harto de esquiar.\nLa verdad es que no, puesto que el pase a pistas es más barato entre semana y gastas menos combustible porque no hay retenciones hasta la estación. Y todo esto sin contar que aparcaba al lado del telesilla, lo cual ahorra tiempo y permite disfrutar más rato de las pistas.\nSí, para disfrutar de la vida, no solo del dinero; pero hazte la siguiente pregunta:\nSi dejases de dedicar tiempo a ganar dinero…¿éste seguiría llegando a tu bolsillo?\nSi es así, tienes el mismo problema que tenía yo, que cuando tuve que pasar por una operación importante y estar un año «fuera de juego» dejé de ingresar dinero y esto, añadido a que yo era un «gastador compulsivo» me llevó a la ruina.\nEs por eso que tienes que crear activos, aquello que te dé dinero aunque no dediques tiempo, porque entonces podrás disfrutar de la vida como te mereces.\nPara acabar, y como prueba de lo que te he explicado, te dejo un mensaje en Facebook de uno de mis contactos, que no hizo más que reforzar que lo importante es el tiempo. Yo no voy a buscar a mi hija al colegio; mucho mejor, yo tengo la opción de hacerlo.\n¿Que harías si tuvieras tiempo? Debes crear activos\n0 responses on "La importancia del tiempo"


Delitos de odio como bozal contra el discrepante - Minuto Crucial\nInicioEspañaDelitos de odio como bozal contra el discrepante\nDe la misma manera que Zara tiene sus «hit» de temporada, la política también tiene los suyos, y en la temporada otoño/invierno 2021/22 parece que vienen fuertes los «delitos de odio», que son muy versátiles y pegan con todo.\n¿Que la luz está más cara que el caviar iraní? Pues un delito de odio por aquí. ¿Que la deuda pública está más alta que mis aspiraciones a miss mundo? Pues otro delito de odio por allá y, además, no tienen ni que ser reales, una bicoca. Así han decidido desde el ejecutivo torear lo que tenemos encima, porque las encuestas no remontan, y si no hay soluciones habrá que entretener a la ciudadanía haciéndoles ver que todo el dineral empleado en miles de chiringuitos estatales está bien empleado solucionando esos graves problemas (aun siendo falsos) aunque ellos no tengan con que pagar sus facturas.\nPero vamos por partes, ¿Qué es un delito de odio? Pues esto es como todo, una cosa es la teoría y otra la práctica. En la teoría, los delitos de odio, regulados en el art. 510 del Código Penal son aquellos consistentes en una infracción o acto penal motivado por prejuicios contra una o varias personas por el hecho de pertenecer a un determinado grupo social. Pero en la práctica, son aquellos que diga la izquierda que lo son, sobre todo si pueden utilizarlos políticamente en su beneficio, pasando éstos al ostracismo cuando las tornas cambian y ya no les vienen bien. Así hemos llegado a un punto dónde lo importante no es el qué sucede, sino el quién lo comete y lo más importante, si les viene bien o no.\nAsí, no hay nada como señalar algo que no quieren oír como delito de odio, no hay ni que argumentar, basta con denunciar al que les molesta como incitador de odio para amordazarlo, verdaderamente es un plan sin fisuras, nadie puede discrepar de sus postulados sin ser denunciado por delito de odio, aunque luego en la realidad de los tribunales y no de los diferentes platós, eso quede en nada.\nLa izquierda, que ya tenía domesticada y pasando por el aro a la derecha con este tipo de subterfugios, ha visto un verdadero problema en Vox, que no tiene pinta de dejarse domesticar, y aunque en numerosas ocasiones se vale de ellos para crear cortinas de humo que tapen sus desastres, emitiendo en prime time horas y horas de este tipo de casos, la realidad es que es una china en su zapato, y a nadie pasa desapercibido el hecho de que intentan usar este tipo de casos, aun siendo falsos, para intentar ilegalizarlos.\nA la izquierda le traen sin cuidado los delitos de odio. Si de verdad le importaran velarían por todos los que suceden; ese chaval que se ve ridiculizado y vejado por hablar castellano en un colegio catalán, esas chicas a las que agreden por llevar una bandera española, ese joven gay al que pegan por ser de Vox, esas víctimas que tienen que aguantar como reciben con vítores a los asesinos de sus familiares… pero ahí no ven odio ninguno, y si se lo recuerdas, resulta que eres tú el que estás crispando.\nDelito de odio o cómo utilizar en mi beneficio lo que creo que me viene bien, obviando lo que va en mi contra. Éste y no otro es el verdadero significado de este tipo de delitos para la izquierda. La diferencia entre un delito de odio o la nada es simplemente los escaños que necesiten para seguir en el poder.


REconomy, una economía a escala humana | La Chispa\nREconomy, una economía a escala humana\nEl próximo 4 y 5 de septiembre tendrá lugar en Marbella el 1º Curso de REconomy organizado por el INtransition Marbella, donde se aportaran herramientas e ideas para que la comunidad dirigida la regeneración económica.\nLa Jornada se desarrolla de 13 a 21 hs en el Albergue Inturjoven Marbella ( ex Albergue África) a cargo de Inez Aponte y Jay Tompt, ambos de la Red Transition Network de UK (www.transitionnetwork.org) y al frente del proyecto Reconomy (www.reconomy.org) de Transition Totnes.\nEs la primera vez que este curso se imparte en España y forma parte de un programa de formación de INtransition Marbella con el fin de dotar a la población de herramientas que permitan un cambio local en materia de sostenibilidad, relocalización de la economía e incremento de la resilencia frente a las crisis actuales y futuras.\nAlejandro Orioli, impulsor de este movimiento a nivel local INtransition Marbella y Director de Arboretum Marbella, nos explica que REconomy es “desarrollar herramientas para ayudar a construir un nuevo tipo de la economía, basado en lo local, con un carácter mucho más social, humano y sostenible, donde nos estrechamos en la cooperación y no en la competencia. Durante el curso nos introduciremos en aspecto como la transformación de las empresas existentes y la creación de nuevas empresas, acorde a un nuevo modelo económico viable y que ya está funcionando en otros países. Un ejemplo de ello son las 20 empresas que dentro de REonomy facturan 3,5 millones de libras en Totnes”\nJay Tompt, facilitador de este curso, nos comenta que “nuestra idea es hacer la economía local más diversificada con mas participación comunitaria y cooperativo, y también mas tipos de negocios de bajo energía o energías limpias, proporcionan trabajos significativos y satisfaciendo las necesidades de la comunidad. Si puede hacer estos cambios, la economía seria más fuerte, resiliente, menso dependiente de los combustibles fosiles y subira el nivel de vivir bien (well being)”.\n“Para el caso de Marbella, una ciudad donde sus ingresos son tan dependientes del turismo está claro que las consecuencias frente a este escenario y a una crisis de incremento del precio de los combustibles, sería de gran impacto negativo.\nPero, si la economía es mas auto suficiente y diversificada, especialmente si no dependería de un sector o de un sector tan vinculado a los precios de petróleo más bajos, sería mucho mejor. En Totnes (UK), el turismo es un sector muy grande en nuestra economía, por eso, estamos trabajando en hacer más fuerte y más elástico otras sectores importantes como agricultura, reparación y restauración de viviendas, energías renovables y cuidado de salud”, así concluye este líder verde involucrado en una serie de iniciativas de desarrollo económico y empresas sociales.\nA través de ejercicios interactivos y discusiones de grupo se explorará:\n• Cómo las “necesidades humanas fundamentales” pueden informar a los proyectos y a las empresas de los pasos a seguir para beneficiar a la comunidad.\n• Nuevas formas de articular el valor económico.\nSe buscara desarrollar una perspectiva más amplia sobre quién o qué es una economía local y para que debe servir, descubrir una nueva forma para comunicar el valor del trabajo, y aprenda a usar una serie de nuevas herramientas para crear un cambio positivo en la comunidad.\nINEZ APONTE es un educador, activista y narrador. Su trabajo actual aúna sus intereses creativos con las teorías de la evolución social y la complejidad de los medios para crear un cambio social.\nTambién es directora de Big Green Canoe (www.biggreencanoe.org) y es un monitor acreditado de Transition Network (www.transitionnetwork.org). Fue miembro de Transition Bristol, una de las primeras iniciativas\nde Transición. Licenciada en Bellas artes y a trabajado en proyectos de comunicación con organizaciones como WWF, The British Council y la Soil Association.\nJAY TOMPT, escritor y activista. Su trabajo actual se centra en la vinculación de nuevos enfoques teóricos de la empresa y de la comunidad dirigida a una regeneración económica por medio de acciones prácticas.\nTambién está involucrado en una serie de iniciativas de desarrollo económico y empresas sociales, incluyendo el Proyecto REconomy (www.reconomy.org) , Transition Town Totnes (www.transitionfreepress.org), Transition Free Press (www.transitionfreepress.org), Big Green Canoe, y consultoría William Green & Associates. Jay fue co-fundador y vicepresidente del Plan-It Hardware ™, el primer distribuidor integral de productos de ética independiente en la industria de mejoras para el hogar EE.UU. Él también tiene un MBA del Monterey Institute of International Studies y BA en Filosofía por la San José State University.\nHorario: 13 – 21Hs\nLugar: Albergue Inturjoven Marbella ( Av. Trapiche 2 – Ex Albergue Africa)\nInformación e inscripción: www.intransitionmarbella.org


¿Que es la gracia? - DESENMASCARANDO LAS FALSAS DOCTRINAS - Gabitos\nGeneral: ¿Que es la gracia?\nFrom: BARILOCHENSE6999 (Original message) Sent: 16/06/2011 01:10\nHay un tema que si bien es importante, a mi juicio le han dado un realce con muy pocos fundamentos y me refiero a la “Gracia”. La palabra Gracia es uno de los pilares del cristianismo e incluso en la óptica de éste se ve como toda una época, situación que no la compartimos en la sinagoga Bet Haderej por lo que trataré de transmitir una óptica que merece ser puesta a su escrutinio ya bien sea para que la comparen con lo que creen y cambien su parecer, o bien busquen argumentos que corroboren sus creencias pero dichos argumentos deberán tener un sustento Escritural y nunca tan solo racionales.\nMucho se habla al respecto de la “Gracia” por lo que debería ser un tema dominado por todos, sin embargo te pregunto ¿Podrías definirla? O te vuelvo a preguntar ¿Crees que tu concepto de gracia concuerde con la de tu rabino, pastor o bien las personas que asisten a tu congregación? Yo creo que no, y te lo puedo comprobar invitándote a que preguntes la definición de Gracia a las personas cercanas anotando sus definiciones y comparándolas con la tuya ¿Qué te parece?\nNo cabe duda que la tan llevada y traída Gracia se ha tomado como bandera por todos aquellos que enseñan o son enseñados al respecto de que la ley ya no esta vigente, sin embargo estoy seguro que la gente que así lo enseña no lo dedujo por cuenta propia sino que lo mas probable es que así lo aprendió de otros, en realidad detrás de lo anterior no existe problema alguno, sino que el problema radica en no darte la oportunidad de cuestionar lo que haz aprendido, máxime que cada uno de nosotros no nada mas le debemos fidelidad a nuestra congregación sino sobre todo se lo debemos a la verdad ya que detrás de la verdad estará siempre el Eterno y si nos privamos de cuestionar nuestros conocimientos en realidad le estamos siendo infieles al Eterno.\nNoaj – Conocido por algunos como Noé, éste varón vivió en una época de las más difíciles de la historia de la humanidad, ya que se considera que será semejante a la generación que prevalezca con el retorno del Mashiaj –Mesías-, su entorno de Noaj hacía que para él fuera difícil mantenerse en integridad, pero no obstante de ello lucho para no contaminarse y fue justamente en esa lucha cuando halló Gracia delante del Eterno.\nGenesis 6:5 Vio Hashem que la maldad de los hombres era mucha en la tierra, y que todo designio de los pensamientos de su corazón solo era de continuo el mal; 6y se arrepintió Hashem de haber hecho al hombre en la tierra, y le dolió en su corazón. 7 Por eso dijo Hashem: «Borraré de la faz de la tierra a los hombres que he creado, desde el hombre hasta la bestia, y hasta el reptil y las aves del cielo, pues me arrepiento de haberlos hecho». 8 Pero Noé halló gracia ante los ojos de Hashem.\nSi leíste con detenimiento pudiste observar que las personas contemporáneas de Noaj era malas, pero él dentro de sí sabía que eso no era lo correcto y trato de luchar contra corriente, él se esforzó por ser justo, tan es así que lo corrobora la Torah –mal traducida como Ley- más adelante:\nGénesis 6:9 Estos son los descendientes de Noé: Noé, hombre justo, era perfecto entre los hombres de su tiempo; caminó Noé con Elohym.\n¿Qué significo el que Noaj hallo gracia del Eterno? El compadecimiento de Hashem como consecuencia del recto caminar de Noaj no obstante su entorno.\nGénesis 7:1 Dijo luego Hashem a Noé: «Entra tú y toda tu familia en el arca, porque solo a ti he visto justo delante de mí en esta generación.\nPor causa de esa Gracia Noaj no solo se salvo él, sino le alcanzo también para su familia. Noaj es un perfecto ejemplo de lo que es la Gracia.\nOtro buen ejemplo de la gracia es el caso de Yoséf –José- que fue un varón que se esforzó por hacer lo justo delante del Eterno y por causa de ello pago un alto precio, recordemos que por causa de no tener intimidad con la esposa de Potifar fue acusado por ésta y lo mandaron a la carcel, él hizo lo recto pero pago un precio por ello, sin embargo Hashem le dio su gracia que se extendió para con aquellos que estaban en liderazgo sobre él:\nGenesis 39.21 Pero Hashem estaba con José y le extendió su misericordia, y le dio gracia en los ojos del jefe de la cárcel.\nCon los dos ejemplos anteriores entendamos que el actuar justamente hace que atraigamos la Gracia de Hashem y me da oportunidad a transmitirte lo siguiente: Nosotros alcanzamos el Olam Haba –Mundo venidero- por cuanto hicimos lo justo, le creímos al Eterno al respecto del Mesías, por lo que ese sencillo acto sin obras redundo en que alcanzamos Su gracia, pero una vez que la alcanzamos debimos dar muestra de nuestra justicia cambiando nuestra vida, demostrándolo con las obras de justicia que son características de todo hijo del Eterno. Mas adelante complementare esto que escribo.\nLa gracia no viene nada mas de parte del Eterno sino que cualquier persona la puede otorgar y lo pude corroborar al darme cuenta que aproximadamente el 85% de las veces que aparece la palabra Gracia viene acompañada por la frase “en tus ojos” lo que de alguna manera nos demuestra parte de la definición que con anterioridad expuse ya que esa Gracia tiene mucho que ver con hallar el favor de una persona. Leámos algunos ejemplos de ésto:\nVolvamos a leer la definición de Gracia:\nGenesis 34.11 Siquem también dijo al padre de Dina y a los hermanos de ella: Halle yo gracia en vuestros ojos, y daré lo que me dijereis.\n¿Quién creó la gracia? El Eterno, y es un atributo que transmitió a los hombres para que la ejercieran y cuyo epítome es precisamente nuestro amado Yehoshua Hamashiaj, sin embargo entendamos que no fue Yehoshua el que la dió, sino que el que la dió fue nuestro Padre:\n1 Pedro 5.10 Mas el Elohym de toda gracia, que nos llamó a su gloria eterna en Yehoshua Hamashiaj, después que hayáis padecido un poco de tiempo, él mismo os perfeccione, afirme, fortalezca y establezca.\nDebido a no entender lo anterior teológicamente se ha enseñado que existen dos periodos el periodo de la Ley y el periodo de la gracia, ¿Pero acaso eso será verdad?\n¿Cuál ha sido el sustento teológico para tal paradigma? Esta basado en un pasuk del libro de Yojanan:\nJuan 1:17 Pues la ley por medio de Moisés fue dada, pero la gracia y la verdad vinieron por medio de Yehoshua Hamashiaj.\nTe invito a que leas varias veces el anterior pasuk, si ya lo hiciste te pregunto ¿Dice ahí que existen dos periodos? Resulta increíble que tanto se enseñe al respecto de periodos en la Escritura y ni siquiera al español exista tal término.\nPor supuesto que Yojanan –Juan- no habla al respecto de periodos, y desde luego no habla al respecto de los autores ni de la Torah o como está al español Ley y desde luego tampoco de la gracia ¿O si? ¿Dice en el pasuk que la gracia fue obra de Yehoshua y la Ley obra de Moshé? ¡NO! Sino que se encuentra una frase que denota algo importante y esta frase es: “por medio” del griego tradujeron al español esta frase de una preposición que es “Dia” y que significa “a través” por lo que bien puedo concluir que Moshé fue el medio que uso Hashem para demostrar Su voluntad por medio de la Torah al hombre y Yehoshua el medio para demostrar Su gracia al hombre ¿Te das cuenta?\nHashem dio la gracia y su manifestación perfecta fue Yehoshua, pero de ninguna manera existió un periodo de la Ley como se ha enseñado y por otro lado un periodo de la gracia, ya que esto imp\nFrom: BARILOCHENSE6999 Sent: 16/06/2011 01:14


Reglas para determinar si una imputación en redes sociales vulnera derechos fundamentales | Noticias jurídicas y análisis de nuevas leyes AMBITOJURIDICO.COM\nLa Corte Constitucional examinó la acción de tutela formulada por una ciudadana que buscaba la protección de sus derechos a la vida, a la seguridad e integridad personal, a la honra y al buen nombre. (Lea: ¿Puede el Estado ordenar “rectificar” una opinión?)\n- Suficientemente intensa para generar un daño en el patrimonio moral del sujeto.\n- Que la gravedad de la misma no depende en ningún caso de la impresión personal ni de la interpretación que este tenga de ella, sino del margen razonable de objetividad que permita al juez avizorar la lesión del núcleo esencial de los derechos a la honra y al buen nombre, lo cual ocurre cuando se endilgan delitos o conductas sancionables por el Derecho.\n- Cuando se atribuyen comportamientos que, sin ser estrictamente punibles, suelen tener un grado significativo de reproche social.\nLo anterior con el fin de que se adopten las medidas que garanticen su seguridad e integridad personal y, si hay lugar a ello, se promueva el proceso tendiente a verificar quién atenta contra sus garantías individuales. (Lea: Comienza el debate constitucional sobre los límites a la libertad de expresión en redes sociales)\nVisto 9724 veces\nVisto 8126 veces


Federer viene a México | La Voz de Tabasco\nEnviado el 19/07/2019 por La Voz de Tabasco en De Última Hora, Deportes\nSu majestad vendrá a México. Uno de los dos protagonistas de la histórica final de Wimbledon de este año, Roger Federer, estará disputando un partido por primera vez en su carrera en tierras aztecas. De acuerdo con información de Eduardo Varela, el tenista suizo se presentará en la Plaza de Toros México el 23 de noviembre para un duelo de exhibición. A pesar de que figuras de la talla de Rafael Nadal y Novak Djokovic se han presentado en nuestro país, para Roger Federer será su primera vez, luego de que lo han buscado para participar en el Abierto Mexicano, al menos, durante 10 años.\nSe lamenta Gio\nUna foto de Giovani dos Santos en estado de ebriedad durante un festejó navideño, ha marcado su carrera, es así como lo ve el nuevo refuerzo del América, quien recalcó que considera «injusto» que lo juzguen por un error que cometió a los 18 años de edad.\n«Creo es una injusticia grande en mi carrera, la gente habla más de una foto que pasó hace diez años que lo que he hecho en mi carrera como futbolista. Era joven, cometí un error, aprendí de eso y a partir de ese momento hay otro Gio», añadió\nDe Ligt ya es de la Juve\nYa es oficial. Matthijs de Ligt ficha por la Juventus de Turín. La operación se ha cerrado y el jugador holandés pondrá rumbo a Italia para hacerse un hueco en la ‘Vecchia Signora’. El central estuvo muy cerca de fichar por el Barcelona, pero finalmente se ha decantado por el equipo que él mismo dejó fuera de la Champions League con un gol de cabeza en los cuartos de final a la salida de un córner.


Documentales Mokete: Hidrógeno, el combustible verde que podría salir al mercado dentro de tres años\nHidrógeno, el combustible verde que podría salir al mercado dentro de tres años\nInvestigadores de EE.UU. han logrado obtener grandes cantidades de hidrógeno a partir de plantas. Su método, más barato y menos contaminante que los que se han probado hasta la fecha, podría empezar a emplearse comercialmente dentro de tres años.\nLa extracción de hidrógeno a partir de cualquier planta podría ayudar a poner fin a nuestra dependencia de los combustibles fósiles, ya que el hidrógeno es uno de los biocombustibles más importantes de cara al futuro, señaló Percival Zhang, profesor adjunto de ingeniería de sistemas biológicos de la universidad estadounidense Virginia Tech, quien lideró esta investigación.\nAunque hasta ahora era solo posible en teoría, el equipo de científicos logró producir hidrógeno a partir de la xilosa -el azúcar simple de origen vegetal más abundante del mundo- y, según Zhang, el método puede aplicarse a cualquier fuente de biomasa.\nAdemás, al contrario que otros métodos ya probados de producción de hidrógeno, el que propone Zhang apenas emite gases de efecto invernadero. Asimismo, usa recursos naturales renovables.\nZhang y su equipo se muestran optimistas y consideran que dentro de tres años este tipo de combustible podría llegar al mercado. Una opinión que también comparte Jonathan Mielenz, director de la Sociedad de Microbiología y Biotecnología Industrial del Laboratorio Nacional Oak Ridge, en el estado de Tennessee. Este experto en biocombustibles, familiarizado con el estudio de Zhang pero no afiliado a este proyecto, asegura que este descubrimiento podría ser muy relevante para la producción de energía alternativa.\n"La clave de este revolucionario invento es que Zhang utiliza el segundo tipo de azúcar más frecuente en las plantas para producir hidrógeno", aseguró, citado por el portal de la universidad Virginia Tech. "Esto reduce el coste total de producción del mismo", agregó.\nLa investigación fue publicada en la revista científica 'Angewandte Chemie'.\nPublicado por Mokete en 7:28 AM\nDemen sus opiniones de este ducumental o cualquier inquitud .\nLa más bella historia jamás contada : Hubert Reeves\n0. Índice 1 1. Resumen del libro 1.1 Acto 1 - El universo 2 1.1.1 Escena 1. El caos 3 1.1.2 Esc...\nCinco frases de Einstein sobre la relatividad\nUn día como hoy, concretamente el 20 de marzo de 1916, Albert Einstein formuló su teoría de la relatividad. Estas son cinco frases inteli...\nCerebro: El último enigma\nLa máquina más asombrosa de la naturaleza y el mayor reto al que se enfrenta la ciencia es una pequeña masa de células nerviosas de apenas k...\nUn científico iraní inventa una 'máquina del tiempo' que no te lleva al futuro: te lo trae Un científico iraní afirma haber dom...\nUna campaña con niños armados retrata la absurda legislación de armas de EE.UU.\nUna campaña con niños armados retrata la absurda legislación de armas de EE.UU. Una organización estadounidense que lucha por un mayor ...\nMantis, el 'robot araña' todoterreno más grande del mundo\nMantis, el 'robot araña' todoterreno más grande del mundo Tras cuatro años de arduo trabajo, un equipo de ingenieros ha logrado cr...\nLos secretos de universo con Morgan Freeman\nLos secretos de universo con Morgan Freeman: 1- Que ocurrio antes del principio? Los secretos de universo con Morgan Freeman: 2- Estamos s...\nUn agujero negro absorbe un planeta 15 veces mayor que Júpiter\nUn agujero negro absorbe un planeta 15 veces mayor que Júpiter Un grupo de astrónomos capó el momento en que un planeta quince veces mayo...\nUna nueva investigación sugiere que los neandertales tenían una visión más aguda y cuerpos más grandes que sus primos humanos de la tempr...\nUna esclava moderna es devuelta a sus 'dueños' por la Policía británica\nUna esclava moderna es devuelta a sus 'dueños' por la Policía británica Una mujer hindú esclavizada en el Reino Unido fue compl...


Malaxunta: Indugraf convoca a un plenario abierto\n(AW) Los trabajadores de Indugraf llaman, para este sábado, a participar de un plenario abierto. Este acto, será una muestra de solidaridad con quienes están defendiendo sus puestos de trabajo; pero también, será una forma de fortalecer la lucha y de buscar nuevas acciones.\nBuenos Aires, lunes 26 de enero, (Trabajadores de Indugraf) Los empleados de Indugraf están luchando hace más de un mes para conservar sus puestos de trabajo, ya que los dueños de la empresa abandonaron las instalaciones dejando a la deriva a 88 familias.\nPara dar un mayor impulso a nuestra lucha, debatir y resolver nuevas iniciativas de acción, llamamos a todas las organizaciones sindicales, barriales y políticas, a las personalidades del campo de la cultura y de los derechos humanos, a todos aquellos que se sientan consustanciados con las reivindicaciones obreras a un gran PLENARIO ABIERTO EL PRÓXIMO SÁBADO 31 DE ENERO A LAS 17 HORAS en la puerta de la planta.\nSachez de Loria 2251. Pque Patricios (C.A.B.A.)


curso online o presencial google ads archivos - Martin Formenti\ncurso online o presencial google ads\n✅ ¿Cuál es el mejor curso de Google Ads para mí? 6 recomendaciones + BONUS final [Actualizado 2021]\n21 diciembre, 2020victorBlog\n6 recomendaciones para elegir el mejor curso de Google Ads en 2021 Introducción – ¿Qué hay que tener en cuenta para elegir el mejor curso de Google Ads? Elegir un curso de Google Ads no es tarea fácil. Existen muchas opciones de cursos de Google Ads en Internet. Muchos de los profesores que imparten...


Espero que nos conozcamos prontísimo\nChicas Girona | 27-08-2021\nTenemos temores más que absurdos con respecto a ciertas s de nuestro organismo. Exactamente la misma mujer que agrada morder el pulgar de su amante en las aproximaciones anteriores a la concreción del acto, rechaza después de plano, en una típica reacción histérica, practicar el sexo oral. El varón que, experimentado, sabe que durante el beso el hecho de morder suavemente uno de los labios de la mujer la predispone más que efectivamente para la relación, quizás evite buscar bucalmente la entrepierna de ella. Esto es consecuencia, como ya indicara en la Introducción, exclusivamente de una deformación cultural. El pene es tan de nuestra anatomía como una oreja, y en verdad no es más sucio que esta. Observen ustedes el comportamiento propio de los hombres cuando ingresan a un baño a orinar; cumplen su necesidad y después se lavan las manos. Si observan con atención, entenderán que éste es un comportamiento absurdo. Las manos son mucho más sucias que el pene, en tanto que están de forma permanente en contacto con todas y cada una de las\nOir qué duda cabe, puede suministrar placer. Por eso amamos la música. De ahí que nos agrada oir el sonido de las olas rompiendo sobre los acantilados, o el canto del ruiseñor, o bien el rumor del viento al enredarse en las hojas de los árboles. Bach no habría pasado a la historia si el acto de escuchar no diera placer. Cuando llega su acompañante, él o ella puede llamar a la agencia para informarles que llegaron con seguridad, y puede hacer o bien recibir llamadas a lo largo de o después de la sesión por seguridad. Todas y cada una de las s serán cautelosísimas en las etapas iniciales del encuentro; la trabajadora sexual deseará cerciorarse de que no sea un agente de policía, y querrá saber lo mismo. Como los agentes de policía en general no pueden quitarse la ropa, desnudarse puede ser una buena manera de disipar los miedos de todos. En todos y cada uno de los casos, jamás se le permite al acompañante decir que va a tener relaciones sexuales por dinero, y jamás debe decir que va a pagar por actos sexuales de ningún género. Si bien esto suena como una forma complicada de negociar su sesión, sepa que puede ser más concreto cuando se haya quitado la ropa y se haya intercambiado dinero (a menudo denominado punta o donación).\nPruébalo ahora mientras que lees esto. Tu piso pélvico está apretado pero el resto de tu cuerpo está relajado. Conforme practica esto con regularidad y el músculo de su ordenador se fortalezca, podrá distinguirlo de los músculos cercanos. En las etapas anteriores, no se preocupe por esto, solo apriete y suelte todos y cada uno de los músculos en el área del piso pélvico, incluyendo el ano y las nalgas. Continuar apretando y soltando múltiples veces. Muy rara vez hallarás en una mujer tan joven las cualidades como amante que posee Michelle. Te dejará sin palabras, y el disfrute y placer que te va a hacer sentir marcarán un nuevo límite que difícilmente se va a ver superado. Llama a su agencia para descubrirla.\nHazlo aplicando una pequeña cantidad de cera sobre un pequeño trozo de piel\nLos besos sirven para generar conexión, debido a la implicación sensible que se genera, ya que no besamos a todo el mundo. Por eso es recomendable por lo menos darte un pequeño beso de despedida si terminas de conocer a la chica de compañía para que así, cuando la escribas para quedar con ella, sea más probable que eso se genere. Sin tensión en la comunicación, Jenny creyó que no había posibilidad de una relación de amor profunda. No obstante, cuando ella entiendió sus fantasmas, decidió buscar en otras áreas de compatibilidad. se sumergió en el autoanálisis y pudo determinar docenas de otros criterios esenciales para el desarrollo de una conexión en su relación de pareja.\nBastantes personas creen que las opciones para gozar sexualmente de su cuerpo son limitadas. La realidad es que esta clase de contacto sexual requiere de imaginación, curiosidad y también inventiva. De la misma manera que cualquier otro tipo de contacto sexual, las posibilidades de explorarlo son amplísimas. Esencialmente, se trata de intentar estar al loro y percibir lo que tocamos a través de los dedos, así sea directamente, o bien intuyéndolo. Es preciso tener los dedos y las manos muy relajados. El pulgar es el dedo que más trabaja; debes ser capaz de transmitir energía a través de una presión directa sobre el punto que interesa por medio de la yema del dedo, y manteniéndolo en horizontal, sin doblarlo. La intensidad de la presión va a depender de la sensibilidad del punto que se toca. Sin llegar a sentir dolor, se debe sentir el punto que tocamos, aun en ocasiones, como una ligera molestia, próxima al dolor.\nLa impresión de asistir a alguien más cuando está muy necesitado es muy fuerte para ti, de forma similar aumenta la huella mental cuando haces algo para quien te ha dado mucha ayuda o alguien que tiene una carácter persona inusual. You see, one of the things I’ve noticed over the years is that many students of this field are collectors. They’ve got stuff from me, stuff from a bazillion imitators and impersonators, they are seminar junkies, product junkies ect but…They Don´t Fucking Do Anything Whit It! Un gran porcentaje de mujeres tiene predilección por: Zapatos, peinado, ropa, bolsos, joyas y maquillaje. Observe a su ex pareja y realce alguno de sus complementos a través de un impacto negativo (Paso4 Pág.91). Utilice esta estrategia una sola vez durante la cita. Intente recordar en que aspecto su ex pareja acostumbraba a poner más empeño cuando estaban juntos y también intente abordarla por esa vía.\nEjercicios pélvicos de pie y piso 4 series de 10 por cada uno\n¡Un suspiro! Es el tiempo que precisamos para advertir en los rasgos faciales si una persona está satisfecha con su físico. Los gestos de coqueteo y cualquier expresión positiva de alguien que se agrada son suficientes para despertar interés sexual en el sexo contrario. Da igual que su belleza entre o bien no en los cánones. La seguridad es una cualidad muy seductora. Aprovechémosla en lugar de volvernos tan justicieros con nosotros mismos. Mis socios me afirmaron que deseaban coger una casa rural para que todos y cada uno de los del curro fuéramos allá, a Huesca, por entonces, mi otro asociado se acababa de echar una churri, y no le interesaba que fuera mucha gente, argumentaba que no había habitaciones suficiente, mientras que el hombre salvaje, animaba a que se lo dijera a pero gente, mi racional decidió hacer caso a mi otro socio, y no se lo dije a todos, así que, se lo dije a los más allegados , a mi queridísimo compañero Des, al final ,los otros compis no pudieron, con lo que, por último fuimos , la nueva churri de mi asociado, Des y yo.\nSoy Bianca, una mulata de impresión\nRespuesta: El diafragma es un disco o aro de goma que la mujer se pone en la vagina cubriendo la entrada del útero para evitar que los espermatozoides entren en este. La tensión flexible del aro deja que el diafragma se ajuste y se sostenga en situación. El masaje Lingam es un masaje concreto para hombres. En tantra, el lingam es el nombre para el pene. Viene del sánscrito y significa ‘varita de luz’. Al igual que con otros masajes, se utiliza aceite, y posiblemente desees utilizar un aceite comible como el aceite de coco o bien aceite de oliva singularmente si el masaje probablemente conduzca a las relaciones sexuales. Si bien el masaje tántrico no necesariamente da sitio a relaciones sexuales, con frecuencia es el caso de que un masaje de lingam o yoni va a conducir al sexo. Mientras veían las fotografías, a las mujeres se les hicieron seis preguntas como ¿Con quién escogerías casarte? y Con qué hombre te agradaría tener una cita, hasta una pregunta bastante sorprendente (considerando que fue de un respetado estudio universitario), ¿A quién elegirías por una sola vez, rodar en el heno?\nEn el peor de los casos, puedes moverte un poquito si vas a colisionarte con alguien\nPuede hacerlo acostarse de espaldas y extender las piernas, o ponerse a 4 patas por usted (con quien sea más cómodo). Es una buena idea calentarlo con un dedo o con un consolador pequeñísimo. Aplica generosamente el lubricante y ve muy lento. Presione cara abajo el pliegue del ano y deslice su dedo o bien el juguete hacia adentro, poco a poco. Emplea exactamente los mismos movimientos lentos que van cara su ano al salir. Verdaderamente no debería sentir ningún dolor, solo presión (y, con suerte, placer). Tanto los hombres como las mujeres pueden disfrutar al penetrar analmente con los consoladores de ventosas de la misma manera que se describe aquí. ¡Ve lento, en tanto que los consoladores son bastante grandes! Recuerde, si emplea un consolador para el juego anal, asegúrese de que tenga una base acampanada y use mucho lubrificante.\nEcíamos ya antes que nos guiamos por las preguntas que hemos recibido en años de trabajo profesional en tareas asistenciales, docentes y de difusión, recogiendo de la propia gente las dudas, temores e incertidumbres, y no hemos agregado ninguna (aunque pudimos haberlo hecho) de nuestra creatividad. Por esto es que quizá los lectores encontrarán ausencias, reiteraciones o bien sobreabundancias. Del mismo modo hemos respetado los nombres y edades, la sintaxis y construcción de las preguntas, puesto que hemos querido que reflejaran el modo de hablar en nuestro medio. Para las mujeres es todo lo contrario, tratan de compartir su amedrentad y tener relaciones íntimas con quien comn química y sentimientos, muy pocas mujeres se acuestan con hombres que no les atraigan físicamente o no tengan sentimientos por el medio.\nEl amante secreto se detuvo para mirarla, envolviéndola a toda ella para sostenerla suya. Jugueteando, hurgando a fin de enterarse si verdaderamente su divina amante estaba allá, si ella deseaba proseguir. En este juego de lo sexual a través del cine, tv e internet hay además envuelto una temática de seducción sensacionalista que expone la infidelidad, la tracción, los crímenes por celos, los abusos sexuales, el sexo ligado a la violencia y a las emociones fuertes. En conclusión, amar demasiado no significa amar a demasiados hombres ni enamorarse con demasiada frecuencia. Para Robin Norwood amar demasiado consiste en ofuscarse con la pareja y confundirlo con amor auténtico. Estas son relaciones basadas en el miedo a estar solas, miedo a no ser dignas, a ser ignoradas, abandonadas o bien a no inspirar cariño. Si es tu situación, puedes estar en un serio problema y necesitas ayuda profesional.


Recibe el solsticio con mandalas | Mujer Mandala\n“El verano está asociado al elemento fuego que se relaciona a la acción, el liderazgo y el principio masculino.\nEl elemento fuego también es un símbolo de transmutación y purificación, son muy conocidos los rituales con fuego para quemar lo que no deseamos en nuestras vidas y darle espacio a lo nuevo. El fuego es una de las fuentes de energía más importante del mundo generando calor y luz.\nEl verano es una gran oportunidad de encender nuestro fuego interno, de disfrutar del calor y la luz que nos brinda la naturaleza. Los días son más largos brindándonos la oportunidad de disfrutarlos al máximo, salir de casa y ponernos en movimiento. Es una época de alegría y entusiasmo, de emprender grandes aventuras, de compartir con la familia y los amigos.\nEnciende este año el fuego de la pasión en tu vida y atrévete a realizar tu sueño más anhelado con la energía y la luz que te brinda la naturaleza en esta época. Siente la alegría de vivir honrando a la vida con gratitud infinita. Hoy agradece lo que tienes, lo que aun no has logrado y las oportunidades maravillosas que el Universo tiene destinado para ti.”\nGisela García. Fragmento de la Agenda Los 4 Elementos.\nDescarga el mandala del elemento fuego\nEn un instagram live, previo al solsticio, daremos claves para conectar con tus deseos y tu ser profundo mediante un mandala que vamos a colorear juntas. Así que descarga el dibujo y únete a la transmisión, para conocer las instrucciones. No olvides imprimirlo y traer colores.\nCuándo: miércoles 20 de junio\nA qué hora: 23 hs España / 17 hs Miami – Caracas\nDónde: En las cuentas de instagram de @mujermandala @giselamandala\nGisela García, coordinadora de la Formación de Orientadores Psico-espirituales a través del Mandala; además, tiene varios años editando la agenda creativa y un maravilloso primer libro de arteterapia: VIAJE INTERIOR CON MANDALAS.\nLaura García\tel 19 junio, 2018 a las 5:36 pm\nDeseo recibir información sobre las formaciones en línea y recibir el Mandala para el solsticio de verano


Cristianismo Místico Rx. apresura Triunfo de Cristo: Juan Salvador Gaviota\n(Por Richard Bach)\nAprendió que un picado aerodinámico a alta velocidad podía ayudarle a encontrar aquel pez raro y sabroso que habitaba a tres metros bajo la superficie del océano: ya no le hicieron falta pesqueros ni pan duro para sobrevivir. Aprendió a dormir en el aire fijando una ruta durante la noche a través del viento de la costa, atravesando ciento cincuenta kilómetros de sol a sol. Con el mismo control interior, voló a traves de espesas nieblas marinas y subió sobre ellas hasta cielos claros y deslumbradores... mientras las otras gaviotas yacían en tierra, sin ver más que niebla y lluvia. Aprendió a cabalgar los altos vientos tierra adentro, para regalarse allí con los más sabrosos insectos.\n-Puedes ir al lugar y al tiempo que desees -dijo el Mayor-. Yo he ido donde y cuando he querido. -Miró hacia el mar-. Es extraño. Las gaviotas que desprecian la perfección por el gusto de viajar, no llegan a ninguna parte, y lo hacen lentamente. Las que se olvidan de viajar por alcanzar la perfección, llegan a todas partes, y al instante.\nRecuerda, Juan, el cielo no es un lugar ni un tiempo, porque el lugar y el tiempo poco significan. El cielo es...\n-Bueno, claro que resultó, Juan. Siempre resulta cuando se sabe lo que se hace. Y ahora, volviendo al tema de tu control... Cuando volvieron, había anochecido. Las otras gaviotas, miraron a Juan con reverencia en sus ojos dorados, porque le habían visto desaparecer de donde había estado plantado por tanto tiempo.\nQuizás hasta hubiera un Exilado por haber dicho la verdad ante la Bandada. Y mientras más practicaba Juan sus lecciones de bondad, y mientras más trabajaba para conocer la naturaleza del amor, más deseaba volver a la Tierra. Porque, a pesar de su pasado solitario, Juan Gaviota había nacido para ser instructor, y su manera de demostrar el amor era compartir algo de la verdad que había visto, con alguna gaviota que estuviese pidiendo sólo una oportunidad de ver la verdad por sí misma.\n-Adiós, Rafa. Nos volveremos a ver. -Y con esto, Juan evocó en su pensamiento la imagen de las grandes bandadas de gaviotas en la orilla de otros tiempos, y supo, con experimentada facilidad, que ya no era sólo hueso y plumas, sino una perfecta idea de libertad y vuelo, sin limitación alguna. Pedro Pablo Gaviota era aún bastante joven, pero ya sabía que no había pájaro peor tratado por una Bandada, o con tanta injusticia.\n-Intentémoslo juntos ahora, en formación. Y concéntrate en ese encabritamiento. Es una entrada suave, fácil. Al cabo de tres meses, Juan tenía otros seis aprendices, todos Exilados, pero curiosos por esta nueva visión del vuelo por el puro gozo de volar.\nDía a día aumentaba la muchedumbre que venía a preguntar, a idolatrar, a despreciar. -Dicen en la Bandada que si no eres el Hijo de la misma Gran Gaviota -le contó Pedro a Juan, una mañana después de las prácticas de Velocidad Avanzada-, entonces lo que ocurre contigo es que estás mil años por delante de tu tiempo.\n-Eso ya es algo -dijo Juan, girando para planear invertidamente por un rato-. Eso es algo mejor que aquello de anticiparnos a nuestro tiempo. Ocurrió justo una semana más tarde. Pedro se hallaba explicando los principios del vuelo a alta velocidad a una clase de nuevos alumnos. Acababa de salir de su picado desde cuatro mil metros -una verdadera estela gris disparada a pocos centímetros de la playa-, cuando un pajarito en su primer vuelo planeó justamente en su camino, llamando a su madre. En una décima de segundo, y para evitar al joven, Pedro Pablo Gaviota giró violentamente a la izquierda, y a mas de trescientos kilómetros por hora fue a estrellarse contra una roca de sólido granito.\n-Como todo, Pedro. Práctica. A la mañana siguiente, la Bandada había olvidado su demencia, pero no Pedro.\nY aunque intentó parecer adecuadamente severo ante sus alumnos, Pedro Gaviota les vio de pronto tal y como eran realmente, sólo por un momento, y más que gustarle, amó aquello que vio. ¿No hay límites, Juan?, pensó, y sonrió.\nSu carrera hacia el aprendizaje comenzaba...\nOración Padre Nuestro Para Librarnos de Tanta Mald...


Integramos el grupo de investigaciòn Huellas, estamos interesados en intercambiar saberes con estudantes, relacinados con los diferentes àmbitos del tema: Dignidad Humana. Etiquetas:\nVínculo permanente Respuesta de daniela bernardez el marzo 26, 2011 a las 9:07am hemos intentado en mi escuela trabajar con los corrreos electrónicos de los alumnos pero parece ser que este medio ya esta perimido. ellos prefieren las redes sociales y es una escuela de nivel primario\nVínculo permanente Respuesta de Reina Cortellezzi el abril 4, 2011 a las 6:36pm Por supuesto que las redes son mucho más efectivas, además puedes crear un grupo dentro de la red donde estos niños se encuentran registrados y desde allí trabaja. Es enriquecedor, además puedes anexar todos los materiales. Más aún, en Uruguay sucede que ingresan a la red y han olvidado hasta la contraseña del correo electrónico. Todo está allí, hasta lo afectivo. Demás está decir que hay mucho para cuestionar. Debemos enseñarles a trabajar de la forma más segura posible.\nVínculo permanente Respuesta de Reina Cortellezzi el abril 4, 2011 a las 6:33pm Hola. es un placer saber de este trabajo. Tuve una experiencia similar y realmente fue todo un éxito. Sólo que el intercambio lo realizamos entre estudiantes de dos escuelas con niveles diferentes.\nVínculo permanente Respuesta de JULIA RUIZ PEREZ el mayo 8, 2011 a las 4:11pm Hola Ana, te cuento que yo como docente de Ciencias Sociales, utilizo mucho los correos de que manera: en el guardo mucha informacion que quiero que no se me pierda, ademas, para las exposiciones que les coloco a los estudiantes, les sugiero que la preparen en power point, y ellos me las jiran al correo, desde alli, cuando llega el dia de la socializacion, abrimos y descargamos el archivo adjunto que necesitan, es importante que todos mis estudiantes tengan correo, ya que es necesario para que realicen los comentarios en las paginas que se trabajan como el blog, y ahora estoy empezando a trabajar el aula 2.0 por medio de mi club. ASOCIATIC CON JULIA RUIZ,\nVínculo permanente Respuesta de JAIRO GARCIA GONZÁLEZ el mayo 13, 2011 a las 7:13am Buen dia ANA,recibe un caluroso saludo , desde Colombia, gracias por esta discusión tan interesante , lo primero que debe hacer un maestro de tics , es hacer que sus estudiantes creen el correo electrónico , este es primordial para iniciarse en las TICs, puesto que para utilizar muchos programas, se requiere tener una cuenta , es necesario ademas enseñárselos a manejar adecuadamente.\nVínculo permanente Respuesta de Reina Cortellezzi el junio 20, 2011 a las 7:39am Se trata de una estrategia muy valiosa, deja documentado todo el proceso, facilita la comunicación y nadie queda fuera-siempre que quiera integrarse. Además, es ecológico. Ahora, un problema que tenemos en nuestro sistema educativo es el enamoramiento por el soporte papel. Si hiciste una evaluación y no imprimiste o escribiste en una hoja que te entrega el profesor, puedes ser juzgado como mal docente, carente de documentación del producto. Equivocado pero lamentablemente de vigencia en aquellas instituciones que escriben y se inscriben en las llamadas instituciones progresistas y amigables con las TIC.\nVínculo permanente Respuesta de Reina Cortellezzi el junio 20, 2011 a las 7:42am Yo también prefiero las redes sociales, sólo sucede que el uso o mejor dicho uso abusivo de algunos ha debilitado en los padres la imagen de las redes. No sé si debilitado o que equipos directivos y padres no han entendido las posibilidades educativas de las redes. Sucede que nos encontramos peleando como el Quijote. Abrazo desde Uruguay\nVínculo permanente Respuesta de NUMAR ALVAREZ CARDONA el junio 24, 2011 a las 7:03pm Colegas:\nVínculo permanente Respuesta de Mª DEL MAR GALVÁN LÓPEZ el febrero 4, 2012 a las 11:56am Hola soy Mª Del Mar Galván Lòpez, maestra de educación Infantil, y estaria interesada en formar parte del grupo, para poder comunicarnos y a la vez aprender de todos y cada uno de ustedes. Muchisimas gracias por su atención\nVínculo permanente Respuesta de Mª DEL MAR GALVÁN LÓPEZ el febrero 4, 2012 a las 12:02pm En mi opinion es muy necesario el uso de las NNTT, para la educación, porque permite que los alumnos trabajen de forma activa, innovadora , cooperativa . Lo unico que hay que adaptarlo a la edad del alumnada y al proceso de enseñanza de aprendizaje del docente.


El canal alemán NTV critica el silencio de Felipe VI por el polémico y golpista chat de los exmilitares - Las Repúblicas\nEl canal alemán NTV critica el silencio de Felipe VI por el polémico y golpista chat de los exmilitares\nLos alemanes se hacen cruces que los militares hayan propuesto dar un golpe de estado con "toda impunidad".\nen Coronavirus, España, Europa, Franquismo, Monarquía Feudal, Portada\nUn grupo de ex oficiales cree que el gobierno de España está respaldado por terroristas. (Foto: imago images / ZUMA Wire)\nAnte los últimos escándalos de ex militares fascistas españoles defendiendo la monarquía y pidiendo el exterminio de 26 millones de personas, la prensa internacional no ha querido perder la oportunidad de hacerse eco de la noticia, y el que más ha recibido ha sido el mismo Felipe VI.\nSegún unas informaciones de la prensa alemana ha expresado que «El rey Felipe calla» en una noticia del Canal NTV, titulada «Exmilitares llaman a un golpe de Estado en España». Donde 70 ex oficiales de alto rango del Ejército del Aire están llamando a un golpe y ya se han puesto en contacto con el rey Felipe.\nDe hecho, en el canal alemán no se explican como los implicados en el famoso chat «hayan llamado, con toda impunidad, a llevar a cabo un golpe de estado», y que se hayan podido poner en contacto con el rey a través de una carta.\nUna vez más, reiteran que «el jefe del Estado ha guardado silencio hasta ahora sobre el tema», y entre otras cosas, mencionan los insultos por parte de los militares hacia los homosexuales, y los «separatistas catalanes» y vascos.\nEtiquetas: AlemaniaCarta al Reyejercito españolFelipe VIGolpe de EstadoMonarquia\nUn conocido neurovirólogo: "Pfizer prepara una vacuna que seguramente se esnifará"