Las palabras claves y su real importancia para optimización de una web - Cybern TechnologiesCybern Technologies\nHome cybern technologies indexación en motores de búsqueda keywords Palabras claves posicionamiento web primeros lugares en los buscadores Las palabras claves y su real importancia para optimización de una web\nby Berny Polanía 10:19\ncybern technologies indexación en motores de búsqueda keywords Palabras claves posicionamiento web primeros lugares en los buscadores\nLos buscadores miran las palabras claves como si estas narraran una historia y la historia se desarrolla a partir de un cuento que termina con el posicionamiento del nombre y slogan de esa web.\nDe acuerdo a unas caracterísitcas los buscadores desarrollan un sistema clasificatorio llamado cloud y otro llamado density y dan unos porcentajes a cada palabra del metatag de la web para saber así donde encasillarla respecto de su competencia.\nSi uno revisa un cloud hay palabras con un tamaño de letra x y otras con tamaño y, estos tamaños indican a los buscadores la reelevancia de cada palabra, conforme pasa el tiempo esas palabras se van diluyendo hasta lograr el climax de posicionamiento y su tamaño reducido indica la meta cumplida.\nSi parece algo muy complejo y en eventos lo es pero es una manera de comprender el algoritmo que usan los buscadores para posicionar sin enredarse, igual se utiliza para optimizar un sitio geográfico y pocas personas saben que hay que trabajar también palabras claves de paises o sectores económicos específicos.\nEl primer paso en el área del web seo es entender la relevancia exacta y la importancia de las palabras clave, la cantidad máxima de estas que debe usarse y como enfocarse en el nicho que se precisa para lograr las visitas exactas que logren ventas y logros rápidos.\nLas palabras clave son los bloques de partida de una exitosa campaña de optimización y toca tratarlas con mucho respeto..\nImportancia de las palabras y frases clave\nLas palabras y frases clave son los principales mecanismos por los cuales el motor de búsqueda selecciona el sitio, por lo que es esencial que las palabras clave que se utilizan sean correctas y que se encuentren de la mejor forma posible.\nEl texto ancla (es decir, el texto utilizado como parte de una instrucción de un enlace en formato html, lenguaje marcado de hipertexto) es particularmente importante, por ejemplo en el buscador Google una palabra clave que aparezca en el texto de anclaje es particularmente ventajosa.\nLas cadenas de texto que aparecen en las etiquetas, es decir, las instrucciones en html que regulan el aspecto de las páginas web es otro lugar importante para palabras clave.\nUno debe asegurarse que las palabras clave aparecen en el propio texto de la página\nLas palabras y frases clave usadas en el título\nDebido a que el título de la página es el primer elemento que los motores de búsqueda ven al buscar una página, es importante que se ponga especial atención en ellos.\nEl título de la página se muestra usando las etiquetas <title></title> en la barra de título del navegador web.\nLas palabras claves que se usan en el título de la página se muestran en los resultados de los motores de búsqueda y son utilizados por el público objetivo como el enlace de la página.\nLa etiqueta de título de la página tiene un peso significativo en la mayoría de motores de búsqueda.\nLas palabras clave del título deben ser inferiores a sesenta caracteres, incluyendo los espacios.\nLas palabras de la página web deben aparecer al principio del título de la página para obtener mejores resultados.\nComo ejemplo podemos decir que el título de página “palabras claves, su importancia en los motores de búsqueda” utiliza palabras clave como : “palabras clave”, “importancia”, “motores de búsqueda” que dependen de la naturaleza y del objetivo de la página web.\nLas frases claves usadas en las meta etiquetas\nLas meta etiquetas son textos html que describen la información acerca de la página web, pero que no se muestran.\nDe todos modos pueden ser revelados con facilidad.\nSon un factor importante en la evaluación de una página web y normalmente aparecen después de la etiqueta de <titulo>.\nEl uso de estas meta etiquetas son una forma de dar cabida a palabras claves y presentárselas de manera óptima a los buscadores.\nLas meta keywords y la meta description pueden contener hasta 1.000 caracteres y es ideal poner una coma de separación.\nUna palabra en particular no se debe repetir más de 7 veces porque algunos motores de búsqueda van a rechazar esto como muestra de basura.\nParticularmente un metatag óptimo no debe exceder de 300 palabras, y para optimizar es bueno seleccionar diez palabras base y derivar de estas treinta de cada una previa selección de las palabras optimizadas con los sitios especializados de keywords.\nCómo se eligen las palabras clave?\nLas palabras claves son el motivo central del contenido de una web.\nAsí que si se vendieran boletos baratos de avión, las palabras claves tendrán que estar relacionadas con los términos "boletos baratos de avión", que son el punto de partida para escribir acerca del contenido de la web.\nPor otra parte, también es esencial a la hora de escribir el contenido de una página pensar a qué audiencia nos dirigimos y como piensan o que buscaría esa audiencia.\nNo sólo es útil hacerlo para conectar mejor con ellos, sino que esta labor previa ayuda a seleccionar las palabras claves a utilizar para aparecer en los buscadores en la mejor posición posible.\nContinuando con el ejemplo de los boletos baratos de avión, se plantean diversas opciones :\nEn el segundo caso, el encargado del posicionamiento propone hablar de boletos baratos ofreciendo los siguientes datos para respaldar su posición :\nOfertas de vuelos tiene 455 búsquedas según Overture y 54 según Wordtracker, mientras vuelos baratos tiene 2.428 y 90 búsquedas respectivamente.\nEn cambio, si uno se fija en la competencia, vuelos baratos tiene 264.000 páginas mientras que ofertas de vuelos tiene 890.000 en el buscador más conocido.\nEn resumen, el encargado del seo ofrece centrarse en una frase de búsqueda que no solo tiene menos competencia, sino que además tiene mayor potencial de atraer mejores clientes potenciales.\nSe trata de hacer un análisis detallado del nicho de mercado y también de la búsuqeda de nuevos clientes así como de la mejor opción para atraer más visitantes de la región geográfica que nos interesa.\nLas palabras claves y su real importancia para optimización de una web Reviewed by Berny Polanía on 10:19 Rating: 5\nTags : cybern technologies indexación en motores de búsqueda keywords Palabras claves posicionamiento web primeros lugares en los buscadores\nprimeros lugares en los buscadores


HomeREPORTAJESLa Caixa rinde tributo a Francesc Moragas, el creador de la entidad\n10 diciembre, 2018 10 diciembre, 2018 No comment\nposted on Dic. 10, 2018 at 11:22 am 10 diciembre, 2018\nLa Fundación La Caixa reinvidica la figura de Francesc Moragas en el 150 aniversario del nacimiento de su fundador. El 13 de diciembre de 1868, nacía en Barcelona Francesc Moragas, fundador de la Caja de Pensiones para la Vejez y de Ahorros, la Caixa y de la Obra Social que ha definido a la entidad desde su creación hasta hoy. En 1902, se formó una huelga general en la que miles de obreros reclamaban mejoras laborales y toda la represión acabó con varios muertos y heridos. Un sector de la empresa, con Moragas a la cabeza, quiso recaudar dinero para los familiares de las víctimas. Y así nacía la Caixa.\nMoragas fue un abogado y economista y un destacado promotor de los seguros sociales en España. Demostró ser un adelantado para su época, poniendo al alcance de todas las clases populares un modo para asegurar la jubilación o la invalidez y un nuevo concepto de ahorro.\nLas celebraciones por el 150 aniversario incluyen una exposición dedicada a Moragas, “El hombre detrás del alma”, que se encuentra situada en el vestíbulo de los servicios centrales de la entidad en Barcelona y que repasa el contexto de su época y la trayectoria de la vida de Moragas, decisiva para la modernización del país, e incluye una publicación de la biografía escrita del creador por Francesc Cabana.\nIsidro Fainé, presidente de la Fundación Bancaria ”la Caixa”, profundizó en la figura de Moragas, en su pensamiento, en sus proyectos y en su legado. «La figura de Francesc Moragas ha sido capital, tanto para ”la Caixa” como para el país. Fue un hombre de acción, pero también, y sobre todo, un hombre de reflexión, de fuertes convicciones. Se movía sin hacer ruido y con prudencia, pero era atrevido en los proyectos y en el saber hacer, pues sus ideas se plasmaban en hechos concretos», explicó el actual presidente en la conferencia que marcaba el inicio del homenaje. Conferencia que ha estado precedida por una lectura teatralizada que se basa en el texto que Josep Pla escribió sobre Francesc Moragas.\nTags:Francesc MoragasObra Social 'la Caixa'tributo


El mejor intercambio de DOWCOIN\nEl mejor tipo de cambio DOWCOIN hoy en todos los mercados de criptomonedas. El mejor mercado para comprar o vender DOWCOIN hoy.\nMejor precio de compra DOWCOIN $\nMejor precio de venta DOWCOIN $\nLa mejor tasa de DOWCOIN se puede calcular observando los resultados del intercambio de pares de criptomonedas en los intercambios de criptomonedas. El saldo de la oferta y la demanda DOWCOIN en cada intercambio es diferente en diferentes momentos. Como resultado, la tasa de cripto DOWCOIN se establece en cada intercambio de criptomonedas individual. La mejor tasa de DOWCOIN debe buscarse analizando las tasas de cambio de todos los intercambios de cifrado y eligiendo la mejor.\nLa mejor billetera DOWCOIN\nLa mejor tasa de compra de DOWCOIN en la actualidad es de $ con el par de negociación en el mercado de cambio .\nLa tasa de venta más vendida de DOWCOIN en la actualidad es de $ con el par de negociación en el mercado de cambio .\nLa mejor billetera DOWCOIN es una opinión individual para cada propietario de criptomonedas. Crypto wallet es un programa complejo en el que se almacena la criptomoneda. La billetera también se usa para pagos, para la transferencia de criptomonedas. La mejor billetera DOWCOIN debe tener las mejores características de confiabilidad y seguridad en nuestra opinión. El mejor intercambiador de criptomonedas DOWCOIN se calcula cada minuto como resultado del análisis de transacciones comerciales completadas en la venta y compra de criptomonedas.\nEl mejor mercado de DOWCOIN\nDOWCOIN mejor tarifa en 23/06/2021 - se muestra en nuestra tabla de todas las tarifas de ofertas comerciales en los intercambios de hoy. Las mejores tarifas de compra y venta de DOWCOIN para hoy son 23/06/2021 en la parte superior de la página. Nuestro servicio "El mejor precio de DOWCOIN para hoy 23/06/2021" le permite analizar automáticamente en línea todas las mejores tarifas de todo el mundo. La mejor tasa de compra DOWCOIN - convertida al dólar, para facilitar la comparación con las tasas de otras fuentes.\nLa tabla muestra las tasas de cambio actuales de DOWCOIN de todos los mercados de criptomonedas. Las tasas de cambio para todos los pares comerciales se convierten a dólares estadounidenses.\nLa mejor tasa de compra DOWCOIN a menudo se establece al comprar una moneda no estándar u otra criptomoneda. En la página junto al mejor tipo de cambio DOWCOIN, se muestra ese par de monedas que ofrece el mejor precio de compra en el intercambio. La mejor tasa de venta de DOWCOIN se muestra en la parte superior de la página. DOWCOIN siempre se convierte a dólares estadounidenses. La mejor tasa de venta para DOWCOIN puede no ser cuando se vende por dólares, sino por otra moneda o criptomoneda.\nAdemás, nuestra página proporciona información sobre la moneda por la cual DOWCOIN podría venderse más. Los mejores intercambios para comprar o vender DOWCOIN se enumeran en la tabla de esta página. Los criptointercambios se muestran ordenados al mejor tipo de cambio, venta, compra DOWCOIN. La información sobre los mejores intercambios para comprar y vender DOWCOIN se actualiza en línea y cambia constantemente.


Inicia la ’Operación Salvavidas Invierno 2019’ en Ahome - Ahome Sinaloa\nInicia la ’Operación Salvavidas Invierno 2019’ en Ahome - Trabajan en coordinación la administración pública federal, estatal, municipal y la iniciativa privada para evitar accidentes que pongan en riesgo la vida de los habitantes y visitantes del municipio. - Ahome - reporterohd.mx\nInicia la ’Operación Salvavidas Invierno 2019’ en Ahome\nTrabajan en coordinación la administración pública federal, estatal, municipal y la iniciativa privada para evitar accidentes que pongan en riesgo la vida de los habitantes y visitantes del municipio.\nDiciembre 22, 2019 04:24 hrs.\nTopolobampo, Ahome, Sinaloa.- Con el objetivo salvaguardar la vida de todos los ahomenses y sus visitantes arranca la ’Operación Salvavidas Invierno 2019’, la cual contará con una embarcación tipo Defender con personal capacitado en operaciones de rescate en el mar, así mismo la Capitanía de Puerto ha proporcionado una embarcación tipo Zodiac, el Hospital Naval ha asignado sus ambulancias, personal médico y enfermeros especializados en la aplicación de primeros auxilios, mientras que el Ayuntamiento de Ahome se encargará de los recorridos vía terrestre en las diferentes playas, por su parte el Décimo Batallón de Infantería de Marina proporciona la seguridad a los paseantes en las playas y al mismo personal que desempeña las operaciones y Cruz Roja Mexicana participa con ambulancias y paramédicos.\nJuan Francisco Fierro Gaxiola, Secretario del Ayuntamiento de Ahome, mencionó que la administración a cargo del Presidente Municipal Billy Chapman ha instruido otorgar todas las facilidades necesarias para brindar una seguridad en todos los habitantes y turistas que visiten el municipio.\n’La instrucción por el Presidente Municipal, Manuel Guillermo Chapman Moreno, es apoyar en todo al operativo, van estar los elementos de Seguridad Pública que están asignados a las zonas turísticas del municipio, contaremos también con la Policía Turística y elementos de Protección Civil, en todo momento coordinados por la Secretaría de Marina, para que el operativo salga con muy buenos beneficios’, dijo Fierro Gaxiola.\nPor su parte el contraalmirante Marco Antonio Ibarra Olaje, Comandante del Sector Naval de Topolobampo, comentó que el fin de coordinarse con diferentes entes de la administración pública, federal, estatal, municipal y la iniciativa privada es evitar accidentes que pongan en riesgo la vida de los habitantes y visitantes del municipio, aun cuando reconoció que el método primordial de seguridad es la prudencia.\n’Ninguna medida que podamos nosotros tomar es tan efectiva como la prudencia y precaución de que cada uno de los visitantes, las medidas a tomar son: no introducirse en el mar tras haber ingerido alimentos o bebidas alcohólicas, nadar donde se encuentre instalado un puesto salvavidas, tomar agua con frecuencia para evitar un deshidratación y no descuidar en ningún momento a los niños en las playas’, dijo el Contraalmirante Ibarra Olaje.\nAñadió que todo prestador de servicio deberá atender las indicaciones de la capitanía de puerto y deberán portar de manera obligatoria el chaleco salvavidas durante la navegación, incluyendo el embarque y desembarque.\nLa seguridad del personal será proporcionada por elementos federales, estatales y municipales en los accesos carreteros a los lugares turísticos del municipio, y la Secretaría de Defensa Nacional, a través de su personal del 89 Batallón de Infantería, proporciona seguridad y monitoreo durante los caminos y accesos de Ahome.\nCabe recordar que el Ayuntamiento a la par mantiene un operativo permanente de 24 horas, hasta el día 24 de diciembre, de un paradero seguro con el programa ’Ahome te Ayuda Paisano’, que brinda diversos servicios a los viajeros como descanso seguro, agua, café, mecánica automotriz, área de lectura, consultas médicas y zona de artesanía y gastronomía instalado en la caseta de peaje en San Miguel Zapotitlán.


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ABC (Madrid) - 17/03/2006, p. 90 - ABC.es Hemeroteca \n90 Economía VIERNES 17 3 2006 ABC Sacyr, Valor del Año de Mi Cartera de Inversión El presidente de Sacyr- Vallehermoso, Luis del Rivero, recibió ayer el premio Valor del Año de los lectores de Mi Cartera de Inversión de manos de Antonio Zoido, presidente de BME. Otros premiados en la XIV edición de estos galardones fueron Fonditel (Telefónica) BBVA, Sogeval (Popular) y Mutuactivos (La Mutua) Panrico abandona su negocio en China y prepara su salida a bolsa P. CERVILLA MADRID. El nuevo equipo directivo de Panrico ha presentado el plan estratégico de la compañía, en el que se contempla una partida de unos 300 millones de euros para posibles compras en España y Portugal, según señalaron a ABC fuentes sindicales, después de conocer el contenido del mismo. El consejero delegado de Panrico, Joan Cornudella, confirmó esta intención de buscar activamente posibles adquisiciones en España y Portugal e, incluso, adelantó a Ep que ha creado una dirección de desarrollo corporativo que está muy centrado en estas adquisiciones. Algunas de las marcas que podrían estar en el punto de mira de Panrico serían galletas Marbú o Filipinos. Esta intención de crecer en la península ibérica contrasta con la venta de las participaciones en Grecia, su salida de China y el desmantelamiento del departamento de exportación, abandonando el negocio que venía llevando a cabo en Francia, Italia, Gran Bretaña, Holanda y Australia. El objetivo de la nueva dirección es duplicar en cinco años las ventas y alcanzar los mil millones de euros y preparar su salida a bolsa. Otras medidas que adoptarán será la venta de la sede de Barcelona y la salida de 100 trabajadores. DANIEL G. LÓPEZ Cortina y Alcocer elevan hasta el 11 su participación en el capital de ACS ABC MADRID. Alberto Cortina y Alberto Alcocer han adquirido un 0,567 adicional de la constructora ACS, unos dos millones de acciones, con lo que elevan su participación en la compañía al 11,176 Según informaron fuentes conocedoras de la operación, con las compras realizadas en las últimas semanas Cortina y Alcocer han pasado de poseer el 10,609 de ACS a hacerse con el 11,176 Al precio al que cerraron ayer los títulos de ACS, 31,39 euros, la toma de esa participación supone una inversión superior a los 62 millones de euros. De este modo, el núcleo accionarial de la constructora ACS, compuesto por los March, a través de Corporación Financiera Alba, que cuenta con un 20,007 de la empresa; Corporación Financiera Alcor, con un 11,176 y Florentino Pérez, controla el 40 del capital de la sociedad.


La búsqueda de regalos de segunda mano en internet crece un 22% en Navidad – Moneda Única\nHome ⁄ Noticias ⁄ Economía ⁄ La búsqueda de regalos de segunda mano en internet crece un 22% en Navidad\n22 diciembre, 2014 por Moneda Única\nLa búsqueda de objetos de segunda mano en internet ha experimentado un crecimiento del 22% con la cercanía de las fiestas navideñas, según revelan los datos de actividad registrados en Segundamano.es.\nConcretamente, el estudio realizado muestra que los productos de electrónica, moda y juguetes son los que generan mayor interés de cara a la Navidad. Dentro de cada una de estas categorías también es posible ver cuáles son los objetos más buscados. Así, en el apartado de electrónica, los productos que generan más interés son los dispositivos móviles, ya sean smartphones o tablets, las consolas y cámaras de fotos. En cuanto a la categoría de moda, se buscan fundamentalmente relojes, zapatillas y zapatos.\nPor último, en la categoría de juguetes los clásicos de construcción y circuitos de coches acumulan el mayor número de búsquedas. Beatriz Toribio, responsable de Estudios de Segundamano.es explica que “en nuestro portal la cercanía de la Navidad siempre se traduce en un repunte de la oferta y la demanda durante estas fechas, ya que cada vez son más las personas que buscan en el mercado de segunda mano objetos de calidad y de primeras marcas a un precio más asequible. Pero también son muchos los que acuden a Segundamano.es para encontrar regalos originales, especiales o únicos, que quizás ya no encontramos en el mercado de primera mano”.\nEn el mercado de segunda mano las marcas que más triunfan en estas fechas son Apple, tanto iPhone como iPad acumulan el 25,8% de búsquedas de la categoría, Samsung (7,6%), Play Station (3,2%) y Nikon (2,9%) en productos de electrónica; en la categoría de moda destacan Tous, que suma un 6,9% de las búsquedas, Nike (5,1%), Rolex (4%) y Adidas (2,6%); mientras que los Playmobil con un 4,2% del global de búsquedas en la categoría de juguetes, el Scalextric (4,1%) y los Lego (2,4%) triunfan como las marcas de juguetes más buscadas en Segundamano.es. “Estamos viendo cómo cada vez son más los compradores que buscan en el mercado de segunda mano objetos de marcas de gama alta o aspiracionales que en muchos casos no podrían adquirir si fueran nuevos debido a su elevado coste” comenta Toribio.\nEl sector del juguete acude a Hong Kong Toys & Games con el apoyo de ICEX\nAcciona Energía se adjudica 600 GWh anuales de suministro eléctrico renovable en Chile


El Código Procesal Penal lo describe como ilegal\nSe establece en el artículo 31 del Código Orgánico Procesal Penal Venezolano, que no se pueden privar judicialmente a personas mayores de 70 años. Es un acto ilegal.\n«No se podrá decretar la privación judicial preventiva de libertad de las personas mayores de setenta años, de las mujeres en los tres últimos meses de embarazo, de las madres durante la lactancia de sus hijos o hijas hasta los seis meses posteriores al nacimiento, o de las personas afectadas por una enfermedad en fase terminal, debidamente comprobada”, expone el artículo.\nEsto se dio a conocer a través de la cuenta en Twitter de la diputada a la Asamblea Nacional, Delsa Solórzano, respecto a la detención arbitraria de Enrique Aristeguieta Gramcko.\nSolórzano publicó una foto a lo establecido en el artículo.\nSolórzano se encuentra junto con los abogados de Aristeguieta en las afueras del SEBIN, para ver al detenido.\n«Estamos atendiendo el caso de la detención arbitraria del doctor Aristeguieta Gramcko desde las 4:00 am. Nuestros abogados están en el Sebin verificando situación y exigiendo ver al detenido», informó la diputada.\nEl abogado y presidente de la Gran Alianza Nacional (GANA), Enrique Aristeguieta Gramcko, fue detenido por el SEBIN en la madrugada de este martes.\nSe establece que lo ocurrido viola el artículo del Código Orgánico Penal Venezolano.\nEl abogado tiene 85 años de edad.\nVarios dirigentes políticos aseguran que no había orden de captura en su contra.\nEl Servicio Bolivariano de Inteligencia Nacional (SEBIN), buscó s Aristeguieta en su casa a las 3:43 am aproximadamente.\nDirigentes políticos repudieron el acto cometido por el SEBIN\nAntonio Ledezma, Richard Blanco y David Smolansky fueron algunos que se manifestaron vía Twitter.\nCatalogan el hecho como un secuestro y un acto de cobardía por parte del gobierno de Nicolás Maduro Moros.\nCabe destacar que Enrique Aristeguieta Gramcko fue uno de los miembros que conformó la Junta Patriótica, luego de la salida de Marcos Pérez Jiménez.\nPosted in POLÍTICATagged dictadura, leyes Venezuela, miedo del gobierno, opresión, violación a la ley


Pitti Uomo, Pitti Bimbo y Pitti Filati consiguieron mantener sus cifras de visitantes extranjeros, pero se redujeron los italianos\n04.02.2019.- Pitti Immagine celebró en Florencia las nuevas ediciones de Pitti Uomo, Pitti Bimbo y Pitti Filati. Empezaron el 8 de enero con el salón de moda masculina y terminaron el 25, con el cierre de Pitti Filati.\nEntre esas dos fechas, bastante inquietud por las malas perspectivas del negocio textil, en parte por las circunstancias políticas y económicas en Italia y en todo el mundo. A pesar de eso, los tres salones consiguieron mantener cifras bastante estables de visitantes extranjeros, aunque con descensos importantes en algunos mercados, como Alemania. Los italianos, en cambio, cedieron unos cuantos puntos respecto a las ediciones anteriores.\nPitti Uomo: 36.000 visitantes profesionales\nThe Pitti Box, un espacio de Pitti Uomo en la Fortezza da Bssso\nLa edición n. 95 de Pitti Uomo –celebrada del 8 al 11 de enero- recibió la visita de 36.000 profesionales, 23.800 de los cuales fueron compradores, cifras que muestran bastante estabilidad respecto al pasado inmediato.\nLos italianos bajaron un 8%. Los extranjeros fueron más estables, aunque con variaciones importantes entre los diferentes países de procedencia. Francia tuvo un descenso importante, España mantuvo cifras estables y crecieron especialmente los visitantes procedentes de Suiza, Bélgica, Escandinavia, Canadá, etc. Los 5 países con mayor número de visitantes fueron Alemania, Japón, Gran Bretaña, Holanda y España.\nTuvieron un impacto importante todos los eventos organizados por Pitti Immagine, como la presentación de la colección de Aldo María Camillo y la pasarela de Y/Project en Sta. María Novella.\nDurante estos cuatro días he visitado todos los pabellones y espacios de la Fortezza de Basso, explica Raffaello Napoleone, director general de Pitti Immagine. Deseo declarar mi admiración por el extraordinario trabajo realizado por los expositores. Es como si toda la cadena de valor de la moda masculina estuviese enfocada a la superación de las dificultades actuales. Nosotros, como organizadores del salón, igual que los expositores y los visitantes, hemos estado leyendo pronósticos y estadísticas preocupantes durante los últimos meses. En lugar de encerrarnos, esperando que los malos tiempos queden atrás, hemos decidido actuar para dar lo mejor de nosotros mismos. Conozco el valor que esto representa. Lo que menos me importa son unas décimas de reducción en la llegada de visitantes.\nPitti Bimbo, con cifras esperanzadoras\nApoteosis final del desfile de Apartment, en Pitti Bimbo\nPitti Bimbo, celebrado del 17 al 19 de enero, recibió casi 10.000 visitantes, 6.400 de los cuales eran compradores. El contingente más importante llegó de España, que aumentó el número de visitantes. También lo hicieron los llegados de Grecia, Bélgica, Polonia y Arabia Saudí.\nLos expositores fueron 552, el 60% de los cuales llegó de fuera de Italia. 152 eran nuevos o volvían después de unas temporadas de ausencia. Sus colecciones destilaron creatividad y un diseño acorde con la protección del medio ambiente.\nEl número de los visitantes llegados de mercados estratégicos como Francia, Gran Bretaña y Turquía fue muy estable, similar a la última edición de invierno. Bajó, en cambio, la cifra de los procedentes de Rusia y Ucrania, debido a la situación económica y política de esos países, aunque estuvo por encima de las expectativas. Descendió el número de los visitantes italianos y alemanes.\nLos resultados comerciales superaron sus expectativas. El peso internacional de Pitti Bimbo quedó especialmente confirmado en los sectores de moda infantil y de estilo de vida contemporáneo.\nA pesar de ello, el ambiente general fue más bien sombrío, resultado de pronósticos negativos para el consumo familiar y el comercio internacional.\nPitti Filati mantuvo las cifras de visitantes\nSpazio Ricerca, en Pitti Filati\nLa edición nº 84 de Pitti Immagine Filati estuvo aquejada por los mismos problemas generales. Logró, sin embargo, mantener casi intactas las cifras de visitantes de la anterior edición, con 4.300 compradores.\nLos países con mayor número de visitantes fueron Gran Bretaña, Francia, Estados Unidos, Suiza, Rusia y España. Alemania y Japón sufrieron descensos visibles. Sorprendentemente, el número de los italianos se mantuvo también casi estable, aunque con un número menor de empresas.\nEl Spacio Ricerca –realizado por Angelo Figus y Nicola Miller- siguió siendo el centro vital de salón. También tuvieron el éxito esperado otros eventos como:\nEl espacio Techno-Luxury, creado en colaboración con Carvico y Jersey Lomellina.\nCustomEASY, en torno a la customización de las prendas.\nY el desfile de los alumnos de la Accademia Costume e Moda y Modateca Deanna.


LG presenta un televisor LCD de Ultra Definición y 84 pulgadas – Últimos Avances Tecnológicos\nLa firma LG anunció hace poco un TV OLED de 55 pulgadas para su stand de CES 2012, pero la compañía surcoreana no para de dejarnos asombrados, hace pocas horas atrás acaba de anunciar un moderno televisor LCD con tecnología 3D y con 84 pulgadas de “ultra definición”.\nEl moderno Tv no sólo es enorme, sino que también tiene una demencial resolución de 3840×2160 Quad Full High Definition. Es decir, el doble del estándar 1080p. Mientras que la tecnología tridimensional de su pantalla es la Film Pattern Retarder (FPR) ya habitual en sus aparatos Cinema 3D y Smart TV, que funciona con anteojos pasivos.\nAún no hay especificaciones de su valor y fecha de salida al mercado (ni tampoco una confirmación de que vaya a haberlas) y sólo queda esperar que todas esas dudas y todo el detalle del aparato sean aclarados en la próxima convención de Las Vegas.


Taquilla USA: Hasta el 'Infinity War' y más allá – No es cine todo lo que reluce\nNo es ninguna sorpresa de que Vengadores: Infinity War vuelva a ser la película más vista este fin de semana. De los casi 170 millones de dólares recaudados en total, unos 114,8 millones han sido para este título con lo que vuelve a ocupar el primer puesto. El segundo puesto es para el estreno Overboard (14,7 millones) protagonizado por Anna Faris, Eugenio Derbez y Eva Longoria y remake de la película con el mismo título de 1987 que en su día protagonizaron Goldie Hawn y Kurt Russell y cuyo título en España fue Un mar de líos y que en esta ocasión hacen un intercambio de roles. Un mimado y rico dueño de un yate, cae por la borda y pierde la memoria, por lo que se convierte en el objetivo de la venganza de su empleada maltratada, una madre soltera.\nBajando una posición el tercer puesto es para Un lugar tranquilo (7,76 millones), el cuarto puesto es para ¡Qué guapa soy! (5,05 millones) que también baja una posición al igual que Proyecto Rampage (4,64 millones) que se queda con el quinto puesto. El sexto puesto es para el estreno Tully (3,28 millones), la nueva película del director nominado por la Academia Jason Reitman protagonizado por la actriz sudafricana Charlize Theron, en la que vuelve a demostrar su gran facilidad para cambiar su físico si el papel de la película lo requiere. La película nos presenta a Charlize Theron como Marlo, una madre de tres hijos, uno de ellos recién nacido, a la que su hermano regala los servicios de una niñera nocturna. Aunque con ciertas dudas al principio, Marlo irá poco a poco formando un vínculo único con la sorprendente y a veces desafiante niñera llamada Tully.\nEl séptimo puesto es para Black Panther (3,25 millones) que baja dos posiciones, el octavo puesto lo ocupa Verdad o reto (1,89 millones), el noveno puesto es para Supermaderos 2 (1,87 millones) que baja tres posiciones y el décimo puesto es para #Sexpact (1,75 millones) que baja dos posiciones.\n← ‘Jefe’: Fecha de estreno de la ópera prima de Sergio Barrejón\n‘Mamma Mia! Una y otra vez’: Póster y tráiler final español →


Volkswagen tendrá una versión eléctrica de todos sus modelos en 2030 – eju.tv\n11/09/2017 - 17:00 Tecnología\nLa compañía destinará 20 mil millones de dólares para desarrollar 80 nuevos modelos eléctricos en 2025 y para que cada uno de sus 300 modelos tenga su propio motor de combustión cero.\nVolkswagen sigue apostando por los coches eléctricos. Después de que la compañía alemana anunciara una inversión de 10 mil millones de dólares a principios de año para automóviles con motor de combustión cero, este lunes 11 de septiembre han anunciado que ofrecerán una versión eléctrica de 300 modelos para 2030.\nLa automotriz afirmó que doblará su inversión a 20 mil millones de euros, con los que espera presentar 80 nuevos modelos eléctricos para 2025 a través de sus marcas como Seat, Audi y Porsche.\n“Los clientes quieren vehículos limpios, la gente quiere tener aire limpio y queremos hacer nuestra contribución aquí”, afirmó el CEO de Volkswagen, Matthias Müller, para BBC.\nPor otro lado, la compañía alemana invertirá otros 50 mil millones de euros en la compra de baterías para sus nuevos automóviles eléctricos. Esta inyección podría suponer una rápida expansión de las baterías en el mercado.\nEsta medida se une a la ya tomada por otros fabricantes como Volvo, quien anunció que todos sus vehículos tendrán un motor eléctrico a partir de 2019. En este caso, los motores tendrán una segunda unidad de potencia de combustión, construyendo así un sistema híbrido.\nAsimismo, algunos países están allanando el camino para acabar con los motores diésel y de gasolina. China ha sido el último país en afirmar que se encuentra en conversaciones con los reguladores para acabar con las ventas y producción de cualquier vehículo de combustión.\nPor su parte, Francia prohibirá los vehículos de combustión a partir de 2040 y dejará de utilizar carbón para generar electricidad antes de 2022. Reino Unido dejará de vender automóviles de diésel, gasolina e híbridos a partir de 2040.


QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii | Protocol (Translated to Spanish)\nLos detalles se presentan sobre cómo mapeo QTL con un mapa genético basado en la secuencia del genoma completo se puede utilizar para identificar un gen de resistencia a los medicamentos en Toxoplasma gondii y cómo esto se puede verificar con el sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente un objetivo genómico, en este caso el Gen de resistencia a fármacos.\nEl conocimiento científico está intrínsecamente ligado a las tecnologías y métodos disponibles. Este artículo presentará dos métodos que permitieron la identificación y verificación de un gen de resistencia a fármacos en el parásito de Apicomplexan Toxoplasma gondii , el método de cartografía de Locus de Rasgo Cuantitativo (QTL) usando un mapa genético basado en la secuencia de Genoma Entero (WGS) y el método De Clustered Regularmente Interspaced Palindromic Corto Repeticiones (CRISPR) / Cas9-basado en la edición de genes. El enfoque de mapeo QTL permite a uno para probar si hay una correlación entre una región genómica (s) y un fenotipo. Dos conjuntos de datos se requieren para ejecutar una exploración QTL, un mapa genético basado en la progenie de una cruz recombinante y un fenotipo cuantificable evaluado en cada uno de la progenie de esa cruz. Estos conjuntos de datos se formatean a continuación para ser compatibles con el software R / qtl que genera una exploración QTL para identificar loci significativo correlacionado con el fenotipo. Aunque esto puede reducir en gran medida la búsqueda wIndow de posibles candidatos, QTLs span regiones que contienen una serie de genes de los que el gen causal necesita ser identificado. Tener WGS de la progenie fue fundamental para identificar la mutación causal de la resistencia a los fármacos en el nivel del gen. Una vez identificado, la mutación candidata puede ser verificada mediante manipulación genética de parásitos sensibles a fármacos. El método más fácil y eficiente para modificar genéticamente a T. gondii es el sistema CRISPR / Cas9. Este sistema comprendía sólo 2 componentes codificados en un solo plásmido, un solo ARN guía (gRNA) que contenía una secuencia de 20 pb complementaria a la diana genómica y la endonucleasa Cas9 que genera una ruptura de ADN de doble hebra (DSB) en el blanco, Cuya reparación permite la inserción o deleción de secuencias alrededor del sitio de rotura. Este artículo provee protocolos detallados para usar las herramientas de edición de genomas basadas en CRISPR / Cas9 para verificar el gen responsable de la resistencia a la sinefungina y para construir parásitos transgénicos.\nLa gama de huéspedes determina la extensión de la prevalencia de un parásito. Algunos parásitos tienen requisitos muy específicos del anfitrión que limitan el área de la cual se encuentran, otros son generalistas. Uno de estos generalistas es Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Este parásito se encuentra en todo el mundo, ya que puede infectar a todos los mamíferos y muchas aves. Los seres humanos también son susceptibles y se estima que aproximadamente 1/3 de la población mundial ha sido infectada. Afortunadamente, una respuesta inmune robusta normalmente controla el crecimiento del parásito, pero en situaciones donde el sistema inmune está comprometido, el parásito puede crecer sin control y causar enfermedades, a menudo encefálico. Además, este parásito puede causar enfermedades congénitas si las mujeres previamente no infectadas se infectan durante el embarazo ya que carecen de memoria inmune para limitar rápidamente la propagación del parásito. Además, hay una carga de toxoplasmosis ocular que puede resultar en pérdida de la visión 1 . Por estas razonesNs T. gondii se ha convertido en un foco de estudio, y debido a los muchos métodos moleculares desarrollados para su estudio, un modelo para los parásitos Apicomplexan. Dos métodos que se discutirán aquí son el mapeo de locus de rasgo cuantitativo (QTL) y el clúster de repetición de palindrómicos cortos regularmente intercalados (CRISPR) / edición de genes Cas9. La cartografía QTL y la edición CRISPR / Cas9 son, respectivamente, enfoques genéticos directos e inversos que se han utilizado en estudios previos para identificar y / o caracterizar genes de virulencia de T. gondii . Aquí, estos métodos se combinan para identificar y confirmar la función de un gen de resistencia a la sinefungina (SNF r ), TgME49_290860, y sus orthologs (anotado como SNR1 ) 2 .\nAunque T. gondii puede infectar una amplia variedad de huéspedes intermedios, debe pasar a través e infectar las células epiteliales intestinales de un felino para completar el ciclo de vida. Los gatos son los anfitriones definitivos del parásito donde el sSe producen etapas exuales y se produce la recombinación genética a través de la meiosis. Para llevar a cabo un estudio QTL se debe crear una cruz genética y en el caso de Toxoplasma esto significa pasar dos cepas parásitas diferentes que difieren en un rasgo fenotípico, las manchas parentales, a través de un gato para producir progenie recombinante 3 . Antes de ser alimentados a gatos, las cepas parentales se hacen resistentes a fármacos separados para permitir una identificación más eficaz de recombinantes por selección de doble fármaco de la progenie 4 . Para ello se han utilizado tres fármacos en T. gondii ; Fluorodeoxirribosa (FUDR) para la cual la uracilo fosforribosil transferasa ( UPRT ) es el gen de resistencia 5 , adenosina arabinósido (ARA) para el cual la adenosina quinasa ( AK ) es el gen de resistencia 6 y la sinefungina (SNF) para la cual el gen de resistencia era desconocido 7 . Varios cruces genéticos han sidoCreado para T. gondii , pero sólo la progenie 24 de la ME49-FUDR r X VAND-SNF r cruz fueron genotipados utilizando secuenciación del genoma total (WGS) [ 8] . Esto abrió la posibilidad de cartografiar e identificar el gen de resistencia a SNF usando este cruce como el padre VAND se hizo resistente a sinefungina por mutagénesis química de la cepa VAND (VAND-SNFs) sensible a fármacos y el genoma de referencia VAND se secuenció usando el VAND- SNF s permitiendo así la identificación de todos los polimorfismos entre la progenie WGS y el VAND-SNF s genoma de referencia, incluyendo la hereditaria parental VAND-SNF r mutación que hizo que algunos de los progenie sinefungina resistente.\nCon el fin de identificar el polimorfismo causal de un solo nucleótido (SNP) en la progenie SNF r , varios recursos de código abierto basados en computación se pueden utilizar para analizar los datos. Para crear el mapa genético para el ME49-Se desarrolló la suite de software REDHORSE 9 que utiliza alineaciones WGS de los padres y progenie para detectar con precisión las posiciones genómicas de los cruces genéticos. Esta información de mapeo se puede combinar entonces con los datos fenotípicos (SNF r en la progenie) para dar formato a un conjunto de datos compatible con el paquete 'qtl' 10 en el software de programación de estadística R donde puede realizarse una exploración QTL para revelar loci significativos correlacionados con el Fenotipo Para identificar el SNP causal localizado dentro del locus QTL, las lecturas WGS de la progenie pueden alinearse individualmente con el genoma VAND sensible a sinefunggin utilizando el programa de alineación Bowtie 2 11 desde el cual se pueden llamar SNPs usando el programa llamador Variscan mpileup2snp variante 12 . Usando estos SNPs, el locus QTL puede ser escaneado para polimorfismos que están presentes en el SNF r, pero noEn la progenie del SNF. Con el SNP causal identificado en la región codificadora de un gen, la modificación genética del gen candidato SNF r puede realizarse en una cepa de SNF para verificar la función de resistencia a fármacos.\nEl sistema de edición del genoma CRISPR / Cas9 se estableció recientemente en Toxoplasma 13 , que agregó importantes herramientas para la exploración de la biología compleja de este parásito, en particular para estudios genéticos en cepas no adaptadas al laboratorio. Debido a la altamente activa No Homologous End Joining (NHEJ) en las células WT Toxoplasma , modificación del genoma dirigida es difícil de lograr desde introducido exógenamente DNA se integra al azar al genoma a una frecuencia extremadamente alta [ 14] . Para aumentar la tasa de éxito de la modificación específica de locus, se han empleado diferentes enfoques para aumentar la eficacia de la recombinación homóloga y / o disminuirE Actividad NHEJ 15 , 16 . Uno de estos enfoques es el sistema CRISPR / Cas9. Comparado con otros métodos, el sistema CRISPR / Cas9 es eficiente en la introducción de modificaciones específicas del sitio y es fácil de diseñar 13 , 17 , 18 . Además, puede utilizarse en cualquier cepa de Toxoplasma sin modificación adicional al parásito 13 , 19 .\nEl sistema CRISPR / Cas9 se originó del sistema inmune adaptativo de Streptococcus pyogenes , que lo utiliza para defender la invasión de elementos genéticos móviles como los fagos 20 , 21 , 22 . Este sistema utiliza la enzima de endonucleasa de ADN guiada por ARN Cas9 para introducir la rotura de ADN de doble hebra (DSB) en el blanco, que posteriormente se recuperaYa sea por el error propensos NHEJ para inactivar los genes objetivo a través de cortas indel mutaciones, o por homología dirigida a la recombinación de alterar el lugar de destino exactamente como se ha diseñado [ 23 , 24] . La especificidad objetivo se determina mediante una molécula de ARN pequeña denominada ARN guía simple (ARNg), que contiene una secuencia de 20 nt individualmente diseñada que tiene una homología del 100% con el ADN diana 22 . La molécula de gRNA también contiene firmas reconocidas por Cas9 que guían la nuclease al sitio diana, que incluye un Motivo Adyacente Protospacer (PAM, secuencia es 'NGG') 25 , 26 . Por lo tanto, la molécula de gRNA y la secuencia PAM trabajan conjuntamente para determinar el sitio de escisión Cas9 en el genoma. Uno puede cambiar fácilmente la secuencia de gRNA para dirigirse a sitios diferentes para la escisión.\nCuando el sistema CRISPR / Cas9 se desarrolló por primera vez en ToxopLasma, se usó un único plásmido que expresaba la nucleasa Cas9 y la molécula de ARNg para introducir DSB en el sitio de orientación 13 , 17 . Se ha demostrado que el CRISPR / Cas9 sistema aumenta drásticamente la eficiencia de sitio específico de la modificación del genoma, no sólo por la recombinación homóloga, sino también la integración no homóloga de ADN exógeno [ 13] . Lo hace en cepas de tipo salvaje que contienen actividad NHEJ. Por lo tanto, este sistema se puede utilizar en esencialmente cualquier cepa de Toxoplasma para la edición eficiente del genoma. En un experimento típico, el plásmido CRISPR específico para el objetivo y el fragmento de ADN usado para modificar el objetivo se cotransfectan en parásitos. Si el fragmento de ADN utilizado para modificar el objetivo contiene secuencias homólogas al locus diana, se puede usar la recombinación homóloga para reparar el DSB introducido por CRISPR / Cas9 para permitir la modificación precisa del objetivo. Por otro lado, si el intEl fragmento de ADN roduced no contiene la secuencia homóloga, todavía puede ser integrado en el sitio que apunta CRISPR / Cas9. Este último se utiliza a menudo para interrumpir los genes mediante la inserción de marcadores seleccionables o para complementar mutantes en loci que permiten la selección negativa [ 13] . Aquí el locus SNR1 sirve como un ejemplo para mostrar cómo CRISPR / Cas9 puede ser utilizado para la interrupción de genes y la generación de parásitos transgénicos.\n1. Evaluar SNF r en la progenie de la ME49-FUDR r x VAND-SNF r Cruz\nNOTA: T. gondii es un parásito intracelular obligado y la fase de taquizoíto crece fácilmente en el cultivo de tejidos.\nPara cultivar el parásito de T. gondii , mantenerlos en un cultivo de monocapa de Fukroblast de Prepucio Humano confluente (HFF) sembrado en matraces T25 con medio de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (medio D10) a 37 ° C y 5% de CO $ ₂ $.\nNOTA: Véase Protocolo 1.1 Nota en archivo adicional 1 .\nPara probar clones de progenie individuales para resistencia a sinefungina, cultivar cada clon a alta densidad de parásitos en un matraz de cultivo T25 HFF durante 2-3 d, hasta que la mayoría de los parásitos comienzan a lisar las células huésped.\nRaspar la monocapa con un raspador de células y pasar la solución del parásito a través de una jeringa de 10 ml / 22 G aguja romo 2-3x tO lyse las células huésped liberación de parásitos. La solución puede ser arrastrada hacia arriba en la jeringa para múltiples pasajes de aguja.\nFiltrar la solución del parásito en un nuevo tubo cónico a través de una membrana con el tamaño de poro de 3 μ m para eliminar las células HFF y desechos celulares.\nContar los parásitos en un hemocitómetro y determinar el número de parásitos por ml.\nUsando un pipeteador, pase 2,5 x 10 5 parásitos a un nuevo frasco de cultivo T25 HFF que contenga medio D10 con concentración de trabajo 0,3 μM del fármaco de sinefungina.\nCultivar los parásitos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 7-10 d.\nAnote la progenie del fenotipo de crecimiento en el fármaco de sinefungina. Observar la monocapa bajo un microscopio de contraste de fase invertido y puntuación 0 para no crecimiento (sensibilidad a la sinefungina), puntuación 1 para el crecimiento y lisis de la monocapa (resistente a la sinefungina).\nNOTA: Véase el Protocolo 1.8 Nota en el archivo suplementario 1 .\n2. RUn a QTL Escaneo del SNF r Fenotipo en R / qtl\nNOTA: Véase Protocolo 2 Nota en archivo suplementario 1 .\nInstale el software de lenguaje de programación R en un equipo local. Véase 27 .\nEjecute R e instale el paquete 'qtl'. O bien, haga esto desde la opción de interfaz R GUI 'Packages-> Install package (s)' o ejecute el siguiente comando desde la línea de comandos R (el primer símbolo ">" en cada ejemplo denota el inicio de un comando, no debe ser Copiado):\n> Install.packages ("qtl")\nNOTA: Una vez que R y el paquete 'qtl' se han instalado, hay dos maneras de ejecutar R / qtl, desde la línea de comandos R o utilizando un programa de interfaz gráfica de usuario (GUI) llamado J / qtl 28 : vea 29 para descargar J / Qtl. Este protocolo proporcionará la sintaxis de línea de comandos R / qtl con referencia ocasional a la función equivalente en J / qtl.\nCargue el paquete 'qtl':\n> Biblioteca (qtl)\nNOTA: Consulte el Protocolo 2.3 Nota en el archivo suplementario 1 para el formato de dataset y descargas.\nCargue el archivo de conjunto de datos en R / qtl.\nPara el formato "csv" (Ver: Archivo de datos 1):\n> SNFR <- read.cross (formato = "csv", archivo = "$ PATH / Rqtl-SNFR.csv", genotipos = c ("0", "1"), na.strings = c ("-" , ConvertXdata = FALSE)\nO para el formato "gary" (Ver: Archivo de datos 2):\n> SNFR <- read.cross (formato = "gary", dir = "$ PATH", chridfile = "chrid.txt", mnamesfile = "mname.txt", mapfile = "markerpos.txt", genfile = "genotipo. Txt ", phefile =" phenos.txt ", pnamesfile =" fenonames.txt ", convertXdata = FALSE)\nDonde $ PATH es la ruta del directorio al archivo (s) que contiene el dataset qtl. Por ejemplo: / Users / HotDiggityDog / QTLfiles\nNOTA: Los archivos también se pueden cargarEd en J / qtl con los comandos anteriores utilizando la opción 'Insertar comentario o comando' o cargar los datos con la opción GUI 'Archivo-> Cargar datos cruzados'.\nCalcular probabilidades para el mapa:\n> SNFR <- calc.genoprob (SNFR, paso = 2.0, off.end = 0.0, error.prob = 1.0E-4, map.function = "haldane", stepwidth = "fixed")\nEjecutar un único escán utilizando una distribución binaria del fenotipo de resistencia sinefungina en todos los cromosomas:\n> SNFR.scan <- scanone (cruz = SNFR, chr = c ("Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa", "VIIb "," VIII "," IX "," X "," XI "," XII "), pheno.col = c (1), modelo =" binario ", method =" em "\nNOTA: Si ejecuta el fenotipo VIR, utilice la opción de distribución 'model = "normal"'.\nEjecutar 1000 permutaciones para calcular umbrales de significación y luego attrIbute las permutaciones a la variable SNFR.scan:\n> SNFR.scan.permutations <- scanone (cruz = SNFR, chr = c ("Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa" «VIIb», «VIII», «IX», «X», «XI», «XII»), pheno.col = c (1), modelo = "binario", method = "em", n.perm = 1000, perm.Xsp = FALSE, verbose = FALSE)\nNOTA: Los pasos 2.5 a 2.7 se pueden ejecutar en J / qtl con la opción 'Análisis-> Exploración principal-> Ejecutar un análisis de genoma QTL'.\nTrace los resultados del análisis:\n> Plot (SNFR.scan, gap = 0, bandcol = "gray")\nNOTA: La trama producida en J / qtl es interactiva.\nTrace los resultados de la exploración para sólo el cromosoma IX, el cromosoma con el pico más alto:\n> Plot (SNFR.scan, chr = c ("IX"), intervalo = 0, bandcol = "gris", show.marker.names = TRUE)\nMostrar todas las posiciones de marcador y LOD resultados de la exploración única:\nMostrar los resultados de umbral de la prueba de permutación:\n> Resumen (SNFR.scan.permutations)\nMostrar sólo aquellos marcadores mayores que el valor de umbral alpha = .05 (tomado de la salida anterior):\nMuestre los marcadores con la puntuación LOD más alta en cada cromosoma:\n> Resumen (SNFR.scan)\nMuestre los marcadores que tienen el valor de puntuación LOD máximo (tomado de la salida anterior):\n> SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> = 6.57,]\nNOTA: Consulte el Protocolo 2.13 Nota en el archivo adicional 1 .\n3. Identificar la mutación del SNF r causal usando WGS Lee de la progenie\nNOTA: Consulte el Protocolo 3 Nota en archivo suplementario 1 .\nAlinee las lecturas de WGS de la progenie individual a la sensibilidad sinefungina VAND(VAND-SNF s ) genoma parental.\nNOTA: Descargue el genoma de referencia VAND (SNF) de NCBI Assembly AEYJ00000000.2 y el WGS lee (archivos .sra) para la progenie 24 de NCBI SRA PRJNA258152. Además, descargue los siguientes programas: Bowtie2 11 , NCBI SRA Toolkit, SAMtools 30 , VarScan 12 y MUMmer 31 .\nCree un índice compatible con Bowtie 2 del archivo FASTA del genoma de referencia VAND usando el programa bowtie2-build, aquí nombrando el índice "VAND":\nConvierta los archivos de lectura WGS formateados de SRA a archivos FASTQ usando fastq-dump con la opción --split-files para lecturas emparejadas (el archivo SRR1555372.sra para la progenie P1_14VB se usará como ejemplo):\n> Fastq-dump --split-files SRR1555372.sra\nNOTA: Ejecute esto y todos los comandos siguientes en Protocolo 3.1 para todos los 24progenie.\nAlinee el WGS lee al genoma de referencia usando bowtie2 con salida a un archivo SAM (.sam) y la opción - end-to-end:\n> Bowtie2 -x VAND -1 SRR155372_1.fastq -2 SRR1555372_2.fastq -S SRR155372.sam - extremo a extremo\nConvierta el archivo .sam en un archivo BAM (.bam):\n> Vista de samtools -bS SRR155372.sam> SRR155372.bam\nOrdenar el archivo .bam:\n> Samtools clase SRR155372.bam SRR155372.sort\nIndexar el archivo .bam clasificado:\n> Índice de samtools SRR155372.sort.bam\nLlame a SNPs para la progenie usando VarScan\nNOTA: Véase el Protocolo 3.2 Nota en el archivo suplementario 1 .\nConvierta todos los archivos BAM (.sort.bam) indexados en un archivo con formato de pileup utilizando samtools mpileup con el archivo de referencia del genoma VAND, todos los archivos .sort.bam de progenie y salida a un archivo llamado AllProgeny-mpileup.txt:\nLlamar a todos los SNPs utilizando el programa VarScan mpileup2snp usando el archivo AllProgeny-mpileup.txt, la cobertura mínima de lectura de 5, la frecuencia mínima de la variante a través de lecturas de .8, un valor p de .01 y la salida a un nombre de archivo AllProgeny-SNPs. TXT:\n> Java -jar VarScan.jar mpileup2snp AllProgeny-mpileup.txt --min-cobertura 5 --min-var-freq .8 --p-valor .01> AllProgeny-SNPs.txt\nNOTA: El archivo AllProgeny-SNPs.txt es un archivo de texto delimitado por tabuladores que se utilizará en el Protocolo 3.4 para localizarEl SNP causal.\nBuscar VAND genoma coordenadas que corresponden a las coordenadas de la ME49 basado QTL locus\nNOTA: Véase el Protocolo 3.3 Nota en el archivo suplementario 1 .\nUtilice el programa MUMmer nucmer para alinear el genoma ME49 (disponible para descargar desde ToxoDB.org 32 ) y el archivo de genoma de referencia VAND (la salida va al archivo out.delta):\nUtilice el programa MOMER show-coords para obtener las coordenadas de las dos alineaciones del genoma, la salida a un archivo llamado ME49vsVAND-coords.txt:\nNOTA: El archivo ME49vsVAND-coords.txt se puede usar para encontrar los contigs VAND y las posiciones que corresponden al locus QTL; Marcadores MV359 a MV366 localizado en el cromosoma IX de ME49 entre 3,187,537 a 4,202,258 pb. Hay dos contigs VAND que cubren el correspLocalización QTL; KN044604.1: 657.441-1 pb y KN042501.1: 430.910-41.870 pb (ambos contigs se alinean inversamente con el cromosoma ME49).\nEvalúe los SNPs de progenie localizados dentro del locus QTL para SNP heredados sólo en la progenie SNF r\nNOTA: Consulte el Protocolo 3.4 Nota en el archivo suplementario 1 .\nRevise el archivo de datos 3 para identificar la mutación causal localizada dentro del locus QTL. Escanee los datos para un patrón en el que la progenie SNF r tenga un SNP y los SNF no lo sean (posible porque los SNPs de la progenie fueron obtenidos por comparación con el genoma de referencia de VAND-SNF). Esto sólo debería resultar en una posición con este patrón, la posición 348130 en VAND contig KN042501.1.\nVea la fila 6604 en el archivo de datos 3 ( Figura 3 ).\nNOTA: Consulte el Protocolo 3.4.2 Nota en el archivo suplementario 1 .\n4. Verificación de Hits Identificados por CRISPR / Cas9-La inactivación génica mediada.\nNOTA: Para confirmar el SNP causal identificado por el mapeo de QTL y el análisis de WGS SNP, los cambios genéticos correspondientes deben realizarse en un fondo de WT SNF y el fenotipo resultante examinado. En el caso de resistencia a la sinefungina, la mutación responsable resulta en la inactivación del gen SNR1 por terminación temprana [ 2] . Por lo tanto, la interrupción de SNR1 se puede utilizar para la confirmación. Aquí un protocolo detallado se proporciona para el uso de CRISPR / Cas9 indu indu mutaciones para interrumpir SNR1 , para demostrar su participación en la resistencia sinefungina ( Figura 4 ].\nConstrucción específica de plásmidos CRISPR de SNR1\nNOTA: Véase el Protocolo 4.1 Nota en el Archivo Suplementario 1 para obtener plásmidos y mapas.\nObtener la secuencia genómica para el gen diana ( SNR1 , TGME49_290860) de ToxoDB 32 .\nUse herramientas en línea como E-CRISP 33 para diseñar gRNAs específicos de destino. No incluya la secuencia de PAM (NGG) en el gRNA.\nNOTA: Consulte el Protocolo 4.1.2 Nota en el archivo suplementario 1 .\nSintetizar los cebadores para construir el plásmido CRISPR específico para el objetivo.\nDe acuerdo con el diseño de la etapa 4.1.2, sintetizar dos cebadores para cambiar el UPRT que apunta al gRNA en el plásmido CRISPR original a la secuencia de gRNA seleccionada por mutagénesis dirigida al sitio.\nNOTA: Las secuencias de estos dos cebadores son las siguientes: gRNA - Fw: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC (N20 es la secuencia de gRNA específica para diana) y gRNA - Rv: AACTTGACATCCCCATTTAC 2 .\nRealizar las reacciones de mutagénesis dirigida al sitio.\nUsando la UPRT dirigida al plásmido CRISPR (pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT) como plantilla y los dos cebadores listados anteriormente, realizan reacciones de mutagénesis dirigida al sitioDe acuerdo con las instrucciones del fabricante.\nNOTA: Utilice las siguientes condiciones de ciclo para PCR: 98 ° C durante 1 min, seguido de 25 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 5 min, seguido de extensión final durante 2 min A 72 ° C.\nTransformar los productos de mutagénesis que contienen los plásmidos CRISPR específicos de GOI a células competentes de E. coli mediante transformación química de acuerdo con el protocolo del proveedor (ver Tablas de Materiales ). Se cultivan los transformantes en placas de caldo de lisogénesis (LB) que contienen ampicilina (100 mu g / ml) a 37ºC. Posteriormente, recoger 2-4 clones y cultivarlos individualmente en 5 ml de medio LB suplementado con 100 μg / ml de ampicilina durante 12-16 h.\nExtraer los plásmidos de los cultivos utilizando un kit de aislamiento de ADN y analizarlos mediante electroforesis en gel de ADN para comprobar el tamaño de los plásmidos (el tamaño esperado del plásmido es 9674 pb, usar el plásmido CRISPR original como cOntrol). Utilizar el cebador M13-Rev (5'-CAGGAAACAGCTATGACC) para secuenciar los plásmidos para confirmar la secuencia específica de gRNA específico.\nUna vez que se identifican los clones positivos, almacenar el ADN del plásmido a -20 ° C y el cultivo bacteriano correspondiente a -80 ° C para uso futuro.\nNOTA: El plásmido CRISPR que se va a utilizar para la transfección debe disolverse en agua desionizada y la concentración se determinará mediante espectrofotometría o un método alternativo.\nTransfección de parásitos.\nNOTA: Los métodos generales para cultivar T. gondii en células HFF en medio D10 se han descrito previamente 34 .\nDos o tres días antes de la transfección, a~nadir suficientes parásitos a un matraz T25 que contiene una monocapa de células HFF confluentes (0,5-1 x 10 6 para cepas de tipo 1, 1-2 x 10 6 para otras cepas) para conseguir una célula HFF de 70-80% Lisis dentro de 2-3 d.\nExamenEl cultivo bajo un microscopio de contraste de fase invertida, cuando la monocapa HFF es 70-80% lisada por los parásitos. Elimine suavemente el medio con una pipeta y lave las células de la superficie del matraz con 5 ml de tampón citomix (KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4 10 mM / KH2PO4 pH = 7,6, HEPES 25 mM, MM de EDTA, 5 mM de MgCl $ ₂ $, pH = 7,6). Posteriormente, transfiera la solución del parásito a un tubo cónico de 15 ml.\nNOTA: Véase Protocolo 4.2.2 Nota en el archivo suplementario 1 .\nPasar la solución del parásito a través de una jeringa de 10 ml / 22 G aguja romo 2-3x.\nPellet los parásitos filtrados por centrifugación a 400 xg durante 10 min.\nSe desprende el sobrenadante y se resuspenden los parásitos granulados con 10 ml de tampón citomix, se toma una alícuota de 10 μl a detArminar la concentración del parásito con un hemocitómetro y sedimentar el resto por centrifugación a 400 × g durante 10 min.\nEliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón citomix para obtener una densidad de 4 x 10 7 parásitos / mL.\nEn una cubeta de separación de 4 mm, mezcle 250-300 μL de solución parasitaria (1-1,3 x 10 7 parásitos) con 7,5 μg de plásmido CRISPR, 6 μl de ATP (100 mM) y 6 μL de glutatión (GSH) (250 mM).\nElectroporación de los parásitos 35 . Incluyen una electroporación separada como un control negativo en el que un plásmido CRISPR se dirige a otros lugares, tales como el plásmido CRIPSR dirigido a UPRT.\nNOTA: Los ajustes de electroporación dependen del dispositivo. Para el electroporador listado en los Materiales utilice las cubetas de separación de 4 mm. Se recomienda el siguiente protocolo: 1.700 V, 176 μs de longitud de impulso, 2 pulsos con intervalo de 100 ms.\nDeterminar la frecuencia de sinefungin resistaNce después de la orientación de CRISPR.\nSembrar las células HFF a los cubreobjetos colocados en placas de 24 pocillos 3-4 d antes de la electroporación para que sean confluentes en el tiempo para realizar la transfección en 4.2.\nSe tripsinizan las células HFF de un matraz T25 confluente y posteriormente se añaden 12 ml de medio D10 y se mezclan bien.\nAñadir una cubreobjetos a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y colocar alícuota de 500 μl de solución de células HFF en cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C durante 3 4 d para dejar que las células crecen hasta confluentes.\nNOTA: Las células de un matraz T25 son suficientes para sembrar una placa de 24 pocillos.\nAñadir 50 μl de solución de parásito electroporado de la etapa 4.2.9 en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga una cubreobjetos sembrados con células HFF confluentes. Transferir el resto de la solución de parásito electroporado en un matraz T25 sembrado con células HFF confluentes.\nEvaluar la eficiencia de la transfección.\nCultivar las células en la placa de 24 pocillos durante 24 hY posteriormente fijar las células (células huésped y parásitos) con 500 μl de formaldehído al 4% para comprobar la expresión de Cas9-GFP por ensayo inmunofluorescente (IFA).\nPruebe las células con un anticuerpo anti-GFP y un anticuerpo específico Toxoplasma (como anti-TgALD) para etiquetar los parásitos totales. Consulte la hoja de productos de anticuerpos para la dilución recomendada (por lo general, 1: 1.000 es suficiente para los IFA). Si los anticuerpos no están conjugados, utilice dos anticuerpos secundarios diferentes conjugados con colorantes fluorescentes para marcar los anticuerpos primarios.\nObserve las células etiquetadas en un microscopio fluorescente con filtros apropiados para los colorantes fluorescentes secundarios. Obtener la eficacia de transfección dividiendo el número de parásitos positivos de GFP por el número de parásitos totales.\nNOTA: Los dos anticuerpos utilizados para IFA deben provenir de dos especies diferentes de huésped, por ejemplo usando la combinación de anti-GFP de ratón y anti-TgALD de conejo.\nDetermine el fDe resistencia a la sinefungina en parásitos transfectados.\nPara los parásitos transfectados cultivados en frascos T25, cultivarlos durante 2-3 d hasta la salida natural. A continuación, recoger los parásitos, romper aguja lyse células huésped para liberar parásitos intracelulares, y purificar por filtración a través de membranas con un tamaño de poro de 3 μ m. Contar los parásitos con un hemocitómetro para estimar la densidad.\nAgregar parásitos purificados en placas de 6 pocillos sembradas con células HFF confluentes: para la primera fila (3 pocillos), añadir 200 parásitos / pocillo y cultivarlos en medio D10 regular (2 ml / pocillo); Para la segunda fila, añadir 5000 parásitos / pozo y cultivarlos en medio D10 que contiene 0,3 μ M sinefungina.\nPoner las placas en una incubadora de CO 2 al 5% y cultivar los parásitos a 37 ° C 8-10 d sin perturbación para permitir que se formen placas. Se fijan las muestras con etanol al 70% (2 ml / pocillo) y se tiñe la monocapa con violeta de cristal al 0,1% (2 ml / pocillo). Lavar los pocillos con agua para visualizarLas placas (zonas claras) formadas por el crecimiento del parásito.\nNOTA: El control negativo debe ser procesado de la misma manera lado a lado.\nCalcular la tasa de resistencia a la sinefungina inducida por CRISPR.\nObtener el número promedio (X) de placas de los pozos que no contienen fármaco y calcular la viabilidad del parásito como X / 200. Obtenga el número promedio (Y) de placas de pozos que contienen sinefungina para calcular la tasa de resistencia a sinefungina inducida por CRISPR como sigue:\nTasa de resistencia inducida por CRISPR = 200 × Y / (5000 × X × eficiencia de transfección)\nNOTA: La eficiencia de transfección se obtiene de 4.3.2.\nExaminar las mutaciones indel inducidas por CRISPR / Cas9\nCultivar los parásitos electroporados de la sección 4.2.9 en un matraz T25 sembrado con células HFF durante 2 d a 37 ° C. A continuación, se sustituye el medio por 5 ml de medio D10 que contiene 0,3 μM de sinefungina (medio de selección).\nMantener los parásitos en el medio de selección durante al menos 3 pasadas hasta que el grupo resistente se estabilice (indicado por la ausencia de crecimiento del parásito en el grupo de control negativo pero crecimiento robusto del parásito en el grupo experimental).\nSubclonar el grupo de resistencia a sinefungina para obtener cepas clonales.\nRecolectar parásitos recién egresados, purificar mediante filtración de membrana de 3 μm y subclonar en placas de 96 pocillos sembradas con células HFF confluentes en 150 μl de medio D10. Cultivar los cultivos de subclonación en un incubador de CO 2 a 37 ° C durante 7 - 10 d sin alterar las placas.\nNOTA: Véase el Protocolo 4.4.2.1 Nota en el Archivo complementario 1 .\nCompruebe las placas de 96 pocillos bajo un microscopio de contraste de fase invertido para buscar pozos que contengan sólo una placa. Marcar tales pozos y posteriormente transferir las células de cada pocillo a placas de 24 pocillos sembradas con células HFF usando una pipeta.\n<Cuando 80-90% de las células HFF en un pozo se lisan, recolecta los parásitos (aproximadamente 500 μL) y pasa 50 μL de solución parásita a un nuevo pozo para mantener la cepa. Utilice el resto (≈450 μl) para extraer el ADN genómico para la amplificación por PCR.\nPara el aislamiento del ADN genómico del clon de SNF r , pellet los parásitos (pequeñas cantidades de contaminación de células HFF es tolerable) a 1.000 xg durante 10 min. Lave los parásitos granulados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) una vez y pételos de nuevo. Aísle el ADN genómico de las células sedimentadas usando un kit comercial o por ebullición. Resuspender los parásitos en 50-100 μ l de PBS.\nNOTA: Realizar PCR para obtener un fragmento del gen SNR1 para la secuenciación. Utilizar los siguientes cebadores para amplificar el locus SNR1 2 : SNR1-Amp-Fw: 5 'CCGACCACAA CAATTTTC y SNR1-Amp-Rv: 5'GACGTGATTCACTTTTTTACAGACAGAC. Utilice ADN polimerasas de alta fidelidad. Amplificar el locus WT para fines de control.\nEjecutarPCR con 20 mu l de volumen de reacción y se lleva a cabo con el siguiente programa: 98ºC durante 1 min, seguido de 30 ciclos de 98ºC durante 10 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 2,5 min, seguido por Extensión final durante 2 min a 72 ° C.\nNOTA: Secuencia de los productos de PCR usando los siguientes cebadores: SNR1-Seq1: 5 'GCC ACA TGC TTT AGC GTG, SNR1-Seq2: 5' TCC TCT CCA TCA CGG GTT GG, SNR1-Seq3: 5 'GCA AGA GCC GCG TGA CG , SNR1-Seq4: 5 'CTC TCC CGC GGT CGA G, SNR1-Seq5: 5' GCA CCG TCC GCA AGC y SNR1-Seq6: 5 'CCG GAA GGT GAA TCG TTC TTC.\nComparar las secuencias del gen SNR1 de mutantes resistentes a sinefungina a la de la cepa WT utilizando una herramienta de alineación de secuencias.\nNOTA: Véase el Protocolo Adicional 2 Protocolo 5 para detalles sobre la utilización de la selección negativa en el locus SNR1 para la complementación genética o la construcción de la cepa transgénica.\nEn este artículo se describen en detalle varios métodos que pueden utilizarse sucesivamente para identificar un gen responsable de la resistencia a fármacos ( Figura 1 ). La progenie 24 de la ME49-FUDR r X VAND-SNF r se evaluó la resistencia al fármaco sinefungina, tal como se describe en el Protocolo 1. Usando el mapa genético y el SNF r fenotipo de la progenie, se realizó una exploración QTL en R / Qtl - Protocolo 2 ( Figura 2 ). Esto resultó en un pico significativo en el cromosoma IX que abarca aproximadamente 1 Mbp. Es en esta región donde se localiza la mutación causal.\nPara identificar la mutación causal, las lecturas de WGS de la progenie se alinearon con el genoma de referencia de VAND-SNF utilizando Bowtie2 - Protocolo 3.1, se usaron SNPs usando VarScan mpileup2snp - Protocolo 3.2 y se identificó el locus QTL en el genoma de VAND usando MUMmer - ProtocOl 3.3. Progeny SNPs dentro de la QTL locus fueron extraídos y escaneados para un patrón donde el SNF r progeny tienen un SNP y el SNF s no, lo que es factible porque la progenie SNPs se obtuvieron por comparación con el VAND-SNF s genoma de referencia ( Figura 3 ] . Sólo un SNP coincide con este patrón que resulta en un codón de parada temprana en un gen portador de aminoácidos putativo llamado SNR1 .\nLa confirmación de que SNR1 es el SNF r gen de resistencia se realizó utilizando el sistema CRISPR / Cas9. Se preparó un nuevo plásmido CRISPR / Cas9 diseñado para la edición del gen de T. gondii que contenía un gRNA dirigido al gen SNR1 cerca de la mutación SNF r identificada en la progenie - Protocolo 4 ( Figura 4A ). El SNR1 dirigida CRISPR / Cas9 plásmido fue electroporated en un SNF s WT parásito cepa y resistente mutantes se obtuvieron cuando el cultoDe sinefungina 0,3 μM. No se obtuvieron parásitos SNF r cuando se electroporaron con el UPRT dirigido al plásmido CRISPR / Cas9. Varios SNF r CRISPR mutantes fueron clonados y la región alrededor de la SNR1 gRNA objetivo fue secuenciado. Cada mutante tenía un indel que interrumpió la secuencia codificante del SNR1 gen ( Figura 4B ]. Este método también puede usarse para insertar una construcción de orientación en el locus SNR1 a través de NHEJ ( Figura 5), o por HR ( Figura 6 ) - Supplemental File 2 .\nFigura 1: Flujo de trabajo esquemático para los experimentos resumidos en los protocolos. Los principales pasos en la identificación y confirmación del gen SNF r utilizando el ME49-FUDR r X VAND-SNF r se muestran con referencia a los protocolos apropiados esbozados en tSu artículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 2: Comandos R / qtl para ejecutar QTL Scan en el SNF r Fenótipo. Los comandos descritos en el Protocolo 2 se ejecutaban en R usando el paquete qtl. Se muestran comandos representativos y diagrama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 3: Localización del SNP Causal. Progeny WGS lecturas se alinearon a la VAND-SNF s genoma de referencia con Bowtie 2, SNPs fueron llamados con VarScan, y el correspondiente Locus VAND QTL identificado con MUMmer. SNPs ubicados dentro del locus QTL fueron importados en una hoja de cálculo y el causal SNP fue identificado. SNF r progenie (amarillo), SNF s progenie (verde), SNF r SNP (rojo) (véase el archivo de datos 3 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 4: Confirmación de SNR1 como SNF r Gene usando CRISPR / Cas9. ( A ) CRISPR / Cas9 indujo mutaciones indel (verde) en el locus SNR1 . ( B ) Indels representativos en SNR1 causados por dos plásmidos CRISPR específicos de SNR1 diferentes (C5 y C6 respectivamente). RH es la cepa WT y C5 y C6 son SNF r mutantes. (B se toma de la referenciaS = "xref"> 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 5. Mutagénesis Insercional usando CRISPR / Cas9. ( A ) Inserción de genes complementarios o transgénicos en el locus SNR1 mediante integración específica del sitio mediada por CRISPR / Cas9. Dos orientaciones posibles del mini gen DHFR insertado y los cebadores utilizados para la identificación, F1 / 2 y R1 / 2 representan los sitios de cebado de oligos utilizados en PCR de diagnóstico. ( B ) PCR de diagnóstico de un clon snr1 :: DHFR * , RH se utiliza como un control WT. La PCR del GRA1p se incluye como un control que comprueba la calidad del ADN genómico como plantillas. Los asteriscos indican carriles con bandas inespecíficas (la figura 5B se toma de referenCe 2 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 6: Gene Knockout utilizando CRISPR / Cas9. Un diseño clásico para el reemplazo de genes homólogos mediados por CRISPR / Cas9 en T. gondii . La orientación del transgén insertado se fija en este caso. F1 / R1, F2 / R2 y F3 / R3 representan los sitios de cebado de oligos utilizados en PCR de diagnóstico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nArchivo de datos 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Fichero cruzado fO utilizar en R / qtl, "csv" Formato. Un archivo .csv que se puede cargar en R / qtl con la opción format = "csv". Haga clic aquí para descargar este archivo.\nArchivo de datos 2: (txt chrid, txt genotipo, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt y phenos.txt). ME49-FUDR r VAND-SNF r Archivos cruzados para uso en R / qtl, "gary" Formato. Seis archivos .txt que se pueden cargar en R / qtl con la opción format = "gary". Haga clic aquí para descargar este archivo.\nArchivo de datos 3. Hoja de cálculo con progenie SNPs a través del SNF r Haga clic aquí para descargar este archivo.\nArchivo suplementario 1: Detalles adicionales del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.\nArchivo Suplementario 2: Protocolo 5 - Utilización de la selección negativa en el lugar SNR1 para la complementación genética o la construcción de la cepa transgénica. Haga clic aquí para descargar este archivo.\nEstos protocolos presentan varios métodos que cuando se combinan permiten la identificación de un gen de resistencia a fármacos en T. gondii . Dos en particular eran parte integrante del proyecto, el método relativamente experimentado de mapeo QTL y el recientemente desarrollado método de edición de genes CRISPR / Cas9. Lander y Botstein publicaron su influyente artículo en 1989 demostrando el mapeo QTL que correlaciona loci genéticos con fenotipos [ 36] . Más recientemente, en 2012, Dounda y Charpentier describieron el sistema de edición CRISPR / Cas9 en Streptococcus pyogenes 22 que se adaptó rápidamente como una herramienta genética en muchos modelos diferentes, incluyendo T. gondii 13 , 17 . Ambos métodos fueron útiles aquí, donde la cartografía QTL define el locus que contiene la mutación de resistencia a los fármacos que se identificó en última instancia mediante la detección de SNP basada en WGS, y la edición de CRISPR / Cas9 me proporcionó Ans para confirmar SNR1 es el gen de resistencia a fármacos sinefungina.\nEl ME49-FUDR r X VAND-SNF r cruz 8 se desarrolló originalmente para interrogar un fenotipo de virulencia 19 , pero las cepas parentales también tuvieron una diferencia fenotípica adicional para la cual el gen causal no se conocía, resistencia a la sinefungina en el gen VAND. Esto pone de relieve un beneficio de los cruces en que pueden ser reutilizados cuando se observan diferencias fenotípicas adicionales en los padres. Este fue el caso de otra cruz Toxoplasma , tipo 2 x tipo 3, donde varios genes implicados en la virulencia se encontraron por la cartografía de múltiples fenotipos [ 37 , 38 , 39 , 40] . Hasta la fecha, se han descrito cuatro diferentes cruces de T. gondii para asignar genes responsables de los fenotiposSs = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 , todos los cuales tienen el potencial de ser reutilizados para asignar nuevos fenotipos para los cuales la base genética es desconocida. En este sentido, los genomas de 62 T. gondii cepas que representan la conocida diversidad genética mundial se han secuenciado [ 43] . Podrían hacerse nuevas cruces de este grupo para las cepas que difieren en fenotipos interesantes. Habiendo alabado las ventajas de la cartografía QTL, hay que decir que la generación de una cruz no es una empresa menor. Existen otros métodos que pueden usarse para identificar genes causales. Una técnica potente utiliza la mutagénesis química para crear mutantes que pueden ser seleccionados para detectar fenotipos. Para encontrar el gen causal, los mutantes pueden ser complementados con bibliotecas de cósmidos [ 44] o métodos de resecuenciación del genoma se puede utilizar para encontrar la mutación causal [ 45] . Para moRe sobre esto, ver dos artículos de JoVE por Coleman et al. Y Walwyn et al. Que describen estos enfoques 46 , 47 .\nMuchas de las etapas que conducen a la identificación de la mutación causal SNF r (Protocolos 2 y 3) se basan en métodos computacionales realizados con software que está libremente disponible para uso académico. Se proporcionan comandos detallados para cada paso y cuando se ejecutan con los archivos adecuados permitirá al usuario volver a crear los conjuntos de datos necesarios para encontrar SNF SNP causal. Tenga en cuenta que algunos de la sintaxis en los comandos se refieren a los nombres de archivo o estructura de directorios ($ PATH) que se pueden modificar a la preferencia del usuario. Aunque los comandos dados aquí ciertamente no agotan las formas en que se puede analizar una cruz con análisis QTL y la identificación SNP basada en WGS, son lo suficientemente amplias para repetir el experimento descrito en este artículo y deberían permitir al usuario convertirse en m Familiarizarse con cómo estos enfoques se utilizan de una manera paso a paso.\nAunque la cartografía QTL y WGS secuencia basada en la detección de SNP fueron suficientes para identificar un candidato SNF r gen, experimentos adicionales son necesarios para confirmar su papel en la resistencia a los medicamentos. Esto puede ser demostrado de manera convincente a través de la interrupción génica o knockout técnicas, ambos de los cuales se puede lograr utilizando CRISPR / Cas9 edición de genes. Se proporcionan métodos detallados para usar CRISPR / Cas9 para generar mutaciones indel o insertar constructos transgénicos en un gen diana en T. gondii . La especificidad de direccionamiento que CRISPR / Cas9 proporciona aumenta la eficacia de la edición de genes sobre los métodos tradicionales. Además, este aumento eficientemente ha hecho posible utilizar cepas no adaptadas para estudios genéticos que antes eran difíciles de modificar 13 . Aunque en su infancia, CRISPR / Cas9 ya se ha utilizado para hacer interrupciones de genes, Y hacen los knockouts de genes 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 en T. gondii , lo que promete ser una herramienta útil Para muchos otros estudios en el futuro.\nEl descubrimiento de que la inactivación de SNR1 conduce a la resistencia a la sinefungina hace que el locus SNR1 sea un sitio prometedor para la inserción de transgenes o la complementación genética. Para maximizar el éxito del uso de la orientación de genes mediados por CRISPR / Cas9 para dirigir la integración del transgén en el locus SNR1 , deben tenerse en cuenta los siguientes aspectosRojo durante el diseño experimental. En primer lugar, se recomienda incluir un marcador de selección en la construcción transgénica para aumentar la eficiencia de la construcción de deformación. Si se incluye un marcador de selección, se pueden usar tanto la selección positiva como la negativa, resultando que casi el 100% de los parásitos doblemente seleccionados son transgénicos con el GOI integrado en el locus SNR1 . Por el contrario, si la construcción transgénica no contiene rasgos seleccionables adicionales y se basa en la selección negativa en el locus SNR1 , la eficacia de la transgénesis satisfactoria depende en gran medida de la eficacia de la cotransfección del plásmido CRISPR y la construcción transgénica.\nEn segundo lugar, aunque la integración de un fragmento de ADN no homólogo mediada por CRISPR / Cas9 se utiliza frecuentemente para la complementación y la transgénesis, debe observarse que la orientación de la inserción no puede garantizarse en estos casos ya que es posible cualquier dirección. Esto puede plantear problemasMs para algunas aplicaciones. Por ejemplo, para complementar un mutante con diferentes alelos génicos, es difícil asegurar que todos los alelos se insertan en la misma orientación, y las discrepancias en la orientación pueden causar diferencias de expresión. Para este tipo de aplicación, se recomiendan construcciones de ADN con secuencias homólogas al locus SNR1 , lo que impulsará la orientación de integración adecuada ( Figura 6 ).\nTercero, durante la transfección, la relación entre el plásmido CRISPR y la molécula de ADN transgénico es crítica para la construcción de la tensión transgénica exitosa. Esta relación debe ajustarse de acuerdo con las estrategias de selección. Se recomiendan las siguientes directrices: 1) Si la construcción transgénica contiene un marcador resistente a los fármacos y el fármaco correspondiente es la única selección utilizada para generar parásitos transgénicos, es decir , no se utiliza la sinefungina, la relación molar sugerida entre la construcción transgénica y el plasma CRISPRId es 1: 5. El uso de más plásmido CRISPR en este caso aumenta la probabilidad de que los parásitos que reciben la construcción transgénica también recibirán el plásmido CRISPR, por lo tanto los parásitos resistentes a los fármacos tienen más probabilidades de tener el marcador insertado en el sitio de selección de CRISPR. Si la proporción se invierte, la mayoría de los parásitos que reciben la construcción transgénica no obtendrán el plásmido CRISPR. Como consecuencia, la gran mayoría de los parásitos resistentes a los fármacos obtienen la construcción transgénica mediante una integración aleatoria no asociada con la inserción específica del sitio mediada por CRISPR / CAS9. 2) Si la construcción transgénica contiene un marcador resistente a fármacos y el fármaco correspondiente se usa junto con la sinefungina para seleccionar parásitos transgénicos, la relación molar sugerida entre la construcción transgénica y el plásmido CRISPR es de 1: 1. Esta estrategia proporciona la mayor eficiencia de la construcción de deformación transgénica. 3) Si la construcción transgénica no contiene un fabricante seleccionable, dependiendo de la selección negativaPor sinefungin sola para obtener parásitos transgénicos, la relación molar sugerida entre la construcción transgénica y el plásmido CRISPR es 5: 1. La justificación para este diseño es la misma que en la primera directriz anterior. Puesto que tanto la pirimetamina como la sinefungina se usaron para la selección en el Protocolo 5, la relación entre el gen mini DHFR * y el plásmido CRISPR dirigido por SNR1 se estableció como 1: 1.\nEn conjunto, los métodos descritos aquí tienen un nivel de detalle que no fue posible transmitir en la publicación original que identificó SNR1 2 . Estos protocolos; Específicamente, la sintaxis de la línea de comandos, el diseño secuencial de los programas utilizados y el uso de CRISPR / Cas9 deberían ayudar a futuros esfuerzos para identificar nuevos genes responsables de los fenotipos.\nAgradecemos a L. David Sibley y Asis Khan por su contribución a la publicación original en la que se basan estos protocolos. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorgar AI108721.