Cargado por Zoila Gutierrez Ayala\nTema 3 - Patología celular\nCitopreparación e Histoquímica\nSet de experimentos de colorante secundario para tinción\nFUNDAMENTOS DEL PROCESO DE FIJACIÓN TISULAR FIJACIÓN TISULAR Fundamento: Consiste en interrumpir los procesos degradativos que aparecen\ntras la muerte celular, tratando de conservar la arquitectura y composición lo más proxima posible a como se encontraba en el organismo vivo. Los procesos degradativos son: AUTOLISIS Y PUTREFACCIÓN AUTOLISIS: Es el proceso por el cual después de la muerte, se produce la autodigestión enzimática celular, tras la salida del contenido lisosómico al citoplasma por rotura de las membranas de estos orgánulos. INTRINSECO (propio). PUTREFACCIÓN: Efecto ejercido por determinadas toxinas y encimas bacterianas sobre los tejidos. Los microorganismos que originan esta acción son de carácter saprofito y complementan el efecto lítico de la autolisis hasta conseguir la total destrucción celular. EXTRINSICO. Sobre ambos procesos influyen diversos factores que dependen: a) Naturaleza del tejido: ej, el páncreas es un tejido rico en enzimas digestivas, o el intestino que contiene gran cantidad de gérmenes. b) De la temperatura: A mayor temperatura ambiente, mayor velocidad de autolisis y putrefacción. Los puntos clave de un fijador son: • • • Preservación de las estructuras celulares y tejidos con minima o nula alteración de su estado natural. Protección ante los siguientes procesos de inclusión y sección. Preparación para los procesos de tinción y visión tanto con el microscopio óptico como con el electrónico, para resistir el haz de fotones. Como regla general la fijación se realiza tomando una sección de un tejido o material biológico que se coloca en un líquido fijador (inmersión), de forma alternativa y en casos de experimentación pueden realizarse otros sistemas de fijación como la perfusión del líquido fijador a través del sistema vascular.\nHabitualmente se realiza primero la fijación de la pieza, a ser posible (siempre que no se vayan a realizar técnicas que requieran su manejo en fresco) en el mismo lugar donde se ha realizado la extracción, quirófano, sala de punción etc. Por estos motivos casi siempre se utilizan fijadores standard tanto para microscopía óptica como electrónica y solo en casos especiales se utilizan otros fijadores. En los cadáveres el problema del tiempo no es con respecto a la fijación de la muestra, pero si lo es el tiempo que ha transcurrido entre la muerte y la autopsia, ya que este tiempo marca la intensidad de autolisis que presenten los órganos. Para microscopia óptica el tiempo en que la imagen histológica no muestra prácticamente alteraciones es de aproximadamente hasta 4-6 horas postmortem. (Si pasan más horas, aparecen cambios morfológicos importantes). El proceso de fijación es una interacción entre el fijador y grupos químicos del material a fijar. Es muy difícil definir exactamente como se realiza este proceso. Los fijadores que se utilizan habitualmente en microscopia se basan en la desnaturalización (rotura de uniones químicas, es decir, se rompen los puentes de hidrogeno de las proteínas) y polimerización (reacción entre el fijador y el material a fijar formando uniones estables entre compuestos químicos). En la microscopia óptica se utilizan fijadores cuyo mecanismo de acción es tanto desnaturalizar como polimerizar. La parafina no se lleva bien con el agua y el alcohol, por los tanto hay los pasos previos a la inclusión. Para quitar el agua, deshidrataremos el tejido para eliminarla, esto lo haremos con OH, no se puede pasar de agua a OH Abs porque el tejido sufriria una retracción muy fuerte (aguaOH 50ºC OH 70ºC OH 96ºC OH Abs). Una vez eliminada el agua, hay que eliminar el OH, esto lo haremos con un aclarado de Xilol. PRINCIPIOS GENERALES DE LA FIJACIÓN 1. No existe un método universal de fijación (un agente fijador adecuado para un tejido, puede no serlo para otro). 2. No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido, ya que fijación no es equivalente a conservación tisular. 3. Un defecto en la fijación jamás puede ser corregido. 4. Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos en la fijación.\nCLASES DE AGENTES FIJADORES SEGÚN SU MECANISMO DE ACTUACIÓN Los clasificamos en dos grupos: • Fijadores por métodos físicos: Se emplea el enfriamiento por congelación del tejido como método para retrasar los procesos de autolisis y putrefacción tisular. Se usa en las biopsias intraoperatorias. • Fijadores por métodos químicos: Los agentes fijadores generalmente en forma líquida, actúan desnaturalizando e insolubilizando las proteínas tisulares, lo cual bloquea la autolisis por inactivación enzimática. Además algunos impiden el crecimiento bacteriano.\nLa fijación por métodos físicos es el método de elección para realizar estudios morfológicos y funcionales en los que se quiere conservar intacta la estructura antigénica del tejido. Para ello el material mas adecuado es el que no está fijado. De ahí que se proceda a la congelación de las piezas en fresco, al objeto de conservarlas hasta el momento de realizar la técnica y además darles la consistencia adecuada para su corte en secciones microscópicas. El sistema de congelación es muy importante ya que congelaciones inadecuadas alteran la conservación antigénica, afectan notablemente la morfología, dificultan el corte y en conclusión pueden conducir a alteraciones tales que impidan la valoración de las técnicas inmunohistoquímicas. El mejor método es la congelación en nitrógeno líquido mediante baño de isopentano. Esto da lugar a una congelación adecuadamente rápida (que impide la formación de los cristales de hielo típico de los métodos lentos), a muy baja temperatura (por debajo de los 100ºC) y sin contacto directo del nitrógeno con material a congelar. El material ha de estar en fresco y bañado completamente en suero fisiológico. La sección no ha de ser mayor que 1x1 cm, con un grosor de 0,2 cm.\nCARACTERISTICAS DE LOS FIJADORES POR MÉTODOS QUÍMICOS CARACTERISTICAS QUE DEBE POSEER EL LÍQUIDO FIJADOR IDEAL: 1. Bloquear de inmediato la autolisis: Este efecto depende principalmente de su poder para producir la desnaturalización de las proteinas, de forma que la actividad enzimatica del tejido queda paralizada. Esta capacidad está relacionada fundamentalmente con la velocidad de penetración y de fijación que posea el agente fijador. a. Velocidad de penetración: Es la rapidez con la que un fijador se infunde en el interior de un tejido. (1mm/h) Recuerda que puedes alterar la velocidad de penetración haciendo piezas mas pequeña. Influye en el tamaño de la pieza. Velocidad es directamente proporcional al tamaño de la pieza.\nb. Velocidad de fijación: No tiene que ser coincidente con la velocidad de penetración, por ejemplo la formalina tiene una velocidad de penetración rápida pero fija con cierta lentitud. Ello explica que el proceso de la fijación es un fenómeno químico determinado por el tiempo que cada fijador tarda en precipitar y estabilizar los componentes químicos de los tejidos (lo que tarda en romper los puentes de hidrogeno). 2. Efecto microbicida: Impide o retrasa la acción bacteriana desencadenante de la putrefacción. 3. No provocar en el tejido retracciones ni distorsiones, que determinen anomalías en su arquitectura. Va a depender principalmente de los cambios inducidos de presión osmótica. 4. Inducción de cambios de textura y composición tisular, que favorezcan la inclusión, corte y coloración. Con lo cual podemos decir que no existe un fijador ideal, o lo que es lo mismo, todos los fijadores actualmente disponibles ofrecen ventajas e inconvenientes que los harán indicados para cada tipo de muestras. *No se puede usar formalina pura para fijar un tejido, ya que esta lo dañaría gravemente, así que hay que reducirla*\nREGLAS GENERALES A CONSIDERAR EN EL EMPLEO DE LÍQUIDOS FIJADORES 1. Colocar el tejido en el líquido fijador lo más rápidamente posible. 2. El tejido debe estar seccionado en láminas de hasta 4mm de grosor máximo. Si se realiza en un órgano entero se deben realizar incisiones sobre superficie y apertura de cavidades, para que el líquido fijador penetre rápidamente en su interior. 3. El volumen necesario de fijador está determinado por el tejido que se va a fijar. La relación de volumen / pieza es de 20/1. (recipiente adecuado). 4. La presión osmótica del líquido fijador y el tejido serán equivalentes, si es necesario debe compensarse la del primero utilizando soluciones salinas como agente de disolución. 5. El pH del líquido fijador debe aproximarse al pH fisiológico, salvo que su composición deba contener ácidos. El pH estará entre 7 y 8. 6. El tiempo de fijación es específico para cada fijador, pero existe un tiempo máximo de fijación que no debe ser sobrepasado.  FORMALDEHIDO O FORMOL (CHOH) Es el fijador más clásico para microscopia óptica, es el tipo más simple y pequeño de los aldehídos, su peso molecular es de 30. Para microscopía electrónica el fijador no podrá ser un formaldehído, sino glutamato. La solución comercial de formaldehído (formalina) es al 40%, se acompaña de cantidad considerable de metanol, entre un 11 y 16% que potencialmente puede actuar como fijador coagulante y desnaturalizador de las proteínas, el agente induce la rotura masiva de los puentes e hidrogeno, determinantes de la estructura helicoidal de las moléculas proteicas dando lugar a la formación de una red o malla reticular polipeptídica por asociación de los grupos activos desenmascarados por el fijador. Recuerda que el formol a 37-38% es al 100% La formalina es una mezcla de formol, alcohol y agua y si queremos potenciar la velocidad de fijación cambiaremos el alcohol por metanol. VENTAJAS: • Es el fijador mas barato que existe (utilizado en los trabajos de rutina de los laboratorios de AP).\n• Provoca escasa retracción tisular. ya que su presión osmótica es muy parecida a la del tejido. modificando la temperatura. (hemoglobina y hemoxiderína (destrucción de glóbulos rojos) INCONVENIENTES • Por acción de la luz se transforma en ácido fórmico para evitar este inconveniente se deben guardar en frasco topacio o emplearse en forma de soluciones neutras o tamponadas. • • Es compatible con la mayor parte de las tinciones. pigmentos que contienen hierro y derivados. Impregnaciones argenticas (técnicas de coloración). por lo tanto no es aconsejable. • El proceso de fijación puede ser acelerado o retrasado. • Debido a su incorporación progresiva al tejido en forma de puentes metilicos. Relativa capacidad de fijación de las proteínas. por lo cual debe encontrarse siempre en exceso. o A temperatura ambiente se consigue fijación en 24h-36h o A 35ºC – 12-24h o A 55ºC – 3h Las proteínas se desnaturalizan y se produce una retracción del tejido provocando una gran deshidratación.• Es un buen fijador único (moderada conservación de la estructura tisular) pero podríamos decir que no va demasiado bien con todas pero tampoco va demasiado mal. • . el formaldehído se consume durante el proceso de fijación. • Velocidad de penetración intermedia (aproximadamente 1mm/h apenas altera la coloración tisular por ello es el agente de elección para fijar grandes piezas quirúrgicas Excelente fijador para el tejido adiposo y lípidos en general. Fijación del tejido nervioso (con formol salino). (20/1) . por lo tanto no expulsará mucha agua fuera del tejido. • Buen desinfectante y no endurece excesivamente los tejidos (conservar y almacenar biopsias y piezas quirurgicas).\n.. • • Produce vapores irritantes sobre la mucosa nasal y conjuntiva...• Por esto y por su baja presión osmótica (1800s)... Formalina comercial (formol) al 100%...0 – 7.. (disminuye el volumen y aumenta el peso) Para evitar esto se utiliza formol salino o amortiguado con tampones o solución de sacarosa. 9g 1 parte de formol comercial y 9 partes de H2O Se parte del formol comercial al 100% b) FORMOL TAMPONADO (Todo) Es la solución mas empleada hoy día para prevenir el choque osmótico que provoca la disolución de formalina en agua destilada.4g .  SOLUCIONES FIJADORAS SIMPLES QUE CONTIENEN FORMALDEHIDO a) FORMOL SALINO (Tejido nervioso..... Se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de soluciones de formaldehido en agua destilada.. COMPOSICIÓN: Como amortiguador se emplea el tampón fosfato calibrado a pH 7.2. así como el deposito de pigmento formólico que ocurre a pH inferior a 6..... Tras la utilización prolongada de formalina y por su conversión en ácido fórmico puede producirse una reducción masiva de la hemoglobina hasta originar un precipitado cristalino birrefringente de color pardonegruzco dificulta la observación al microscopio. (se produce una degradación y destrucción de la hemoglobina. incorpora agua en los espacios intratisulares y el volumen del tejido disminuye una vez fijado.. y recibe el nombre de pigmento formólico.100ml Fosfato sódico monobásico…………………………. (Las muestra aguantan menos en formol salino) COMPOSICIÓN: Formol al 10% …………. por lo tanto se destruye el tejido).. 100ml Cloruro sódico…………. similar al formol taponado).\n.......900ml 1L de formol al 10%  formalina + agua destilada c) FORMALINA ÁCIDA (es muy parecida al formol salino) Se emplea para fijar el tejido nervioso en la preparación de algunas técnicas de impregnación argéntica.…6....Fosfato sódico dibásico………………………….…. 95ml Ácido acético glacial…………………… 5ml Solución stock: Cloruro de mercurio……………… 5g ..... COMPOSICIÓN: Ácido acético glacial……………….1cc Formalina al 10%. ……99cc (partes) d) FORMOL CALCICO DE BAKER (Tecnicas histoenzimatológicas) Añadir CaCl2 al 1% a una solución de formalina neutra o tamponada al 10% COMPOSICIÓN 10 ml solución ClCa2 al 1% 990 ml de formol tamponado MEZCLAS FIJADORAS QUE NO CONTIENEN FORMOL LÍQUIDO DE ZENKER (Biopsias de medula ósea.... ya que es descalcificante) Preparación: Solución stock de Zenker………………..5g Agua destilada………………………………….....\nvelocidad de penetración y fijación rápida. Sin embargo.. produce una excesiva retracción histica así como hemólisis de los eritrocitos y pobre conservación estructural de las proteínas globulares y del ADN. Preparación: Etanol absoluto………………. testículos) Es una mezcla utilizada como alternativa a la formalina. MEZCLAS FIJADORAS Se clasifican en dos grandes grupos. y en general para los hidratos de carbono simple y para proteínas fibrilares pero sobre todo para las miofibrillas. órganos endocrinos. dependiendo de que contengan o no formaldehído en su composición... a) Mezclas fijadoras que contienen formol + otros fijadores LIQUIDO DE BOUIN (piel. se puede ver el glucogeno) Es el mejor fijador para el glucógeno. 30ml Ácido acético glacial………. 10ml El mayor endurecimiento se produce al prolongar el tiempo de deshidratación en alcohol se puede prevenir sustituyendo el etanol por metanol y produce menos retracción.Dicromato potásico………………. . 60ml Cloroformo…………………. 2. 1g Agua destilada…………………… 100ml LIQUIDO DE CARNOY (para el músculo y el hígado.5g Sulfato sódico…………………….\n. ya que evita su disolución...5g Formalina concentrada 40%... TÉCNICA DE DESCALCIFICACIÓN (hay calcio en los huesos y en los tumores) ......2 tiempo de fijación: de 2 a 24h OBSERVACIONES: Tras la fijación.5 ml OBSERVACIONES: mezclar antes de su uso. Preparación: Alcohol etilico al 80º……………. lavar abundantemente con alcohol de 70º hasta la decoloración de la muestra para asegurarse la completa desaparición del ácido pícrico.Preparación: Solución saturada de ácido pícrico…………...... 2. 250ml Ácido acético glacial………………………… 50ml pH final aproximado………………………….... 30ml Ácido acético glacial…………… 7........ 750ml (Ácido pícrico al 1-2% en agua destilada) Formalina comercial 40%.... 75ml Ácido pícrico…………………… 0......... BOUIN ALCOHOLICO: (Dubosq-Brasil) Constituyen una alternativa válida a la mezcla clásica de Bouin cuando la pieza que se va a fijar es voluminosa (velocidad de penetración más elevada) y cuando se precisa una fijación especifica de sustancias hidrosolubles como el Glucogeno.....\nDescalcifica de 24 – 48 horas 2) FORMOL FÓRMICO AL 20 % VENTAJAS: 1. Hay que tener mucho cuidado. No deteriora los tejidos 2. 3) ÁCIDO NÍTRICO AL 5% Conserva la estructura Su relativa lentitud (40 -50h) lo hace idóneo para descalcificar en fines de semana largos. VENTAJAS: Es muy rápido. INCONVENIENTES: Deteriora los tejidos y no debe emplearse mas de 10 – 24h.MATERIAL: LIQUIDOS DESCALCIFICANTES 1) MEZCLA DE CITRATO SÓDICA – ÁCIDO FÓRMICO • SOLUCIÓN A: Citrato sódico al 20% SOLUCIÓN B: Ácido fórmico al 50% Ambas soluciones se mezclan al 50%.  DESCALCIFICACIÓN . 2. etc. añadiendo la B sobre la A en el momento de usarla. VENTAJAS: 1.\n2. (contra mas líquido mas facilidad) 5. Fijarlos en formol 24h. Lavado de 15-30 minutos en agua. la mayor parte de las muestras para estudio histopatologico requiere da la inclusión en un medio sólido. En este caso se realizarán cortes de tejido sin descalcificar empleando un microtomo motorizado específico para seleccionar tejidos duros incluidos en plastico.Se denomina descalcificación a la completa eliminación de las sales de calcio presentes en los tejidos tras haber realizado su fijación. (2-3 veces). Habitualmente este procedeimiento técnico se realiza de forma sistematica sobre tejidos mineralizados (dientes y huesos) y esporádicamente. SOLO ESTÁ DESACONSEJADO DESCALCIFICAR EL TEJIDO EN LAS ENFERMEDADES METABOLICAS.  METODOS Y TÉCNICAS DE INCLUSIÓN Con excepción de los tejidos destinados a congelación. 4.5 x 0.5 cm de dimensiones máximas. Los principales agentes descalcificadores estan formados por acids fuertes o débiles . Introducirlos en líquido descalcificante en proporción 50/1. procurando que todas las superficies estén en contacto con el mismo. lavar con agua corriente las piezas antes de incluirlas en parafina. .5 x 1. Cortar bloques de 1. sobre material anatomicopatologico con calcificaciones que dificulten o impidan la observación macroscopica de las lesiones.  METODO 1. 6. Vigilar la descalcificación cada 12 -24h probando su dureza con aguja o bisturí. 7. 3. Una vez descalcificadas. empleados aisladamente o en conjunción con distintos líquidos fijadores. Cambiar cada vez el líquido.\nAunque es posible realizar la inclusión en muy diferentes medios. En los modernos laboratorios. ya que la acción brusca de un alcohol de elevada graduación sobre el tejido provocaría una elevada retracción de este. el método de elección sigue siendo la inclusión en parafina. puede emplearse como agente deshidratante: • • • El alcohol metílico/metanol Acetona Alcohol butílico . algunos de ellos hidrosolubles. El tejido fijado se somete siempre a: • • • deshidratación aclaramiento infiltración A excepción de la inclusión en un medio hidrosoluble que o requiere de los dos primeros pasos. El proceso de deshidratación se suele realizar mediante el empleo de alcohol etílico. No debe alterar las estructuras tisulares b. no produce cambios estructurales importantes y es miscible con los aclaradores. Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante. (Formolaguaalcohol) 1) DESHIDRATACIÓN La deshidratación tiene por finalidad la eliminación completa de agua de la muestra tisular para que se pueda embeber adecuadamente el tejido en aquellos medios de inclusión que no sean hidrosolubles. Las principales condiciones de un agente deshidratante son dos: a. empleando una serie de baños de graduación ascendente hasta llegar al alcohol absoluto. se realiza de forma automática mediante procesadores de inclusión.La finalidad es proporcionar a la pieza anatómica homogeneidad y dureza suficiente para que se puedan obtener secciones finas de calidad. Además del alcohol etílico. (fuerte choque osmótico) El etanol es el que mejor deshidrata. es barato. La deshidratación podrá realizarse utilizando cualquier reactivo que sea capaz de absorber el agua de los tejidos.\nsondas. agua). También son agentes aclarantes: • • • • • El tolueno Benceno Cloroformo Tetracloruro de carbono Dioxano El alcohol no es soluble con la parafina. en el que pueda disolverse el medio de inclusión. líquidos (fuente de formol. cinta métrica. pinzas con dientes y sin dientes. bisturís. un dictafono para . cuchillos de autopsia). y de éste modo penetrar en el tejido. necesitamos a un patólogo (que hará el tallado) un técnico. OHº Abs Xilol Xilol Xilol Xilol TALLADO Para realizar un tallado. plancha de mármol. flujo laminar de gases. Los agentes aclarantes también reciben la denominación genérica de líquidos intermediarios. una mesa de tallado (tijeras. Con ello se pretende que toda la pieza histopatológica se encuentre embebida en un agente químico líquido. agujas histológicas.• • • Dioxano Alcohol isopropílico Tetrahidrofurano H2O OH º 50 OH º 70 OH º 96 OHº Abs 2) ACLARAMIENTO / PASO INTERMEDIO Es el proceso por el cual se consigue la sustitución del agente deshidratante por una sustancia miscible con el medio de inclusión que va a utilizarse. El xileno es el agente aclarante de empleo habitual.\nEstos baños deben renovarse frecuentemente. los casets debidamente identificados del modo que el patólogo indique. casi siempre es imprescindible eliminar todos los restos aclarantes residuales en el tejido. INCLUSIÓN EN PARAFINA Para la infiltración en parafina se usan habitualmente parafinas con punto de fusión de 56 a 58 grados centígrados. equipos de protección personal (bata. El resultado serán un número de casets identificados con las muestras ya talladas. 3) INFILTRACIÓN. Además. por evaporación del solvente después de la inclusión. Recuerda que las placas se cortaran cuboidalmente (1. mascarilla. que produce una infiltración más rápida. o por su extrema delicadeza no pueden ser incluidas en el procesador automático.una descripción macroscópica. volviéndola más blanda y menos apropiada para el corte. La inclusión en parafina de un tejido se puede realizar: • • • de forma manual automática El procedimiento manual ha sido desplazado por sistemas automáticos. Tiene por objeto rellenar o infiltrar completamente la muestra histopatológica con el medio que se va a utilizar para embeber el tejido. Se realiza mediante baños sucesivos en parafina fundida. Para conseguir éste efecto. guantes.5 x 0. Cuando hay que hacer una . IMPREGNACIÓN. O INCLUSIÓN PRÓPIAMENTE DICHA. porque se cargan de medio de aclaramiento y ello provoca descenso en el punto de fusión de la parafina. fijadas y listas para procesar. Para procedimientos no rutinarios es posible realizar la infiltración en el vacío. por ejemplo: piezas quirurgicas completas. es decir. pero sigue siendo válido para el procesamiento de muestras que por su volumen. la orientación. El medio de inclusión ocupará por completo los espacios intra y extracelulares inicialmente rellenos por el agua intratisular.5 x 1.5 cm) El patólogo decide el método de corte según la estructura de la pieza. se produce la desecación y retracción de la pieza lo que le da un aspecto típico de cuero curtido de las inclusiones defectuosas. gafas…). hojas de petición y los botes.\nTIEMPO PARA BAÑOS Formol 10% líquido de lavado postfijación Etanol al 70% Etanol al 96% Etanol absoluto Etanol absoluto Etanol absoluto Xileno o tolueno Xileno o tolueno Xileno o tolueno Parafina líquida Parafina líquida Parafina líquida TIEMPO TOTAL PROCESAMIENTO MANUAL 2 horas 2 a 4 horas 2 a 4 horas 1 a 2 horas 1 a 2 horas 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 2 horas 16 a 22 horas AUTOMÁTICO 2 horas 2 horas 2 horas 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 2 horas 16 horas TIEMPO PARA BAÑOS Formalina tamponada Etanol al 70% Etanol al 96% Etanol absoluto PROCESAMIENTO RÁPIDO 30 min a 60ºC 30 min a 60ºC 30 min a 60ºC 30 min a 60ºC . indica la necesidad de cambiarlos.inclusión rápida en parafina. • En el procesamiento automático se emplean automáticos que contienen multiples vasos para realizar los baños y un sistema mecánico de transporte a través de ellos regulado por un programador horario. Estos sistemas poseen tres ventajas fundamentales: o Procesar simultáneamente gran cantidad de muestras distintas o Economizar la cantidad de líquidos empleados en el proceso o Realizar el procesamiento a lo largo de la tarde/noche. el procesamiento manual puede ser acelerado realizando también en caliente la deshidratación. pudiendo elaborarse los bloques y hacerse los cortes en la siguiente jornada de trabajo. Para obtener buenos resultados es fundamental renovar a menudo los líquidos contenidos en los baños: su enturbamiento o el olor a líquido aclarante en el último baño de parafina.\nambiente 15 min a t. ambiente 15 min a 60ºC 30 min a 60ºC 1 hora a 60ºC 5 HORAS 30 MINUTOS sucio H2O X 2 PF H2O X 5 min 15 min PF OH 50º PF OH 70º PF OH 96º 45-60 ‘ 45-60’ 45-60’ PF OH Abs 45-60’ PF interme.Etanol absoluto Etanol absoluto Etanol acetona Acetona Xileno o tolueno Xileno o tolueno Xileno o tolueno Parafina líquida Parafin líquida Parafina líquida TIEMPO TOTAL  DESHIDRATACIÓN 15 min a 60ºC 15 min a 60ºC 15 min a 60ºC 15 min a 60ºC 15 min a t. Cuando la demanda de inclusiones es muy elevada. limpio OH Abs PF OH Abs 45-60’ 45-60’  ACLARAMIENTO Xilol 1 60-90’  PARAFINA PF Xilol 2 60-90’ PF Xilol 3 60-90’ Parafina 1 45-60’ Parafina 2 45-60’ Parafina 3 45-60’ FUNCIONES DEL TÉCNICO Tiene a su cargo la programación del procesador automático el recambio periódico de sus líquidos y la colocación en su interior de las canastillas que contienen los casetes. también es competencia del técnico establecer las prioridades: en primer lugar se procesan las pequeñas biopsias de . L inclusión se inicia al final de la jornada y se completará durante la tarde/noche. ambiente 15 min a t.\ny como método previo cuando hay que mantener unidos los diferentes elementos de objetos heterogéneos que deben cortarse por congelación. La inclusión en celoidina es recomendable para materiales de grandes dimensiones o excepcionalmente duros por ej: centros nerviosos de animales grandes o tejido oseo. Con este procedimiento se obtienen bloques de gran dureza. y por último el material de autopsias e investigación. una vez extraídas las muestras del procesador automático de tejidos. Es el caso de la inclusión en: • • • Medios hidrosolubles. o por el tratamiento con agentes . Sólo se emplea en casos muy especiales. La primera tarea diaria del técnico de AP. como la gelatina y el polietilenglicol y su derivados. La inclusión en plástico (resinas) La principal ventaja de la gelatina es que no se precisa deshidratar el tejido.diagnóstico. dias e incluso semanas. es conveniente que participe el técnico que ayudó al patólogo. La inclusión en celoidina. será la fabricación de los bloques de parafina correspondientes a la inclusión del día anterior. y por otra parte los cortes obtenidos a partir de celoidina no pueden ser inferior a 10 micras de grosor. y también para materiales muy heterogéneos por ej: el globo ocular. lípidos y cuantos elementos tisulares puedan ser desnaturalizados por el calor deshidratantes y aclarantes. La mayor limitación es el mucho tiempo necesario para completar el procesamiento. OTROS MÉTODOS DE INCLUSIÓN Se aplican muy raramente en la práctica diaria. por lo general serán de 15 micras. sobre todo en microscopia electrónica. El polietilenglicol y sus derivados se emplean fundamentalmente para la demostración de enzimas. por ello se emplea cuando los compuestos a determinar no resisten el alcohol ni otros disolventes. en segundo lugar las piezas quirúrgicas procedentes de cirugía. También es competencia del técnico el mantenimiento y limpieza del material empleado. ya que es soluble en agua. En las piezas que requieren orientación especial. pero son de gran interés para investigación o en determinadas tecnologías especiales.\no Auto: Activa el movimiento de oscilación de los cestos. 3 posiciones: Manual – auto – OFF.TIEMPO BAÑOS Formalina tamponada Etanol al 70% Etanol al 96% Etanol absoluto Etanol absoluto Etanol absoluto Etanol acetona Acetona Xileno o tolueno Xileno o tolueno Xileno o tolueno Parafina líquida Parafin líquida Parafina líquida TIEMPO TOTAL RÁPIDO 30 min a 60ºC 30 min a 60ºC 30 min a 60ºC 30 min a 60ºC 15 min a 60ºC 15 min a 60ºC 15 min a 60ºC 15 min a 60ºC PARA PROCESAMIENTO 15 min a t. ambiente 15 min a 60ºC 30 min a 60ºC 1 hora a 60ºC 5 HORAS 30 MINUTOS PROCESADOR 2) • • Panel de control Palanca de encendido : ON/OFF. (Piloto. . (piloto. Excepto si está en operación retardada) • • Control para operación retardada. No ontrola el movimiento de la cúpula hasta que los stops del disco están situados. (Piloto – ON) Selector. Se moverá de recipiente en recipiente hasta que se ponga en OFF. 12 stops. cuando el selector está en auto) Disco: periodo de 24 horas. o Manual: No activa movimiento oscilante de los cestos. ambiente 15 min a t. ambiente 15 min a t.\nun microinterruptor corta el circuito. Al lado derecho. 6) Parada automática en la parafina. Esta consta de los elementos necesarios para confeccionar un bloque de parafina que contenga una o varias muestras de tejido dentro de ella. 7) Los potes de parafina están ajustados para control automático de la temperatura en un rango de 37 – 62 grados C.  CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES Para confeccionar bloques en el laboratorio de anatomia patologica y citologia usamos la estacion de inclusión. receptores para los enchufes de los potes de parafina. Usar solo cuando la campana esta elevada.2) 3) Derecha izquierda. debajo de la campana PULL. Las estaciones de inclusión constan de diferentes partes: • • • • Dispensador de parafina líquida Placa caliente (debao de la boquilla de vertido de parafina) donde se calentara el molde de acero y se pone a la misma temperatura que la parafina líquida. si hay solidificación en los potes de parafina. Continua el movimiento oscilante de los cestos hasta que la palanca OFF. 4) Palanca de control manual. Los potes Fusibles a la izquierda tienen unos pilotos que se encienden cuando la palanca ON. 5) Campana de seguridad. se para el movimiento de rotación de la cúpula. Placa fria: para solidificar la parafina (0ºC) Piscina de parafina caliente Aparte de la estacion de inclusión necesitamos: • • • • Un mechero bunsen para calentar la aguja histologica y las pinzas Aguja histologica Pinzas con y sin dientes (Mejor una pinza atraumatica) Moldes de acero PROCEDIMIENTO Y TECNICA: . El fundamento de la confección es obtener un soporte idóneo para el tejido que permita cortarlo con la precision que requiera.\nDesmoldar. • • • Ponemos la tapa del casset y llenamos el molde hasta arriba (ver que la parafina sube por encima de la rejilla del casset). . por tanto. un portabloques en el que se apoya el material que se va a cortar se hace incidir de forma periodica sobre una cuchilla. cogemos los tejidos con una pinza y los ubicamos en el molde de acero.  MICROTOMOS. Dejar al menos 3 minutos. Traslado de ese molde a la placa fria donde se dejará aproximadamente durante 5 y 10 minutos. Para ello utilizamos la pinza de disección sin dientes y la aguja histológica previamente calentadas con el mechero bunsen para evitar el choque fuerte de temperatura. obteniendose secciones tisulares con un espesor equivalente al que previamente se seleccionó en el tornillo micrométrico que controla el mecanismo de avance. Sacar el casset de la piscina de parafina caliente/dispensador y colocarlo sobre la placa caliente. Echar una pequeña cantidad de parafina sobre el molde asegurandonos que este a la temperatura adecuada (0 opacidad). Tipos fundamentales de microtomos: • • • • • microtomo de rotación o tipo Minot microtomo de deslizamiento Microtomo de congelación Criostato o criotomo Ultramicrotomo Todos tienen los mismos principios básicos de funcionamiento. TÉCNICAS DE CORTE DE LOS TEJIDOS El microtomo es un instrumento mecánico con el que se realizan secciones tisulares de espesor micrométrico y. lo suficientemente delgadas para permitir su posterior observación microscópica.• • • • • • Sacar las muestras de la ultima parafina del procesamiento y meterlas en la piscina de parafina caliente/dispensador Encender la placa caliente y ponerla a temperatura de fusión (56-58ºC) Colocar el molde de hacer debajo del grifo de parafina en la placa calefactora. Abrimos el casset. desbastar y cortar.\nUn tipo de microtomo de deslizamiento es el TETRANDER. de gran tamaño. De esta manera. el movimiento que produce el corte es el avence y retroceso de la porción móvil del microtomo sobre unas guias metálicas. Una vez congelado el material. permaneciendo esta fija. las secciones se practican con una cuchilla que pivota sobre un eje fijo. c) MICROTOMO DE CONGELACIÓN (Antiguo y obsoleto) La congelación del material se realiza haciendo circular por el interior de su portabloques hueco. según que se movilice el portabloques sobre la cuchilla. una corriente de anhídrio carbónico procedente de una bombona a presión. o Espesor de los cortes. que permite realizar secciones de órganos completos. El movimiento de rotación del brazo del microtomo produce además el avance automático y constante del portabloques. En ambos casos. mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance . Es un instrumento de gran precisión que permite obtener secciones seriadas muy finas. al expandirse en su interior. y se mueve arriba y abajo delante del filo de la cuchilla. a) MICROTOMO DE ROTACIÓN O TIPO MINOT El portabloques está colocado en posición vertical. produce el enfriamiento progresivo de la superficie donde se coloca el tejido. el gas. Existen dos tipos fundamentales de microtomos de deslizamiento. b) MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO Se le llama así debido a los carriles de que va provisto. Se emplean para efectuar cortes sobre tejido incluido en celoidina. superior a 10 micras o Dificultad para estirar los cortes realizados. d) CRIOSTATO O CRIOTOMO Consta de un microtomo de tipo Minot incluido en una cámara de congelación. o viceversa. de forma que el avance lo realiza el portabloques por un mecanismo directo de tornillo. Este tipo de mirotomo ha sido desplazado por el criostato debido a sus inconvenientes: o dependencia del gas carbónico para mantener la congelación.El portabloques qiene un dispositivo de orientación que garantiza su paralelismo con la cuchilla y es posible cambiar la posición del portacuchillas para variar el ángulo de inclinación de la mismo. El volante que controla la realización del corte se encuentra en el exterior.\n9%. e) ULTRAMICROTOMO (microscopia electrónica) Es un microtomo básicamente derivado del tipo Minot. aunque dotado de numerosas mejoras técnicas que permiten efectuar secciones de hasta unas pocas decenas de nanómetros de espesor a partir de material incluido en plástico (hepoxiresinas). o Entrega al patologo. Biplana estándar: tejidos blandos y duros Biplana con faceta: Tejidos extremadamente duros o Evitan la vibración. Hay 4 tipos básicos de cuchilas: • • • • Bicóncava: Parafina blanda + tejido blando (glandulas) Planoconcavas: Tejidos Blandos (casi no se usan) o Tipo Ay B.  REALIZACIÓN DE CORTES CON EL CRIOSTATO o Muestra en fresco humedecida con suero salino 0. o Se le da un baño de OH 96º y dos baños de para rehidratarlo.están situados dentro de la cámara fria (normalmente a -20ºC). procesar e incluir la muestra en frío (colocaremos el tejido en la platina y le pondremos gel OCT. El resultado es un porta con tejido congelado. . lo colocamos en la pieza del criostato por donde pasará el Nitrogeno líquido para congelar la muestra)    La muestra se pone tal cual viene. o Se prepara la tinción y se tiñe (preferiblemente Hx). o Fijar. TIPOS DE CUCHILLAS PARA EL MICROTOMO En la actualidad se emplean fundamentalmente cuchillas desechables. La cuchilla se encuentra en posición horizontal y pueden obtenerse secciones seriadas grácias a la existencia de un sistema antienrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. Una vez engarzada en el portamuestras se congela y se corta entre 4-6 micras.\nAntes de colocar el bloque en el microtomo debe enfriarse para conseguir la consistencia óptima de la parafina. en caso necesario se restablece mediante manipulación del portabloques. se hace descender el brazo del microtomo hasta que la superficie del bloque entra en contacto con la cara interna de la cuchilla de desbastado. Orientación del bloque. Selección del espesor del corte. • FIJACIÓN AL PORTABLOQUES Hoy en dia en la confección de los bloques de parafina se emplean soportes plásticos que se adaptan al portabloques. Consta de 6 pasos: • • • • • • • Retallado y enfriamiento del bloque. Fijación al portabloques.o Traquea. Con los actuales moldes esta maniobra es innecesaria. En este momento se comprueba el paralelismo entre ambas. El enfriamiento más adecuado se obtiene almacenando los bloques en una cámara frigorifica a 4ºC. zonas de pulmon. Orientación de la cuchilla y desbastado del bloque. músculo… • Desechables: Uso limitado y caro. La temperatura ideal en el momento de realizar los cortes se encuentra entre 5 y 10 grados centigrados. • ORIENTACIÓN DEL BLOQUE Una vez colocado el bloque en el portabloques. TÉCNICAS DE CORTE SOBRE BLOQUES DE PARAFINA Es una de las labores de mayor trascendencia que debe realizar el técnico de laboratorio. • ORIENTACIÓN DE LA CUCHILLA Y DESBASTADO DEL BLOQUE . zonas cartilaginosas. RETALLADO Y ENFRIAMIENTO DEL BLOQUE Retallar un bloque es el eliminar el exceso de medio de inlusión que rodea la pieza. Realización de las secciones.\no Si es mayor de 15ºC. Las posibles arrugas y pliegues que suelen producirse pueden ser eliminadas mediante . la cuchilla estará excesivamente paralela al bloque. el filo no incide sobre la superficie del bloque.Se denomina orientación de la cuchilla a la inclinación de ésta con relación a la superficie del corte. el filo tiende a introducirse profundamente en la parafina del bloque. E conveniente sujetarla según se vaya formando. ser heterogeneo (coagulos. El desbastado termina cuando se obtiene en cada corte la superficie completa del tejido. o Cuando el angulo de inclinación es menor de 10ºC. la cuchilla estará excesivamenteperpendicular al bloque. arrancando parte de esta y provocando una fuerte vibración de la cuchilla. Iniciaremos el movimiento rotatorio del brazo del microtomo hasta obtener una cinta de cortes (5-6 cortes). En caso de que sea necesario. Todo ello origina pequeñas ondulaciones en la superficie del bloque y cortes de espesor muy irregular. se desliza sobre é. etc) o estar cargado de electricidad estatica. la inclusión del material se debe realizar en CELOIDINA. o ESTIRADO DE LOS CORTES Y CONFECIÓN DE LAS PREPARACIONES Se estiran en un baño con agua caliente a temperatura entre 50-56ºC gracias a las fuerzas de tensión superficial que se generan en la ámina de parafina y tejido al hacerla flotar sobre el líquido. • SELECCIÓN DEL ESPESOR DE LOS CORTES Las secciones obtenidas a partir del tejido incluido en parafina suelen tener un espesor de entre 2 y 6 micras. El ángulo de inclinación debe encontrarse entre 10 y 15 ºC. eliminando las cpas de parafina situadas sobre el tejido. se procede al desbastado de este. Cuando el tejido tiende a quebrarse o desmoronarse por estar demasiado frio. Una vez orientada la cuchilla sobre el bloque. Esto trae como consecuencia la obtención de cortes discontinuos de gran espesor. suele ser muy util exhalar vaho de la respiración sobre el bloque de parafina. De esta manera no es posible obtener una sección hasta que el bloque ha avanzado lo suficiente. El tejido incluido en parafina no puede ser cortado don un grosor mayor de 20 micras porque los cortes se enrollan de manera irreversibles. tejido oseo. • REALIZACIÓN DE LAS SECCIONES Se sustituye la cuchilla de desbastado por la que vamos a emplear para los cortes finos.\nde base inmunológica y de biología molecular. con dos pinceles de pelo fino o con dos agujas histoogicas. Para ello se han empleado sustancias naturales como la albumina de huevo o la gelatina. introduciendo verticalmente el portaobjetos en el baño hasta tocar la sección por uno de sus bordes. pero actualmente están siendo sustituidas por materiales sintéticos como la polo-L-lisina. por ello evitaremos que se formen desprendiendolas periódicamente de las superficies del baño. o SECADO DE LAS PREPARACIONES HISTOLOGICAS Se deben secar meticulosamente para evitar su desprendimiento. una ves que están sobre el agua.la manipulación de los cortes. que causan con gran frecuencia el desprendimiento de los cortes. se emplearán para técnicas inmunohistoquimicas con multilpes pasos. Por último se capturan los cortes elegidos. FUNCIONES DEL TÉCNICO . Se deja drenar el aguador gravedad. Se puede realizar de forma rápida. donde se requieren incubaciones prolongadas a 100ºC de temperatura. Las burbujas de aire que se formadebajo de los cortes son difíciles de eliminar son producir artefactos sobre el tejido. Los portaobjetos impregnados en esta sustancia. Esto se consigue pasando sobre la superficie del agua un pañuelo de papel de filtro. y por ello es imprescindible impregnar los portaobjetos con sustancias fijadoras que dificulten éste fenomeno. el corte va quedando adherido al portaobjetos según se retira del agua lentamente. colocando los portaobjetos en la estufa a 60ºC durante 30-60 minutos • SOLUCIONES ADHERENTES PARA PORTAOBJETOS Para los procedimientos más rutinarios. la adhesión del tejido al portaobjetos queda garantizada con el proceso de desengrasado. proporciona la masima adhesividad. Antes de colocar en el baño seccions nuevas. cuando éste se encuentra libre de cortes. Pero hoy en dia se realizan muchas técnicas histoquímicas. y sobre todo para biología molecular. eliminaremos cualquier vestigio de las anteriores para evitar contaminaciones accidentales. que aunque es mucho más cara.\n TRATAMIENTO DE LOS CORTES PREVIO A LA COLORACIÓN • DESPARAFINACIÓN Xilol 1 En caliente (40-45ºC) 10-15 min PF Xilol 2 En frio 10-15 min o Desparafinación física: En la estufa a 60ºC entre 25-45 min (evapora el agua y quita la parafina). . o Desparafinación química: Si ponemos en contacto la parafina con el xilol este la elimina.• • Como norma general. • HIDRATACIÓN OH Abs PF X2 5 min • COLORACIÓN OH 96º PF 3-5 min OH 70º 3-5 min PF OH 50º 3-5 min PF H2Od x2 5 min Los tiempos dependerán de cada colorante utilizado. tiene a su cargo la supervisión y el mantenimiento de los aparatos utilizados. Además de los cortes. El número de técnicas solicitadas.  FUNDAMENTOS GENERALES DE LA COLORACIÓN GENERALIDADES El principio general de las coloraciones se basa en la propiedad que tienen los tejidos o formaciones celulares de incorporar o fijar de modo variable determinadas sustancias llamadas colorantes. cada técnico tiene asignado un número diario de bloques para seleccionar.\nse forman derivados bencénicos. se tiene que adicionar a otros grupos atomicos que tienen la propiedad de disociarse electrolíticamente o de formar sales en los tejidos. . los cuales absorben las radiaciones luminosas dentro del aspecto visible y muestran color. formamos cromógenos que tienen capacidad de coloración* Existen varios radicales cromóforos entre ellos: azoico (-N=N-). A estos grupos se les denomina AUXOCROMOS o potenciadores de color. * Si unimos los bencenos con los cromóforos. En histotecnología de rutina son ampliamente utilizados. • Colorantes artificiales: La mayor parte son derivados de la anailina. Etileno (>C=C<)… Para que el cromogeno se transforme en colorante. Hoy en dia se sintetizan en los laboratorios. siendo los responsables de que si el colorante tenga mayor o menor afinidad por la estructura que va teñir. siendo los más conocidos como colorantes nucleares: Hematoxilina. orceina. Colorantes citoplasmaticos: Safranina. A estos radicales se les llama CROMÓFOROS y al derivado bencénico que se forma recibe el nombre de CROMÓGENO. se obtienen en forma de extractos a partir de ciertas plantas o insectos. Este hidrocarburo aromático es incoloro.TIPOS DE COLORANTES Según su origen: • Colorantes naturales: Son relativamente escasos. Inicialmente se obtenian del alquitran de carbón. Hoy en dia constituyen la base de la mayor parte de las coloraciones histológicas. como una sustancia que puesta en contacto con un soporte adecuado. Estos pueden tener carácter ácido o básico. se une a el de forma perdurable transmitiéndole un color. Carmín. El soporte químico de la mayor parte de los colorantes naturales y de la totalidad de los artificiales es el BENCENO (estable químicamente) (C6H6). Cuando el benceno se pone en contacto con distintos radicales. por lo que su numero crece continuamente. NATURALEZA QUÍMICA DE LOS COLORANTES Podemos definir al colorante.\npero casi no se utilizan. o El color primario del colorante se debe a que predomina en la solución la variedad monomérica (molécula simple). como por ejemplo la Fucsina Básica. en la mayor parte de los metodos. Pueden colorear conjunta o separadamente diversas estructuras. Cristal Violeta. Azul de Anilina… Utilizando principalmente para el citolpasma celular y los compuestos básicos en general (proteínas celulares. por lo que simplemente colorean los tejidos por un mecanismo de impregnación (impregnación argentica). los colorantes metacromaticos se utilizan en concentraciones de 0. • COLORANTES METACROMÁTICOS: La mayor parte de los colorantes tiñen los tejidos de forma ORTOCROMATICA. organulos citoplasmaticos…) • COLORANTES BÁSICOS: Están compuestos por una base colorante y un ácido indiferente. Sin embargo algunos colorantes comunican a ciertos tejidos un color diferente del que le es propio a esto se le llama METACROMASIA. MECANISMOS GENERALES DE LA COLORACIÓN . Verde de Metilo… Se emplean principalmente para colorear los núcleos celulares. comunicandoles los distintos tonos del colorante. pero también colorean en ciertas condiciones. otras estructuras ácidas (ADN). como por ejemplo el Azul de Toluidina. que resultan de la unión de un ácido colorante y una base colorante. que se unen con el colorante para dar la propiedad mencionada. etc. • COLORANTES INDIFERENTES: No poseen carácter ácido ni básico. Fucsina ácida. PAS. Los colorantes metacromáticos son básicos del tipo de la anilina. • COLORANTES NEUTROS: Se pueden considerar como sales. Eritrosina. Violeta de Metilo. Hematoxilinas. Debe evitarse el exceso de tinción suele estar entre 5-20 minutos. cromogeno y el pH. En la práctica.CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SUS GRUPOS AUXOCROMOS Y APETENCIA TISULAR • COLORANTES ÁCIDOS: Son aquellos compuestos cuyo principio activo es el acido. como por ejemplo la Eosina. o Caracteristicas del tejido o sus componentes. La metacromasia va a depender de: o Las particularidades del colorante: grupo auxocromo. Azul de Metileno. Naranja G.1 % en p/v. Estos colorantes no poseen polaridad.\nVioleta de Cresilo… Entre los naturales tenemos: Hematoxilinas. Fucsina Básica. Los dos van a cambiar. ninguno de los dos. Carmín… COLORANTES CITOPLASMÁTICOS En general son menos especificos que los nucleares. se fijan a los componentes extracelulares de los tejidos provocando su tinción simultanea. Los más utilizados son: Eosina. definiendo su contorno y realzando su contenido cromático. o Impregnación: El colorante por su gran volumen molecular o por precipitación en forma de agregados solubles. Eritrosina… . Por ello se utilizan colorantes básicos con apetencia por los grupos fosfóricos ácidos del ADN.Existen tres mecanismos de coloración que se dan entre la materia colorante y los tejidos. o Dilución: El colorante es más soluble en el tejido que en el disolvente que le sirve de vehiculo como el colorante de las grasas (con alcohol la grasa se deshace. además se forma una nueva molécula. Entre estos tenemos: Verde metilo. queda atrapado entre la malla de células y fibras que constituyen el tejido. COLORANTES NUCLEARES La mayor parte de las coloraciones que se utilizan en histopatología contienen colorantes que tiñen de manera especifica el núcleo celular. El colorante al ponerse en contacto con el sustrato a teñir no sufre cambios químicos. • MECANISMO FISICOQUÍMICO: Estas coloraciones tisulares son las que se producen por la atracción electroestatica entre las distintas sustancias que se van a colorear y los colorantes propiamente dichos. • MECANISMO FÍSICO: Es el que se produce por dilución o por impregnación. Uno de los 2 o los 2 puede sufrir cambios químicos. de forma que cuando interaccionan forman un nuevo cromógeno que es el responsable del color obtenido. Safarina. por lo tanto se utiliza SUDAN). • MECANISMO HISTOQUIMICO: Es un mecanismo puramente químico en el cual se produce una reacción química entre el colorante y la estructura objeto de tinción. Son el caso de los colorantes ácidos que tiñen estructuras básicas y viceversa.\nliquido que nos ca a servir como aclarante de la preparación. secarla y recubrirla con una lamina fina de cristal llamada cubreobjetos. Histomount… .  TRATAMIENTO DE LOS CORTES TRAS LA COLORACIÓN • DESHIDRATACIÓN H2Od 5 min • OH 50º PF 5 min OH 70º PF 5 min OH 96º PF 5 min OH Abs PF X2 5 min Xilol X2 10 min ACLARADO Pasaremos los cortes al xileno. haciendola transparente y eliminando todo el alcohol. o Medios de montaje Un buen medio de montaje debe ser químicamente neutro. o Medios no miscibles con el agua Estos son los más utilizados. la eosina Y es mejor. se difunden fácilmente entre las estructuras místicas. Se puden emplear en solución acuosa o alcoholica siendo más solubles en la primera. perfectamente transparente y desprovisto de color. Actualmente se emplea el Eukitt. al mismo tiempo se utilizan estos solventes organicos ya que son miscibles con el medio de montaje que tenemos que utilizar. su empleo es fácil. no alterarse con el tiempo y sobretodo peseer un indice de refracción elevado a fin de revelar al máximo las diferencias de refringencia entre el medio y las estructuras a estudiar. • MONTAJE Y CONSERVACIÓN DE LAS PREPARACIONES Está destinado a facilitar el examen microscopio y especialmente a conservar los cortes durante muhos años. su conservación ilimitada y su indice de refracción es elevado (no produce distorsión). Montar una preparación consiste en impregnarla de una sustancia inactiva.Colorean los tejidos en diversas tonalidades de ROJO y ROSA. siendo fácilemte atraídas hacia los radicales básicos.\ngrasa) Estos medios son de uso menos corriente que los precedentes. hasta que estén secas para etiquetar y archivar.Una vez que el corte esté totalmente transparente se efectua el montaje depositando en el centro del portaobjetos una buena gota de este medio.. ya que es un precursor de un cromoforo. Este cubreobjetos es depositado rápidamente en el centro de la preparación impregnada de Xilol. se exporta en palos de alrededor de un metro (palo de Campeche) se cortan en trozos pequeños para la extracción y el colorante obtenido se utiliza no solamente para microscopia sinó también para teñir la seda y la lana. • OXIDACIÓN DE LA HEMATOXILINA . que trataremos de eliminar con mucho cuidado con la ayuda de una aguja histológica. Las preparaciones montadas las colocaremos en una bandeja portamuestras. pero el colorante natural no es un colorante activo. 100 ml Fenol…………………. 15 gr Agua destilada………. ya que su empleo es mas delicado. La sustancia de montaje se disuelve inmediate. una gota Glicerina……………… 100 ml  FUNDAMENTOS DE LA TINCIÓN CON HEMATOXILINA La hematoxilina es un colorante natural que se extrae del árbol Haematoxilon Campechanum. Entre estos tenemos: Glicerina gelatinizada (la mas utilizada) Gelatina………………. se extiende y generalmente aprisionan algunas burbujas de aire. Con un trapo limpio y con un poquito de xileno trataremos de limpiar los bordes del cristal sin pasar este por encima de la preparación.. Solo sirven prácticamente para montar cortes por congelación conteniendo sustancias y vcolorantes alcohol-solubles. o Medios miscibles con el agua (criostato. sus propiedades conservadoras limitadas y su rendimiento óptico débil. no genera color.\no Oxidación física: Cuando entra en contacot con el aire ambiental (CO2). 0. 1.77 gr Dicromato potásico………… 0.Para que la hemaoxilina puede ser empleada como colorante en histotecnologia.05gr Permanganato potasico……. La oxidación demasiado prolongada (sobremaduración) da lugar a compuestos casi todos incoloros y sin utilidad. 0. (capacidad de tinción muy limitada) ha de ser oxidada previamente a Hemateina (Cromóforo de la hematoxilina). La hematoxilina así obtenida tiene una carga débilmente ácida y una coloración rojo vinosa.5 gr Yodato de Sodio…………… 0.20gr       Todas estas cantidades están referidas a 1gr de hematoxilina. Este proceso de oxidación ha de ocurrir espontáneamente en contacto con el oxigenos del aire a lo largo de 4 a 6 semanas o de forma arificial a traves de agentes oxidantes actuando como Cromóforo. o Oxidación química: Cuando entra en contacto con agentes químicos como el oxido de mercurio. Así las soluciones acuosas neutras se sobreoxidan con facilidad por lo que son relativamente inestables (Harris).28gr Clorato potásico…………….Las alcoholicas glicerinadas tienen mayor duración (Carazzi). por lo tanto es fundamental utilizar en la preparación de los colorantes de hematoxilina la cantidad correcta de oxidante... le confiere la capacidad de teñir. LACAS DE HEMATOXILINA . OXIDACIÓN CROMÓFORO  CROMÓGENO A este proceso se le conoce como MADURACIÓN DE LA HEMATOXILINA puede ser acelerado mediante agentes oxidantes artificiales artificiales como: Oxido de mercurio………… 0..11gr Yodato potásico……………. Estas soluciones de hematoxilina suelen estar influidas por el tipo de disolvente que se utiliza.\nTras la oxidación. Los auxocromos que se emplean son sales metálicas bivalentes o trivalentes. Es una coloración indirecta (uso de mordientes) y es progresiva o regresiva. Como regla general para la preparación de las lacas de hematoxilina debe tenerse en cuenta que todos los componentes de la formula han de agregarse en el orden establecido y deben estar totalmente disueltos antes de añadir el siguiente.…………………………. 20g Yodato potásico (oxidante)……………………. La más utilizada es la Aluminica potásica conocida como hemalumbre. 100mg Glicerina…………..……… 500mg Sulfato aluminico potásico (mordiente)………. actuando como nexos de unión entre el colorante y los tejidos a través de la formación de un quilato en forma de precipitado insoluble. 100ml Agua destilada………………. normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial agregando grupos auxocromos. Hx + O2  HEMATEÍNA(cromoforo) + GRUPO AUXOCROMO BÁSICO (SAP) (Mordiente) • TECNICA HEMATOXILINA EOSINA Es una tinción topográfica de conjunto del tejido de forma que es posible separar todos sus componentes (separar lo ácido de lo básico)...………………... por lo general en forma de alumbres de tal forma que se originan diversas lacas de hematoxilina de carácter básico y tonalidad azulada o negruzca dependiendo de la sal metalica utilizada. 400ml La hematoxilina de Carazzi es un colorante progresivo (aquella que a una mayor exposición.. Estas sales englobadas dentro de los mordientes. que ademas le confiere un carácter fuertemente básico y son los respnsables de su especificidad por los núcleos celulares. HEMATOXILINA DE CARAZZI (500mL): • • • • • Hematoxilina………………………….. más intensidad de color tendrá) .\no Por último se deshidrata.. OHº Abs OHº Abs OHº 96 OHº70 X2 H2Od o Una vez se ha hecho la hidratación se pasa a la coloración con la Hematoxilina Carazzi durante 5 y 15 minutos. en la cual situaremos unas cubetas identificadas. 20 ml . 10 ml o Alumbre potásico o férrico…………………. Reactivos o Hematoxilina………………………………… 1gr o Alcohol absoluto……………………………. HEMATOXILINA HARRIS La hematoxilina de Harris es una tinción regresiva (lo que se ha teñido no se puede retirar ni quitar los restos. o Una vez acabada la coloración con carazzi. o Una vez realizada la desparafinación.o Resultados  Coloración violeta - Técnica: o Se recogen los cestillos llenos de portaobjetos (con sus muestras o cortes correspondientes) y se colocan en la estufa para eliminar la parafina del portaobjetos. se aclara y se monta. cambiándola hasta que esta salga limpia. o Se le da un lavado con agua destilada de 5 o 10 pases.. o Un paso opcional es añadir amoniacal después de la eosina alcohólica. pero usando alcohol clorhídrico se pueden quitar los residuos básicos) por lo que hay que tener un control exhaustivo del tiempo. se preparará una batería en la campana extractora de gases. Para realizar la hidratación. se pasara el cestillo a una cubeta con agua del grifo. se procede a empezar la hidratación. o Como ultima coloración se hace baño en eosina alcohólica de entre 2 y 3 minutos de duración. 20 gr o Agua destilada………………………………….\n. la acuosa y la alcohólica.. se aparta de la llama y se le añade el óxido de mercurio. Esta tinción tiene un inconveniente. Existen dos formas de presentación. se le añade de 2 a 4 cc cada 100 mL de disolución de ácido acético glacial para reducir su capacidad tintorial. siendo el disolvente en la acuosa el agua destilada y en la alcohólica el alcohol de entre 80 y 96 º. Reactivos: o OH 80º………………………………………. EOSINA Es el colorante citoplasmático por excelencia que posee una polaridad ácida. Mezclar y hervir rápidamente.5 y 1 cc de acido acético glacial por cada 100 ml de disolución. 100 ml o Eosina alcohólica …………………………. tiene una duración determinada de entre 6 y 12 meses. 1 gr o Acido acético glacial………………………… 1 ml HEMATOXILINA-EOSINA Reactivos: o Hematoxilina Harris/Carazzi . es el mas utilizado en histotecnología de forma conjunta con la hematoxilina.5 gr Resultados o Coloración azulada Técnica Se disuelve la hematoxilina en el alcohol y el alumbre en agua caliente. además le podemos añadir los 10 ml de alcohol ya que todo se habrá evaporado durante la ebullición. La eosina se vuelve más intensa y selectiva si se le añade entre 0. Una vez enfriada la solución. Ambas poseen una concentración de eosina al 1%.o Oxido de mercurio……………………………… 0. se mezcla por movimientos suaves de rotación.\nRosa pálido o anaranjado. Técnica Se desparafina e hidrata el corte ya realizado previamente. Se hace un lavado de agua destilada para acabar de limpiar los cortes Baño en la tinción de eosina alcohólica durante 2 o 3 minutos... 1gr Alcohol de 96º…………… 100 ml Solución B: Agua destilada……………. Rojo brillante o Citoplasma………………………………. 95 ml Cloruro férrico al 29%.. se aclara y se monta el corte.. Pardo negruzco/azul negro o Eritrocitos. Por último se deshidrata..... Opcionalmente se puede hacer un paso por agua amoniacal para preparar los citoplasmas y fibras antes de la eosina....……. o Hematoxilina de Harris de entre 3 y 5 minutos..o Eosina alcohólica Resultados: o Núcleos……………………………. músculos. HEMATOXILINA FÉRRICA DE WEIGHERT Colorante nuclear tricromico (1 nuclear y 2 citoplasmáticos) Solución A: Hematoxilina……………. gránulos eosinófilos…………. Se hacen 5 pases de OH 96º + HCl Dependiendo de la hematoxilina que usemos: o Hematoxilina de carazzi de entre 5 y 15 minutos.. Se hacen 5 pases de agua + amoniaco. 4 ml Acido clorhidrico al 25 %. Se hace un lavado en agua del grifo hasta que esta salga limpia. 1 ml .....\nTienen una función básica de soporte. la duración máxima es de 2 semanas. Se emplean tres tipos de colorantes: Un colorante nuclear: Por lo general una laca de hematoxilina férrica de weighter . Estos elementos poseen afinidad por los colorantes ácidos. Las fibras del tejido conectivo (con base de proteína) son de tres tipos principales: Colágeno Reticulina Elastina FIBRAS DE COLÁGENO Es el principal tipo de fibra que se encuentra en la matriz extracelular de la mayoria de los tejidos conectivos.  TECNICAS DE TINCIÓN ESPECIFICAS COLORACIONES PARA FIBRAS DEL TEJIDO CONECTIVO Todos los tipos de tejido conectivo o conjuntivo poseen dos elementos constituyentes principales: Las células La matriz extracelular: Componente fundamental que determina las propiedades físicas de cada tipo de tejido conectivo. una vez constituida. FUNDAMENTO DE LAS COLORACIONES TRICROMICAS En general se basan en los mismos principios teóricos. .B sobre A en proporción 1:1. Se han descrito cuatro tipos principales de fibras de colágeno. o Diversos tipos de fibras que se encuentran enclavadas en el interior de la sustancia fundamental. Las tecnicas para tinción de fibras de colágeno se agrupan clásicamente bajo la denominación de COLORACIONES TRICRÓMICAS. Está formado por: o Un material amorfo y transparente denominado sustancia fundamental. Cada uno de ellos presenta ligeras variaciones en al composición de las cadenas polipeptidicas que constituyen las fibras. El colageno tipo I constituye cerca del 90 por cien del colágeno total del organismo y se dispone formando haces gruesos. ya que los demas son muy ácidos.\n- Dos colorantes ácidos. Por lo que respecta a la coloración nuclear empleada. el bajo pH con que se realiza la coloración diferencial hace aconsejabe utilizar lacas de hematoxilina que no sean decoloradas en el proceso de tinción. El colorante que se encuentra en solucion finamente dispersa puede penetrar en poco tiempo en todas las estructuras. las fibras del tejido conjuntivo forman una malla menos densa. solo penetra en ese periodo entre las mallas estructurales poco densas. Derivan del anillo del trifenilmetano (grupo auxocromo) (teñira el colágeno): Fucsina ácida Azul de anilina Verde luz    En el proceso de fijación tisular. En estas coloraciones es un factori importante el valor del pH a que se utilizan los colorantes. puede emplearse (teñira el citoplasma):    Acido Pícrico Naranja G Naranja de Metilo o El otro estará en solución coloidal. todavía no habrá penetrando en las mallas estructurales finas. FIBRAS DE RETICULINA . donde luego se acoplaran los colorantes ácidos derivados del trifenilmetano. las proteinas de los citoplasmas celulares se agrupan para formar una malla de poro muy fino. También desempeñan un papel importante los ácidos fosfotungstico o fosfomolibdico. de particulas gruesas.5). que se diferencian en sus propiedades físico químicas: o Uno de ellos se encontrara en disolución verdadera (disolución homogenea en que todos sus iones se disuelven por completo) de particulas pequeñas. El colorante que se encuentra en solución coloidal de particulas gruesas. En cambio. Si la coloración con los derivados del trifenilmetano (colorante ácido) se prolonga demasiado. incluidas las mas finas (colorantes citoplasmáticos). ya que tienen mayor apetencia por las fibras colágenas en medio fuertemente ácido (2. que al parecer bloquean selectivamente los residuos básicos existentes en el tejido a excepción de las fibras de colágeno. se origina una sobrecoloración de todos los elementos tisulares. las mas indicadas las lacas de hematoxilina férrica. finamente dispersas.\nOHK) • Ag2O + NH3 (gota a gota)  Plata amoniacal Ag(NHO3)2   . Formas de impregnación argentica o Impregnación argentica por mecanismos predominantemente físicos y físico-químicos: Hasta que no hayamos reducido la plata. Para poner de manifiesto éstas fibras se emplea la impregnación argéntica (plata metenamina). IMPREGNACIÇON ARGENTICA Se basa en la reducción del nitrato de plata (forma más estable de la plata) AgNO 3 hasta obtener plata metálica. que antes se consideró que representaba una especie distinta de fibra debido a su afinidad por las sales de plata con las que se tiñe de negro grisaceo. ya que los tejidos tienen afinidad por la plata. por eso necesitamos un agente reductor externo. Este tipo de impregnación puede realizarse por la reacción de BIEL CHOWSKY. Posteriormente los iones de plata atraídos por el tejido (por fuerzas electroestáticas) son precipitados a plata metálica por acción de un agente reductor externo. son ARGILOFILOS (apetencia de un tejido o estructura por los iones de la plata metalica.El colágeno tipo III da lugar al tipo de fibra conocido como reticulina. para conseguir que se deposite sobre los tejidos en forma de precipitado. Para que sea posible este tipo de impregnación: Se necesitan varios agentes reductores externos (tejidos argentofilos pero no argentafines)  Los tejidos a teñir deben presentar argentofilia. la impregnación no hará nada. Las fibras de reticulina forman la delicada malla reticular de sostén en los tejidos muy celularizados tales como el higado y los organos linfoides. impregnación argentica en dos tiempos: Impregnación primaria: • AgNO3 (5%) + Agente reductor 5 gotas al 40 %  Ag2O (base fuerte OHNa. que es la propiedad de unirse a los iones de plata derivados del nitrato de plata o de la plata amoniacal.\nNo todos los tejidos tienen idéntica apetencia por la plata. o Impregnación argéntica por mecanismo histoquímico: No requiere un agente reductor externo. la plata metálica en forma de finos precipitados tiene especial apetencia por depositarse sobre estructuras fibrilares finas y pr superficies celulares dotadas de delgadas prolongaciones tales como células de la glia. En este caso el tejido interviene activamente a través de una reacción química de reducción. * La oxidación es coger electrones de una molécula mediante sustancias reductoras. tanto la carga electrica como la textura de las células por teñir.La plata amoniacal es soluble en agua pero inestable e iónica Impregnación secundaria: • Plata amoniacal + Formol (10%)  Plata metálica Esta impregnación es para cuando el tejido no es argentafin * Si el tejido es argentafin. * La reducción es quitar electrones de una molécula usando sustancias oxidantes. interviene de manera decisiva. los tejidos deben presentar  ARGENTAFINIDAD. Para que sea posible éste tipo de impregnación. . que por este motivo reciben la denominación de argirófilas. fibras reticulares del tejido conjuntivo. etc. no haria falta seguir con la impregnación secundaria * La plata metalica es la que se deposita sobre el tejido en forma de moleculas muy estable. ya que el tejido poseera sustancias argentofines (capaces de reducir la plata por si solas). ya que este necesita un agente reductor. * Un tejido argentofin será argentofilo. neuronas. Esta propiedad es caracteristica de determinadas granulaciones citoplasmaticas presentes en células cutáneas como los melanocitos que secretan melanina. pero un tejido argentofilo no será siempre argentofin. y ciertas células de secreción endocrina presentes en el tubo digestivo y que reciben el nombre de células argentafines (células calciformes). En general . que es la propiedad de reducir la plata amoniacal a plata metálica sin la intervención de agentes reductores externos.\ngrupos químicos que favorecen la coloración. Es muy frecuante que se desprendan sobretodo si el grosor de los cortes es elevado y el portaobjetos no está impregnado de alguna sustancia adhesiva. Están compuestas por un núcleo central de naturaleza proteica. FIBRAS DE ELASTINA Las fibras elasticas del tejido conjuntivo se encuentran fundamentalmente en determinados órganos dotados de especial distensibilidad. disponiendose en forma de fibras y hojas discontinuas en la matriz extracelular. piel. Cuando se emplea permanganato potasico deben blanquearse los cortes a continuación con una solución de METABISULFITO SÓDICO u ACIDO OXALICO. - Después de la impregnación argéntica se puede realizar un viraje con una solución de cloruro de oro. rodeado . Para evitarlo emplearemos los portaobjetos adecuados y los cortes serán lo mas delgado posible (no mas de 5 micras).MANIOBRAS COMPLEMENTARIAS A REALIZAR USUALMENTE EN LA IMPREGNACIÓN ARGENTICA - En la mayor parte de las técnicas es conveniente realizar un tratamiento previo con un agente oxidante del tejido como el PERMANGANATO POTASICO. que dará un color negro azulado a los depositos pardo negruzcos de la plata. cualquier impureza en él o en el agua destilada utilizada para lavarlo hace precipitar la plata amoniacal. pulmón. vasos sanguineos. - Siempre hay que fijar la coloración con TIOSULFATO SÓDICO (Hiposulfito). que hace que aparezcan en las estructuras. que retira la sal de plata no reducida y la plata metálica que no ha impregnado las estructuras. - La limpieza del material de vidrio que se emplea en este tipo de tinción debe de ser escrupulosa. - Uno de los principales problemas que plantean las técnicas de impregnación argéntica es la fijación del corte al portaobjetos.\nEsta capa parece esencialmente responsable de las afinidades por los colorantes de las fibras elasticas...3 min Lavar con agua ---.4gr (citoplasma) o Agua destilada………………………… 300ml o Acido ácetico glacial………………….paso ligero Acido fosfomolibdico ---.5min Lavar con agua ---. es una capa protectora de la fibra). MÉTODO TRICRÓMICO DE MASSON Reactivos: Hematoxilina de Harris (núcleos) Rojo Mallory (disolución verdadera): o Fucsina ácida………………………….3 min Lavar con agua ---.paso ligero Verde luz ---.de elastomucina (carácter ácido. 0. aclarar y montar Resultados Nucleos  Azul . 1cc (mordiente) Ácido fosfomolibdico al 1% (diferenciador) Verde luz (disolución coloidal) o Agua destilada………………………… 100cc o Verde luz……………………………… 1gr o Acido acético glacial…………………. 1gr (colágeno) o Naranja G……………………………. El colorante más empleado es la orceina (carácter ácido aunque tiñe fibras ácidas) que se fija selectivamente aunque sin especificidad absoluta sobre estos elementos. 1cc (mordiente) Técnica Desparafinar e hidratar Hematoxilina de Harris ---. Tambien se puede emplear la TÉCNICA DE GOMORI que ya no se usa.paso ligero Deshidratar..paso ligero Rojo Mallory ---.\nazul MÉTODO TRICRÓMICO DE VAN GIESON PICROFUCSINA DE VAN GIESON: Es una coloración tricrómica compuesta por una coloración nuclear (hematoxilina férrica).5 min Aclarar en agua destilada Teñir en la solución de trabajo de Van Gieson ---. una coloración citoplasmática por un colorante ácido (ácido pícrico) y una coloración selectiva del colágeno por otro colorante ácido (fucsina ácida). Queratina. 90 ml La solución actua mejor si se deja madurar durante algunas semanas. Reactivos Hematoxilina férrica de Weighert Picro-fucsina de Van Gieson (solución coloidal) o Solución 1:   Fucsina ácida……………. fibras musculares y eritrocitos  Rojo anaranjado Colágeno  Verde. Si está recién preparada se le agrega inmediatamente antes de su uso.- Citoplasmas.25 ml/100ml de ácido clorhídrio concentrado Técnica Desparafinar e hidratar Hematoxilina férrica de weighert ---.30 segundos /1 min Secar con papel de filtro Lavar rapidamente en etanol al 70% Completar la deshidratación con rapidez.10/12 min Lavar en agua corriente ---. 0. aclarar y montar Resultados . 10 ml Solución 2………………. 1gr Agua destilada…………… 100 ml o Solución 2:  Solución acuosa saturada de ácido pícrico (solución verdadera) o Solución de trabajo:   Solución 1……………….\n..... Resultados Fibras reticulares  negro (color lápiz) ................ 40 cc o Nitrato de plata al 10%...................... 7 min (impregnación primaria) Lavar en agua destilada Formol al 10% paso ligero hasta color tabaco (impregnación secundaria) Lavar en agua destilada Deshidratar........ o Añadir agua destilada………………………… 320 cc Técnica: Desparafinar e hidratar Permanganato potasico al 0.....……………..... 40 cc o Añadir amoniaco gota a gota hasta que la disolución se vuelva transparente................... aclarar y montar..........- Nucleos  azul negruzco Citoplasmas  amarillo Colágeno  rojo intenso TÉCNICA DE WILDER (RETICULINA) Reactivos: Permanganato potásico al 0.............. 1º min (colorear fibras) Lavar en agua destilada Plata de Wilder/amoniacal……………….5 % ………………………5 min Lavar en agua destilada Acido oxalico al 1% hasta decolorar Lavar en agua destilada Alumbre férrica al 2%...5% (oxidante del tejido) Acido oxalico/metabisulfito de sodio al 1% (blanqueante  adquirir color) Alumbre férrico al 2% (ayuda a las fibras colágenas) Formol al 10% (revelante) Hiposulfito sódico al 5% (retira la sal no reducida y la plata metalica no fijada) Plata Wilder/ Plata amoniacal o Hidroxido de sodio al 3%..........................\n........... 0..- Fibras colágenas  amarillento rojizo TÉCNICA DE ORCEINA – VAN GIESON (FIBRAS ELASTICAS Y COLÁGENAS) Reactivos Solución de Orceina: o Orceina………………………………….......6 ml Alcohol ácido: o Alcohol absoluto ……………………… 100ml o 10 gotas de HCl concentrado Solución número 2 de Van Gieson (Picrofucsina) o Solución acuosa de fucsina ácida al 1% …………… 15 ml o Solución acuosa saturada de ácido pícrico …………... 2 partes Técnica solución 2 de Van Gieson 5 min Hx férrica Lavado H2O grifo Lavado H2O destilada Acido pícrico. 50 ml o Agua destilada ……………………………………… 50 ml Solución de ácido pícrico: o Alcohol etilico al 96% ……………………… 1 parte o Solución acuosa saturada de ácido pícrico…......... 1gr o Alcohol etilico al 70%...fucsina ácida 5 min Deshidratar Resultados Núcleos  Marrón/Negro Colágeno  Rosa . 100 ml o Acido clorhidrico concentrado ……….\ncuando aparece marrón pálido examinar microscópio.2/10 min observando a simple vista.5/30 min hasta decolorar. 100cc Orceina ácida .. 0..2/3 min Diferenciar en la solución de ácido pícrico hasta que aparezca solo en rojo la colágena Deshidratar. Completar la decoloración del fondo con alcohol ácido ---.15 gr o Ácido sulfúrico………………………………….. lavar el exceso de colorante Alcohol absoluto ---. 100 cc Ácido oxálico al 2% Solución de orceina: o Orceina…………………………………… 0. 0.30/60 min Lavar en agua ---.- Musculo  Amarillo Técnica Desparafinar e hidratar Solución de orceina ---.4 gr o Ácido clorhidrico………………………… 1 cc o Alcohol de 70 grados……………………..015 cc o Agua destilada…………………………………. aclarar y montar Resultados Fibras elasticas  marrón (concentración de orceina + alta) Fibras colágenas  rojo Citoplasmas y músculo  amarillo pálido TÉCNICA DE LA ORCEINA (nuclear azul de metileno) Reactivos: Mordiente: o Permanganato potásico…………………………. las fibras eslasticas apareceran de color purpura. Lavar en agua corriente por lo menos 5 minutos Colorear con la solución de Van Gieson numero 2 ---.2/3 min Secar en papel de filtro Alcohol de 95 grados .\n5 min Lavar en agua corriente Solución de orceina ---. a temperatura ambiente dura como maximo una semana.- Alcohol ácido: o Alcohol absoluto………………….3 minutos Lavar en ácido oxalico ---.5 min Deshidratar.marrón Nucleo  Azul Colágeno  No teñido La solución de orceina no dura mas de un mes en la nevera. El azul de metileno tiñe los fibroblastos (sus núcleos) COLORACIONES PARA ESTUDIOS NEUROHISTOLÓGICOS .20/30 min Lavar en agua corriente Lavar y decolorar en alcohol de 96 grados y extraer el exceso de colorante Alcohol ácido ---.2/5 min Lavar en agua corriente ---. aclarar y montar Resultados: Fibras elasticas  Negro. 100 cc o Ácido clorhidrico…………………. 10 gotas Técnica Desparafinar e hidratar (opcional azul de metileno y agua) Mordiente ---..\nAdemás de colorear los grumos de Nissl tiñen los núcleos. violeta de cresilo… Estos colorantes se unen a los ácidos nucleicos por un mecanismo físico químico de atracción electroestática. ya que en ciertas enfermedades se observa su desaparición. son acumulo de reticulo endoplasmatico rugoso que se encuentran en el citoplasma de las neuronas. ya que estos contienen ADN. 100 ml Resultados: Grumos de Nissl y núcleos  Violeta Células nerviosas  Azul tenue Estructuras restantes  No se tiñen COLORACIONES PARA VAINAS DE MIELINA Determinadas fibras nerviosas van recubiertas por unas envolturas llamadas vainas de mielina que contienen sustancias lipoides.Barrera utiliza como coloranteel luxol Fast blue.. Poner de manifiesto estas grasas es importante. .5 gr o Tampón acetato……………………………………. y estan compuestos por RNA ribosómico y RNA mensajero.. las vainas de mielina que rodean a las fibras nerviosas y la glia o tejido de sostén. Se pueden realizar: COLORACIONES NO ARGENTICAS: o Coloraciones para neuronas y grumos de Nissl: Los grumos de Nissl.La finalidad de las preparaciones neurohistológicas es poner de manifiesto los tres elementos constitutivos fundamentales del sistema nervioso: las células nerviosas. El método de Kluver. azul de toluidina. 4 partes Solución de cresilo extra: o Violeta de cresilo extra o tionina…………………… 0. Para que la coloración sea adecuada se necesita un pH ácido TÉCNICA DE NISSL Soluciones: Tampón acetato o Acetato sódico………………………………………1 parte o Acido acetico………………………………………. o sustancia tigroide. tionina. según ciertos autores se produce una atracción fisico-quimica entre la mielina y el colorante. Para teñirlos se emplean colorantes básicos como: azul de metileno.\n.......5% o Carbonato de litio……………………………………….... En la actualidad la inmunohistoquimica está desplazando a las coloraciones clásicas.................... 0............... MÉTODO KLUVER....... 0........ sino tambien las celulas nerviosas y sus núcleos por una tinción combinada con violeta de cresilo........... 75 gotas Carbonato de litio al 0.....5 ml Violeta de Cresilo al 0............ Con esta tecnica queda teñida no solo la mielina..............................para otros lo que sucede es que el luxol Fast blue tiene una gran apetencia por los fosfolípidos y la tinción tien lugar por una disolución del colorante en la mielina.... ya que mediante anticuerpos específicos se identifican con claridad la mielina y los oligodendrocitos que la producen...........1% o Luxol Fast blue... 500 ml Resultados: Vainas de mielina  Azul o verde azulado Neuronas y grumos de Nissl  Violeta o rosado  HISTOQUÍMICA ...............5 gr o Agua destilada…………………………………………… 500 ml o Acido acetico glacial al 10%........... 0.5 gr o Alcohol de 96º…………………………………………… 500 ml o Acido acetico glacial 10% ……………………………… 2...25 gr o Agua destilada…………………………………………… 500 ml Alcohol etilico al 70%.BARRERA Solución: Luxol Fast blue al 0....................1 % o Violeta de Cresilo………………………………………........\nLos monosacáridos al igual que los oligosacáridos son solubles en agua.La histoquímica es una rama de la histología que sirviendose de reacciónes químicas estudia la localización microscópica de las sustancias que componen los tejidos o la actividad de las enzimas. Las moleculas más sencillas de hidratos de carbono se denominan monosacaridos. Si el numero de moleculas de monosacaridos es superior a 10 se forman polisacaridos. Si el grupo carbonilo se encuentra en posición terminal (aldehido) y si el grupo carbonilo está incluido en la cadena por lo general en posición 2 (cetona). Los glucidos . disminuyendo su solubilidad con el grado de polimerización llegando a la total insolubilidad que suelen presentar los polisacaridos. ciertas sustancias y su actividad. Por condensación de dos a diez moleculas de monosacáridos se forman oligosacáridos. En todas estas reacciones químicas o bien se tiñe la sustancia que buscamos o los colorantes reaccionan con ella químicamente. Tinciones para glúcidos Tinciones para lípidos Tinciones para pigmentos Histoquímica enzimatica TINCIONES PARA HIDRATOS DE CARBONO O GLÚCIDOS Los hidratos de carbono son polialcoholes oxidados (polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas). La histoquímica es la aplicación de reacciones químicas en la técnica histológica con el fin de localizar y determinar de manera científica. Se perderan tantas moleculas de agua como uniones se originen.\nmonómeros o poco polimerizables no se conservan en las preparaciones histológicas ordinarias debido a su gran solubilidad. como el glucogeno (glucosa + glucosa…) musculo e higado Los polisacaridos complejos. factor intrinseco…) La queratina Tiroglobulina Heparina o Mucoproteínas: Son complejos de proteínas y polisacáridos en los que predomina el primer componente. podemos considerar: Los polisacaridos simples. Si el contenido en hexosamina es superior al 4 % se denominan mucoproteinas. pueden emplearse dos tipos de técnicas: Técnicas histoquímicas: reacción del PAS Los MUCOPOLISACARIDOS ÁCIDOS son fáciles de caraterizar por métodos histoquímicos. que se subdividen en tres grandes grupos: o Mucopolisacaridos:  Acidos (dependiendo de que presenten o no grupos ácidos) • • • •  Condroitina : Proteina de la sustancia fundamental del cartílago Sustancia fundamental del tejido Ácido hialurónico Células glandulares del epitelio respiratorio Neutros (con frecuencia se hallan unidos a una proteina. fundamental se emplea: La técnica del azul alcián La reacción metacromática (azul de toluidina) . Entre los polisacaridos. si es inferior se denominan glucoproteinas. o Mucolípidos: Son una mezcla de polisacaridos y ácidos grasos complejos. Para la demostración histológica del GLUCOGENO. “moco”) Revestimiento gástrico (pepsina. Sólo los polisacaridos son detectables por métodos histoquímicos. formando glucoproteinas o mucoproteinas) • • • • • Glándulas intestinales de duodeno y yeyuno principalmente (células calciformes que segregan mucina. que se encuentran generalmente en forma de cerebrósidos y gangliosidos (SNC y mielina).\ndesde el punto de vista de su detección. de modo que puedan ser posteriormente demostrados por el reactivo de SCHIFF. TINCIÓN P.A. en una porción aproximada de uno por molécula de monosacárido. A menudo se les designa con el nombre de compuestos mucides. Se disuelve y se enfria a 50ºC. se dice que son compuestos PAS +.S Reactivos: Acido peryódico 0. Se deja reposar 24 h en un frasco opaco y se filtra (la solución no . MUCOPROTEINAS.5% Bisulfito Sódico al 2% Hx Carazzi Reactivo de Schiff o H2O……………………… 200 cc o Fucsina básica……………. 2 gr o Metabisulfito sódico o HCl concentrado…………. El agente oxidante es generalmente el ácido periódico. Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados. aunque en alguna variante puede utilizarse el ácido crómico. GLUCOPROTEINAS Y MUCOLÍPIDOS constituyen un grupo homogéneo.Los MUCOPOLISACARIDOS neutros. si se encuentran situados en carbonos contiguos. La reacción del PAS es uno de los mejores métodos para su detección. ya que solo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff. 1 cc o Carbono activado Preparación: Se lleva a ebullición el agua y se añade la fucsina. Los mucopolisacaridos ácidos no pueden ser oxidados por el ácido peryódico por presentar grupos ácidos: carboxilicos o sulfatados. Por ello es necesario oxidarlos. con el fin de incrementar dichos grupos. en lugar de grupos alcoholicos. a diferencia de los mucopolisacáridos ácidos que son compuestos PAS -. Filtrar y añadir metabisulfito y HCl (color rosa pálido). REACCIÓN DEL PAS Fundamento Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico para incrementar el número de grupos carbonilos presentes en ellos.\n20/30 min Bisulfito sódico Lavado en agua ---.3/5 min Lavado en agua del grifo ---.10 min HX Carazzi ---. Añadir el Carbono más o menos unos 8 gr cada 200 ml de solución. Cuando coja un color rosadito lo tiramos. Lavado en agua ---. aclarar y montar Resultados: Nucleos  Azul PAS +  Rosa. rojo (a veces naranja) PAS . Incoloro .10 min. Dejaremos reposar unas horas y lo filtraremos (en nevera y frasco topáceo). entre transparente y rosa pálido).2/10 min Reactivo de Schiff ---. Técnica: Desparafinar e hidratar Crear dobles enlaces con el acido periódico ---.tiene que tener color.2/4 min Deshidratar.\nDocumentos similares a PROCESOS 1\nMás de Zoila Gutierrez Ayala\nCelulas Madres de La UCM\nLesiones Pre Neoplasicas18!05!2013\nSilabo - Fisico Quimica 2017\nREPORTE LABORATORIO FLUIDOS 2 4 MANUEL MOROCHO.pdf\nGuia de Problemas Espectrofotometria\nEJERCICIOS DE QUIMICA.docx\nInforme 3 - Elaboración de jabones.docx\nFormato Informe Laboratorio.doc


jueves, 21 de enero de 2021, 19:51\nRedacción Diario de Valderrueda | jueves, 7 de enero de 2021, 22:19\nInternet, gracias a la velocidad de la red actual, permite que la mayoría de los usuarios puedan seguir sus eventos favoritos desde cualquier dispositivo. Entre esos eventos, por supuesto, los deportes son algunos de los más seguidos, y existen aplicaciones y servicios dedicados precisamente a complacer esos gustos.\nGratuitos o de pago, especializados en un deporte o multitemáticos, la diferencia entre los servicios no sólo va de precios o de dispositivos compatibles, por lo que las posibilidades de elección son bastante diversas, de acuerdo a los intereses de cada uno de los usuarios.\nDenominado el Netflix de los deportes, es una de las plataformas que más rápido ha crecido y hoy es sinónimo de deportes en vivo, de deportes en alta definición y de eventos exclusivos, como la Premier League o los mejores combates del boxeo mundial.\nDAZN tiene un primer mes gratuito para nuevos usuarios, a partir de ahí, tiene un coste mensual de 9,99 euros, aunque se pueden utilizar diferentes trucos para abaratar ese coste sin perder calidad en el servicio, e incluso, hay sitios que ayudan a conseguir DAZN pirateado para no pagar nada por un servicio premium.\nVentajas: la mayor cantidad de eventos deportivos del mundo, la mejor definición y una plataforma muy interactiva a disposición, tanto en la web como en todos los dispositivos.\nDesventaja: es una aplicación de pago, aunque existen trucos y sitios web que ayudan a abaratar ese coste.\nCuando se trata de ver deportes en vivo y por streaming, Movistar + es una de las aplicaciones más interesantes que existen. Aunque para tener acceso a la misma se requiere disponer de una cuenta como suscriptor de su servicio de televisión, la aplicación complementa la experiencia con la posibilidad de ver todos los eventos deportivos en vivo o en diferido, y desde cualquier dispositivo.\nSi se tiene este servicio de suscripción en casa, tener la aplicación es prácticamente una obligación para no sólo limitarse al televisor como dispositivo para ver los deportes, sino que también se pueda usar en una tablet o un móvil inteligente para ello.\nVentajas: exclusividad en algunas ligas y eventos -el fútbol español, por ejemplo-.\nDesventaja: es necesario ser cliente de su servicio de televisión por suscripción para hacer uso de la aplicación.\nEs una de las páginas más conocidas para ver deportes de forma gratuita por internet. Sólo transmite deportes en vivo y está enfocada en una variedad de deportes muy amplia, aunque con especialidad en el cricket -de ahí su nombre-, el baloncesto y el fútbol -siendo las ligas británicas donde se concentra el grueso de su oferta-.\nAl ser gratuita, lógicamente se echan en falta una serie de características que sí están disponibles tanto en DAZN como en Movistar +, como la calidad siempre en HD o 4K, narración y comentarios en español, y una selección mucho más amplia de contenidos.\nVentajas: gratuito y sin necesidad de instalar nada.\nDesventajas: no tiene la cantidad de eventos de otras plataformas, y la definición casi siempre es estándar (SD).\nQue la industria del juego ha crecido en España no es un secreto para nadie. Pero lo que sí se olvida varias veces, es que la mayoría de las casas de apuestas ofrecen servicio de streaming deportivo para sus usuarios, o al menos, así sucede en las casas de apuestas más conocidas.\nAlgunas, por términos de patrocinio, terminan teniendo transmisión exclusiva de algunas ligas o equipos, por lo que resultan una referencia obligada. Lamentablemente, no se puede disfrutar de forma gratuita de este servicio, sino que se debe ser usuario y haber realizado, alguna vez, un depósito en este tipo de páginas.\nVentajas: la mejor definición, eventos en vivo con sonido ambiente y sin comentaristas, variedad muy amplia de contenidos.\nDesventajas: si bien el servicio es gratuito, por ser un aspecto adicional a las características de cada cuenta, sí que se debe hacer un depósito como usuario de la casa de apuestas en cuestión para disfrutar de los contenidos en streaming.


La informática, también llamada computación, es una ciencia que estudia métodos, técnicas, procesos, con el fin de almacenar, procesar y transmitir información y datos en formato digital.\nNo existe una definición consensuada sobre el término, lo cual puede comprenderse a través de las Discusiones que acompañan esta página. Sin embargo, la Asociación de Docentes de Informática y Computación de la República Argentina (ADICRA) han tomado una posición, definiéndola de la siguiente manera:\nEn los inicios del procesamiento automático de la información, con la informática solo se facilitaban los trabajos repetitivos y monótonos del área administrativa. La automatización de esos procesos trajo como consecuencia directa una disminución de los costes y un incremento en la productividad. En la informática convergen los fundamentos de las ciencias de la computación, la programación y también las metodologías para el desarrollo de software, la arquitectura de las computadoras, las redes de computadores, la inteligencia artificial y ciertas cuestiones relacionadas con la electrónica. Se puede entender por informática a la unión sinérgica de todo este conjunto de disciplinas. Esta disciplina se aplica a numerosas y variadas áreas del conocimiento o la actividad humana, como por ejemplo: gestión de negocios, almacenamiento y consulta de información, monitorización y control de procesos, industria, robótica, comunicaciones, control de transportes, investigación, desarrollo de juegos, diseño computarizado, aplicaciones/herramientas multimedia, medicina, biología, física, química, meteorología, ingeniería, arte, etc. Puede tanto facilitar la toma de decisiones a nivel gerencial (en una empresa) como permitir el control de procesos críticos. Actualmente, es difícil concebir un área que no use, de alguna forma, el apoyo de la informática. Ésta puede cubrir un enorme abanico de funciones, que van desde las más simples cuestiones domésticas hasta los cálculos científicos más complejos. Entre las funciones principales de la informática se cuentan las siguientes:\nLos virus informáticos son programas que se introducen en una computadora, sin conocimiento del usuario, para ejecutar en él acciones no deseadas.\nTroyanos: hace que las computadoras vayan más lentas.\nObtenido de «https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Informática&oldid=107661310»\nSe editó esta página por última vez el 9 may 2018 a las 14:01.


Ramón Vargas en Lucerna - SWI swissinfo.ch\nRamón Vargas en Lucerna\nEl tenor mexicano Ramón Vargas se presenta este miércoles 11 de mayo con la Filarmónica de Baden-Baden, bajo la batuta de Pavel Baleff, en Lucerna.\nEste contenido fue publicado el 10 mayo 2011 - 17:16 10 mayo 2011 - 17:16\nLa cita se produce días después de su aplaudida presentación en Berna el 3 de mayo, un regalo a los sentidos con su presentación de gala.\nEl tenor nacido en 1960, cuyo debut en el escenario fue en 1982 en la Ciudad de México, tiene un lazo afectivo con Suiza significativo. Justo después de su iniciación con el personaje de John Falstaff en la ópera de Verdi, firmó contrato en 1988 como miembro de la compañía de Teatro de Lucerna, donde se hizo de renombre.\nDurante dos temporadas interpretó numerosos papeles protagónicos, incluyendo algunos poco usuales como Belfiore en Il viaggio a Reims, Nerone en L'incoronazione di Poppea, Werther, y Axur, Re d'Ormus de Salieri.\nEn 1990 se volvió independiente y también es estrella en la vecina Zúrich, en la casa de ópera citadina.\nSu reconocimiento como uno de los mejores tenores del momento fue en 1993 con la suplencia en lugar de Luciano Pavarotti en ‘Lucia di Lammermoor’ de Donizetti.\nVargas ha interpretado en el escenario más de cincuenta papeles principales, fundamentalmente de los repertorios belcantista y románticos (Mozart, Rossini, Donizetti, Bellini); pero ha sido aclamado también en óperas verdianas como Traviata, Rigoletto, Don Carlo y Ballo, en Werther de Massenet, Les Contes d'Hoffmann de Offenbach, Faust de Gounod, Eugen Oneguin de Tchaikovski, The Rake's Progress de Stravinski, y La Bohème de Puccini, entre muchas otras.\nEl repertorio en Berna y Lucerna esta vez son una muestra de esta versatilidad y riqueza de repertorio, con la Filarmónica de Baden-Baden, con la experiencia en la dirección del reconocido Pavel Baleff.\nFondo Memorial Eduardo Vargas\nRamón Vargas en Suiza\nEste contenido fue publicado el 22 dic. 2009 22 dic. 2009 El reconocido tenor lírico mexicano, considerado actualmente como uno de los mejores a nivel mundial, se encuentra en Suiza este mes de diciembre...


Pursuit Force: Extreme Justice. Playstation Portable: GAME.es\nEstás en: Inicio Videojuegos Pursuit Force: Extreme Justice\nCapital City es una ciudad asediada por el crimen y sólo hay una solución, Pursuit Force y su Justicia Extrema. En esta secuela de uno de los grandes éxitos de PSP, las nuevas bandas campan a sus anchas y deberás hacer todo lo que esté en tu mano para detenerlas.\nLas persecuciones a toda velocidad son aún más emocionantes gracias a la habilidad de saltar entre los vehículos a toda pastilla y la llegada de vehículos como tanques gigantes, trenes e incluso escuadrones de aviones que completan las nuevas opciones de la persecución. El juego incluye nuevas opciones multi-jugador y otras como 'Justice Bar', que te permitirá recuperar fuerzas y prolongar la misión con lo que podrás disfrutar aún más de la persecución original. Enfréntate a nuevas bandas y a Viper Division, un escuadrón rival de la fuerza policial. Salta de vehículo en vehículo para que nada te detenga a la hora de administrar justicia extrema.


Protección Civil reporta saldo blanco en la FENAE 2018 – San Luis A Tiempo\nProtección Civil reporta saldo blanco en la FENAE 2018 Reviewed by Momizat on Abr 07 . El balance en una semana de la Feria Nacional de la Enchilada 2018 ha sido positivo al registrarse hasta el momento “saldo blanco”, informó el director de Prote El balance en una semana de la Feria Nacional de la Enchilada 2018 ha sido positivo al registrarse hasta el momento “saldo blanco”, informó el director de Prote Rating:\nYou Are Here: Home » Soledad » Protección Civil reporta saldo blanco en la FENAE 2018\nProtección Civil reporta saldo blanco en la FENAE 2018\nPosted date: abril 07, 2018 In: Soledad\nEl balance en una semana de la Feria Nacional de la Enchilada 2018 ha sido positivo al registrarse hasta el momento “saldo blanco”, informó el director de Protección Civil Municipal de Soledad, Mauricio Ordaz Flores.\nDestacó el comportamiento de la población que ha formado parte de las diferentes actividades, principalmente del Teatro del Pueblo, en donde se han presentado artistas que han atraído a miles de personas, lo que aunado a una estrecha coordinación entre las corporaciones de seguridad pública y Protección Civil han logrado que todo se desarrolle sin incidencias.\nEn los módulos de Protección Civil se han entregado trípticos que contienen información sobre las recomendaciones que deben observar al asistir a eventos masivos como el no acudir con carriolas, con objetos que pudieran causar algún daño como hebillas, está prohibido el ingreso de bebidas alcohólicas, entre otros.\nSeñaló que existe la constante revisión a todos los puestos que se instalan en los distintos pabellones; en la muestra gastronómica se tiene especial cuidado en los tanques de gas y que éstos cumpla con los lineamientos establecidos en cuanto a su instalación y capacidad, así como las condiciones de las instalaciones eléctricas, además hasta las 11 horas se permite el abastecimiento de lo necesario en cada uno de los negocios.\nEn el área de juegos mecánicos es exhaustiva la revisión, con el objetivo de garantizar la seguridad de quienes hacen uso de los mismos, “tenemos peritos en la materia y especialistas en dictámenes estructurales”.\nFinalmente, hizo la invitación a toda la población soledense a que acuda en la recta final a este gran evento ferial, con la confianza de que se desarrolla en un ambiente familiar.


«Las ondas cerebrales son los ladrillos con los que la consciencia se construye a sí misma en nuestra forma física.»\nfueron diseñados de forma genérica y\nLa mejor forma de determinar si un entrenamiento cerebral está siendo productivo es saber de antemano qué funciones específicas estamos optimizando (concentración, memoria, ondas cerebrales específicas, etc). Después, debemos mantenernos constantes con la forma de entrenamiento cerebral que hemos escogido y convertirla en un hábito, ya que los logros derivados de nuestro entrenamiento cerebral no son permanentes. No podemos esperar cambios estables si apenas hemos practicado.\n«En Mindful Science ofrecemos diversas prácticas para ejercitar las ondas cerebrales Alfa y Theta.»\nEstos antiguos conceptos de samata y vipasana, concentración y observación, representan en realidad dos aspectos de la atención, un estado metacognitivo de la mente que permite que se active el mecanismo biológico de la conciencia. Cuando estamos concentrados en lo que observamos, estamos atentos; cuando estamos atentos, nos volvemos conscientes de lo experimentado, y nuestro cerebro responde conectando funcionalmente las neuronas que estaban dispersas en la corteza cerebral y el tálamo.