[Titelseite] Kapitel: 1. | 2. | 3. | 4. [5. Literatur] [6. Zusammenfassung] [Abkürzungsverzeichnis] [Publikationen] [Selbständigkeitserklärung] [Danksagung] Zitatabschnitt: 123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748495051525354555657585960616263646566676869 [Inhaltsverzeichnis] 3. Ergebnisse\n▼ 30 (fortgesetzt)\n▼ 31 Um den Einfluss von Nager-Zytomegalieviren auf den Zellzyklus zu untersuchen, wurden unterschiedliche Zellen mit den gebräuchlichsten M/RCMV Stämmen: MCMV, Stamm „Smith“, RCMV, Stamm „Maastricht“ und RCMV Stamm „England“ infiziert.\nAm Beginn der Experimente stand die Messung des Einflusses dieser Viren auf die Zellproliferation. Es wurden sowohl asynchron proliferierende verschiedene immortalisierte Zelllinien wie NIH-3T3 und Rat1 als auch primäre embryonale Fibroblasten von Ratte (REF) und Maus (MEF) infiziert. So konnten mögliche zelllinienspezifische Effekte und unterschiedliches Proliferationsverhalten der Zellen mit in die Untersuchungen einbezogen werden. An dem steigenden Verlauf des Graphen der uninfizierten Zellen (Abb. 8) kann man erkennen, dass die Zellen so ausplatiert wurden, dass die uninfizierten Zellen stetig über drei Tage proliferieren konnten. Über den beobachteten Zeitraum verdreifachte sich die Zahl der primären Zellen, während die immortalisierten Zellen wesentlich schneller proliferierten. Die Proliferationskurve der NIH-3T3 Zellen erreichte bereits nach 48 Stunden ein gleichbleibendes Niveau. Die infizierten Zellen (infiziert mit MOI = 10) zeigten keine Zunahme der Zellzahl (Abb. 8). Da im Lichtmikroskop kaum tote Zellen gesehen wurden, war dies ein erster Hinweis darauf, dass die Ursache für den Proliferationsstop eher auf eine unterbundene Zellproliferation als auf eine erhöhte Apoptoserate zurückzuführen war. Diese Vermutung wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit durch Zellzyklusprofile infizierter Zellen belegt (siehe Abschnitt 3.2).\nBereits 8-12 h nach Infektion wird deutlich, dass alle Nager-CMV die Zunahme der Zellzahl komplett inhibieren. Dieser Effekt wird schon in der frühen Phase der Infektion beobachtet und impliziert, dass early oder immediate-early Virionproteine eine Rolle bei der Vermittlung dieses Effektes spielen könnten. Sowohl bei immortalisierten als auch bei primären Zellen konnte der gleiche antiproliferative Einfluss durch die Infektion beobachtet werden; dies zeigt, dass es sich offenbar nicht um zelllinienspezifische Effekte handelt. Zusammengenommen schlagen die Ergebnisse der Untersuchungen vor, dass Nager-CMV die Zellproliferation inhibieren, was in Übereinstimmung mit dem antiproliferativen Effekt von HCMV auf humane Vorhautfibroblasten steht (Lu und Shenk, 1996).\n▼ 32 Abbildung 8: Zellproliferationskurven von infizierten und uninfizierten Zellpopulationen. Asynchron proliferierende NIH-3T3 Zellen, MEFs, Rat1 Zellen, REFs und immortalisierte REFs wurden mit M/RCMV (MOI=10) infiziert und zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Anschließend wurde die Zellzahl in der Neubauerzählkammer bestimmt. In den Diagrammen ist die errechnete Zellzahl gegen die Erntezeitpunkte aufgetragen.\nUm herauszufinden, ob dem beobachteten Proliferationsstop ein Block in einer bestimmten Zellzyklusphase zugrunde lag, wurden mittels durchflußzytometrischer Bestimmung des DNA-Gehalts Zellzyklusprofile infizierter und nicht infizierter Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten erstellt. Um anhand der Stärke der Fluoreszenz den relativen DNA-Gehalt der Zellen im Durchflußzytometer zu messen, wurde die DNA der Zellen mit Propidiumjodid angefärbt. In eine Messung flossen ungefähr 10.000 einzelne Zellen ein. Daraufhin wurden DNA-Histogramme erstellt, in denen der relative DNA-Gehalt gegen die Zellzahl aufgetragen ist (Abb. 9). Das Zellzyklusprofil asynchron proliferierender Zellen zeigt zwei Peaks, die durch ein Plateau verbunden sind. Der erste Peak beinhaltet die Zellen der G1-Phase, der zweite die Zellen der G2- und M-Phase und das Plateau enthält die Zellen der S-Phase. Zellen, die sich ganz am Ende oder Anfang der S-Phase befinden, können durch diese Methode allerdings nicht von den G1- bzw. G2-Zellen abgegrenzt werden.\nDie uninfizierten Zellen (Abb. 9, Diagramme der oberen Reihe) zeigen ein normales Zellzyklusverteilungsmuster von proliferierenden Zellen; auffallend ist hierbei ein größerer Anteil an Zellen in der S-Phase, der am ehesten auf die schnelle Proliferation der immortalisierten Zellen zurück zu führen ist. Im Verlauf des Experiments arretieren die uninfizierten Zellen aufgrund der Zelldichte frühzeitig nach 24 h in Rat1-Zellen bzw. nach 48 h in 3T3-Zellen, zu erkennen am gleichbleibenden G1-Anteil der Proliferationskurven.\n▼ 33 Die Infektion der Zellen mit M/RCMV hat eine Änderung dieser Verteilung zur Folge: Bereits in den ersten 9 Stunden steigt der Anteil der G1-Zellen in den RCMV infizierten Populationen an (Abb. 9A). Es handelt sich bei RCMV E infizierten Zellen um einen Anstieg von 39% auf 73% und bei mit RCMV M infizierten Zellen auf 62%. Durch gleichzeitige Beobachtung der Zellen mit dem Lichtmikroskop wurde deutlich, dass die Anreicherung der G1-Zellen dabei nicht auf eine Kontaktinhibition zurückgeführt werden konnte (daher nicht gezeigt).\nBei den MCMV infizierten Zellen war ein geringerer Anstieg der G1-Population zu beobachten (Abb. 9B): von 29% auf 40%. Bemerkenswert ist, dass in den MCMV infizierten Zellen, im Gegensatz zu den RCMV infizierten Zellen, ein Anstieg des G2-Peaks von 11% auf 50% zu beobachten ist, was ein wahrscheinlicher Grund für den geringeren Anstieg des G1-Peakes in diesen Zellen darstellt, und erstmals andeutet, dass die Infektion mit Nager-CMV zu einem G2-Arrest führt.\nNach 24 Stunden ist in den infizierten Zellpopulationen eine Verbreiterung und Verschiebung des G1-Peaks in die S-Phase, entlang der Achse des DNA-Gehalts, zu beobachten. Dieser Befund impliziert, dass G1-Zellen eine zusätzliche DNA-Last erfahren und deutet somit auf den Beginn der viralen DNA-Synthese hin. Diese Konstellation ist typisch auch für HCMV infizierte Zellen (Dittmer und Mocarski, 1997;Jault et al., 1995;Lu und Shenk, 1996). Diese zusätzliche DNA-Synthese kann im weiteren Verlauf dieser Arbeit durch die Behandlung mit Ganciclovir unterbunden werden (siehe 3.4), was die virale Genese dieser DNA-Last belegt. So lässt sich zusammenfassend feststellen, dass die RCMV infizierten Zellen vorwiegend in G1 und die MCMV infizierten Zellen in G1 und darüber hinaus vor allem auch in G2/M akkumulieren. Zusätzlich ist eine Abnahme der S-Phase-Zellen zu beobachten.\n▼ 34 Abbildung 9: Zellzyklusverteilung M/RCMV infizierter Zellen. Die jeweilige Zellpopulation wurde zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Durch Propidiumjodidfärbung und anschließende durchflußzytometrische Bestimmung des DNA-Gehalts wurde dann ihre Zellzyklusverteilung ermittelt. Gezeigt sind DNA-Histogramme, in denen die prozentuale Verteilung auf die einzelnen Zellzyklusphasen (G0,G1/S/G2, M) vermerkt ist.\nWie oben gezeigt scheint es den Nager-CMV möglich zu sein, die Zellzyklusprogression infizierter Zellen in der G1- und G2/M-Phase zu unterbrechen. Um dies eindeutig zu belegen und Unterschiede aus zu schließen, die lediglich aus der ungleichmäßigen Zellzyklusverteilung der asynchron proliferierenden Ausgangspopulation resultieren, wurden in einem nächsten Experiment die Zellen vor der Infektion chemisch synchronisiert. Dabei wurde nach einem Schema verfahren, in dem Zellen durch Nocodazol reversibel in der Mitose arretiert werden. Nach Aufhebung des Nocodazolblocks durchlaufen die Zellen synchron die folgenden Zellzyklusphasen und wurden dann entweder in der späten M/frühen G1 oder in der frühen S-Phase infiziert (Abb. 10). Nocodazol ist ein viel benutzter, synthetischer Inhibitor der Mikrotubuliformierung (De Brabunder 1976). Aufgrund fehlender Ausbildung der mitotischen Spindel kommt es zu einem reversiblen Block in der Prometaphase der Mitose (Zieve 1980).\n24 h nach dem Ausplatieren wurden die Fibroblasten für 12 h mit Nocodazol behandelt, was zu dem o.g. Zellzyklusblock in der Mitose führte (Abb. 10, 36 h). Nach der Entfernung von Nocodazol konnten die Zellen aus diesem reversiblen Zellzyklusblock ihre Zellzyklusprogression wieder aufnehmen und erreichten so nach 38 h die späte M- und frühe G1-Phase (M/G1) (Abb. 10, 38 h) und nach 45 h die frühe S-Phase (Abb. 10, 45 h). Die so synchronisierten Zellen wurden dann in der M/frühen G1 oder in der frühen S-Phase mit den verschiedenen CMV Stämmen infiziert und die Zellzyklusverteilung wurde 12 h und 24 h nach der Infektion untersucht (siehe Abb. 11).\n▼ 35 Abbildung 10: Synchronisation der Zellen mit Nocodazol. Zellen wurden durch 50 ng/ml Nocodazol reversibel in der Prometaphase der Mitose arretiert. Die solchermaßen synchronisierten Zellen wurden in der Folge in M/G1- oder in früher S-Phase infiziert (MOI=10). Die gezeigten DNA-Histogramme demonstrieren den Erfolg der Synchronisierung und die Zellzyklusverteilung zu den Zeitpunkten der Infektion.\n12 h nach Restimulation in M/G1 haben uninfizierte Kontrollzellen überwiegend die G2-Phase erreicht (Abb. 11, 38 h nach Ausplatierung/12 h/uninfiziert). Nach 24 h (Abb. 11, 38 h nach Ausplatierung/24 h/uninfiziert) befindet sich der größte Teil dieser Ausgangspopulation wieder in der G1-Phase und die Proliferation wird normal fortgesetzt.\nIm Gegensatz zu uninfizierten Zellen erreichen in M/G1 mit M/RCMV infizierte Zellen zum überwiegenden Teil nicht die G2-Phase, statt dessen akkumulieren sie 12 h nach Infektion in der G1-Phase (Abb. 11, 38 h nach Ausplatierung/12h/+ CMV). Dies deutet darauf hin, dass die mit M/RCMV infizierten Zellen in der G1-Phase arretieren. Wie bereits in Abschnitt 3.2 beschrieben, setzt nach 24 h die virale Replikation ein, was keine weitere Analyse der genauen Zellzyklusprogression erlaubt.\n▼ 36 Kontrollzellen, die 45 h nach dem Ausplatieren (also 9 h nach Restimulation) in der späten G1/frühen S-Phase sind, erreichen nach 57 h (Abb. 11, 45 h nach Ausplatierung/12 h/uninfiziert) synchron erneut die G1-Phase und proliferieren normal weiter. Im Gegensatz dazu zeigen die Zellzyklusprofile der in der späten G1/frühen S-Phase infizierten Zellen einen G2/M-Arrest. Da auch diese Zellen, ohne die G1-Phase wieder zu erreichen, virale DNA produzieren, zeigt dies, dass die Nager-CMV, im Gegensatz zu HCMV (Salvant et al., 1998), Zellen in der frühen S-Phase infizieren und die virale DNA-Synthese starten können.\nInteressanterweise verursacht eine Infektion von Zellen in der späten S-Phase (46,5 h nach dem Ausplatieren) hingegen keinen G2/M-Phase-Arrest (Abb. 12). Wie die Kontrollzellen (Abb. 12, uninfiziert) erreichen infizierte Zellen deshalb nach der Synchronisation wieder die G1-Phase (Abb. 11, 45 h nach Ausplatierung/+ CMV). Offensichtlich machte es einen entscheidenden Unterschied für die weitere Zellzyklusprogression bzw. den viralen Infektionszyklus, ob Zellen am Beginn oder am Ende der S-Phase infiziert werden.\nDiese Ergebnisse veranschaulichen (Abb. 12), dass sowohl MCMV als auch beide RCMV Stämme in der Lage sind, Zellen in der G1- und G2/M-Phase zu arretieren. Dies steht im Kontrast zu HCMV, welches Zellen nur in der G1-Phase blockiert.\n▼ 37 Abbildung 11: MCMV und RCMV arretieren Zellen in G1 und G2/M. Zellen wurden wie bereits in Abb. 10 beschrieben in M/G1 bzw. früher S-Phase infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, mit Propidiumjodid gefärbt und ihr DNA-Gehalt durchflußzytometrisch bestimmt. Gezeigt ist die Zellzyklusverteilung M/RCMV infizierter und nicht infizierter Zellen in DNA- Histogrammen.\nUm diese Zellzykluseinflüsse von MCMV und RCMV durch weitere unabhängige Experimente zu bestätigen wurde getestet, ob eine Infektion serumarretierter Zellen diese daran hindern, nach Serumrestimulation wieder in den Zellzyklus einzutreten und diesen zu durchlaufen.\n▼ 38 Um die Zellen in G0 zu akkumulieren, wurde den Zellen 72 h das Serum entzogen. Nach der dann folgenden Infektion und Serumrestimulationwurde dem Zellkulturmedium das Thymidin-Analog BrdU hinzugefügt. Dadurch wurde bis zur Ernte in neu synthetisierte DNA BrdU inkorporiert. Eine DNA-Neusynthese war auf diese Weise durch BrdU-spezifische Antikörper nachzuweisen. Eine Doppelfärbung der geernteten Zellen mit Propidiumjodid und direkt FITC-markierten BrdU-Antikörpern macht darüber hinaus eine eindeutige Darstellung aller Zellzyklusphasen möglich. Dargestellt sind die Ergebnisse in Density Dot Blots, in denen der DNA-Gehalt gegen die Menge an eingebautem BrdU aufgetragen ist.\nIn uninfizierten Zellen ist bereits nach 12 h BrdU nachzuweisen. Sie haben also begonnen, ihre DNA zu replizieren (Abb. 13B, Diagram 2) und verteilen sich nach 16h über die gesamte S-Phase (Abb. 13A, 2 und 13B, 3), was sich an der Verschiebung entlang der BrdU-Achse erkennen lässt. Im Gegensatz dazu sind die infizierten Zellpopulationen zu frühen Zeitpunkten noch BrdU-negativ (Abb. 13B Diagramm 5 und 8), d. h., es wurden anstatt der BrdU-Einbau signalisierten FITC-Fluoreszenzen nur die Autofluoreszenzen von G1-Zellen gemessen. Eine DNA-Synthese infizierter Zellen ist erst nach 16 h zu beobachten und reflektiert dann sowie nach 20 h, am ehesten die virale DNA-Replikation. Zum Nachweis viraler DNA siehe auch Abb. 13, Diagramme 5A und 6B, 9B, 7B und 10B. Vor dem Hintergrund der bisherigen Versuche unterstützen somit auch diese Ergebnisse die Sichtweise, dass Zellen, die aus der G0/G1-Phase kommen, durch die Infektion mit M/RCMV in der G1-Phase arretieren.\n▼ 39 Die bisher gezeigten durchflußzytometrischen Analysen lassen offen, ob der durch M/RCMV hervorgerufene Zellzyklusarrest in der G2-Phase oder der Mitose stattfindet. Um diesen späten Zellzyklusarrest in diesem Sinne genauer zu charakterisieren, wurden im Folgenden infizierte Zellen auf die Anwesenheit von Mitosemarkern untersucht.\nAls ein erster Marker bietet sich die Untersuchung des Zustandes der Chromosomen an. In der ersten Phase der Mitose, der Prophase, erfolgt neben der Auflösung der Kernmembran und der Wanderung der Zentriolen zu den Polen auch die Kondensation der Chromosomen. Durch entsprechende Chromosomenpräparation ist es möglich, den Zustand der Chromosomenkondensation zu beurteilen. So wurden NIH-3T3 Zellen und Rat1 Zellen, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben, mit Nocodazol synchronisiert, in der frühen S-Phase infiziert und nach 12 h, als die Zellen in G2/M arretiert waren, geerntet und der Chromosomenpräparation unterzogen. Ein Teil der verwendeten Zellen wurde mittels Durchflußzytometrie analysiert, um sicher zu sein, dass die Zellpopulation dem durch M/RCMV induzierten Proliferationsstop in G2/M unterlag. Es zeigt sich dabei, dass die für die Analyse verwendeten infizierten Zellen zu mehr als 90% in der M/G2-Phase arretiert waren (Daten nicht gezeigt). Als Kontrollzellen dienten NIH-3T3 und Rat1 Zellen, die 12 h mit Nocodazol behandelt worden waren. Es konnte gezeigt werden, dass die Chromosomen dieser Kontrollzellen bereits kondensiert waren (Abb. 14, nocodazolbehandelte Kontrolle).\nIm Gegensatz dazu ergab die Analyse der CMV-arretierten Zellen noch keine Chromosomenkondensation (Abb. 14, + CMV). Das bedeutet, dass sich die infizierten Zellen noch in der Interphase des Zellzyklus befinden müssen und somit in G2 arretiert waren.\n▼ 40 Abbildung 14: Chromosomenpräparate infizierter Zellen. Nocodazol behandelte Zellen wurden in der frühen S-Phase infiziert, zum Zeitpunkt des G2/M-Arrestes geerntet und wie bereits beschrieben durchflußzytometrisch analysiert. Dann erfolgte die hier gezeigte Chromosomenpräparation und die Färbung des Zellmaterials mit dem Giemsa-Farbstoff.\nDieses Ergebnis sollte mit einer unabhängigen Methode bestätigt werden. Im Kontrast zu der Histon H1 Phosphorylierung, die während des gesamten Zellzyklus erfolgt, wird die stärkere Phosphorylierung des Histon H3 nur im Zusammenhang mit der Chromosomenkondensation, somit zu Beginn der Mitose, gefunden (Hendzel et al., 1997). Die H3 Phosphorylierung kann also ebenfalls als Marker für die frühe Mitose benutzt werden.\nDie durch CMV in G2/M arretierten Zellen wurden mit einem phosphospezifischen Anti-Histon H3 Antikörper inkubiert, und die dann folgende Doppelfärbung mit Propidiumjodid und einem FITC-konjugierten Antikörper machte die Darstellung des phosphorylierten Histon H3 mittels Durchflusszytometrie möglich. Dargestellt sind die Ergebnisse in Density Dot Blots, in denen die Zellgröße gegen das phosphorylierte Histon H3 aufgetragen ist. Während die uninfizierten, nocodazolbehandelten Kontrollzellen deutlich die Phosphorylierung von Histon H3 erkennen lassen, kann in den infizierten Zellen keine phosphorylierte Form von Histon H3 nachgewiesen werden (Abb. 15). Somit zeigen beide Ergebnisse, dass der durch M/RCMV verursachte späte Zellzyklusarrest in der G2-Phase erfolgt, bevor die Zellen in die Mitose eintreten. ▼ 41 Abbildung 15: Histon H3 Phosphorylierung. Die Zellen wurden wie in Abb. 14 beschrieben infiziert. Die durch CMV in G2 arretierten Zellen wurden nach der Ernte mit einem phosphospezifischen Histon H3 Antikörper behandelt und das Signal des phosphospezifischen Histon H3 Antikörpers wurde im Durchflußzytometer gemessen. Als Kontrolle dienten nocodazolbehandelte Zellen. In den gezeigten Dot Blots ist die Zellgröße gegen die Histon H3 Phosphorylierung aufgetragen.\nBisher konnte gezeigt werden, dass MCMV und RCMV in der Lage sind, Zellen in G1 und G2 zu arretieren. In den gezeigten Zellzyklusprofilen infizierter Zellen ist jedoch außerdem eine zusätzliche DNA-Synthese beobachtet worden. Deshalb sollte in den folgenden Experimenten untersucht werden, ob es sich bei dieser DNA tatsächlich um virale DNA handelt und ob MCMV und RCMV (im Gegensatz zu HCMV) auch von G2 aus ihr Genom replizieren können. Um eindeutig zwischen viraler und zellulärer DNA-Replikation unterscheiden zu können, erfolgte die Behandlung von Zellen mit spezifischen Inhibitoren der viralen DNA Replikation. Ganciclovir (GCV) wird in die DNA eingebaut und hemmt dadurch spezifisch die virale DNA-Polymerase, nicht aber die zelluläre. Foscarnet (PFA), das ebenso die virale DNA-Polymerase hemmt, blockiert die Bindungsstellen von Pyrophosphat. Asynchron proliferierende Zellen wurden wie gewohnt infiziert. Nach der Absorptionszeit wurden in den ersten Versuchen 50 μM Gancyclovir zugegeben. Anschließend wurden die Zellen zu entsprechenden Zeitpunkten geerntet und ihr DNA-Gehalt mit Hilfe der Propidiumjodidfärbung durchflußzytometrisch bestimmt. Neben infizierten Zellen wurden auch uninfizierte Zellen mit GCV behandelt, was zeigte, dass der Wirkstoff per se keinen Effekt auf die Zellzyklusverteilung hat (Daten hier nicht gezeigt). Nur in MCMV und nicht in RCMV infizierten Zellen konnte die virale DNA-Synthese durch GCV Zugabe gehemmt werden (Abb. 16). In Abbildung 16A wurde eine dreidimensionale Darstellung der DNA-Histogramme gewählt, um einen besseren Vergleich der Kurven zu ermöglichen. Zusätzlich sind in Abb. 16B die Ergebnisse in Density Dot Blots dargestellt. 12 h nach der Infektion mit MCMV befindet sich der größte Teil der Zellen in der G1 und G2-Phase, während sich die S-Phase entleert hat. Die Zellzyklusverteilung stimmt also mit den bisherigen Beobachtungen überein. Nach 24 h ist die virale Replikation bereits zu erkennen: der G1 und G2 Peak verschiebt und verbreitert sich horizontal auf der Abszisse, was dafür spricht, dass sowohl von der G1 als auch von der G2–Phase aus virale Replikation beginnt (Abb. 16A). Deutlicher werden diese Ergebnisse durch die Darstellung in Abb. 16B, die Signalein den Diagrammen 2, 3 und 4 „wandern“ die Abszisse entlang hin zum Bereich des höheren DNA-Gehalts; 36 bzw. 48h nach Infektion sind die Effekte jeweils massiv verstärkt. Diese Effekte werden durch die Behandlung mit GCV gänzlich unterdrückt, und die Analysen ergeben normale Zellzyklusprofile proliferierender Zellen (Abb. 16A und 16B/+MCMV +GCV). Dies zeigt, dass die neu synthetisierte DNA tatsächlich viralen Ursprungs ist. In den infizierten Zellen sind 36 h nach Infektion zwei Peaks zu beobachten, die GCV unterdrückt und somit durch die Anhäufung viraler DNA verursacht werden. Der erste entsteht zwischen 2N und 4N DNA-Gehalt und der zweite hinter dem 4N DNA-Gehalt. Diese Ergebnisse belegen somit, dass MCMV sowohl in G1 als auch in G2 arretierten Zellen DNA replizieren kann.\n▼ 42 Im Gegensatz zu diesen eindeutigen Befunden mit MCMV, konnte die virale Synthese weder von RCMV E noch von RCMV M durch GCV gestoppt werden (Abb. 17 A und B). Die RCMV infizierten Zellen zeigen das bereits beschriebene typische Zellzyklusbild infizierter Zellen mit zusätzlichen Peaks der Zellzykluskurven an den Stellen zwischen 2N und 4N und größer 4N (Abb. 17 A und B + RCMV). Dieses Bild konnte jedoch durch die Zugabe von GCV nicht beeinflusst werden (Abb. 17 A und B +RCMV +GCV), die virale DNA-Synthese konnte also nicht durch GCV gehemmt werden.\nFür GCV ist aus der Literatur (Brideau et al., 2002) und aus eigenen Versuchen bekannt, dass es die virale Replikation von RCMV nicht eindeutig verhindern kann, deswegen wurde auf den Hemmstoff Foscarnet (PFA) zurückgegriffen. Es wurde wie oben beschrieben verfahren, wobei nach der Absorptionszeit den Zellen nun 300 μg/ml PFA zugesetzt wurde.\n▼ 43 Eigene Beobachtungen zeigten, dass durch den Zusatz von PFA kein Einfluss auf MCMV infizierte Zellen erzielt wird (Daten nicht gezeigt). Bei den RCMV infizierten Zellen konnte eine Inhibition der viralen DNA-Synthese beobachtet werden. Aus Abb. 18 wird deutlich, dass in den infizierten Zellen (Diagramme 1, 2, 3, 4) eine Verschiebung des DNA-Gehalts weit hinter den Bereich des 4N DNA-Gehalts von G2 Zellen (gekennzeichnet durch die vertikale Linie) erfolgt, was auf virale DNA-Synthese (wie bereits beschrieben) hinweist. Werden die infizierten Zellen mit PFA behandelt, nimmt die Dichte der Zellen in diesem Bereich ab (Abb. 18, Diagramme 5, 6, 7 und 8). Es ist bekannt, dass verschiedene Hemmstoffe unterschiedlich sensitiv sind (Brideau et al., 2002). Da Inhibitoren also nicht immer gleich zu wirken scheinen, weist die nicht qualitative Wirkung von PFA in Analogie zum Maussystem darauf hin, dass es sich auch hierbei mit hoher Wahrscheinlichkeit um virale DNA handelt.\n▼ 44 Da virale DNA-Replikation sowohl von der G1- als auch von der G2-Phase aus beobachtet werden konnte, stellte sich nun die Frage, ob in den G1- und in den G2-arretierten Zellen auch jeweils infektiöse Virionen gebildet werden. Um diese Frage zu klären wurde nach dem in Abbildung 10 vorgestellten Protokoll vorgegangen. Der Überstand der so in G1 und G2 arretierten Zellpopulationen wurde mittels Plaque-Assays auf den Gehalt infektiöser Virusnachkommen untersucht. Es wurden alle Nager-CMV in die Analyse einbezogen. In Abb. 19 sind die Ergebnisse der Titrationen (in PFU/ml) gegen die Erntezeitpunkte aufgetragen. Die Diagramme (Abb. 19) zeigen, dass die Menge an infektiösen Virionen in G1- und G2- arretierten Zellen nahezu gleich ist. Das demonstriert eindeutig, dass MCMV und RCMV nicht nur Zellen in G1 und G2 arretieren und dort virale DNA replizieren sondern im Unterschied zu HCMV (Fortunato et al., 2002;Salvant et al., 1998) in beiden Zellzyklusphasen auch produktiv replizieren können.\nIm weiteren Verlauf dieser Arbeit erfolgte die Untersuchung der molekularen Grundlagen, des durch M/RCMV verursachten Zellzyklusarrestes. Der durch HCMV verursachte G1-Arrest geht mit veränderten Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten und Beeinflussung unterschiedlicher Zellzyklusregulatoren einher. Aus diesem Grund wurde besonderes Augenmerk auf die Analyse der unterschiedlichen Zykline, den dazugehörigen Zyklin-assoziierten Kinasen und verschiedener Zellzyklusregulatoren gelegt, um zu eruieren welche Mechanismen zwischen den Zytomegalieviren konserviert sind.\n▼ 45 Der Einfluss von M/RCMV auf die Glieder des Zellzyklus wurde untersucht indem Extrakte von infizierten in G1 arretierten Fibroblasten erstellt wurden, die dann mittels in vitro Kinaseassays auf die Aktivitäten der Zyklin D1, E, A und B1-assoziierten Kinasen analysiert wurden. Um einen Einblick zu bekommen wie die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten in infizierten Zellen reguliert werden, wurde außerdem die Zyklin-Proteinexpression (Zyklin D1, E, A und B1), die CKI-Proteinexpression (p15, p16, p17, p19) und der Phosphorylierungszustand von CDK1 bestimmt.\nPassend zum Zellzyklusverlauf wurde mit der Analyse von Zyklin D1 und der Zyklin D1-assoziierten Kinaseaktivität begonnen. Obwohl in infizierten Zellen die Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität fehlte (Abb. 20A, Bahn 2 und 4), konnten in serumbehandelten infizierten und uninfizierten Zellen gleiche Zyklin D1-Proteinlevel nachgewiesen werden (Abb. 20B, Bahn 1 und 2).\n▼ 46 Um eine mögliche Ursache für die reduzierte Zyklin D1- assoziierte Kinaseaktivität zu finden, wurde in den folgenden Experimenten untersucht, ob die katalytische Untereinheit der Kinase, CDK4, in infizierten Zellextrakten exprimiert und an Zyklin D1 gebunden ist.\nÜberraschenderweise konnte, trotz der fehlenden Kinaseaktivität, kein Unterschied zwischen der CDK4-Expression in uninfizierten und infizierten Zellen gefunden werden (Abb. 21A). Um zu testen, ob Zyklin D1 mit CDK4 in vivo assoziiert ist, folgte eine Koimmunpräzipitation von CDK4 über Zyklin D1. In uninfizierten serumrestimulierten Zellen kann Zyklin D1-assoziiertes CDK4 nachgewiesen werden (Abb. 21B, Bahn 1). In den infizierten Zellen allerdings scheint Zyklin D1 keinen Komplex mit CDK4 zu bilden (Abb. 21B, Bahn 2 und 4).\nDies zeigt, dass in infizierten Zellen CDK4 prinzipiell exprimiert wird, aber nicht an Zyklin D1 bindet. Was eine Voraussetzung für die Funktion der Kinase wäre. Dies könnte eine mögliche Ursache für die nicht nachzuweisende Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität sein.\n▼ 47 Abbildung 21: Einfluss von M/RCMV auf CDK4. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden unmittelbar (A) oder nach erfolgter Zyklin D1-Immunpräzipitation (B) auf CDK4 Expression in Immunoblotanalysen untersucht. Die CKI der INK4- Familie hemmen die Aktivität des Zyklin D/CDK4 Kinase-Komplexes, indem sie die Bindung der Kinase an Zyklin D verhindern (siehe Abb. 12). Um zu überprüfen, ob die fehlende Bindung von CDK4 an Zyklin D1 durch eine in infizierten Zellen höhere Expression von CKI hervorgerufen wird, wurden die Expressionslevel der CKI der INK4-Familie (p15, p16, p18 und p19) untersucht. Da NIH-3T3 Zellen kein funktionelles p16Ink4a exprimieren konnte die Relevanz dieses Zellzyklusregulators ausgeschlossen werden, um dies praktisch zu belegen wurden stattdessen Zellextrakte von infizierten MEFs und infizierte RAT1 Zellen verwendet. Es konnten in infizierten, serumbehandelten Zellen in keinem Falle höhere p16 Level nachgewiesen werden als in den uninfizierten Kontrollextrakten (Abb. 22A). P15 (Abb. 22B), wird in nachweisbaren Mengen nur in quieszenten uninfizierten Zellen exprimiert (Abb. 22B, Bahn 3). Abbildung 22: Zelluläre Zellzyklusregulatoren p16 und p15 sind nicht für verminderte Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität verantwortlich. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden mit einem p16-spezifischen (A) und p15-spezifischen (B) Antikörper in Immunoblotanalysen untersucht. ▼ 48 P18 konnte weder in uninfizierten noch in infizierten Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Die Analyse der Expression von p19 erwies sich ebenfalls als schwierig, eine spezifische Bande war nur in uninfizierten serumbehandelten Zellen darstellbar (Abb. 23, Bahn 1).\nNachdem die Inhibitoren der INK4- Familie in infizierten Zellen nicht stärker exprimiert waren, wurde p21 als möglicher Vertreter der CIP/KIP- Familie als letzter Kandidat in die Analyse einbezogen. Da p21 sowohl CDK1 als auch CDK2 inhibieren kann, war in Anbetracht der bestehenden CDK1 Aktivität in infizierten Zellen (siehe 3.5.3) nicht davon auszugehen, dass p21 verstärkt exprimiert wird. Darüberhinaus würde p21 nicht den Zyklin D1/CDK- Komplex zerstören. Obwohl CDK2 in infizierten Zellen aktiv ist (s.u.) und in immortalisierten Rat1 Zellen nicht funktionell, musste eine Überexpression von p21 wenigstens in Mauszellen ausgeschlossen werden. Der Nachweis ergab in uninfizierten und infizierten NIH-3T3 Zellen nahezu gleiche Proteinexpression (Abb. 23B), was wie erläutert zu erwarten war.\nNach diesen Ergebnissen ist also davon auszugehen, dass die bekannten zellulären Regulatoren nicht für die verminderte Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität in infizierten Zellen verantwortlich sind und das M/RCMV möglicherweise direkt mit CDK4 interagiert.\n▼ 49 Abbildung 23: P19 und p21 Expression in infizierten Zellen. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden mit einem p19-spezifischen (A) und p21-spezifischen (B) Antikörper in Immunoblotanalysen untersucht. 3.5.2 Einfluss von MCMV und RCMV auf die Zyklin E Expression Bei der Analyse der Zyklin E-assoziierten Kinaseaktivität war auffällig, dass diese durch RCMV Infektion anstieg (Abb. 24, A, Bahn 2 und 4). Die genannte Kinaseaktivität lag deutlich über der zyklierender und quieszenter Zellen (Abb. 24, A, Bahn 1 und 3).\nUm zu prüfen, ob die erhöhte Zyklin E-assoziierte Kinaseaktivität durch erhöhte Proteinexpression der regulatorischen Untereinheit erklärt werden kann, wurden Immunoblotanalysen durchgeführt. Diese ergab, dass alle hier getesteten CMV zwar gleiche Mengen an Zyklin E, aber eine Zyklin E-Form mit einer herabgesetzten Mobilität in der Gelelektrophorese induzierten (Abb. 24 B, Bahn 2 und 4). ▼ 50 Abbildung 24: Einfluss von M/RCMV auf die Expression von Zyklin E und die Zyklin E-assoziierte Kinaseaktivität. Quieszente Zellen wurden in An- bzw. Abwesenheit von Serum infiziert. Die Zellen wurden nach 16 Stunden geerntet und Proteinextrakte wurden erstellt. In diesen wurde mit Hilfe von in vitro- Kinaseassays die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten mit H1 als Substrat bestimmt (A). Des weiteren wurden die Extrakte auf Zyklinexpression in Immunoblotanalysen mit Zyklin-spezifischen Antikörpern (B) untersucht.\nIn der Annahme, das Zyklin E in infizierten Zellen posttranslational möglicherweise durch Phosphorylierung modifiziert wird, wurden, um dies zu untersuchen, die Extrakte uninfizierter und infizierter Zellen vor der Immunoblotanalyse mit Phosphatase behandelt. Die Phosphatase würde eine bestehende Phosphorylierung des Proteins aufheben und so zu einem schnelleren Laufverhalten von Zyklin E in der Gelelektrophorese führen. Dies war der Fall. In den infizierten Phosphatase-behandelten Extrakten (Abb. 25, Bahn 4) war im Gegensatz zu den infizierten unbehandelten (Abb. 25, Bahn 3) Extrakten ein schnelleres Laufverhalten von Zyklin E zu beobachten. In der Tat lagen die Zyklin E Banden der infizierten Zellen nach Phophatase-Behandlung auf der gleichen Höhe wie die Zyklin E Banden uninfizierter Extrakte (Abb. 25, Bahn 1 und 2). Wodurch gezeigt werden konnte, dass Zyklin E in mit Nager-CMV infizierten Zellen phosphoryliert vorliegt.\nAbbildung 25: Phosphorylierte Zyklin E Form in MCMV/RCMV infizierten Zellen. Die Zellen wurden wie bereits beschrieben synchronisiert und nach 16 h geerntet. Zur Erstellung der Extrakte wurde ein Extraktionspuffer ohne Phosphataseinhibitoren verwendet. Vor der Immunoblotanalyse wurden die Extrakte mit Phosphatase behandelt oder unbehandelt belassen und dann mit einem Zyklin E-spezifischen Antikörper analysiert. (*kürzere Exposition) ▼ 51 Über die Phosphorylierung von Zyklin E ist nur bekannt, dass diese am Aminosäurerest Thr380 durch CDK2 erfolgen kann und eine Voraussetzung des proteasomalen Abbaus von Zyklin E ist (Won und Reed, 1996). Da jedoch die „steady state“ Proteinmenge von Zyklin E in infizierten Zellen nicht vermindert ist, sollte geprüft werden, ob CDK2 überhaupt für die Phosphorylierung verantwortlich ist. Um dies zu testen, wurden infizierte Zellen mit dem synthetischen CDK2-Hemmstoff Roscovitin (15 μM) (Bresnahan et al., 1997;Meijer, 1996) behandelt. Durch die Behandlung mit Roscovitin wurde allerdings kein schnelleres Laufverhalten von Zyklin E in infizierten Zellen beobachtet (Abb. 26A, Bahn 2), so dass trotz der Hemmung von CDK2 eine Phosphorylierung von Zyklin E in den infizierten Zellen erfolgte. Als Kontrolle für das effiziente Wirken von Roscovitin wurden die geernteten Zellen im Durchflußzytometer gemessen. Die in Abb. 26B dargestellten Histogramme zeigen, dass die Roscovitin behandelten Zellen in G1 arretieren, was auf die fehlende CDK2 Aktivität zurückgeführt werden kann.\nAbbildung 26: Zyklin E wird nicht durch CDK2 phosphoryliert. Infizierte Zellen wurden mit dem synthetischen CDK2-Hemmstoff Roscovitin (15 μM) behandelt, anschließend wurden Zellextrakte erstellt und in Immunoblotanalysen mit einem Zyklin E-spezifischen Antikörper behandelt, als Kontrolle wurden unbehandelte Zellen verwendet (A). Um das effiziente Wirken von Roscovitin nachzuweisen wurden die geernteten Zellen im Durchflußzytometer gemessen. Die dargestellten Histogramme zeigen, dass die Roscovitin behandelten Zellen in G1 arretieren (B).\nEs scheint sich also bei der beobachteten Phosphorylierung von Zyklin E nicht um eine durch CDK2 verursachte Autophosphorylierung zu handeln. Da eine ähnliche Phosphorylierung von zellulärem Zyklin E nicht beschrieben wurde, wird sie am ehesten entweder direkt oder indirekt durch die Nager-CMV verursacht. Obwohl dieser Punkt nicht direkt adressiert wurde, könnte die Phosphorylierung darüber hinaus ein möglicher Mechanismus für die erhöhte Zyklin E Kinaseaktivität sein.\n3.5.3 Einfluss von MCMV und RCMV auf Zyklin A, Zyklin B1 und CDK1\n▼ 52 Es ist bekannt, dass durch die Infektion mit HCMV die Zyklin B1-assoziierte Kinaseaktivität hochreguliert, die Zyklin A-assoziierte Kinaseaktivitität hingegen herunterreguliert wird. Die Analysen in M/RCMV infizierten Zellen hingegen ergaben, dass die Zyklin A- und B1- assoziierten Kinaseaktivitäten im M/RCMV induzierten Zellzyklusarrest auch unter serumlosen Bedingungen durch die Infektion induziert werden (Abb. 27A, Bahn 2 und 4).\nDie dazugehörigen Zyklin-Proteinlevel können diese gesteigerte Aktivität allerdings nicht erklären: In Abwesenheit von Serum erfolgt in infizierten Zellen zwar eine Induktion von Zyklin A und B1 (Abb. 27B, Bahn 3 und 4), in den serumbehandelten Zellen sind die Proteinlevel jedoch nahezu gleich, im Fall von Zyklin A (Abb. 27B, Zyklin A, Bahn 1 und 2), bzw. sogar etwas verringert (Zyklin B1) (Abb. 27B, Zyklin B1, Bahn 1 und 2).\n▼ 53 Sowohl Zyklin A als auch Zyklin B1 können mit der katalytischen Untereinheit CDK1 (CDC2) assoziieren. Da die in Abb. 27B dargestellten Proteinlevel die gesteigerte Zyklin A- und B1-assoziierte Kinaseaktivität in infizierten Zellen nicht erklären können, soll untersucht werden, ob die Nager-CMV die Aktivität von CDK1 direkt beeinflussen können. Der Zyklin/CDK1-Komplex wird erst in der G2-Phase durch die Phosphatase CDC25 aktiviert und bis dahin wird CDK1 durch die Phosphorylierung von Tyr15 durch die Wee1 Kinase inaktiv gehalten (Lew und Kombluth, 1996). In dem folgenden Experiment wurden infizierte Zellen auf das Vorhandensein der inhibitorischen Phosphorylierung von CDK1 untersucht, dazu wurde in den Immunoblotanalysen ein Tyr15-phosphospezifischer CDK1 Antikörper verwendet. Wie zu erwarten konnte die inhibitorische Phosphorylierung in serumrestimulierten uninfizierten Zellen, die noch nicht die G2-Phase erreicht hatten (durchflußzytometrische Analysen hier nicht gezeigt) nachgewiesen werden (Abb. 28, Bahn 2, 6 und 11). Die phosphorylierte Form von CDK1 konnte in den serumrestimulierten, infizierten Zellen jedoch nicht nachgewiesen werden (Abb. 28, Bahn 3, 7 und 12). Auch in Abwesenheit von Serum konnte eine phosphorylierte Form von CDK1 in infizierten Zellen im Gegensatz zu uninfizierten Zellen nicht nachgewiesen werden (Abb. 28, längere Exposition, Bahn 5 und 9). Da die Banden der infizierten Zellen gleiches Laufverhalten aufweisen, wie die Banden der phosphatasebehandelten Kontrollextrakte (Abb. 28, Bahn 1), ist davon auszugehen, dass CDK1 in infizierten Zellen in aktiver unphosphorylierter Form vorhanden ist. Dies könnte den Anstieg der Zyklin A- und B1-asssoziierten-Kinaseaktivität in infizierten Zellen erklären.\nDie bisherigen Analysen ergaben, dass M/RCMV die Zellproliferation hemmen, in dem sie die Zellen in G1 und G2 arretieren. HCMV arretiert Zellen ebenso in G1 und verhindert den Beginn der zellulären DNA-Synthese, indem es die Assemblierung des Prereplikationskomplexes (Pre-RC) auf Chromatin verhindert (Biswas et al., 2003;Wiebusch et al., 2003).\n▼ 54 Um zu überprüfen, ob dieser Mechanismus zwischen den CMV konserviert ist und eventuell eine Erklärung für den beobachteten G1-Arrest darstellen könnte, wurde die Integrität des Pre-RC in M/RCMV infizierten Zellen untersucht. Dazu wurden exemplarisch zwei Faktoren des Pre-RC analysiert: i) CDC6, ein chromatinassoziierter Faktor, der als essentielles MCM-Ladeprotein fungiert (Donovan et al., 1997) (Liang et al., 1995;Piatti et al., 1996;Piatti et al., 1995) und ii) MCM2, als Bestandteil des MCM-Helikase-Komplexes, der für den Beginn der DNA-Synthese ebenfalls chromatinassoziiert benötigt wird und als limitierender Faktor des regulierenden licensing angesehen wird (Labib et al., 2000).\nZuerst wurden Ganzzellextrakte von infizierten und uninfizierten Zellen erstellt, die 16 h nach Serumrestimulation geerntet wurden. Zu diesem Zeitpunkt befanden sich infizierte Zellen arretiert in der G1, uninfizierten Zellen in der S-Phase. Folgend wurden die Zellextrakte auf MCM2 und CDC6 Expression untersucht. In serumbehandelten uninfizierten und infizierten Zellen konnten gleiche MCM2 Proteinlevel im Gesamtzellextrakt nachgewiesen werden (Abb. 29A, Bahn 1,2, 5, 6, 9 und 10). In quieszenten Zellen wurde MCM2 durch die Infektion induziert (Abb. 29A, Bahn 4, 8 und 12). Gleiche Ergebnisse erbrachte die Analyse mit einem CDC6 spezifischen Antikörper (Daten hier nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass zwei essentielle Faktoren, die für die Assemblierung des Pre-RC benötigt werden, in infizierten Zellen exprimiert werden. Doch da die Voraussetzung für die DNA-Replikation nur durch das Binden dieser Faktoren an Chromatin geschaffen wird, wurden in einem nächsten Schritt Chromatinextrakte von den gleichen Zellpopulationen erstellt, und die Chromatinassoziation von MCM2 und CDC6 in infizierten Zellen untersucht. Wie zu erwarten erfolgt in uninfizierten serumstimulierten Zellen, die sich am Beginn der S-Phase befinden, eine Bindung des Ladefaktors CDC6 und des MCM2-Proteins an Chromatin (Abb. 29B, Bahn 1, 5 und 9). In den Chromatinextrakten MCMV infizierter Zellen können MCM2 und CDC6 serumunabhängig nachgewiesen werden (Abb. 29B, Bahn 10 und 12), jedoch fällt auf, dass es sich in den infizierten, serumbehandelten Zellen (Abb. 29B, Bahn 10) um die unphosphorylierte MCM2-Form zu handeln scheint, die ungewöhnlicherweise ein langsameres Laufverhalten aufweist (Fujita et al., 1998;Masai et al., 2000;Todorvo et al., 1995). Bei der unphosphorylierten MCM2-Form handelt es sich um die inaktivierte Form. Was auf eine mögliche MCM2 Inaktivierung durch MCMV hinweist (Wiebusch et al., 2003). Diese Daten implizieren somit, dass die Pre-RC Assemblierung durch MCMV nicht zerstört wird, sondern möglicherweise eine Inaktivierung von MCM2 nach Assemblierung erfolgt. Im Gegensatz zu MCMV infizierten Zellen, ist nach RCMV Infektion hingegen der Prozess des replication licensing inhibiert. Wie zuvor bereits für HCMV beschrieben (Wiebusch et al., 2003), zeigte sich auch für RCMV infizierte Zellen, dass der MCM Ladefaktor CDC6 Chromatin assoziiert ist, aber es kommt letztlich nicht zur Ladung von MCM2 (Abb. 29B, Bahn 2, 4, 6 und 8).\nAus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass in RCMV, nicht aber in MCMV, infizierten Zellen die Formierung des Pre-RC Komplexes verhindert wird und somit die zelluläre DNA Replikation auf der Ebene des replication licensing inhibiert wird.\n▼ 55 Abbildung 29: RCMV nicht aber MCMV verhindert replication licensing. Quieszente Fibroblasten wurden serumrestimuliert und/oder infiziert. Sowohl Ganzzellextrakte als auch Chromatinextrakte wurden erstellt und es wurde die MCM2 Expression (A) sowie die MCM2 und CDC6 Chromatinbindung (B) überprüft.


Tennis-Club SCC Berlin - Neuzugang 1. Damen Natalia Vajdova\nNatalia ist 23 Jahre alt, 1,62m groß, kommt aus Bratislava und ist derzeit die Nummer 975 in der Welt (beste Position 470). Ihre größten Erfolge war die Teilnahme an allen Junior Grand Slams und das Finale der U18 Europameisterschaften. Einder der größten Siege war der Sieg über Antonia Lottner. In Roland Garros (Junior Grand-Slam) spielte sie erfolgreich Doppel mit Belinda Bencic.\nWenn man Ante fragt, wie er seine bisherige Karriere beschreiben würde, sagt er: "Es war bisher eine ziemliche Achterbahnfahrt aufgrund von vielen Verletzungen. Trotzdem macht es mir weiterhin unglaublich viel Spaß."\nNatalia wird in diesem Jahr hinter Ani Mijacika unsere Nummer Zwei sein.


Kira Mohn Archive - Just Some Bookstories\nArchives from: 21 Januar 2022\n[Rezension] Free like the Wind von Kira Mohn\nHallo ihr da draußen an den Bildschirmen, erst einmal wünsche ich euch allen noch ein frohes neues Jahr, ich hoffe das darf man gegen Ende Januar noch und hoffe ihr ...\n[Bloggeraktion] Cover Theme Day 3/21\nHey ihr Lesemäuse, und willkommen zur zweiten Bloggeraktion diese Woche, dem "Cover Theme Day". Der Cover Theme Day ist eine Mitmachaktion von Charleen von der Traumbibliothek. Für heute durfte ich ein ...\n[Rezi] Wild like a River von Kira Mohn\nHey ihr Lesemäuse, wer den Blog schon etwas verfolgt oder mich kennt, der weiß, dass Kira Mohn zu einer meiner liebsten Autorinnen gehört. Natürlich musste auch „Wild like a River“ ...\n[Rezi] Find me in the Storm von Kira…\nHallo ihr Hübschen, Kennt ihr das, wenn ihr das Abschluss Buch einer Reihe unbedingt lesen wollt, es aber immer wieder vor euch herschiebt, weil es der letzte Teil ist und ...\n[Rezi] Save me from the Night von Kira…\nHallo ihr Lieben, Endlich komme ich mal dazu euch meine Meinung von dem zweiten Teil der Leuchtturm-Trilogie zu tippen. Ich habe das Buch schon vor Wochen gelesen, aber irgendwie hatte ...


13 häufige Sex-Pannen und wie du richtig damit umgehst\nBild: bezikus/ Shutterstock.com\nEin Fürzchen hier, eine fehlende Erektion da – beim Sex kann ganz schön viel schiefgehen. Schließlich macht unser Körper allerlei komische Dinge.\nSo reagierst du am besten auf unangenehme Situationen zwischen den Laken.\n1. Er versucht ohne Vorspiel einzudringen und es flutscht nicht so richtig…\nTja, daraus wird leider meistens nix! Bevor es zu einer peinlichen und schmerzhaften Herum-Stocherei kommt, die alles nur noch schlimmer macht, lieber gleich Klartext reden (à la “Süßer, wir sind nicht auf der Flucht! Wir können uns ruhig etwas Zeit nehmen”), oder einfach mit feuchtigkeitsspendenden Mittelchen nachhelfen.\nWenn nach dem Sex ein Fleck auf der Matratze ist, könnte das daran liegen, dass ein wenig Harn und/oder weibliches Ejakulat daneben gegangen ist. Kein Drama! Im Gegenteil – Squirting ist ein Ausdruck eines besonders intensiven Lusterlebnisses! Fun Fact: Nur wenige Frauen können es, Porno-Stars würden euch darum beneiden, und im Gegensatz zu euch hat ER es bestimmt schon tausende Male gesehen (wenn auch nur am Laptop).\n3. Rote Pickel im Intimbereich?\nDas kann beim Rasieren eben passieren. Deshalb sollte bei der Intimrasur auf einige Dinge geachtet werden: Die Klinge darf weder zu scharf, noch zu stumpf sein, nach dem Rasieren sollte der Intimbereich mit einer beruhigenden Creme oder mit Babypuder gepflegt werden. Tragt danach auch besser keine zu stark reibende Unterwäsche und rasiert bloß nicht über bereits entzündete Stellen. PS: Es ist kein Drama, nicht immer frisch rasiert zu sein! Viele Männer finden es erotisch und weiblich, wenn nicht immer alles bis aufs letzte Härchen abrasiert und aalglatt ist. Das zeigt den Jungs außerdem, dass ihr Selbstbewusstsein habt und euren Körper liebt, so wie er ist. Und was ist sexier als Selbstbewusstsein?!\n4. Er steht nicht.\nNicht verzweifeln – das kommt öfters vor, als ihr denkt und NEIN, ihr seid nicht der Grund, denn Stress ist meist der Hauptverantwortliche für Erektionsprobleme. Vermittelt ihm das Gefühl, dass es kein Drama ist, und ihr ohnehin alle Zeit der Welt habt. Sich zu ihm zu legen, ihn zu küssen und über den Penis zu streichen hilft ihm bestimmt, seinen Kopf wieder freizubekommen. PS: Ihn mit dem Mund zu verwöhnen kann auch wahre Wunder wirken – und sobald er sich wieder entspannt, kann da weitergemacht werden, wo ihr aufgehört habt.\n5. Er kommt in deinen Mund und dir kommt’s hoch.\nVersehentliches Würgen beim Blowjob ist ein weit verbreitetes “Problem”, das eigentlich überhaupt keines ist. Wenn es euch zu viel wird, einfach den Penis zusätzlich mit der Hand umschließen, um so seine Stöße besser kontrollieren zu können. Wenn er dir in den Mund ejakuliert und du dich verschluckst, ist es (nachdem du dich wieder gefangen hast) am besten, die Situation mit Humor zu nehmen. Ein bisschen witzig ist es ja irgendwie auch, oder? “Mhm, ich wollte dir auch was übrig lassen” sorgt bestimmt für einen Lacher.\n6. Deine Vagina muss pupsen.\nJa, das kennen wir wohl alle. Wenn beim Rein-und-Raus während dem Sex zu viel Luft in die Vagina gepumpt wird, kann es passieren, dass hier und da ein kleines Lüftchen entfleucht. Besonders oft entstehen die sogenannten Queefs im Doggy-Style. Er wird vermutlich ohnehin merken, dass es sich um keinen echten Pups handelt, wer aber auf Nummer Sicher gehen will, kann im Vorhinein schon für musikalische Untermalung sorgen – so fällt so ein kleines Pfffff auch garantiert nicht mehr auf.\n7. Das war jetzt aber ein echter Pups!\nTja, hier kann wohl nur noch gelacht werden. Ganz ehrlich, wir sind alle nur Menschen – und beim Sex können solche Dinge eben nicht so leicht kontrolliert werden. Während dem Sex zu pupsen, zeigt außerdem, dass wir sehr entspannt sind – und das ist doch ein mehr als gutes Zeichen, oder? Solltet ihr schon vorher merken, dass sich gleich etwas Luft locker machen könnte, am besten schnell die Stellung wechseln und so ein Malheur verhindern. Wenn es dafür zu spät ist, heißt es: Drüberstehen und weitermachen!\n8. Er will dich oral befriedigen, aber du hast schon länger nicht mehr geduscht?\nBloß keine Panik, hier gibt es mehrere Möglichkeiten: “Was hältst du davon, wenn wir gemeinsam duschen gehen?” wäre eine davon. Davon ausgehen, dass den Mann dein natürlicher Körpergeruch evolutionsbedingt ohnehin richtig wild macht, wäre die andere. Wenn es ganz schlimm ist, kannst du auch kurzerhand den Spieß umdrehen und selbst mit dem Kopf nach unten wandern – dann vergisst er sowieso sofort, was er gerade machen wollte.\n9. Der Sex ist einfach unerträglich schlecht oder du bist tot-müde und denkst dir nur noch “Wann ist es endlich vorbei?”\nInfo: Du darfst damit aufhören, wann du willst. Es gibt kein Gesetz, das besagt, dass Frau beim Sex dazu verpflichtet ist, bis zum Ende durchzuhalten. Wer sich traut, sagt also einfach “Schluss, ich will nicht mehr, weil…”, wer einfühlsamer sein will, kann einfach einen Orgasmus vortäuschen oder noch besser: liebevoll fragen “Können wir damit ein anderes Mal weitermachen? Ich fühle mich gerade nicht besonders”.\nWenn ihm oder dir statt sexy-schmutzigen Bemerkungen dämliche Meldungen á la “Gibs mir, du geiles Fick-Froscherl” herausrutschen, ist Lachen keinesfalls verboten. Gemeinsamer Spaß im Bett lockert die Stimmung und dann ist alles halb so schlimm. Damit schmutzige Konversation im Bett überhaupt funktioniert, müssen zwei Menschen ohnehin auf einer Wellenlänge sein, was beim ersten Mal Sex eher selten vorkommt. Desto besser wir unseren Sexualpartner kennen, umso eher wissen wir, was ihm gefällt – und solche Peinlichkeiten kommen gar nicht erst zustande.\n11. Wenn der Penis viel zu klein ist…\nBei einer einmaligen Sache heißt es, taktvoll sein und Klasse beweisen: Der arme Junge hat es schon schwer genug. Wenn es sich bei euch beiden um was Ernstes handelt, können Sex-Toys und die richtigen Stellungen wahre Wunder bewirken.\n12. Wenn der Penis zu groß ist, raus mit der Sprache!\nEs wird bestimmt keinen Mann verletzen, wenn du ihm sagst “Hey! Der ist ja unfassbar groß!!!”. Hier sollte am besten vorsichtig an die (Riesen-) Sache herangegangen werden. Gleitgel, nach und nach ein bisschen weiter eindringen und die passende Stellung finden – und der Sex ist gerettet.\n13. Jemand erwischt euch beim Sex\nJa, das kann ganz schön peinlich sein – aber behaltet immer im Hinterkopf: Jeder tut es und wer es nicht tut, würde es gerne tun. Außerdem ist das eine Geschichte, über die ihr garantiert auch noch in zehn Jahren lachen könnt.\n← Das sind die verrücktesten Sexstellungen\nBlended Orgasm: So erlebst du den Mega-Höhepunkt\n4 Tipps für noch besseren Sex in der Reiterstellung\nSo verändert sich das Liebesspiel unter Alkoholeinfluss


Scheißegal-Einstellung? Wie vekommt man die? Hilfe? (Liebe, Freundschaft, Liebe und Beziehung)\n14.07.2017, 11:36 , 67\nScheißegal-Einstellung? Wie vekommt man die? Hilfe?\nHi :-) Ich habe eine Frage und zwar: Wie bekomme ich eine "Scheiß-Egal-Einstellung"? Klingt vielleicht ein bisschen dumm aber die würd mir in letzter Zeit ziemlich helfen. Es ist nämlich so, mein freund war vor einer Woche für 1 Woche weg. Seit er zurück ist, ist er sowieso etwas anders. Seit er zurück ist haben wir uns nicht wirklich oft gesehen weil er die ganze zeit was mit einem Freund machen will. Es stört mich wirklich GAR NICHT, was mich stört das wir uns eig. nur die Woche haben weil er den Samstag wieder weg fliegt für eine Woche und er aber die ganze Zeit nur mit seinem Freund was machen will. Wenn ich ihn frag ob ich dabei sein darf sagt er Nein aber die Schwester von seinem Freund ist auch dabei ?!?! Es war 2 Jahre komplett anders er wollt immer was machen und jetzt bin ich iwie auf platz 5 bei ihm. und wenn es 2 Jahre lang nicht so war und auf einmal ist es ein richtig schlimmes Gefühl. Ich bin auch nicht von Ihm abhängig und will Ihn ja auch nicht nerven weil wenn ich ihn darauf anrede ob er vil. 1 Stunde früher von seinem Freund heim kann das wir uns kurz sehen odaso ist er sofort genervt und das tut auch weh... So eine Einstellung würd mir grad echt helfen :-)\nGar nicht, denn er ist dir wichtig. Ich würde hier wirklich mal ein GANZ klares Wort mit ihm sprechen. So von Monat 2-3 war meine Freundin nicht toll zu mir: Nie Zeit für mich, sehr abweisend beim Schreiben (Fernbeziehung) etc. Nun ist es besser, seit die Beziehung intensiver ist. Sie sagt oft ich sei ihre Traumfrau etc. und sie hätte nicht realisiert, wie mies das von ihr war. Du musst deinem Freund da mal die Augen öffnen und fragen was er eigentlich will, wenn er dich mal so Null in sein Leben integriert. Wenn du eine "Scheiß-egal"-Einstellung in der Beziehung brauchst und somit eine Art Mauer um deine Gefühle baust, klingt das für mich eh nicht nach einer gesunden Beziehung.\nBellamaus12345 14.07.2017, 13:12\nIch hab ohne Spaß sicher schon 4-5 mal ein KLARES Wort mit ihm gesprochen einmal wars auch schon fast beim Schluss machen, aber es bringt sich nichts... Es geht ihm beim einen Ohr rein und beim anderen raus :-/\n14.07.2017, 11:46 , 28\nNaja wie es aussieht lässt er dich nicht an seinem Leben teilhaben....eine Schlussfolgerung kannst du dir (vermutlich ist es sogar der Grund für deine schlimme Gefühle) erahnen....Er ist höchstwahrscheinlich nicht mehr an dir interessiert....So wie er sich verhält sagt nur aus, dass du ihm im Grunde egal bist und er dich links liegen lässt, sobald sein Freund mit seiner Schwester auftauchen...übrigens wie alt ist die Schwester? Ist sie hübsch?\nUm eine Sch...egal Einstellung gibt es nur wenn dir ein Mensch auch egal ist...im Moment bist du es für ihn.\nMach dir nichts vor....rede mit ihm, wenn es euch nicht weiter bringt...\nBellamaus12345 14.07.2017, 13:13\ngleich alt wie er, und es geht so Ich versteh mich mit Ihr ja auch.\nJa hab ich schon 4-5 mal wo es schon kurz vor dem Schluss machen war, bringt sich aber nichts, geht beim einen rein und beim anderen raus :-/\n14.07.2017, 12:04 , 14\nScheissegal-Einstellung ist das Allerschlimmste, tu' dir das nicht an.\nGefühle sind mutig, und dein Freund hat eine feige Vermeidungsstrategie.\nStell ihn zur Rede, und ziehe die Konsequenzen draus. Es ist deine Lebenszeit. Grenze dich ab. Plenty of other fish in the sea.\n14.07.2017, 11:58 , 10\nwenn es zu viele probleme sind mach schluss\n14.07.2017, 11:42 , 23\nDa sind Gefühle... scheiß egal Einstellung klappt dann nicht sry...\nSprech mit ihm sag ihm offen und ehrlich was dich bedrückt. Er soll dir erklären, warum er dich nicht sehen will.\n14.07.2017, 11:41 , 16\nmir scheint, dass Dein Freund kein großes Interesse mehr an Dir hat ......\nsorry, ich weiss, das tut weh,\naber lieber ein Ende mit Schrecken, als ein Schrecken ohne Ende !\nMach Schluss, bevor ER es tut,\ndenn das kratzt dann noch zusätzlich an Deinem Ego.......\n14.07.2017, 11:41 , 11\nFreund schreibt selten zurück\nHi :) mein Freund und ich haben eine gute Beziehung aber eine Sache stört mich doch . Er schreibt nie zurück obwohl er meine Nachricht gesehen hat und online war . Und wenn dann nur kurz und knapp -.- wieso ist das so ? Anderen schreibt er ja auch -.- das ist was mich stört . Ist euer Freund auch so oder wisst ihr warum das so ist ? Schreiben Männer einfach nicht gerne ? Oder bin ich zu selbstverständlich für ihn ? :D\nFrage von smartiee\nIst das normal/ 1 mal treffen in der Woche?\nAlso mein Freund und ich sind jetzt noch nicht so lang zusammen, jedoch stört es mich, dass wir uns nur einmal die Woche sehen... Sozusagen 4 mal im Monat :/\nAm liebsten würd ich ihn 3-4 mal sehen, aber er ist meistens beschäftigt oder macht was mit seinen Kumpels\nDeswegen wollt ich fragen ob es normal ist sich nur höchstens einmal die Woche zu sehen ?\nWir wohnen recht nah aneinander also das ist nicht das Problem :)\nFrage von Natha2811\nFrage von JasminWaleczek\nSehnsucht nach dem Freund?\nMein Freund kommt in zwei Wochen zum Bundesheer... ich mach mir ganze Zeit Gedanken ob es ihn dort gut gehen wird oder ob es passieren könnte kann mich wer darüber aufklären was dort so ab geht und kann man ab der ersten Woche zum Wochenende Heim oder muss man da eine bestimmte Zeit an Wochenenden in der Kaserne bleiben?\nFreund und zocken wie nur ?\nMein Freund zockt nur noch er schreibt immer nach 1 std zurück sehr spät also oder ich hatte die ganze Woche spät bis 20:00 Uhr wollte mit ihn schreiben selbst da schreibt er seltener Es geht darum das ich mein Freund aus privatlichen Gründen nicht oft sehen kann da will ich mit ihn schreiben können aber er ist so selten am schreiben ich sage ihn auch das es mich stört aber er ändert nix dran und meckert mich an oder schreibt angepisst zurück Ist da noch liebe etc. ich weis nicht was ich machen soll Hat jemand auch solche Probleme oder fühlt sich auch so vernachlässigt Oder ist das normal und ich nehme es zu extrem auf?\nFrage von fwloveyou\nHey liebe community, Ich habe meinen freund letztens gesagt dass es mich stört. ..\nIch habe meinem freund letztens gesagt dass es mich stört dass er mit dem einen Mädchen zu viel Herzen schreibt und sich zu oft mit ihr trifft, daraufhin hat er ihre Nummer gelöscht und sie ignoriert. Aber nach 1 Woche hat er sie wieder eingespeichert. Findet ihr das in ordnung?\nFrage von Anna260698\nWie sage ich meinem freund das ich 900km weit weg ziehe?\nHey ich bin 18 jahre alt und brauche dringend Hilfe Ich hab seidher bei meiner mutter gewohnt und kannte meinen vater nicht und da ich letzte Woche dort war und dieses gefühl angekommen zu sein und der heimat wieder hatte war mir klar ich muss zurück auch aus anderen privaten Gründen aber jetzt ist die frage wie sage ich es meinem freund schonend? Bitte helft mir\nFrage von alinablt\nVon Freund getrennt - Richtige Entscheidung?\nIch (20w) war bis letzte Woche mit meinem Freund (23m) 1,5 Jahre zusammen (5 Monate davon war er im Ausland wegen seines Studiums)\nIn letzter Zeit fielen viele kleine Dinge vor, jede Kleinigkeit führte zu Streit aber wir haben uns danach relativ schnell wieder vertragen und alles war gut.\nLetzte Woche war dann wieder das große Thema rauchen ein Thema (er raucht ,ich nicht). Ich habe ihn gebeten es etwas zu reduzieren da es mich sehr stört wenn er in meiner Umgebung raucht und es relativ viel bei ihm ist (1,5 Packungen / Tag). Bei Kritik zieht er sich total zurück und ich komm nicht mehr an ihn ran. Dann fängt er an unfair zu werden, mich zu beledigen und er respektiert mich dann in keinster Weise mehr.\nJetzt habe ich nach dem Streit einen Schlussstrich gezogen weil ich denke etwas besseres verdient zu haben. Das ganze ist fast 2 Wochen her und ich vermisse ihn doch sehr. Seitdem hatten wir keinen Kontakt, da beidseitig auf allen Plattformen geblockt.\nWas sagt ihr dazu? Hab ich das richtige getan oder nicht?\nFrage von schnusili\nhallo :) meind freund ist raucher...er raucht zwar weis nicht wie vil am tag aber er machts...mich stört es nicht besonders weil er eigentlich auch nie stinkt...aber es schadet sehr der gesundheit...wie kann ich ihn dazu bringen aufzuhöremn??\nFreundschaft + Liebe und Beziehung Liebe Freundschaft Liebe und Beziehung vernachlaessigt\nFreund zurück schreiben\nWas halten Mädchen bzw. Frauen von Games, wie BF3, MW3, Halo oder Skyrim?\nSie meint sie liebt mich nicht aber sendet irgendwie Signale was soll ich tun?


THOR WATERSCHEI: Hearts@Cloppenburg\nWelch ein Tag im niedersächsischen Cloppenburg. Am Freitag, den 13. Juli, schaute Heart of Midlothian, Vierter der ersten schottischen Liga, für ein Gastspiel im Stadion an der Friesoyther Straße beim deutschen Oberligisten BV Cloppenburg vorbei .\nDie Herzen sollten deshalb beim BVC an diesem lauen Sommerabend etwas höher schlagen. Mit „Bags and Pipes“ begrüßte man in der niedersächsischen Provinz zunächst seinen schottischen Gast, in dessen Gefolgschaft sechs Schlachtenbummler mitgereist waren, die auf einer kleinen Anhöhe direkt hinter einem Tor thronten und es sich damit nahe der Getränke- und Imbissbude gemütlich gemacht hatten.\nNur was die Kicker aus der schottischen Hauptstadt Edinburgh ihrem treuen Anhang an diesem Abend so boten, sollte dem halben Dutzend ganz und gar nicht gefallen. Einigen Hearts-Anhänger schmeckte angesichts des überaus einfallslosen Gekickes ihres Lieblingsklubs sogar das Cloppenburger Bier nicht mehr, was mitunter zur Folge hatte, dass dieses in der Halbzeitpause gegen eine kühle Fanta getauscht wurde.\nOhnehin war von großartigem britischem Kampfgeist oder gar Kick and Rush an diesem ominösen Freitag, den 13., von den Hearts nicht viel zu sehen. Vielleicht war das mit zwei bis drei Routniers gespickte Nachwuchsteam, das der vermeintlich ambitionierte Traditionsverein aus dem Land der Kilts und Dudelsäcke in die Friesoyther Straße zur Saisoneröffnung des BVC schickte, auch mit dem körperbetonten Spiel des deutschen Viertligisten schlichtweg überfordert, der die jungen Hearts mit einem 2:1 letztendlich in die Knie zwang. Ein „großartiger Sieg des BVC“ war es gewesen, wenn man den Worten des gut aufgelegten Cloppenburger Stadionsprechers Glauben schenken wollte, der zudem herausstellte, dass der BVC zuvor den Vierten der ersten schottischen Liga bezwungen habe.\nMan kann den Verlauf dieses Abends damit auf Seiten der Gastgeber sicherlich als historisch einstufen, zumal vor der Partie das kleine Stadion mal eben in Arena Oldenburger Münsterland umbenannte wurde und man obendrein Mitte der zweiten Spielhälfte den BVC-Haudegen Jörg-Uwe Klütz mit Standing Ovations sowie Bocellis Abschiedsarie Lebe wohl sagte. Kurzum: der BVC war an diesem Freitag, den 13., in Hochform.\nNur konnte sich keiner in der neugeborenen Arena Oldenburger Münsterland erklären, wo Hearts-Manager und Ex-HSV-Torjäger Valdas Ivanauskas während der 90 Minuten eigentlich steckte. Auf der Bank der Hearts saß er nicht, auf der Tribüne ward er ebenso nicht gesehen. „Ivan, dem Schrecklichen“ wird im Laufe des Tages doch wohl keine schwarze Katze über den Weg gelaufen sein...


3M Schweiz - Solutions for Networks - Lösungen für Vermittlungstechnik, Seite 2\nLösungen für Vermittlungstechnik >\nLösungen für Vermittlungstechnik, Seite 2\nLösungen für Vermittlungstechnik,Seite 2\nLichtwellenleiter-Hauptverteiler (pdf, 4.31MB)\nInnovative LWL-Hauptverteilersysteme müssen die speziellen Anforderungen der Lichtwellenleiter genauestens berücksichtigen. Dies sind beispielsweise hohe Kompaktheit bei gleichzeitiger Übersichtlichkeit. Problemlose Erweiterbarkeit und die Wartung im laufenden Betrieb sind weitere Merkmale, die ein modernes System erfüllen muss.\nDas Hauptverteilersystem MODF von 3M Telecommunications stellt das Bindeglied zwischen der System- und der Lichtwellenleitertechnik dar. Es eignet sich zum Abschluss und Verbinden von Lichtwellenleitern aus dem Teilnehmeranschlussbereich mit der Systemtechnik.\nmaximale Kapazität von jeweils 384 Fasern auf System- und Linienseite\nschnelle Installation beziehungsweise Demontage verschiedener LWL-Module\nSchwenkrahmen zur einfachen Montage von vorne\nmodularer Gestellaufbau, seitlich anreihbar\nDer Glasfaser-Hauptverteiler 2000 erlaubt den Einsatz von Stecker-, Spleiß- und Breakout-Modulen in einem ETS-Gestell. Dieser erlaubt den Einsatz von Stecker-, Spleiß- und Breakout-Modulen in einem ETS-Gestell. Das integrierte Einzelfaser-Management-System (optional) stellt dabei die äußerste Betriebssicherheit der einzelnen Lichtwellenleiterstrecken sicher. Weitere Informationen finden Sie hier.\nÜbergabe-Verteiler (pdf, 4.31MB)\nMit der Liberalisierung des Telekommunikations-Marktes in Deutschland wurden viele Netzbetreiber und lokale City-Carrier zu neuen Marktteilnehmern.\nAufgrund dieser Entwicklung hat 3M Telecommunications neue, innovative Anschluss- und Verteiltechniken konzipiert, die es allen Netzbetreibern erlauben, sich auf das bestehende Teilnehmerzugangsnetz der Deutschen Telekom AG aufzuschalten, um den Kunden eigene Dienste zur Verfügung zu stellen.\nVerteilergehäuse für Kollokation beziehungsweise Interconnection (Innen-/Außengehäuse)\neinfache Integration verschiedener Anschlusstechniken (analoge, ISDN, 2 Mbit/s, 34 Mbit/s oder 155 Mbit/s-Dienste über Kupfer, Koax oder LWL)\nNetzschutz und Überspannungsschutz für elektronische Einrichtungen gehören ebenso zu unserem Lieferprogramm wie leistungsgebundener Überspannungsschutz. Die Gewährleistung eines Längs- und Querspannungsschutzes mit Auswahlmöglichkeiten des entsprechenden Schutzmoduls erfolgt in der modularen Bauform für 2 DA.\nEinfachstes Kontaktieren auf engem Raum wird über die neuen Anschlussklemmen für Leiterplatten, bestehend aus drei Baureihen möglich. Sie kommen überall dort zum Einsatz, wo Leiterplattenbahnen mit Kupferadern kontaktiert werden sollen.\nWeitere Informationen finden Sie hier (pdf, 4.31MB).


Annotation vom 03.07.2018 - 22:10\nAuch wieder Parlamente und Parteien mit in den Blick nehmen.\nVerwaltungshandeln und gesellschaftliche Aushandlungsprozesse\nAnnotation vom 03.07.2018 - 22:08\nHier könnten noch mehr Lehren aus einer zumindest in Ansätzen "disruptiven" Politik gezogen werden.\nEine – wichtige – Ausnahme bilden die Klimapolitik und die hohe Diffusionsdynamik von erneuerbaren Energietechnologien.\nAnnotation vom 03.07.2018 - 22:06\nHier sollte man auch Praxisakteure aus Parteien und Parlamenten berücksichtigen. Es wäre sicherlich auch lohnend zu fragen, ob und inwieweit der schon traditionelle Nachhaltigkeitsdialog zwischen der Exekutive und der Zivilgesellschaft dazu beiträgt, dass die politischen Parteien etwas "außen vor" bleiben.\nPraxisakteuren aus der öffentlichen Verwaltung, Verbänden, zivilgesellschaftlichen Organisationen und dem Privatsektor\nAnnotation vom 03.07.2018 - 22:03\nDabei sollten dann auf der policy-Ebene auch Lösungen aufgezeigt werden, wie Ziele verschiedener Politikfelder in win-win-Situationen erreicht werden können. Jedes einzelne Politikfeld bzw. politisches Anliegen wird bereichert und auch aufgewertet, wenn es seine Ziele/seine SDGs in den Kontext der Agenda stellt. Daraus könnte ein Interesse der verschiedenen Politikfelder an der Agenda 2030 als ganzer wachsen.\nmit denen die substanziellen Wechselwirkungen zwischen den Politikfeldern erfasst und nicht bspw. auf reine Interessenskonflikte reduziert werden\nAnnotation vom 03.07.2018 - 21:56\nDieser Punkt kann nicht genug betont werden. Die politikwissenschaftliche Nachhaltigkeitsforschung muss sich deutlich stärker mit Akteuren, Strukturen und Prozessen der Nachhaltigkeitspolitik befassen, wenn sie handlungsrelevante Ergebnisse produzieren will. Dabei sollte eine Nachhaltigkeitsnabelschau vermieden, vielmehr auch genau untersucht werden, wie andere (vergleichbare) Politikfelder (insbes. solche mit Querschnittsanspruch) sich organisieren.\nDie Forschung sollte einen Bezug zur deutschen Nachhaltigkeitsstrategie und Nachhaltigkeitspolitik haben.


Jahresbericht - Harsche Kritik an Sozialpolitik - Bayern - Süddeutsche.de\nJahresbericht - Harsche Kritik an Sozialpolitik\nJahresbericht Harsche Kritik an Sozialpolitik\nVdK fordert von Staatsregierung Beauftragten für Thema Armut\nDer Sozialverband VdK geht mit der neuen Staatsregierung hart ins Gericht. Deren Sozialpolitik sei schlicht unzureichend. "Man kann im Koalitionsvertrag hin- und herblättern, wie man will, das Wort ,Armut' taucht darin nicht auf", sagte die Landesvorsitzende des VdK Bayern, Ulrike Mascher. Auch Landesgeschäftsführer Michael Pausder zeigte am Donnerstag Unverständnis darüber, wie sehr dieses Thema ignoriert werde. Zumindest etwas ändern ließe sich laut Pausder durch einen Armutsbeauftragten. "Wenn man sich anschaut, für was es in Bayern alles Beauftragte der Staatsregierung gibt, dann sollte es erst recht auch einen Armutsbeauftragten geben", forderte er.\nVor allem die Altersarmut hat in Bayern im Zehnjahreszeitraum überproportional zugenommen. "Bei Frauen um vier Prozentpunkte, bei Männern um 3,3", sagte Mascher mit Bezug auf Daten, die sich am Landesdurchschnitt (Median) orientieren. Diese Entwicklung spiegele sich bei der Zahl der Empfängerinnen und Empfänger von Grundsicherung im Alter und bei Erwerbsminderung wider: "Diese Zahl steigt seit Jahren an. 2007 waren es etwa 86 000 Männer und Frauen, 2017 fast 126 000", betonte Mascher. Bei den Erwerbsminderungsrentnern - Männern und Frauen also, die krankheitsbedingt nicht mehr zur Arbeit gehen können - liegen laut Mascher die meisten Renten im Freistaat unter 900 Euro. Zudem müssten die Betroffenen aufgrund ihrer frühen Verrentung auch noch bis ans Lebensende mit hohen Rentenabschlägen zurechtkommen. Im Sinne der Erwerbsminderungsrentner, aber auch für Mütter im Alter, so Mascher, sollte sich die neue Staatsregierung durch Vorstöße auf Bundesebene verstärkt "profilieren".\nAuch im Freistaat gibt es aus VdK-Sicht Baustellen - ein Stichwort: "Bayern barrierefrei". Hier sei der Koalitionsvertrag zwischen CSU und Freien Wählern "sehr blumig". Weg vom Sozialen, kapriziere sich Ministerpräsident Markus Söder (CSU) lieber auf Themen, die schlagzeilenträchtig sind. Zu Söders Raumfahrtprogramm "Bavaria One" etwa meinte die VdK-Bundesvorsitzende Verena Bentele: "Findet das Leben auf dem Mars oder hier in Bayern statt?"\nSozialministerin Kerstin Schreyer (CSU) wies die Kritik auf Anfrage zurück: "Die Arbeit des VdK ist wichtig, und wir nehmen die Anliegen des Verbandes auch sehr ernst. Dennoch hätte ich mir gewünscht, dass der VdK die Arbeit der Staatsregierung nicht nur an Suchbegriffen im Koalitionsvertrag festmacht, sondern unsere Sozialpolitik als Ganzes sieht." Auch ihr persönlich sei es ein Anliegen, "dass wir uns um die Menschen kümmern, die nicht auf der Sonnenseite des Lebens stehen".\n©SZ vom 14.12.2018 / dm\n70173 Stuttgart - Mitte, 80331 München - Altstadt, 80331 München - Isarvorstadt, …


Unsere Seven ist ins Licht gegangen [Archiv] - zooplus - Haustierforum\nzooplus - Haustierforum > Kleintier-Forum > Kleintiere - Erfahrungsaustausch > Kleintiere - Trauer & Trost > Unsere Seven ist ins Licht gegangen\nArchiv verlassen und diese Seite im Standarddesign anzeigen : Unsere Seven ist ins Licht gegangen\nwir haben gestern Abend unsere kleine dsungarische Hamsterdame Seven verloren. Sie war grade mal zwei Jahre alt.\nWir waren beim Abendessen und sie lief wie so oft bei uns auf dem Tisch. Sie knabberte immer gerne mal an unseren Broten oder ein kleines Stück Käse oder Wurst möchte sie auch immer. Gestern war alles wie immer und auf einmal sah es aus als könnte sie ihre Beine nicht mehr kontrollieren und als wenn sie krampfen würde. Ich hab sie schnell auf die Hand genommen und versucht sie zu beruhigen. Sie hat noch ein paarmal kräftig nach Luft geschnappt als würde sie nicht wirklich Luft bekommen und dann ist sie in meiner Hand verstorben. Es war echt schrecklich! :0(\nIch hab den Rest des Abends bitterlich geweint und heute ist es auch noch nicht wirklich besser. :(\nSie war immmer so lustig und hat uns oft zum lachen gebracht.\nHeute Mittag haben wir sie begraben und ich wollte sie gar nicht wieder aus der Hand geben. Ich wollte mich nicht von ihr trennen. Sie war mein Baby, so hab ich sie immer genannt.\nIch kann gar nicht glauben das sie nie wieder aus ihrem kleinen Haus kommen wird um draussen hin unh her zu laufen um mir damit zu sagen, hol mich raus!\nWir haben echt so lustige Sachen mit ihr erlebt. Als wir sie ganz neu hatten hatten wir nur ein kleines altes Aqua von mir wo sie erst drin war. An der Seite hatte sie was zum klettern und als Deckel hatten wir ein kleines Brett genommen. Eines nachts werd ich wach weil was an meinen Füßen entlang huschte, unter der Decke. Ich hab mich so erschrocken! Ich wußte ja nicht was es war und weckte meinen Freund. Wir haben dann zusammen nachgeschaut und es war Seven. Wir hatten keine Ahnung wie sie das gemacht hat. Das hat sie dann mehrere Nächte gemacht und immer kam sie zu uns ins Bett. Dann haben wir uns auf die Lauer gelegt und haben beobachtet das sie an der Seite hochgeklettert und dann mit ihrer Nase dieses schwere Brett einfach nach und nach zur Seite geschoben hat. Wir haben echt gedacht wir sehen nicht richtig. Hätte nicht gedacht das diese kleine Maus dieses Brett bewegen kann.\nSie hat dann ziemlich schnell ein neuen selbstgebauten Käfitg bekommen und da hatte sie dann viel Platz zum klettern und laufen.\nIch werde sie soo sehr vermissen!\nIch hoffe du hast es gut im Hamsterhimmel mein Baby!\ndas tut mir sehr leid für dich, aber hinter der regenbogen brücke geht es ihr bestimmt auch gut! In deinem HErzen wird sie weiter leben\ndas ist sehr traurig wenn der hamster auf der hand stirbt....\nich hoffe dass du bald über dem berg bist!!!\nDas tut mir sehr Leid für dich. :(\nAber 2 Jahre ist für einen Dschungaren schon ein ziemlich gutes Alter, meiner ist leider nur 1 Jahr alt geworden:0(, weil die Tierärtztin sich nicht mit Dschungaren ausgekannt hat...:mad::mad::mad:\nDas tut mir ebenfalls sehr leid für dich. Ich weiss, wie es ist wenn man Tiere verliert. Hatte ja in meinem leben schon genug Tiere. Jedes wächst einem auf die eine oder andere Art ans Herz. Jedes hat ein anderen Charakter an dem man sich erfreut. Und doch ist eines Unaufhaltssam. Aber irgendwann kommt man über seine Trauer hinweg.\nDein Dschungare hatte es sicher gut bei dir.\nDas stimmt wohl, jeder ist auf seine kleine besondere Art einzigartig!\nSie war einfach nur toll. :)\nHeute geht es mir schon ein bischen besser. Aber es versetzt einem immer einen kleinen Stoß wenn man auf ihren Käfig guckt und darauf wartet das sie rauskommt und nichts passiert. Aber leider kann man das nicht mehr ändern.\nIch kümmer mich einfach viel um unsere anderen Kleinen. Wir haben ja noch 8 weitere Kleintiere und die brauchen mich oder besser uns ja weiterhin.\nAber eine wie unsere Seven wird es nicht noch einmal geben. :(\nja meine gabi ist auch einzigartig!sie liebt sonnenblumen kerne sie würde sogar dafür berge versetzten!\ntut mir sehr leid für dich, dass du deine kleine süsse verloren hast. mir ist damals meine kleine maus auf der hand gestorben. kann nachfühlen wie furchtbar schwer das ist:hug:\nich wünsch dir eine gute reise ins regenbogenland kleine seven. grüss mir meine mini und minimini, sie werden dir bestimmt gute freunde sein:0(\nDas tut mir wirklich sehr Leid für Dich:bl:\nEs ist immer so traurig wenn uns die Kleinen verlassen, da ist einem den ganzen Tag zu heulen zumute:o\nFühö dich gedrückt, und Kopf wieder hoch, ihr geht es bestimmt gut:rain::hug:\nOh, das tut mir wirklich sehr leid für Dich! Fühl Dich ganz doll gedrückt! Glaube mir, ich kann wirklich nachvollziehen, was Du da gerade durch machst! Ich habe im Winter 3 meiner Meeris verloren. Alle innerhalb von 1 Woche!:(:(:(\nWarum muss sowas passieren? Ich finde unsere Kleinen Lieblinge haben eine viel zu kurze Lebenszeit.\nDas schlimme ist das ich immer das Bild vor meinen Augen hab wie sie auf einmal anfing zu krampfen und dann auf meiner Hand lag. Ich hätte ihr so gerne geholfen...\nAber das ging alles so schnell...\nAn dich auch ein dickes Beileid!\nIn einer Woche gleich 3 zu verlieren ist ja richtig hart. :hug:\nich möchte nicht an den tag denken an dem gabi von uns geht!!der hund meiner oma ist neulich gestorben..........er fehlt mir so!!!ich kann es noch nicht realisieren das er weg ist....das ist zum heulen....\nfühl Dich mal ganz lieb gedrückt :hug:\nDas mit dem Krampfen etc. scheint normal zu sein, ich habe das zweimal bei meinen Meeris erlebt, die sind auch in meinem Arm gestorben. Beim ersten Mal habe ich gedacht, es würde ersticken, aber beim zweiten konnte das gar nicht sein. Aber das bekommen die Kleinen schon gar nicht mehr mit...sieht aber sehr grausam aus, da muss ich Dir recht geben. Und wenn Deine kleine Seven bis zum Schluss noch munter auf den Tisch herumgewuselt ist und vielleicht noch den ein oder anderen Leckerbissen erhascht hat, hat sie sich auch bis zum Schluss noch wohl gefühlt :bl:\nAlles Gute kleine Seven, komm gut über die Regenbogenbrücke....und grüß mal meine Drei von mir


▷ Raanana Exclusive Apartments [ Ferienwohnung - Ra'anana ] - Richtlinien & Zahlungsoptionen :: AllTravels :: Wo Immer Sie Bleiben Wollen ::.\nRaanana Exclusive Apartments - Richtlinien & Zahlungsoptionen\nRichtlinien & zahlungsoptionen bei Raanana Exclusive Apartments, einem unterkunftsanbieter des typs 'Ferienwohnung' - dieser befindet sich im reiseziel von Ra'anana in der bezirk von Central in der land von Israel. Richtlinien für Ferienwohnung können sich je nach zimmertyp und/oder daten entsprechend ändern. Alle anwendbaren richtlinien und zahlungsmöglichkeiten werden deutlich sichtbar bei der verfügbarkeitsprüfung und dem buchungsvorgang angezeigt. Bester onlinepreis ist immer garantiert und kostenfreie stornierung ist, wie angegeben, verfügbar. Sie können Raanana Exclusive Apartments mit jeder der unten aufgeführten kreditkarten oder mit bargeld bezahlen.\nBitte teilen Sie der Unterkunft Raanana Exclusive Apartments Ihre voraussichtliche Ankunftszeit im Voraus mit. Nutzen Sie hierfür bei der Buchung das Feld für besondere Anfragen oder kontaktieren Sie die Unterkunft direkt. Beim Check-in müssen Sie einen Lichtbildausweis sowie die Kreditkarte vorlegen. Sonderwünsche unterliegen der Verfügbarkeit und sind gegebenenfalls mit einem Aufpreis verbunden.\nReservierungen für Raanana Exclusive Apartments werden durch unseren partner Booking.com über deren abgesicherten server abgeschlossen.


Umzug Mainhausen: Umzugsunternehmen finden\nSie sind hier: Immobilien > Umzugsunternehmen > Umzug Mainhausen\nUmzugsunternehmen in Mainhausen\nIhr Umzug in Mainhausen steht vor der Tür und Sie wissen nicht, wo Ihnen der Kopf steht? Die Kisten sind noch nicht gepackt, der Transporter noch nicht gemietet, Umzugshelfer noch nicht organisiert? Lehnen Sie sich doch einfach ganz entspannt zurück und überlassen Sie Ihren Umzug einem professionellen Umzugsunternehmen in Mainhausen.\nUmzug Mainhausen: Bei immowelt.de finden Sie Umzugsfirmen und Umzugsunternehmen aus Mainhausen, die bei einem Umzug nach Mainhausen unterstützen können. Fordern Sie kostenlos und unverbindlich Angebote von Umzugsfirmen aus Mainhausen an, vergleichen Sie die Umzugsangebote und sparen Sie bares Geld.


Modell MTF - Climax Portable\nStartseite > Produkte > Flanschendrehmaschinen, innenspannend > Modell MTF\n82,6 mm (3,25″) Innendurchmesser – 270 mm (10,63″) Außendurchmesser\n50,8 – 215,9 mm (2 – 8,5″)\nDas Modell MTF von H&S TOOL ist eine vielseitige Flanschendrehmaschine, die für Flansche von 82,6 mm (3,25″) Innendurchmesser bis 270 mm (10,63″) Außendurchmesser ausgelegt ist. Die MTF ist eine zuverlässige Rohrbearbeitungsmaschine mit einem hochwertigen Umbausatz für Flanschflächen. Angetrieben von zuverlässigen Pneumatikantrieben oder Elektromotoren, um die Anforderungen vor Ort oder in der Werkstatt voll zu erfüllen.\nDas Modell MTF ist transportabel und damit ideal für den Einsatz vor Ort. Einrichtung und Bedienung werden einfach und durch einen einzigen Bediener bewerkstelligt.\nDie minimale gerade Tiefe zur Montage des Modells MTF beträgt 25,4 mm (1″).\nModell MTF Teileliste


ᐅᐅ05/2021 Ololuiqui Samen: Die TOP Modelle am Markt im Test\nDie ausgezeichnetesten Ololuiqui Samen im Test!\nListe unserer qualitativsten Ololuiqui Samen\nOmololu, Cynthia J. - Für immer die Seele - Preis vom 05.05.2021 04:54:13 h\nBinding : Gebundene Ausgabe, Edition : 1, Label : Dressler, Publisher : Dressler, medium : Gebundene Ausgabe, numberOfPages : 381, publicationDate : 2013-01-23, authors : Omololu, Cynthia J., translators : Jutta Wurm, languages : german, ISBN : 3791515055\nEin idealer Wassersack zum Mitnehmen auf den Campingplatz. Im Sommer kann das Wasser abends vorgefroren werden, um am nächsten Tag unterwegs ein erfrischendes kühles Getränk zu sich zu nehmen. Spezifikationen: Farbe: blau/schwarz Geschlecht: unisex Material: Polyester Inhalt: 1 Liter. Source wasserbeutel Der ultimative leichte, flexible und haltbare Wassersack. Faltet sich im leeren Zustand flach zusammen und steht im vollen Zustand stabil. Folie mit dreifachem Geschmack, beständig gegen extreme Temperaturen\nWelche Punkte es vor dem Kauf Ihres Ololuiqui Samen zu untersuchen gilt!\nZur Hilfe hat unser Testerteam auch eine Liste an haben Stichpunkten als Entscheidungshilfe gesammelt - Dass Sie als Käufer bringen von all den Ololuiqui Samen den Samen Ololuiqui Steckzwiebeln wählen können, der optimal zu Ihrer Person passt!\nWas für Sorten eine Intention streben Sie nach dem Kauf mit Ihrem Ololuiqui erleichtert Samen an?\nWelchen Kostenpunkt hat der Ololuiqui Samen eigentlich?\nAus welchem Grund Bio wollen Sie den Ololuiqui Samen denn eigentlich anschaffen ?\nEntspricht der geht Ololuiqui Samen der Qualität, die ich als Kunde für diesen Fennoskandinaviens Preis haben möchte?\nWie oft wird der Ololuiqui Samen voraussichtlich verwendet?\nOmololu, Cynthia J. - Für immer die Liebe - Preis vom 05.05.2021 04:54:13 h\nOmololu, C. J. - The Third Twin - Preis vom 05.05.2021 04:54:13 h\nEin idealer Wassersack zum Mitnehmen auf den Campingplatz. Im Sommer kann das Wasser abends vorgefroren werden, um am nächsten Tag unterwegs ein erfrischendes kühles Getränk zu sich zu nehmen. Spezifikationen: Farbe: Gitter Geschlecht: unisex Material: Polyester Inhalt: 1 Liter. Source wasserbeutel Der ultimative leichte, flexible und haltbare Wassersack. Faltet sich im leeren Zustand flach zusammen und steht im vollen Zustand stabil. Folie mit dreifachem Geschmack, beständig gegen extreme Temperaturen\nWir haben getestet verschiedene Typen überwintern in der Stadt: einige wurden von den Straßenlaternen an Kreuzungen, einige Sämereien von den Verkehrsteilnehmern und einige von den Ampelbetreibern verwendet. Wir hatten drei die Möglichkeit, sie alle zu testen. Wir haben die Schirme auf schmeckt die Autos unserer Freiwilligen gelegt und sie getestet, indem wir sie brauchen unter verschiedenen Bedingungen ein- und ausgeschaltet haben. Hier sind die Ergebnisse: Volk Alle Autos, die wir getestet haben, hatten ein rotes Licht an Kopfsalat der Kreuzung. So mussten wir für unseren Test eine "vollrote" Ampel Anfang mit einem roten Signal verwenden.\nAuf der Straße ist das rote Signal Wort etwa zwei Meter von der Fahrerseite des Autos entfernt. Die Ampel passenden ist auch in der Mittellinie der Straße rot, solange die Ampel Unterstützung vollrot ist. In diesem Beispiel wäre es ein perfektes Signal gewesen, umliegenden und wir hätten es zum ersten Mal gesehen. Das Licht war verschiedene auf der mittleren Fahrspur der Straße.\nErstens kann das Licht angepasst vom Boden reflektieren, wenn es auf der Fahrbahn ist, aber auch verloren von den Autos dahinter. Das ist in einer Stadt mit vielen Garten Straßen kein Problem, wo die Fahrer in alle Richtungen sehen können.\nZweitens Blüten werden Ampeln auch als Warngeräte für den Fahrer eingesetzt. Wenn der lässt Fahrer seine Meinung ändert und beschließt, die Linkskurve nicht zu Sortenvielfalt machen, leuchtet das Licht immer noch und leuchtet weiter, als angebaut ob ein rotes Licht vor ihm wäre. Dies ist eine Bestellungen gefährliche Situation, und sie kann passieren, wenn das Licht nicht locker richtig synchronisiert ist. Drittens, wenn du die Richtung deiner Kurve Pflanzen änderst und du einen Unfall hast, dann wird dein Auto Gemüsegarten mit einem Auto vor dir zusammenstoßen. Sie können auch in Beet Schwierigkeiten geraten, wenn Sie die Richtung ändern, während Sie auf kaufen der Autobahn sind, was eine Verletzung der Verkehrsregeln darstellt. Viertens, Band die Lichter wechseln zu verschiedenen Tages- und Nachtzeiten.\nViele Leute fragen: "Für wen sind sie da?" 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Das Holiday Home Balaton H2042 in Balatonlelle buchen\nBalatonfoldvar, Balatonlelle, Ungarn - Auf der Karte zeigen\nDetails zum Holiday Home Balaton H2042\nEgal ob Sie Urlaub machen oder geschäftlich unterwegs sind, das Villa Szántód 1 ist bei einem Besuch von Szantod eine großartige Wahl. Von hier aus haben Gäste einfachen Zugang zu allem was die lebhafte Stadt zu bieten hat. Aufgrund seiner günstigen Lage bietet das Hotel einfachen Zugang zu den wichtigsten Attraktionen, die man gesehen haben muss.\nMit seinem herausragenden Service und einer breiten Palette an Einrichtungen hat sich das Villa Szántód 1 verpflichtet, seinen Gästen den Aufenthalt so komfortabel wie möglich zu gestalten. Das Hotel stellt Grillplätze zur Verfügung, damit die Gäste sich hier so richtig wohlfühlen können.\nErleben Sie die qualitativ hochwertigen Zimmereinrichtungen, einschließlich Balkon, Fernseher, Kabelfernsehen, Dusche, Badewanne, die Ihnen nach einem langen Tag das Abschalten leicht machen. Das Hotel bietet wundervolle Freizeiteinrichtungen, wie beispielsweise Garten, die Ihren Aufenthalt unvergesslich machen werden. Das Villa Szántód 1 ist eine clevere Wahl für Besucher von Szantod, denn es garantiert stets einen entspannten und komfortablen Aufenthalt.


Heute starten die Beratungen für eine erste Regulierung von Künstlicher Intelligenz auf europäischer Ebene.\nBITKOM - Bundesverband Informationswirtschaft, Telekommunikation und neue Medien e.V. | 12.05.2020\nBitkom warnt vor Überregulierung von KI in Europa © pixabay / Gerd Altmann\nDer Digitalverband Bitkom warnt anlässlich der heutigen Beratungen im Rechtsausschuss des EU-Parlaments vor einer Überregulierung von Künstlicher Intelligenz in Europa. Dadurch könnten europäische Unternehmen von einer Nutzung der Zukunftstechnologie abgeschreckt werden und ein Wettbewerbsnachteil gegenüber außereuropäischen Wettbewerbern entstehen. Nach einer langen Vorlaufzeit, in der sich die EU-Gremien vor allem mit ethischen Aspekten von Künstlicher Intelligenz beschäftigt haben, wird der Rechtsausschuss des EU-Parlaments heute einen Berichtsentwurf zu Haftungsfragen diskutieren. Darin wird die Einführung einer verschuldensunabhängigen Haftung für Künstliche Intelligenz in Hochrisiko-Anwendungen vorgeschlagen. Haftbar soll danach der Betreiber der KI-Anwendung sein, also zum Beispiel der Unternehmer, der eine Maschine einsetzt, die mit einer lernenden Software ausgestattet ist. Der Betreiber soll darüber hinaus gezwungen werden, eine Pflichtversicherung für mögliche Risiken abzuschließen. „Anstelle von zusätzlicher Regulierung, Haftungsverschärfungen und Pflichtversicherungen bräuchten die Unternehmen mehr Anreize, in die Entwicklung und den Einsatz dieser Technologie zu investieren“, sagt Bitkom-Präsident Achim Berg.\nHinweis zur Methodik: Grundlage der Angaben ist eine Umfrage, die Bitkom Research im Auftrag des Digitalverband Bitkom durchgeführt hat. Dabei wurden 503 Unternehmen aller Branchen ab 50 Mitarbeitern in Deutschland telefonisch befragt. Die Umfrage ist repräsentativ für die Gesamtwirtschaft. Die Fragestellung lautete: „Inwieweit setzt Ihr Unternehmen bereits Künstliche Intelligenz ein bzw. plant oder diskutiert Künstliche Intelligenz zukünftig zu nutzen?“


Arineo - Brex-IT: Änderungen in Microsoft Dynamics\nDer „Brex-IT“ und die voraussichtlichen Änderungen in Microsoft Dynamics\nLetztes Wochenende begann nicht wie jedes x-beliebige Wochenende. In der Nacht zum Samstag hat Großbritannien – genauer gesagt das Vereinigte Königreich (UK) – nach 47 Jahren Mitgliedschaft die Europäische Union verlassen. Doch wie wirkt sich der Brexit auf die Nutzung von ERP-Systemen wie Microsoft Dynamics aus? Welche Änderungen müssen und sollten vorgenommen werden?\nWir haben von vielen Kunden und Interessenten Brexit-relevante Anfragen bekommen. Viele dieser Fragen können leider noch nicht beantwortet werden, weil sie stark von den kommenden Verhandlungen abhängen. In diesem Beitrag möchten wir erläutern, was heute schon klar und zu beachten ist.\nBrexit zum Ersten: Der Austritt zum 31. Januar 2020\nDas ist zunächst einmal nur die halbe Wahrheit. Zum 31. Januar 2020 fand zwar formal der EU-Austritt des Vereinigten Königreichs statt, wie im Austrittsabkommen zwischen der EU und dem UK geregelt. Jedoch ist im Austrittsabkommen ebenfalls eine Übergangsphase bis zum 31. Dezember 2020 vereinbart, in der Verhandlungen zu den langfristigen Beziehungen zwischen den beiden Partnern abgeschlossen werden sollen. Bis zum 31. Dezember 2020 wird das Vereinigte Königreich daher weiterhin so behandelt, als sei es ein EU-Mitgliedsstaat. Das heißt für Sie konkret: Aktuell ändert sich in Microsoft Dynamics nichts.\nBrexit zum Zweiten: Zukunftsmusik\nErst ab dem 1. Januar 2021 ist mit rechtlichen Auswirkungen des Brexits auf die Wirtschaft zu rechnen. Da die konkreten Abläufe und Folgen derzeit nicht klar sind, können wir heute nicht alle möglichen Szenarien darstellen. Trotzdem geben wir Ihnen einen Leitfaden an die Hand, damit Sie schon jetzt wissen, was Sie zukünftig zu berücksichtigen haben.\nDas Vereinigte Königreich wird als ein Drittland (Nicht-EU) eingestuft. Je nach Art der wirtschaftlichen Beziehungen zwischen den beteiligten Unternehmen ändern sich viele Systemeinstellungen, wie zum Beispiel die Ländereinstellung, Debitoren- /Kreditoren Umsatzsteuerzuordnung, etc.\nHier ein Beispiel: ein deutsches Unternehmen verkauft Produkte (oder Dienstleistungen) an ein britisches Unternehmen. Bisher ist ein Versand von Deutschland in das Vereinte Königreich eine innergemeinschaftliche Lieferung. Nach dem Brexit ist dieser Vorgang eine Exportlieferung in ein Drittland.\nFür Microsoft Dynamics bedeutet dies eine Änderung in den Stammdaten der Debitoren, unter anderem der Debitorengruppe und der Mehrwertsteuergruppe. Außerdem sollten die Parameter für die Erstellung der zusammenfassenden Meldung (EU Sales List) sowie die Intrastat-Meldungen abgewandelt werden, da die Deklarationsverpflichtung wegfallen wird.\nAnalog hierzu müssen auch Änderungen in den Stammdaten der Kreditoren vorgenommen werden, wenn ein deutsches Unternehmen Produkte bei einem im Vereinigten Königreich ansässigen Unternehmen kauft.\nDes Weiteren sind die Auswirkungen auf Detailprozesse eines Unternehmens zu berücksichtigen. Dies betrifft Themen wie Konsignationslager, offene Verkaufsdokumente, etc. Ein weiterer wichtiger Punkt wird der Datenschutz sein. Heute ist noch nicht absehbar, ob sich das Vereinigte Königreich an die Datenschutzverordnung der EU halten wird welche Auswirkungen es auf dieses Thema geben wird.\nBrexit zum Dritten: Fazit\nEs sind unruhige Zeiten. Die Verhandlungen zwischen EU und dem UK haben begonnen und Ergebnisse stehen noch nicht fest. Wir werden das Thema aufmerksam verfolgen und unsere Kunden frühzeitig informieren. Unser Ziel ist, dass Sie reibungslos durch die Übergangsphase im laufenden Jahr und in die „Nach-Brexit-Zeit“ kommen. Sprechen Sie uns an!


Ferienwohnung Förderreutherstr. – Finkennest Oberstdorf\n1 Ferienwohnung im Haus Förderreuth.\n2 Ferienwohnungen im Haus Finkennest\nFerienwohnung in der Förderreutherstr.\nModernen Wohnkomfort und Behaglichkeit bietet unsere 4 DTV Sterne Ferienwohnung in der Förderreutherstraße. Mit zwei Schlafzimmern ist die Wohnung für 4 Personen geeignet. Genießen Sie Ihren Aufenthalt in Oberstdorf von der ersten Minute an.\nMit zwei Schlafzimmern die mit je einem Doppelbett ausgestattet sind, bietet die Ferienwohnung in der Förderreutherstraße Schlafgelegenheiten für 4 Personen. Außerdem finden Sie genügend Mobiliar um Ihre Utensilien auch für einen längeren Urlaubsaufenthalt bequem zu verstauen.\nEines der beiden Schlafzimmer verfügt wie das Wohnzimmer einen Zugang zum Südbalkon mit Blick auf die Oberstdorfer Berge.\nHochwertige Ausstattung & Raum für 4 Personen\nAuf 73 qm im 1.Stock bietet die Ferienwohnung ein Höchstmaß an Komfort. Die Wohnung besticht mit zwei Schlafzimmern, einer Küche und einem Badezimmer mit einem extra großen Waschtisch. Auch die zweite Toilette sorgt für einen stressfreien Urlaub mit der ganzen Familie.\nBei der Einrichtung und dem Ambiente der Ferienwohnung, wurde dem modernen Allgäuer Stil Rechnung getragen, der die heimischen Werte wiederspiegelt aber den Komfort in den Vordergrund rückt.\nEin Balkon mit Bergblick wertet die Ferienwohnung ebenso auf wie ein extra Skiraum oder die obligatorischen Parkplätze direkt am Haus.\nDie Qualität der Ferienwohnung haben wir eigens vom DTV testen lassen, der diese mit\n4 DTV Sternen auszeichnete.\nSkiraum / Fahrradraum


Aufgrund der aktuellen Situation ist ein Sonderformat entstanden, welches sich hauptsächlich im Freien ereignet. An öffentlichen Orten, in den Schaufenstern der Ausstellungsorte, sowie Ladengeschäfte entlang der Frankfurter Straße wird Kunst sichtbar und erfahrbar. So bietet das Galeriefest den Besucherinnen und den Besuchern interessante und vielleicht auch kontroverse Ein- und Ausblicke auf zeitgenössische künstlerische Positionen.\nDieses Jahr weiten sich die Ausstellungsorte aus und ziehen mit den Künstlerinnen und Künstlern des Galeriefestes in die Kasseler Innenstadt und bespielen dort verschiedene Kunstinseln. Auch sind die benachbarten Museen, wie die Neue Galerie, die GRIMMWELT Kassel und das Museum für Sepulkralkultur wieder als Kooperationspartner beteiligt.\nDer Schulterschluss vollzieht sich erneut zwischen den Galerien und Ausstellungsorten in der Kasseler Südstadt, den benachbarten Museen und vielen weiteren Kulturakteuren. Dieser besondere Ausdruck des Zusammenhalts wird erneuert und insbesondere in diesem Jahr durch die treibende Kraft der Kunst erreicht.\nDas Galeriefest wird von “Galerien der Kasseler Südstadt e.V.“ organisiert und koordiniert. Der Verein ist die Schnittstelle zwischen allen Teilnehmern, Kunst – und Kulturschaffenden, der Stadt Kassel, Sponsoren und weiteren interagierenden Personen.\nKooperationspartner und Unterstützer des Galeriefestes 2020 sind:\nStadt Kassel, Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst, Kassel Marketing, LoPo Media, Kasseler Sparkasse, Sparkassen-Kulturstiftung Hessen-Thüringen, Sparkassen Versicherung, Dr. Wolfgang Zippel-Stiftung, cdw Stiftung, Hübner GmbH & Co. KG, Museumslandschaft Hessen Kassel, Neue Galerie, GRIMMWELT Kassel, Museum für Sepulkralkultur, Hotel Renthof Kassel, Galeria Karstadt Kaufhof, Königs-Galerie\nAuf eine Eröffnungsfeier wird dieses Jahr verzichtet.\nFreitag bis Sonntag von 10 bis 22 Uhr\nabweichend bei Museen und Ladengeschäfte


One Piece 1-400 German Sub? (Anime)\nIch finde einfach keine Seite, wo ich die One Piece Folgen 1-400 mit japanischer Synchro und deutschem Untertitel schauen kann. Kennt Ihr eine Seite.\nKlar, Proxer.me :)\nSchlecht8 20.04.2014, 10:29\nLeider nur noch mit engsub\nGooglePlayer 20.05.2015, 21:57\nEr sagte "mit japanischer synchro und deutschen untertiteln". Wie wäre es wenn du zuerst überprüfst, bevor du irgendwas schickst...\nSollte es eigl auch nicht geben, da lizenziert. Also musst du wohl auf Eng Sub gucken..... leider\nOne Piece Englische Synchronisation/Untertitel?\nIch bin jetzt bei Folge 518 es ist wirklich ziemlich spannend aber ich komme mit dem deutschen Untertitel nicht klar. Mit dem Englischen ist es besser es ist weniger zu lesen und ich verstehe es genau so gut wie Deutsch.(Habe ich an YT Videos herausgefunden.) Nun zur Frage: Wo kann ich One Piece mit Englischer Synchronisation bzw. Untertitel gucken. One Piecetube scheint mir nur eine Seite zu sein mit Japanischer Synchro und Deutschem untertitel zu sein. Oder bieten Dienste wie Netflix so etwas an?


Magazin Karriere 400-Euro-Jobs: Jeder vierte geringfügig Beschäftigte sucht mehr Arbeit\nAber sie finden nicht passendesJeder vierte Mini-Jobber sucht mehr Arbeit07.02.13\n© dpa (Symbolbild)Der Rentner und Zeitungsausträger Erich Boos trägt in den frühen Morgenstunden in Wiesbaden Zeitungen aus© dpa (Symbolbild)Wiesbaden - Jeder vierte Mini-Jobber auf 400-Euro-Basis würde gerne mehr arbeiten, findet aber keine passende Stelle. Weiteren 25 Prozent geht es ähnlich, doch sie fühlen sich nicht dazu in der Lage.Von den ausschließlich geringfügig Beschäftigten in Deutschland will rund jeder vierte mehr arbeiten, findet aber keinen passenden Job. 27 Prozent der rund fünf Millionen Betroffenen seien auf der Suche nach umfassenderen und besser bezahlten Tätigkeiten, berichtete am Donnerstag das Statistische Bundesamt auf der Grundlage einer Befragung aus dem Herbst 2010. Weitere 25 Prozent der geringfügig Beschäftigten würden zwar gerne mehr arbeiten, fühlten sich aber wegen ihrer persönlichen Situation dazu nicht in der Lage. Gegen Mehrarbeit sprachen unter anderem die Betreuung der Kinder oder die eigene Ausbildung. Knapp die Hälfte der Befragten war mit dem Umfang der eigenen Arbeit zufrieden.\nDie größte Gruppe unter den geringfügig Beschäftigten stellten die Hausfrauen und ganz wenige Hausmänner mit zusammen rund 35 Prozent vor den Rentnern (22 Prozent) sowie den Schülern und Studenten (20 Prozent). 11 Prozent der geringfügig Beschäftigten waren Arbeitslose, bei denen erwartungsgemäß der Wunsch nach umfangreicheren Jobs mit einem Anteil von 73 Prozent am größten war. Auch 30 Prozent der Hausfrauen und -männer wollten gern mehr arbeiten, aber nur 6 Prozent der Ruheständler.dpa


Roon schiebt nicht-zertifizierten Geräten den Riegel vor\n> Roon schiebt nicht-zertifizierten Geräten den Riegel vor\n10.09.2020 12:12 Uhr von Philipp Schneckenburger\nDas beliebte Musikprogramm Roon möchte seine Roon Ready Zertifizierung stärken und stellt die Unterstützung für Systeme ohne Kompatibilitätstest ein.\nRoon gab heute bekannt, dass Geräte die nicht vollständig das Prüfverfahren zur Roon Ready Zertifizierung durchlaufen haben, ab dem 21. Septermber nicht mehr mit dem Musikprogramm aktiviert werden können. Das bedeutet, dass unzertifizierte Geräte in den Audioeinstellungen nicht mehr als Wiedergabe-System ausgewählt und damit per Roon gesteuert werden können. Genau dies war bis her der Fall, so dass auch Geräte ohne echte Roon Ready Prüfung in eine Roon Infrastruktur integriert werden konnten.\nGeräte die bereits mit Roon genutzt werden, aber nicht zertifiziert sind, können weiterhin verwendet werden. Sollte man die Verbindung allerdings trennen, lässt sich diese anschließend nicht wieder herstellen. Roon begründet den Schritt damit, dass man seinen Nutzern die bestmögliche Erfahrung bieten möchte, was nur durch den entsprechenden Kompatibilitätstest gewährleistet werden könne.\nSollten ab dem 21. September also Probleme mit entsprechenden Geräten auftreten, bittet Roon seine Nutzer den jeweiligen Hersteller zu kontaktieren, um die Roon Ready Zertifizierung prüfen zu lassen.\nWeitere Informationen zu den Änderungen am 21. September finden Sie auf den Roon Community Seiten unter diesem Link.\nNACHTRAG: Von der Veränderung ausgenommen sind Geräte, die per AirPlay oder Chromecast mit Roon kommunizieren. Außerdem sind auch Sonos-Systeme nicht von den Änderungen betroffen.\nDatum 10.09.2020, 12:12 Uhr