Witting, Anke - Kapitel 4\n4.1 Kleinhirnneurone als apoptotisches Modellsystem\nZur Untersuchung der Bindungsmechanismen zwischen apoptotischen Zellen des zentralen Nervensystems und Mikrogliazellen war es notwendig, ein neuronales Zellmodell zu etablieren, in dem ein apoptotischer Zelltod synchron in möglichst vielen Neuronen ausgelöst werden konnte. Neuronenkulturen aus dem Kleinhirn boten sich zu diesem Zweck an, da in diesen Kulturen die Auslösung eines apoptotischen Zelltods bereits von anderen Arbeitsgruppen untersucht wurde (\nD'Mello et al., 1993\n). Ein apoptotischer Zelltod kann in diesen Kleinhirnneuronen beispielsweise durch einen Austausch des Kulturmediums mit hohen Kaliumkonzentrationen (25 mM) gegen Kulturmedium mit niedrigen Kaliumkonzentrationen (5 mM) oder durch die Zugabe von Stickstoffmonoxid (NO) Donatoren ausgelöst werden (\n; Armstron et al., 1997 ; Leist et al., 1997\n). Für diese Arbeit wurde ein apoptotischer Zelltod in den Kleinhirnneuronen mit dem NO-Donator S-Nitrosocystein (SNOC) ausgelöst. Hierzu wurde, wie im Methodenteil (3.2) beschrieben, SNOC in einer Konzentration von 100 µM den Neuronenkulturen beigefügt.\n4.1.1 Nachweis des apoptotischen Zelltods in den Kleinhirnneuronen Ob durch NO-Donatoren überwiegend ein apoptotischer oder nekrotischer Zelltod von Neuronen ausgelöst wird, hängt von den eingesetzten Konzentrationen der Donatoren und den Kulturbedingungen der Neurone ab (\n). Unter Zellkulturbedingungen folgt dem apoptotischen Zelltod immer eine sekundäre Nekrose, da sich im allgemeinen keine Phagozyten in den Kulturen befinden (\n). Daher war es notwendig, den Zeitverlauf des durch SNOC ausgelösten Zelltods in den Kleinhirnneuronenkulturen zu charakterisieren. Die Charakterisierung des Zelltods erfolgte anhand morphologischer und biochemischer Merkmale des apoptotischen und nekrotischen Zelltods.\n4.1.1.1 Nachweis der für Apoptose spezifischen morphologischen Veränderungen Charakteristische morphologische Merkmale eines apoptotischen Zelltods sind Schrumpfung der Zelle, Bläschenbildung der Membran und Zerfall der Zelle in vesikuläre Strukturen (apoptotische Körper) und können im Phasenkontrastmikroskop beobachtet werden (\n). Aus diesem Grund wurden die Neuronenkulturen des Kleinhirns nach der Zugabe von 100 µM SNOC alle 30 Minuten mikroskopisch untersucht. Abbildung 4: Für Apoptose spezifische morphologische Veränderungen der Kleinhirnneurone nach einer SNOC-Behandlung.\nKultivierte Kleinhirnneurone der Ratte wurden mit 100 µM S-Nitrosocystein (SNOC) behandelt und nach vier Stunden unter Phasenkontrastbeleuchtung fotografiert. Auf der linken Seite sind unbehandelte Kontrollneurone und auf der rechten Seite Neurone vier Stunden nach einer SNOC-Behandlung dargestellt. Erste morphologische Zeichen einer Apoptose, wie Schrumpfung der Neurone und eine Zerstörung des Neuritennetzwerkes aufgrund einer Fragmentation der Neurone konnten frühestens zwei Stunden nach der SNOC-Behandlung festgestellt werden und waren vier Stunden nach der SNOC-Behandlung in der gesamten Kultur deutlich erkennbar (Abb.4).\n4.1.1.2 Nachweis einer DNA-Fragmentation Ein biochemisches Merkmal der Apoptose ist die enzymatische Fragmentation der DNA (\n; Nicotera und Leist, 1997\n. Isolierte DNA aus apoptotischen Zellen, die elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt wurde, bildet daher ein charakteristisches Leitermuster im Gel aus (\nGong et al., 1994\nDarzynkiewicz und Traganos, 1998\n). Eine weitere Methode zum Nachweis apoptotischer Fragmentation der DNA ist die in situ Markierungen der Strangenden der DNA (\nGorczyca et al., 1992\n; Darzynkiewicz und Traganos, 1998\n). Dazu wurde in den Kleinhirnneuronen die sogenannte ApopTag-Färbung (Oncor; Gaithersburg, USA) durchgeführt, wobei die DNA-Enden fluorometrisch markiert wurden (siehe Methodenteil 3.3.3). Da es auch während des nekrotischen Zelltods in geringem Maße zu DNA Strangbrüchen kommt, wurden die Zellen zusätzlich mit PI gefärbt (siehe Methodenteil 3.3.3).\nKörnerzellen in unbehandelten (Kontroll-) Kulturen (linke Abbildungen) und 18 Stunden nach der SNOC-Behandlung (rechte Abbildungen) wurden durch ApopTag-Färbung markiert. Die Phasenkontrast-Aufnahmen sind in den oberen Bildern dargestellt. Die ApopTag-Färbungen sind in den unteren Bildern dargestellt. 4618 Stunden nach einer SNOC-Behandlung wies ein Großteil der Neurone, im Gegensatz zu unbehandelten Kontrollneuronen, eine intensive ApopTag-Färbung im Zellkern auf (Abb.5). Einige dieser ApopTag-positiven Neurone zeigten ebenfalls eine PI-Färbung (nicht dargestellt). Es liegt nahe, daß es sich bei diesen Neuronen um sekundär nekrotische Zellen handelt (siehe 4.1.1.3). 4.1.1.3 Nachweis einer Chromatinkondensation Morphologische Merkmale des apoptotischen Zelltods, wie die Kondensation des Chromatins und die zum Teil auch stattfindende Fragmentation des Zellkerns können mit Hilfe von DNA-Farbstoffen, wie 4,6-Diamidino-2-Phenylindoldihydrochlorid (DAPI) nachgewiesen werden (Übersicht: Darzynkiewicz und Traganos, 1998\n). In den Zellkernen mit kondensiertem Chromatin kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität.\nZum Nachweis einer Chromatinkondensation und einer Fragmentation des Zellkerns wurden unbehandelte Kleinhirnneurone und Kleinhirnneurone nach unterschiedlichen Zeiten nach einer SNOC-Behandlung mit dem DNA-Farbstoff DAPI angefärbt (siehe Methodenteil 3.3.2). Zum Nachweis nekrotischer Zellen wurden die Zellen mit dem membranimpermeablen DNA-Farbstoff Propidiumjodid (PI) angefärbt. Die Anzahl der Neurone mit kondensiertem Chromatin oder PI-markierten Zellkernen in den Kleinhirnneuronenkulturen wurde wie im Methodenteil (3.3.2) beschrieben ermittelt. 47 Abbildung 6: Apoptotischer und nekrotischer Zelltod in den Körnerzellen des Kleinhirns nach einer Behandlung mit 100 µM S-Nitroso-L-Cystein.\nA: DAPI-Färbung in Kontrollkulturen (linke Abbildung) und sechs Stunden nach einer Behandlung mit 100 µM SNOC (rechte Abbildung). Apoptotische Neurone werden durch ihre kondensierten Zellkerne und das kondensierte Chromatin charakterisiert (Pfeile). B: Unbehandelte (Kontroll-) und SNOC-behandelte Neuronenkulturen wurden mit DAPI und PI gefärbt. Der Prozentsatz apoptotischer und nekrotischer Neurone wurde durch Auszählung von fünf zufällig ausgewählten Feldern auf den Deckgläsern ermittelt. Eine spontane Apoptose konnte in den Kontrollkulturen festgestellt werden; eine sekundäre Nekrose konnte 18 Stunden nach der SNOC-Behandlung beobachtet werden. Die Ergebnisse sind in Mittelwerten ± SEM dargestellt, die von 23 Experimenten für die sechs Stunden Werte und 11 Experimenten für die 18 Stunden Werte erhalten wurden. * p < 0,05\n48Sechs Stunden nach einer Behandlung der Kleinhirnneurone mit 100 µM SNOC besaßen die Mehrzahl der Neurone (86.2 % ± 3.0 %) kondensiertes Chromatin im Zellkern und waren apoptotisch (Abb. 6). Ein nekrotischer Zelltod war sechs Stunden nach einer SNOC-Behandlung - verglichen mit unbehandelten Kontrollkulturen - kaum erkennbar (0.3 ± 0.1 %) (Abb.6). Eine Behandlung der Kleinhirnneurone mit 100 µM SNOC löste also keinen nekrotischen Zelltod aus. 18 Stunden nach der SNOC-Behandlung konnte eine signifikante Zunahme des nekrotischen Zelltods (23.6 ± 2.2 %) festgestellt werden, während der Prozentsatz apoptotischer Neurone abnahm (69.2 ± 3.8 %). Diese PI-markierten Zellen wiesen häufig einen kondensierten Zellkern auf. Dies läßt darauf schließen, daß eine sekundäre Nekrose stattgefunden hatte. In der Kontrollkultur, die nicht mit SNOC behandelt wurde, wiesen ebenfalls einige Zellen kondensierte Zellkerne auf (18.3 ± 2.2 %, von 6.6 bis 45.7 %; n = 23). Es handelte sich hierbei um spontan apoptotische Zellen (Abb.6).\n4.1.1.4 Nachweis von Phosphatidylserin auf der Außenseite der Plasmamembran\nWährend des apoptotischen Zelltods kommt es zu einer Präsentation von Phosphatidylserin (PS) auf der Außenseite der Plasmamembran (\n). Mit Hilfe des fluoreszenzmarkierten Proteins Annexin-V, welches an negativ geladene Phospholipide wie PS bindet, können PS präsentierende apoptotische Zellen markiert werden (\n). Die Präsentation von PS auf der Außenseite der Plasmamembran wird als ein früher Marker des apoptotischen Zelltods angesehen, da die Präsentation von PS in vielen apoptotischen Zellen bereits vor der nukleären Kondensation auftritt (\n). Zum Nachweis der PS Präsentation wurden die SNOC behandelten Kleinhirnneurone mit FITC-konjugierten Annexin-V gefärbt (siehe Methodenteil 3.3.4). Zum Nachweis nekrotischer Zellen wurde diese Färbung mit einer PI-Färbung kombiniert. Im direkten Anschluß an die Färbung wurden die Zellen mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops untersucht. Auf Ebene der Zellkörper wurden die mit Annexin angefärbten Membranen als Ringe sichtbar (Abb.7). 49 Abbildung 7: Phosphatidylserin wird im Verlauf der SNOC induzierten Apoptose früh auf der Oberfläche der Neurone präsentiert.\nUnbehandelte (Ktr) Körnerzellen und nach verschiedenen Zeitpunkten (2, 4 und 6 Stunden) mit SNOC behandelte Körnerzellen. Die Phasenkontrastaufnahmen sind auf der linken Seite dargestellt. Die Präsentation von Phosphatidylserin auf der äußeren Seite der Plasmamembran wurde mit Hilfe des FITC-konjugierten Annexin-V markiert und ist in den mittleren Abbildungen zu sehen. Die PI gefärbten Kerne der nekrotischen Zellen sind in der rechten Abbildung dargestellt. Die Abbildungsserie zeigt einen repräsentativen Versuch aus drei unabhängigen Versuchen.\n50In den mit Annexin-V gefärbten unbehandelten Kontrollkulturen konnten wenige Annexin-V-positive Zelle beobachtet werden (Abb.7). Zwei Stunden nach der Behandlung mit 100 µM SNOC wurde eine Zunahme von Annexin-V-positiven Neuronen beobachtet (Abb.7). Eine Behandlung der Kleinhirnneurone mit 100 µM SNOC löst also schnell den apoptotischen Zelltod in den Neuronen aus. Vier Stunden nach der SNOC-Behandlung nahm die Anzahl Annexin-positiver Zellen weiter zu und sechs Stunden nach der SNOC-Behandlung war der größte Teil der Neurone Annexin-V-positiv (Abb.7). Somit zeigt die Annexin-Markierung, daß innerhalb des Untersuchungszeitraumes von sechs Stunden die Mehrheit der Neurone apoptotische wurden, wenn auch nicht in allen Neuronen synchron PS auf der Außenseite präsentiert wurde. Die Anzahl nekrotischer Zellen nahm im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollkulturen nicht zu (Abb.7). Innerhalb der ersten sechs Stunden nach der SNOC-Behandlung konnte also keine sekundäre Nekrose festgestellt werden. 4.2 Apoptotische Neurone produzieren keine löslichen Signale, die eine chemotaktische Reaktion in Mikrogliazellen hervorrufen. Apoptotische Zellen im peripheren Immunsystem produzieren keine löslichen Signale, die auf professionelle Phagozyten chemotaktisch wirken (\n). Die Erkennung apoptotischer Zellen im peripheren Immunsystem erfolgt ausschließlich über Zell-Zell-Kontakte (\n). Um zu überprüfen, ob im zentralen Nervensystem gleiche Gesetzmäßigkeiten wie im peripheren Immunsystem herrschen, wurden in dieser Arbeit die Überstände von apoptotischen Neuronen auf das Potential hin untersucht, eine Migration der Mikrogliazellen in einem Mikrochemotaxistest auszulösen (siehe Methodenteil 3.5). Zusätzlich wurden die Bewegungen der Mikrogliazellen in apoptotischen Neuronenkulturen auf zielgerichtete Bewegungen zu apoptotischen Neuronen hin mit Hilfe von Zeitraffervideomikroskopie untersucht. Zielgerichtete Bewegungen der Mikrogliazelle weisen auf chemoattraktive Substanzen hin.\nFür die Mikrochemotaxisexperimente wurden Überstände von unbehandelten Kontrollneuronen, SNOC behandelten Kleinhirnneuronen und lösliche Überstände von mechanisch zerstörten, nekrotischen Neuronen verwendet. Diese Überstände, die von sieben unterschiedlichen Präparationen stammten, wurden im Mikrochemotaxis Test eingesetzt (siehe Methodenteil 3.5) (Abb.8). 51 Abbildung 8: Kulturüberstände von apoptotischen Neurone besitzen keine chemotaktische Wirkung auf Mikroglia.\nÜberstände von unbehandelten Neuronen, SNOC-behandelten und mechanisch zerstörten Neuronen wurden in einem Mikrochemotaxistest auf ihr Potential getestet, eine mikrogliale Migration auszulösen. Überstände von apoptotischen Neurone besaßen keine chemotaktische Wirkung, während Überstände von nekrotischen Zellen in drei von sieben Experimenten eine deutliche chemotaktische Reaktion hervorriefen. Die Experimente wurden mit dreifach Ansätzen durchgeführt. Die dargestellten Werte stellen Mittelwerte von 7 Experimenten, ausgedrückt als Migration und deren Standardfehler (± SEM) im Vergleich zur Migration in Kontrollkulturen dar und wurden auf die Migration der Kontrollneurone norminiert.\nObwohl die einzelnen Präparationen sich in ihrem migrationsfördernden Potential auf Mikrogliazellen unterschieden, gab es keine signifikante Induktion der Mikroglia Chemotaxis durch Überstände von apoptotischen Neuronen im Vergleich zu den Überständen der jeweiligen unbehandelten Kontrollneuronen (Abb.8). Im Gegensatz dazu stimulierten die löslichen Überstände von neuronalen Zellextrakten in drei von sieben Präparationen die Mikroglia Migration (Abb.8). Diese Ergebnisse zeigen, daß apoptotische Neurone keine löslichen Substanzen produzieren, die chemoattraktiv auf Mikrogliazellen wirken.\nFür die Videozeitraffer Beobachtungen (siehe Methodenteil 3.4) wurden Mikrogliazellen zwei Stunden nach der SNOC-Behandlung auf die Neuronenkulturen gegeben. 52 Abbildung 9: Video Zeitraffer Aufnahmen von Mikrogliazellen, die zu apoptotischen Neuronen gegeben wurden.\nZwei Stunden nach der SNOC-Behandlung der Neurone wurden Mikrogliazellen (schwarze Pfeilspitze) zu der Kultur gegeben. Die Beobachtungszeit ist jeweils oben links vermerkt. Nachdem sich die Mikroglia am Substrat angeheftet hatten, bewegten sich ihre Lamellipodien und nahmen Kontakt mit verschiedenen apoptotischen Neuronen in der Nachbarschaft auf (Mikroglia mit Sternchen). Nach 90 Minuten (12.31) band die Mikroglia ein Neuron mit einem kondensierten Zellkern (Pfeil) und phagozytierte dieses Neuron. 53Zunächst mußten sich die Mikrogliazellen auf dem Substrat anheften (Abb.9). Die Mikrogliazellen adherierten dabei auf zellfreien Regionen des Deckglases. Anschließend kam es zur Ausbildung von Lamellipodien, mit denen die Mikrogliazellen Kontakt zu den Neuriten und den Zellkörpern der benachbarten Neurone aufnahmen. Eine Wanderung der Mikroglia fand nicht statt, was darauf hindeutet, daß apoptotische Neurone keine chemoattraktiven Signale produzieren. Die Lamellipodien der Mikroglia interagierten erst mit vielen nicht apoptotischen Neuronen bevor es zur Phagozytose eines apoptotischen Neurons kam. Dies deutet darauf hin, daß wie im peripheren Immunsystem ein direkter Zell-Zell-Kontakt für die Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikroglia notwendig ist. Der eigentliche Prozess der Aufnahme von Neuronen durch die Mikrogliazelle dauerte in diesem Modell normalerweise 15-20 Minuten, wie auch schon für das peripheren Immunsystem beschrieben (\nFalasca et al., 1996\n; van den Eijnde et al., 1998\n4.3 Mikrogliazellen binden/phagozytieren apoptotische Zellen\nUm die Bindungsmechanismen zwischen apoptotischen Neuronen und Mikrogliazellen zu untersuchen, war es notwendig ein Interaktionsmodell zu entwickeln. Der Zeitraum der Interaktion zwischen apoptotischen Neuronen mit Mikrogliazellen wurde so gewählt, daß eine sekundäre Nekrose der Neurone ausgeschlossen werden konnte. Wenn auch in allen bisher beschriebenen Arbeiten im peripheren Immunsystem so durchgeführt, war es für die Fragestellung dieser Arbeit nicht sinnvoll, apoptotische Zellen zu adhärenten Mikrogliazellen zu geben, da das Ablösen der Neurone einen hohen Prozentsatz nekrotischer Zellen induzierte. Vor allem in den Kontrollkulturen konnte durch die mechanische Zerstörung der Neuriten ein nekrotischer Zelltod festgestellt werden (nicht dargestellt). Für das Interaktionsmodell wurden daher die Neurone, die sich auf Deckgläsern befanden, mit 100 µM SNOC behandelt und nach zwei Stunden Inkubationszeit wurden Mikrogliazellen in einem Verhältnis von einer Mikrogliazelle zu zehn Neuronen zugegeben. Der Prozentsatz der phagozytierenden Mikroglia wurde nach einer Koinkubationszeit von sechs Stunden ermittelt (für einige Experimente wurde der Prozentsatz bereits nach drei Stunden ermittelt). Hierzu wurden, wie im Methodenteil (3.6) beschrieben, die Mikrogliazellen, die apoptotische Neurone phagozytiert hatten, ausgezählt (Abb.10).\n54 Abbildung 10: Die Bindung/Phagozytose von Neuronen durch Mikrogliazellen nimmt in Kokultur mit SNOC-behandelten Neuronen zu.\nA,B: Doppelte Fluoreszenzfärbung von Mikroglia, die apoptotische Neurone phagozytieren. In (A) sind vier Mikrogliazellen gezeigt, die mit ILB4-FITC markiert wurden. Die DAPI Färbung (B) zeigt, daß zwei der Mikrogliazellen ein apoptotisches Neuron, erkennbar am kondensierten Zellkern, gebunden bzw. phagozytiert haben (Pfeile). C: Der Prozentsatz phagozytierender Mikroglia nimmt nach einer sechstündigen Koinkubationszeit in den SNOC behandelten Neuronen-Kulturen auf 134 ± 7.7 % zu. Die Werte sind auf die Kontrolle normiert und als Mittelwerte ± SEM dargestellt (n = 29). * p < 0,05 55Abhängig von den an jeweils unterschiedlichen Tagen präparierten Neuronenkulturen trat eine relativ hohe Phagozytoserate in den unbehandelten Kontrollkulturen auf (Mittelwert 21.3 ± 1.9 %, von 7.4-46.2 %; n = 29). Wie unter 4.1.2 beschrieben, können apoptotische Zellen in den unbehandelten Neuronenkulturen festgestellt werden. Da nur Neurone mit kondensiertem Chromatin im Zellkern durch die Mikrogliazellen in den Kontrollkulturen aufgenommen wurden, beruhte die hohe Phagozytoserate in den Kontrollkulturen (Mittelwert 21.3 ± 1.9 %, von 7.4-46.2 %; n = 29) auf einer Aufnahme apoptotischer Neurone. In der SNOC-behandelten Kultur nahm der Prozentsatz der Mikroglia, die apoptotische Neurone phagozytiert hatten (Mittelwert 27.2 ± 2.2 %; n = 29) im Vergleich zu den Kontrollkulturen zu. In den einzelnen Experimenten wurde eine Phagozytoserate von 50.8 % (von 8.5-50.8 %) nie überschritten. Aufgrund der hohen Variabilität zwischen den einzelnen Experimenten wurde die Mikroglia Phagozytose in den apoptotischen Kulturen in jedem Experiment auf die Phagozytose in den jeweiligen, nicht mit SNOC behandelten Kontrollkulturen normalisiert. In den apoptotischen Kulturen konnte so eine signifikante Zunahme der Phagozytose auf 134 ± 7.7 % im Vergleich zu der Phagozytose in den Kontrollkulturen festgestellt werden (Abb.10). Führte man den Kokulturansatz umgekehrt durch, gab also apoptotische Neurone zu kultivierten Mikrogliazellen, nahm der Prozentsatz phagozytierender Mikroglia deutlich zu (66 ± 8.9 %) (nicht dargestellt). Dieser experimentelle Ansatz war jedoch, aus den erwähnten Gründen, für die Fragestellung dieser Arbeit nicht sinnvoll. 4.4 Identifikation der Bindungsmechanismen zwischen apoptotischen Neuronen und Mikrogliazellen\nIm peripheren Immunsystem spielen drei Erkennungsmechanismen zwischen apoptotischen Zellen und Makrophagen eine bedeutende Rolle: 1. Die Erkennung von veränderten Zuckerstrukturen auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen durch Lektine der Phagozyten (siehe 1.4.1.1). 2. Eine Thrombospondin-vermittelte Erkennung von apoptotischen Zellen (siehe 1.4.1.3). 3. Die Erkennung von Phosphatidylserin auf der Oberfläche apoptotischer Zellen (siehe 1.4.1.2). 56In dieser Arbeit wurde untersucht, ob diese Erkennungsmechanismen ebenfalls eine Rolle bei der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikroglia spielen. 4.4.1 Spezifische Kohlenhydrate inhibieren die Bindung/Aufnahme von apoptotischen Neurone durch Mikroglia\nMonosaccharide, die mit den Lektin-Bindungsstellen interagieren, inhibieren die Aufnahme von apoptotischen Leukozyten durch Makrophagen und semiprofessionellen Phagozyten aus dem peripheren Immunsystem (\n). Um festzustellen, ob derartige Mechanismen auch bei der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen gelten, wurden die Phagozytoseansätze in Gegenwart von verschiedenen Monosacchariden durchgeführt (Abb.11). Die verwendeten Konzentrationen der Monosaccharide orientieren sich an früheren Studien zur Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen und semiprofessionelle Phagozyten aus dem peripheren Immunsystem (\n; Pradhan et al., 1997\n). Eine signifikante Inhibition der Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikroglia konnte in Gegenwart von 20 mM Galaktose (Gal) beobachtet werden (75.0 ± 7.7 % der Kontrolle = apoptotische Neurone ohne Inhibitoren, n = 11). Die Zugabe von 20 mM des Aminozuckers N-Acetylglukosamin (GlkNac) zeigte eine inhibitorische Tendenz auf die Bindung bzw. Aufnahme apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen (75.8 ± 7.3 %; n = 9). N-Acetylgalaktosamin (GalNac) (n = 9), Glukose (Glu) (n = 6), Mannose (Man) (n = 7) und Fukose (Fuk) (n = 6; 20 mM jeweils) zeigten keinen inhibitorischen Effekt auf die Interaktion zwischen Mikrogliazellen und apoptotischen Neuronen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß eine Lektinbindung eine Rolle in der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikroglia spielt. 57 Abbildung 11: Effekt von Monosacchariden auf die Phagozytose apoptotischer Körnerzellen des Kleinhirns durch Mikroglia.\nDie Anzahl phagozytierender Mikroglia wurde, wie im Methodenteil beschrieben, sechs Stunden nach Koinkubationszeit der Mikroglia mit den apoptotischen Neuronen ermittelt. Keine Inhibition der Phagozytose war in Gegenwart von Glukose (Glu; n = 6), Fukose (Fuk; n = 6), Mannose (Man; n = 7) oder N-Acetylgalaktosamin (GalNac; n = 9) festzustellen. Eine signifikante Inhibition konnte bei Galaktose beobachtet werden (Gal; n = 11). N-Acetylglukosamin (GlkNac; n = 9) zeigte eine Tendenz zur Inhibition der Phagozytose (*) p = 0.051. Die Werte sind auf die Kontrolle des jeweiligen Experiments normiert und als Mittelwerte der prozentualen Phagozytose der Mikroglia ± SEM dargestellt. Der Schwankungsbereich der phagozytierenden Mikroglia in der Kontrolle lag zwischen 8.5 bis 50.8 %. * p < 0,05 versus Kontrollwerte.\n4.4.2 RGDS Peptide üben einen inhibitorischen Effekt auf die Erkennung von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen aus\nSpezifische inhibitorische Effekte von Argenin-Glycin-Asparagin-Peptiden (RGD Peptide) und kationischen Aminozuckern zeigten, daß ein Thrombospondin-vermittelter Mechanismus bei der Erkennung von apoptotischen Eosinophilen und Lymphozyten durch Makrophagen eine Rolle spielt (\n). RGD-Peptide binden an Integrine, wie dem Vitronektinrezeptor (V3), der eine Komponente des Thrombospondin Rezeptors des Phagozyten ist (\n). Kationische Aminozucker verhindern die Bindung von Thrombospondin, da sie anionische Thrombospondin Bindungsstellen auf den apoptotischen Zellen maskieren (\n). Um festzustellen, ob ein Thrombospondin-vermittelter Mechanismus bei der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen eine Rolle spielt, wurden die 58Phagozytoseansätze in Gegenwart von synthetischen Argenin-Glycin-Asparagin-Serin-Peptiden (RGDS Peptid) oder dem Aminozucker Glukosamin durchgeführt (Abb.12). Zusätzlich wurden synthetische Argenin-Glycin-Glutamin-Serin-Peptide (RGES Peptid) als Kontrollpeptide eingesetzt. RGES-Peptide binden nicht an Integrine und sollten daher auch keinen inhibitorischen Effekt auf die Thrombospondin-vermittelte Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten ausüben. Die angegebenen Konzentrationen der Substanzen orientieren sich an früheren Studien zur Aufnahme apoptotischer Zellen durch semiprofessionelle Phagozyten (\n). Abbildung 12: RGDS Peptide inhibieren die Phagozytose von apoptotischen Kleinhirnneuronen durch Mikroglia.\nDie Anzahl phagozytierender Mikrogliazellen wurde sechs Stunden nach Koinkubation der Mikroglia mit apoptotischen Neuronen ermittelt. 10 mM Glukosamin (Glkn) besaß keinen inhibitorischen Effekt auf das Phagozytoseverhalten der Mikrogliazellen. Die Blockierung der Mikroglia Phagozytose durch 20 mM Glukosamin (Glkn; n = 6) war unspezifisch, da 20 mM Glukosamin einen toxischen Effekt auf Mikrogliazellen ausübte (#) (siehe Tabelle1, Seite 51). Ein inhibitorischer Effekt des Kontrollpeptids RGES konnte nicht festgetellt werden (n = 7). Eine signifikante Inhibition konnte für 2 mM RGDS (n = 8) beobachtet werden, jedoch nicht für 1 mM RGDS (n = 6). Die Werte sind auf die Phagozytoserate der Kontrolle des jeweiligen Experiments normiert und als Mittelwerte der prozentualen Phagozytose der Mikroglia ± SEM dargestellt. p < 0,05 versus Kontrollwerte.\n59Mit dem Kontrollpeptid (2 mM RGES) konnte kein inhibitorischer Effekt festgestellt werden. Durch Zugabe des RGDS Peptids in das Interaktionsmedium wurde die Phagozytose apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen signifikant inhibiert. Die Inhibition von RGDS war signifikant bei einer Konzentration von 2 mM (76.1 ± 7.8 %, n = 8), konnte jedoch nicht bei einer Konzentration von 1 mM RGDS (n = 6) beobachtet werden. Dies stimmt mit den inhibitorischen Konzentrationen überein, die auch bei semiprofessionellen Phagozyten beobachtet wurden (\n). Dieser RGDS Effekt zeigte eine Zeitabhängigkeit: während eine Inhibition durch 2 mM RGDS nach einer dreistündigen Inkubationszeit von Neuronen mit Mikroglia nicht festgestellt werden konnte, war die Inhibition nach einer sechstündigen Inkubationszeit signifikant (nicht dargestellt). Diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß eine Bindung von Thrombospondin an Vitronektin Rezeptoren bei der Erkennung apoptotische Neurone durch Mikrogliazellen eine Rolle spielt. Diese Integrin-vermittelte Erkennung ist möglicherweise erst später im apoptotischen Programm wichtig, wie für periphere Makrophagen und semiprofessionelle Phagozyten gezeigt wurde (\n). Die kationischen Aminozucker Glukosamin und Mannosamin üben einen inhibitorischen Effekt auf die Thrombospondin-vermittelte Phagozytose von apoptotischen Neutrophilen durch semiprofessionelle Phagozyten aus (\n). 10 mM Glukosamin (Glkn) inhibierte in diesem Interaktionsmodell die Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen nicht signifikant. Durch eine Konzentration von 20 mM Glukosamin, wie sie auch in anderen Phagozytosemodellen verwendet wurde, wurde die Aufnahme von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen geblockt. Diese Blockierung war unspezifisch, da im Neutralrottest gezeigt werden konnte, daß 20 mM Glukosamin einen toxischen Effekt auf Mikroglia ausübte (siehe 4.4.4).\n4.4.3 O-Phospho-L-Serin inhibiert die Bindung/Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikroglia Apoptotische Neurone präsentieren Phosphatidylserin (PS) auf der Außenseite ihrer Plasmamembran (\n). Diese Präsentation von PS auf der Plasmamembran stellt ein Erkennungssignal für Phagozyten dar, wie durch wasserlösliche PS-Analoga, die an die Phosphatidylserinrezeptoren der Phagozyten binden und dadurch 60die Erkennung apoptotischer Lymphozyten durch Makrophagen inhibieren, gezeigt werden konnte (\n). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die PS-Präsentation durch apoptotische Kleinhirnneurone ebenfalls ein Signal zur Erkennung und Phagozytose dieser Zellen durch Mikrogliazellen darstellt.\nHierfür wurde der Phagozytoseassay in Gegenwart von 10 mM O-Phospho-L-Serin (OPS), der wasserlöslichen Kopfgruppe des Phosphatidylserins, durchgeführt. Abbildung 13: Der inhibitorische Effekt von O-Phospho-L-Serin auf die Mikroglia Phagozytose von apoptotischen Kleinhirnneuronen.\nDie Anzahl phagozytierender Mikrogliazellen wurde sechs Stunden nach Koinkubation der Mikroglia mit apoptotischen Neuronen ermittelt. Eine Inhibition der Phagozytose konnte mit 10 mM O-Phospho-L-Serin (OPS; n = 6) beobachtet werden. Die Werte sind auf die Kontrolle des jeweiligen Experiments normiert und als Mittelwerte der prozentualen Phagozytose der Mikroglia ± SEM dargestellt. Die Anzahl der phagozytierenden Mikroglia in der Kontrolle lag zwischen 8.5 und 50.8 %. p < 0,05 versus Kontrollwerte.\nDie Anzahl der Mikroglia, die apoptotische Neurone phagozytierten, wurde durch die Anwesenheit von OPS im Interaktionsmedium im Vergleich zu der Kontrolle ohne Inhibitoren im Interaktionsmedium signifikant verringert (60.0 ± 5.6 %; n = 6) (Abb.13). Dies weist darauf hin, daß es durch OPS zu einer Blockierung der PS-Rezeptoren kommt, wodurch ein Teil der apoptotischen Neurone nicht mehr von Mikrogliazellen erkannt werden konnte. 614.4.4 Vitalitätstest mit Neutralrot in Gegenwart der verwendeten inhibitorischen Substanzen Eine mögliche inhibitorische Wirkung der eingesetzten Substanzen auf die Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Mikrogliazellen könnte auf eine unspezifische toxische Wirkung der Substanzen auf Mikroglia beruhen. Aus diesem Grund wurde mit Hilfe eines Vitalitätstest mit Neutralrot (NR) untersucht, ob die eingesetzten Substanzen einen unspezifischen, toxischen Effekt auf Mikrogliazellen ausübten (siehe Methodenteil 3.8). NR wird durch die sogenannte fluid phase Endozytose von den Zellen aufgenommen (\nKonopski et al., 1995\n). Endozytose ist die vesikuläre Aufnahme von Flüssigkeit, Makromolekülen oder Partikeln in (endo) die Zelle (cyto). Tabelle 1: Neutralrot Test zur Bestimmung der Überlebensfähigkeit der Mikroglia in der Anwesenheit der löslichen Inhibitoren.\nKonzentrationen der phagozytotisch inhibitorischen Substanzen\n(Mittelwert in % der Kontrolle ± SEM)\n96.7 ± 2.5\n20 mM Fukose\n20 mM Mannose\n96.3 ± 2.4\n20 mM Galaktose\n100.6 ± 3.3\n20 mM N-Acetylglukosamin\n20 mM N-Acetylgalaktosamin\n10 mM O-Phospho-L-Serin\n20 mM O-Phospho-L-Serin\n10 mM Glukosamin\n20 mM Glukosamin\n77.2 (n = 1) ?\n10 mM Mannosamin\n61.4 ± 13.3 ?\n20 mM Mannosamin\n55.2 (n = 1) ?\n61.7 (n = 1)\nDie Endozytose von Neutralrot wird mit Ausnahme von Glukosamin und Mannosamin nicht durch die löslichen Inhibitoren beeinflußt. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte in % der Kontrolle ± SEM von fünf Experimenten ausgedrückt. In jedem einzelnen Experiment wurde jede Substanz in sechs parallelen Ansätzen getestet. Die Kontrollwerte entsprechen Mikrogliazellen, die unter gleichen Bedingungen ohne jegliche Testsubstanz inkubiert wurden. Mit 2 % Paraformaldehyd fixierte Zellen wurden als Negativkontrolle verwendet.\n62Die Konzentrationen der verwendeten Peptide, OPS und der meisten Monosaccharide wirkten nicht toxisch auf Mikrogliazellen (Tabelle 1). 20 mM Glukosamin, 10 mM und 20 mM Mannosamin, die in anderen Phagozytosemodellen einen inhibitorischen Effekt ausübten (\n), zeigten hingegen in diesem Modell eine toxische Wirkung.\n4.5 Charakterisierung der Phosphatidylserinbindung Aufgrund des starken inhibitorischen Effekts durch OPS auf die Aufnahme von apoptotischen Kleinhirnneurone durch Mikrogliazellen ist eine Erkennung von PS auf der Außenseite der Plasmamembran von apoptotischen Kleinhirnneuronen ein bedeutender Mechanismus, durch den diese apoptotischen Zellen durch Mikrogliazellen erkannt und phagozytiert werden. Daher wurden Versuche durchgeführt, die den Mechanismus der Phosphatidylserinbindung durch Mikrogliazellen näher charakterisieren sollten. Zu diesem Zweck wurden Lipidvesikel (large unilamellated vesicles (LUVs)), die unterschiedliche Konzentrationen (10 %; 1 % und 0,1 %) von PS (PS-LUVs) enthielten, als ein apoptotisches Zellmodell verwendet. Lipidvesikel, die nur aus Phosphatidylcholin (PC-LUVs) bestanden, dienten als Modell für normale, nicht apoptotische Zellen. Zur Detektion der PS- und PC-LUVs enthielten diese 1 mol% Rhodamin-konjugiertes Phosphatidylethanolamin.\n4.5.1 Spezifische Erkennung von Phosphatidylserin durch Mikroglia Die Natur des Phosphatidylserin Rezeptors, der zur Aufnahme von apoptotischen Zellen durch Phagozyten führt, ist noch ungeklärt (\n). Mögliche Kandidaten könnten Scavenger Rezeptoren oder der LPS-Rezeptor CD14 darstellen (\n). Beide Rezeptortypen werden von Mikrogliazellen exprimiert (\n; Paresce et al., 1996\n). Da einige Phagozyten PS exprimierende Zellen binden ohne sie zu phagozytieren, scheint die Phagozytose von PS exprimierenden Zellen durch Phagozyten noch von weiteren Faktoren abhängig zu sein (\n). Mit Hilfe der Lipidvesikel sollte untersucht werden, ob Mikrogliazellen Rezeptoren exprimieren, die spezifisch PS erkennen und ob diese Erkennung zu einer Phagozytose der Lipidvesikel führt. Zu diesem Zweck wurden Mikrogliazellen mit den jeweiligen Lipidvesikeln (PS-LUVs bzw. PC-LUVs) für eine Stunde inkubiert (siehe Methoden 3.9).\n63 Abbildung 14: Mikrogliazellen binden und phagozytieren Lipidvesikel, die Phosphatidylserin enthalten.\nA: Mikrogliazellen wurden mit Rhodamin markierten LUVs für 60 Minuten inkubiert. LUVs mit 10 mol% Phosphatidylserin wurden von Mikrogliazellen gebunden (rechte obere Abbildung). Kulturen inkubiert mit PC-Kontroll-Vesikeln (kein Phosphatidylserin) zeigen eine geringe unspezifische Bindung (linke obere Abbildung). In den unteren Abbildungen sind die entsprechenden Phasenkontrastbilder zu den oberen Fluoreszenzbildern dargestellt. Die Abbildungen zeigen einen repräsentativen Versuch aus fünf unabhängigen Versuchen.\nB: Konfokale Aufnahme einer Mikrogliazelle, die mit IL-B4-FITC (grün) angefärbt wurde. Die Rhodamin markierten PS-LUVs (rot) befinden sich im Cytoplasma der Mikroglia. 64\nPS-LUVs wurden von den Mikrogliazellen stark gebunden und, wie durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden konnte, auch phagozytiert (Abb.14). PC-LUVs wurden nur schwach von den Mikrogliazellen gebunden (Abb.14). Mikrogliazellen exprimieren daher einen Rezeptor, der PS binden kann. Damit konnte auch ausgeschlossen werden, daß das zur Fluoreszenzdetektion in den LUVs eingebaute Rhodamin konjugierte Phosphatidylethanolamin die Bindung der LUVs an die Mikrogliazelle beeinflußte. 4.5.2 Spezifische Erkennung von Phosphatidylserin durch Astrozyten\nNicht nur professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und Mikroglia sondern auch semiprofessionelle Phagozyten, wie Hepatozyten, sind in der Lage, apoptotische Zellen zu erkennen und zu phagozytieren (\n). Auch für Astrozyten wurde eine phagozytotische Aktivität beschrieben (\n). Aus diesem Grund wurde untersucht, ob Astrozyten oder Oligodendrozyten selektiv PS-LUVs erkennen. Hierzu wurden Gliamischkulturen, in denen sich neben Mikrogliazellen auch Astrozyten und Oligodendrozyten befanden, mit Lipidvesikeln inkubiert (siehe Methoden 3.9).\nEine deutlich stärkere Bindung der PS-LUVs, im Gegensatz zu den PC-LUVs, konnte ebenfalls bei kultivierten Astrozyten festgestellt werden (Abb.15). Dies deutet darauf hin, daß Astrozyten als semiprofessionelle Phagozyten in der Lage sind, apoptotische Zellen zu erkennen. Oligodendrozyten hingegen zeigten keine Bindung der PS-LUVs (Abb. 15)\n65 Abbildung 15: Bindung von PS-LUVs durch Astrozyten: Gliakulturen die sowohl Mikrogliazellen (mg), Astrozyten (as) als auch Oligodendrozyten (ol) enthielten, wurden mit Rhodamin markierten LUVs für 60 Minuten inkubiert. LUVs mit 10 mol% Phosphatidylserin wurden stark durch Mikrogliazellen gebunden (linke Abblidung). Astrozyten (as) wurden ebenfalls markiert, während Oligodendrozyten (ol) unmarkiert blieben. Kulturen inkubiert mit PC-LUVs zeigten eine schwache unspezifische Bindung (rechte Abbildung). Die unteren Abbildungen stellen die entsprechenden Phasenkontrastbilder zu den oberen Fluoreszenzbildern dar. Die Abbildungen zeigen einen repräsentativen Versuch aus zwei unabhängigen Versuchen. 4.5.3 Zeitabhängigkeit der Bindung von Phosphatidylserin-LUVs durch Mikrogliazellen\nApoptotische Zellen werden im Gewebe schnell durch Phagozyten erkannt (\n). Zur Untersuchung der Frage, wie schnell es zu einer Bindung von PS-LUVs durch den PS-Rezeptor der Mikrogliazelle kommt, wurden Mikrogliazellen unterschiedlich lange mit den Lipidvesikeln inkubiert (siehe Methodenteil 3.9). 66 Abbildung 16: Zeitabhängige Bindung der Phosphatidylserin-LUVs an Mikrogliazellen.\nMikrogliazellen wurden zeitabhängig mit Rhodamin markierten PS-LUVs, die 10 mol% PS enthielten, inkubiert. Bereits nach fünf Minuten Inkubationszeit der Mikrogliazellen mit PS-LUVs konnte eine Bindung der LUVs beobachtet werden. Nach einer 15 minütigen Inkubationszeit der Mikrogliazellen mit PS-LUVs konnte eine Fluoreszenz in den Vesikeln der Mikroglia beobachtet werden. Nach 30 und 60 Minuten war eine deutliche Akkumulation der Fluoreszenz in den Mikrogliazellen festzustellen. Die Abbildungen zeigen einen Versuch aus drei unabhängigen Versuchen.\nDie PS-LUVs wurden bereits nach fünf Minuten schwach von den Mikrogliazellen gebunden. Die Fluoreszenz war jedoch scheinbar hauptsächlich auf die Oberfläche der Mikrogliazelle beschränkt. Die Bindung der LUVs erfolgte daher sehr schnell. Bereits nach einer 15 minütigen Inkubationszeit befand sich die Fluoreszenz der LUVs auch im Zytoplasma der Mikrogliazelle, was auf eine Phagozytose der LUVs hindeutet (Abb.16). Innerhalb der nächsten 30-60 Minuten kam es zu einer weiteren Akkumulation von fluoreszierenden Partikeln im Zytoplasma. 4.5.4 Konzentrationsabhängige Bindung der Phosphatidylserin-LUVs an die Mikroglia\nDa Lipidmoleküle spontan zwischen der inneren und der äußeren Seite der Plasmamembran wechseln können (flip-flop), kommen geringe Konzentrationen von PS wahrscheinlich auch unter normalen, nicht apoptotischen Bedingungen auf der extrazellulären Seite der Zytoplasmamembran vor (\nvan Meer et al., 1981\n; Roelofsen und Op den Kamp, 1994\n). Die Erkennung von Phosphatidylserin sollte daher von der Konzentration des exponierten Phosphatidylserins abhängig sein. Um diese mögliche untere Schwellenkonzentration von Phosphatidylserin in Membranen zu bestimmen, die für eine spezifische Erkennung durch Mikroglia notwendig ist, wurden Lipidvesikel mit unterschiedlichen Konzentrationen von PS (10, 1 oder 0,1 mol% PS) mit Mikrogliazellen inkubiert (siehe Methodenteil 3.9). Zwischen PS-LUVs die 1 mol% und 10 mol% Phosphatidylserin enthielten, konnte kein Unterschied in der Fluoreszenz festgestellt werden (Abb.17). Vesikel mit 0.1 mol% PS 68hingegen konnten nur schwach detektiert werden, das heißt die PS-LUVs wurden von der Mikrogliazelle gering gebunden. Diese Mikroglia assoziierte Fluoreszenz entsprach der Kontrolle (PC-LUVs) (Abb.17). Eine spezifische Erkennung und Bindung von Phosphatidylserin durch Mikrogliazellen dürfte daher bei etwa 1 mol% Phosphatidylserin liegen. Dies korrespondiert mit Beobachtungen an seneszenten Erythrozyten, deren PS-Konzentration auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran bei 0,6 mol% liegt (\n69 Abbildung 17: Konzentrationsabhängigkeit der Phosphatidylserinbindung.\nMikrogliakulturen wurden mit Rhodamin markierten LUVs, die unterschiedliche Konzentrationen von Phosphatidylserin enthielten, für 60 Minuten inkubiert. Auf der linken Seite sind die Fluoreszenzaufnahmen dargestellt, auf der rechten Seite die entsprechenden Phasenkontrastaufnahmen. Eine Inkubation der Mikroglia mit 10 mol% PS-LUVs oder 1 mol% PS-LUVs führte zu einer spezifischen Färbung der Mikrogliazellen, während eine Inkubation der Mikroglia mit 0.1 mol% PS-LUVs nicht von einer Inkubation mit den Kontroll-Vesikeln (PC-LUVs) zu unterscheiden war. Die Abbildungsserie zeigt einen repräsentativen Versuch aus drei unabhängigen Versuchen.\n704.5.5 Die Bindung der Phosphatidylserin-LUVs ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikroglia\nDer bevorzugte Bindungsmechanismus zwischen apoptotischen Zellen und Makrophagen hängt auch vom Aktivierungszustand der Makrophagenzelle ab (\n). Mikrogliazellen kommen im Gewebe in unterschiedlichen Aktivierungszuständen, die auch mit morphologischen Veränderung der Mikrogliazellen verbunden sind, vor (siehe Einleitung 1.3). Durch den Prozess der Kultivierung werden Mikrogliazellen aktiviert und liegen als amöboide Zellen vor. Durch die Behandlung mit astrozytenkonditioniertem Medium bilden kultivierte Mikrogliazellen der Maus eine ramifizierte Morphologie aus (\n). Eine Behandlung der kultivierten Mikrogliazellen mit Lipopolysaccharid (LPS) führt zu einer verstärkten Aktivierung dieser Zellen, was mit einer Zunahme der phagozytotischen Aktivität verbunden ist (\nabd-el Basset und Fedoroff, 1995\n). In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob Mikrogliazellen unabhängig vom Aktivierungszustand einen PS-Rezeptor exprimieren. Diese Versuche wurden mit Mikrogliazellen aus der Maus durchgeführt, da eine ramifizierte Morphologie der Mikrogliazellen in Kultur mit Hilfe von astrozytenkonditioniertem Medium nur im Maussystem erreicht werden kann. Zunächst wurde bestätigt, daß PS-LUVs deutlich stärker als PC-LUVs auch von Mikrogliazellen der Maus gebunden wurden (nicht dargestellt). Dann wurden unbehandelte Mikrogliazellen der Maus, LPS behandelte Mikrogliazellen (100 ng/ml LPS für 24 Stunden) und Mikrogliazellen die mit astrozytenkonditioniertem Medium kultiviert wurden, für eine Stunde mit PS-LUVs inkubiert. 71 Abbildung 18: Die Bindung der PS-LUVs ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikrogliazellen.\nMikrogliazellen wurden für eine Stunde mit PS-LUVs inkubiert. Ramifizierte Mikrogliazellen wurden mit astrozytenkonditioniertem Medium kultiviert. Aktivierte Mikrogliazellen wurden für 24 Stunden mit 100 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert. Eine Bindung/Aufnahme von PS-LUVs konnte in allen unterschiedlich Kultursystemen beobachtet werden.\nEine Bindung der PS-LUVs konnte in allen Kultivierungsansätzen festgestellt werden (Abb.18). Die Rezeptoren für Phosphatidylserin sind also in jedem Aktivierungszustand der Mikrogliazelle in Kultur vorhanden.\n4.6 Die Bindung und Phagozytose von Phosphatidylserin-LUVs ist nicht mit einer Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen durch Mikrogliazellen verbunden\nDa es im Verlauf der Phagozytose von apoptotischen Zellen nicht zu einer Aktivierung der Phagozyten kommt, wird ein apoptotischer Zelltod nicht von einem inflammatorischen Prozess begleitet (\n). In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Mikrogliazellen ebenfalls durch eine ausbleibende Aktivierung der Mikroglia gekennzeichnet ist. Als Modellsystem für apoptotische Zellen wurden PS-LUVs verwendet. Als Aktivierungsmarker wurde die Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen, wie TNF-, IL-6 und IL-12 und 72Chemokinen, wie KC und MIP-1 durch die Mikrogliazellen untersucht. Diese Untersuchungen wurden an Mikrogliazellen der Maus durchgeführt, da entsprechende ELISAs im Labor der Arbeitsgruppe von Prof. Kettenmann etabliert waren und die entsprechenden Zytokin-Tests für das Rattensystem nicht alle kommerziell erhältlich waren. Mikrogliazellen wurden über Nacht mit den Lipidvesikeln inkubiert und anschließend der Überstand auf die oben genannten Zytokine oder Chemokine hin untersucht (siehe Methodenteil 3.10). Als Positivkontrolle dienten Überstände von Mikrogliazellen, die mit 100 ng/ml LPS behandelt wurden. Abbildung 19: Eine Inkubation der Mikrogliazellen mit Lipidvesikeln führt nicht zu einer Stimulation der Zytokin/Chemokin- Sekretion\nDer Gehalt von Zytokinen und Chemokinen im Überstand von Mikrogliazellen, die über Nacht mit LPS, PC-LUVs oder PS-LUVs inkubiert wurden, konten mit Hilfe spezifischer ELISAs ermittelt werden. Für TNF-, IL-12 und KC wurden 20 Werte in zwei unabhängigen Versuchen ermittelt. Für IL-12 und MIP-1 wurden 12 Werte ermittelt. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ± SEM ausgedrückt als % der Zytokin bzw. Chemokin Ausschüttung durch Mikroglia nach einer LPS-Behandlung. 73Weder die Inkubation der Mikrogliazellen mit PS-LUVs, noch die Inkubation mit PC-LUVs führte zu einer erhöhten Zytokin- oder Chemokin Sekretion im Vergleich zu unbehandelten Mikrogliazellen (Abb.19). LPS hingegen führte eindeutig zu einer Freisetzung aller untersuchten Faktoren. Eine Erkennung von Phosphatidylserin durch Mikrogliazellen führt daher nicht zu einer Aktivierung dieser Zellen im Sinne einer erhöhten sekretorischen Aktivität. 4.7 Induktion einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration in Mikrogliazellen durch Phosphatidylserin-LUVs\nDie Interaktion zwischen dendritischen Zellen und apoptotischen Zellen induziert eine Erhöhung des intrazellulären Kalziums, ein Prozess, an dem der Vitronektin Rezeptor beteiligt ist (\n). Mit Hilfe von Kalziumchelatoren konnte gezeigt werden, daß dieses Kalziumsignal für die Phagozytose der apoptotischen Zellen durch dendritischen Zellen notwendig ist, während Makrophagen keine Mobilisierung des intrazellulären Kalziums benötigen (\n). In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Interaktion zwischen apoptotischen Zellen und Mikrogliazellen ebenfalls mit einem Kalziumsignal verbunden ist. Als apoptotisches Modellsystem wurden PS enthaltende Lipidvesikel verwendet. Die Lipidvesikel wurden in einer Konzentration von 100 µM lokal in der Nähe von Mikrogliazellen mit einer Glasmikropipette appliziert und der Verlauf der intrazellulären Kalziumkonzentration beobachtet (siehe Methodenteil 3.11). Eine Erhöhung des Verhältnisses der Fluoreszenz von 340 nm zu 380 nm um 2/3 des Ausgangswertes wurde als Kalziumsignal gewertet. Die Lipidvesikel wurden an zwei, zu unterschiedlichen Zeitpunkten präparierten Mikrogliazellkulturen mit jeweils mindestens 60 Zellen getestet. 74 Abbildung 20: Die Bindung von PS-LUVs induziert Kalziumsignale in Mikrogliazellen.\nDie Abbildung zeigt zwei typische, durch Applikation von 100 µM PS-LUVs ausgelöste, intrazelluläre Kalziumsignale. Die Kalziumsignale zeigen einen schnellen Anstieg, der wieder auf den Ruhewert absinkt. Rechts ist die Reaktion einer Mikrogliazelle mit zwei peakförmigen Antworten dargestellt, die Zelle links zeigt nach einer pekförmigen Antwort noch eine Plateauphase.\nExemplarisch sind zwei durch die Applikation von PS-LUVs (5 µl) ausgelösten Kalziumsignale in Abbildung 20 dargestellt. Der Verlauf des intrazellulären Kalziumsignals zeigt in der Regel zunächst einen schnellen Anstieg bis zu einem Maximalwert und sinkt dann, nach einer kurzen Plateauphase, schnell wieder auf den Ruhewert ab (Abb.20). In einigen Mikrogliazellen konnten auch mehrere Antworten beobachtet werden (Abb.20).\nEine Applikation von PS-LUVs führte, im Gegensatz zu einer Applikation von PC-LUVs (9,7 % ± 6,9 %) in 66,5 % ± 20,0 % der Mikrogliazellen zur Induktion eines Kalziumsignals (Abb.21). Um Applikations-Artefakte auszuschließen, wurde HEPES-Puffer appliziert. Dies führte nur in wenigen Zellen zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration (8,5 ± 9,0 %). Dieser durch HEPES-Puffer ausgelöste Prozentsatz von Mikrogliazellen mit einem Kalziumsignal lag in dem Bereich, in dem auch Mikroglia mit spontanen Kalziumsignalen beobachtet wurden (23,7 % ± 21,7 %). Eine Bindung von PS durch Mikroglia führt daher, wie bei der Aufnahme apoptotischer Zellen durch dendritische Zellen, zu einem intrazellulären Kalziumsignal in der Mikrogliazelle. Die Applikationsmethode selbst führte nicht zur Auslösung von Kalziumsignalen in Mikrogliazellen.\nEine Applikation von PS-LUVs führte in den Mikrogliazellen im Gegensatz zu einer Applikation von PC-LUVs oder HEPES-Puffer zu einem Anstieg der intzrazellulären Kalziumkonzentration. Die Ergebnisse sind Mittelwerte der Kalziumantworten in den Mikrogliazellen in Prozent ± SD.


Savage Gear High Rider 170 BELLY BOAT - Test\nLIMITIERTES Savage Gear B-SG High Rider BELLY BOAT!\nBelly Boote sind eine praktische Sache, es kann sowohl der Uferbereich aber auch fern ab von diesem gefischt werden. Wenn nun Savage Gear eine limitierte Version auf dem Markt schmeißt, dann erwartet der Angler in erster Linie Qualität, Stabilität und ein schlicht & einfaches praktisches Gefährt! Ob das Savage Gear B-SG High Rider BELLY BOAT aber genau diese Anforderungen erfüllt,wird sich zeigen.\nDa wir Savage Gear Köder auch in unseren Boxen versenden, hat uns die Info zu einem neuen Produkt in der Savage Gear Range als erstes erreicht und natürlich besonders interessiert. Wir beleuchten vorab die trockenen Eckdaten der beiden Varianten, denn SG bietet ein 170er & ein 150er Modell an:\nSavage Gear High Rider Belly Boat 170 – the Flagship\n+ 14kg netto Gewicht\n+ 170cm Gesamtlänge\n+ maximale Beladung (inkl. Dir) 180kg\n+ 0,9mm starkes PVC\nSavage Gear High Rider Belly Boat 150 – the Sniper\n+ 12kg netto Gewicht\n+ 150cm Gesamtlänge\n+ maximale Beladung (inkl. Dir) 145kg\nBei einem Durchschnittsgewicht des Anglers von ca. 85kg, bleiben also 60kg Zuladung bei de r150er Variante und sage & schreibe 95kg bei der 170er Variante des Savage Gear High Rider Belly Boots. Aus der Erfahrung heraus liegen die meisten günstigen Belly Boat Modelle bei +- 110kg Gesamtbeladung, hier kann SG also deutlich punkten!\nAusladen, aufpumpen oder gar aufgepumt transportieren ist mit dem Savage Gear Belly Boat schlichtweg kein Problem. Mit 14kg liegt die 170er Variante des High Rider deutlich unter jedem Schlauchboot. Was uns sofort auffällt, das Belly macht einen sehr durchdachten Eindruck.\nZum einen befinden sich links und rechts neben dem Fahrer zwei Taschen, in denen sich zum Beispiel TackleBoxen und Köder aufbewahren lassen. Hinter dem klappbaren Sitz ist zudem Platz für eine ganze Tasche, hier macht die hohe Zuladungsgewichtskapazität deutlich Sinn.\nWirklich sehr genial sind die beiden Ruder, die es bei der 170er Variante gibt. Der Steuermann ist unabhängig von den Flossen und kann so auch längere Strecken relativ ermüdungsfrei zurücklegen. Alleine aus diesem Grund würden wir auf das 170er Modell zurückgreifen.\nGenial, jedoch nicht ganz neu, ist das Netz, welches sich direkt vor einem befindet. Auf diesem feinmaschigen gummierten Netz lassen sich hervorragend Köder ablegen oder gefangene Fische abhaken und vermessen. Äußerst genial sind auch die beiden Rutenhalter auf der Rückseite des Sitzes.\nIst das Savage Gear High Rider Belly Boat bedenkenlos zu empfehlen?\nMit 399€ für die 150er Variante und 449€ für die 170er Variante bewegen sich diese Bellys sicher im höherpreisigen Bereich, vergleichbar mit einem Guideline oder Outcast Belly Boot. Ohne hier die Werbetrommel rühren zu wollen, aus unserer Erfahrung legt Savage Gear großen Wert auf ausgereifte Produkte. Das High Rider Belly ist definitv ausgereift, wir sprechen eine bedenkenlose Kaufempfehlung aus.\nWir würden euch jedoch empfehlen, immer einen guten Ansprechpartner vor Ort zu haben! Ein Fachhändler berät euch individuell und organisiert passende Schläuche oder Ersatzteile schnell. Hier lohnt sich der Kauf im Angelladen und weniger eine Online-Orderung.\nOptisch ist das SG Belly auf jeden Fall ein Hingucker und auf Praktikabilität & Qualität wurde großen Wert gelegt.


Angelina und Brad: So sieht wahre Liebe aus • WOMAN.AT\nAngelina und Brad: So sieht wahre Liebe aus\nSie sind das Hollywood-Paar, dass die meisten Augen auf sich zieht. Bei der "Cinema For Peace"-Gala zeigten Brad Pitt und Angelina Jolie, wie verliebt sie ineinander sind.\nvon Red am 14.02.2012, 8:54\nSuperstar Angelina Jolie wurde bei der Wohltätigkeitsgala "Cinema for Peace" gleich doppelt für ihr friedenspolitisches Engagement geehrt. Die 36-Jährige erhielt einerseits für ihr Regiedebüt «In the Land of Blood and Honey» den Preis für den wichtigsten Film des Jahres. Zusammen mit ihrem Team bekam sie zudem den Ehrenpreis im Kampf gegen Krieg und Völkermord.\nMit Tränen in den Augen nahm die schöne Schauspielerin vor den rund 600 Gästen im Konzerthaus am Gendarmenmarkt die gläserne Preisfigur aus den Händen von Friedensnobelpreisträger Mohammed el-Baradei entgegen. «Ich habe diesen Film gemacht, weil ich hoffe, dass mehr Menschen aufstehen und versuchen, die Dinge zu ändern», sagte Jolie.\nBrad ist stolz auf seine Angelina. Mega-Star Jolie war in einem schlichten, hochgeschlossenen Kleid von Ralph & Russo gemeinsam mit dem Lebensgefährten Brad Pitt am Roten Teppich von hunderten durchgefrorenen Fans mit «Kreischalarm» empfangen worden. «Ich bin sehr aufgeregt», gestand Pitt vor der Saaltür. «Es ist ein sehr wichtiger Film. Ich freue mich, dass sie ihn gemacht hat.» Wie stolz er tatsächlich ist, zeigte der Schauspieler, als die Ehrung für Angelina Jolie verkündet wurde. Zärtlich blickte er in ihre Augen, drückte sanft ihren Arm. Später sagte Pitt: «Wir haben sechs Kinder, bei uns ist immer etwas los. Trotzdem verfolgt Angelina ihre Karriere  sie ist eine wundervolle, beeindruckende Frau.»


VOTO-Studie zu den eidgenössischen Volksabstimmungen vom 27. September 2020 - DeFacto1\nBei der Abstimmung über die Begrenzungsinitiative stand die SVP alleine auf weiter Flur. Es gelang ihr nicht, ausserhalb der eigenen Anhängerschaft Mehrheiten zu gewinnen. Die Kosten von 6 Mia. CHF und Zweifel an der Notwendigkeit einer hoch gerüsteten Luftwaffe machten das Rennen um die Beschaffung der Kampfjets spannend. Dies zeigt die Analyse der Befragung von 1’513 Stimmberechtigten im Rahmen der VOTO-Studie zur eidgenössischen Volksabstimmung vom 27. September 2020. Die Studie wurde vom Zentrum für Demokratie Aarau, von FORS und dem Befragungsinstitut LINK durchgeführt und von der Bundeskanzlei finanziert.\nAn der Abstimmung vom 27. September 2020 hatte das Schweizer Stimmvolk über fünf Vorlagen zu befinden: Die Volksinitiative «Für eine massvolle Zuwanderung», die Änderung des Jagdgesetzes, die Änderung des Bundesgesetzes über die direkte Bundessteuer, die Änderung des Erwerbsersatzgesetzes und die Beschaffung neuer Kampfflugzeuge. Die Volksinitiative wurde abgelehnt ebenso wie das Jagdgesetz und die Erhöhung der steuerlichen Kinderabzüge. Die Beschaffung der Kampfflugzeuge und der zweiwöchige Vaterschaftsurlaub wurden indessen gutgeheissen.\nDie Begrenzungsinitiative scheiterte im Wesentlichen daran, dass es der SVP kaum gelang, ausserhalb der eigenen Anhängerschaft Stimmen zu gewinnen. Die Sympathisierenden der SP, Grünen und GLP verwarfen das Begehren mit Nein-Stimmenanteilen von über 85 Prozent wuchtig. Auch bei den Gefolgschaften der CVP und FDP verpasste das Begehren eine Mehrheit deutlich (33% bzw. 28% Zustimmung). Die Parteiungebundenen brachten der Vorlage zwar mehr Sympathien entgegen, waren aber unentschlossen (52% Nein).\nAbgelehnt wurde die Initiative vor allem, weil es in den Augen der Nein-Stimmenden die bilateralen Beziehungen zur EU gefährdete. Zudem befürchteten viele Nein-Stimmenden einen gravierenden wirtschaftlichen Schaden, sollte das Personenfreizügigkeitsabkommen gekündigt werden. Diese beiden Motive gaben vor allem bei den bürgerlichen Anhängerschaften den Ausschlag, die sich zwar prinzipiell eine eigenständige Zuwanderungssteuerung wünschen, aber nicht um den Preis eines Bruchs mit der Europäischen Union.\nAusschlaggebend für den Entscheid zum Jagdgesetz war zunächst der Umstand, ob man in einer Region lebt, wo der Wolf heimisch ist. Überraschenderweise spielte auch die politische Haltung eine wichtige Rolle für den Entscheid: Linksaussen betrug der Nein-Stimmenanteil zum Jagdgesetz 93 Prozent, während die Revision im rechten Lager mit Ja-Stimmenanteilen von deutlich über 60 Prozent gutgeheissen wurde.\nDie politische Haltung war in den Alpenkantonen, wo die Wolfsrudel auch beheimatet sind, nur von sekundärer Bedeutung, spielte aber eine umso stärkere Rolle in den urbanen Zentren. In Bezug auf die Entscheidungsmotive spielten Emotionen eine bedeutsame Rolle. Dabei führten die Nein-Stimmenden das Existenzrecht des Wolfes ins Feld, während auf der befürwortenden Seite auf die Gefahr hingewiesen wurde, die nicht nur für Mensch, sondern auch für andere Tiere vom Wolf ausging. Die Ja-Stimmenden sahen in der Ablehnung des Jagdgesetzes überdies eine Bevormundung der alpinen Bergregionen durch die bevölkerungsstarken Mittellandskantone. Ausschlaggebend für das knappe Nein war indessen das Argument, wonach neu auch Tiere hätten getötet werden dürfen, die bisher noch keinen Schaden angerichtet haben. Das ging nicht bloss den Nein-Stimmenden zu weit, auch einer grossen Minderheit der Ja-Stimmenden behagte dies nicht.\nDie Änderung des Bundesgesetzes über die direkte Bundessteuer scheiterte daran, dass es von weiten Teilen der Stimmenden als Steuergeschenk für Vermögende betrachtet wurde. Kein anderes Nein-Motiv wurde auch nur annähernd so häufig genannt wie jenes, dass die Kinderabzüge nur den Reichen nützen würden. Auch deshalb vermochte die Revision bei keiner der sechs grossen Parteianhängerschaften eine Mehrheit zu erzielen. Im linken Lager war die Vorlage chancenlos, aber auch die Anhängerschaften der bürgerlichen Parteien, die sich für die Vorlage ausgesprochen hatten, konnten sich für die Steuerabzüge nicht mehrheitlich erwärmen.\nIm linken Lager war der Vaterschaftsurlaub unumstritten. Etwa neun von zehn Stimmenden, die sich dem linken Lager zugehörig fühlen, unterstützten die Einführung einer zweiwöchigen «Papizeit». Dazu passt auch, dass nicht wenige von ihnen bei der Begründung ihres Votums auf eine inhaltliche Rechtfertigung verzichteten und stattdessen antworteten, die Einführung eines Vaterschaftsurlaubs sei schlicht überfällig gewesen. Die Anhängerschaften von CVP und FDP waren ihrerseits gespalten: Rund die Hälfte der FDP- und etwas mehr als 50 Prozent der CVP-Sympathisierenden nahmen den Vaterschaftsurlaub an. Die parteiungebundenen Stimmenden sprachen sich ebenfalls in ihrer Mehrheit für die Vorlage aus. Einzig bei den SVP-Sympathisierenden hatte der Vaterschaftsurlaub einen schweren Stand: 78 Prozent von ihnen verwarfen ihn.\nBemerkenswert ist zudem der Umstand, dass junge Frauen die Vorlage gar noch deutlicher annahmen als junge Männer. Aus den Motivnennungen geht indessen auch hervor, dass mit der Einführung des Vaterschaftsurlaubs nicht bloss gleiche Rechte, sondern oft auch gleiche Pflichten von Frau und Mann verknüpft wurden.\nDie Beschaffung von Kampfjets nahmen Männer, ältere Stimmende und bildungsferne Schichten mehrheitlich an, während sie Frauen, jüngere Stimmende und bildungsnahe Schichten mehrheitlich verwarfen. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen waren aber meist gering: so nahmen Männer den Planungsbeschluss mit einer knappen Mehrheit von 55 Prozent an. Wie schon bei früheren Armeevorlagen zog sich ein tiefer Graben zwischen links und rechts: Links wurde die Beschaffung der Kampfjets wuchtig abgelehnt, rechts hingegen deutlich angenommen. Stimmende, die sich der politischen Mitte zuordnen, hiessen die Vorlage mit 60 Prozent Ja-Stimmenanteil gut.\nEine grosse Zahl der Ja-Stimmenden steht grundsätzlich hinter der Armee oder hält sie zwecks Wahrung von Sicherheit, Neutralität und Unabhängigkeit für unverzichtbar. 7 Prozent überzeugte indessen der Umstand, dass die 6 Mia. CHF aus dem ordentlichen Armeebudget stammen. Das Motiv wurde vergleichsweise oft von GLP-Sympathisierenden vorgebracht, was angesichts des knappen Ergebnisses von Bedeutung für den Abstimmungsausgang war. Ausserdem begründeten rund fünf Prozent der Ja- Stimmenden ihren Entscheid primär mit der Empfehlung des Bundesrats und anderen Akteuren, wobei VBS-Vorsteherin Viola Amherd im Vordergrund stand.\nFür eine beträchtliche Zahl der Nein-Stimmenden war das vorgelegte Rüstungsprojekt zu teuer. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, dass die Pandemiesituation im Kanton Tessin von 13 Prozent der Nein-Stimmenden als Hauptgrund für ihr Nein-Votum genannt wurde. Wenn es also einen «COVID 19-Effekt» gab, dann am ehesten im Kanton Tessin, wo die Kampfjetvorlage knapp abgelehnt wurde. Sodann zweifelten viele Nein-Stimmende an der Notwendigkeit einer hochgerüsteten Luftwaffe, sei es, weil die Gefahrenlage sich in den letzten Jahrzehnten grundlegend geändert habe oder sei es, weil sie einem kleinen Land wie der Schweiz nicht angepasst sei. Die Analyse der Hauptargumente zeigt, dass es sich bei dieser Vorlage vornehmlich um eine Abstimmung für oder gegen die Armee handelte.\nAm eidgenössischen Urnengang vom 27. September 2020 nahmen die Stimmberechtigten aus dem links- grünen Lager, jene mit hoher Bildung und hohem Einkommen sowie jene aus den urbanen Zentren in erhöhtem Masse teil.Die starke Mobilisierung dieser Bevölkerungssegmente wirkte sich auf die Abstimmungsergebnisse aus.\nHinweis zur Zitierweise: Thomas Milic, Alessandro Feller und Daniel Kübler (2020). VOTO-Studie zur eidgenössischen Volksabstimmung vom 27. September 2020. ZDA, FORS, LINK: Aarau/Lausanne/Luzern.\nFragen zum Inhalt der Studie: Dr. Thomas Milic, 079 600 82 36, thomas.milic@zda.uzh.ch\nFür diese Studie wurden zufällig ausgewählte Stimmberechtigte per Telefoninterview befragt. Die Frageformulierungen, die Erhebungen sowie die Datenanalyse liegen in der alleinigen Verantwortung von VOTO. Alle Berichte, die Fragebogen sowie die Rohdaten mit Zusatzinformationen zur Erhebung sind für wissenschaftliche Zwecke frei zugänglich unter www.voto.swiss bzw. durch das FORS Datenarchiv forsbase.unil.ch.


Unitymedia und Vodafone: Zum IT-Training in den Escape-Room - cio.de\nZum IT-Training in den Escape-Room\nVodafone schluckt gerade den Kabelnetzbetreiber Unitymedia. Etwas leichter verdaulich wird die 18-Milliarden-Akquise durch die vielen IT-affinen Mitarbeiter, die Unitymedia CIO Ulrich Irnich im "Escape Room" schulen lässt. Und durch einen neuen API-Hub.\n"True Dungeon" mag das erste Escape Game gewesen sein. Aber der echte, wirkliche Kerker versteckt sich in Köln, Aachener Straße 748. Getarnt als Zentrale der UnitymediaUnitymedia scheint das Gebäude erst einmal harmlos. Aber hier sitzt die IT, im zweiten Untergeschoss, hinter der Sprinklerzentrale. Das Tageslicht hat den Besucher längst verlassen, als die Brandschutztür aufknarzt. Dahinter räkelt sich ein ITler hinter zwei 24-Zoll-Monitoren und grinst genüsslich, während sich seine vier Gefangenen im Escape Room abarbeiten. Hier wird IT geschult. Top-500-Firmenprofil für Unitymedia\nIm 2. Untergeschoss von Unitymedia, kurz hinter der Sprinkeranlage …\nCIO Ulrich Irnich hat den Gefangenen folgende Geschichte erzählen lassen: Ein HackerHacker ist hinter die Sprinkleranlage gekrochen. Er hat sich des Systems "Cable Master" bemächtigt. Cable Master ist die CRM-Lösung, die Unitymedia im Umgang mit seinen rund 7,2 Millionen Endkunden einsetzt. Das Ding war mal eine Standardlösung von Netcracker, ist aber über die Jahre so erfolgreich verbogen worden, dass nur noch wenige Mitarbeiter den Code wirklich kennen. Und ein Hacker, der einen Trojaner eingepflanzt hat. Die Aufgabe an die vier Gefangenen im Escape Room lautet: Kommt hier in 60 Minuten raus, um den Trojaner zu stoppen. "Machen sie gar nicht so schlecht", meint der ITler hinterm Monitor. Alles zu Hacker auf CIO.de\n… hat das Tageslicht den Besucher längst verlassen. Da leuchtet ein Lösungsweg auf.\nFiktive Aufgabe, realer Lerneffekt\nDie Aufgabe ist fiktiv, der Lerneffekt real: Ganz nebenbei begreift jeder Teilnehmer, dass er in punkto IT-Sicherheit mitdenken muss. Und die Gruppe wächst zusammen. Seit April schicken Fachbereiche Teams von vier bis sechs Personen in den Raum. An drei Tagen der Woche dürfen drei der insgesamt 170 IT-Mitarbeiter sich dann von ihren eigentlichen Aufgaben fernhalten, um ins zweite UG hinabzusteigen. Sie gehören zu dem Team, das sich das Escape Game im Rahmen der Unitymedia-HR-Maßnahme "Tell Your Story" ausgedacht haben.\n"Ich hatte ihnen dann 3000 Euro gegeben, damit sie den Raum bauen können", erzählt Irnich. Die Kollegen sind mit eigenen Akkuschraubern angetreten, um unter anderem ein Regal im Raum zu fixieren, dem eine Schlüsselrolle im Spiel zukommt. Mehr wird nicht verraten. Wer einmal aus dem Escape Room herausgekommen ist, darf auch nichts vom Lösungsweg weiterplappern. Nur so viel: "Der ist schon anspruchsvoll", sagt Irnich: "Meine Erwartungen wurden weit übertroffen."\nNicht ganz so günstig, aber ähnlich erfolgreich ist ein Projekt, dass 15 ITler Anfang des Sommers realisiert haben: In nur sechs Wochen haben sie eine Testumgebung gebaut und 150 APIs (Application Programming Interfaces) neu gestrickt. Auf der Shortlist für den API-Hub standen Apigee (2016 von Google gekauft) und Mulesoft (2018 von Salesforce gekauft).\nSchock or SOC?: Warum Sie sich ein Security Operations Center leisten sollten\nIT-Sicherheit in Deutschland: Transparenz erster Schritt für mehr IT Security\nPraxiswissen wichtiger als formaler Abschluss: Was IT-Security-Experten können müssen\nAPI-Hub erleichtert IT-Anbindung\nThemen: CRM und Hacker\nTop500-Firmenprofile: Unitymedia und Vodafone


Das Offroad Forum: Der Langenaltheim Bilder und Video Thread\nVerfasst am: 23.06.2019 11:58:53 Titel:\nWollt ihr nicht mal einen Bewerb mitfahren? Mit eurer Streckenkenntnis von LAH dürftet ihr doch echt gut bei der Steinbeißer dabeisein.\nVerfasst am: 23.06.2019 22:14:38 Titel:\nBeide ZJ's haben natürlich einen massiven Bügel drin. Sollte selbstverständlich sein\nEine Steinbeisser halten die ZJ's nicht durch.\nDieses Jahr werden wir aber das OldMansRace in LAH mit fahren.\nIm Oktober wird das XJ Projekt fertig. Das steht gerade bei dem Bader in Passau...LS Motor, Unimogachsen etc.\nDer wird im September fertig. Dann folgt nächstes Jahr die Steibeisser\nVerfasst am: 08.07.2019 16:00:49 Titel:\nDenn nach den ganzen Videos der schier unaufhaltsamen Monstern kommen wir mit unseren 0815-Karren\nAber das Ziel ist ungefähr das gleiche - wir haben einfach nur Spaß dabei *g* [/video]\nUnd so manches Mal bin ich eigentlich verwundert, was so Fahrzeuge im Serien-Trimm alles aushalten und schaffen.\nAlso hau ich auch mal einen Langenaltheim-Link hier rein:\nVielleicht hat ja einer Spaß beim anschauen, der es noch nicht kennt!\nwarum? - weil´s Spaß macht!\nVerfasst am: 08.07.2019 17:08:05 Titel:\nIst es nicht ein bisschen leichtsinnig, ohne Sicherheitsgurt im Offroad Park unterwegs zu sein?\nIhr stellt Videos ins Netz, in dem ihr ohne unterwegs seid. Das nenne ich lebensgefährlich!!\nIhr könnt mir glauben, ich war schon des öfteren in LAH und anderen Offroad Parks, aber so nicht.\nIch finde, die Sicherheit hat immer Vorrang.\nVerfasst am: 08.07.2019 22:38:48 Titel:\n...wie auch die Auflagen der Gaynehmigungsbehörde und des Betreibers einzuhalten und Trialgeschwindigkeit zu fahren!\nIst ein gefundenes Fressen für den an Morbus Thunberg leidenden Teil unserer Bevölkerung, der leider unaufhörlich anwächst...\nDas ist der Teil, der mich und andere dann halt auch irgendwie betrifft...\nVerfasst am: 11.07.2019 12:28:47 Titel:\nKlar hat Sicherheit Vorrang, aber ich halte uns da jetzt nicht gerade für lebensmüde.. Und trotzdem fahren wir zeitweise unangeschnallt, weil man sonst kaum was sehen kann. Das Risiko ist aber wohl überschaubar (was soll passieren, wenn ich durch eine Matschpfütze fahre?) und wenn´s tatsächlich an kritische Stellen geht, dann schnallen wir uns auch an. Sieht man aber übrigens auch mal im Video.\nWie dem auch sei, ich denke letztendlich muss das jeder für sich entscheiden\nVerfasst am: 11.07.2019 19:06:49 Titel:\n4x4buddies hat folgendes geschrieben:\nDas erklärt alles,\nVerfasst am: 12.07.2019 16:12:10 Titel:\nstimmt, denn derjenige muss dann ja auch nicht damit klarkommen, wenn im schlimmsten Fall, beispielsweise Helfer traumatische Erinnerungen davon tragen, weil ein ziemlich zermatschter Verletzter von ihnen geborgen werden musste\nwas gar nicht geht, ist durch leichtsinnige Spielerreien Dritte zu gefährden, wie die junge Dame mit der Kamera bei ca. 6:30.\nMan sollte schon darauf achten (bzw. man HAT sicherzustellen!), dass sich keine Personen im potentiellen Abrollbereich des Fahrzeugs aufhalten\nVerfasst am: 12.07.2019 21:21:02 Titel:\nVerfasst am: 13.07.2019 05:50:10 Titel:\nviele Quad Fahrer sind dort wesentlich schmerzbefreiter. Sieht wohl cool aus wenn sie im T-shirt rummdriften und anschließend über die Hänge purzeln.\nHab dort mal erste Hilfe geleistet, als einer vor mir vom eigenen Quad überrollt wurde. Hat ganz schön gedauert bis der Sani dort war und der im Krkw war.\nDie Schnittwunden von den Steinplatten dort sind nicht ohne.\nVerfasst am: 13.07.2019 10:07:44 Titel:\n*hehe* Geld für einen geschlossenen Autoanhänger, aber keine Sperren.\nSo setzt jeder eben seine Prioritäten.\nBtw, Verschränkung nützt im Schlamm leider gar nichts (Seitenhieb auf die LR-Fraktion)\nVerfasst am: 13.07.2019 15:14:50 Titel:\nOhne Gurt ist doch gar nicht so schlimm.\nDachte sich der Fahrer in Saverne auch bevor er tödlich verunglückte.\nVerfasst am: 13.07.2019 18:05:04 Titel:\nZurück zum Thema, mit Gurt und Bügel/Käfig\nVerfasst am: 23.07.2019 15:04:48 Titel:\nDie Steinbeisser Trophy 2019\nAlle drei Sektionen der Formula Steinbeisser,\nVerfasst am: 17.08.2019 19:31:52 Titel:\nOffroad Forum Foren-Übersicht -> Bilder und Videos Gehe zu Seite Zurück 1, 2, 3, 4, 5, 6 Weiter =>


Heilpraktiker in Deutschland finden\nDer Begriff Heilpraktiker ist eine geschütze Bezeichnung für einen Beruf. Dabei ist zu beachten, dass Heilpraktiker eine Heilkunde ausüben, ohne im Besitz einer ärztlichen Aprobation zu sein.\nAuf der Seite Heilpraktiker-Reisen.de finden Sie Informationen über verschiedene heilpraktische Verfahren, über die Alternativmedizin und natürlich zum Thema Gesundheit allgemein. Insbesondere die Thematik der Alternativen Heilmethoden bzw. der Alternativmedizin ist in der jüngsten Vergangenheit immer mehr in den Mittelpunkt des allgemeinen Interesses gerückt. Häufig werden alternative Heilmethoden wie Shiatsu oder Ayurveda auch in Verbindung mit Wellnessreisen angeboten.\nDie Grundlagen einer nicht unerheblichen Anzahl alternativer Heilmethoden wurden im asiatischen Raum und hier insbesondere in China und Indien gelegt. Aus diesem Grund nutzen auch zahlreiche europäische Heilpraktiker die Möglichkeit, uraltes Wissen direkt vor Ort und somit beispielsweise in Indien zu erwerben. Viele Heilpraktiker Reisen nach Indien, um sich dort beispielsweise jahrtausende altes Wissen über Ayurveda anzueignen oder um sich über Heilkräuer und Heilpflanzen zu informieren.\nEine lange Tradition hat in der indischen Kultur auch das Fasten. So wird in Indien das Fasten schon seit vielen Jahrhunderten praktiziert und unter anderem zum Meditieren genutz. Daher ist es nicht verwunderlich, dass gesundheitsbewußte Menschen nach Indien reisen und in ihrem Indien Urlaub dort fasten. Eine Fastenkur im Hotel hat eine lange Tradition und läßt sich beispielsweise mit einer Indien Rundreise verbinden.


Rathauspreis geht an Gehse und Nyborg\nOberbürgermeister vergibt bei Empfang Auszeichnung / Ehrenspange für Feuerwehrkameraden\nPreisträger und Laudatoren inklusive Oberbürgermeister Bert Knoblauch (3. von rechts) für ein Foto vor die Kamera zu bekommen, war aufgrund des großen Publikumandrangs gar nicht so einfach. Karl-Friedrich Gehse (2. von rechts) hatte der Stadt als Geschenk eines seiner Lieblingsbilder mitgebracht. Anders Nyborg (links) und Stadtrat Reiner Hornich waren so sehr ins Gespräch vertieft, dass die klickenden Kameras an ihnen vorüber gingen. Rechts Christian Jung, Martin Hennig 3. von links.\nErstmals seit 2011 ist in Schönebeck wieder der Rathauspreis vergeben worden. Die Auszeichnung ging an den Künstler Anders Nyborg und den Architekten Karl-Friedrich Gehse. Eingebettet in die Veranstaltung war auch eine hohe Auszeichnung für die Feuerwehrkameraden Martin Hopfer und Gunnar Ulrich aus Ranies.\nSchönebeck l Die Stadt Schönebeck hat am Sonnabend während eines Empfangs des neuen Oberbürgermeisters Bert Knoblauch (CDU) anlässlich seines Amtsantritts zwei Männer mit dem Rathauspreis geehrt. Beide haben Schönebeck wesentlich geprägt. Die Rede ist von Anders Nyborg und Karl-Friedrich Gehse. Der eine ist Schöpfer der Skulptur Salzblume am Elbufer, der andere hat als Architekt insbesondere die Altstadt wesentlich städtebaulich geprägt. Die Verleihung des Rathauspreises - der seit 2010 wieder erstmals vergeben worden ist - wurde im Dr.-Tolberg-Saal ausgerichtet. Ein knapp zweieinhalbstündiges Programm erwartete die Gäste.\nDie Veranstaltung eröffnete Oberbürgermeister Bert Knoblauch (CDU) mit einer Rundumschau auf seine ersten Wochen als Stadtoberhaupt. Er beschwor geradezu die Schönebecker, die Aufgaben der städtischen Entwicklung als Chance und Gemeinschaftsaufgabe zu sehen. "Unser Image ist, wie man uns sieht. Deshalb liegt es mir fern, Schönebeck in schwarzen Farben zu malen. Was ist schlecht daran, ein wenig stolz zu sein auf seine Heimatstadt?" Knobaluch pries die Potenziale wie wirtschaftliche Neuansiedlungen, hob die Elbelandschaft, die touristischen Chancen und den Kurstandort hervor und sprach diesbezüglich von der "Achse des Guten", die es gelte, miteinander zu verknüpfen. "Bei all dem verkenne ich nicht unsere Probleme, wie etwa die Vernässung. Aber heute sind wir hier nicht zu einer Bürgerversammlung zusammengekommen", schlug er den Bogen zur Preisverleihung und führte weiter aus: "Heute ist ein guter Tag für Schönebeck."\nErster Laudator des Tages war der Stadtrat Christian Jung. Seinen Ausführungen über Karl Friedrich Gehse hatte er die Worte vorangestellt "Es war einmal ..." Es war einmal eine wirtschaftlich und sozial blühende Stadt. "Doch in der sogenannten Vor- und Nachwendezeit geschah das, was es nie in ihrer Geschichte zuvor gab. Häuser verfielen, Prachtstraßen wurden zu Straßen des Grauens, die Häfen versandeten, große Betriebe mussten schließen, die nördliche Altstadt war nur noch ein Trümmerfeld."\n"Individuelle Ideen stehen in einem kritischen Diskurs."\nDie politische Wende kam ,und es gab Aufbruchstimmung. "Diese Stimmung wurde durch einen Menschen aufgenommen, genutzt und beeinflusst, den wir nun mit dem Rathauspreis ehren: Karl-Friedrich Gehse."\nJung berichtete rückblickend von den verschlungenen Wegen und den seltsamen Zufällen des Lebens, die letztlich dazu führten, dass der Bochumer Architekt Gehse auf Schönebeck aufmerksam wurde. Eine von ihm präsentierte Diashow unterstrich es nachdrücklich: Der Mann, der der Schönebecker Altstadt nach der Wende zumindest in Teilen ein neues Gesicht gab, heißt Karl-Friedrich Gehse.\nUnd weil es in der Welt immer solche und solche Ansichten gibt, fügte der Redner hinzu: "Alles, was einer individuellen Idee entspringt und schöpferisch gestaltet ist, steht im kritischen Diskurs."\nDie von Gehse in Gang gesetzte städtebauliche Entwicklung sei jäh gestoppt worden. "Heute können wir leider nur so, wie ich meinen Vortrag begann, sagen: Es war einmal!" Doch der verbale Mutmacher Jungs fehlte nicht. "Die Amtseinführung des neuen Oberbürgermeisters sollte ein Ansatz sein, um die Stimmung des Aufbruchs und Neuanfangs wieder in die Köpfe derer zu tragen, welche die Geschicke unserer Stadt bestimmen."\nKarl-Friedrich Gehse stellte beim Blick in die große Runde fest: "Ich sehe wenig bekannte Gesichter. Es sind nun einmal 20 Jahre vergangen." Ja, er sei fasziniert gewesen von der Aufbruchstimmung nach der Wende. "Hier, dachte ich damals, bist du richtig." Sein erster Eindruck von Schönebeck 1990 habe ihn an das 1. Buch Mose erinnert, in dem sinngemäß steht: "Und die Welt war trüb und leer."\nMit der heutigen deutlich reglementierten Architektur kann sich der 74-Jährige indes nicht anfreunden. "Damit komme ich nicht klar", räumte er ein. Schönebeck habe nach wie vor positive Ansätze. Diese Schätze müssten gehoben werden. "Ich wünsche der Stadt gutes Gelingen und muss sagen: Es hat Spaß gemacht."\nSpaß an seiner Arbeit, Spaß am Leben hat unzweifelhaft auch der zweite Preisträger: Anders Nyborg. Die Laudatio für den dänischen Bildhauer und Maler hielt Martin Hennig, der ehemalige Baudezernent und - nun im Ruhestand - heutige Vorsitzende des Elbuferfördervereins. Nyborg, 1934 in Kopenhagen geboren, arbeitete viele Jahre als Verleger, bevor er sich mit Mitte 50 der Bildhauerei und der Malerei zuwandte. Für den 80-Jährigen gelte das Motto: "Das ganze Leben ist ein großer Urlaub, wenn man die Dinge mit Freude tut." Genau das, versuchte Hennig den Vital-Virus unter die Leute zu bringen, "sollte für uns alle gelten".\n"Die Salzblume eine Wahnsinns-Idee!"\nDie beiden Preisträger kennen sich übrigens von damals, als in Schönebeck alles neu begann. Gehse war angetan von einem alten Salzschuppen am Elbufer und erschuf daraus die Salinehäuser und damit das längste Fachwerkhaus der Welt, auch wenn die Stadt Halle diesen Titel bislang gerne für sich in Anspruch nahm. Damals entstand auch die Idee einer Skulptur an der Elbe. Sie sollte Attribute vereinen, die zu Schönebeck pasen: Salzkristalle, die Elbe, Schiffssegel. Martin Hennig hat für diesen Plan heute einen prägnanten Satz übrig: "Was für eine Wahnsinns-Idee!"\nViele Dinge mussten geklärt werden, vor allem die Finanzierung über Spenden, die Materialbeschaffung, die bauliche Genehmigung. "An dieser Stelle möchte ich ein Geheimnis verraten, in der Hoffnung, dass diese Tat zwischenzeitlich verjährt ist", sagte Hennig und erzählte die Geschichte von der vereinfachten Baurecht-Schaffung. Der Schönebecker Stadtrat bekam nur die Beschlussfassung zum Bau der Salzblume auf den Tisch, stimmte nicht explizit über das Kunstwerk als solches ab. Das hätte eine unendliche Diskussion gegeben, meinte Hennig und verwies auf andere Städte, wo Vorhaben dieser Art nie aus den Debatten im Rat herausgekommen sind.\nEnthüllt wurde die Salzblume am 23. Mai 1997. "Anders Nyborg hat nicht nur sein größtes Kunstwerk an die Elbe gebracht, sondern damit auch dafür gesorgt, dass die Stadt Schönebeck weit über die Landesgrenzen hinaus bekannt wurde. Jeder Elbschiffer kennt die Salzblume inzwischen. Es besteht auch die vage Hoffnung, dass auch jeder Schönebecker sie inzwischen kennt", sagte Hennig.\nNyborg gab sich in seinem Grußwort bescheiden. Er habe die Auszeichnung nicht verdient, jedenfalls nicht allein. Eine solche Skulptur enstehe nur, wenn viele Menschen mit Herzblut mitwirken. Als kleines Geschenk für Schönebeck hatte er zwei Musiker aus Berlin im Schlepptau. Helmut Rosenthal und Professor Klaus Kießner sind etwas älteren Jahrgangs und beide brauchten zu Fuß etwas länger, um auf die Bühne zu kommen. Was sie dann am Flügel und am Xylophon abzogen, war allerdings ein musikalisches Feuerwerk, das im gesamten Saal zündete. "Einfach einmalig" lobte Oberbürgermeister Knoblauch den Auftritt der beiden. "Wir kennen uns seit dem Studium und waren viele Jahre an der Deutschen Oper in Berlin", sagte Helmut Rosenthal gegenüber der Volksstimme. Das Duo gehört zum großen Freundeskreis von Anders Nyborg.\nEbenfalls eingebettet in die Veranstaltung war die Auszeichnung von zwei Feuerwehrkameraden mit der Ehrenspange, Hintergrund ist ihr Einsatz während der Juni-Flut 2013. Diese besondere Auszeichnung erhielten Gunnar Ulrich und Martin Hopfer. Sie gehören der Freiwilligen Ortsteilfeuerwehr Ranies an und sind beide sowohl hochqualifizierte Verbandsführer als auch Berufsfeuerwehrleute. Ihr Fachwissen und Engagement sei dem gesamten Einsatz während der Flut-Wochen sehr dienlich gewesen, würdigte Landkreis-Dezernentin Reingard Stephan.\nFür die weitere musikalische Untermalung des Tages sorgten die Musikschüler Anna-Lena Schiemann, Christoph Markl und Marlin Flagmansky.\nEine hohe Auszeichnung erhielten die Feuerwehrkameraden Martin Hopfer (3. von rechts) und Gunnar Ulrich (2. von rechts) in Anwesenheit von Dezernentin Reingard...


Die Ohrenreinigung: So macht man's richtig - asklubo.com\nDie Ohrenreinigung: So macht man's richtig\nOhrenschmalz ist ästhetisch fragwürdig - es ist gelb, klebrig und sieht irgendwie eklig aus.\nDabei ist die gelbliche Masse wichtiger als die meisten denken! Sie befeuchtet den Gehörgang und schützt zudem vor Infektionen. Außerdem befördert es Schmutz, abgestorbene Hautzellen und Staub aus dem Inneren in Richtung Ohrenausgang. Trotzdem wollen viele Menschen ihr Ohrenschmalz entfernen. Das ist gesundheitlich nur dann sinnvoll, wenn das Ohrenschmalz einen Pfropf bildet und unangenehm im Ohr drückt oder sogar das Hörvermögen beeinflusst.\nSpitze Gegenstände gehören nicht in den Gehörgang\nZur Ohrenreinigung sollten Sie keinesfalls spitze Gegenstände wie Stifte oder Heftklammern verwenden. Diese können den Gehörgang und das Trommelfell nachhaltig verletzen. Außerdem könnten sie das Ohrenschmalz weiter in das Ohreninnere verschieben und Ihre Probleme somit nur noch verschlimmern.\nAuch handelsübliche Wattestäbchen sind zur Ohrenreinigung nicht optimal, denn auch die Watteenden der Stäbchen könnten eine Verschiebung des Ohrenschmalzes nach sich ziehen.\nOhrenkerzen können zu Verletzungen führen\nEine beliebte Methode zur Ohrenreinigung sind Ohrenkerzen, die angezündet im Ohr für einen Unterdruck sorgen. Problematisch wird diese Methode, wenn Wachs ins Ohreninnere eindringt. Dann droht die Gefahr einer Trommelfellverletzung.\nWie reinigt man Ohren denn nun am besten?\nNun stellt sich die Frage, wie man eine Ohrenreinigung durchführt ohne sich selbst Schaden zuzufügen.\nAm besten ist es, wenn Sie das Ohrenschmalz sich selbst überlassen. Der Körper reguliert das Schmalz im Ohr recht gut. Sanft lässt sich sichtbares Schmalz entfernen indem Sie es mit einem feuchten Tuch etwas abtupfen oder nach dem Duschen mit einem Wattebausch entfernen.\nSollte Sie das Ohrenschmalz gesundheitlich beeinträchtigen, hilft am besten der Gang zum Hals-Nasen-Ohren-Arzt. Dieser kann eine professionelle Ohrenreinigung bei Ihnen durchführen.\nTags:Ohren , Nase


Kollektive Intelligenz erobert die Börse - Eine Pressemitteilung von Hanseatischer Börsenkreis der Universität zu Hamburg e.V. (HBK)\nAm Mittwoch, den 20. Juli 2016 dreht sich in der monatlichen Vortragsreihe „Spotlight Finance“ alles um die kollektive Intelligent! Zu Gast ist Corvin Schmoller, Geschäftsführer der Intelligent Recommendations GmbH!\nDas Unternehmen ist ein innovatives, global skalierbares Finance 2.0-Unternehmen und bietet dem Privatanleger eine bankenunabhängige Orientierung für eine erfolgreiche Finanzanlage.\n„Die Crowd schätzt am besten!“ Das ist das Credo, an dem sich die innovativen Handelssysteme und -ansätze des Unternehmens richten!\nDer Vortrag "Kollektive Intelligenz erobert die Börse" soll die Systematik kollektiver Intelligenz in erfolgreicher Anwendung an der Börse durch das IR-System zeigen. Es soll verdeutlicht werden, wie und wann kollektive Intelligenz entsteht und wie sie in Trading-Signale umgewandelt wird, um besten Ergebnisse zu erreichen, die anschließend in verschiedenen Produkten zum Einsatz kommen.\nZwei wissenschaftlichen Proofs of Concept aus dem Jahr 2015 untermauern den nachhaltigen Erfolg des Ansatzes. Bei Anlageentscheidungen erreicht das IR-System die Bestleistung aller Kollektive-Intelligenz-Systeme und eine deutliche Index-Outperformance! Erfahren Sie mehr über die innovative IR-Informationstechnologie, die am 20.07.2016 näher verdeutlicht wird!\nDer Vortrag startet um 18.00 Uhr in der Universität Hamburg (Edmund-Siemers-Allee 1, Raum ESA WEST 221). Der Eintritt ist frei. Eine Anmeldung ist nicht erforderlich. Im Anschluss an den Vortrag lädt der HBK zu einem kleinen Imbiss ein.\nDer HBK organisiert den jährlich stattfindenden Hamburger Börsentag. Mit rund 5.500 Besuchern, über 80 Ausstellern und knapp 65 hochkarätigen Vorträgen ist der Hamburger Börsentag der Besuchermagnet zum Thema Börse und Kapitalmarkt im Norden.\nFür den Inhalt der Pressemitteilung ist der Einsteller, Maximilian Ligus (Tel.: 040 - 428 383 747), verantwortlich.\nPressemitteilungstext: 356 Wörter, 2965 Zeichen. Pressemitteilung reklamieren\nKeywords: Finanzen Vermögen Geldanlage Geld Börse\nUnternehmensprofil: Hanseatischer Börsenkreis der Universität zu Hamburg e.V. (HBK)\nWeitere Pressemeldungen von Hanseatischer Börsenkreis der Universität zu Hamburg e.V. (HBK)\nZum runden Jubiläum hat der Börsentag Hamburg in diesem Jahr ein besonders hochkarätiges Programm zu bieten. Am Samstag, den 31. Oktober 2015 kommen in der Zeit von 9.30 bis 17.00 Uhr die Top-Experten der Finanzbranche in die Handelskammer Hamburg. Hautnah erleben können die Besucher des Hamburger Börsentages u. a. Dirk Müller, alias Mr. DAX, und Robert Halver (Baader Bank), bekannt aus T... | Vollständige Pressemeldung lesen


Ohne Vorbereitungsturnier nach Wimbledon: Nächstes Husarenstück von Federer? - 20 Minuten\nAktualisiert 10.06.2009 17:08\nOhne Vorbereitungsturnier nach Wimbledon: Nächstes Husarenstück von Federer?\nRoger Federer und Rafael Nadal wollen ohne Vorbereitungsturnier auf Rasen den Titel in Wimbledon holen. Seit 20 Jahren haben erst drei Spieler dieses Kunststück geschafft. Und raten Sie mal, wer da dabei ist.\nDas Turnier auf dem heiligen Rasen von Wimbledon wird von den meisten Spielern als das wichtigste der Saison betrachtet. Das sehen auch Roger Federer und Rafael Nadal so. Die zwei zur Zeit besten Spieler der Welt sind denn auch die grossen Favoriten auf den Titel in London. Seit 2003 gab es keinen anderen Sieger mehr. Doch ist es möglich, dieses Grand-Slam-Turnier zu gewinnen, ohne einen Ernstkampf auf Rasen vor Turnierstart bestritten zu haben? Ja, es ist. In den letzten Jahren gelang dies drei Spielern: Boris Becker 1989, Andre Agassi 1992 und Roger Federer 2007.\nFederer liess 2007 das Turnier in Halle sausen, weil er zuvor einen langen French-Open-Final bestritten hatte – ähnlich wie in diesem Jahr. Trotzdem reichte es ihm zum Titel. Bei seinen ersten vier Wimbledon-Erfolgen reiste der Schweizer jeweils mit dem Selbstvertrauen des Turniersiegers in Halle auf die Insel.\nFrench Open/Wimbledon-Double schwer zu schaffen\nBei den letzten 20 Austragungen in Wimbledon sind diese Leistungen allerdings eine Ausnahme: Elfmal erreichte der spätere Sieger der All England Championship beim einzigen Vorbereitungsturnier auf Rasen jeweils mindestens das Halbfinale. Nur einmal gabs ein Debakel: Pete Sampras flog 1993 in Queen's in der Startrunde raus – holte wenige Tage später in Wimbledon aber seinen ersten von sieben Titeln des wichtigsten Turniers der Welt (siehe Info-Box rechts).\nGelingt Federer tatsächlich der Sieg in Wimbledon, würde er in den exklusiven Kreis der French Open/Wimbledon-Double-Gewinner aufsteigen. Im selben Jahr gelang dies in der Neuzeit nur Björn Borg (1978 bis 1980) sowie in der letzten Saison Rafael Nadal. Der Sieg bei diesen beiden Grand-Slam-Turnieren im gleichen Jahr ist aus zwei Gründen schwer zu erreichen. Erstens sind die beiden Turniere zeitlich nahe beieinander, zweitens ist die Umstellung vom langsamen Sand auf den schnellen Rasen etwas vom Schwierigsten im Tennis.\nSieger in Wimbledon und ihr Abschneiden beim Rasen-Vorbereitungsturnier seit 1989:\n2008: Nadal, Sieger in Queen's\n2007: Federer, ohne Vorbereitungsturnier\n2006: Federer, Sieger in Halle\n2005: Federer, Sieger in Halle\n2004: Federer, Sieger in Halle\n2003: Federer, Sieger in Halle\n2002: Hewitt, Viertelfinal in 's-Hertogenbosch\n2001: Ivanisevic, Achtelfinal in 's-Hertogenbosch\n2000: Sampras, Finalist in Queen's\n1999: Sampras, Sieger in Queen's\n1998: Sampras, Achtelfinals in Queen's\n1997: Sampras, Viertelfinal in Queen's\n1996: Krajicek, Viertelfinal in Rosmalen\n1995: Sampras, Sieger in Queen's\n1994: Sampras, Finalist in Queen's\n1993: Sampras, 1. Runde in Queen's\n1992: Agassi, ohne Vorbereitungsturnier\n1991: Stich, Halbfinalist in Rosmalen\n1990: Edberg, Halbfinalist in Queen's\n1989: Becker, ohne Vorbereitungsturnier\nFrontSportOhne Vorbereitungsturnier nach Wimbledon: Nächstes Husarenstück von Federer?


TIPP: VMWare Ressourcensparend\nDiskutiere TIPP: VMWare Ressourcensparend im IT-News Forum im Bereich News; Newsmeldung von Diego: Mit den VMware Batches kann man spielend leicht den Ressourcenverbrauch von VMware minimieren. Somit verbraucht VMware nur noch Ressourcen wenn Sie die ...\n08.06.2007, 21:15 TIPP: VMWare Ressourcensparend #1\nNewsmeldung von Diego:\nMit den VMware Batches kann man spielend leicht den Ressourcenverbrauch von VMware minimieren. Somit verbraucht VMware nur noch Ressourcen wenn Sie die Software auch wirklich benötigen.\nWeitere Infos & Projekt Website:\nSchau mal hier: TIPP: VMWare Ressourcensparend. Dort wird jeder fündig!\n08.06.2007, 21:16 TIPP: VMWare Ressourcensparend #2\nVielen Dank @ thedoctor\n08.06.2007, 21:40 TIPP: VMWare Ressourcensparend #3\nCoole Sache! Da kann auch ich mit meinen mickrigen 1024 mb ram mal 3 vm`s synchron laufen lassen\n08.06.2007, 21:47 TIPP: VMWare Ressourcensparend #4\nNö, so ist das nicht gedacht !\nDie Batches verringern den Verbrauch wenn die Software nicht benutzt wird. Wenn du sie benutzt, braucht VMware natürlich den Speicher.\n09.06.2007, 10:45 TIPP: VMWare Ressourcensparend #5\nschönes skript wirklich .\n09.06.2007, 13:24 TIPP: VMWare Ressourcensparend #6\nIch gehe mal davon aus, das bezieht sich auf die Workstation-/Server-Version, weil der Player keine Ressourcen braucht, wenn er den nicht läuft.\nVMware installiert zwar einige Dienste, die beim Systemstart laufen, aber die kann man 1. auf manuell setzen und 2. brauchen die effektiv so gut wie gar nichts, weil der benötigte Speicher nach kurzer Zeit bereits von Windows ausgelagert wird.\n09.06.2007, 16:17 TIPP: VMWare Ressourcensparend #7\n09.06.2007, 20:52 TIPP: VMWare Ressourcensparend #8\nwie auf der Website steht, Workstation, Server\n10.06.2007, 12:40 TIPP: VMWare Ressourcensparend #9\nAlso die Dienste von VMWare Workstation 6 reservieren nach dem Start auf meinem Laptop 16 MB Ram...davon wurden aber von Windows sofort 7 MB ausgelagert. Wenn andere Programme mehr RAM benötigen, kann es leicht sein, dass Windows die Dienste komplett auslagert.\nAm Homeserver habe ich zwar noch VMWare Server, aber der läuft gerade nicht. Bin mir aber sicher, dass es sich da nicht viel anders verhält.\nÄhnliche Themen zu TIPP: VMWare Ressourcensparend\nVMware workstation und VMware player: hallo welchen unterschied genau gibt's zwischen VMware workstation und VMware player ? sind die beide varianten für den privaten gebrauch...\nSind die VMware Tools von VMware Server 2 abwärtskompatibel?\nSind die VMware Tools von VMware Server 2 abwärtskompatibel?: Hallo. Kann mir jemand von euch sagen, ob die VMware Tools, welche der VMware Server 2 mitliefert auch mit dem VMWare Server 1.0.6 funktionieren?...\nTIPP: Wer noch Dire Straits im ohr hat sollte sich die scheibe holen :repect Titel : All The Roadrunning :sing GENIAL\nDu betrachtest gerade TIPP: VMWare Ressourcensparend


[ TEST ] ChromaGun VR – Farbenrätsel für Fortgeschrittene / Play Experience\nPlay Experience > Spiele Test > [ TEST ] ChromaGun VR – Farbenrätsel für Fortgeschrittene\nPosted by Kai Voss 22. März 2019\nIn ChromaGun VR finden wir uns als identitätslose Testperson wieder. Aus der Ego-Perspektive heraus, manövrieren wir uns durch die einzelnen Testkammern, die alle in sterilem Weiß gehalten sind. Eine Computer-Stimme gibt uns dabei nicht nur Anweisungen über unser Vorgehen, auch den ein oder anderen zynischen Witz, vorgetragen in einem Tonfall, wie er nüchterner kaum sein könnte, müssen wir über uns ergehen lassen.\nAber Moment mal? Das klingt doch wie eine Beschreibung zu Portal! Ja, das mag sein. Auch hier bedient man sich nur allzu gerne an der Rahmenhandlung von Valves Erfolgsspiel.\nDoch der Spielablauf unterscheidet sich dann doch deutlich. Zwar bekommen wir auch in ChromaGun VR eine Waffe in die Hand gedrückt, die wir als Werkzeug benutzen, die einzelnen Testkammern zu lösen, doch verschießen wir hier keine Portale an die Wände. Farbe heißt das Stichwort. Unsere Waffe befähigt uns, die drei Grundfarben gelb, rot und blau zu verschießen. Per Knopfdruck wechseln wir spielend einfach in der Farbpalette hin und her. Doch wir sind in den Testkammern nicht allein. Kugelartige, schwebende Roboter, so groß wie Medizinbälle, leisten uns stumme Gesellschaft. So rätselhaft sie auch sein mögen, sie sind der Schlüssel in der Lösung der meisten Rätsel in ChromaGun VR.\nEingeteilt ist die Story dabei in sieben Kapiteln, die über jeweils acht Testkammern verfügen. Die Rätsel laufen dabei immer nach dem gleichen Prinzip ab. Mit der Waffe verpassen wir unseren Roboterfreunden eine Farbe und leiten sie zu einem Schaltermechanismus, indem wir die weißen Wände der Testkammer mit der gleichen Farbe beschießen. Angezogen von der Farbe, bewegt sich der Roboter auf die jeweilige Wand zu, an denen er den Mechanismus aktiviert, der uns die Tür zur nächsten Kammer öffnet.\nKlingt einfach? Wird mit fortschreitender Story aber immer komplexer. In späteren Leveln gesellen sich aggressive Roboter hinzu, die uns auch schnell mal töten können. Außerdem lassen sich unsere drei Grundfarben mischen. Ein Schuss mit gelb und anschließend nochmal mit blau nachgeschossen und schon bekommen wir grün. Das ergänzt die Rätsel um weitere Denkebenen. Elektrische Felder, die uns ebenso gefährlich werden können, sorgen für weiteren Nervenkitzel beim Knobeln und wenn dann in einigen Testkammern das Licht ausgeknipst wird und wir mit dem kleinen Lichtkegel unserer Taschenlampe ganz genau schauen müssen, welche Farbe die einzelnen Objekte haben, raucht uns schnell der Kopf.\nDer Schwierigkeitsgrad der einzelnen Herausforderungen wankt dabei zwischen den Testkammern immer wieder deutlich von sehr einfachen Rätseln, die wir in Windeseile überwunden haben, zu echten Kopfnüssen, an denen wir uns lange die Zähne ausbeißen müssen. Einen kontinuierlich ansteigenden Schwierigkeitsgrad hätten wir uns da eher gewünscht. Oft enden fordernde Rätsel damit, dass wir blind herumprobieren und anschließend mehrfach den letzten Checkpoint laden, wenn wir uns verrannt haben.\nDie Grafik von ChromaGun VR ist sehr minimalistisch und steril gehalten, was die Labor-Atmosphäre aber durchaus unterstützt. Die Virtuelle Realität ist gut umgesetzt. Mit unserem PSVR-Headset erreichen wir eine sehr gute Räumlichkeit, die Auflösung ist recht gut und stellt die einzelnen Objekte scharf dar. Spielen lässt sich das Knobel-Game nicht nur mit dem Dualshock auf wunderbar präzise Weise, auch Move-Controller oder der Aim-Controller lassen sich als alternative Steuerungsmethoden für unsere Waffe benutzen. Die Kamera dürfen wir im Optionsmenu entweder in einer flüssigen Darstellung bewegen oder in einer schrittweisen Darstellung – dies ist besonders für die Spieler hilfreich, die unter Motion-Sickness leiden.\nDer Soundtrack fällt eher durch immer wiederkehrende Musikuntermahlung auf, die in ihrer Tonalität mitunter leicht nervig werden kann. Der Sprecher, der uns in den Testkammern Anweisungen gibt, kann sowohl in einer deutschen als auch in einer englischen Vertonung gewählt werden. Beide Versionen überzeugen längst nicht immer.\nEin Spiel zum Preis von 2\nDer Umfang von ChromaGun VR ist recht gering. Nach etwa fünf Stunden haben wir uns durch das skurrile kleine Spiel geknobelt. Zu beachten ist, dass ChromaGun und ChromaGun VR als separate Spiele angeboten werden. Beide Versionen sind inhaltlich gleich. Ein bisschen unverschämt ist es hingegen schon. Alle Spieler, die bereits ihr Geld in die Standard-Version gesteckt haben, sind nun gezwungen noch einmal 19,99 Euro zu löhnen.\nKurzweiliges Rätselabenteuer mit guter VR-Umsetzung\nChromaGun VR ist ein spaßiger Ausflug in die Welt des VR-Gaming. Es ist allerdings kundenunfreundlich, dass der VR-Modus nicht als kostenloser DLC nachgereicht, sondern in einen separaten Titel wiederverwertet wurde. Doch das tut dem Spielspaß selbst keinen Abbruch. Wer die Wahl hat, sollte auf jeden Fall zur VR-Version greifen. Die Immersion und Räumlichkeit sind toll umgesetzt und die Steuerung wird präzise wiedergegeben.\nChromaGun VR ist ab sofort im PlayStation Store für die PlayStation VR erhältlich.\nTags: CHROMAGUN Indie Pixel Maniacs PSVR review Test VR\nPrevious Article RAINBOW SIX SIEGE – LG präsentiert neue E-Sport Liga\nNext Article SPEEDLINK – lässt nun den Kampf mit Lichteffekten der „TYALO“ beginnen