Chapitre 3 Résultats et discussion\n3.0 L’infection des cellules HEK293T par le système de Lentivirus\n3.1 Création d’une lignée cellulaire stable\n3.2 Construction d’une banque d’ADNc\n3.3 Criblage d’une librairie d’ADNc de cerveau embryonnaire humain\nPour mettre au point le système de Lentivirus et ainsi pouvoir infecter des neurones primaires, les essais de transfections et d’infections ont été effectuées sur des cellules embryonnaires de reins humains 293T. Lors d’un premier essai, en utilisant la méthode au chlorure de calcium, nous avons transfecté 5μg de PMDG, 20μg de PCMV∆R8,9 et 12μg pSIN/PS1H115Y dans les cellules 293T. Dans ce cas-ci, notre gène d’intérêt est la préséniline1 mutée, une mutation impliquée dans le développement de la maladie d’Alzheimer sous forme héréditaire. La mutation H115Y résulte de l’inversement d’un acide aminé pour un autre, l’histidine est remplacée par une tyrosine. Après la transfection, le milieu d’infection est récupéré et les cellules sont infectées avec des virions qui contiennent notre gène d’intérêt PS1H115Y (voir méthode point 2.8). L’ARN total, des cellules infectées avec différentes quantités de milieu d’infection, servira à réaliser un RT-PCR (voir méthode point 2.11 et 2.12).\nLes produits obtenus après RT-PCR sont vérifiés sur gel d’agarose 1% (figure 9). Dans chacun des puits nous voyons une augmentation de l’intensité de la bande à 700pb, ce qui corrèle avec l’augmentation de la quantité de milieu d’infection utilisée de 0, 50μl, 100μl, 250μl, 500μl jusqu’à 1000μl. Le contrôle se retrouve dans le premier puits où aucune quantité de milieu d’infection a été ajoutée sur les cellules. Ainsi, la bande de faible intensité retrouvée dans ce puits représente l’expression endogène de la protéine PS1 dans les cellules HEK293T. D’après les résultats obtenus, nous pouvons déterminer la quantité de milieu d’infection optimale pour infecter d’autres cellules avec ce même milieu d’infection.\nCes résultats montrent que le système de Lentivirus est efficace, car une augmentation de l’intensité des bandes corrèle avec l’augmentation de la quantité de milieu ajoutée. Ceci indique qu’il y a une augmentation de l’ARNm menant à la formation de notre protéine d’intérêt. Nous voulions reproduire les mêmes résultats mais en utilisant des plasmides qui contiennent une portion du gène Notch; pSIN/E+C ou pSIN/ICN.\nFigure 9 Vérification sur gel d’agarose 1% des produits du RT-PCR suite à l’infection des cellules HEK293T par le système de Lentivirus. Les vecteurs utilisés pour l’infection sont PMDG, PCMV∆R8,9 et pSIN/PS1H115Y. Le contrôle négatif se retrouve dans le puits 1. Les cellules des puits 2 à 6 ont été infectées avec une quantité de milieu d’infection précise de 50μl, 100μl, 250μl, 500μl et 1000μl. Dans chacun des puits, il apparaît une bande de 700pb qui augmente d’intensité du puits 1 à 6.\nLa portion E+C du gène Notch (figure 4) est rattachée à la membrane et doit être clivée par la γ-sécrétase pour libérer le domaine intracellulaire de Notch (NICD). Ainsi, le domaine NICD pourra transloquer au noyau et avoir un effet sur des gènes cibles. En ce qui concerne la portion ICN de Notch, aucun clivage n’est nécessaire. Le fragment ICN sera constitutivement actif lorsque présent dans la cellule.\nPlusieurs essais ont été effectués avec le plasmide pSIN/E+C ou pSIN/ICN pour obtenir les mêmes résultats qu’avec le vecteur pSIN/PS1H115Y. Nous nous sommes assurés d’utiliser les mêmes conditions. Les résultats obtenus après plusieurs essais pour pSIN/E+C (figure 10A) ou pSIN/ICN (figure 10B) sont négatifs, il n'y a aucune bande de 1kb tel qu’attendue. Pour s’assurer que la réaction de RT-PCR n’est pas la cause des résultats négatifs obtenus, nous avons utilisé des contrôles positifs. Le contrôle positif pour la réaction de la transcription inverse consiste à prendre l’ADNc nouvellement synthétisé après le RT de quelques échantillons et d’effectuer une réaction PCR dans le but d’amplifier le gène GAPDH. Le gène GAPDH est une enzyme clé dans la voie de la glycolyse et il est exprimé de façon ubiquitaire dans la cellule (Berry and Boulton 2000). Le contrôle de la réaction PCR consiste à mettre 1μl du vecteur pSIN/E+C au lieu de l’ADNc provenant du RT et d’effectuer la réaction PCR en utilisant les mêmes conditions que dans les autres tubes.\nFigure 10 Vérification sur gel d’agarose 1% des produits du RT-PCR suite à l’infection des cellules HEK293T par le système de Lentivirus. Les vecteurs utilisés pour l’infection sont PMDG, PCMV∆R8,9 et pSIN/E+C (A) ou pSIN/ICN (B). Le contrôle négatif se retrouve dans le puits 1 de chacun des gels. Les cellules des puits 2 à 6 ont été infectées avec une quantité de milieu d’infection précise de 50μl, 100μl, 250μl, 500μl et 1000μl. Il n’apparaît aucune bande dans ces puits. (A) Dans le puits 7, il y a amplification du contrôle positif de la réaction PCR, soit une bande à 1Kb. (B) Dans les puits 7 à 10, amplification du gène GAPDH donnant une bande à 570pb, soit les contrôles du RT.\nLes résultats négatifs obtenus ne mettent pas en cause la réaction PCR car il y a eu amplification d’une bande de forte intensité à 1kb, la longueur attendue (puits 7, figure 10A). Il en est de même pour la transcription inverse, car il y a eu amplification de GAPDH représenté par une bande de forte intensité de 570pb (puits 7 à 10, figure 10B) à partir des 4 échantillons d’ADNc vérifiés. Suite à ces essais et aux résultats obtenus, nous avons envisagé d’autres alternatives en nous concentrant sur les diverses méthodes de transfections existantes ainsi que sur la concentration des virions.\nAu lieu de transfecter nos cellules HEK293T en utilisant le chlorure de calcium, nous avons fait des essais avec la méthode d’électroporation et en utilisant des produits spécifiques permettant l’intégration de l’ADN plasmidique dans les cellules tels que Fugene et la lipofectamine. Malgré tous ces essais, nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés lorsque nous vérifions sur gel d’agarose les produits de RT-PCR des cellules infectées. En effet, soit qu’il n’y avait aucune bande du poids moléculaire attendu ou bien il n’y avait aucune augmentation de l’intensité des bandes en corrélation avec l’augmentation du milieu d’infection utilisé. Étant donné que les réactions de transcription inverse et de polymérisation en chaîne sont contrôlées lors des essais, nous avons regardé si l’étape limitante était la transfection ou bien l’infection.\nPour ce faire, le plasmide pSIN.EGFP/PS1wt a été transfecté par électroporation. L’utilisation de ce plasmide a l’avantage que le gène de la préséniline1 est fusionné avec EGFP qui lorsque intégré dans une cellule émettra une couleur verte sous microscope à fluorescence. Nous pouvions ainsi contrôler l’étape de la transfection mais également celle de l’infection. Après transfection, plus de 50% des cellules émettaient de la fluorescence, ce qui indiquait que ces cellules avaient intégré le plasmide pSIN.EGFP/PS1wt. Suite à l’infection des cellules avec ce milieu d’infection, la fluorescence était quasi inexistante. Ainsi, l’infection serait l’étape limitante. Par contre, il faut prendre en considération que ces essais avec EGFP ont été seulement effectués avec la méthode par électroporation et que nous n’avions aucun moyen de vérifier si la cellule a intégré les deux autres vecteurs (PMDG et PCMVΔR8,9) qui sont nécessaires à la formation des virions permettant l’infection des cellules.\nNous avons envisagé que l’étape de l’infection des cellules pourrait être limitante à cause de la quantité trop faible de virions disponibles pour l’infection. Donc, dans le but de maximiser l’infection des cellules HEK293T, nous avons concentré les virions en effectuant une série d’ultracentrifugation. Ces essais ne donneront pas les résultats espérés. Lors de cette manipulation, nous ne pouvons pas apercevoir de culot car les virions sont des particules invisibles à l’œil nu, donc nous ne savons pas si les virions sont dans le fond du tube sous forme d’un culot ou bien encore en suspension dans le surnageant. En plus, malgré le fait que nous faisons attention lorsque nous enlevons le surnageant après centrifugation, il se pourrait bien que nous enlevions également une partie des virions.\nNous avons démontré que le système de Lentivirus peut être efficace en utilisant des cellules HEK293T. Par contre, malgré la multitude d’essais que nous avons effectué pour mettre au point le système de Lentivirus avec le plasmide contenant la portion ICN et E+C du gène Notch, nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés. Nous voulions utiliser le système de Lentivirus pour pouvoir infecter des neurones primaires. Ces cellules infectées auraient surexprimé la portion E+C ou ICN du gène Notch, nous permettant de les utiliser pour construire une banque d’ADNc. Ainsi, pour nous permettre de réaliser notre objectif de construire une banque d’ADNc, nous avons choisi une autre alternative qui consiste à réaliser une lignée cellulaire stable dans les neuroblastomes de souris (Neuro2A).\nNous avons choisi d’utiliser les neuroblastomes de souris (Neuro2A), car ce sont des neurones transformés qui peuvent être facilement gardées en culture cellulaire. En plus, elles ont les caractéristiques associées aux neurones. Pour établir la lignée cellulaire stable, nous avons transfecté les cellules Neuro2A avec le plasmide pCDNA3/E+C qui exprime la portion E+C du gène Notch (figure 4). Ce plasmide a également la propriété de posséder un gène de résistance à la néomycine dont l’analogue est la généticine (G-418sulfate). Ainsi, nous avons la possibilité de sélectionner les cellules qui ont intégré le plasmide de celles qui ne l’ont pas en utilisant une quantité prédéterminée de G-418sulfate. Les Neuro2A possède une résistance naturelle à la drogue G-418 et c’est pour cela que nous devons déterminer la quantité idéale de drogue à utiliser pour garder les cellules en sélection.\nPour ce faire, nous avons mis dans chacun des puits (35mm), 100 000 cellules Neuro2A non-transfectées avec 2ml de milieu DMEM supplémenté contenant une quantité précise de G-418sulfate allant de 0mg/ml à 2,5mg/ml (tableau 9). Pendant une semaine, ces cellules ont été comparées avec les cellules servant de contrôle où aucune drogue n’a été ajoutée. Lorsque les cellules du contrôle ont atteint une confluence de 100%, nous avons pris en considération que la survie cellulaire est de 100%. Ensuite, nous avons déterminé la survie cellulaire des cellules dans les autres puits en déterminant le pourcentage de cellules adhérent au pétris comparativement au contrôle (tableau 15). Ces résultats nous démontrent qu’il n’y a aucune survie cellulaire lorsque les cellules sont en présence d’une quantité égale ou supérieure à 2mg/ml.\nTableau 15 La survie des cellules Neuro2A non transfectées mises en présence d’une quantité déterminée de la drogue G-418sulfate\nConcentration du G418sulfate\nNous avons créé notre lignée cellulaire stable en faisant un essai avec une quantité de 2mg/ml de la drogue G-418sulfate mais également avec une quantité de 3mg/ml. En utilisant ces concentrations, nous nous assurons que les cellules qui survivront possèderont notre plasmide d’intérêt et qu’il n’y aura pas la croissance d’une population cellulaire résistante à la drogue.\nAvant qu’elles ne soient mises en présence de la drogue, les cellules Neuro2A doivent être transfectées avec le plasmide pcDNA3/E+C. Nous avons vérifié l’expression de notre protéine d’intérêt après transfection en effectuant un immunobuvardage et en sondant la membrane avec l’anticorps btan20 qui reconnaît la partie C-terminal du gène Notch. Les résultats obtenus nous permettent d’affirmer qu’il y a une forte expression de la protéine Notch E+C après transfection. En effet, une bande de forte intensité apparaît à 97kDa pour l’essai numéro 1 et 2 (figure 11a, puits 1,2). Des cellules Neuro2A non transfectées nous servent de contrôle négatif et dans ce cas-ci nous pouvons observer qu’il n’y a pas détection de l’expression de la protéine Notch endogène (figure 11A, puits 3).\nEn sachant que nos cellules expriment notre protéine d’intérêt, nous les avons cultivées en sélection avec 2mg/ml pour l’essai numéro 1 et 3mg/ml pour le deuxième essai. Lorsque les cellules étaient confluentes, les cellules étaient récoltées et séparées en deux parties. Avec la première partie nous remettions les cellules en sélection avec la même quantité de drogue utilisée au départ tandis que la deuxième partie des cellules était gardée pour effectuer un immunobuvardage et ainsi vérifier l’expression de notre protéine.\nAu premier passage des cellules en sélection, les résultats de l’immunobuvardage démontrent clairement une diminution importante de l’expression de ma protéine (figure 11A, puits 4 et 5). Il n’y a pas de différences majeures entre les résultats obtenus des cellules mises en sélection avec 2mg/ml de G-418sulfate (1) de celles en présence de 3mg/ml de G-418sulfate (2). Suite au deuxième et troisième passage des cellules (figure 11A, puits 6 à 9), nous ne remarquons plus aucune expression de la portion E+C de la protéine Notch. Pour les deux essais effectués, il y a perte d’expression.\nNous nous sommes assurés qu’il y avait une quantité égale de protéine dans chacun des puits en sondant de nouveau la membrane avec l’anticorps Ab14 qui reconnaît la partie N-terminal de la préséniline1 endogène. Ainsi, nous avons montré que la quantité de protéines est équivalente dans chacun des puits par l’apparition d’une bande à 33kDa (figure 11B).\nFigure 11 Vérification de l’expression de la portion E+C de Notch par immunobuvardage après transfection et lors de la sélection des cellules Neuro2A avec la drogue G-418sulfate. (A) Expression de la protéine Notch pour l’essai 1 et 2 (puits 1et 2) après transfection montrant une bande à 97kDa. (3) Des cellules Neuro2A non transfectées. Pour les puits 4 à 9, l’expression de la protéine Notch après 3 passages subséquents des cellules Neuro2A en sélection avec 2mg/ml de G-418sulfate (1) ou 3mg/ml de G-418sulfate (2). (B) La même membrane sondée avec Ab14 qui reconnaît la partie N-terminal de la préséniline1 en donnant une bande de 33kDa.\nNous avons également vérifié si nos cellules contenaient encore le plasmide pcDNA3/E+C par RT-PCR, mais nous n’avons pas obtenu de résultats concluants. Étant donné que nous utilisons une quantité élevée de G-418sulfate, la possibilité que les cellules développent une résistance naturelle à la drogue est très peu probable. Cependant, c’est un aspect à prendre en considération, car nous n’avons pu démontrer la présence du plasmide dans nos cellules Neuro2A en sélection. Par contre, l’hypothèse la plus probable est que la cellule développe un mécanisme de dégradation de notre protéine. En effet, nous savons qu’une très faible quantité de NICD est nécessaire pour permettre l’activation des gènes cibles au noyau (Schroeter, Kisslinger et al. 1998). En plus, nous ne pouvons observer Notch endogène en immunobuvadarge lorsque sondé avec un anticorps qui reconnaît la partie C-terminal. Donc, il est possible que l’expression de Notch soit régulée de façon stricte évitant ainsi une accumulation plus élevée que le niveau endogène.\nNous voulions établir une lignée cellulaire stable dont les cellules surexprimeraient la portion E+C de notre protéine d’intérêt, dans le but d’utiliser ces cellules pour construire une banque d’ADNc. Par contre, la perte d’expression de notre protéine nous amène à envisager une façon différente de construire notre banque d’ADNc. En effet, nous allons procéder par des transfections transitoires dans les cellules Neuro2A et HEK293T.\nNous avons effectué une banque d’ADNc à partir de cellules Neuro2A et HEK293T qui surexpriment la portion E+C du gène Notch lors de transfections transitoires. Pour ce faire, nous avons effectué 4 transfections indépendantes avec chaque type cellulaire en utilisant le plasmide pcDNA3/E+C et la méthode de la lipofectamine. Après transfection, le tiers des cellules Neuro2A ou HEK293T est gardé pour vérifier l’expression de notre protéine par immunobuvardage (figure 12) en sondant les membranes avec l’anticorps btan20 qui reconnaît la partie C-terminal de la protéine Notch. Un contrôle positif (figure12, C) a été utilisé pour nous permettre de s’assurer que la migration du gel et le transfert des protéines ont été efficaces. Ce contrôle consiste à prendre 20μl d’un lysat cellulaire qui nous a déjà donné les résultats voulus lorsque la membrane avait été sondée avec l’anticorps btan20 lors d’un immunobuvardage. Incluant les contrôles, nous avons obtenu la bande attendue de 97kDa de forte intensité dans chacun des puits. En sachant que l’expression de la protéine Notch endogène n’est pas détectable en immunobuvardage (démontré à la figure 11, puits 3), ceci nous indique qu’il y a surexpression de notre protéine d’intérêt après transfection pour les cellules Neuro2A (figure 12A) et pour les cellules HEK293T (figure 12B). En comparant l’expression de la protéine Notch chez les deux types cellulaires (figure 12 A et B) nous observons que la protéine est exprimée plus fortement dans les cellules HEK293T que dans les cellules Neuro2A. Nous pouvons expliquer ces résultats simplement par le fait que l’efficacité de la transfection est supérieure lorsque nous utilisons des cellules HEK293T.\nLe tiers des cellules a été utilisé pour vérifier l’expression de notre protéine, tandis que nous nous sommes servis du deux tiers des cellules pour extraire l’ARN total dans le but d’établir la librairie d’ADNc. Pour chaque type cellulaire, nous avons combiné les culots d’ARN total obtenus des quatre transfections effectuées. Pour effectuer le protocole permettant la synthèse des fragments d’ADNc, nous avons extrait l’ARNm de l’ARNtotal pour ensuite procéder à la synthèse d’ADNc telle que décrite à la figure 6. Deux essais ont été effectués en combinant l’ARNm des cellules Neuro2A avec l’ARNm des cellules HEK293T.\nFigure 12 Vérification de l’expression de la portion E+C de Notch par immunobuvardage après transfection du plasmide pcDNA3/E+C dans des cellules Neuro2A et des cellules HEK293T. (A) Les 4 transfections indépendantes (1 à 4) dans les Neuro2A donc le C représente un contrôle positif. (B) Les 4 transfections indépendantes (1 à 4) dans les cellules HEK293T donc le C représente un contrôle positif.\nLa synthèse des fragments d’ADNc se fait en plusieurs étapes dont certaines peuvent être contrôlées en utilisant la radioactivité. En utilisant le P32dCTP, nous avons pu démontrer par un autoradiogramme que la synthèse du 1er brin d’ADNc à partir de l’ARNm a été effectuée car nous pouvons voir une traînée sur le film (figure 13, puits 2). À cette étape, nous n’avons obtenu aucun résultat pour l’essai 1, ce qui résulte d’une erreur de manipulations étant donné que nous obtenons les résultats escomptés lors de la suite de l’expérience (figure 13, puits 3 et 5). Avant d’effectuer la synthèse du deuxième brin d’ADNc par une réaction PCR, nous avons prélevé 5μl du mélange de chacun des essais et ajouté du P32dCTP. Ces tubes serviront de contrôles pour noter la différence avant et après la synthèse du deuxième brin d’ADNc. Les résultats obtenus indiquent que la synthèse du deuxième brin a été effectuée car nous observons une augmentation de l’intensité et de la hauteur des bandes si nous comparons avec les contrôles (figure 13, puits 5 et 6).\nLa suite du protocole nous permet d’obtenir des fragments d’ADNc de différentes longueurs et unidirectionnels. En effet, les fragments contiennent une extrémité EcoR1 et une extrémité Xho1, ce qui amène un avantage primordial lors de la ligation de ces fragments dans le vecteur pGADT7 préalablement digéré par EcoR1 et Xho1. Ainsi, les fragments peuvent seulement se lier dans une direction précise qui corrèle avec leur cadre de lecture.\nPlusieurs essais de ligations ont été effectués. Pour le contrôle négatif, nous mettons le vecteur seul avec les composantes permettant la ligation. Nous pouvons ainsi vérifier si le vecteur peut se lier même en l’absence de fragments. Ainsi, nous avons isolé chacun des clones obtenus en effectuant des transformations bactériennes par électroporation avec les produits de ligation. Pour que nous puissions être en mesure de vérifier l’efficacité de la transformation, nous utilisons le vecteur puc19 comme contrôle. L’efficacité des transformations bactériennes par électroporation est très élevée allant de 1x108 à 1x109 colonies lorsque nous utilisons des cellules électrocompétentes DH10B commerciales. Toutes les ligations effectuées ont été vérifiées par transformation par électroporation. Malgré le fait que nos transformations étaient très efficaces lorsque vérifié avec le contrôle positif puc19, il en était tout autre pour les produits de ligations des ADNc clonés dans le vecteur pGADT7. Idéalement nous aurions dû obtenir une efficacité d’environ 1x109 mais nous étions très en dessous ce chiffre (seulement quelques colonies sur les pétris avec ampicilline).\nFigure 13 Autoradiogramme des 2 essais représentant les étapes de la synthèse des fragments d’ADNc. Dans chacun des tubes, une concentration de 800Ci/mmol de P32dCTP a été utilisée. (1, 2) Synthèse du premier brin d’ADNc à partir de l’ARNm. (3, 4) Contrôles avant la deuxième synthèse des fragments d’ADNc. (5, 6) Synthèse du deuxième brin d’ADNc.\nNous pouvons expliquer ces résultats par le fait que nos ligations n’ont pas fonctionné mais également par certains problèmes rencontrés lors du protocole de la transformation. En effet, dans plusieurs des cas, après la pulsion, il y avait explosion de mon mélange de cellules compétentes et de milieu de ligation, ce qui ne favorise aucunement la transformation. Le milieu de ligation contient des sels, alors nous soupçonnons que c’est probablement la cause majeure causant l’explosion. En plus, après avoir étalé sur des pétris sélectifs, il y avait la présence de colonies satellites qui envahissaient nos colonies d’intérêt.\nPour régler le problème des ligations, nous avons fait des tests en faisant différentes dilutions du milieu de ligation avant d’effectuer la transformation. Pour enrayer le problème des colonies satellites, nous avons augmenté la quantité d’antibiotique de chacun des pétris de 75μg/ml à 100μg/ml, mais cela n’a pas donné les résultats escomptés, il y avait toujours la présence des ces colonies indésirables.\nÉtant donné que nous avions des problèmes techniques avec la transformation par électroporation, nous avons décidé d’utiliser l’autre méthode de transformation bactérienne, soit par choc thermique malgré l’efficacité plus faible de 1x105 à 1x106 colonies. Nos résultats n’ont pas été ceux que nous aurions espérés et donc nous en sommes venus à la conclusion que ce n’est pas les méthodes de transformations bactériennes employées qui causent le problème majeur rencontré mais bien les ligations.\nNotre principale hypothèse repose sur une étape particulière lors de la synthèse des fragments d’ADNc, soit la ligation des adaptateurs EcoR1 aux fragments. Cette étape n’est pas contrôlée avec la radioactivité et elle peut s’avérer limitante dans la mesure où la ligation des adaptateurs nécessite des fragments avec des extrémités aux bouts francs. Si par mégarde un adaptateur ne peut se lier de façon adéquate, notre fragment ne possède plus une extrémité EcoR1 et Xho1 et la ligation dans le vecteur pGADT7 aux extrémités EcoR1 et Xho1 est impossible. Cette hypothèse expliquerait la faible efficacité lors des transformations bactériennes.\nSuite aux divers problèmes rencontrés pour la création de notre banque d’ADNc, nous avons décidé de cribler directement une librairie commerciale d’ADNc de cerveau humain embryonnaire. Les sondes utilisées étaient la partie N-terminal de la préséniline1 (1 à 132a.a) et le domaine intracellulaire d’APP.\nNous avons utilisé le système de double hybride de la levure pour cribler la librairie d’ADNc de cerveau embryonnaire humain prétransformée dans les levures Y187. Nos plasmides d’intérêt pGBKT7/PS1(1-132) et pGBKT7/AICD, ils ont été transformés dans les levures AH109. Les levures AH109 et Y187 haploïdes sont sexuellement différentes ce qui nous permet d’effectuer un «mating». Le «mating» mène à l’obtention de levures diploïdes contenant le total des plasmides contenus dans chaque type de levure utilisé pour réaliser le «mating».\nAvant d’effectuer le «mating», nous nous sommes assurés que les souches de levures AH109 et Y187 avaient le phénotype approprié (tableau 16). Pour ce faire, nous avons étalé ces levures sur différents milieux sélectifs et vérifier leur croissance.\nTableau 16 Phénotype attendu des levures AH109 et Y187 sur des milieux sélectifs\n- (aucune croissance), + (croissance)\nLe phénotype de la souche Y187 était adéquat comparativement à la souche AH109 qui poussait sur le milieu sélectif SD/-His, ceci étant causé par une fuite transcriptionnelle du gène histidine. Pour contrer ce problème, nous avons ajouté au milieu une concentration de 2mM d’un inhibiteur compétitif pour la protéine HIS3 de la levure, le 3-AT (3-amino-1, 2, 4-triazole, Sigma). Alors, les deux souches de levures étant adéquates, nous avons procédé à la vérification de la toxicité et de l’autoactivation de la réponse GAL-4 de nos protéines d’intérêt, AICD et PS1(1-132).\nEn ce qui concerne le plasmide pGBKT7/PS1(1-132), nous savions que l’expression du gène de la préséniline1 n’est pas toxique pour la levure et qu’il n’y a pas d’autoactivation de la réponse GAL-4. Par contre, pour le plasmide pGBKT7/AICD nous avons du vérifier ces deux paramètres. Étant donné que les levures transformées avec le vecteur pGBKT7/AICD poussent normalement sur un milieu sélectif SD/-T, nous sommes arrivés à la conclusion que l’expression du domaine intracellulaire d’APP n’est pas toxique pour la levure. Pour déterminer si notre plasmide pouvait causer une autoactivation de la réponse GAL-4, nous avons effectué une co-transformation dans la levure AH109. En effet, nous avons transformé la levure AH109 avec le plasmide pGBKT7/AICD mais également avec le vecteur pGADT7. Les levures co-transformées ont été vérifiées sur un pétris sélectif –TL mais également sur un pétris –TLHA. Nous avons obtenu une multitude de colonies sur le pétris –TL, ce qui nous indiquait que les levures AH109 contiennent les deux plasmides, que notre co-transformation a été efficace. Par contre, aucune colonie était présente sur le pétris –TLHA, ceci indiquant que notre plasmide pGBKT7/AICD ne cause pas l’autoactivation de la réponse GAL-4. Bref, il n’y a pas d’interactions entre AICD et le vecteur pGADT7, empêchant ainsi l’activation de la réponse de GAL-4.\nEn sachant que nos levures possèdent le bon phénotype, que nos protéines d’intérêt ne sont pas toxiques pour la levure et qu’il n’y a pas d’autoactivation de la réponse GAL-4, nous avons pu effectuer les contrôles du «mating». Le but premier de ces contrôles est de nous assurer que nous obtiendrons une efficacité adéquate lors du «mating» avec la librairie prétransformée de cerveau embryonnaire humain. Les résultats obtenus (tableau 17) nous ont permis de calculer l’efficacité du «mating» pour chaque contrôle.\nTableau 17 Efficacité du «mating» des 3 contrôles\nPour le vecteur pGBKT7/AICD, nous avons obtenu une efficacité de 7% comparativement à 6% pour le vecteur pGBKT7/PS1(1-132). En ce qui concerne pGBKT7/p53 et pGADT7, l’efficacité atteint 7,5%. D’après le protocole de Clontech, nous devions obtenir une efficacité de plus de 2% pour considérer le «mating» efficace. Dans ces cas-ci, les résultats que nous avons obtenus montrent une très bonne efficacité. Nous pouvons maintenant entreprendre l’étape du «mating» avec la librairie d’ADNc et notre plasmide pGBKT7/AICD ou pGBKT7/PS1(1-132).\nEn premier lieu, nous avons titré la librairie d’ADNc avant qu’elle ne soit utilisée pour chacun des «mating» et ainsi déterminer le nombre approximatif de colonies/ml contenu dans chaque tube. Nous avons obtenu 3,3x108cfu/ml pour la librairie d’ADNc qui a été utilisée pour le «mating» avec le plasmide pGBKT7/PS1(1-132) et 1,3x108cfu/ml en ce qui concerne la librairie qui a été utilisée pour effectuer le «mating» avec le plasmide pGBKT7/AICD. Il ne nous restait plus qu’à effectuer les «mating».\nNos résultats nous indiquent (tableau 18) que nous avons obtenu une efficacité de 6,40% pour le «mating» avec le plasmide pGBKT7/PS1(1-132) tandis qu’avec le plasmide pGBKT7/AICD nous avons obtenu 5,70%. En prenant en considération que nous obtenons des valeurs supérieures à 2%, nous pouvons considérer que les deux «mating» sont réussis. En plus, nous avons pu calculer le nombre approximatif de clones indépendants pour chacun des «mating», soit 5,1x106 clones indépendants pour le criblage avec pGBKT7/PS1(1-132) et 2,9x106 clones indépendants pour le criblage avec pGBKT7/AICD.\nTableau 18 Efficacité du mating de la librairie d’ADNc avec pGBKT7PS1(1-132) ou pGBKT7/AICD\nLe mélange obtenu après chacun des «mating» a été étalé sur des pétris sélectifs –TLHA. Pendant deux semaines nous avons identifié les colonies apparaissant sur chacun de ces pétris sélectifs. En ce qui concerne nos résultats (tableau 19), nous avons obtenu 14 colonies suite au criblage avec le plasmide pGBKT7/PS1(1-132) et 24 colonies lors du criblage avec pGBKT7/AICD. Nous avons suivi l’apparition des colonies.\nTableau 19 Les colonies obtenues sur pétris -TLHA après le criblage de la librairie d’ADNc\nColonies obtenues sur pétris -TLHA après «mating»\nCriblage avec le plasmide:\nÉtant donné que les colonies ont poussé sur le milieu très stringeant –TLHA, nous considérons que pour chaque colonie obtenue, il y a une interaction entre notre protéine d’intérêt et un fragment d’ADNc de la librairie. Pour confirmer cette interaction, nous avons étalé chacune des colonies obtenues sur de nouveaux pétris sélectifs –TLHA dans le but d’effectuer un test β-Gal. La colonie AICD no.24 n’a pas poussé lorsque étalée de nouveau sur un pétris –TLHA, donc nous avons maintenant 23 colonies.\nAinsi, nous avons effectué le test β-Gal pour chacune des colonies et nos résultats (figure 14) se sont avérés positifs. En effet, toutes les colonies testées sont teintées en bleues. Pour qu’une colonie devienne bleue, il doit nécessairement avoir une interaction entre notre protéine d’intérêt et un fragment d’ADNc de la librairie. En effet, cette interaction est nécessaire à l’activation de la réponse de Gal-4 qui permet la transcription du gène rapporteur LacZ . Ce gène code pour la β-galactosidase qui dégrade le substrat chromogène X-Gal utilisé lors du test β-Gal ce qui donnera la couleur bleue caractéristique. Nous pouvons remarquer diverses variantes de bleu corrèlant avec le degré d’interaction du clone avec notre protéine d’intérêt. Nous considérons que le clone interagit fortement avec notre protéine d’intérêt lorsque la couleur se rapproche de celle obtenue pour le contrôle positif (figure 14, c). Les plasmides utilisés comme contrôle positif, pGBKT7/p53 et pGADT7/T, sont utilisés pour leur propriété d’interagir fortement ensemble. En effet p53 interagit fortement avec l’antigène T du SV40 (Simian virus 40). Nous pouvons voir une forte interaction du contrôle positif par le test β-Gal, mais également lorsque les deux plasmides sont dans la même levure et que celle-ci est étalée sur un pétris –TLHA (tableau 17).\nNous savons maintenant que pour chaque colonie il y a un clone qui interagit avec notre protéine d’intérêt, PS1(1-132) ou AICD. Les prochaines étapes consistent à isoler le clone qui permet cette interaction. En premier lieu, nous avons extrait les plasmides des levures présents dans chacune des colonies. Par la suite, nous avons utilisé les bactéries qui possèdent l’avantage, comparativement aux levures, de n’intégrer qu’un seul plasmide. À cette étape, nous avons décidé de ne pas investir avec le clone no.9 obtenu suite au criblage par le plasmide pGBKT7/AICD, car les cultures bactériennes obtenues étaient anormales. Sur la multitude de colonies obtenues sur nos pétris sélectifs après transformation bactérienne, nous avons décidé de vérifier l’ADN plasmidique de 4 colonies, c’est-à-dire de déterminer les profils de 4 clones qui proviennent de la même colonie isolée au départ après «mating».\nFigure 14 Tests β-Gal effectué sur tous les clones obtenus sur pétris -TLHA après le criblage de la librairie d’ADNc de cerveau embryonnaire humain avec pGBKT7/AICD ou pGBKT7/PS1(1-132). (A) Tests β-Gal des clones 1 à 23 obtenus après criblage avec pGBKT7/AICD. (B) Tests β-Gal des clones 1 à 14 obtenus après criblage avec pGBKT7/PS1 (1-132). Le contrôle positif (c): le vecteur pGBKT7/p53 et pGADT7/T.\nEn sachant que les fragments d’ADNc de la librairie ont été clonés dans le vecteur pACT2 aux sites de restriction EcoR1 et Xho1, nous avons effectué une digestion enzymatique avec ces enzymes de restriction pour déterminer le profil de chacun des clones. En analysant les résultats obtenus sur gel d’agarose, nous avons conclu que pour chacune des colonies obtenues après «mating» il n’existe qu’un profil pour les 4 clones vérifiés. La seule exception est le clone no.9 obtenu suite au criblage avec pGBKT7/PS1(1-132), nous obtenons deux profils caractéristiques. Pour le profil des 23 clones obtenus suite au criblage de pGBKT7/AICD, nous obtenons pour chacun des clones (figure 15) une bande commune à 8100pb qui représente le vecteur pACT2 et des bandes de différentes hauteurs. Il est en de même pour le profil des 14 clones obtenus (figure 16) suite au criblage de pGBKT7/PS1(1-132) où nous retrouvons la bande commune à 8100pb et des bandes de différentes hauteurs.\nFigure 15 Profils sur gel d’agarose des clones 1 à 23 suite au criblage avec pGBKT7/AICD. Chaque clone a été digéré avec EcoRI et XhoI. La bande à 8,1Kb représente le vecteur pACT2. (A) Profils des clones 1 à 12. (B) Profils des clones 13 à 23. Les flèches indiquent les clones qui ont été séquencés.\nFigure 16 Profils sur gel d’agarose des clones 1 à 14 suite au criblage avec pGBKT7/PS1(1-132). Chaque clone a été digéré avec EcoRI et XhoI. La bande à 8,1Kb représente le vecteur pACT2. (A) Profils des clones 1 à 10. (B) Profils des clones 11 à 14. Les flèches indiquent les clones qui ont été séquencés.\nParmi les clones obtenus, nous avons décidé de séquencer certain d’entre eux (pointés par une flèche à la figure 15 et 16). Les clones qui n’ont pas été séquencés représentaient le même profil d’un clone qui a été séquencé. L’analyse sommaire des clones séquencés nous permet d’identifier des régions d’homologie entre nos clones et des gènes codant pour des protéines connues ou inconnues (tableau 20). L’analyse de la séquence du clone no.12 obtenu après le criblage avec pGBKT7/AICD, nous indique que ce clone est en fait la protéine FE-65. La protéine FE-65 est connu pour interagir avec AICD en lui permettant de transloquer au noyau (De Strooper and Annaert 2000) (Cao and Sudhof 2001). Ce résultat nous indique que le criblage a été efficace car nous avons recruté une protéine connue qui interagit avec AICD.\nTableau 20 L’analyse sommaire des clones séquencés\nDe tous les clones obtenus nous nous sommes particulièrement intéressés au clone no.15 dont la séquence est homologue à la séquence de la protéine KBP (KyoT Binding Protein) qui lie la protéine KyoT dans la voie de signalisation de Notch (Taniguchi, Furukawa et al. 1998). Ceci est très intéressant car nous pourrions être en mesure d’établir un lien entre la voie de signalisation de Notch et d’APP. Dès lors, nous voulons confirmer l’interaction entre le clone 15 et AICD en utilisant la méthode d’immunoprécipitation. Jusqu’à maintenant seulement 2 essais non concluants ont été effectués pour vérifier l’interaction du clone 15 avec AICD. En ce qui concerne les autres clones obtenus, il pourrait s’avérer très intéressant de poursuivre l’analyse et ainsi pouvoir émettre des hypothèses sur le rôle d’AICD au noyau ou d’élaborer sur le rôle de PS1 dans les diverses voies de signalisation.\nChapitre 2 Matériel et méthodes Conclusion


Jean-Michel – Entre Marne et Forêts\nPublié le 12 mars 2022 19 mars 2022\nContinuer la lecture de « Pour moi ce sera Emmanuel Macron. »\n2022 : an 1 du mandat municipal ?\nLes vœux 2022 ont été placés une fois encore sous le signe de la virtualité et de la distanciation sociale du fait d’un COVID qui nous accompagne depuis les élections municipales. Ce mandat ne ressemble décidément à aucun autre.\nRares sont les événements au niveau planétaire, hormis les conflits mondiaux évidemment, qui auront eu autant d’impact sur nos vies quotidiennes ou collectives, comme sur la perception des uns et des autres de repères tutélaires qui balisaient et jalonnaient jusque là nos existences respectives, encadrant quelque peu nos conceptions de la société et priorités de vie. Demain ne sera décidément plus comme hier.\nPour un Maire, élu local de proximité par nature, cette altération durable du lien et des interactions sociales provoque un sentiment compréhensible de manque doublé inévitablement de frustration … Le temps file, file, et le contexte sanitaire perturbe et contrarie considérablement les projets portés pour nos territoires afin de bâtir, construire, proposer, réaliser …\nIl faut cependant savoir raison garder, tant ces derniers mois se sont passés en mode actif pour ce qui nous concerne. Les élus locaux n’ont pas failli, loin s’en faut. Ils n’ont pas donné dans le spectaculaire certes, mais dans l’utile, voir l’indispensable. Présents au quotidien sur le terrain, agissant par petites touches de pinceaux successives, plus impressionnistes que pointillistes, afin de répondre aux aléas et priorités de l’instant. Leur action lorsque l’on l’analyse avec un minimum de distanciation prend tout son sens, tant elle a grandement contribué à la résilience de territoires qui ont pu ainsi répondre présents à l’adversité et incertitudes de l’époque.\nCette crise planétaire a souligné surtout l’importance d’être solidaires, collaboratifs, d’impulser des dynamiques et solidarités de proximité. Elle a démontré l’intérêt pour le pays de préserver la capacité d’action des communes et acteurs de terrain, afin qu’ils soient en position d’alimenter la capillarité qui irrigue nos territoires et nourrit leurs métabolismes urbains, ensembles complexes et fragiles s’il en est, afin d’éviter qu’ils ne dépérissent. Les modèles XXL, sans racine, désincarnés et lointains considérés autrefois comme l’alpha et oméga de l’organisation territoriale et de la gouvernance publique ont démontré toutes leurs limites durant la crise, agissant comme un véritable crash test.\nL’utilité des « premiers de corvée », hier invisibles et totalement hors des radars de nos élites, s’est imposé à tous et à chacun, leur action concrète, constante et résolue a permis au pays de tenir et de fonctionner au quotidien et de préserver ainsi sa capacité à rebondir après l’orage et le vent mauvais.\nLa place de l’État et de ses services, dont nous avons subi trop fréquemment les postures caricaturales passées et dépassées (la France d’aujourd’hui n’est plus celle de Napoléon) se doit d’être reconsidérée.\nLe problème n’est pas « plus ou moins d’État », comme certains veulent nous le faire croire, (c’est la période), tant nos territoires ont en grand besoin, mais « mieux » d’état. Il faut que ce dernier soit agile, proche, réactif, créatif, collaboratif, à l’écoute du terrain, en résonance de ses besoins et de priorités aussi essentielles que la santé, l’éducation, les solidarités …\nLa crise sanitaire constitue un catalyseur et un accélérateur des transitions que traverse un monde globalisé qui n’arrête pas lui d’avancer. Elle illustre la rupture entre deux millénaires se chevauchant, qui hier encore se tutoyaient et se confondaient .\nElle a surtout permis de rappeler la primauté de la vie sur l’économie, de l’essentiel face à l’insignifiant ou l’accessoire, et dévoiler des qualités insoupçonnées chez nos concitoyens. Sous l’orage ils n’ont ni flanché, ni craqué, se sont montrés solidaires, fait violence parfois pour accepter avec discipline les contraintes successives qui s’imposaient face aux aléas, tant le doute a remplacé les certitudes d’hier, ce qui au final n’est pas si mal, mieux vaut douter parfois … Il faut le souligner, le rappeler et le marteler, si nécessaire, les français dans leur immense majorité ont su faire « société » et bloc lorsqu’il le fallait.\n2022, je l’espère sera l’année du rebond et constituera également pour les élus locaux de 2020, aussi incroyable que cela puisse paraitre, mais les faits sont têtus, la première vraie année de ce mandat municipal.\nAvec à la clé un formidable défi à relever : renouer avec la vie …\nIl nous faut, et plus que jamais, nous mobiliser et agir, agir ensemble, pour retisser les liens distendus ou brisés, réparer les terribles dégâts causés par ces mois chaotiques, « prendre sens dans l’insensé », auprès des naufragés, des plus touchés, des personnes isolés, des seniors à reconnecter au lien social et à tous ces jeunes désorientés qu’il faut de nouveau réenchanter, tant ils représentent, incarnent et sont l’avenir …\nBelle feuille de route au final, non ?


La Rolex Milgauss\nSujet: La Rolex Milgauss Dim 10 Aoû - 7:30\nOyster Perpetual Milgauss Réf :116400\nLorsqu’on ôte la surboîte en carton de couleur anis, on découvre la montre dans une boîte verte aux dimensions très réduites par rapport aux gigantesques boîtes de la concurrence :\nIci ni bois précieux, ni tiroir supplémentaire, ni cd, … juste le minimum vital :\nC’est un beau morceau de fonderie en acier poli miroir et sa taille est de 40 mm pour une hauteur de 13 mm.\nLa large lunette est également polie, la couronne vissée n’a qu’un trait sous le logo Rolex et est donc de type «Twinlock».\nMais avec 7 mm de diamètre elle est plus grande que les couronnes de ce type, ce qui facilite la préhension.\nLa Milgauss est donc étanche jusqu’à 100 m\nLe verre saphir plat dépasse légèrement du boîtier, mais est biseauté ce qui devrait protéger un peu d’éventuels coups.\nCe verre n’est malheureusement pas traité anti-reflets. Rolex n’a pas encore évolué sur ce point.\nLa lisibilité est cependant très bonne, il s’agit, avec l’Explorer II fond blanc, du modèle Rolex le plus lisible que j’ai eu jusqu’à présent entre les mains.\nIl est blanc avec une minuterie de couleur orange faisant alterner des graduations et des chiffres arabes de 5 à 60.\nLes 11 indices jaunes orangés sont en or blanc (à 12 h on retrouve la couronne Rolex), ceux situés à 3, 6 et 9 h sont de taille plus importante que les 7 autres.\nIls son traités au Superluminova et prennent une teinte bleutée la nuit, alors que les aiguilles prennent une teinte verte.\nLa lisibilité nocturne baisse malheureusement assez rapidement au fil des heures.\nL’aiguille la plus marquante est celle des secondes en forme d’éclair.\nSur le réhaut sont gravés le numéro de série et les inscriptions Rolex, Rolex, …\nLorsque l’on dévisse le fond, on ne découvre en fait pas le mouvement, mais un caisson anti-magnétique.\nLe mouvement se trouve à l’intérieur de ce container à fond vissé, la seule ouverture côté cadran est celle de l’axe des aiguilles et latéralement celle de l’axe de la couronne.\nRolex a fait volontairement l’impasse sur la date qui aurait demandée une ouverture supplémentaire.\nLa particularité de ce modèle est en effet d’être protégé contre les champs magnétiques jusqu’à mille Gauss, soit 0,1 Tesla ou 80 000 A/m.\nHormis un appareil à imagerie par résonance nucléaire (IRM), la montre ne craint rien ni personne.\nIl faut donc dévisser un deuxième couvercle fait d’un alliage d’acier et de cobalt ferromagnétique pour découvrir le calibre de manufacture 3131 à remontage automatique.\nL’on aperçoit en bleu le nouveau spiral Parachrom avec une courbe Breguet développé et fabriqué par Rolex, qui est fait d’un alliage au niobium-zirconium anti-magnétique et qui est de plus très résistant aux chocs.\nL'échappement est muni d'une roue d'ancre réalisée dans un nouveau matériau en nickel phosphore également paramagnétique.\nLe reste du mouvement est connu et éprouvé, la décoration est soignée : rotor soleillé, anglage, ponts décorés, têtes de vis soigneusement polies, …\nAvec un retard de 3 à 4 secondes par jour, c’est tout de même un peu décevant pour une Rolex !\nContrairement au boîtier entièrement poli, le bracelet Oysterclasp est composé de maillons latéraux satinés et de maillons centraux polis.\nIl est superbement fini et on est à cent lieux de celui de ma 14060.\nL’ouverture de la boucle est assez ingénieux : une petite traction avec l’ongle sur la partie avant qui intègre un système à levier et la boucle s’ouvre.\nIl est peut-être un peu plat pour une montre de ce gabarit, mais il se porte agréablement.\nAu poignet de sa propriétaire :\nIl est de 4 760 € ce qui peut paraître élevé pour une simple 3 aiguilles, mais il faut avouer que, contrairement à IWC avec sa nouvelle Ingénieur Vintage, Rolex est allé jusqu’au bout dans la réalisation d’une montre avec des propriétés anti-magnétiques.\nA moins de travailler dans un milieu à risques, on peut naturellement trouver inutile l’utilité d’une telle mise en œuvre, mais bon …\nLa Milgauss n’est pas identifiable au premier coup d’œil comme une Rolex.\nSon look a quelque chose de neuf, de différent, de plus fun.\nAvec sa grande ouverture de cadran elle a une belle présence au poignet et offre une bonne lisibilité.\nC’est clair qu’il s’agit d’un modèle qu’on aime ou qu’on déteste, mais c’est un design auquel on peut finir par s’habituer.\nCe n’est pas ma montre, ce n’est pas mon choix, mais celui de madame et je le respecte …


Le Mée-sur-Seine. Polémique autour d'accusations de corruption sur l'attribution de logements | La République de Seine et Marne\nLe Mée-sur-Seine. Polémique autour d’accusations de corruption sur l’attribution de logements\nLors de l'élection du maire du Mée-sur-Seine, des propos tenus par Robert Samyn, doyen de la séance et élu d'opposition ont semé le trouble, concernant l'attribution de logements.\nPublié le 3 Juin 20 à 19:02\nLors de l’élection de Franck Vernin (au 1er plan), Robert Samyn (au centre) a évoqué des malversations présumées quant à l’attribution de logements (©JVC/La Rep 77)\nLes propos ne sont pas passés inaperçus, lors de l’élection du maire du Mée-sur-Seine. D’autant qu’ils étaient retransmis en direct, bien que la séance soit à huis clos. Robert Samyn, en tant que doyen de l’assemblée a présidé les débats, samedi 23 mai, lors du conseil municipal d’installation de la nouvelle majorité. Dans son propos liminaire, il a, en filigrane, évoqué des accusations de corruption quant à l’attribution de logements dans la commune.\nLire aussi : Seine-et-Marne. Franck Vernin réélu maire du Mée-sur-Seine\n« Je dois me faire l’écho de personnes ou de familles en situation difficile, a-t-il débuté. J’aurais préféré ne jamais entendre, que certains puissent imaginer, que des attributions de logements pourraient être consenties contre compensation ou contre présentation de la carte électorale tamponnée. » Pis, a-t-il poursuivi, « j’aurais préféré ne jamais entendre quiconque, croire qu’il puisse exister des pratiques de nature douteuse et, je cite, ‘comme en Afrique’ m’a-t-on précisé. »\nUne plainte à venir ?\nContacté en marge de la séance, l’élu persiste et signe. « Ce n’est pas ma première campagne et je suis toujours prudent sur les rumeurs, mais la répétition de tels propos dans différents quartiers pose question », souligne-t-il. Interrogé sur la possibilité d’un dépôt de plainte, il indique toutefois « ne pas avoir de témoignages concrets » et ne « viser personne en particulier. »\nLors de la séance, Franck Vernin avait rétorqué savoir « faire la différence entre les rumeurs et la réalité. » Sollicité après la séance, le nouveau maire indique être « très désagréablement surpris de cette sortie verbale, surtout de la part de Robert Samyn. Je suis attristé, car il est allé trop loin et cela touche les personnes qui travaillent dans ce service. »\nLire aussi : Le Mée-sur-Seine. Le maire Franck Vernin décore Robert Samyn, un membre de l’opposition\n« Faux, rétorque Robert Samyn. Je n’accuse personne. La polémique n’a jamais été dans mes habitudes, je voulais seulement attirer l’attention du nouveau maire afin qu’il puisse se pencher sur la question, en toute transparence. » De son côté, Franck Vernin indique néanmoins réfléchir à la possibilité d’une plainte pour diffamation.\nSelon l’édile, « les commissions d’attribution de logements sont transparentes dans la mesure où elles sont constituées de parties indépendantes : bailleurs, associations, représentants de l’État etc. » Et d’ajouter : « Quand on porte de telles accusations il faut des preuves. »\nMais pour Nathalie Dauvergne-Jovin, candidate face à Franck Vernin lors des municipales et désormais cheffe de file de l’opposition, « cette remontée du terrain est aussi un moyen de montrer que nous serons attentifs durant ce mandat, notamment sur les questions de transparence. » Et de conclure : « Cela fait des années que l’on demande les critères d’attribution des logements sociaux du contingent mairie, cette tribune est peut-être le moyen de les obtenir car jusqu’alors, nous ne les avons jamais reçus. »\nSeine-et-Marne. Corps découvert dans un tonneau : la victime a été étranglée et poignardée\nSeine-et-Marne. Lors d'une rixe à Melun, un SDF asperge d'essence un autre et menace de le brûler\nSeine-et-Marne. Des jeunes filles en difficulté lors d'une baignade (interdite) dans le Loing


Petit Rangement Boite Vakka Haute | Iittala - Silvera Eshop\nPetit rangement Boite VAKKA haute Iittala\nVakka est une série de grandes boites en contreplaqué, créée par Elina et Klaus Aalto pour Iittala. Le design de ces objets polyvalents nous rappe... En savoir plus\nDimensions L 45cm x P 30cm x H 23cm\nVakka est une série de grandes boites en contreplaqué, créée par Elina et Klaus Aalto pour Iittala. Le design de ces objets polyvalents nous rappelle que le rangement, qui est une problématique essentielle dans tous les intérieurs, peut aussi être un élément esthétique à part entière. Les boites Vakka, disponibles en deux hauteurs, s'intègrent facilement dans toutes pièces, de la chambre au bureau, et peuvent être empilées les unes sur les autres, créant ainsi des petites tables d'appoint très pratiques.\nDimensions : L 45cm x P 30cm x H 23cm\nPour plus d'informations sur l'article Boite VAKKA haute, référence: IIT02821, veuillez remplir le formulaire ci-dessous :


Historique – Centre scolaire Saint-Stanislas – Mons\n1840 : les Pères Jean-Baptiste L’Hoir et Louis Blanquart arrivent à Mons, rue des Ursulines (aujourd’hui rue Fétis).\n1845 : achat d’une aile de l’ancien hôtel du Val de Beaulieu, rue des Dominicains. Constructions diverses à front de la rue.\n7 octobre 1851 : ouverture du Collège St-Stanislas. 18 élèves en 6 ème Latine et 10 en Préparatoire. n\n1851-1879 : construction de plusieurs bâtiments, dont celui des arcades, au fond de la grande cour, et l’église, consacrée en 1869.\n1870 : le Collège compte 240 élèves, dont 109 pensionnaires.\n1893 : incendie du bâtiment des arcades. Reconstruction et agrandissement (inauguration en 1895)\n1897 : création de l’Association des Anciens.\n1907 : achat de l’hôtel Rouwez (aile gauche de l’ancien hôtel du Val de Beaulieu). Aménagement du réfectoire dans l’ancien salon Empire.\n1911 : 422 élèves au Collège, dont 210 en Latin-Grec, 125 en Modernes, 16 en Première Scientifique et 71 en Préparatoires.\n1912 : les élèves du Père Honnay présentent « Achilleus », d’après Homère.\n1914-1918 : le Collège est réquisitionné à plusieurs reprises. Vingt élèves ou anciens élèves meurent dès le début de la guerre.\n1919 : le Père Chassot crée au Collège la première troupe scoute du Hainaut\n1929 : installation de la TSF et de téléphones intérieurs.\n1930 : une brochure de « propagande » signale que les cours de gymnastique sont obligatoires, ceux d’anglais, d’allemand et de dessin facultatifs. On peut prendre des leçons particulières (payantes) de musique et d’escrime. Le pensionnat revient à 5.600 francs l’an et le minerval d’un externe à 200 francs.\n1932 : prolongation du bâtiment des arcades en direction du jardin des Pères. Aménagement de la salle des Missions (dite aussi salle d’Académie).\n1940 : le bombardement allemand du 14 mai ne touche guère le Collège, mais au Sacré-Cœur voisin plusieurs religieuses sont tuées.\n1944 : le bombardement allié du 10 mai détruit une partie du bâtiment des classes et la salle des fêtes.\n1947-1950 : reconstruction du bâtiment des classes et des pensionnaires, construction d’une salle de gymnastique.\nDu centième au 125ème anniversaire\n1951 : fêtes du centenaire du Collège, du 1 er au 3 juin. Le 2, visite du Prince Baudouin, alors Prince Royal. Représentation de « Jules César » au Théâtre Royal de Mons.\n1959 : première pièce annuelle des Rhétos : « Œdipe-Roi » de Sophocle.\n1961 : création de la Scientifique Spéciale.\n1963 : début des voyages de Rhétos (en Italie).\n1965 : les sections Latin-Math et Latin-Sciences s’ouvrent.\n1966-1967 : rénovation complète de l’église.\n1967 : création de l’Association des Parents.\n1968-1979 : démolition et reconstruction de l’ensemble du bâtiment de la rue des Dominicains et de l’église. Construction de la petite résidence et du « Trianon » attenant à la nouvelle église. Construction de la salle omnisports à l’emplacement du préau de la seconde cour.\n1968 : des rhétoriciennes du Sacré-Cœur et des Ursulines participent pour la première fois à la pièce des Rhétos, « Le Marchand de Venise » de Shakespeare.\n1969 : les premières étudiantes font leur apparition en Scientifique Spéciale.\n1970 : renaissance des Modernes, prolongées ensuite par les Economiques. Le Collège compte 390 élèves.\n1971 : les deux premiers professeurs féminins, Claudine Demols-Dewulf et Fernanda Bonafini, enseignent au Collège. Pour la première fois, le titulariat d’une classe de Rhétorique est confié à un laïc, Etienne Vandendorpe.\n1974 : suppression de l’internat.\n1976 : le Collège a 125 ans.\n1978 : le Collège compte 497 élèves.\n1979 : le Collège devient mixte : arrivée des premières filles en humanités. Le Pouvoir Organisateur, jusque-là composé des directeurs des sept collèges jésuites de Belgique francophone, cède le relais à un P.O. « local », avec des professeurs, des parents, un Ancien, un représentant extérieur et huit Jésuites.\n1980 : débuts de l’enseignement rénové. Un laïc, Raymond Hennebicq, devient pour la première fois préfet de discipline.\n1982 : nomination du premier directeur laïc du Collège, Jean-Pierre Dubuquoy. Le Père Pattyn, Recteur, dirige désormais uniquement la communauté jésuite.\n1985 : sortie de la première promotion mixte de Rhétos, qui est aussi la dernière promotion de l’enseignement traditionnel. Fusion avec l’Ecole Professionnelle de Ghlin. Nomination de Raymond Hennebicq comme sous-directeur et de Pierre Noë comme préfet des études.\n1992 : retraite de Raymond Hennebicq. Pierre Noë devient sous-directeur et préfet du 1 er degré. Anne Roels est nommée préfète du 2 ème degré. Pour la première fois, les Rhétos dépassent le chiffre 100 : ils sont 104 à terminer leurs études.\n1993 : la Compagnie de Jésus renonce à sa majorité absolue au sein du Pouvoir Organisateur : seuls quatre Jésuites demeurent au P.O.\n1994 : fusion des Pouvoirs Organisateurs du Centre Scolaire St-Stanislas et de l’Externat St-Joseph.\n1995 : le Collège dépasse les 800 élèves.\n1996 : l’Ecole Professionnelle de Ghlin quitte le Collège et rejoint l’Institut Ste-Marie à Quiévrain.\n2000 : mort de Pierre Noë. Anne Roels est nommée sous-directrice et préfète du cycle supérieur, Thierry Héroufosse, préfet du cycle inférieur. Henri Delporte est le premier laïc à devenir président du Pouvoir Organisateur.\n2001-2002 : le Collège St-Stanislas fête son 150 ème anniversaire.\n2002 : la communauté jésuite quitte la rue des Dominicains. A partir de la rentrée de septembre 2002, le centre scolaire occupe progressivement l’ensemble des locaux.\n2006 : Jean-Pierre Dubuquoy prend sa retraite. Jean-Philippe Mogenet lui succède.\n2008 : retraite d’Anne Roels. Vincent Vancoppenolle prend la succession de Jean-Philippe Mogenet, qui devient inspecteur de langues anciennes. Thierry Héroufosse devient sous-directeur.\n2009 : Pierre Miche succède à Henri Delporte à la présidence du Pouvoir Organisateur.\n2012 : début des travaux de rénovation du bâtiment « Arcades ».\n2012 (septembre) : début de l’enseignement en immersion (anglais, au deuxième degré).\n2015 : Frédéric Moens devient président du Pouvoir Organisateur\n2015 : inauguration du collège rénové\n2016 : départ à la retraite de Vincent Vancoppenolle. Thierry Héroufosse devient directeur; Vinciane Jacques lui succède à la sous-direction.


Service social Ile de France - Assistance sociale pour vos démarches\nService social Ile de France\nA l’écoute de votre situation et de vos problèmes, le service social Ile de France est présent sur tout le territoire. Une accueil physique dans tous les départements de la région : Paris (75) – Seine-et-Marne (77) – Yvelines (78) – Essonne (91) – Hauts-de-Seine (92) – Seine-Saint-Denis (93) – Val-de-Marne (94) – Val-d’Oise (95).\nDifférentes structures impulsent une politique sociale qui ne laisse personne de coté. Qui lutte au quotidien contre toutes les formes d’exclusion. Mais aussi qui vous aide dans vos démarches.\nPour cela, les mairies des communes sont les premières concernées. Des assistantes sociales de proximité sont à votre service. Avec l’aide des centres communaux d’action sociale CCAS. Et des centres intercommunaux d’action sociale CIAS pour les plus petites communes.\nAccompagnement personnalisée dans vos démarches sociales\nCes acteurs viennent en soutien à la population fragile. A savoir les seniors, les personnes en situation de handicap, les personnes en situation d’exclusion financière. Mais aussi les familles qui en ont besoin. Et les étudiants sans ressource.\nDifférents dispositifs peuvent vous aider à mieux vivre au quotidien. Des aides financières et techniques existent. En complément des placements en EHPAD ou en résidence sociale.\nPour obtenir un accompagnement personnalisée du service social Ile de France, vous êtes donc invité à prendre rendez-vous. Cela afin d’être reçu par l’assistance sociale de votre ville. Vous trouverez ainsi l’ensemble des coordonnées et les informations pratiques ci-dessous.\nA noter que certaines aides sont directement octroyés par des organismes spécialisés. C’est le cas par exemple de la MDPH. Qui depuis la loi sur le handicap de février 2005 devient le guichet unique du handicap en France.\nService social La Garenne-Colombes\nInformations pratiques du service social La Garenne-Colombes. Comment contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS? Et quelles aides demander à l’assistante sociale de ma commune.\nService social Fosses\nService social Fosses en ligne. Les coordonnées pour contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS ou l’assistante sociale de votre ville ou de votre commune.\nService social Verneuil-Sur-Seine\nInformations pratiques du service social Verneuil-Sur-Seine. Comment contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS? Et quelles aides demander à l’assistante sociale de ma commune.\nService social Yerres\nInformations pratiques du service social Yerres. Comment contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS? Et quelles aides demander à l’assistante sociale de ma commune.\nService social Gennevilliers\nService social Gennevilliers en ligne. Les coordonnées pour contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS ou l’assistante sociale de votre ville ou de votre commune.\nService social Épinay-Sur-Seine\nService social Épinay-Sur-Seine en ligne. Les coordonnées pour contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS ou l’assistante sociale de votre ville ou de votre commune.\nService social Nemours\nService social Nemours en ligne. Les coordonnées pour contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS ou l’assistante sociale de votre ville ou de votre commune.\nService social Villetaneuse\nAssistance et service social Villetaneuse. Informations pratiques pour contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS ou l’assistante sociale de votre commune ou de votre arrondissement.\nService social Arnouville-Lès-Gonesse\nAssistance et service social Arnouville-Lès-Gonesse. Informations pratiques pour contacter et prendre rendez-vous avec le CCAS ou l’assistante sociale de votre commune ou de votre arrondissement.


26.04.03 - Irak : Non à un Etat théocratique.\nLes chrétiens du Moyen Orient sont soucieux d'une situation qui risque de les rejeter de leur pays. Ils souhaitent que les apprentis-sorciers de l'Occident s'en inquiètent.\n" Alors que les moyens d'information ont décrit la manifestation des chiites à Karbala comme un symbole de victoire, de démocratie et de liberté, nous, chrétiens irakiens, sommes préoccupés pour l'avenir de la liberté religieuse dans notre Pays ", déclare à l'Agence Fides le P. Nizar Seeman, prêtre syriaque du diocèse de Ninive.\nIl ajoute : " Les journalistes qui transmettaient en direct la manifestation n'avaient pas la pleine conscience de la réalité, et de ce que signifie une manifestation de ce genre : nous, chrétiens d'Irak, nous regardons avec appréhension ce qui se passe. Non parce que nous sommes contre la liberté religieuse et contre la liberté de culte, que nous voulons voir figurer comme fondement du nouvel Irak, mais parce que nous connaissons bien la mentalité et la culture des chiites, et le but de ce type de manifestation religieuse : construire un Irak théocratique fondé sur la loi islamique. "\n..." Le risque est d'être contraints de choisir entre continuer à vivre en Irak, réduits à être des citoyens de catégorie B, privés de droits, ou quitter la terre de nos pères."\n..." Je regrette que la manifestation des chiites ait été retransmise en même temps que la célébration pascale des chrétiens d'Irak, sans montrer les deux réalités différentes : alors que les chrétiens priaient pour la paix et pour la vraie liberté et la vraie démocratie, nos frères chiites lançaient des slogans en faveur d'un Etat islamique (qui ne respecte aucune autre religion) et d'une nouvelle guerre."\n..." Je souhaite que le monde civilisé s'aperçoive rapidement de ce danger et continue à travailler pour former un Irak laïc et démocratique, qui respecte toutes les minorités " (source : fides)


Mohamed - Marseille 14e , : Elève ingénieur propose des cours de soutien en maths physique et informatique sur Marseille\nSuperprofCours particuliersCours de mathscours de physique - chimiecours de physiqueElève ingénieur propose des cours de soutien en maths physique et informatique sur MarseilleÉlève ingénieur généraliste. J'ai très bien réussis mes classe préparatoire en Maths/Physique.\nJ'ai été admis aux Mines et à Centrale qui sont très connus par le niveau des concours écrits et oraux.\nMa façon d'expliquer est depuis toujours d'essayer d'aller pas à pas avec mes interlocuteurs jusqu'à ce qu'ils acquièrent une méthodologie et finalement qu'ils soient autonomes.\nJ'enseigne les maths, la physique - chimie, la physique. Pour les niveaux primaire, secondaire, , , , , supérieur, formation pour adultes, débutant, intermédiaire.\nJ'avait depuis très longtemps l'habitude d'être sollicité par plusieurs personnes après les cours pour leurs expliquer les points qui trouvaient incompréhensibles. Effectivement la façon qu'avec laquelle je transmets le message est exactement celle qui m'avait permis de comprendre les informations pendant le cours.\nJ'ai été sélectionner pour faire un double diplôme en Allemagne.\nMaintenant élève ingénieur centralien en deuxième année des études d’ingénierie généraliste dans une des plus grandes école en France.\nJ'ai réussis mes deux ans de prépa(MP). J'ai été admis en 4 grands concours.\nJ'ai obtenu mes bac en sciences mathématiques avec une mention très bien.\nElus pour représenter mon lycée aux olympiades des mathématiques.


Ever-Pretty Robe de Soirée Longue Femme avec Ruchés en Mousseline de Soie Classique 09016 - Personal Gifter\nAccueilFêtesIdée cadeau mariageEver-Pretty Robe de Soirée Longue Femme avec Ruchés en Mousseline de Soie Classique 09016\nAmazon.fr Prix: 32,86€ (Prix constaté le 20/04/2021 13:13 PST- Details)\nS’il vous plaît consulter notre TAILLES parmi les principales images du produit, PAS taille lien d’information. Il est de taille au Royaume-Uni lorsque vous passez commande.\nCette robe maxi formelle est entièrement doublée. Il est rembourré dans le buste de soutien-gorge d’usure en option. Une fermeture éclair dissimulée le dos assure la robe en place. Cette robe n’est pas extensible. Sur la plupart des femmes cette robe sera longueur de plancher.\nUne silhouette classique maxi est super polyvalent et peut être porté pour presque tous les occassion! Ces dessins sont excellents pour les mariages, les fêtes et toute autre sortie officielle!\nClassique col en V Taille Empire élégant longue robes de demoiselle d’honneur V manches longues col formel Maxi Dress


Jancarthier rajoute 90 Mie au volume d'affaires du GIE Manor\nle GIE ne sera pas présent à Top Resa\nRédigé par Jean DA LUZ le Lundi 20 Juillet 2009\nLe Groupe Jancarthier que contrôle désormais Jo Slama, vient d'apporter 90 Mie de volume d'affaires tourisme au GIE Manor avec ses 54 agences. En attendant Impact Voyages (7 points de vente), dont il est aussi propriétaire ?\n'' Notre réseau ne sera pas présent à l'IFTM Top Resa en septembre à Paris, annonce Jean Korcia. Nous préférons rémunérer davantage nos adhérents plutôt que dépenser 50 000 euros...''\nJean Korcia est un adepte de la politique des petits pas.\nL'homme tisse sa toile en "bon père de famille" comme il aime à se définir mais n'en nourrit pas moins de solides ambitions.\nCar si Manor compte moins de points de vente (65 licences) que les autres réseaux volontaires, il n'en est pas moins important avec ses 1,4 milliard de volume d'affaires réalisés en 2008.\nLa dernière recrue en date n'est pas venue les mains vides.\nAprès avoir pris le contrôle de Jancarthier Voyages, Jo Slama qui avait adhéré au GIE Manor pour la billetterie, lui confie aussi son volume d'affaires tourisme, le total représentant plus de 90 Mie (50 de tourisme et 40 de billetterie) pour ses 54 points de vente.\nNouvelle Commission pour des partenariats éventuels\nIl a aussi bon espoir d'accueillir, à terme, les 7 points de vente Impact Voyages qui appartient en propre à Jo Slama, aujourd'hui sous l'enseigne TourCom.\nCe dernier prend d'ailleurs du gallon dans le nouvel organigramme de Manor qui en a fait le co-président de la Commission Tourisme avec Lotfi Tazzi.\nAu niveau de la composition des Commissions, pas de changement au Transport ni à la Technologie où Renaud Cluis, fidèle au poste, se verra tout de même adjoindre le renfort de 2 délégués.\nEn revanche, une nouvelle Commission ad hoc a été créée et sera présidée par Jean-Michel Rath et Pénélope Rambaud.\nMission : étudier les opportunités de partenariats éventuels avec d'autres réseaux même si Thomas Cook et American Express, respectivement dans le tourisme et la billetterie, semblent tenir la corde ?\n"La décision en sera prise avant la fin de l'année, annonce le président. Peut-être lors des prochaines Journées des Dirigeants qui se tiendront à Florence du 8 au 11 novembre sur le thème "quel modèle pour demain ?".\nUn thème en rapport avec la nouvelle loi de réforme sur le tourisme, bien entendu, mais aussi sur l'ensemble des bouleversements survenus au cours des derniers mois.\n"Nous n'irons pas à l'IFT Top Resa..."\n"Notre réseau ne sera pas présent à l'IFTM Top Resa en septembre à Paris, annonce Jean Korcia. Nous préférons rémunérer davantage nos adhérents plutôt que dépenser 50 000 euros dans une manifestation dont nous n'attendons pas de grand impact en ce qui concerne nos métiers. Nous sommes au stade de l'observation par rapport à ce salon et attendrons l'année prochaine pour nous prononcer..."\nTags : jancarthier, jean korcia, jo slama, manor\n1.Posté par Slama Jo le 21/07/2009 12:38 | Alerter\nJe tiens à vous apporter quelques precisions.\nTout d'abord, je dirige Jancarthier avec mon neveu, Philippe.\nNous sommes les Deux et Unique Actionnaires du Groupe Jancarthier.\nEn 2009, nous allons realiser 90 M€ de Volume d'affaires, 50 M€ en billeterie et 40 Me en tourisme. Nous sommes adherents de Manor et nous en sommes contents.\nLe President, Jean Korcia m'a demandé d'apporter mon experience et mon expertise à la cellule Tourisme. Celle ci presidé par Lotfi.\nConcernant Mes agences Impact Voyages, elles sont au nombre de 7 points de vente et sont adherentes de Tourcom.\nConcernant Concept Voyages, malheureusement je ne connais pas cette societe.\n2.Posté par Jean DA LUZ le 21/07/2009 13:51 | Alerter\nMerci de ces précisions. Nous avons rectifié.


Courtier pret immobilier Pontivy dans le 56 Morbihan - Sauvéo\nPourquoi faire appel aux services d'un courtier en pret immobilier à Pontivy : quelles sont les économies ?\nVoir un courtier en pret immobilier peut certainement vous appuyer pour la préparation de votre dossier de financement et la réalisation d'appréciables économies, que ce soit pour votre maison ou pour un terrain à louer. Un taux trop haut pour votre financement immobilier alourdira vos mensualités et amoindrira inutilement votre budget annuel.\nQu’est ce qu’un courtier en pret immobilier à Pontivy ?\nFaisant parti de la très surveillée famille des professionels de la banque, le courtier en pret immobilier est qualifié d' Intermédiaire en Opérations de Banque et en Services de Paiement (en acronyme IOBSP).\nA compté du 01 Janv. 2013, le courtier en prêt immobilier à Pontivy doit être détenteur d'une preuve de compétence professionnelle et être enregistré au Registre des Intermédiaires centralisé par l'ORIAS, organisme de contrôle.\nLe courtier en prêt immobilier à Pontivy fait l'intermédiaire entre l'acquéreur et la banque. Il examine pour le personne qui l'a mandaté le mode de prêt le plus adapté que ce soit pour l'achat et les ressources du client.\nPourquoi confier la négociation de son credit à un courtier en prêt immobilier à Pontivy comme Sauvéo ?\nSe faire aider d'un courtier en prêt immobilier à Pontivy comme Sauvéo vous permet un gain de temps et d'argent. En effet la personne cherchant un credit n’aura plus besoin de consulter plusieurs banques. Le courtier en pret à Pontivy peut le faire sur tout votre département du Morbihan et potentiellement toute la France. Sauvéo placera les organismes bancaires en concurrence pour obtenir le taux d’intérêt le plus avantageux.\nDe part des liens professionnels qu'il entretient avec lesbanques, le courtier en pret immobilier à Pontivy, en l'occurence Sauvéo, est a même de négocier des taux attrayant que des particuliers auraient du mal à atteindre seuls.\nVotre courtier en pret immobilier à Pontivy, alias Sauvéo, vous annonce des possibilités de crédit sur-mesure. Pour cela, Sauvéo s'applique à englober les particuliarités de son client. Le client aura besoin de lui envoyer chacun des éléments qui autoriseront un développement de sa nécessité de financement et le montage de son dossier : bénéfice, quel type de contrat de travail, couple avec enfants ou célibataire, actifs, dettes ... Tout ces points permettent au courtier en prêt immobilier à Pontivy de dire entre autres si l'acquisition est praticable mais pareillement en amont, de calculer une enveloppe budgétaire. Sauvéo pourra en plus guider le client pour l’aider à réaliser son financement.\nRémunération du courtier en prêt immobilier à Pontivy\nLe courtier en pret immobilier à Pontivy est rémunéré par la banque à l'aide d’une commission bancaire , celle-ci est indexée au montant de l'emprunt. Elle est établie selon la convention de partenariat liant le courtier en pret immobilier à Pontivy et l'antenne bancaire du Morbihan ou de la Bretagne . Cette commission peut être plafonnée.\nCette commission correspond au métier d'apporteur de client accompli par le courtier en pret à Pontivy. Ce reversement prend en compte les frais de commercialisation avancés par le courtier .\nLe courtier en prêt immobilier à Pontivy pourra être en plus rétribué par le client. Le courtier facture des frais de dossier qui correspondent au métier de conseil auprès du client.\nLe conseil du courtier en prêt immobilier à Pontivy incorpore la dispense à l'acquéreur d'éléments notamment sur le marché, la consultation de la situation budgetaire, la fabrication d’une enveloppe financière au regard des informations financières qui lui ont été fournies.\nLe courtier en pret immobilier à Pontivy va alors aller examiner le taux le plus profitable et effectuer un contrôle de différentes offres bancaires. Le choix de la banque ne s'évalue pas simplement au taux d’intérêt. Il doit en outre prendre en considération la comptabilité entre l'acquisition et la position stratégique de la banque.\nLes frais de dossier ne seront être reversés au courtier en pret immobilier à Pontivy avant le déblocage des fonds ou la régularisation de l’acte authentique.\nVotre courtier en prêt immobilier et transition énergétique à Brest, Nantes, Angers, Caen, Mans, Lanester, Lorient, Vannes, Saint-Brieuc, Ploemeur, Noyal-Pontivy, Pluméliau, Loudéac, Moréac, Baud, Locminé, Languidic, Plouay, Inzinzac-Lochrist, Pluvigner et dans toute la france.


2 Cours de management stratégique en pdf - Tifawt\nMàj le 27 mai 2021\nLe management stratégique a pour but fondamental, le développement de la réflexion « réfléchir sur des situations suppose avoir le sens d’analyse et le sens de synthèse). Le management est un processus, enchaînement de plusieurs étapes. Chacune de ces dernières nécessite des outils, ainsi chaque étape constitue une partie du plan.\nLe premier cours est un résumé précis du cours “Management stratégique” pour les étudiants de .\nLe deuxième cours a pour objectifs de :\nComprendre les fondements de base de la stratégie de l’entreprise\nPrésentation des objectifs et des niveaux de la stratégie de l’entreprise\nPrésentation de la démarche stratégique et les outils d’analyse stratégique\nLes niveaux de la stratégie :\nStratégie Corporate : Appelée aussi, stratégie d’entreprise ou stratégie globale. Elle concerne le dessin et le périmètre de l’organisation dans sa globalité et la manière dont elle ajoute de la valeur à ses différentes activités.\nStratégie Business : Appelée aussi stratégie concurrentielle ou stratégie par DAS. Elle consiste à définir les facteurs clés de succès FCS de l’entreprise dans un marché particulier.\nStratégie opérationnelle : Ou stratégie fonctionnelle. Elle est constituée par l’ensemble de choix et de décision au niveau des différents service au sein de chaque DAS. La réussite des stratégies globale et concurrentielle repose sur la réussite de ces stratégies.\nLa stratégie militaire peut être définit comme étant l’ art de faire évoluer une armée sur un terrain de combat jusqu’ au moment où elle entre en contact avec l’ ennemi : c’ est l’ organisation générale de l’ armée en position défensive ou offensive.\nLa planification stratégique est un processus qui consiste à construire un programme d’action permettant à l’entreprise de mettre en œuvre ces choix stratégique afin d’agir sur son avenir.\nTélécharger le 2 cours de management stratégique\nPremier cours de management stratégique:\nTélécharger “le cours de management stratégique”\tTéléchargé 1529 fois – 776 Ko\nDeuxième cours de MS:\nTélécharger “2 Cours de management stratégique”\tTéléchargé 242 fois – 861 Ko\nAccueil / Cours de Management / 2 Cours de management stratégique en pdf


Hotel restaurant près de Chenillé-Changé - Cristal Hôtel\nVous recherchez un hotel restaurant près de Chenillé-Changé ? L'Hôtel Cristal vous accueille toute l'année pour un séjour agréable et reposant sur les bords de Loire.\nL’Hôtel Cristal est ouvert tous les jours midi et soir. Le Chef vous propose une cuisine traditionnelle et authentique élaborée à partir de produits frais et de qualité. Découvrez une carte variée de plats faits maison. Le bar de notre hotel restaurant près de Chenillé-Changé vous sert cocktails et boissons variées, ainsi que du snacking tout au long de la journée.\nL’Hôtel Cristal, hotel restaurant près de Chenillé-Changé, comprend 22 chambres à la décoration personnalisée, élégante et raffinée. La plupart des chambres bénéficie de la vue sur la Loire. Toutes disposent d’équipements de qualité pour vous apporter tout le confort et le bien-être souhaité lors de votre séjour.\nNotre hotel restaurant près de Chenillé-Changé assure de nombreux services et prestations afin de vous garantir un séjour réussi. Une équipe dynamique et souriante demeure disponible pour répondre au mieux à vos besoins.\nDisposant d’un emplacement exceptionnel au cœur de la ville, l’Hôtel Cristal, hotel restaurant près de Chenillé-Changé, permet de profiter lors de votre séjour de tous les atouts culturels et artistiques de la ville et de découvrir aisément les alentours. Les plus hauts lieux touristiques de la région s’offrent à vous !


Application Criblage de minerai sur quatre installations à étage unique de 10' x 24' par an de #57, #8, #9 et « Agg-Meal », une mouture plus fine de chaux agricole. Une carrière de calcaire résout ses problèmes de goujonnage pour » Chat Online OR GO TO » Feedback Form\nPar ailleurs, la mouture est très fine mais laisse peu de traces sur les doigts (photo). Si vous êtes équipés d'une machine manuelle, équipez-vous également d'un moulin (électrique ou manuel). En plus d'une mouture fine et homogène, un café fraîchement moulu est bien meilleur!\nenrichissement de bas grade fines de minerai de fer. minerai de fer processus de mouture humide . amelioration de bas grade du minerai de fer riche en . processus de fabrication de l'aluminium par l . Contacter le fournisseur; broyage humide de minerais getsmill. broyage humide de minerais . broyage des minerais de graphite .\nmouture du ma s Standard Concasseur Vente spéciale. projet de mouture de maïs mobiles stop-reoffending. 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Finies les allusions au 400e anniversaire de la ville de Québec, la projection se veut un hommage à l'histoire et aux artistes de la Vieille Capitale.\nbroyage ultra fine calcaire smartkn\nbroyage ultra fine calcaire. calcite broyage lagos végétales moulin Maroc stmarkles. manganese import export manganese . bonjour, nous fournissons du manganèse purity 4044%, quantité à partir de 5000mt, possibilité de faire un contrat, fob lagos/exw lagos. si intéressé,\ncomment moudre grain de caf&#;, grande, S&#;lectionnez une taille de mouture fine, grande mouture d'asphalte machine . [discussion en ligne] la machine doccasion moudre le ble a vendre, moudre le grain machine machine de broyage de blé, séparateurs d'occasion et neufs à vendre, Cette machine est en état de, Finesse de la mouture .\nEffets de la finesse de mouture sur les propriétés de -bestand. Effets de la finesse de mouture sur les propriétés de ciments avec fillers montrent que l'addition de calcaire dans le ciment a des effets variables et parfois\ncalcaire fabricant fine broyeur Domy Přezletice\nBroyeur à marteau à poudre fine. Usine de fabrication de machine de concassage de calcaire en Chine est le fabricant et fournisseur d'usine de fabrication de machine de concassage de calcaire en Chine. Nous vous offrons l'usine de concassage de calcaire et moulin broyeur de calcaire. Cette page est sur le concasseur de calcaire. Chat Now\nEntretien et nettoyage. Toutes les machines à café ont deux ennemis le calcaire et l'encrassement dû aux huiles contenues dans les cafés. Les systèmes à lait et mousse de lait doivent également être nettoyés régulièrement. L'entretien est donc primordial et vous permettra de profiter durablement de votre machine dans de bonnes conditions.\nRecette pour faire un bon café filtre Belleville\nVotre café met trop de temps à s'extraire ? La mouture doit être trop fine, donnant lieu à une sur-extraction plus la mouture est fine, plus la surface de contact entre cette dernière et l'eau est importante, entrainant ainsi un temps d'écoulement plus long. Une libération de notes amères non désirées se rapprochant du tabac ou\nbroyage de calcaire de moulin nettotalvalue\nmoulin de broyage de calcaire au belgique Machinery. meule Le moulin à meule est constitué par la réunion de 2 meules dont la totalité prend une pierre Évolution du matériel de broyage et de mouture au Paléolithique Les roches gréseuses à ciment calcaire, me les\nBonjour, j ai le même problème, la manette de réglage du degré de mouture est positionné sur 7, la manette de sélection du goût du CAFE est sur max . Je m en sert depuis 6 ans sans jamais avoir modifié ses réglages et là maintenant mon café est très clair (jus de chaussette). Avant dans le récipient à marcs à café j avais une\nComment faire un bon expresso Chacun Son Café\nLa mouture utilisée est trop grossière, il s'agit probablement d'une mouture pour café filtre et il faut donc utiliser une mouture très fine pour expresso. La quantité de café moulu est insuffisante ou elle n'est pas tassée auquel cas l'eau passe facilement sans résistance au travers. Il\nVous pouvez régler les niveaux de mouture en utilisant le sélecteur situé à l'intérieur du bac à grains. Une mouture plus fine convient mieux pour un espresso intense, tandis qu'une mouture plus grossière donne un café moins fort.\nmachines de mouture, qui résoud tout problème de tamisage en général et de l'industrie difficils comme produits de mouture qui viennent des filtres Obtenez le prix; mouture fine de calcaire ccfc-containers . 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Guinée 500tph station de concassage\nCafés Rombouts Réussir son café France\nTrès faible en calcaire, elle préserve également le bon état des machines à café. La Mouture et le dosage. Poudre fine, moyenne ou grosse, tout dépend du type de cafetière. La mouture la plus fine est celle du café à la turque. Vient ensuite celle de l'expresso, plutôt fine\n14-3-2012 · http// Il peut parfois être difficile de savoir quelle mouture convient à votre type de café ou à votre cafetière. Pour démystifier le to\nsable mouture en une fine poudre thartrenovatie\ncalcaire de mouture fine theodoraseu. Une astuce pour obtenir une mouture de café filtre celle ci doit être aussi fine que du sucre en poudre Chat en direct » mouture humide avec le prixInstallation de [chat en direct] mouture brut broyeur broyeur a boulets nano4healthbe. Sucre fin fraisage machine sucre mouture machine fine poudre moulin à Obtenez le prix sec broyeur a boulets et broyage\nEn effet, ce filtre va grandement réduire la teneur en calcaire de votre eau tout en conservant les sels minéraux pour le développement harmonieux des arômes de votre café. Aussi, un détartrage préventif peut s'imposer. La mouture du café est probablement très fine pour un


PARCOURS DÉCOUVERTE DES MÉTIERS DU LIVRE - Revue de presse - LYCEE DES METIERS CHAMPOLLION\nVous êtes ici : Accueil › Informations générales › Revue de presse › Blog › Page courante : PARCOURS DÉCOUVERTE DES MÉTIERS DU LIVRE\nPARCOURS DÉCOUVERTE DES MÉTIERS DU LIVRE\nPar NATHALIE VAYLET, publié le lundi 14 décembre 2020 11:30 - Mis à jour le lundi 14 décembre 2020 11:30\nInitié en 2018, le Parcours découverte des métiers du livre est un programme d’actions de médiation et de découverte des métiers de la chaîne du livre auprès d’un public jeune, en lien avec les acteurs professionnels et bénévoles du territoire.\nConsacré d’abord aux lycéens, le projet a été construit dans un groupe de travail interprofessionnel réuni sous le nom « Acteurs du livre » : bibliothécaires, libraires, professeurs documentalistes et bénévoles d’associations dédiées à la promotion de la littérature sur notre territoire apprennent à se connaître et conçoivent ensemble des actions de sensibilisation et de promotion du livre et de la lecture.\nun atelier pratique de découverte de plusieurs aspects du métier de bibliothécaire à la médiathèque de Figeac : l’acquisition de collections, l’animation, la restauration de fonds ancien et la communication. Uneclasse de première du lycée Champollion sera accueillie en 2020 par les bibliothécaires en charge des ateliers, qui conduiront à des propositions graphiques et d’animation pour la Nuit de la lecture en janvier 2021 et àl’achat d’une sélection d’ouvrages pour la médiathèque.\nune journée organisée à Toulouse avec des enseignants de l’Université Jean Jaurès (DUT métiers du livre) pour assister à un cours magistral et rencontrer les étudiants. L’après-midi à Toulouse doit permettre de découvrir les grandes librairies et les bibliothèques universitaire et municipale.\nla rencontre d’un auteur, d’un illustrateur, d’un traducteur ou d’un éditeur. Cette année, l’auteure et traductrice accueillie grâce à l’association Lire à Figeac est Valérie Zenatti.\nD’autres actions parsèment ce chemin de découverte : une exposition « Pour faire un livre », des éditions du Larzac, présentée à la médiathèque de Figeac ; des temps de rencontre avec la presse ; des restitutions sur les réseaux sociaux et en direct auprès des collégiens de 3e, qui s’apprêtent à passer au lycée.\nL’objectif est de sensibiliser les jeune aux différents métiers du livre pour qu’ils puissent mieux les appréhender et préciser leur projet professionnel de manière concrète et éclairée.\nPlus globalement, ce type d’actions doit permettre de valoriser toute la filière et la chaîne du livre sur leterritoire.\nLe grand Figeac, automne 2020


Samsung vient d’annoncer sa nouvelle gamme de SSD M.2 dotés de l’interface NVMe et de mémoire flash V-NAND 64 couches. Destinés aux PC portables et aux mini PC, les modèles 970 EVO et Pro se distinguent par une vitesse de lecture record, pouvant atteindre 3500 Mo/s. En écriture Samsung annonce des débits maximaux remarquables de 2700 Mo/s pour le 970 Pro et 2500 Mo/s pour le 970 EVO.\nLe 970 Pro est le modèle haut de gamme de Samsung doté de mémoire flash MLC (2 bits de données par cellule). Il se décline en version 512 Go ou 1 To et bénéficie d’une excellente endurance avec, pour le modèle 1 To, la garantie de l’écriture d’au moins 1200 To pendant sa durée de vie (1200 TBW). Le 970 Pro se révèle aussi très performant en utilisation multitâche et atteint les 500 000 IOPS (entrées/sorties par seconde) en lecture et en écriture. Il coûte environ 330 dollars pour 512 Go et 630 dollars pour 1 To (les prix en France ne sont pas encore connus).\nLe modèle 970 EVO est plus orienté grand public car il coûte moins cher : environ 120 dollar pour 250 Go, 230 dollars pour 500 Go, 450 dollars pour 1 To et 850 dollars pour 2 To. En revanche, il embarque de la mémoire flash TLC (3 bits de données par cellule), moins endurante et moins performante que la mémoire MLC. Ainsi, Samsung annonce une endurance de 600 To écrits au minimum pendant la durée de vie du modèle 1 To (600 TBW), soit deux fois moins que pour le 970 Pro de même capacité. Les performances baissent un peu pour le multitâche avec un maximum de 500 000 IOPS en lecture et 480 000 IOPS en écriture.\nLes SSD 970 Pro et 970 EVO de Samsung seront disponibles début mai.


Explications du débit carte WJUZSHOP : qui, quoi, comment le résilier ? - A quoi correspond ce prélèvement ?\n1/4 Quelle entreprise me prélève sous l’intitulé WJUZSHOP ? S’agit-il d’une arnaque ?\nVous observez un prélèvement sous le libellé WJUZSHOP ? WJUZSHOP est une plateforme en ligne qui vous facture des services. Les débits WJUZSHOP correspondent à un abonnement. Il s’agit de prélèvements récurrents. Concrètement, vous avez sans doute entré votre carte bancaire sur un site internet pour acheter un service (offre d’essai sur un site – rencontres, voyance, contenu culturel du type vidéos ou musique en streaming, abonnement à un service de coaching sportif, sites de réductions… Les services en ligne sont très variés).\n2/4 Pourquoi je constate des retraits CB WJUZSHOP sur mon compte ?\nIl peut arriver que les abonnements liés aux débits WJUZSHOP ne soient pas souhaités par les internautes. Mais il faut savoir que les offres d’essai attractives débouchent bien souvent sur des abonnements si aucune démarche n’est faite pour annuler cela.\n3/4 Comment arrêter WJUZSHOP ? 2 méthodes :\nIl existe deux solutions pour arrêter les prélèvements WJUZSHOP et annuler/résilier l’abonnement en cours :\n– Vous préférez être accompagné par un professionnel pour effectuer les démarches de résiliation : confiez votre problème à un prestataire de service. Nous vous recommandons Sos Internet pour vous aider à stopper les prélèvements WJUZSHOP :\n4/4 Bloquer sa carte bancaire pour stopper les débits WJUZSHOP : une bonne idée ?


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