Mécanicien de véhicules/équipements\n- Effectue divers travaux de vérifications et de réparations mécaniques, électriques et hydrauliques sur tous genres de véhicules, équipements et outillages actionnés par un moteur diesel ou à essence;\n- Assume l'ensemble des opérations reliées au programme d'entretien préventif (PEP) en conformité avec les règles et normes en vigueur émises par la Société de l'Assurance automobile du Québec.\nAutres tâches liées à l'emploi :\n- Conduit et opère les véhicules et la machinerie lourde conformément aux politiques municipales dans le cadre des travaux d’entretien des propriétés, équipements et réseaux de toute nature placés sous la responsabilité de la municipalité;\n- Assure la réalisation de différents travaux de construction, de réparation et d’entretien sur des équipements, des terrains, des bâtiments et autres travaux relatifs à l'entretien du réseau de voies publiques, de la signalisation routière, des réseaux de distribution et d'évacuation des eaux ainsi que des fossés de drainage, des ponts et des ponceaux;\n- Assure l’entretien préventif des véhicules et équipements utilisés, tient à jour une feuille de route et rapporte toute défectuosité observée à son supérieur;\n- Effectue le transport ou le déplacement d’équipements, de matériaux et participe à leur chargement et leur déchargement;\n- Fournit le support nécessaire à l’accomplissement de certains travaux de nature mécanique ou technique;\n- Accomplit diverses tâches manuelles inhérentes à la tonte de gazon et à l’entretien des fossés, des parcs et espaces verts municipaux;\n- Assure l'ensemble des opérations de déneigement, d'épandage d'abrasifs, de déglaçage des routes et des ponceaux sur le territoire de la municipalité, en conformité avec les règles et normes en vigueur et selon un horaire variable;\n- Applique le programme de prévention de santé et sécurité au travail en conformité avec les règles et normes en vigueur selon la loi sur les accidents de travail et les maladies professionnelles et selon les attentes de la CNESST;\n- Assure des communications avec certains fournisseurs pour l’achat de pièces ou d’équipements;\n- Fournit le support nécessaire lors de l’application de certaines interventions du Service de protection incendie;\n- Lors des activités de la municipalité, assure l’ouverture et la fermeture des locaux, prépare les équipements requis pour le bon déroulement des activités et fournit le support technique pour l’aménagement des salles, des équipements et des terrains;\n- Effectue les commissions pour l’ensemble des services;\n- Assure l’approvisionnement des produits sanitaires et de premiers soins dans les différents bâtiments utilisés par le service;\n- Informe son supérieur du déroulement des activités et de l’état des bâtiments, locaux, plateaux et équipements utilisés par la clientèle;\n- Exécute toutes autres tâches connexes, occasionnelles ou ponctuelles, assignées par son supérieur immédiat.\n- Diplôme DEP mécanique de véhicule lourds routiers ou toute combinaison d’études et d’expériences pertinentes;\n- Détenir une attestation du programme d’entretien préventif PEP de la Société de l’assurance automobile du Québec (SAAQ);\n- Minimum de 3 années d’expérience pertinentes à l’emploi;\n- Posséder un permis de conduire de classe 3 valide;\n- Polyvalence, autonomie, responsable, respect des échéanciers, minutie, bon esprit d’équipe, leadership, sens de l’organisation, excellent jugement;\n- Bonne connaissance des outils informatiques (Suite MS Office);\n- Avoir une grande disponibilité;\n- Expérience municipale serait un atout.\nLa semaine de travail est de 40 heures, soit du lundi au vendredi de 8 h à 17 h et nécessite à l’occasion un horaire variable et une disponibilité en soirée, la nuit et la fin de semaine.\nDurant la saison estivale (1er juin au 30 août 2019), l’horaire est du lundi au jeudi de 7 h à 17 h et le vendredi de 8 h à 12 h.\nTraitement selon l’échelle en vigueur, entre 47 405 $ et 58 117 $ annuellement.\nAdmissible au programme d’assurances collectives et au régime de retraite.\nDate d’entrée en fonction prévue : 5 août 2019\nLes personnes intéressées à présenter leur candidature doivent faire parvenir leur curriculum vitae avant 17 h le 28 juillet 2019 par courriel à l’adresse emploi@villestoneham.com.


Comment activer et utiliser le GPS sur Blackviews ZETA - Comment réparer\nAccueil » Blackviews » Comment activer et utiliser le GPS sur Blackviews ZETA\nLe GPS dans les voitures s’est rapidement développé si bien que beaucoup de foyers français en possède un. Cependant, tout le monde n’a pas forcément les moyens de se payer un tel objet. Mais depuis quelques années et avec le développement des performances du smartphone, les constructeurs ont décidé d’intégrer la fonction de GPS. Ce fut une vraie révolution dans l’utilisation d’un appareil. C’est pourquoi, nous allons vous expliquer comment activer le GPS sur votre Blackviews ZETA, puis comment l’utiliser et enfin télécharger un GPS via Google Play Store.\nComment activer le GPS sur Blackviews ZETA ?\nAvant de vous lancer dans toutes les manipulations destinées à utiliser le GPS sur votre Blackviews ZETA, assurez-vous que l’application Google Maps soit installée sur votre Blackviews ZETA. Il vous suffit en effet de la rechercher sur votre Blackviews ZETA. Si elle n’est pas disponible sur votre appareil, alors allez sur Google Play Store où il vous suffira de taper “Google Maps” dans la barre de recherche et l’installer.\nLorsque vous avez trouvé l’application ou que vous venez tout juste de l’installer sur votre Blackviews ZETA, commencez par aller dans “Paramètres” puis allez sur la section “Personnel”. De là, vous trouverez le bouton “Emplacement” ou “Localisation” et vous n’aurez qu’à cliquer dessus afin d’activer la localisation de votre Blackviews ZETA. Puis, activez le mode “Haute précision” permettant d’utiliser le GPS, les réseaux mobiles et le Wifi afin de vous localiser grâce à votre Blackviews ZETA. De plus, vous devez impérativement activer le Wifi ou les réseaux mobiles car sans cela, le GPS ne pourra pas fonctionner.\nUne fois que vous avez effectué ces manipulations, vous avez su activer le GPS sur votre Blackviews ZETA.\nComment utiliser le GPS sur Blackviews ZETA ?\nSi vous avez réalisé correctement tout ce que l’on vous a décrit dans le paragraphe précédent, alors maintenant, nous allons vous expliquer comment utiliser le GPS sur votre Blackviews ZETA. Premièrement, vous devez tout simplement ouvrir l’application appelée “Google Maps”. Ensuite, il vous suffit d’entrer le nom d’une ville ou d’une adresse précise où vous souhaitez vous rendre avec votre Blackviews ZETA, puis appuyez sur “Rechercher”. Quand vous avez trouvé votre destination, appuyez sur l’adresse ou le nom de la ville que vous avez recherché, généralement situé en bas de votre écran. A partir d’ici, Google Maps affichera l’itinéraire, le temps à parcourir, le nombre de kilomètres et le mode de transport que vous pouvez choisir.\nConcernant le mode de transport, plusieurs choix s’offrent à vous : la voiture, le vélo, le mode piéton ou les transports en commun. Une fois votre choix fait, appuyez sur “Démarrer la navigation”. Le GPS de votre Blackviews ZETA se mettra en marche et vous n’aurez plus qu’à suivre l’itinéraire indiqué par celui-ci.\nTéléchargez des applications de navigation GPS sur votre Blackviews ZETA\nCes applications sont spécialisées dans la navigation GPS, et selon votre choix, elles peuvent être plus performantes que l’application initialement installée sur votre Blackviews ZETA. Nous vous mettons en garde! Lisez attentivement les notes et les avis des utilisateurs de l’application qui vous intéresse.\nDe plus, certaines applications GPS sont gratuites tandis que certaines sont payantes pour votre Blackviews ZETA, donc prenez garde.\nConclusion : votre Blackviews ZETA est un GPS utile et performant\nLe développement du GPS sur les smartphones s’est avéré être une idée très utile qui a permis à beaucoup de personnes de ne plus se perdre, lorsqu’ils n’avaient pas leurs GPS sous la main. Un GPS installé sur votre Blackviews ZETA peut être très pratique, plus rapide et plus performant que les GPS traditionnels étant donné que les cartes sont davantages mises à jour.\nCependant, l’utilisation du GPS sur votre Blackviews ZETA entraînera une baisse assez rapide de votre batterie.\nPar conséquent, évitez d’utiliser le GPS de votre Blackviews ZETA sur une longue distance ou bien rechargez-le via l’allume cigare pour ne pas arriver à destination avec un appareil déchargé. En cas de problèmes, n’hésitez pas à consulter un expert qui saura vous aider pour utiliser le GPS sur votre Blackviews ZETA.\nComment augmenter ou diminuer le son sur Huawei\nComment bloquer les appels anonymes sur son Nokia C6


Quel temps est prévu au Bar-sur-Loup le jeudi 23 juillet 2020 ? - Nice-Matin\nQuel temps est prévu au Bar-sur-Loup le jeudi 23 juillet 2020 ?\nCe jeudi 23 juillet 2020, Le Bar-sur-Loup connaîtra des températures proches de 23 degrés et un ciel essentiellement clair. On attend des orages en après-midi et en soirée.\nAu Bar-sur-Loup, le ciel sera dégagé au réveil ce jeudi 23 juillet, et la température de l'air sera en moyenne de 21 ° C sur la première partie de journée. À l'aube, le vent sera quasiment inexistant, et se renforcera entre 8 h et 11 h pour parvenir à environ 10 km/h. Il sera en provenance du Nord pendant cette plage horaire. Le thermomètre affichera 19 °C à 7 h, et montera en milieu de matinée jusqu'à 23 °C. Les nuages surgiront aux alentours de 11 h.\nL'après-midi, le ciel sera toujours nuageux vers midi, puis se dégagera complètement vers le début de l'après-midi et deviendra orageux autour de 15 h. On prévoit des orages vers la fin de l'après-midi. Le mercure baissera jusqu'à 23 °C aux alentours de 17 h, tandis que la force du vent variera entre 5 et 10 km/h. Durant cette période, il sera de secteur Nord.\nLa force du vent oscillera aux alentours de 5 km/h au cours de la soirée, et il soufflera en provenance du Nord. Le temps va s'éclaircir partiellement aux alentours de 18 h, s'assombrir très sérieusement en début de soirée et se découvrir entièrement autour de 21 h. Il y aura des orages vers le début de la soirée. Le mercure va poursuivre sa baisse entre 19 h et 21 h jusqu'à 21 °C.\nGlobalement, le ciel sera essentiellement couvert au cours de la nuit. Le vent évoluera encore aux environs de 5 km/h, et il sera de secteur Nord. Le thermomètre restera constant à 20 °C.\nPour vendredi, le temps sera majoritairement couvert, avec des averses du matin au soir. Les températures seront inférieures à celles d'aujourd'hui : elles seront de 20 °C en moyenne, avec un maximum de 22 °C atteint aux alentours de 11 h et 20 h.


#Concert : Frank Carter & The Rattlesnakes – Le Trabendo – 13/03/2018 | Daily mars\nJessica Saval mars 29, 2018 MUSIQUE\nPetit roux fluet au pantalon bien trop serré, Frank Carter aurait tout de la punchline grinçante s’il n’était pas ce que le metal compte de plus sérieux… et de plus talentueux. La preuve est encore gravée sur les murs poisseux de sueur du Trabendo, et le plus beau c’est qu’on y était !\nExit la scène exiguë et le photo pit fantôme auxquels adeptes du Trabendo – et photographes – sont habitués. Ce mardi 13 mars, Frank Carter & The Rattlesnakes ont vu les choses en grand. Ce n’est donc pas après une mais deux premières parties (l’électrisant Demob Happy et les Écossais de The Woes) que le rouquin entre en scène. Si la fosse n’avait fait que s’animer, il aurait pu s’agir d’une entrée en matière classique, mais le public – étonnamment hétéroclite – est déjà déchaîné. Tout aussi ramassé que savamment équilibré entre deux albums acclamés, son set distille hymnes prompts au headbang et morceaux plus enlevés avec une précision quasi chirurgicale. S’il est circoncis aux plus grands succès des Serpents à Sonnette, il ne fait que gagner en puissance jusqu’à un gigantesque rappel que l’on aurait souhaité éternel.\nS’il pourrait presque paraître surfait de s’épancher sur la qualité des compositions de Frank Carter, vanter la maîtrise scénique de l’ancien frontman de Gallows est loin d’être superflu : presque chacune de ses performances étant agrémentée d’une introduction adéquate, souvent chargée en émotions. À peine monté sur scène, il annonce la couleur : tout le monde est le bienvenu ce soir. S’il est bien triste qu’un artiste ressente le besoin de le préciser, il apostrophe ses fans féminines en leur assurant qu’ici, elles sont libres de se jeter dans la foule sans risques. En 2018, il serait temps…\nAyant récemment souffert de dépression, Carter n’hésite pas à également s’étendre sur les troubles mentaux ainsi que sur l’absolu nécessité d’en parler. Quelques chansons plus tard vient la traditionnelle pique à nos dirigeants politiques. Si « le monde est de plus en plus déglingué », la seule échappatoire serait-elle le pogo ? À tout prendre, on valide !\nUn gigantesque micro atterri sur la petite scène du Trabendo. Une paire de lunettes égarée retrouve son propriétaire au détour d’un couplet. Voilà le concert déglingué qu’il nous fallait !\n23 heures. Le rappel touche à sa fin. Frank Carter & The Rattlesnakes dédient une dernière chanson aux fans de liberté et d’amour ayant perdu la vie lors de concerts.\nLes lumières se rallument. La nuit parisienne attend. On se revoit au Download messieurs !


Juventus : les détails du transfert de Cristiano Ronaldo\nJuventus : de nouveaux détails sur l’arrivée de Cristiano Ronaldo à Turin\nLe coordinateur sportif de la Juventus Turin, Fabio Paratici, a une nouvelle fois raconté comment il avait réussi à recruter Cristiano Ronaldo l’été dernier.\nFabio Paratici n’en finit plus de raconter le meilleur coup de sa carrière : le transfert de Cristiano Ronaldo du Real Madrid à la Juventus Turin l’été dernier. Dans La Gazzetta dello Sport du jour, le coordinateur sportif « bianconero » a donné encore plus de détails de cette transaction sensationnelle… et pas spécialement programmée !\n« Quand nous avons joué à Madrid (Le 11 avril 2018), Jorge Mendes est venu. Je lui ai dit que Cristiano avait inscrit des buts incroyables, comme le retourné au match aller. Il m’a regardé et il m’a dit « Tu ne vas pas me croire, mais si CR7 part, il veut venir à la Juve. Souviens-toi que c’est moins improbable que tu ne le penses. On en reparlera ». J’ai cru alors à une boutade, mais j’ai commencé à y réfléchir. »\n« Plus tard, on était à l’aéroport. Il m’a dit : « Tu verras que Ronaldo va quitter le Real. Je te le dis clairement, il veut venir à la Juve. Il a joué à Manchester United, le plus grand club anglais. Puis le Real, un autre grand club. Il ne va que dans les clubs historiques. Il n’a jamais joué en Italie, il veut gagner le titre. Si vous le voulez, lui est d’accord. Voilà le coût du transfert et voilà le salaire ». Je lui ai demandé de me laisser plusieurs jours pour lui donner une réponse. »\nPublié le 12 février 2019 à 16 h 02 min\n08:30Real Madrid, PSG – Mercato : Florentino Pérez prépare sa contre-attaque


Adele : Hilarante et bluffante en sosie d'elle-même pour un concours ! - Purepeople\nAdele, dans l'émission spéciale BBC\nAdele, lors de l'émission sur la BBC\nLa chanteuse Adele, lors de l'émission sur la BBC\nLa chanteuse Adele à la sortie de son hôtel à New York. Le 17 novembre 2015\nLa chanteuse Adele est allée dîner au restaurant "Spotted Pig" dans le quartier de West Village à New York. Le 18 novembre 2015 © CPA / Bestimage\nExclusif - Adele dans les rues de New York, le 18 novembre 2015\nAdele à New York, le 20 novembre 2015.\nLa star anglaise a prouvé, une fois encore, qu'elle possède un solide sens de l'humour...\nLe marathon promo d'Adele, pour défendre son dernier album intitulé 25 (disponible depuis le 20 novembre) a été marqué par l'émission spéciale Adele at the BBC, diffusée au Royaume-Uni. Au cours du programme, l'animateur Graham Norton l'a conviée à prendre part à un concours de sosie... d'elle-même. Toujours prête à la rigolade, la star a participé en se déguisant en fausse Adele !\nC'est sous le faux nom de Jenny que la star a donc participé à ce drôle de concours. Modifiant un peu sa voix et aidée par des prothèses au niveau des yeux et du menton, Adele a d'abord réussi à se fondre dans la masse, discutant sans se faire griller avec les autres participantes, toutes vêtues et coiffées de la même façon qu'elle.\nAdele, parfaite comédienne, n'a pas manqué de commenter les prestations de ses concurrentes, s'amusant de la gestuelle de l'une ou de la voix de l'autre. Au moment de passer, elle a même fait semblant de ne pas se sentir bien, demandant à relancer la musique. Sous les regards indulgents des autres fausses Adele, elle a alors entamé l'interprètation de Make You Feel My Love et, assez rapidement, les unes après les autres elles ont finir par comprendre que leur idole se tenait devant elles !\nAdele, que l'on avait pu voir sur la scène des NRJ Music Awards, a enregistré l'émission Le Grand Show, pour France 2, diffusée le 28 novembre. Elle chantera son nouveau single Hello et son tube planètaire Rolling in the Deep. La star est en ce moment aux États-Unis où elle court les interviews.\nLe 21 Novembre 2015 - 22h36\npeople UK photo vidéos télé émission télé Musique top news Toutes les news : News people L'actu du moment Rihanna news Justin Bieber news


29 Décembre 2017 à 23h56 - 1256 - URL\nVous cherchez un site pour pouvoir jouer à des jeux vidéo pas cher ? Accédez facilement à un site qui vous propose les meilleurs jeux du moment à un prix incroyable. Vous trouverez sur cette plateforme de steam telecharger les derniers hits du moment. Que ce soit durant votre pause-déjeuner ou encore durant vos moments libres, amusez-vous avec vos titres favoris.\nLa meilleure plateforme de jeux vidéo en ligne\nQue vous aimiez jouer sur votre Smartphone, votre tablette ou encore sur votre PC, découvrez tous les plus beaux jeux vidéo du moment, ou des titres plus anciens sur cette plateforme. Jeu d’action et d’aventure, jeu indépendant, jeu de course et plus encore, vous n’aurez que l’embarras du choix en ligne. Grâce à la multitude de titres disponibles, vous pourrez vous faire plaisir à petit prix. Après une journée fatigante, vous apprécierez de jouer à vos jeux favoris pour déstresser. Des jeux très variés vous attendent en ligne. Faites votre achat sur cette plateforme sécurisée et soyez certain de recevoir votre commande dans les meilleurs délais.\nUne panoplie de jeux inédits\nRendez-vous sur ce site pour accéder à une collection de jeux, régulièrement mise à jour pour satisfaire les gamers tous azimuts. Pour vous offrir une entière satisfaction, le site propose ses hits à des prix très attractifs. Que vous soyez féru des jeux classiques ou que vous soyez plutôt friands des dernières nouveautés, soyez certain de trouver votre bonheur sur ce site. Envie de vous détendre et de vous relaxer en vous adonnant à des jeux vidéo pas chers ? Ce site est totalement sécurisé, vous n’aurez ainsi aucun souci à vous faire en ce qui concerne vos données personnelles. Profitez des offres alléchantes sur le site et achetez vos jeux préférés pour y jouer sereinement une fois chez vous durant le week-end, ou sur votre Smartphone durant vos pauses au bureau.\n27 Nov. 2021La brume parfumée pour une peau hydratée et rafraîchie213


Cours particuliers La Chaume (21520) | LiveMentor\nCours particuliers à La Chaume (21520)\nLa demande en soutien scolaire à La Chaume\nLa demande en cours particuliers à La Chaume s’explique en partie par la répartition des établissements scolaires. Il s'agit d'une ville du département Côte-d'Or\nOn peut par ailleurs se demander si l'influence relative de l'enseignement privé joue sur le marché du soutien scolaire à La Chaume :\nÀ La Chaume, la recherche de cours particuliers peut aussi s'expliquer par la situation de l'emploi selon le diplôme obtenu.\nIl n'y a donc parmi les agriculteurs, personne correspondant au diplôme d'étude suivant : On peut aussi considérer le marché des cours particuliers à La Chaume au regard des études réalisées par les artisans, commerçants et chefs d'entreprises. Sur les artisans, commerçants, chefs d'entreprises que compte la ville, .\nSelon les données de l'INSEE pour le soutien scolaire, la ville de La Chaume a 21159 comme CODGEO.


Netflix mise sur les jeux vidéo pour diversifier son offre\nD’abord accessible sur mobile, l’offre de jeux vidéo de Netflix sera disponible sans coûts supplémentaires.\nNetflix souhaite, à son tour, intégrer le marché tant convoité du jeu vidéo. Crédit : CardMapr.nl / Unsplash\nNetflix a dévoilé cette semaine ses derniers résultats trimestriels. À cette occasion, l’entreprise en a profité pour détailler un peu plus son expansion dans le secteur du gaming dans sa lettre aux actionnaires (pdf). En effet, les prochains mois, elle sera “principalement axée” sur le développement de jeux vidéo, majoritairement sur mobile.\nNetflix se concentre d’abord sur les jeux mobiles\nDepuis plusieurs mois, Netflix ne cache plus ses ambitions d’intégrer le marché du gaming. La firme a récemment annoncé un nouveau service permettant d’accéder à plusieurs jeux, directement depuis sa plateforme. L’avantage, c’est qu’ils seront proposés sans frais supplémentaires, un argument de taille pour s’imposer face à ses concurrents.\nDans un premier temps, Netflix se concentrera sur le développement de jeux vidéo mobiles. L’idée est d’étendre les contenus interactifs déjà existants sur la plateforme. Parmi eux, l’épisode Bandersnatch de Black Mirror, qui avait connu un succès phénoménal. Par ailleurs, la firme a déjà adapté certaines de ses séries sur mobile, comme Stranger Things et La Casa De Papel. Elle avait également mis la main sur des licences phares, dont Tomb Raider et Sonic, qui seront bientôt adaptés en séries. Son intérêt pour ce monde n’est donc pas nouveau, et s’intensifie au fil des années.\n"Nous considérons le jeu comme une nouvelle catégorie de contenus pour nous, similaire à notre expansion dans les films originaux, l'animation et la télévision non scénarisée", a expliqué Mike Verdu, un ancien de Facebook et d’Electronic Arts. Il a été recruté en tant que vice-président de la division gaming chez Netflix, un indicateur de la volonté de l’entreprise de s’imposer sur ce marché.\nL’entreprise veut stimuler sa croissance\n“Il s’agit de renforcer et d’améliorer notre service, et non pas de créer une source de profits à part”, a précisé Reed Hastings, cofondateur de la société, lors d’une conférence virtuelle. En effet, l’ajout d’un nouvel élément sur la plateforme pourrait l’aider à faire face au ralentissement de sa croissance.\nLors du confinement, elle s’est imposée comme le leader du divertissement, enregistrant 16 millions de nouveaux abonnés. Néanmoins, au fur et à mesure de la sortie de la crise sanitaire et des ralentissements des productions, ils se sont faits plus rares. Au premier trimestre 2021, Netflix en a enregistré 3,9 millions. Au second trimestre de l’année, la firme a séduit 1,5 million de nouveaux abonnés.\n“De nouvelles sources de revenus comme les produits dérivés et de potentielles expérimentations futures comme des sorties en salle, des podcasts et des jeux vidéo pourraient apporter de la croissance”, explique Eric Haggstrom de eMarketer, société d’études de marché. “Mais le succès dans ces domaines est loin d’être assuré” ajoute-t-il. En effet, dans le secteur du gaming, Netflix serait le petit dernier, et devra faire face à de sérieux concurrents. Parmi eux, Amazon Games et Tencent, qui vient de racheter le studio de jeux vidéo Sumo.


Découvrez pourquoi ouvrir un compte professionnel\nLa création d’une entreprise implique certaines obligations légales, dont l’ouverture d’un compte bancaire professionnel. Si vous êtes encore perplexe à l’idée de créer un autre compte, voici quelques arguments qui vont modifier votre opinion. Vous découvrirez ci-après les avantages et les documents nécessaires pour l’ouverture d’un compte à titre professionnel.\nOuverture d’un compte bancaire professionnel, une obligation pour les entreprises\nL’obligation d’ouvrir un compte bancaire professionnel repose sur le statut de l’entreprise. Les sociétés répondant à la qualité de personne morale sont tenues de disposer d’un compte professionnel. Ce devoir est souligné par l’article L.123-24 du Code de commerce. C’est effectivement le cas des sociétés aux statuts d’EURL (Entreprise unipersonnelle à responsabilité limitée), de SA (Société anonyme) et de SARL (Société anonyme à responsabilité limitée). Ce compte servira à recueillir leur capital social. À défaut de compte, l’entreprise ne peut obtenir ni un certificat de dépôt de fonds ni une immatriculation au RCS (Registre du commerce et des sociétés). Les auto-entrepreneurs sont cependant dispensés de l’obligation d’ouverture de compte professionnel, à condition de disposer d’un compte bancaire personnel.\nOuverture d’un compte bancaire professionnel, quel intérêt ?\nOuvrir un compte bancaire professionnel soulève de multiples avantages. Cette démarche isole les opérations financières de la société des transactions privées et facilite la tenue de la comptabilité. La présence d’un compte professionnel supprime le risque d’oubli lié aux obligations comptables et fiscales. Cette étape fondamentale donne accès à des services singuliers, inaccessibles avec un compte personnel. Il peut, à titre d’exemple, s’agir d’autorisations de découvert en fonction du flux de trésorerie ou d’une prime de fidélité élevé. À ces avantages s’ajoute l’absence de confusion entre capital professionnel et argent privé. Ce compte est d’une grande utilité pour solliciter un prêt professionnel et pour ouvrir un crédit de caisse.\nOuverture d’un compte bancaire professionnel, quelles sont les procédures ?\nOuvrir un compte bancaire professionnel passe par plusieurs étapes, dont la collecte de documents administratifs. Une Immatriculation au Répertoire des Métiers délivrée par la Chambre des Métiers est indispensable pour les artisans entrepreneurs qui emploient moins de 10 personnes. Les commerçants comptant plus de 10 employés doivent fournir une Immatriculation au Registre du Commerce et des Sociétés. Un extrait du journal ou une attestation de parution dans un journal d’annonces est de mise pour les sociétés nouvellement en activité. Il faut y ajouter l’immatriculation au Registre du Commerce et des Sociétés. Les entreprises utilisant un local professionnel doivent fournir un justificatif de l’emplacement, comme un bail commercial.


Titre : Chef d’équipe (H/F)\nLieu de travail : Goetzenbruck, Moselle\nNiveau de classification : III-3\nDans le cadre de notre développement, nous recherchons notre chef d’équipe en charge des activités de production.\nAu sein de la direction des opérations et sous la responsabilité du responsable de la production, vous animez une équipe de 14 personnes.\nVeiller au bon déroulement du travail de son équipe et parer à tout imprévu d'absence de son personnel. Gestion des demandes de congé de son équipe en accord avec son responsable.\nGérer le flux des ordres de fabrication entrants et en particulier le traitement des options de pré-calibrage. Gestion et commandes des verres semi-finis en stock.\nGérer et savoir analyser les retours internes de notre production dans le but d'une amélioration continue. Est responsable de la formation des nouveaux entrants et de la qualité de leur travail. Surveiller et prévoir le flux des déchets recyclés.\nAssistance et première analyse des pannes machines pouvant survenir dans les différents services lors de la mise en route ou le fonctionnement de celles-ci.\nMaintenir les outils de production en ordre de marche avec suivi des générateurs, des polisseurs, etc…\nResponsable du maintien d'un bon climat social favorable au sein de son équipe, de l'hygiène et de la sécurité. Il veille au respect des programmes de fabrication pour permettre d'atteindre les objectifs fixés en termes de qualité, quantité et délai.\nAnalyse et suit tous indicateurs permettant de mesurer les paramètres qualité, délai, productivité au sein de son équipe.\nCe poste intéressera:\nVous justifiez d’une première expérience réussie d’au moins trois ans en management de Production et avez de réelles aptitudes à manager une équipe dans un environnement « amélioration continue ».\nTravaillant en étroite collaboration avec d’autres services internes (Ateliers de production, Service Maintenance, Services Supports Site et autres, etc.), nous intégrerons une personne ayant un très bon sens de la communication, capable de fédérer une équipe autour d’objectifs.


Mouche Domestique Musca Domestica - Vente insecte vivant pour reptiles : grillon criquet, blatte et vers\nHomeNon classéMouche Domestique Musca Domestica\nMouche Domestique Musca Domestica\nLes mouches domestiques constituent l’espèce de mouche la plus couramment rencontrée en Europe. Ces petits insectes de quelques millimètres ont une durée de vie très courte (pas plus de deux semaines). Ils possèdent possède une trompe qui leur sert à capter une nourriture exclusivement liquide. Les mâles sont un peu plus petits que les femelles.\nLes mouches passent par un stade larvaire avant de devenir des insectes. Au cours de sa courte vie, une femelle peut pondre jusqu’à un millier d’œufs en plusieurs pontes. Ceux-ci se transforment très rapidement en larves puis en insectes au bout de quelques jours. Il n’est pas conseillé de nourrir un reptile avec des mouches capturées dans la nature car celles-ci peuvent transporter des bactéries voire même des résidus de produits chimiques.\nLes mouches sont utilisées comme complément alimentaire pour la nutrition des reptiles. Les apports nutritionnels sont peu importants (comme pour les araignées) mais ces insectes permettent aux animaux de faire un peu d’exercice et de retrouver leur instinct de chasseur. De plus, il est important de diversifier l’alimentation des lézards ou des caméléons pour qu’ils restent en bonne forme et puissent se reproduire. Les mouches présentent également l’intérêt d’être très digestes pour les reptiles (faible teneur en chitine).\nVous pouvez constituer un élevage de mouches en achetant des larves qui seront conservées dans une boite en plastique au réfrigérateur. Certains conditionnements vendus dans le commerce conviennent parfaitement. Pour obtenir des mouches, transférez une petite quantité de larves dans un bocal dont vous aurez percé le couvercle pour assurer la ventilation. Il suffit ensuite d’attendre une dizaine de jours pour voir les larves se transformer. Le taux de mortalité étant extrêmement faible, vous obtiendrez facilement quelques individus que vous pouvez transférez directement dans le terrarium en enlevant le couvercle.\nLes mouches sont économiques, faciles à élever, et contribuent à maintenir les reptiles actifs. Il est possible de les conserver quelques jours dans une boite d’assez grande taille (50 centimètres de côté). Vous disposer des rouleaux en carton (sopalin par exemple) pour qu’elles puissent se poser. Le couvercle doit être percé de petits trous pour la ventilation. Il est possible de récupérer les œufs puis de stocker les larves au frais. Très simples d’entretien, les mouches constitueront une distraction pour votre reptile qui sortira rapidement de sa cachette pour s’intéresser à l’insecte.\nComment nourrir les mouches avant leur consommation par les reptiles mouches ?\nLorsque vous obtenez les mouches à partir des larves, il faut les nourrir avant de les transférez dans le terrarium. Vous pouvez utilisez toutes sortes d’aliments riches en sucres : jus de fruit, lait concentré ou compote. Versez un peu de nourriture à travers les trous du couvercle et en une journée vous obtiendrez des proies prêtes à être consommées par vos animaux.\nVers de terre rose Lumbricus Rubellus\nCloporte Trichorhina tomentosa


Une quantification précise de facteur de transcription (TF)-interactions ADN est essentiel pour comprendre la régulation de l’expression génique. Étant donné que les approches existantes souffrent de limitations importantes, nous avons développé une nouvelle méthode pour déterminer les affinités de liaison TF-ADN avec la sensibilité élevée sur une grande échelle. Le test repose sur le principe d’anisotropie (FA) de fluorescence établie mais introduit des améliorations techniques importantes. Tout d’abord, nous mesurons une courbe de titrage concurrentiel de FA complet dans un seul puits en y incorporant les TF et une référence fluorescent étiquetée ADN dans une matrice de gel d’agarose poreux. Sans étiquette DNA oligomère est chargé sur le dessus comme un concurrent et, par la diffusion, forme un gradient spatio-temporelle. Le gradient de FA qui en résulte est ensuite donné lecture en utilisant une configuration de microscope épifluorescence personnalisés. Cette configuration améliorée augmente considérablement la sensibilité de détection de signal de FA, ce qui permet une liaison faible et forte à doser fiable, même pour les molécules de poids moléculaires semblables. De cette façon, nous pouvons mesurer une courbe de titrage / puits d’une plaque multipuite, et grâce à une procédure d’ajustement, on peut extraire la constante de dissociation absolue (KD) et la concentration de la protéine active. En testant toutes les variantes de mutation de point unique d’un consensus donné lie séquence, nous pouvons sondage le paysage de spécificité de liaison entière de TF, généralement sur une seule plaque. Les matrices de poids position qui en résulte (PWM) surclassent celles obtenues par d’autres méthodes pour prédire en vivo occupation TF. Nous présentons ici un guide détaillé de mise en œuvre HiP-FA sur un microscope à fluorescence automatisé conventionnel et le pipeline d’analyse de données.\nÉtant donné le rôle central des facteurs de transcription (TFs) dans la régulation des gènes, déterminer leurs préférences de fixation de manière quantitative est d’une importance primordiale. Séminales études par von Hippel a introduit la notion que TFs réglementation reconnaissent rapidement ADN, tels que leur liaison est bien décrite par l’équilibre thermodynamique, tandis que les événements en aval de l’ARN polymérase pour le promoteur de recrutement sont contrôlés par de cinétique plus lente1. En vivo contraignantes des études récentes suggèrent que cette photo est probablement plus complexe2,3; Néanmoins, ces hypothèses générales servent de bonnes approximations et soutiennent plusieurs approches informatiques pour rechercher des éléments cis-régulateurs et prédire l’expression de séquences4,5,6. Alors que l’attache d’équilibre a ainsi été utilisée avec succès comme un concept, les méthodes actuelles de détermination des interactions ADN-TF mettre l’accent sur la spécificité de liaison et généralement ne sont pas directement mesurer les affinités de liaison à l’équilibre. La mesure systématique de la TF-DNA binding représente un défi technique considérable, et les méthodes existantes présentent plusieurs limites différentes.\nImmunoprécipitation de la chromatine suivie profond séquencement (ChIP-seq)7, la plus répandue en vivo technique, ne permet pas la mesure des affinités de liaison ou la localisation précise des sites dans les fragments génomiques de liaison. Plusieurs in vitro méthodes, y compris la DNase empreinte8, mobilité électrophorétique Maj (EMSA)9, surface plasmon resonance (SPR)10et micro-échelle thermophorèse11 sont capables de mesurer les affinités de liaison, mais ils sont relativement faible débit. À l’inverse, les techniques à haut débit, notamment des protéines liant microarrays12HT-SELEX13,14et bactérienne un hybride (B1H)15 ne sont pas capables de mesurer les affinités de liaison et généralement céder trop spécifique liant les séquences, qui est principalement due à la sélection rigoureuse ou laver les étapes nécessaires. Développements plus récents incluent le séquençage en profondeur basé HiTS-FLIP16, SELEX-seq17et l’axée sur la microfluidique MITOMI18 ou19de sourire-Seq, qui permettent une extraction des affinités de liaison absolue ; Cependant, ils s’appuient sur la mesure des intensités de fluorescence de TF et d’ADN marqué. Signaux fluorescents, par conséquent, se limitant à des concentrations de faible teneur en protéines et dans la détermination de faibles valeurs de KD (< ~ 10 nM). En outre, la liaison TF-ADN dans ces méthodes se déroule sur une surface mince, soulevant des questions avec liaison non-spécifique et/ou arrière-plan auto-fluorescence, ce qui rend difficile de quantifier précisément la liaison faible.\nPour pallier ces lacunes, nous avons développé une nouvelle méthode pour déterminer les paysages d’affinité TF-ADN à l’équilibre et en solution, que nous avons appelé haute performance fluorescence anisotropie (HiP-FA)20. La technique est basée sur la fluorescence établie anisotropie (FA) dosage21 mais modifiée pour mesurer les constantes de fixation avec la sensibilité élevée et à grande échelle utilisant un microscope automatisé personnalisé et la configuration de l’analyse.\nLe dosage de FA surveille l’interaction des espèces fluorescent étiquetés (comme un oligomère d’ADN) à un partenaire de liaison, dans ce cas un TF, en mesurant la rotation moléculaire de la molécule marquée. Lors de la liaison à la TF, sa vitesse de rotation diminue en raison du rayon hydrodynamique plus élevé et le poids moléculaire du complexe lié, qui se traduit par une augmentation FA. La mesure exacte de la très forte liaison (KD < ~ 1 nM) nécessite l’utilisation de faibles concentrations de référence étiquetée, ADN (c < ~ 1 nM). C’est difficile à réaliser avec un instrument commercial tel qu’un lecteur de microplaque standard. En outre, une différence de grande taille (10-100 fois) entre les complexes liées et non liées est habituellement nécessaire, interdisant la mesure des interactions entre domaines de liaison TF et courts oligomères d’ADN, qui sont typiquement des poids moléculaires à peu près semblables . Enfin, une courbe de titrage complet nécessite normalement la préparation et la mesure de plusieurs puits contenant une série de concentration pour les espèces de titration.\nPour résoudre ces problèmes, nous utilisons une configuration de microscope widefield, modifiée pour atteindre la sensibilité de détection élevé et permettent des mesures de FA à z-positions différentes d’un seul puits. Cela nous permet de surveiller les interactions de liaison entre les espèces de poids moléculaire semblable et avec des affinités élevées. Un débit plus élevé est obtenu en mesurant la FA en formats de plaque multipuits et procéder à une série de titrage complet en un seul bien à l’aide d’un contrôle système de livraison (Figure 1a). En outre, grâce à un essai de liaison compétitive, nous avons extrait non seulement les constantes de fixation, mais aussi la concentration de protéine active. Il s’agit d’une caractéristique importante de l’analyse, étant donné qu’une partie des molécules exprimées TF sont actives en raison d’un mauvais repliement des protéines ou de dégradation. Le dispositif expérimental est issu d’un microscope à épifluorescence commercial équipé d’étapes XY et Z-piezo. Nous avons modernisé le système avec excitation laser externe, puis détecté que les deux émis des composantes de la polarisation linéaire sur la puce d’une EM-CCD caméra avec un rendement quantique élevée pour la détection de lumière (Figure 1b et 1C). Le système utilise un objectif de forte ouverture numérique (NA) couplé à un capteur ultrasensible et offre ainsi des mesures hautement sensibles de FA. En enregistrant la fluorescence z-cheminées, les contraignant des interactions peut être mesurée le long de l’axe optique z lors de l’utilisation d’une matrice hétérogène pour les réactifs. Toutes ces modifications peuvent être facilement mises en œuvre sur un système existant et sont rentables.\nNous employons un essai de liaison compétitive dans laquelle l’affinité d’un oligomère d’ADN sans étiquette est mesurée par rapport à l’ADN fluorescent étiqueté, qui sert de référence. TF et référence ADN sont incorporés à des concentrations fixes dans une matrice de gel d’agarose poreux (pore taille ~ 1 µm) qui constitue un environnement sans interaction pour la liaison. La référence ADN est étiqueté avec Cy5. Ce colorant s’est avéré bien adapté pour les mesures de FA en raison de sa durée de vie de fluorescence relativement longue (~ 1ns) et émission de fluorescence dans l’infra-rouge du spectre visible (fond faible auto-fluorescence). La concentration de TF est en excès molaire sur ADN Cy5-référence, veiller à ce que tous les ADN de référence est lié aux protéines. Une solution de concurrent sans étiquette ADN est alors déposée sur la surface du gel et se diffuse à l’intérieur de la matrice poreuse, établir un gradient de concentration c (z, t) qui change sur le z-position du plan focal et du temps t (Figure 1a, Figure 2a-2C). Le TF liaison à l’ADN Cy5-référence est donc localement exposé à différentes concentrations du concurrent ADN qui est en concurrence pour la liaison, conduisant à une FA change dynamiquement de l’ADN de Cy5-référence FAREF(z, t) (Figure 2b et 2C).\nPour déterminer le c(z,t) de concentration concurrent, nous mesurons en puits séparés (puits d’étalonnage), la FA change dynamiquement du signal du Nil bleu (n.-b.), FANB(z, t) (Figure 2un et 3). Ce colorant s’intercale dans l’ADN et agit ainsi comme une sonde d’ADN pour le concurrent de l’ADN. Avec ce système de livraison contrôlé, des dizaines ou des centaines de différentes affinités de liaison des protéines et l’ADN peuvent être mesurées au sein d’une seule plaque multipuite (format de plaque de 96 ou 384 puits). Mesure est ensuite exécutée séquentiellement jusqu'à un déplacement complet de la référence marqué l’ADN de la TF. Nous avons déterminé la spécificité de liaison pour un facteur donné en mesurant les affinités de toutes les mutations de base unique de 3 N de la séquence consensus de longueur N. Hanche-FA nécessite de faibles quantités de protéines (~ pmols par la courbe de titrage) et spectacles à faible variabilité dans la détermination de KDs [coefficient de variation (CV) < 20 %], tout en permettant des mesures à relativement grande échelle. La méthode peut être effectuée manuellement ou entièrement automatisée à l’aide d’un système robotisé, ayant pour résultat encore plus bas CVs (Figure 4, panneau supérieur). Constantes de dissociation sont mesurés avec une grande précision jusqu'à 0,5 nM. Pour une affinité extrêmement élevée (KD < 500 pM), nous utilisons un titrage concurrentiel standard (Figure 5) en raison des imprécisions dans la mesure des concentrations d’ADN aux concurrents à des niveaux faibles (< 100 nM).\nHanche-FA peuvent être mis en œuvre sur presque n’importe quelle norme, inversé, fluorescent microscope à épifluorescence, fourni la disponibilité d’un XY-stade automatisé et une étape d’axe z piezo. Composants optiques ont été construits autour d’une installation automatisée widefield équipée d’un objectif de longue distance. Dans la pratique, le dosage peut être adapté aux objectifs présentant d’autres caractéristiques (dans un travail particulier, distance et ouverture numérique). Cependant, cette technique nécessite optimisation des paramètres (distances entre les z-tranches, la porosité et la hauteur du gel d’agarose, etc..). L’utilisation d’autres types de lasers ou de la caméra est également possible. Une description détaillée de l’ensemble de la procédure expérimentale et analyse des données est donnée ci-dessous dans la section protocole.\n1. polarisation microscopie\nPour un éclairage laser widefield, concentrer une ligne de 638 nm d’un laser diode continu (40 mW) sur l’ouverture de la fibre optique multimode pour nettoyage du faisceau. Monter un polariseur linéaire à la sortie de la fibre pour définir la polarisation de la lumière laser.\nBloquer la composante de l’excitation de la lumière émise avec un miroir dichroïque (seuil de 640 nm) et un filtre passe-bande (passe-bande 700/75).\nLaissez le signal de fluorescence passent par un séparateur de faisceau polarisant, qui fractionne la lumière émise en ses composantes polarisées perpendiculaires et parallèles. Alors, se concentrer le faisceau non réfléchie (composante parallèle) et le faisceau réfléchi (composante perpendiculaire) avec une lentille achromatique de 200 mm de focale sur la puce d’une caméra CCD EM rétro-éclairé (Figure 1b et 1C). Utiliser un miroir pour ajuster la direction du faisceau perpendiculaire vers l’objectif.\n2. conception et essais de référence fluorescentes marquées DNA oligomère\nDéterminer la séquence de base de l’ADN de référence : la méthode est basée sur une analyse concurrentielle qui mesure la constante de dissociation (KD2) entre un facteur de transcription et les oligomères d’ADN concurrent sans étiquette qui est en concurrence pour la liaison avec un ADN fluorescent étiqueté dont affinité à la TF agit comme un références (KD1). La séquence consensus obtenue d’autres sources comme l’empreinte de DNase ou bactérienne 1-hybride peut servir comme un départ point5,15.\nRemarque : comme une règle, une référence appropriée ADN a un 3 d’ordre 7 diminution de l’affinité de liaison pour la TF par rapport à la séquence consensus.\nMesurer par HiP-FA le KD1s de mutations unique provisoires de 2-3 de la séquence consensus dérivé à l’étape précédente. Essayez de muter dans la séquence consensus des positions qui ne sont pas trop spécifiques pour éviter la perte complète de la liaison.\nRemarque : Il est important que la séquence de référence est liée par le facteur de transcription d’intérêt (nous avons utilisé dans le présent protocole Gt géant), mais pas trop fortement, afin que les concurrents plus faibles il peuvent supplanter à des concentrations élevées.\nÉtendre le motif de base (8-12 paires de base généralement) à une longueur de 16 paires de bases ou plus en ajoutant symétriquement flanquant la séquence de deux côtés (ajouter des chaînes latérales pour la liaison correcte). Si nécessaire (plus longtemps biding domaines, par exemple), utilisez des séquences plus longues (jusqu'à environ 50 paires de base ont été testés avec le test HiP-FA).\nAttention : Veillez à ne pas d’ajouter les bases qui devraient créer des sites de liaison ectopique. Utiliser des outils informatiques qui permettent de prédire les sites de fixation de PWM disponible pour faciliter ce processus (par exemple, PySite,22).\nComme référence étiquetée ADN, oligomères d’ordre qui sont étiquetées fluorescent soit transmettre ou inverser le fil à l’extrémité 3' ou 5'. Utilisez, par exemple Cy5, Bodipy-650 ou tout autre colorant approprié à une concentration de 10 µM (stock de 10 x 100 µM) dans de l’eau et diluer par étapes comme décrit à l’étape 3.1.\nPréparer 500 mL de 1 x tampon de liaison en ajoutant un tampon phosphate potassium 33 mM (pH = 7,0), 90 mM NaCl et 0,01 % de détergent non ionique dans l’eau distillée. Aussi préparer 3 x tampon de liaison, qui contient les mêmes composants, sauf à des concentrations triple. Si vous utilisez 3 x tampon de liaison comme solution-mère pour le 1 x tampon de liaison, préparer des volumes > 500 mL ; Sinon, préparer 250 mL.\nRemarque : Cette composition a été optimisée pour la stabilité de facteur de transcription et de prévenir la dimérisation de glutathion S-transférase (GST).\nMesure avec le programme d’installation de microscopie décrite à l’étape 1 la FA 200 µl de tampon de liaison contenant 0,8 nM libellé référence ADN en présence d’une quantité différente de TF dans une plaque de 96 puits de microscopie verre bas (5-6 puits avec différentes concentrations de TF) au déterminer la concentration de TF à utiliser. Effectuer une série de titration avec des quantités croissantes de TF et choisir pour le dosage de la concentration pour laquelle la courbe atteint un plateau, ce qui indique une liaison complète de l’oligomère de référence de l’ADN.\nRemarque : La concentration optimale de TF dépend des valeurs des constantes de dissociation TF-ADN. En règle générale, inférieure KDs nécessitent des concentrations plus faibles.\n3. oligomère recuit\nPour recuire les oligomères d’ADN de la référence étiquetée ADN (séquence déterminée à l’étape précédente), mélanger 7 µL d’un colorant marquée de 10 mM vers l’avant simple brin ADN solution et 7 µL d’une concentration de 10 mM de son complément inverse non étiqueté dans 186 µL d’eau.\nPour les séquences d’ADN de concurrent, mélanger 20 µL des solutions de 100 mM (dans l’eau, fourni par le fabricant) de l’ADN simple brin avant avec 20 µL de 100 mM de la correspondante inverse simple brin ADN pour chaque séquence de chaque concurrent doivent être mesurés.\nEffectuer le recuit séparément dans un cycler PCR standard en chauffer les solutions à 70 ° C pendant 3 min et en diminuant la température de la RT à raison de 0,1 K/s. Si la machine PCR utilisée ne supporte pas les gradients de température à ce rythme, il suffit de faire des incubations par étapes avec la température (testés étaient 99 cycles de 3 s avec K-0,40 par cycle).\n4. préparation du gel\nRemarque : La section suivante explique la préparation de deux différents types de gels : 1) les puits de titrage contiennent des gels avec protéine et servent à déterminer le K sDpour les séquences d’ADN de concurrents respectifs, et 2) les puits d’étalonnage utilisent NB à déterminer la concentration d’ADN à chaque hauteur de point et l’acquisition de temps donné. L’accent est mis sur la préparation de l’expérience dans une plaque à 96 puits, mais les volumes correspondants à un format de plaque 384 puits sont également indiqués.\nDissoudre 0,5 % p/v bas point de fusion d’agarose dans le tampon de liaison en la faisant bouillir dans un four à micro-ondes de laboratoire. Après dissolution complète, réglez le volume à nouveau avec les ddH2O pour compenser l’évaporation possible.\nRemarque : Pour plus de commodité, préparation d’un stock de 10-20 mL 10 parties aliquotes de gels et faire fondre à 75° C lorsqu’ils sont nécessaires. Les stocks de gel peuvent être stockés à température ambiante.\nAttention : Veillez à éviter la surchauffe de la solution de gel dans le four à micro-ondes. Court temps de chauffage avec agitation des intervalles entre les deux sont préférables.\nPour préparer les puits de titrage et de calibrage, tout d’abord faire fondre deux 10 mL gel stock parties aliquotes à 75 ° C sous agitation.\nUtiliser 240 µL (y compris frais généraux de 20 %) pour chaque concurrent (n = nombre de séquences de concurrent).\nUtilisez le même volume de gel pour le puits de calibration NB pour assurer une température égale et la viscosité des deux gels.\nRégler la température à 35 ° C, puis attendez que la température de s’équilibrer.\nPour les puits de titrage, ajouter 1,4 nM (concentration finale) hybridé référence ADN (obtenu en étape 3), protéine TF (concentration finale CTF = 20-60 nM, tel que déterminé à l’étape 2.6), TNT (0,2 mM) et la liaison de la mémoire tampon dans un volume total de n x 200 µL ou n x 13 µL dans un 96 - ou 384 puits plaque format, respectivement (plus les frais généraux). Mélanger soigneusement en inversant/secouant (ne pas de vortex).\nAjouter lentement 200 µL / puits en format de plaque à 96 puits (13 µL/puits puits 386) de la solution de gel préparé à l’étape précédente dans les puits de titrage la plaque bien.\nPour les puits de calibration, ajoutez d’abord 5 nM NB au gel fondu à l’extérieur des puits (totales volume selon le format de plaque bien utilisé et le nombre d’étalonnage puits ; 5-6 par plaque puits est généralement suffisant).\nPipeter 200 µL (13 µL pour format de plaque 384 puits) du Nouveau-Brunswick contenant un gel lentement dans les puits de titration de la plaque bien et n’oubliez pas d’éviter les bulles d’air.\nRemarque : L’utilisation des pipettes électroniques ou robotique augmente considérablement la reproductibilité.\nLaisser le gel se solidifient pendant 10 min à ta et un autre 10 min à 4 ° C (retirer la condensation de la vitre par la suite si nécessaire). Assurez-vous d’effectuer toutes ces étapes sur une surface parfaitement horizontale pour éviter les surfaces gel non homogènes.\nRemarque : Les gels contenant de la protéine sont généralement stables pendant au moins plusieurs heures à 4 ° C.\n5. ajouter la Solution d’ADN concurrent\nRemarque : Les solutions suivantes doivent être préparées avant de commencer le titrage et sont ajoutées sur le dessus des puits de calibration et de titrage en même temps.\nAjouter que le recuit marqué référence ADN et les protéines chez 3 x tampon de liaison à 3 fois les concentrations plus élevées que les aliquotes de stock de gel.\nMélanger 20 µL de la solution obtenue avec 40 µL de chaque recuit solution concurrent d’ADN obtenue à l’étape 3.\nPour chaque puits de calibration, mélanger 20 µL de 3 x tampon de liaison contenant 15 mM NB solution 40 µl de recuit concurrent ADN (n’importe quelle séquence de même longueur est adapté).\nRemarque : Pour les plaques 384 puits, utilisez µL 21 au lieu de 60 µL au total.\nVous pouvez également vérifier l’homogénéité les niveaux de hauteur de gel dans les différents puits de la plaque par spectroscopie en mesurant l’absorbance à 380 nm, en utilisant un lecteur de plaque multipuits (les valeurs d’absorbance sont proportionnels aux hauteurs de gel).\nAjouter 50 µL (7 µL pour format de plaque 384 puits) des solutions d’ADN concurrent mixtes (recuit à l’étape 3) sur le dessus les gels. Essayez d’ajouter toutes les solutions de concurrent aussi simultanément que possible à l’aide de pipettes multicanaux électroniques ou une tête de pipetage de 96 voies, si elles sont disponibles. Après l’addition des solutions concurrent, placer la plaque sur la platine du microscope et commencer les mesures immédiatement (étape 7).\n6. Acquisition d’images\nSéquentiellement acquérir fois série de z-piles (p. ex., utilisation 12 avions et 100-300 ms de temps d’illumination). Éviter de prendre des photos trop près de la surface du bien (< ~1.4 µm avec les plaques utilisées dans les présentes) d’exclure toute partialité de polarisation.\nEffectuez 10 à 25 cycles de mesures jusqu'à la séparation complète de l’ADN de référence marquée de la TF. Le point de terminaison est généralement atteint après 1-2 h, selon la cinétique de liaison et de la diffusivité du concurrent ADN.\n7. extraction des FA(z,t) de données brutes\nUne fois une plaque puits a été imagée, calculer à partir des images brutes fluorescence les valeurs de pixel moyenne des régions d’intérêt pour le parallèle (I=) et verticalement (I+) polarisées intensité composants (Figure 1c). Cela peut être fait automatiquement à l’aide de la hanche-FA logiciel23.\nRemarque : Le logiciel HiP-FA, un manuel d’instructions et un ensemble de données de test peuvent être téléchargé23. Également utiliser tout autre logiciel d’écriture personnalisée pour extraire I= et j’ai+ et effectuer l’analyse en aval des courbes de titrage, tel que décrit en détail ci-dessous.\nCalculer FA pour chaque puits. Pour chaque puits, le script calcule FA(z,t) dans chaque position z et temps point t selon :\nOù G est l’instrument de G-facteur qui corrige tout biais vers le chenal perpendiculaire.\nDéterminer le facteur G de l’installation de microscopie en mesurant la FA de toutes les solutions contenant un colorant fluorescent de l’anisotropie connu. Extraire les composants de deux polarisation du signal et ensuite utiliser l’équation 1 pour obtenir G, sachant la FA de la solution (G = 1,15 dans cette configuration).\n8. courbe d’étalonnage pour la détermination de la Concentration d’ADN de concurrent de FANB\nRecuire 120 µL de chaque oligomère de référence avant et arrière (concentration stock 100 mM ; n’importe quelle séquence aléatoire avec la même longueur que le concurrent séquence peut être utilisé) et mélanger avec 120 µL de 3 x tampon de liaison contenant NB (15 nM).\nPréparer une série de dilution avec des dilutions de 1:2 en 1 x tampon de liaison avec des 6 dilutions au total. Mélanger 50 µL de ces dilutions avec 200 µL de gel d’agarose (T > 35 ° C) point de fusion bas de 0,5 % en 1 x tampon de liaison contenant 5 nM du NB de réanalysés.\nAjouter 200 µL de chacune des 6 solutions préparées à l’étape précédente dans une plaque à 96 puits et stocker la plaque pendant 1 h à 4 ° C pour assurer la complète gélification, puis 1 h à RT. mesure la FANB des solutions à l’aide de la configuration de hanche-FA.\nExtrait de FANB (z, t) conformément à l’étape précédente et ajuster les données en utilisant une équation de Hill :\nÉquation 2 :\nOù CADN est la concentration de l’oligomère d’ADN ; k la concentration des oligomères ADN à laquelle la moitié des sites de liaison sont occupés ; FAmax est une constante de normalisation ; et n est le coefficient de Hill. k, FAmax et n sont définies comme paramètres libres au cours de la procédure d’ajustement.\nEntrer les trois paramètres obtenus à partir de la procédure d’ajustement dans le logiciel HiP-FA (dans le panneau inférieur gauche).\nRépéter la détermination de la courbe d’étalonnage après quelques mois ou après des changements dans la configuration de la microscopie.\n9. détermination des Concentrations d’ADN de concurrent\nUtilisez le logiciel HiP-FA pour extraire c (z, t) partir des mesures de FANB(z, t) (Figure 3). Tout d’abord obtenir la courbe d’étalonnage comme décrit dans la section précédente et entrez les paramètres d’ajustement du logiciel (voir le manuel pour plus de détails).\nUtilisez le programme d’extrapoler automatiquement c(z,t) pour c < 100 nM (voir le manuel pour plus de détails) en utilisant l’équation 3 (Figure 3b), qui décrit la diffusion unidimensionnelle du concurrent ADN dans le gel d’agarose, en supposant que diffusion gratuite.\nÉquation 3 :\nC0 est la concentration initiale du concurrent ADN ; ERF est la fonction d’erreur ; z est la position ; D est le coefficient de diffusion du concurrent ADN ; et t0 est l’heure du départ des mesures. Les paramètres libres utilisés sont C0 et z / .\n10. classique titrage concurrentiel avec HIP-FA pour fixation à l’ADN très fort\nEn série de diluer les oligomères d’ADN différents concurrents dans les lignes d’une plaque à 96 puits (ou une plaque 384 puits) aux concentrations de : 0, 1,25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 et 4000 nM. Ajoutez la référence étiquetés Cy5 ADN (1 nM) et TF (20 à 50 nM) à une concentration constante, avec un volume total de 200 µL / puits dans le tampon de liaison (Figure 5a). Attendre 40 min jusqu'à ce que l’équilibre thermodynamique est atteint et d’acquérir (avec l’installation de hanche-FA) z-piles pour chaque puits (dispositif acquiert plusieurs images / puits réduit la variabilité en faisant la moyenne des valeurs calculées de FA).\nConstruire les courbes de titrage de liaison équilibre et fixez-les avec l’équation 4 (Figure 5b). KDs déterminée par titration concurrentielle classique sont identiques à ceux obtenus par HIP-FA à l’aide d’un gel d’agarose de matrice des20.\n11. procédure des courbes de titrage FA d’ajustement\nLes courbes de titrage reconstituées pour les séquences de chaque concurrent d’affichage dans le logiciel HiP-FA FA(z,t) = f[c(z,t)] et vérifier visuellement la qualité des données (voir le manuel pour plus de détails). Le cas échéant, préciser les paramètres utilisés pour déterminer les concentrations d’ADN de concurrent à l’étape 10.\nS’adapter à chaque courbe de titration individuelle automatiquement à l’aide d’équation 4, qui donne une solution analytique pour le titrage concurrentiel essais24.\nÉquation 4 :\nOù RT est la concentration de la protéine ; LT est le sans étiquette et LST est la concentration d’ADN marquée ; D2 de la K est la constante de dissociation à déterminer ; RT est la concentration de protéine active ; et A et B sont des paramètres de normalisation.\nTout d’abord déterminer KD1, qui sert de référence pour déterminer les différentes valeurs de KD2 . KD1 est peut être aisément déterminée avec le test en choisissant la séquence d’ADN de colorant-référence que la séquence du concurrent sans étiquette ADN (voir manuel).\nEntrez la valeur obtenue de KD1 dans le logiciel et de calculer les valeurs de KD2 pour tous les concurrents ADN sur la plaque.\nRemarque : Les paramètres libres de la procédure d’ajustement sont KD2, R,T, A et B.\nExporter la constante de dissociation KD2 et la concentration de la protéine active RT pour tous les puits de titration individuelle de la plaque en cliquant sur le bouton « Exporter » dans le logiciel.\n12. PWM Construction, spécificité des interactions protéine-ADN et comtes de Pseudo\nCréer les logos de séquence pour le PWM différents à l’aide de l’outil en ligne WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), comme décrit plus haut20.\nNous avons appliqué le HiP-FA à TFs de la segmentation gène réseau25,26, qui génère le modèle corps antéro-postérieur des embryons de drosophile, en grande partie par le biais de la régulation transcriptionnelle. De ce réseau, nous avons choisi le bZIP domaine TF géant (Gt) pour une analyse détaillée (Figure 4). Comme des facteurs de transcription pleine longueur sont difficiles à exprimer et donnent pour la plupart les mêmes préférences de liaison que leur ADN liant domaines (DBD)13, nous avons utilisé le DBD fusionnés avec TPS et exprimé la construction dans les protéines de fusion e. coli GST à fournir les mêmes résultats que seul DBDs20.\nLa séquence consensus Gt (uneTTACGTAAC) représente la séquence de liaison plus forte que nous avons déterminé tel que décrit ci-dessus. Ensuite, nous avons étudié l’influence sur l’énergie de liaison de toutes les mutations de point unique possibles au sein de la séquence Gt 10-mer (un total de 30), flanqué des bases supplémentaires aux extrémités 5' et 3'. Nous avons mesuré deux répétitions dont échantillons de gel ont été produites à l’aide d’automation et une réplique supplémentaire produites manuellement pour comparaison. Le KDs se situe entre 0,6 nM > 2000 pour les séquences séparément mutées, et nous a également confirmé l’absence totale de se lier à une séquence de « non contraignant » (données non présentées).\nSpécificités TF-ADN sont généralement modélisées en utilisant une matrice de poids position (PWM), dans lequel un score est attribué à chaque nucléotide possible à chaque position dans le motif de liaison. Le PWM suppose que chaque position contribue à reliure force indépendamment et dans la plupart des cas constitue un modèle suffisant pour TF contraignant préférences27. Nous avons généré PWM révisé basé sur nos mesures d’affinité qui suit établit les procédures28,29 et comparés à deux PWM précédemment rapportées dans la littérature. Le premier est issu des comtes de fréquence de nucléotides des sites identifiés par ADN empreinte4,5de fixation, et le deuxième PWM a été obtenu par la sélection bactérienne un hybride (B1H). 15\nLa forte similarité de la ce pour les trois répétitions (Figure 4, panneau supérieur), y compris pour l’échantillon préparé manuellement (réplication 3), illustre la grande reproductibilité de la méthode de hanche-FA. Tandis que le PWM obtenue par HiP-FA est globalement semblables à la PWM obtenue avec les autres méthodes (Figure 4, panneau inférieur), il y a des déviations significatives : à la position 2 (flèche noire), le début du motif coeur bZIP, mutations T > (G, C, A) conduire à compléter la perte de la liaison dans le motif obtenu par HiP-FA, qui est compatible avec le motif B1H mais pas avec celle obtenue avec l’empreinte de DNase, dans lequel la liaison reste relativement forte pour bases (G, A). À l’inverse, à la position 7 (flèche grise), la mutation T > C conduit à beaucoup liaison plus forte que ce qui était attendu basé sur le PWM précédemment mesurée.\nAutres écarts sont plus subtil mais non moins important. Dans l’ensemble, le PWM HiP-FA est moins spécifique que les deux autres, compte tenu du fait que plusieurs mutations du consensus entraînent toujours liaison modérément forte. Cela peut être quantifiée à l’aide du contenu de l’information (IC). L’IC est de 11,5 bits pour la matrice de hanche-FA (moyenne des trois répliques), comparée à IC = 13,4 bits et 16,8 bits pour l’empreinte de la DNase et matrices B1H, respectivement. Généralement (mais pas universellement), le PWM obtenue par HiP-FA est moins précis que ceux obtenus par d’autres méthodes, basées sur 26 TFs enquêté sur20.\nFigure 1:des représentations schématiques de la hanche-FA test et montage expérimental. b système de livraison gel pour titrer concurrent ADN unique puits. (b) installation de hanche-FA microscopie. Personnalisé de microscope widefield automatique avec détection de lumière de fluorescence polarisée sur un EM-CCD de la caméra. (c) les premières images de fluorescence avec les deux régions d’intérêt utilisé pour déterminer le parallèle (rouge) et la perpendiculaire (vert) polarisé composants. (d) synoptique typique d’une plaque à 96 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 2 : Données brutes FA et courbes de titrage reconstituées. (a) trajectoire de FA(z,t) typique d’un étalonnage cupule contenant NB (b, c) Fa(z,t) les trajectoires de temps pour les deux puits de titrage mesurant la liaison forte (b) et un concurrent de liaison plus modéré (c) DNA. (d, e) Correspondant reconstruit mesures de titration de FA et monté des courbes pour le fort (d) et modéré (e) contraignant. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 3 : Détermination de la concentration du concurrent ADN c (z, t) à l’aide du Nil bleu (n.-b.). (a) courbe d’étalonnage FA-concentration pour 16 oligomères de paires de bases ADN. Dans une série de classiques de titrage, NB est incorporé en gel d’agarose avec différentes concentrations d’ADN de concurrent. L’affinité du NB d’ADN est indépendant de séquence20; par conséquent, les mêmes courbes d’étalonnage peuvent être utilisées pour la détermination de c (z, t) pour des séquences d’ADN différentes de la même longueur. b profil diffusion temps concurrent ADN à un arbitraire z hauteur déterminée à l’aide de cinq puits de calibration. Pour chaque cycle de mesure, le FAs moyen de quatre puits contenant du NB sont affiché comme points blancs. Les courbes sont montés à l’aide de l’équation 3 (ligne blanche, des puits individuels en couleur) et le c (z, t) à de faibles concentrations (C < ~ 100 nM) est déterminé par la courbe extrapolée de raccord. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 4 : Liaison des spécificités de la famille de domaine bZIP TF géant (Gt). HIP-FA PWM de trois répétitions : deux préparés en utilisant automation et un préparé manuellement (panneau supérieur) sont comparées avec la PWM généré par l’empreinte de DNase et par la méthode de sélection un hybride (B1H) bactérienne (panneau inférieur). Dans l’ensemble, les motifs de liaison HIP-FA concordent avec les données précédentes, mais montrent également des différences significatives, comme le souligne avec des flèches noires et grises. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nFigure 5 : Classique titrage concurrentiel avec HIP-FA. (a) conception de la plaque montre 8 concurrents différents ADN dilués en série dans le tampon de liaison dans une seule ligne d’une plaque à 96 puits. Une carte de chaleur FA apparaît pour forces de liaison arbitraire différente. (b) concurrentiel titrage des trois concurrents DNAs liant à la TF Bcd avec des affinités différentes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.\nHanche-FA est une nouvelle méthode complète pour déterminer les paysages de préférence de liaison des interactions ADN-TF. Il mesure des affinités de liaison de mutational ADN motif variantes directement, en évitant toute hypothèse sous-jacente que les préférences de fixation sont reflétées dans la fréquence d’apparition des nucléotides dans un ensemble de liants au-dessus de seuil. Mesure a lieu dans la solution sans immobilisation et d’interférence mécanique ou chimique dans la réaction de liaison, se rapprochant des conditions d’équilibre autant que possible. Le système de livraison contrôlé permet de mesurer une courbe de titrage complet au sein d’un même bien et augmente le débit et la fiabilité tout en économisant des protéines. À l’aide d’un objectif avec une grande ouverture numérique et EM-CCD caméra avec un rendement élevé de collecte lumineuse permet une détection lumière fluorescente hautement sensible. Donc, avec cette configuration, FA petit changements aussi bas que 10-15 mP peut être détectée avec précision ; dans la pratique, cela signifie que toute réaction de liaison dont l’augmentation de la masse après que liaison est minime (aussi bas qu’un rapport de masse des 2) est facilement détectable. Ce n’est généralement pas le cas avec les systèmes commerciaux comme des lecteurs de microplaque. Grâce à sa haute sensibilité, HiP-FA étend la gamme des constantes de dissociation qui peut être évalué de façon fiable dans la gamme picomoles. Énergies de liaison sont déterminés avec précision plusieurs ordres de grandeur.\nPour évaluer la qualité de la PWM révisé, nous avons réalisé deux types d’analyse20. Nous avons testé, pour cinq facteurs du réseau gène segmentation, comment bien différents PWM permet de prédire des profils de ChIP-seq expérimentaux dans les régions génomiques de 21 gènes de segmentation. Un deuxième test, nous avons utilisé un modèle d’expression de la séquence4 qui prédit les profils d’expression des exhausteurs de segmentation sur la base de la liaison préférence et la concentration protéique de TFs participantes. Dans les deux exercices, nous avons constaté que la moins spécifique PWM HiP-FA effectuer beaucoup mieux que l’empreinte plus spécifique et B1H PWM20.\nContrairement aux méthodes de novo , HiP-FA nécessite une connaissance préalable de préférence de liaison de donnée TF. Toutefois, des séquences consensus sont connus pour TFs beaucoup, et beaucoup de méthodes existantes peut leur fournir13,14,15. Le cas échéant, la séquence de la véritable fixation optimale se trouve par itération.\nNous avons utilisé des oligomères de référence ADN fluorescent étiquetés Cy5 et Bodipy-650. Ces colorants sont avérés pour effectuer bien pour les mesures de la FA, l’anisotropie de l’ADN marqué-référence dépendant et indépendant étant le plus important parmi les différents colorants testés. Cela garantit une portée dynamique maximale pour les valeurs de la FA. En règle générale, n’importe quel colorant fluorescent avec une fluorescence lifetime ≥ 1 ns est susceptible d’être adapté mais doit être mis à l’essai d’abord. Si possible, il est conseillé d’utiliser des colorants réagissant dans la gamme de l’infrarouge proche pour minimiser la protéine autofluorescence.\nL’étape la plus critique de la méthode expérimentale est le pipetage du gel dans les plats. Bonne reproductibilité exige le gel des volumes être aussi uniformes que possible. Changements de hauteur de gel sont traduites en changements de diffusivité de l’oligomère ADN concurrentiel et donc au changements apparents d’affinité lorsqu’on évalue les données. Il s’agit de la principale source de variance dans une adaptation technique. L’utilisation d’une techniques de pipette ou automatisation électronique améliore la reproductibilité. Bulles d’air dans le gel peuvent être évités en pipettant également, lente et minutieuse. Il est également important d’ajouter les toutes les solutions de concurrent sur le dessus des puits de titrage avec peu de retard que possible. Pour une meilleure reproductibilité, l’ensemble du processus peut être automatisé à l’aide d’un robot de pipetage avec incubateurs de chaleur. La nécessaire optimisation de la température de l’incubateur et les temps d’incubation est essentiel pour le transfert du protocole à l’automatisation. Assurez-vous de trouver un équilibre optimal entre la viscosité du gel (i.e., pas trop froid) et de la stabilité des protéines (c.-à-d., pas trop chaud). Cela dépend à la fois sur la vitesse de distribution des gels dans le puits et la stabilité de la protéine utilisée.\nHanche-FA fait usage d’un système de livraison contrôlé pour les oligomères d’ADN de concurrent. Pour construire les courbes de titrages, il est nécessaire de déterminer la concentration d’ADN concurrent c(z,t) pour chaque donnée z-positionner dans le gel et le point tdu temps. Il s’agit d’une autre étape critique, étant donné que la détermination de KDs dépend directement de c(z,t). Puits de calibration contenant le colorant NB comme un capteur pour la concentration d’ADN sont utilisés à cet effet (dde laFigure 1, Figure 2a). 3-5 puits de calibrage contenant NB par plaque sont généralement suffisants. Avant d’évaluer toute hanche-FA expérimenter, une courbe d’étalonnage NB devrait être construite pour l’installation en exécutant une série de classiques de titrage du NB dissous dans le gel d’agarose avec un concurrent de l’ADN de n’importe quelle séquence à différentes concentrations (Figure 3 un), comme cela est expliqué en détail à l’étape 8. Dans le cas de très forte liaison (KD < 500 h), l’extrapolation utilisée pour la détermination de faibles concentrations de concurrent ADN devient limitant, car il est moins précis qu’une mesure directe. Toutefois, pour TFs avec ce bas KDs, le programme d’installation de hanche-FA peut servir à effectuer un titrage concurrentiel conventionnels dans le tampon de liaison sans l’utilisation d’une matrice de gel d’agarose (Figure 5). Par exemple, un titrage complet avec 12 différentes concentrations d’ADN concurrent peut être effectuée en une seule rangée d’une plaque de 96 puits.\nLe système de livraison contrôlé nécessite également les cinétique de liaison rapide TF-ADN et protéines stables, depuis la diffusion si le gel d’agarose est dynamique (bien que lente). Ces deux propriétés peuvent être testées directement avec l’installation de hanche-FA en se conformant, au fil du temps, la FA le TFS d’intérêt lorsqu’elle est liée à leurs respectifs fluorescent étiqueté référence ADN. Nous avons mesuré le taux KON et KOFF pour les facteurs étudiés et les ai trouvés est de l’ordre des millisecondes à secondes20, conformément à d’autres études30. C’est suffisamment rapide pour s’assurer que les mesures se déroulent à l’équilibre. Dans le cas d’autres réactions de liaison avec une cinétique plus lente, la diffusivité du concurrent peut être réglée en abaissant sa concentration ou réduire la taille de pore de gel. Dans le cas de la TSF testées, qui tous ont vite TOFF (~ secondes), un temps de mesure totale d’environ 1-2 h est suffisant pour assurer l’équilibre thermodynamique à chaque mesure.\nUn autre problème potentiel lié à la protéine est la formation d’agrégats de protéines qui peuvent altérer les mesures de FA. L’utilisation d’autres conditions de tampon contenant différents additifs (comme tensides) peut empêcher la formation globale, si nécessaire.\nNous avons travaillé dans l’hypothèse de linéarité de la PWM ; Cependant, HIP-FA peut être redimensionnée afin d’inclure toutes les mutations possibles di-nucléotides de la séquence consensus. Enfin, HiP-FA peut être adapté pour mesurer les autres types d’interactions de liaison. Le prérequis est d’avoir une molécule de référence approprié disponible lié par la protéine qui peut être étiquetée fluorescent. Avec le système de livraison contrôlé, un gradient de concentration peut être généré pour tout type de ligand ; par conséquent, interactions protéine-protéine et protéine-médicament peuvent être mesurées de la même façon de haute fidélité et un débit.\nNous remercions J. Müller de clones d’ADNc et les membres du laboratoire de la Gaule, en particulier S. Bergelt, de précieux conseils et discussion animée. Ce travail a été soutenu par SFB 646, réseaux de régulation dans l’Expression du génome et l’entretien (juge en chef, P.B.), le centre pour Science de la protéine intégrée (UG) et la Graduate School de Munich de Biosciences Quantitative (M.S.). U.G. reconnaît soutenir par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF : ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie) et la Fondation Humboldt (Alexander von Humboldt, Poste de professeur).


Montpellier Hérault Rugby - Stade Français en direct - 27 février 2022 - Eurosport\nTop 14 - Suivez en live la rencontre de Rugby opposant Montpellier Hérault Rugby et Stade Français. Ce match se déroule le 27 février 2022 et débute à 17:30. Rugbyrama propose pour cette rencontre un suivi en direct permettant de connaître l'évolution du score et les actions importantes.\nAprès un premier acte où les Montpelliérains se sont montrés plus réalistes et opportunistes, le MHR a fait la différence au retour des vestiaires, avec une meilleure occupation du terrain et une grosse pression mise sur des Parisiens finalement en difficulté pour inverser la pression. Avec 3 essais marqués pour aucun encaissé, les Cistes décrochent en plus le bonus, tandis que le Stade Français pourra regretter quelques coups...\nFIN DU MATCH. Montpellier s'impose 30 à 3, avec le bonus offensif, face au Stade Français.\nLe lancer de Roelofse à 23m, sur la droite, avec un ballon porté mis en place par les Parisiens. C'est ressorti, et le jeu est renversé. Paris va sur ses extérieurs, et Lapègue sur la gauche. Le cuir est tombé...\nUne pénalité en faveur de Paris, sur ses 40m, récupérée dans le secteur de la mêlée. C'est une occasion de rejouer dans le camp adverse et de tenter un dernier coup.\nLe Stade Français, qui était sur une meilleure dynamique, n'enchainera pas un troisième succès de rang.\nLe MHR va aller chercher un dixième match sans défaite en TOP 14, avec neuf succès pour un nul.\n... et Serfontein qui percute, maintient l'avancée du MHR. Pour autant Lamositele pénalisé à 5m de l'en-but pour un ballon gardé au sol, manquant d'ailleurs de soutiens.\nOn sent que les Cistes ont marqué leur adversaire, car ils récupèrent encore un autre ballon d'attaque et profitent maintenant de nombreux espaces, qu'exploite Ngandebe...\nLa transformation pour Bouthier dans la foulée, en prenant tout de même son temps... 30-3\nL'ESSAI DU BONUS POUR LE MHR ET GABRIEL NGANDEBE ! Sur cette phase près de la ligne, le ballon sort pour l'ailier, lancé, et qui après ses crochets peut éliminer pour se jeter sur la ligne au pied des poteaux. 28-3\nVan Rensburg capte ce lancer, côté gauche, à environ 10m. Montpellier pousse près de l'en-but, avec du jeu direct. C'est du "pick and go".\nLes Stadistes se heurtent à un mur et semblent avoir de plus en plus de mal à basculer le jeu dans le camp adverse, à inverser la pression et la dynamique. Et ils sont pénalisés dans leur camp, voyant les Cistes taper en touche.\nMêlée effectuée par les Parisiens dans leur camp, et qui obtiennent la pénalité. Le pilier droit a poussé en travers.\nBouthier a trouvé la touche dans le camp adverse, et l'on voit Dakuwaqa en premier attaquant sur l'aile droite. Les Cistes travaillent devant les 22m, et sur une passe de Aprasidze vers Nariashvili, un en-avant est concédé par le pilier.\nLe lancer à 5m cette fois pour Panis, et Azagoh qui ne capte pas. Avec de la réussite, Paris récupère la possession, et sur le reculoir, la pénalité contre le Stade alors que Serfontein est venu contester dans les bras de Naivalu.\nLe lancer parisien, et Azagoh qui capte. Le passage par le sol, et la défense montpelliéraine à la faute. Le maul avait été écroulé tandis que le cuir est à nouveau expédié en touche par Paris.\nUne pénalité obtenue par les Parisiens à 45m, pour plaquage haut, et Segonds qui tape en touche pour trouver un lancer à 20m, sur la droite.\nOn notera les chiffres en touche, 4 ballons perdus par Montpellier pour 1 ballon perdu par Paris dans ce secteur.\nVeianu qui progresse devant les 40m, et décale Naivalu. Puis tous les trois-quarts parisiens se replacent pour maintenir l'avancée sur cette attaque rapide. Pour autant, encore un gros travail défensif du MHR, à l'image de Mercer. Et c'est récupéré par les Cistes qui repoussent le danger.\nLe MHR prend 20 points d'avance, alors que Paris paie son manque de réalisme.\nLes points sont demandés par Montpellier qui ajoute 3 points par Foursans-Bourdette, d'un coup de pied de pénalité des 20m. 23-3\nSerfontein qui joue après-contact dans l'axe, puis Mercer qui entre dans les 22m parisiens. Aprasidze donne du rythme à l'attaque du MHR, et un plaqueur parisien à la faute. L'avantage est laissé, et ne profite pas. Chapuis n'était pas sorti assez vite.\nEncore une fois, c'est allé très vite d'un camp à l'autre et le MHR qui pousse pour aller chercher un troisième essai qui serait synonyme de point de bonus offensif.\nHamdaoui attaque la ligne sur les 40m adverses, et le ballon ensuite écarté sur l'aile gauche. Chapuis fait en-avant, turnover et Tisseron pour le contre montpelliérain avec du dribbling et un ballon dans les 22m parisiens !\nVeianu qui relance Paris sur un ballon récupéré dans ses 22m, et une belle course. Puis les Parisiens se soulagent d'un autre coup de pied.\nCe sera une pénalité contre le Parisien, Moses Alo-Emile se rend coupable de jeu déloyal et écope d'un carton jaune.\nUne nouvelle fois, la vidéo est demandée, pour une percussion de Moses Alo-Emile sur Becognee sur cette séquence. Le Parisien percute le Montpelliérain, on veut voir s'il y a un changement d'axe de course, et si le point de contact est haut ?\nPercillier essaie de trouver des espaces au près, et le demi de mêlée parisien fait en-avant alors que Paris avait perdu un peu de terrain sur une séquence pourtant intéressante.\nParis qui parvient à écarter et qui - sur le couloir droit - voit Briatte éliminer. Du surnombre possible, de l'avancée et du rythme. Le Stade Français se rapproche des 22m adverses.\nDu jeu au pied pour tenter d'inverser la pression, et Montpellier qui tente la contre-attaque grâce à la vitesse de Ngandebe, bloqué à son tour. Puis Foursans qui alterne et monte une quille. Cela joue à gagne-terrain.\nUne autre mêlée pour Paris dans son camp cette fois, devant ses 22m, et la relance des Stadistes derrière l'épreuve de force. Hamdaoui se fait bloquer.\nL'enchainement de maladresses depuis quelques instants empêche la continuité du jeu...\nIntroduction parisienne donc, et cela tourne ! Le pack du MHR récupère la pénalité.\nLe rythme forcément haché par cet enchainement de mêlées et ces deux arbitrages vidéo.\nUne introduction effectuée, et un ballon qui part sur le fermé avec Aprasidze. Nouvel en-avant du demi de mêlée héraultais...\nAu tour de Aprasidze de tenter un par-dessus mais qui fait en-avant. Le premier en-avant sur la séquence était parisien, alors on jouera une mêlée introduction montpelliéraine juste avant la médiane.\nLes Stadistes veulent redonner du rythme à leur attaque, face à une défense qui monte vite sur le porteur de balle. Encore un par-dessus tenté pour jouer dans le dos du premier rideau, le MHR est en couverture au moment de se replier.\nCet essai fait pour l'instant basculer ce duel, car on est passé proche de l'essai parisien pour finalement voir le break montpelliérain.\nA gauche des poteaux, Foursans-Bourdette transforme. 20-3\nL'ESSAI DU MHR, ALEXANDRE BECOGNEE ! Pas en position de hors-jeu sur ce ruck, le joueur surgit sur le côté du ruck pour venir aplatir au nez et à la barbe de Percillier. 18-3\nLe ruck formé sur la ligne d'en-but parisienne voit le cuir sortir, être dispo pour le demi de mêlée. Percillier tarde à prendre le ballon, tandis que Becognee qui n'est pas joueur du regroupement surgit sur le côté pour faire pression sur le ballon. Pas de position de hors-jeu de l'Héraultais et cela va être validé.\nNouvelle vidéo demandée, pour un possible essai de Montpellier !\nPaenga-Amosa pour van Rensburg, sur ce côté droit, et Montpellier qui gagne du terrain grâce à un porté. Le jeu est renversé, et Lucas qui pousse au pied poru voir Paris à la récupération mais sous pression devant sa ligne.\nLe premier contre de la partie, en touche, réalisé par les Cistes sur le lancer de Panis. Et Montpellier qui insiste avec un jeu au pied de pression, qui débouche sur une touche... pour le MHR.\nC'est donc une mêlée à 5m pour le MHR, qui subit dans ce début de seconde période. Et qui voit Paenga Amosa jouer derrière son alignement, pour trouver Mecer. Puis Aprasidze dégage en touche.\nPAS D'ESSAI POUR PARIS ! Sur cette séquence, Barré effectue un par-dessus pour éliminer le premier rideau. C'est récupéré derrière, et c'est ensuite orienté sur l'aile gauche d'un autre coup de pied qui voit Lapègue se saisir du cuir, le long de la ligne de touche... et finir. Mais le pied de l'ailier est en touche !\nL'essai parisien ? La vidéo est demandée...\nParis attaque sur son aile droite après la mêlée, et son demi de mêlée donne de la vitesse. Tentative de coup de pied à suivre de Segonds, contré, mais qui récupère. Le MHR ne recule pas.\nIl y avait en-avant montpelliérain sur cette séquence, au moment du duel aérien sur le jeu au pied parisien. L'épreuve de force est jouée sur les 40m, Percillier à l'introduction alors qu'il y a eu des soucis pour se lier.\nPour l'instant, Paris tient bien le ballon et cherche à défier, avant cette alternance et ce coup de pied qui permet la récupération des Stadistes dessous. Naivalu tente le coup de pied à suivre, contré, qui lui revient et veut transmettre à Veainu à l'entrée des 40m adverses.\nMI-TEMPS. Le MHR mène 13 à 3 à la mi-temps face au Stade Français.\nLa touche n'est pas trouvée par Segonds, et Bouthier qui tape en dehors des limites.\nA force de mêlées, le pack montpelliérain se met à la faute. Forletta a amené son vis-à-vis au sol et le pilier est sanctionné.\nCette autre mêlée s'effondre à nouveau... pas plus de réussite.\nLa mêlée introduite par Reinach, le pack héraultais avance un peu. L'arbitre intervient pour refaire jouer l'épreuve de force qui a tourné.\nLes Parisiens ont un peu de réussite en défense, alors que les Montpelliérains ont cette envie de jouer. Autre relance, et cette fois ce sont Mercer puis Ngandebe qui donnent du rythme et de l'avancée, avec du jeu debout. Pour autant, un en-avant à environ 35m casse la dynamique.\nLa pénalité est jouée à la main pour un coup de pied vers la gauche... Foursans se précipite, et Hamdaoui capte. Il y avait mieux à faire pour le MHR.\nJustement, une autre pénalité contre Roelofse pour un mauvais contest à 20m. Et quel rythme sur la relance des Cistes, grâce au crochet de Bouthier. Reinach a maintenu le rythme.\nLe plus difficile pour Paris, c'est d'inverser la pression alors que Montpellier revient toujours vite - et fort !\nFinalement, le Stade Français qui peut introduire, et le cuir sort avec Godener en percussion. Et la défense se donne de l'air grâce à Segonds.\nLa mêlée à jouer pour Paris, quasiment sur ses 22m. Percillier ne peut introduire, on manque de stabilité des deux côtés.\nSur le renvoi, Tisseron plus rapide à la course et qui est à deux doigts de récupérer le cuir dans les airs pour s'offrir une occasion d'essai. Mais il fait en-avant.\nPénalité pour le Stade Français. Des 25m côté gauche, Segonds débloque le compteur des Parisiens. 13-3\nMêlée à 10m de sa ligne pour le MHR. Mercer enchaîne et fait avancer les siens avec puissance. Mais les soutiens sont à la faute.\nLancer pour Panis sur les 15m, côté gauche. Le Parisien lobe son alignement. Pour M. Brousset le lancer n'est pas droit.\nA l'approche des 22m du MHR, le pack parisien n'avance plus. M. Brousset revient à une faute de Van Rensburg qui est passé sur le côté.\nC'est un échec pour Segonds. Des 40m, dans l'axe, le cuir passe trop à droite pour le buteur parisien...\nHamdaoui tente de lancer le jeu dans l'axe mais se heurte à un rideau montpellierain très compact. Ouedraogo est rappelé à l'ordre sur sa tentative de grattage. Pénalité pour le Stade Français !\nSanchez est contraint de quitter le terrain pour un protocole commotion. Segonds fait son entrée dans les rangs parisiens.\nDes 25m, du côté droit, Foursans soigne l'avance des siens. Le MHR se détache. 13-0\nCarton jaune pour Chapuis ! M. Brousset revient à un en-avant jugé volontaire du troisième-ligne parisien.\nParis est sanctionné pour une faute au sol et rend la possession aux Montpelliérains.\nMêlée introduction Percillier sur les 22m du MHR, côté gauche. Le Parisien sort rapidement et lance ses trois-quarts.\nFace aux perches, Foursans se charge de la transformation. 10-0\nESSAI POUR LE MONTPELLIER HÉRAULT RUGBY, MERCER ! Bouthier récupère un ballon perdu et sert Galletier. Belle combinaison dans le couloir gauche avec le troisième ligne qui peut filer seul aplatir entre les poteaux, suite à un enchainement de surnombres sur cette contre-attaque. 8-0\nLes deux formations accélèrent et les turnovers s'enchaînent.\nLapègue avance dans le couloir gauche. Barré enchaîne au pied mais Ngandebe est le premier dans son en-but pour aplatir et sauver la défense montpelliéraine.\nMêlée introduction Percillier, dans le camp montpelliérain à 40m. Le demi-de-mêlée sort sur le côté fermé. Barré dégage, mais Bouthier évite la touche in extremis.\nSanchez tente de passer par dessus pour trouver Barré, mais le MHR est à la réception.\nReinach sort rapidement pour Serfontein. La défense parisienne est au contest et récupère la pénalité !\nParis tente d'enchaîner mais laisse échapper le cuir à deux reprises. Chapuis est finalement repris pour un en-avant sur la médiane.\nLe MHR n'avance pas. Reinach tente de servir Tisseron au pied, mais le cuir termine en touche.\nLongue séquence des Parisiens qui insistent sur la largeur, mais le contest montpelliérain est finalement récompensé.\nDes 30m, légèrement sur la gauche, Foursans ouvre le score pour Montpellier. 3-0\nA 5m, Paenga-Amosa lobe son alignement. Paris récupère et tente le contre. De Giovanni est rappelé à l'ordre après une faute dans un ruck. Foursans va tenter les points.\nRoelofse est sanctionné pour une faute au sol. Le MHR va chercher la pénaltouche.\nPremière mêlée de cette partie, introduction Reinach. La mêlée est stable et le Montpellierain bascule rapidement sur l'aile pour Tisseron. Le ballon termine en touche.\nPremière séquence du MHR. Reinach tente de sortir rapidement le cuir du ruck, mais trouve M. Brousset. Ce sera une mêlée en faveur des Montpelliérains.\nSur l'engagement, les Parisiens tentent d'inverser la pression par un long jeu au pied.\nCOUP D'ENVOI ! C'est parti au GGL Stadium, Foursans-Bourdette engage pour le MHR.\nTop 14 - Léo Barré : "Depuis le début de la saison, on est des morts de faim"\nLe XV de départ parisien : Hamdaoui - Lapegue, Naivalu, Barré, Veainu - (o) Sanchez, (m) Percillier - Godener, Briatte, Chapuis - Maestri, De Giovanni - Roelofse, Panis, Kakovin.\nLe XV de départ montpelliérain : Bouthier - Tisseron, Lucas, Serfontein, Ngandebe - (o) Foursans-Bourdette, (m) Reinach - Mercer, Galletier, Ouedraogo - Capelli, Van Rensburg - Thomas, Paenga Amosa, Forletta.\nLe SFP est l'autre équipe du moment, avec deux succès de rang, et pas des moindres avec une victoire à Toulouse (28-29) ainsi qu'un carton face à Biarritz (65-19). Les Parisiens poursuivent leur remontée au classement et se rapprochent des places qualificatives, montrant qu'ils sont capables de rivaliser avec les "gros". Ils veulent donc le montrer une fois de plus !\nOn le répète semaine après semaine, mais Montpellier c'est l'équipe en forme du moment en TOP 14. Le MHR (3e, 51 points) reste sur 8 succès consécutifs et 1 nul en championnat, cet accrochage ayant eu lieu à Brive (16-16) lors de la précédente journée. Les Cistes n'ont plus perdu sur la scène nationale depuis le mois d'octobre, à domicile, face à Clermont...\nBienvenue si vous nous rejoignez sur Rugbyrama.fr, avec le TOP 14 qui se poursuit ce dimanche pour un duel entre Montpellier Hérault Rugby et le Stade Français Paris, comptant pour la 19ème journée de TOP 14 et que nous allons suivre en direct commenté. Le coup d'envoi sera donné à 17h30 au GGL Stadium.


▷ Tenerife: réserver des vacances »Les prix »sélection\nTénérife Last Minute\nL'île volcanique Espagnole de Tenerife est un paradis pour les amoureux des vacances à la plage, de la nature, mais aussi pour les touristes actifs. Les paysages variés et impressionnants des régions côtières sont idéals pour s’adonner aux joies des randonnées pédestres ou des sorties à vélo. Les vastes plages de l'Atlantique en toile de fond sont propices à la détente, mais aussi à la pratique des nombreux loisirs disponibles sur l’île, qui a quelque chose à offrir pour tout le monde, du windsurf à la plongée, en passant par le parapente.\ndès CHF 759.-\ndès CHF 893.-\nVoyage et transports Deux aéroports relient Tenerife avec les autres îles des Canaries et le continent. « L’Aeropuerto Los Rodeos » est principalement utilisé pour les vols inter-Canarie, mais aussi par des compagnies aériennes internationales. Mais un volume nettement plus élevé du trafic est issue de « l'Aeropuerto Reina Sofia » au sud de l'île.\nLe temps de vol estimé de Zurich est autour de 4 heures et 25 minutes, à partir de Bâle autour de 4 heures et 35 minutes et environ de 4 heures et 25 minutes de Genève.\nTenerife dispose d'un système de bus très bien développé, qui conduit même les touristes dans les coins les plus reculés de l'île. Les bus vert "Guagas" font la liaison au départ des deux aéroports au moins une fois par heure.\nCeux qui préfèrent voyager de façon plus confortable se tourneront vers les nombreuses offres de navettes ou bien de voiture de location.\nDepuis 2007, un tramway fait la liaison entre la capitale « Santa Cruz » au nord et la ville de « La Laguna » au sud.\nVaccin Aux Canaries, il est recommandé d’avoir les vaccins suivant à jour : Diphtérie, Hépatite A et Hépatite B.\nTopographie Dans le nord de la plus grande île des Canaries, les nombreuses collines sont affectées par l'érosion creusant des ravins profonds très appréciés par les randonneurs. Les montagnes Anaga dans le nord sont très luxuriantes et sont souvent couvertes par de denses nuages. Symbole de l'île, le « Pico del Teide », culmine à 3.718 mètres d’altitude, ce qui en fait le plus haut sommet d'Espagne et le troisième plus haut volcan dans le monde. Au centre de l'île, vous pourrez admirer un large cône volcanique de 17 kilomètres de large : « la Caldera de las Cañadas ». Les environs du « Parque Nacional del Teide y de las Cañadas » attire chaque année des millions de visiteurs. Le sud de l'île est une destination populaire pour les amateurs de soleil grâce à ses longues plages de sable, comme celle de « El Médano », ou la plage du village touristique de Santa Cruz.\nFlore et faune Les amateurs de nature pourront profiter du microcosme unique de l'île. Dans le nord, vous trouverez surtout des plantes adaptées à la sécheresse telle que les Euphorbe. Emblème des îles Canaries, vous y trouverez le Palmier des Canaries et le dracaena. Le parc rural de Teno dans le nord est l'un des rares endroits dans le monde où poussent de denses forêts de lauriers. Comme sur toutes les îles Canaries, de nombreuses espèces végétales sont uniques à la région. Ainsi, presque toutes les espèces végétales de l'île sont désormais sous protection stricte.\nTenerife abrite une grande variété d'oiseaux tels que le balbuzard pêcheur, le serin des canaries ou le Teide Finch. Au large de la côte ouest, tout au long de l'année, vous pourrez observer une population de dauphins. Juste à quelques kilomètres de la ville touristique de « Playa de los Cristianos », vous pourrez aussi voir des colonies de globicéphales.\nFêtes et traditions de Tenerife Les occasions de faire la fête sont nombreuses à Tenerife. La plupart des dates importantes du calendrier ont une origine religieuse, comme la fête de la Sainte Pedros le 26 Juin, ou la fête de la Vierge de Candelaria le 15 Août. La plus grande célébration de l'année est, néanmoins, le Carnaval, qui a prend place entre Février et Mars. Les rues de la capitale Santa Cruz se réveille alors avec des défilés grandiloquents. Les fêtards sont habillés de façon fantaisiste, danse et musique ne sont évidemment pas absent des festivités.\nUne partie importante du carnaval sont les « Murgas ». Des groupes, généralement composés d’hommes qui entonnent des chansons satiriques et drôles sur la politique du pays ou la société en générale. Après que chaque groupe ait été évalué, le vainqueur gagne un prix.\nParmi les coutumes traditionnelles de Tenerife vous trouverez les Pèlerinages annuels. Lors de ces journées, différents groupes de fidèles pèlerins font le voyage d’une ville à l’autre tout en honorant divers Saints. Souvent, ils portent des costumes traditionnels et font le déplacement en musique.\nTenerife est connue, comme les autres îles des Canaries, comme « île de l'éternel printemps ». Grâce aux alizés venus du nord et aux courants des Canaries, l’île reste agréablement chaude toute l'année. Les températures n’y varient jamais de plus de 6°C et les températures de l'eau descendent rarement en dessous de 20 degrés Celsius. Les 320 jours de vent par an font de Tenerife une destination idéale pour le surf. Le nord et l'est de Tenerife sont significativement plus pluvieux par rapport au sud et à l'ouest. Dans le sud, ensoleillé et sec, vous aurez du mal à trouver un nuage. Ils se concentrent généralement sur la chaîne de montagnes au centre de l'île et y laisse toute leur humidité. La meilleure période de voyage pour visiter Tenerife est sans doute de Mai à Août, quand les températures oscillent autour des 30 degrés Celsius. En Novembre et Décembre, de violentes tempêtes peuvent frapper l’île. Néanmoins, elle reste très agréable même en hiver. Surtout au sud avec ses 20° Celsius et ses cinq heures d'ensoleillement, qui s’avèrent une alternative confortable au froid de l'hiver européen.