La SEP est une maladie humaine chronique caractérisée par une inflammation et les maladies neurodégénératives du système nerveux central qui est censée être entraînée par une réponse auto-immune dirigée vers la myéline. La perte de la myéline et des axones au fil du temps le résultat de la baisse progressive de la fonction cognitive et motrice 1. "Auto-immune expérimentale encéphalomyélite" est un terme générique pour les modèles animaux de la maladie auto-immune dirigée vers la myéline du SNC. Comme MS humaine, EAE est généralement caractérisée par une infiltration de cellules immunitaires du système nerveux central et, dans certains cas, 2 démyélinisation. Cependant, la mesure dans laquelle un modèle EAE donné ressemble à MS humaine dépend en partie de l'espèce ou de la souche utilisée et de la complexité de la réponse auto-immune anti-myéline sous-jacente.\nautoimmunité anti-myéline peut être induite expérimentalement de plusieurs façons, mais la méthode la plus couramment utilisée aujourd'hui consiste à immuniser des souris avec un peptide court d'acides aminés mimant le CD4 immunodominant 35-55), qui est utilisé pour induire l' EAE chez les souris C57BL / 6 3. Toutefois, pour certaines fins expérimentales, il est souhaitable, voire nécessaire, pour immuniser avec de plus grands antigènes protéiques et en effet il y a plusieurs avantages à cette immunisation avec plus de peptide court. Tout d'abord, en raison de la restriction du CMH, des peptides courts ne sont généralement efficaces dans une gamme très limitée de souches, tandis que les grands antigènes protéiques représentant soit l'ensemble de la protéine ou d'un domaine spécifique peuvent être traitées normalement pour la présentation sur plusieurs souches de souris consanguines ou même chez différentes espèces 4. En second lieu, un antigène de protéine plus grande est capable d'induire une réponse immunitaire plus complexe comportant plusieurs types de lymphocytes dans la reconnaissance des antigènes, plutôt que limiting reconnaissance de l' antigène aux lymphocytes T CD4 +. Par exemple, les cellules B via leur récepteur des cellules B (BCR) interagissent directement avec la protéine entière plutôt que de traiter. Nous et d' autres ont montré que les cellules B activées par MOG 35-55 vaccination ne reconnaissent pas la protéine MOG 5. Comme les cellules B ont été récemment démontré à jouer un rôle pathogène dans MS humaine 6, les modèles EAE qui incorporent les cellules B en pathologie auto - immune sont de plus en plus importante.\nMalgré les avantages de l'utilisation de plus grandes protéines d'antigènes pour induire l'EAE, il reste peu de sources disponibles dans le commerce pour de telles protéines. En effet, alors que les peptides courts comme MOG 35-55 peuvent être synthétisés très rapidement et à un coût relativement faible, les options commerciales pour la protéine MOG sont limitées et le coût nettement plus à l' achat. Néanmoins, il existe plusieurs vecteurs d'expression disponibles pour les groupes de recherche pour générer MOG domaine extracellulaire (MOG 1-125) eux - mêmes. However, tous les systèmes d'expression que nous avons identifiés dans la littérature sont basées sur les technologies plus anciennes qui ont depuis été remplacés par des systèmes d'expression plus efficaces 7. En outre, la plupart sont basées sur le rat ou humain MOG 8. Pour certaines enquêtes d'auto-immunité chez la souris, un antigène sur la base du autoantigène MOG de la souris est préférable. Enfin, toutes les protéines à base de MOG que nous avons identifiés, qu'ils soient commerciaux ou sous forme de vecteurs d'expression, sont des protéines de fusion contenant des acides aminés supplémentaires à la base MOG 1-125. Ceux-ci comprennent une étiquette pour la purification et le plus souvent d'autres séquences ainsi, dont beaucoup avec une fonction que nous étions incapables d'identifier.\nPour répondre à ces limitations, nous avons généré une nouvelle protéine de fusion sur la base du MOG domaine extracellulaire de la souris fusionnée à une étiquette contenant la thiorédoxine pour lutter contre l'insolubilité connu de la protéine MOG 5. La séquence de balise contient également une séquence 6xHis pour la purification et une protéase TEV cleSite Avage qui permet l'élimination complète de toutes les séquences marqueur, si on le souhaite. Ceci est la seule méthode que nous sommes conscients de pour générer pur protéine MOG 1-125. Afin de faciliter la production de grandes quantités de protéine, dont la séquence a été MOG 1-125 codon optimisé pour l' expression bactérienne et la protéine marqueur de fusion MOG a été insérée dans le système d'expression pET-32. Ici, nous décrivons en détail le protocole pour produire et purifier MOG protéine étiquette, et MOG pur 1-125, en utilisant un équipement non spécialisé disponible pour la plupart des laboratoires d'immunologie.\n1. L'induction de protéines\nNOTE: Dans les étapes suivantes, BL21 bactéries Escherichia coli transformées avec un vecteur pET-32 contenant la séquence de la protéine MOG tag de fusion (voir référence 5 et la figure 1) sont cultivées à des densités élevées et sont ensuite induites pour exprimer la balise protéine MOG . Voir Figure 2 pour calendrier global - noter que les jours sont des points d'arrêt approximatives et alternatives sont notées dans le protocole. Si à partir de l' ADN tag vecteur pET-32 MOG purifié, il sera nécessaire de transformer chimiquement en compétente BL21 E. bactéries coli en utilisant la sélection de l' ampicilline, comme cela a été bien décrit 9. Transformation réussie peut être confirmée par la purification d' ADN à partir de bactéries sélectionnées à l' aide d' un kit commercial standard, suivie par une digestion avec les enzymes de restriction et Âge1 Sac1 pour produire une bande de 424 pb sur un gel d' agarose à 10.\ntag stock de glycérol et incuber pendant la nuit à 37 ° C, 200 rpm.\nPlacer deux flacons 1 L d'Erlenmeyer contenant 500 ml de bouillon LB stérile dans un incubateur à 37 ° C en préparation pour le lendemain.\nAjouter 500 ul de 100 mg / ml d'ampicilline à chacun des flacons contenant 500 ml de LB provenant de l'étape 1.2 (concentration finale 0,1 mg / ml d'ampicilline). Transférer 1 ml de la culture de la nuit à partir de l'étape 1.1 à chacun des deux flacons de bouillon LB. Incuber à 37 ° C et à 200 tours par minute pendant 5 heures ou jusqu'à une densité optique de 0,6.\nPrendre une aliquote de 1 ml de l'un des flacons et la transfère dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse séparée. Pellet les cellules à 16.000 xg pendant 1 min et retirer le surnageant. Étiqueter le tube en T 0 (pré-induction) et ensuite mis le culot bactérien dans un congélateur à -20 ° C pour une future électrophorèse sur gel de Polyacrylamide dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) analyse (voir la section 8 et Figure 3).\nAjouter 0,5 ml de 1 M isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1, isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) à chaque flacon de culture. Incuber les flacons à 37 ° C, 200 rpm pendant 4 heures, puis à la température ambiante à 75 tours par minute pendant la nuit.\n2. La récolte MOG tag Protein\nNOTE: A ce stade, les bactéries aura produit de grandes quantités de MOG tag protéines. Pour récolter MOG balise, les bactéries sont tout d' abord lysées dans un tampon Triton X-100 , suivi par sonication. MOG tag est alors libéré de corps d'inclusion et dénaturé avec de l' imidazole et guanidine, résultant dans une solution de protéine brute contenant la balise protéine MOG.\nPrendre une aliquote de 1 ml de l'une des cultures d'une nuit à l'étape 1.5 et de le transférer dans un tube de 1,5 ml. Pellet les cellules à 16.000 xg pendant 1 min et retirer le surnageant. Étiquette de la baignoiree T O / N (post-induction) puis mettre le culot bactérien dans un -20 ° C congélateur future analyse SDS page (Figure 3).\nDistribuer les cultures équitablement entre 250 ml bouteilles compatibles avec centrifugation à grande vitesse et de garder ceux-ci sur la glace à partir de ce point. Pellet les cellules bactériennes à 22.000 xg pendant 15 min à 4 ° C.\nJeter le surnageant. Stocker les culots bactériens à -20 ° C ou passez à l'étape 2.4.\nPréparer un tampon de lyse (0,1 mg / ml de lysozyme d'oeuf de poule, 0,1% de Triton-X (v / v) dans un tampon phosphate salin (PBS)) par l'addition de 60 ul de Triton X-100 et de 120 ul de 50 mg / ml d'oeuf de poule lysozyme solution mère à 60 ml de PBS.\nResuspendre et combiner tous les culots bactériens de l'étape 2.3 dans un total de 30 ml de tampon de lyse. Transférer ce volume à un tube de ml de fond 50 rond capable de centrifugation à grande vitesse. Placer ce tube dans un bain d'eau à 30 ° C pendant 30 min. Pendant le temps d'incubation, agiter le tubedeux fois pour remettre en suspension les cellules.\nAprès l'incubation, transférer le tube sur la glace et sonication la solution à 20 kHz, amplitude 70%, impulsion sur 3 sec, le pouls de 3 sec, et cinq impulsions par tour. Soniquer la solution pour six rounds totaux et laisser refroidir la solution sur la glace entre-deux tours.\nCentrifuger la solution à 24.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et répétez les étapes 2,5-2,7 fois. Conserver le culot à -20 ° C ou passez à l'étape 2.8.\nPréparer un tampon A (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM d'imidazole, pH 7,9) par addition de 0,8766 g de NaCl, 0,09456 g de Tris-HCl et 0,01021 g d'imidazole à un bêcher de 100 ml. Ajouter la lettre H 2 O jusqu'à ce que le volume atteint 28 ml , puis ajuster le pH de la solution à 7,9. Ensuite, transférer la solution à 100 ml graduée et ajouter H 2 O jusqu'à ce que le volume est de 30 ml.\nRemettre en suspension le culot de l'étape 2.7 dans 30 ml de tampon A et on incube cette solution à 4 ° C pendant 3 h. Pendant ce tempspeser 17,2 g de guanidine-HCl.\nSoniquer la solution sur la glace en utilisant les mêmes paramètres que dans l'étape 2.6. Ensuite, ajouter 17,2 g de chlorhydrate de guanidine à la solution. Incuber cela sur la glace pendant 1 heure pour solubiliser la protéine MOG d'étiquette.\nCentrifuger la solution à 24.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant et conserver le surnageant à 4 ° C jusqu'à la purification des protéines.\n3. Purification de la protéine\nNOTE: Dans les étapes suivantes de la balise protéine MOG sera purifiée à travers 4 séries d'absorption sur résine de nickel chargé (via l'étiquette His) et l' élution.\nFaire les tampons suivants:\nPréparer le tampon B (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM d'imidazole, guanidine 6 M-HCl, pH 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 0,0681 g d'imidazole et 114,64 g de chlorhydrate de guanidine dans un bêcher de 500 ml. Ajouter ensuite de H 2 O jusqu'à ce qu'elle atteigne 190 ml et ajuster le pH à 7,9. Transférer le solution à 250 ml graduée et ajouter H 2 O jusqu'à ce que le volume est de 200 ml.\nPréparer un tampon d'élution (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 0,5 M d'imidazole, guanidine 6 M-HCl, pH 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de tris-HCl, 6,808 g d'imidazole et 114,64 g de chlorhydrate de guanidine dans un bêcher de 500 ml. Ajouter H 2 O jusqu'à ce qu'il atteigne 190 ml et ajuster le pH à 7,9. Transférer la solution à 250 ml graduée et ajouter H 2 O jusqu'à ce que le volume est de 200 ml.\nPréparer un tampon bande (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 100 mM d'EDTA, pH 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 40 ml d'EDTA 500 mM à un bécher de 500 ml. Ajouter H 2 O jusqu'à ce qu'il atteigne 190 ml et ajuster le pH à 7,9. Transférer la solution à 250 ml graduée et ajouter H 2 O jusqu'à ce que le volume est de 200 ml.\nPréparer le tampon de charge (sulfate de 0,1 M de nickel). Ajouter 5,257 g de sulfate de nickel à un bécher de 500 ml et ajoutez H 2 O jusqu'à ce qu'il atteigne 190 ml (ATTENTION, ne pas manipuler le nickelsulfate extérieur d'une hotte jusqu'à ce que le sulfate de nickel a été dissous dans H 2 O). Une fois que le sulfate de nickel est dissous, transférer la solution dans 250 ml cylindre gradué et ajouter la lettre H 2 O jusqu'à ce que le volume atteigne 200 ml.\nDiviser 10 ml de résine de nickel entre deux coniques tubes de 50 ml de centrifugeuses capables de résister à des forces centrifuges plus de 4500 xg (5 ml dans chaque tube).\nChargez et équilibrer la résine de nickel:\nLaver la résine par addition de 40 ml de H 2 O dans chaque tube contenant de la résine. Poser les tubes horizontalement sur une bascule et laissez-les agiter pendant 5 min à 4 ° C. Une fois terminé, centrifuger les tubes à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C.\nJeter le surnageant par pipetage pour ne pas perturber le culot. Ajouter 40 ml de tampon de charge à chaque tube. Transférer les tubes sur un rocker et laissez-les agiter pendant 15 min à 4 ° C. Une fois terminé, centrifuger les tubes à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C.\nFacultatif: Prendre 150 pi de la protéine solubilisée recueillies à l'étape 2.11 et le transférer dans un tube de 1,5 ml. Etiqueter le tube comme pré-incubation et congeler ce à -20 ° C pour une future analyse SDS page (Figure 3, brut MOG tag).\nPurifier le MOG tag Protein:\nTransférer la totalité du volume de la protéine solubilisée de l' étape 2.11 (~ 40 ml, moins le petit échantillon prélevé à l' étape 3.4) dans le premier tube (figure 2, le tube 1) contenant une résine de nickel à partir de l' étape 3.3, mélanger et placer horizontalement sur un basculeur à 4 ° C pendant 1 heure.\nCentrifuger le tube à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C. Une fois terminé, transférer le surnageant à la secondeTube (figure 2, le tube 2) de résine de nickel et laisser incuber comme décrit dans l'étape précédente. En attendant, continuez avec les étapes 3 à 6 ci-dessous avec tube 1.\nRemettre en suspension la résine de nickel dans le tube 1 dans 40 ml de tampon d'élution et de placer le tube horizontalement sur une bascule à 4 ° C pendant 5 min. Ensuite, centrifuger le tube à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C.\nTransférer le surnageant contenant la protéine éluée MOG d'étiquette dans un flacon de 250 ml étiqueté «protéine MOG tag purifiée» et de garder cette bouteille à 4 ° C. A chaque étape d'élution, en commun le surnageant résultant dans cette bouteille.\nAjouter 40 ml de tampon de bande à la résine de nickel et de placer horizontalement sur un balancier pendant 5 min à 4 ° C.\nCentrifuger le tube à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C. Jeter le surnageant, puis rechargez la résine de nickel comme indiqué dans l'étape 3.3.\nUne fois terminé, aller de l'avant avec le second tube comme indiqué dans l'étape 3.5. Un total de 4 roundl 'absorption de la protéine solubilisée de l'étape 2.11 sur la résine chargée de nickel et une élution va récupérer la majeure partie de la protéine, bien que, si on le souhaite, la protéine supplémentaire peut être récupérée dans des cycles supplémentaires d'absorption et élution.\nUne fois que les quatre (ou plus) cycles d'absorption et l'élution sont terminées, stocker la protéine purifiée regroupées à 4 ° C pendant une nuit. une résine de nickel peut être stockée dans 40 ml d'une solution d'éthanol à 20% à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit à nouveau nécessaire.\n4. Mesure de la concentration de la protéine\nNOTE: Avant d' aller plus loin , il est nécessaire de quantifier la quantité de protéine purifiée MOG d'étiquette générée dans la section 3. Cette valeur sera utilisée pour déterminer le volume final de concentrer la protéine à la fin du protocole. Nous décrivons une norme Bradford Assay ici. La concentration de la protéine purifiée MOG d'étiquette est déterminée en comparant l'absorbance spectrale de la série diluted protéine MOG étiquette à une courbe étalon de sérum albumine bovine (BSA) à une concentration connue.\nFaire 10x tampon acétate en y ajoutant 23 ml d' acide acétique glacial et 8,2 g d' acétate de sodium dans un bêcher de 3 litres, puis ajouter 1,9 l de H 2 O pour dissoudre l'acétate de sodium. Transférer cette solution à un 2 L graduée et ajouter H 2 O jusqu'à ce que le volume atteint 2 L. Puis rangez - le dans un 2 L bouteille à la température ambiante. Faire 1 ml de tampon acétate 1x en ajoutant 100 ul de 10 x tampon acétate à 900 pl de H 2 O.\nMettre en place une plaque à 96 puits pour des dilutions en ajoutant 30 pi de tampon d'acétate 1x puits G2-8 et 60 pi à G9. Ajouter 48 ul de tampon acétate 1x à H2 et H3.\nMettre en place la dilution en série initiale de la norme BSA dans la ligne G comme suit: Ajouter 216 pi de tampon d'acétate 1x et 54 pi de disponible dans le commerce 2 mg norme / ml de BSA dans G1 bien et bien mélanger. Ajouter 210 ul de G1 et G2 bien, bien mélanger,puis ajouter 180 pi de G2 et G3 ainsi. Ajouter 150 pi de G3 et G4 à bien, bien mélanger et poursuivre cette tendance de l'ajout de 30 ul moins à chaque puits subséquent jusqu'à ce G8 ainsi. (Voir le tableau 1 pour les listes de facteurs de dilution équivalente).\nMettre en place trois échantillons de chaque dilution en transférant 10 pi de G1 bien aux puits A1, B1 et C1, et 10 pi de G2 et aux puits A2, B2, C2 et, et ainsi de suite. Utiliser une pipette à canaux multiples.\nPour mettre en place des dilutions de MOG tag, ajouter 60 pi de protéine purifiée MOG d'étiquette de l' étape 3.6 à H1 bien. Ajouter 12 ul de H1 puits à H2, bien mélanger, puis ajouter 12 pi de H2 puits à H3, mélanger soigneusement (cela produit une dilution de 1x en H1, 1/5 dilution dans H2, et 1/25 dilution dans H3) .\nMettre en place des échantillons en triple pour les dilutions variables MOG en transférant 10 ul de puits H1-H3 à des lignes D, E et F comme décrit à l' étape 4.4.\nMélanger 2 ml de dosage de protéine de colorantConcentré de réactif avec 8 ml de H 2 O. Ajouter 200 ul de ce mélange dans tous les puits pré-chargés dans les lignes A, B, C, D, E et F, en utilisant une pipette à canaux multiples, si elle est disponible. Pop les bulles dans le puits à l'aide d'une aiguille avant de lire la concentration en protéines.\nEn 10 minutes de l'addition du réactif de coloration, la mesure de l'absorbance 595 nm de chaque puits dans les rangées A, B, C, D, E et F.\nUtilisez les lignes A, B et C pour mettre en place une courbe standard où les positions 1-9 correspondent à 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 et 0 mg / ml de BSA. Sur la base de cette courbe, calculer la concentration de MOG tag protéine en utilisant la dilution de MOG balise qui correspond le mieux à la courbe standard. En règle générale, il y aura 200 à 250 mg de protéine MOG marqueur de 1 litre de culture bactérienne en utilisant le protocole décrit ici.\nNOTE: Pour faire MOG 1-125 procéder d'ici à la section optionnelle 7 indiqué à la fin du protocole. Sinon, passez à l'article 5.\nREMARQUE: La dialyse est effectuée pour éliminer progressivement guanidine de la solution contenant purifiée, étiquette MOG dénaturé pour permettre à la protéine de se replier. Des précautions doivent être prises au cours de cette étape que MOG lui-même est très insoluble, et tout cela est améliorée par la présence de la balise thiorédoxine, il est toujours enclin à sortir de la solution. Par conséquent, le repliement doit être effectué progressivement et à une concentration relativement faible MOG d'étiquette.\nAvant de commencer la dialyse, diluer la MOG protéine étiquette purifiée avec un tampon B (tampon B peut être réalisé comme indiqué dans l' étape 3.1) jusqu'à ce que la concentration est de 0,5 mg / ml ou moins, en fonction de la quantité de MOG tag calculé à la section 4.\nCouper environ 30 cm de tube de dialyse peau de serpent et fixer une extrémité d'une pince hémostatique de verrouillage en repliant l'extrémité de la peau de serpent sur trois fois et serrer l'extrémité repliée de la pince hémostatique. Remplissez le snakeskin avec diluéProtéine MOG tag (entre 60 à 90 ml de MOG protéine étiquette par tube) , puis éliminer les bulles d'air de la peau de serpent en les forçant hors de l'extrémité ouverte. Enfin, sceller l'autre extrémité du tube à l'aide d'une seconde pince hémostatique de verrouillage.\nRépétez l' étape 5.2 pour remplir les sections supplémentaires de tube de dialyse jusqu'à ce que toute étiquette protéine MOG a été transféré dans un tube de dialyse snakeskin. Assurez-vous qu'il n'y a pas de fuites.\nFaire l'acétate 1x avec 4 M guanidine en pesant 382,12 g de guanidine-HCl et en ajoutant 100 ml de 10x tampon d'acétate faites à l'étape 4.1 à 2 L bêcher. Ajouter 0,5 l de H 2 O dans le bêcher et laisser le chlorhydrate de guanidine pour dissoudre. Une fois dissous, transférer la solution à un 1 L éprouvette graduée et ajouter H 2 O jusqu'à ce que le volume atteint 1 L. Répétez cette recette pour tous les 2 peaux de serpents qui sont nécessaires.\nEffectuer la dialyse comme suit: remplir un grand seau (minimum 10 L) avec 1 L de tampon acétate 1x avec 4 M guanidine de l'étape 5.4. Placez jusqu'à to 2 sections de tube de dialyse contenant MOG tag dans le seau, laissant place à une barre d'agitation magnétique pour tourner librement dans le fond. Mettez le seau dans une chambre de 4 C ° sur une plaque d'agitation magnétique et tourner à une vitesse de rotation lente (c. -à- pas élevé, juste assez pour déplacer le fluide):\nREMARQUE: Effectuez les étapes suivantes pour réduire progressivement la quantité de guanidine dans la mémoire tampon. temps de Stir sont donnés à titre minimum, mais peuvent être laissés pendant la nuit. La dialyse prendra un minimum de 3 jours, mais cela peut être étendu si désiré. Vérifiez régulièrement pour vous assurer que le tube est intact et que les extrémités sont bien fermé.\nLaissez le seau asseoir et agiter pendant 4-5 heures.\nAjouter 1 litre de tampon acétate 1x (100 ml 10x tampon acétate et 900 ml de H 2 O) dans chaque godet.\nRépétez les étapes 5.5.1 et 5.5.2 un total de 3 fois pour un total de 4 L de tampon dans le seau.\nJeter la moitié de la mémoire tampon dans le seau et le remplir avec 1 litre de tampon acétate 1x (100 ml 10x tampon acétate et 900 ml de H 2 O, pas guanidine) et mettre en place la barre de tube et remuer.\nRépétez les étapes 5.5.1 et 5.5.2 une fois (soit jusqu'à il y a un total de 4 L de tampon dans le seau).\nEnfin, remplacer la totalité du volume 4 L dans le seau avec 4 litres de tampon acétate de 1x frais et laisser l'agitation pendant 4-5 heures. Pour de meilleurs résultats, cette étape le jour de la concentration en protéines.\nRetirez délicatement le tube de dialyse avec repliée tag MOG et jeter le tampon du godet.\n6. Concentrer MOG tag Protein\nNOTE: Dans la dernière étape, la protéine repliée tag MOG est concentré à la dilution de travail pour le stockage. Comme MOG tag est très insoluble, il ne doit pas dépasser 5 mg / ml. Cette concentration est à peu près équimolaire avec 0,4 mg / ml de peptide MOG 35-55, qui est couramment utilisé pour induire l' EAE chez les souris (mélange 1: 1 avec complet de Freund adjuvant (CFA)). Au cours du processus de concentration, il est fréquent qu'une petite quantité de protéines pour sortir de la solution sous forme de précipité blanc. précipitation excessive est un problème, cependant.\nCalculer le volume final désiré pour obtenir une concentration de MOG tag de 5 mg / ml, sur la base de la valeur calculée à la section 4.\nTapisser un moule de papier d'aluminium et couvrir la feuille d'aluminium avec du polyéthylène glycol (PEG) 3350 et le PEG 8000 à un ratio de 1: 1. Le PEG 3350 est incorporé dans ce mélange , car il peut aider à prévenir l' agrégation des protéines lors de la concentration et est un moyen efficace cyropreservative 11.\nMettre le tube de serpent (avec MOG protéine étiquette à l' intérieur) sur le dessus de la feuille d'aluminium et couvrir avec PEG 8000. Que ce sit à la température ambiante et de vérifier le volume régulièrement jusqu'à ce que le volume est égal ou inférieur au volume final estimée (calculée à l' étape 6.1) le volume réel sera mesuré dans l'étape suivante. Si la casserole devientsursaturé avec de l'eau pendant le processus de concentration, mis en place une nouvelle casserole avec une feuille d'aluminium et PEG 3350 et le PEG 8000.\nLaver l'extérieur des peaux de serpent avec H 2 O et transférer la protéine MOG d'étiquette sur une bouteille de verre séparé en utilisant une pipette sérologique. Garder une trace du volume que la protéine est transférée à assurer le volume est correct.\nSi le volume a été réduit en dessous du volume final prévu, ajouter un tampon d'acétate 1x jusqu'à ce que le volume souhaité soit atteint. Si le volume est supérieur au volume final estimé, transférer le tag protéine MOG retour dans le tube de dialyse et de poursuivre la concentration (étapes 6.2-6.3).\nDistribuer la balise protéine MOG entre tubes de 1,5 ml (0,5 ml par tube), stocker les tubes à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Pour induire l'EAE, mélanger ce volume 1: 1 avec CFA.\nExécuter un gel de SDS - PAGE pour confirmer l'expression de la protéine étiquette MOG en utilisant les échantillons prélevés dans les étapes 1.4, 2.1, 3.4, et la protéine MOG purifiée à partir de l'étape 6.4.\n7. Génération MOG 1-125 de MOG tag utilisant TEV Protease (Facultatif)\nREMARQUE: Cette étape facultative continue à partir de la fin de l' étape 4. Si MOG 1-125 sans séquences de balises supplémentaires est nécessaire, les séquences de balises peuvent être éliminées en utilisant la protéase TEV (Figure 4). Pour autant que nous le sachions, il n'y a aucun autre système d'expression capable de générer pur MOG 1-125. Toutefois, il convient de noter que , sans l'étiquette thioredoxine, MOG 1-125 est fortement insoluble, ce qui peut causer des problèmes lors de la purification et la manipulation, et pour cette raison enlever l'étiquette si cela est absolument nécessaire pour des raisons expérimentales. Plusieurs étapes sont nécessaires pour générer pur MOG 1-125. MOG tag est d' abord dialysée dans un tampon de clivage de protéase TEV. Après la digestion avec la protéase TEV, le volume est réduit à l'aide d'une purification ultérieure de steps, puis dialysées dans le tampon B, puis la séquence de marqueur His-tag contenant est éliminé en utilisant la résine de nickel. Enfin, la protéine est quantifiée et MOG pur 1-125 est concentré à la concentration finale.\nFaire 1 litre de tampon 10x TEV de clivage (500 mM de Tris-HCl, 5 mM EDTA) en y ajoutant 1,861 g d'EDTA, 44,4 g de Tris-HCl et 26,5 g de Tris à un bécher de 2 L.. Ajouter H 2 O jusqu'à ce que le volume atteint 990 ml , puis ajuster le pH à 8 pour dissoudre l'EDTA. Transférer la solution à un 1 L graduée et porter le volume à 1 L en utilisant H 2 O.\nDiluer MOG tag protéine à partir de l' étape de 3,6 à 0,5 mg / ml en utilisant un tampon B (le même tampon décrit dans l' étape 3.1), sur la base de la quantité de protéine calculée à la section 4. Transfert 120 ml de diluée protéine MOG d'étiquette à un tube de dialyse de snakeskin comme décrit dans les étapes 5.2 à 5.3. Le volume peut être étendu cependant la quantité de protéase TEV nécessaire pour cliver la totalité de la protéine MOG tag sera SUBSTAntial.\nSuivre le protocole de dialyse énumérés à l'étape 5.5, à l'exception de remplacer le tampon 10x acétate avec un tampon de clivage 10x TEV faite à l'étape 7.1.\nTransférer la balise MOG, maintenant dans un tampon de clivage TEV, à un nouveau flacon de 250 ml en verre et surveiller l'augmentation du volume de la dialyse. Ajouter 1 pi de β-mercapto-éthanol par tous les 2,85 ml de MOG protéine ajoutée à la bouteille d'étiquette. Ajouter au moins 1 mg de TEV protéase (solution de TEV à 5 mg / ml) pour 50 mg de MOG tag protéines (TEV protéase peut être ajouté jusqu'à 1:10 TEV: rapport de la protéine MOG) et incuber à température ambiante, abri de la lumière pendant au moins 72 heures.\nNOTE: A la fin de la protéase TEV incubation, des précipités blancs devraient être considérés au fond de la bouteille en verre.\nAvant de transférer la protéine à un tube de dialyse, ajouter le chlorhydrate de guanidine à la solution jusqu'à ce que les protéines se dissolvent pour empêcher la précipitation des protéines de coller à la bouteille en verre. Transférer 150 ul decette solution dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml et d'étiqueter le tube comme "MOG avec TEV". Conserver la solution à -20 ° C pour une future analyse SDS-PAGE.\nTransférer la totalité du liquide provenant de l'étape 7.5 dans un tube de dialyse comme indiqué dans les étapes 5.2 à 5.3. Remplir un grand seau avec 2 litres de H 2 O et placer le tube de dialyse dans le seau. Incuber ce à 4 ° C avec de la lumière une nuit d'agitation. Cette étape est importante pour diluer la guanidine pour permettre à la concentration des protéines de se produire rapidement et de commencer à enlever l'EDTA à partir de la solution qui va interférer avec la purification des protéines.\nConcentrer la protéine dans le tube de dialyse comme indiqué dans les étapes 06.02 à 06.03 (à l'exception seulement d'utiliser le PEG 8000), de sorte que le volume final de la solution est d'environ 40 ml. Laver le tube de dialyse avec du H 2 O et éliminer tout résidu de PEG 8000 toujours fixée à la tubulure. Cette réduction du volume permet d'adapter l'ensemble de la protéine digérée dans un tube de 50 ml contenant du nickel rele péché, tel que décrit à l'étape 3.5.\nDialyser la protéine digérées au tampon B:\nRemplir un grand seau avec 1 litre de tampon B (29,22 g de NaCl, 3,152 g de Tris-HCl, 0,3405 g Imidazole 573,18 g de guanidine-HCl, pH 7,9).\nPlacez les peaux de serpent contenant de la protéine digérée de l'étape 7.7 dans le seau le long d'un aimant d'agitation (comme décrit plus en détail dans l'étape 5.5). Mettez le seau dans un 4 ° C chambre froide sur une plaque d'agitation réglée à une agitation lente et laisser les peaux de serpent à dialyser pendant 5 ou plusieurs heures.\nVider le seau et le remplir avec un autre 1 L de tampon B et que ce sont assis dans la salle C 4 ° froide sur une plaque d'agitation réglée à une agitation lente et laisser les peaux de serpent à dialyser pour 5 ou plus h.\nEffectuer la purification de la MOG 1-125 protéines comme indiqué dans la section 3, avec la différence importante que les séquences de balises clivées seront liés par la résine de nickel, laissant MOG 1-125 en solution. Encore une fois, 4 cycles de purification serontréalisée sur le même volume, mais dans ce cas, le but est d'améliorer la pureté, plutôt que de récupérer autant de protéine que possible. Voir la figure 4.\nFaire les tampons de purification des protéines énumérées à l'étape 3.1\nChargez les deux tubes de résine de nickel comme décrit dans l'étape 3.3.\nPurifier MOG 1-125 par le protocole détaillé dans l' étape 3.5, à l'exception essentiel que l'éluat de la résine contenant du nickel marqueur est mis au rebut (keep 150 pi de l'éluat dans un tube de 1,5 ml pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE), tandis que la solution contenant 1-125 MOG est retenu comme produit final.\nMesurer la concentration de MOG 1-125 protéine telle que décrite dans la section 4:\nMettre en place les dilutions de courbe standards BSA comme décrit dans les étapes 4.2 et 4.4.\nMettre en place les dilutions de MOG 1-125 comme décrit dans les étapes 4.5 et 4.6. En variante, il peut être utile de générer un plus grand éventailde dilutions (1x, 1/2, 1/4 et 1/8, par exemple). Ajustez les volumes de 1x tampon acétate et MOG 1-125 en conséquence.\nEffectuer le dosage de Bradford comme décrit dans les étapes 04.07 à 04.09 et de calculer la quantité de MOG 1-125 généré. Le rendement attendu est d'environ 4 mg ou plus de protéines.\nReplier MOG 1-125 par l' élimination progressive de guanidine par dialyse, comme décrit dans la section 5.\nConcentrez - MOG 1-125 protéine telle que décrite dans la section 6. La concentration finale devrait être de 2,24 mg / ml, qui est équimolaire à 5 mg / tag MOG mL.\n8. SDS-PAGE Gel pour la confirmation MOG tag Production et Pureté\nNOTE: Les échantillons prélevés sur les étapes 1.4, 2.1, 3.4 et 6.4 sont analysées par SDS-PAGE standard pour confirmer MOG production d'étiquettes et de pureté. Cette étape doit être effectuée après la purification finale soit tag MOG ou MOG 1-125.\n<li> Faire un tampon de charge 2x SDS-PAGE en y ajoutant 1,576 g de Tris-HCl à 2 ml de H 2 O et réglé le pH à 6,8. Ajouter 0,4 g SDS dans la solution de Tris-HCl, puis ajouter H 2 O jusqu'à ce que le volume atteint 7 ml.\nAjouter 0,2 g de bleu de bromophénol à 10 ml de H 2 O puis ajouter 1 ml de ce à la solution faite à l' étape 8.1. Enfin, ajouter 2 ml de glycérol pour terminer le tampon de charge 2x SDS-PAGE. Lors du stockage de cette solution, garder à 4 ° C et le protéger de la lumière pour un maximum de 3 mois.\nDécongeler les aliquotes congelées de bactéries à partir des étapes 1.4 et 2.1, ainsi que la MOG solubilisé protéine étiquette des étapes 3.4 et 6.4 à la température ambiante.\nRetirer les sels des solutions recueillies dans les étapes 3.4 et 6.4 en ajoutant 60 pi de chaque colonnes de protéine de dessalage. Purifier les protéines en suivant les instructions du fabricant.\nAjouter 20 ul de β-mercapto-éthanol, 1 ml de la solution préparée à l'étape 8.2. Ajouter 40 pi de cette aux deux bacGranulés maté- de l'étape 8.3 et 60 pi aux protéines dessalée provenant de l'étape 8.4 et incuber ceux-ci à 95 ° C pendant 10 min.\nFaire la page SDS tampon de course 1x en pesant 5 g de Tris, 28,8 g de glycine et 1 g SDS. Ajouter à un bêcher de 1 litre et ajouter 500 ml de H 2 O pour dissoudre tout. Une fois dissous, transférer la solution à un 1 L éprouvette graduée et remplir avec H 2 O jusqu'à ce que le volume atteint 1 L.\nMise en place d'un gel de Polyacrylamide à 12% dans un appareil à gel puis ajouter le tampon en cours d'exécution par SDS-PAGE 1x à l'appareil de gel, tel que le tampon est en cours d'exécution juste au-dessus du sommet des puits dans le gel. Laver les puits du gel par pipetage de 50 ul d'un tampon en cours d'exécution dans les puits cinq fois chacun.\nCharge 10 pi de protéine échelle dans le premier puits et ajouter 10 pi des solutions bouillies de l'étape 8.5 pour séparer les puits. Exécutez le gel à 115 V pendant 60 min.\nRetirer le gel de l'appareil et de le transférer dans un petit récipient. Remplissez le container avec 100 ml de pur H 2 O et transférer le récipient vers une plate - forme en rotation lente pendant 8 min. Après 8 minutes, vider l'eau et laver le gel deux fois avec H 2 O.\nVider le H 2 O à partir du récipient et ajouter 100 ml de réactif de coloration rapide au récipient. Permettre que cette reposer sur une plate-forme tournante lentement pendant la nuit, couvrir de papier d'aluminium.\nVider le réactif de coloration rapide et ajouter environ 100 ml de H 2 O au récipient. Permettre que cette reposer sur une plate-forme tournante pendant 8 min. Dump de l'H 2 O et répéter deux fois le H 2 O lavage.\nImage du gel en utilisant un imageur pour les taches bleu Coomassie. Recherchez une bande autour de 31,86 kDa (MOG tag protéine) et une bande plus faible à 63.72 kDa (MOG tag dimères).\nUne fois la purification terminée, les échantillons prélevés dans les étapes 1.4, 2.1, 3.4, et le produit final de l' étape 6.4 doivent être exécutés sur un gel de protéine (figure 3A). MOG tag devrait d' abord apparaître comme une bande 31,86 kDa dans l'échantillon T O / N, mais pas T 0, et devrait être le seul groupe dans le produit pur final. Pour tester si la balise protéine MOG a correctement repliée, la balise protéine MOG peut être utilisé pour marquer les cellules B spécifiques MOG-protéine par FACS. Par lymphocytes étiquetage de la souris avec un 1: 1000 dilution de MOG tag avec un anticorps secondaire dirigé contre l'étiquette His et un anticorps anti-IgG1 tertiaire marqué par fluorescence, les cellules MOG spécifiques B peuvent être identifiés (figure 3B). Alternativement, MOG tag peut être directement conjugué à fluorophores pour réduire la coloration de fond (résultant de cellules B de liaison aux anticorps secondaires et tertiaires) commedécrit dans la référence 5 pour identifier des cellules spécifiques MOG B. Cela est nécessaire lorsque vous essayez d'identifier les cellules MOG liaison B chez les souris de type sauvage, car ces cellules sont normalement très rare 5. Souris IgH MOG ont une Knockin de chaîne lourde qui, lorsqu'il est associé à une chaîne légère kappa appropriée, confère une spécificité pour MOG. Comme la liaison de MOG tag est renforcée parmi les cellules IgH MOG B, cela confirme que ce protocole génère un antigène bien plié. Surtout, les cellules B IgH MOG contribuent à une pathologie auto - immune dans les modèles de la MOG dirigée EAE 12, ce qui confirme que MOG marqueur induit à la fois T et l' auto - immunité des lymphocytes B.\nAvant de commencer la dialyse pour replier la protéine comme décrit dans l' article 5, il est nécessaire de mesurer la concentration en protéine en utilisant un dosage de Bradford, comme décrit dans la section 4. Les résultats représentatifs d'un dosage de Bradford sont présentés dans le tableau 1 figure 5.\nLa génération de MOG pur 1-125 est accomplie par l'addition de la protéase TEV à la protéine MOG étiquette entraînant finalement la coupure de l'étiquette de protéine MOG dans MOG 1-125 et la séquence de marquage , comme le montre la figure 6. Après purification du nickel de résine élimine MOG tag, séquence de marqueur, et TEV impuretés de protéase finalement résultant en pur MOG 1-125 comme le montre la figure 6.\nFigure 1: MOG tag protéines (dupliqué ici avec la permission de Dang et al 5..).. Structure linéaire, et des acides aminés et des séquences d' ADN de la protéine de fusion MOG de la balise. La séquence d'ADN codant pour le domaine extracellulaire de MOG de souris (MOG1-125, la séquence inférieure en bleu) a été codon optimisé pour l' expression dans des bactéries (noir). Cette séquence a été synthétisé et inséré dans un vecteur pour créer une fusion N-terminale à une étiquette contenant thiorédoxine et un S-Tag pour contrer l'insolubilité connue de la protéine MOG 13,14, ainsi qu'un marqueur 6x HIS 15 pour la purification. Un site de clivage de protéase TEV sépare la MOG 1-125 à partir des séquences d'étiquettes. Clivage entre glutamine-164 et la glycine-165 TEV-médiée utilisant un site de clivage consensus TEV alternatif 16 résultats dans l' élimination de tous les acides aminés non-MOG. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.\nFigure 2: Vue d' ensemble des étapes nécessaires à la production de protéines pures MOG tag Pour.générer MOG tag protéines, bactéries exprimant la protéine MOG tag sont cultivées à des densités élevées puis induites pour exprimer tag MOG en utilisant IPTG comme indiqué à la section 1. Après une culture de nuit, les bactéries sont lysées et par une série de pastillage étapes de la fraction protéique contenant corps d'inclusion, qui contient MOG tag, est extrait comme indiqué dans la section 2. MOG tag est ensuite purifié à partir de la fraction de protéine brute à travers quatre cycles d'absorption sur résine de nickel chargée et l' élution de la balise protéine MOG comme indiqué dans la section 3. Une partie de l'éluat commun est alors pris pour un essai de Bradford pour déterminer le rendement de MOG tag protéines et le reste de l'éluat est dialysée dans un tampon acétate au cours de plusieurs jours comme énumérés dans les sections 4 et 5. Enfin, la protéine est concentrée en utilisant du PEG 3350 et le PEG 8000 à une concentration finale de 5 mg / ml sur la base du rendement de MOG variable déterminée dans la chambredosage radford comme indiqué dans la section 6. L'ensemble du processus peut prendre un minimum de 10 jours, avec le jour de début de chaque étape indiquée entre parenthèses. Cependant, l' arrêt de remplacement et les points de départ sont listées dans le protocole, et des mesures peuvent être réparties sur une plus grande quantité de temps si vous le souhaitez. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.\nFigure 3:. Purification de la protéine MOG d'étiquette et de l' évaluation de son activité (A) Montré sont des échantillons de protéines qui ont été recueillies à partir de différents points à travers la procédure de purification des protéines et fonctionnent sur un gel SDS-PAGE. T = 0 bactéries BL21 avant induction de protéines (collectées à l' étape 1.4), T O / N = bactérie BL21 après l'induction de l' expression protéique (recueillieà l' étape 2.1), brut MOG tag = solubilisé MOG tag protéines avant la purification des protéines (recueillies à l' étape 3.4), balise MOG pure = MOG étiquette protéique après purification (recueillies à l' étape 6.4). (B) La liaison de la protéine MOG tag à CD19 pos CD4 neg cellules B naïves de ganglions lymphatiques à partir soit de type sauvage C57BL / 6 souris ou souris IgH MOG qui expriment une chaîne lourde d'immunoglobuline spécifique pour la protéine MOG 7,17 a été évaluée à l' aide de cytométrie en flux . Les cellules B spécifique de MOG d'étiquette ont été identifiés par la coloration des cellules des ganglions lymphatiques avec l' étiquette de MOG suivie d'un anti-son anticorps marqueur secondaire et un anticorps anti-IgG1 tertiaire fluorescent. Coloration des cellules de C57BL / 6 ou IgH MOG souris est représenté avec une fluorescence MOG d'étiquette moins un (FMO) tache de contrôle des cellules IgH MOG. S'il vous plaît clécher ici pour voir une version plus grande de cette figure.\nFigure 4: Vue d' ensemble des étapes pour générer MOG 1-125 de MOG tag protéines. Après avoir recueilli le tag éluat MOG comme décrit à l' étape 3.5 du protocole, la balise protéine MOG est dialysée dans un tampon de clivage de protéase TEV. Une fois que la dialyse est terminée, la protéase TEV est ajouté à la solution résultante MOG de la balise dans le clivage de MOG marqueur dans la protéine MOG 1-125. Le volume de la solution de clivage est ensuite réduit et dialysée dans du tampon B avant la purification des protéines. Les impuretés de la solution de clivage sont extraits par quatre cycles successifs d'absorption sur résine chargée de nickel et de l'élution des impuretés résultant en fin de compte dans une solution de MOG pur < sub> 1-125. La concentration de la protéine MOG 1-125 est déterminée par un dosage de Bradford et la protéine est repliée sur une période de plusieurs jours par dialyse. Une fois la dialyse terminée, le MOG 1-125 protéine est concentrée à 2,24 mg / ml en utilisant du PEG 3350 et PEG 8000. Ce protocole est discuté en détail dans la section 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.\nFigure 5: Exemple d'une courbe standard de dosage de Bradford pour déterminer la concentration de MOG tag protéines. lectures standard de BSA prises à partir du tableau 1 ont été représentés graphiquement pour obtenir une formule de régression linéaire pour calculer la concentration de l' étiquette MOG en fonction de la densité optique à 595 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.\nFigure 6:. TEV clivage de MOG tag protéines et purification subséquente de MOG 1-125 Montré sont des échantillons de protéines fonctionnent sur un gel SDS-PAGE démontrant la purification de MOG 1-125 pure tag MOG = MOG tag protéines avant TeV clivage (collectées. à l' étape 6.4), MOG tag w / TEV = fraction de protéine qui a été prélevé après 72 heures d'incubation de tag MOG avec TEV protéase (recueillies à l' étape 7.5), Elution = fraction de protéine qui est resté lié à la résine de nickel au cours de la MOG 1- 125 protocole de purification (recueillies à l' étape 7.9), MOG pure 1-125 = MOG1-125 protéine après purification (recueillies à l' étape 7.12). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.\n1.079 0,998 0,948 0.853 0,769 0,699 0,583 0,493 0,373\n1.069 1.017 0,944 0,848 0.781 0,592 0,494 0,374\nMOG tag dilution 1 1/5 1/25\nTableau 1: Les valeurs représentatives d'un dosage de Bradford pour déterminer la concentration de MOG tag protéine BSA dilu.tions à des concentrations connues sont utilisées pour déterminer la courbe d' étalonnage représentée sur la Figure 5. Les dilutions de MOG purification protéine étiquette de poste sont utilisés pour déterminer la concentration finale de protéine MOG tag. Les lignes contiennent la densité optique mesurée à 595nm et chaque ligne représente une répétition d'un total de 3 répétitions à chaque concentration indiquée.\nIci, nous avons décrit un protocole pour la production de MOG protéine étiquette et comment générer MOG pur 1-125 de la protéine MOG d'étiquette. Ce protocole est basé à la fois sur la base des procédés de purification de protéines His-tag standard, ainsi qu'un protocole décrit précédemment pour la production d'une protéine à base de MOG âgée 15. Bien qu'il ne soit pas décrit ici, l'utilisation primaire de la protéine MOG tag est d'induire l' EAE par l' immunisation avec l' antigène protéique. Un protocole décrivant comment EAE est induite chez la souris, ce qui est compatible avec la balise protéine MOG, peut être trouvé dans la référence 3. Nous avons déjà démontré que la vaccination avec l' étiquette de MOG ou MOG 1-125 dérivé de MOG tag non seulement induit maladie auto - immune du système nerveux central avec une plus grande inflammation de la moelle épinière et de la démyélinisation par rapport à la norme MOG 35-55 peptide, mais aussi que les pathogènes cellules IgH MOG B that reconnaissent la protéine MOG sont activés pour produire une réponse du centre germinatif en réponse à MOG tag ou MOG 1-125, mais pas à MOG 35-55 5. Par conséquent, l' immunisation avec MOG tag n'induit en effet une réponse des cellules B anti-MOG approprié.\nMOG tag protéine est purifiée par absorption sur résine de nickel chargé (via l'étiquette His) et l' élution. En raison de la grande quantité de protéine produite dans les étapes précédentes, de multiples cycles d'absorption et d'élution sont nécessaires pour recueillir la majeure partie de la protéine. Nous avons constaté que, au moins 4 tours sont nécessaires pour isoler la majorité des protéines si l'on utilise un volume approprié de résine pour tubes de 50 ml. Si on le désire, le protocole peut être adapté de manière à utiliser plus ou plus grands tubes et plus de résine de nickel pour réduire le nombre de tours d'absorption. En variante, la Chromatographie liquide à haute performance (HPLC) avec des colonnes de nickel peut effectivement purifier les protéines à marquage His 18 </ sup> et en effet , nous avons constaté que HPLC peut efficacement purifier la protéine MOG tag (observations non publiées). Comme HPLC est pas accessible à de nombreux laboratoires d'immunologie standard, le protocole énuméré ici est conçu pour être réalisé en utilisant un équipement de laboratoire commun. En plus de son étiquette de purification, la balise protéine MOG contient une balise de S qui est compatible avec les protocoles S-tag purification si l'on préfère 14.\nLes protéines recombinantes à base de MOG ( la plupart du temps humain ou de rat) ont été décrits précédemment 8. Celles - ci étaient basées sur les anciens systèmes d'expression qui ont depuis été remplacés par des systèmes commandés par des promoteurs de transcription forts capables de produire de grandes quantités de protéines dans des bactéries Escherichia coli. Notre système MOG tag d'expression utilise le promoteur T7 efficace dans le vecteur pET-32a (+), ce qui est nettement plus efficace que les systèmes disponibles pour la production en interne de la protéine MOG 19. Cependant, il should noter que la protéine marqueur MOG décrite ici est basée sur MOG de la souris. L' immunisation avec la protéine MOG humaine a été montré pour induire l' EAE chez des souris qui a des caractéristiques différentes par rapport à une maladie induite en utilisant 8 souris MOG. En outre, MOG de rat peut être plus immunogènes que MOG de souris chez les souris 20 dans certains cas. Par conséquent, pour une balise MOG basée sur la souris des fins expérimentales peuvent ne pas être idéal. Nous sommes en train de générer plusieurs versions différentes de la balise protéine MOG que peut mieux convenir à certaines fins, et le protocole de purification décrit ici va travailler pour tout cela. Dans l'intervalle, il est possible que le protocole de purification décrit ici peut fonctionner pour d'autres systèmes d'expression de MOG, ou même d'autres protéines, à condition qu'ils comportent un marqueur 6x HIS pour l'absorption de la résine de nickel. Cependant, sans l'étiquette de thiorédoxine, la solubilité de la protéine MOG à des concentrations plus élevées peuvent être un problème, et bien sûr, il ne sera pas possible de ge nerate pur MOG 1-125 que ce qui est unique au système MOG de tag.\nMesure de la concentration en protéine MOG tag avant repliement des protéines par l' intermédiaire d'une dialyse est essentielle à la réussite de ce protocole de purification. Si la concentration est trop élevée, la protéine peut agréger et tomber hors de la solution au lieu de plier en protéines individuelles. Ceci peut être vu pendant le protocole de dialyse précipité blanc se formant au fond du tube de dialyse. Si cela se produit, dissoudre le tag protéine MOG nouveau avec 6 M de guanidine et de mesurer la concentration en protéines. Diluer la protéine à 0,5 mg / ml, puis recommencer la dialyse comme aucun précipités devraient former à 0,5 mg / ml. MOG pour 1-125, précipités peuvent être attendus pour former que la protéine est hautement insoluble. Nous avons découvert que cela n'affectera le pliage de MOG 1-125 à condition que la protéine a été diluée de manière adéquate avant la dialyse.\nnt "> Pour la protéase TEV pour cliver efficacement la balise protéine MOG en pur MOG 1-125 , il est important d'utiliser une quantité suffisante de TEV protéase. Les anciennes versions de protéases TEV sont inactivées par l' auto-clivage 21 versions cependant plus modernes souffrent de émet insolubilité 22 donc il est important d'ajouter suffisamment TEV protéase pour obtenir un clivage suffisante de la balise protéine MOG avant TEV protéase inactivation. Depuis disponible dans le commerce protéase TEV peut être coûteuse, nous vous recommandons de production et de purification TEV protéase comme décrit dans la référence 22. Lors de l' utilisation souris pur MOG 1-125 protéines pour les expériences, il est important de noter que la protéine est hautement insoluble et peut précipiter hors de la solution et doit donc être mélangée intensivement avant l'utilisation.\nEn résumé, voici que nous avons décrit un protocole simple pour la production et la purification de grandes quantités de MOG tag protéines. e plusle minerai, l'ajout d'une protéase site de clivage TEV à notre protéine MOG tag offre la possibilité de générer pur MOG 1-125 si nécessaire. MOG tag protéine est reconnue et liée par les cellules B auto - immunes anti-myéline et MOG tag induite par EAE incorpore B pathologie à médiation cellulaire 5. Par conséquent, la protéine MOG tag surmonte les obstacles majeurs qui limitent l'utilisation à grande échelle de l' antigène protéique pour induire l' EAE.


Du bénéfice des erreurs.\nLe tâtonnement expérimental, ça vous parle? C'est l'idée qu'on apprend grâce à nos réussites mais aussi nos erreurs. Que l'expérience nous permettrait de développer tout un tas de compétences indispensables; l'autonomie, la capacité à surmonter une situation, à l'évaluer, à accepter l'échec, la coopération pour trouver une solution. Célestin Freinet l'avait compris bien avant moi et l'appliquait dans son école nouvelle. Et l'enseignant avait toute sa place puisqu'il était le


Tuto RVCA / Surf Session : Patrick Beven nous prépare au roller - Surf Session\nPar Marc-Antoine Guet - @surfsessionmag - jeudi 21 octobre 2021 à 11h05\nAprès le take-off il y a deux semaines ainsi que le bottom turn la semaine dernière, place aujourd'hui au roller.\nC'est une des manoeuvres de base. Celle qu'il faut maitriser avant d'imaginer plus grand. Celle qui va nous envoyer au fond, ou celle qui va nous donner des frissons.\nLe roller est surtout la suite logique du bottom turn. C'est un virage radical au sommet de la vague qui doit vous relancer dans une nouvelle pente. Le but ici est d'utiliser la lèvre de la vague pour se relancer dans cette dernière avec un maximum de vitesse.\nSi de nombreux tutos existent déjà sur internet sur la partie technique, aucune vidéo jusqu'à présent n'abordait le roller d'un point de vue préparation physique. C'est pourquoi, RVCA et Patrick Beven, en collaboration avec Surf Session, ont décidé de vous proposer trois rapides exercices physiques pour vous préparer au mieux à ce moment crucial. Trois exercices qui devront vous permettre d'appréhender au mieux un moment pas évident mais pourtant déterminant.\nAujourd'hui place au roller ! Prochain rendez-vous : le cut-back.\n>> Revoir le 1er épisode avec le take-off ainsi que le 2e épisode du bottom turn.\nMots clés : rvca, patrick beven, tuto, tutos, take-off, surf, entrainement, préparation physique, bottom turn, roller,\n27/12/2021 - Surf Session TV\n(Best of) Tuto RVCA / Surf Session : Patrick Beven vous...


Août et ses nouveautés\nCe n’est pas parce que les vacances estivales battent leur plein que la culture est en pause. Loin de là. Je vous propose des activités et nouveautés que l’on peut retrouver dans notre belle Métropole, cette semaine et un peu plus selon les événements. Du visuel décoiffant, hallucinant. Des pièces uniques qui déstabilisent. Beaucoup de cinéma, expériences visuelles et de la nouveauté auditive.\nBonne semaine à tous et bons visionnements.\n© Hymne au quotidien – Nathalie St-Pierre\nL’Université du Québec à Montréal (UQAM) et le Partenariat du Quartier des spectacles sont heureux de présenter Hymne au quotidien, une nouvelle vidéoprojection qui animera la façade du pavillon Président-Kennedy de l’UQAM du 1er au 29 août, à l’aube de la rentrée. Cette création aborde avec empathie et humour le quotidien bouleversé des étudiantes et des étudiants durant la pandémie et célèbre la résilience de la communauté universitaire.\nLes derniers mois auront été tout sauf habituels. Notre quotidien s’est transformé en véritable jour de la marmotte. Nos pantoufles, nos chats et notre espace intime ont pris une place prépondérante dans nos journées. Un contexte particulier notamment pour les étudiants qui ont vu leur réalité et leurs interactions, d’habitude trépidantes, comprimées en une succession d’instants répétitifs.\nÀ partir d’une direction artistique réalisée par l’équipe de l’UQAM, Hymne au quotidien combine photographies et illustrations ponctuées par des mots-clés significatifs. Habilement animée et mise en scène par le studio multimédia montréalais HUB Studio, cette nouvelle vidéoprojection parlera au plus grand nombre.\nDu 1er au 29 août 2021. Tous les jours dès la tombée de la nuit jusqu’à 23 h. Façade du pavillon Président-Kennedy de l’UQAM\nL’équipe de programmation du Festival international de films FANTASIA est heureuse de dévoiler les premiers titres de cette 24e édition virtuelle en ligne, dont le coup d’envoi sera donné le 20 août par la présentation de THE RECKONING de Neil Marshall. En raison des conditions uniques de cette année et afin de se conformer aux directives de la santé publique, le festival Fantasia aura lieu sous une forme virtuelle d’avant-garde en ligne du 20 août au 2 septembre prochain. Tous les festivaliers auront accès à un programme complet de films, de panels, de discussions et d’ateliers par le biais de la plateforme numérique Festival Scope, et ce pour la première fois de partout au Québec et à travers tout le Canada.\nLe passeport du festival vous donne accès à tous les films présentés en ligne. Mais, pour les projections en salle, vous devrez vous procurer des billets individuels.\nLe coût du passeport est de 75 $, taxes incluses. Notez que le passeport est disponible uniquement pour les résidents du Canada. Si vous n’êtes pas au Canada durant le festival, il vous sera impossible de visionner les films.\nLe Cinéma sous les étoiles de Funambules Médias se poursuit au mois d’août 15 projections gratuites en plein air dans 7 parcs montréalais encore jusqu’au 25 août 2021\nCe cinéma est heureux de présenter 15 projections gratuites en plein air au courant du mois d’août dans le cadre de sa 12e édition. Présent dans 7 parcs montréalais du 2 au 25 août 2021, l’événement reste gratuit bien qu’une réservation soit nécessaire pour accéder aux projections.\n© China Forbes – Officielle\nChina Forbes présente aujourd’hui la chanson Full Circle, premier extrait de son prochain album solo tant attendu. L’illustre chanteuse de Pink Martini a écrit cet hymne pop orchestral à la suite d’une rupture, reconnectant ainsi à sa force intérieure, celle qui lui permet de persévérer et de continuer à aimer la vie.\nFull Circle traite des schémas amoureux que nous avons tendance à répéter. Ceux-ci peuvent nous faire tourner en rond et nous ramener souvent à la case départ. Toutefois pour l’artiste, ce recommencement est synonyme de renouveau, car on y reviendra toujours en tant que nouvelle personne.\nL’Infini, c’est un voyage inoubliable dans l’espace où plusieurs médiums (réalité virtuelle, réalité augmentée et projections) se rencontrent avec un réalisme exceptionnel dans un parcours d’une heure.\nDans votre parcours, vous serez un membre privilégié de l’équipage avec les astronautes internationaux. Vous prendrez part à l’aventure épique, émotionnelle et inspirante. Découvrez du contenu inédit capté provenant du plus grand projet média jamais réalisé dans l’espace intitulé Space Explorers: The ISS Experience – nominé aux Emmy Awards 2021 dans la catégorie « Programme interactif exceptionnel ». L’ascension émotionnelle de l’expérience comprend également une œuvre exclusive de Ryoji Ikeda formée par un plafond à LED et un sol en miroir. L’immensité noire, l’effet de gravité et même le vertige seront au cœur de ce chapitre.\nQuittez la Terre et admirez-là d’un nouveau point de vue. À l’ère où la collaboration internationale se fait de plus en plus nécessaire, les leçons et valeurs humaines qui guident chacune des missions spatiales, nous poussent à réfléchir aux actions qui assureront la pérennité de notre planète Terre.\nC’est le moment de devenir astronaute et de monter à bord de la Station spatiale internationale.\nChina Forbes, Cinéma sous les étoiles, Festival international de films Fantasia, Le Quartier des Spectacles, Les nouveautés à voir et entendre, MatTv. MatTv.ca, Mylène Groleau, Nasa, PHI Centre, Pink Martini, UQAM


Ecole Sainte Mondane 24 primaire et maternelle\nSainte Mondane Ecole\nNombre d'écoles publiques et privées à Sainte Mondane 24 liste et carte des écoles primaires et maternelles. Avis, nombre d'élèves cantine, équipement\nNombre d'écoles à Sainte Mondane, écoles privées et publiques en primaire et en maternelle. Cantine, animation et équipement.\nEcole Sainte Mondane 24 primaire et maternelle : École à Sainte Mondane. Liste des écoles, nombre d'école du public et du privé à Sainte Mondane. Nombre d'écoles maternelles et primaires. Carte des écoles\nVille-Data.com ecole Sainte Mondane\nÉcoles maternelles et écoles élémentaires publiques et privées de Sainte Mondane dans le département (24)\nIl n'y a pas d'école maternelle ni élémentaire à Sainte Mondane.\nVous trouverez une école élémentaire publique à Carsac-Aillac\nÉcoles sur la commune de Sainte Mondane ou à proximité.\nECOLE PRIMAIRE PRIVEE MONTESSORI\n534,9m de Sainte Mondane\nÉcole proche de Sainte Mondane, école Maternelle et Élémentaire.\nL'école a un total de élèves, elle se trouve Bourg LE BOURG.\nÉcole située à Sainte Mondane, école Maternelle.\n2,9km de Sainte Mondane\nÉcole proche de Sainte Mondane, école Élémentaire.\n4,0km de Sainte Mondane\nÉcole élémentaire publique Eepu Masclat\n4,8km de Sainte Mondane\n4,9km de Sainte Mondane\n5,0km de Sainte Mondane\n6,2km de Sainte Mondane\nÉcole maternelle publique Empu Milhac\n6,4km de Sainte Mondane\nÉcole proche de Sainte Mondane, école Maternelle.\nÉcole élémentaire publique Eepu Lamothe Fénelon\n6,5km de Sainte Mondane\n7,0km de Sainte Mondane\nÉcole maternelle publique Empu Fajoles\n7,2km de Sainte Mondane\n7,6km de Sainte Mondane\n8,4km de Sainte Mondane\nL'école a un total de 21 élèves, elle se trouve Les Cledoux et propose un service de restauration scolaire.\n8,5km de Sainte Mondane\nÉcole élémentaire publique Eepu Anglars Nozac\n8,7km de Sainte Mondane\nÉcole élémentaire publique Eepu Rouffilhac\n9,4km de Sainte Mondane\n9,7km de Sainte Mondane\nÉcole maternelle publique Empu Souillac\n9,9km de Sainte Mondane\nL'école a un total de 101 élèves, elle se trouve Route de Sarlat.\n10,0km de Sainte Mondane\nCarte des écoles de Sainte Mondane.\nHôtels à Sainte Mond...\nEcole pour les plus grandes villes à proximité de Sainte Mondane\nVilles à proximité de Sainte Mondane par nombre d'habitants pour la rubrique Ecole\nL'ensemble des données concernant Ecole Sainte Mondane 24 primaire et maternelle présentées sur ville data sont librement reproductibles et réutilisables que ce soit pour une utilisation privée ou professionnelle, nous vous remercions cependant de faire un lien vers notre site ou d'être cité (source : Ville-data.com).\nLes données de la page Ecole Sainte Mondane 24 primaire et maternelle proviennent de SOURCES : Ministère de l'Éducation nationale, de l'Enseignement supérieur et de la Recherche, nous les avons vérifiées et mise à jour le mardi 27 mars 2018. Le producteur des données émet les notes suivantes :\nEcole Sainte Mondane\nÉcoles maternelles de Sainte Mondane\nListe et coordonnées des écoles maternelles de Sainte Mondane. Nombre d'élèves, adresse et tel.\nSainte Mondane : écoles maternelles privées et publiques\nÉcoles privées de Sainte Mondane.\nListe, adresse, tel, mail et carte des écoles privées de Sainte Mondane, nombre d'élèves.\nSainte Mondane : écoles privées - adresse - carte\nÉcoles primaires du public et du privé de Sainte Mondane\nListe et carte des écoles Primaires, élémentaires privées et publiques de Sainte Mondane, nombre d'élèves, adresses.\nSainte Mondane : écoles Primaires - privées et publiques\nNombre d'habitants à Sainte Mondane\nCombien d'habitants à Sainte Mondane, nombre d'hommes et de femmes, de célibataires, de couples et d'enfants. leur répartition par âge et l'évolution de la population\nSainte Mondane : nombre d'habitants - âge - démographie


L'ETAT ET LA DEREGULATION :\nANALYSE RETROSPECTIVE DE TROIS RAPPORTS\nFRANÇAIS SUR LES AUTOROUTES DE L'INFORMATION.\nCentre d’Etude des Médias\nMSHDU 33405 Talence\n91025 Evry (F)\nLes trois principaux rapports remis au gouvernement français sur les "autoroutes de l'information" (Théry, 1994 ; Breton, 1994 ; Miléo, 1996) mettent en lumière le déterminisme techno-économique des décideurs et l'injonction politique d'avoir à combler d'urgence le retard européen en matière d'informatique et de télécommunications. Cela au nom d'une hypothétique sortie de l'impasse industrielle et du chômage.\nDe plus, la politique française de "convergence européenne" semble hésiter entre le désir de maintenir l'autorité régalienne et une pratique de dérégulation au profit du commerce électronique privé.\nLe niveau d'acceptabilité politique de la société de l'information semble constituer l'enjeu sous-jacent des projets gouvernementaux.\nMots -clés Autoroutes de l'information. Politiques publiques. Dérégulation.\nL'Etat français face aux défis de La "société de l'information" :\nce que disent les rapports publics.\nA l'instar des autres pays industriels, la France s'est engagée dans la bataille des "autoroutes de l'information" avec pour objectif, on s'en doute, de ne pas trop se laisser distancer par ses principaux concurrents en ce domaine. Bien qu'elle participât à la construction européenne, la France a voulu élaborer un projet autonome. C'est en tout cas ce que souhaitait Edouard Balladur, l'ex-premier ministre, dans sa lettre du 28 février 1994 à Gérard Théry, lui commandant un rapport sur les "autoroutes de l'information" : "...Tout en participant activement à ce processus européen, notre pays doit, lui aussi, définir sa propre démarche. Il est d'autant plus fondé qu'il dispose, grâce au Minitel, d'une expérience précieuse en matière de services télématiques de grande diffusion".\nA partir de 1994, les hauts fonctionnaires, par mimétisme et/ou par une réelle volonté stratégique, vont se lancer dans une production considérable de rapports détaillants ce que sont pour eux les enjeux de "la société de l'information'. Depuis cette date, comme le titrait un article du journal Libération, on rencontre une "farandole de rapports autour du retard hexagonal". En effet, tous s'accordent sur la nécessité et l'urgence de l'investissement dans les autoroutes de l'information tout en mettant en perspective leur développement selon des angles particuliers. Ces publications ont également pour but de sensibiliser le public sur les enjeux sociétaux des "inforoutes".\nNous proposons de mettre en lumière les principales idées et recommandations contenues dans les trois rapports suivants : "Les autoroutes de l'information" de Gérard Théry, ancien directeur des télécommunications, publié en 1994 ; "Les Téléservices en France, quels marchés pour les autoroutes de l'information" de Thierry Breton, publié en 1994 ; "Les réseaux de la société de l'information" du groupe présidé par Thierry Miléo, du Commissariat général au Plan, publié en 1996.\nEssayons de voir comment se présente la "société de l'information" à travers ces études en commençant par le rapport de Gérard Théry.\nD'entrée de jeu on apprend que "la révolution de l'an 2000 sera celle de l'information pour tous. Comparable en ampleur technique à celle des chemins de fer ou de l'électrification, elle sera plus profonde dans ses effets, car les réseaux de télécommunications constituent désormais le système nerveux de nos sociétés [...] Ce nouvel âge de l'information est plus qu'une révolution industrielle ou un renouvellement des services de communication. Les autoroutes de l'information constituent un défi universel. Face à ce défi, la France a de bonnes chances de figurer dans le peloton de tête de la compétition dans un monde de plus en plus ouvert, si elle est capable de définir sans délai une stratégie ambitieuse mobilisant tous ces moyens."\n"Révolution", "l'information pour tous", "défi", "définir sans délai une stratégie ambitieuse", le ton est suffisamment fort pour comprendre qu'on est vraiment face à un "nouvel âge de l'information".\n"La réalisation des autoroutes de l'information oblige à maîtriser les techniques et les technologies de toute la chaîne de l'information, depuis la source jusqu'à l'utilisateur. [...] Dans l'état actuel de la technique, le déploiement de la fibre optique pour le raccordement des abonnés apparaît comme la voie la plus sûre et la plus évolutive, que ce soit pour les zones urbaines ou rurales. Les choix d'architecture sont différents selon les zones considérées, mais dans tous les cas des choix favorisant le câble coaxial face à la fibre optique conduirait à un abandon à moyen terme des nouveaux investissements."\nLa mise en place des autoroutes de l'information passerait donc par la maîtrise de "toute la chaîne de l'information, depuis la source jusqu'à l'utilisateur" ; et il conviendrait à cet égard de favoriser "le déploiement de la fibre optique".\n"L'Europe et la France ont des chances sérieuses pour réussir la révolution de l'information ; une forte demande potentielle de services utilisateurs des autoroutes de l'information ; des acteurs forts dans les services, l'industrie, la R&D et les réseaux de télécommunications. Mais les capacités de l'industrie du logiciel doivent être réorientées, les réseaux doivent évoluer. Ces atouts sont d'autant plus faciles à concrétiser que le contexte juridique est globalement favorable et que le coût financier est supportable" [...] "Au total des investissements pour la réalisation des infrastructures des autoroutes de l'information se situeront autour de 150 à 200 milliards de francs sur une période de 20 ans. Les services ayant une part prépondérante, on peut estimer que la valeur ajoutée permise par cet investissement sera au moins trois fois plus élevé."\nDonc, selon le rapport Théry, la bataille pour les autoroutes de l'information est une mission dont la France comme l'Europe peut s'acquitter, au prix d'investissements et de réorientations nécessaires dans les industries concernées. Un tel effort ne pourrait qu'être généreusement récompensé :\n"Dans cette perspective il conviendrait de fixer un double objectif : - la mise à disposition de tous les citoyens d'ici à l'an 2015 des autoroutes de l'information, chez eux et sur tous leurs lieux d'activité ;\n- l'égalité de tous dans l'accès aux autoroutes de l'information, c'est-à-dire l'élargissement aux nouveaux services offerts par les autoroutes du Service Universel déjà applicable au téléphone. Ce double objectif est une réponse à l'enjeu de compétitivité pour tous les acteurs économiques du pays, à celui du développement équilibré de notre société et à celui de l'égalité dans l'accès à la connaissance et à la culture [...] Or un tel accès fondé sur la seule loi du marché ne pourrait que renforcer une société duale où l'exclusion de l'information aboutirait à l'exclusion de l'emploi et à l'exclusion sociale. Il serait donc indispensable, dans un régime concurrentiel, de veiller à ce que le Service universel -actuellement limité au droit de chaque citoyen d'avoir accès au seul téléphone- soit élargi aux services multimédia, qui permettront, dans une acception claire, l'accès de tous à l'information et à la connaissance."\nAinsi, pour éviter "qu'une société duale où l'exclusion de l'information aboutirait à l'exclusion de l'emploi et à l'exclusion sociale", l'élargissement du "service universel" serait nécessaire pour assurer "l'égalité de tous dans l'accès aux autoroutes de l'information".\nGlobalement le rapport Théry se présente comme une étude concise et claire, où l’auteur nous explique les mécanismes et les enjeux des autoroutes de l'information. Loin d'être simplement une étude technique ou pédagogique sur les NTIC, le rapport explicite les dimensions sociales et culturelles de la société de l'information. Il se veut un outil d'aide à la décision, destiné essentiellement aux responsables des politiques d'informatisation.\nPour mieux comprendre l'aspect marchand de la "société de l'information", nous allons maintenant explorer les principaux passages du rapport de Thierry Breton, intitulé "Les Téléservices en France, quels marchés pour les autoroutes de l'information". Cette étude se présente comme "la première véritable étude de marché sur les inforoutes. Elle permet en particulier de mettre en évidence le caractère stratégique des Téléservices pour l'économie française (téléinformatique, téléservices de médiation, téléservices fonctionnels), pour l'aménagement du territoire aussi, compte tenu de leur aptitude à la délocalisation, mais également pour l'identité nationale (télé-enseignement, téléservices de loisir et de culture, téléservices d'information ainsi que télé médecine ...) ".\nPour ce qui est de la définition des Téléservices le rapport retient "toute prestation de service à valeur ajoutée, entre entités juridiques distinctes, utilisant les outils de télécommunications." Les domaines d'application énumérés sont au nombre de sept : - Téléservices fonctionnels\n- Téléinformatique (Téléservices liés à l'informatique)\n- Télégestion, télésurveillance d'équipements ou de réseaux\n- Téléservices d'information et de médiation\n- Téléservices aux particuliers Cette classification des téléservices donne une idée de l'étendue du champ d'application des autoroutes de l'information. A cet égard, les clients des téléservices se diviseraient en trois grandes catégories : - le marché professionnel en général ( grands comptes, professions libérales, etc.) ;\n- des niches spécifiques de marchés professionnels (le secteur médical, les exploitants d'infrastructures d'équipements ou de réseaux, le secteur de la formation, etc.) ;\n- le marché public. Et Thierry Breton conclut : "L'un des enjeux essentiel de cette économie des téléservices est de parvenir à gérer efficacement la remontée de flux financiers, du consommateur vers les prestataires : ces échanges doivent être sécurisés et fiabilisés".\nSelon ce rapport, les tarifs élevés du réseau Numéris en France freinent le développement des téléservices : "Les prestataires de téléservices n'expriment pas le besoin d'une infrastructure nettement plus performante que celle actuellement disponible sur le réseau français. Cela tient au fait que pour la plupart des téléservices, le réseau Numéris suffit amplement et sa couverture nationale est un facteur unique au monde de développement des téléservices. En fait, le frein ne se situe pas au niveau technologique mais économique : les prestataires de téléservices indiquent que les tarifs proposés sur le réseau Numéris par l'opérateur national semblent dissuasifs pour la plupart de leurs clients (le nombre d'échanges entre un prestataire et son client ne justifie pas jusqu'à un certain niveau de consommation la mise en place d'un accès à Numéris)."A cet égard, l'opérateur de télécommunications public pourrait jouer un rôle important : "Son action pourrait consister à aider les entreprises naissantes de téléservices et les initiatives de télétravail en étudiant avec elles un plan d'investissement de télécommunications. Il pourrait : - mettre en place une tarification progressive sur une base forfaitaire à titre gratuit ou à des tarifs adaptés ;\n- jouer encore plus un rôle de conseil en télécommunication pour trouver les solutions les plus efficaces et les moins coûteuses." Le facteur culturel est également évoqué comme un frein pour le développement des téléservices : "Dans plusieurs domaines d'application, le contexte culturel est un frein au développement des téléservices. Si cet élément subsiste en milieu industriel, lié à la crainte d'une perte de maîtrise ou du pouvoir induite par l'externalisation de fonctions, il est plus important encore dans le cas d'applications de type résidentiel ou institutionnel. Ces freins culturels sont notoires dans le domaine de la télémédecine ou du télé-enseignement, où les principaux intervenants (corps médical, corps enseignant) n'acceptent pas sans réserve l'irruption des technologies dans l'univers de la connaissance (savoir médical, savoir pédagogique)."\nEn réponse à ces difficultés, le rapport formule "trois facteurs clés de succès pour le développement d'une politique d'attraction des entreprises de téléservices (ou utilisant les téléservices) : - l'action en synergie de l'opérateur de télécommunications et de la collectivité locale ;\n- la complémentarité entre les offres financières et non financières (les seules offres financières ne suffisent pas) ;\n- la mise en place de structures supportant le développement des téléservices : centres de recherche, actions menées par les universités en direction des entreprises, formation du personnel, conseil pour la création d'entreprise. C'est la combinaison de ces trois éléments, associée à la qualité de l'infrastructure de télécommunications, qui a permis à plusieurs provinces et à l'Etat nord-américains de développer une activité économique fondée sur les téléservices."\nLes incidences sur l'emploi du développement des téléservices sont présentées dans le rapport de manière mitigée. D'un côté, on est prévenu des risques de pertes d'emplois dans les mouvements de délocalisation : "Les téléservices permettent de réaliser une prestation à des milliers de kilomètres de l'endroit où elle est attendue. Les téléservices sont de ce fait placés au centre de la problématique sur la délocalisation. Mais si la mondialisation présente des risques évidents pour l'économie française, la France n'est pas démunie dans cette compétition internationale."\nOr d'un autre côté ce rapport affirme que "globalement, il apparaît que : - il existe des perspectives de création d'emplois et de chiffres d'affaires en France ;\n- l'emploi est essentiellement créé par des offres de téléservices à relativement faible valeur ajoutée destinés à des pays d'Europe, à main d'oeuvre comparativement plus chère. A ce jour, cette offre n'est que marginale. L'atteinte de ces objectifs nécessite des actions de promotion volontaristes ;\n- le chiffre d'affaires potentiel proviendrait essentiellement des téléservices à forte valeur ajoutée (base de données techniques .. ) ;\n- les applications de télé-enseignement et de télémédecine, même si elles existent, ne devraient avoir à l'horizon visé que des impacts marginaux en terme d'emplois."\nL'impact des téléservices sur l'aménagement du territoire est également souligné dans le rapport. Il se situe à deux niveaux : - la limitation de l'exode rural :\nDeux moyens complémentaires ont été imaginés pour limiter l'exode rural : la formation des habitants et des régions éloignées et l'aide pour les entreprises locales à l'accès aux moyens de télécommunication. L'Australie présente une expérience intéressante dans ce domaine à travers le développement de réseaux de télécentres.\n- l'attraction d'entreprises :\nL'autre type d'action menée par les collectivités locales ou par des gouvernements pour avoir un impact sur l'aménagement du territoire est d'essayer d'attirer les entreprises. I1 peut s'agir d'entreprises fournissant des téléservices : télémarketing, externalisation du traitement de données informatique, gestion de services consommateurs ; mais aussi d'entreprises souhaitant délocaliser certaines de leur fonctions : production informatique, service de relation avec la clientèle (centre d'appels), back- office dans le domaine financier (banques, assurances). En dehors de ces cas, où se manifeste une volonté affichée d'avoir un impact sur l'aménagement du territoire, les téléservices s'implantent souvent en zones urbaines, pour des raisons utilitaires (embauche de main-d'oeuvre qualifiée, entretien et dépannage, proximité des clients).\nA la lecture de ces principaux passages du rapport Breton, il est clair que le débat sur la "société de l'information" est fortement structuré par la logique marchande, entendue comme l'ensemble des préoccupations et préférences à la base de l'orientation libérale des stratégies d'acteurs dans la sphère économique et financière des NTIC. En termes purement financiers, "le marché total des téléservices, en France, est ainsi évalué en 1993 à 33 milliards de francs. Il serait en 2005 compris entre 86 milliards et 195 milliards de francs." Les enjeux économiques des NTIC sont bien entendu considérables. Les prévisions sur la rentabilité de leur utilisation sont toutefois difficiles et aléatoires, car il s'agit surtout de promesses.\nLe discours optimiste sur l'ère des téléservices pèsera sans doute sur la mise en oeuvre de choix, mais il ne suffira pas à créer le marché. L'heure est encore aux grandes manoeuvres de rapprochement entre les opérateurs venant du monde de l'informatique, des télécommunications, de l'édition, de la production audiovisuelle, en attendant que le public ratifie les choix des professionnels, avec les incertitudes que cela suppose.\nLa compréhension de la conception française de la "société de l'information" implique d'aller au delà des rapports Théry et Breton. Ces derniers ont chacun apporté un éclairage capital sur l'enjeu stratégique des inforoutes et sur leur champ d'application. Mais ils ne donnent pas de réponse satisfaisante à la question de savoir comment l'Etat devrait assurer son rôle dans la "société de l'information". Autrement dit, il s'agit de se demander comment l'Etat pourrait satisfaire conjointement les besoins des investisseurs et ceux des consommateurs (essentiellement en termes de qualité et de faibles coûts), afin de contribuer à garantir le minimum de cohésion faute duquel la pérennité même de la "société de l'information" serait menacée.\nL'Etat, s'il n'a pas "vocation à se substituer aux autres acteurs de la "société de l'information", a des fonctions importantes de régulation et de réglementation des autoroutes de l'information : l'organisation de la concurrence, le contrôle des prix et tarifs, l'établissement des régimes d'interconnexion entre opérateurs, l'adaptation et l'attribution de licences d'exploitation de services, l'accès aux ressources limitées (fréquences, sites d'antennes), la garantie du service universel, etc".\nA cet égard, le rapport sur "Les réseaux de la société de l'information" de Thierry Miléo offre un terrain fertile à la réflexion sur l'enjeu de la régulation dans la "société de l'information". La problématique de cette étude tourne autour de la formulation suivante : "Pour l'Etat qui se voudrait maître des horloges, celle des technologies de l'information tourne vite. Pour autant, il ne peut pas se retirer du jeu." Cette façon d'aborder la question a le mérite de souligner l'insuffisance du mode traditionnel d'intervention de l'Etat face à la diversité de situations inédites créées par le développement rapide des NTIC. Par exemple, "le téléphone, l'informatique, l'audiovisuel étaient des industries puissantes mais distinctes, leur fusion est en marche. On distinguait traditionnellement le contenu -la production d'informations-, le contenant -qui les transportait- et les fabricants d'équipement ; désormais les frontières se dissolvent." Ainsi, "la régulation des réseaux est complexe et mouvante. Entre public et privé, entre intérêt général et intérêts particuliers, entre administration et entreprise, entre monopole et concurrence, la ligne de partage n'est pas aisée à tracer. A vrai dire, elle est sans cesse en mouvement, en fonction des technologies, des besoins individuels et collectifs, du contexte des politiques économiques, des revendications sociales et des idées politiques".\nLa notion de service public est tout a fait centrale dans cette conception de l'architecture de la "société de l'information". "Des trois motivations qui justifient traditionnellement l'intervention du service public dans les réseaux, chacune aujourd'hui demeure valable -et tout spécialement applicable aux communications : les préoccupations de puissance publique et de souveraineté nationale dans des secteurs essentiels et stratégiques pour le pays ; la garantie des droits fondamentaux des citoyens et de leur accès à des services de base ; le contrôle des monopoles naturels et la protection des consommateurs contre les abus des positions dominantes. Mais l'équilibre entre ces préoccupations légitimes et les avantages de l'ouverture des marchés et de la concurrence s'est modifié, en raison notamment de la prolifération des innovations et de l'accélération de la globalisation." Ceci étant, ajoute le rapport Miléo, "l'autonomie de décision des nations face aux forces du marché global et des entreprises multinationales n'est pas un concept dépassé".\nA partir de ces considérations, le rapport souhaite l'organisation du rôle de l'Etat dans la "société de l'information" autour de quatre axes majeurs : "1. Une réglementation qui favorise le développement des entreprises, dans un environnement de concurrence équilibrée ;\n2. Un encouragement des acteurs qui souhaitent innover, pour le plus grand bénéfice des consommateurs ;\n3. Une régulation efficace du marché, assurée par une autorité indépendante dotée de pouvoirs réels ;\n4. une réglementation compatible avec les missions de service public, dans le respect de la notion communautaire de service universel."\nDans cette perspective, le rapport insiste sur "le développement des autoroutes de l'information, au carrefour de deux univers complémentaires mais dont les problématiques sont distinctes : - d'un côté se trouve le monde des contenus, pour lesquels doit être mise en place une régulation volontariste qui vise à assurer la pérennité du pluralisme, et celle d'une politique culturelle et linguistique s'attachant à valoriser les ressources de notre patrimoine, par l'intermédiaire de services multimédias innovants et attractifs pour le grand public ;\n- de l'autre se trouve le monde des contenants (infrastructures) et des technologies, capables désormais d'acheminer des informations de nature très différente. L'action publique doit permettre l'apparition des conditions économiques propres favorisant le développement d'une offre diversifiée et concurrentielle, tout en garantissant à tous l'accès à ces services." Pour s'acquitter efficacement de sa mission, l'Etat devrait non pas réguler directement mais superviser le processus de mise en oeuvre de ces quatre énoncés. A cet égard, le rapport Miléo souligne les insuffisances du système actuel de régulation et la nécessité d'une nouvelle organisation : "La Direction générale des Postes et Télécommunications, qui a pendant plusieurs années joué pleinement et effectivement son rôle de régulateur des télécommunications, ne disposait d'aucun pouvoir de sanction financière, n'avait pas compétence en matière de concurrence et surtout était placée sous le contrôle direct du gouvernement. Le Conseil Supérieur de l'Audiovisuel (CSA), lui, est effectivement indépendant et doté de réels pouvoirs de sanction, mais n'a la possibilité ni de moduler les conditions d'application de la législation, ni de réguler le comportement des acteurs économiques du secteur."\nA cet égard, le rapport fait remarquer que les acteurs du monde des télécommunications se sont largement prononcés en faveur d'une Autorité de Régulation des Télécommunications (ART), qui serait dotée d'une indépendance accrue, proposition qui a été reprise dans la nouvelle loi de réglementation (loi sur la réglementation des télécommunications du 26 juillet 1996) : "Autorité unique qui fusionnerait CSA et ART, augmentation des pouvoir du CSA, indépendance accrue de l'ART, telles sont les options principales dont disposera le gouvernement pour faire évoluer le mode de régulation des communications dans les années futures. En tout état de cause, il apparaît clairement, compte tenu de l'échéance du 1er janvier 1998 et sans préjuger des choix qui pourront être faits ultérieurement, que l'urgence était effectivement à la création d'un régulateur des télécommunications, l'ART, indépendant et doté de pouvoirs renforcés par rapport à ceux de la DGPT. Un consensus national s'est fait jour sur ce point, que reflète le nouveau cadre réglementaire des télécommunications".\nAinsi, n'en déplaise aux partisans du "laisser-faire", il faudrait refuser de considérer comme une évidence, une donnée naturelle, le développement de la "société de l'information", et dévoiler le travail d'interprétation et d'organisation qui revient aux pouvoirs publics.\nPour ce qui est du travail d'interprétation, on peut dire que les deux rapports Théry et Breton se situent dans un processus intellectuel de construction d'une politique stratégique (Gérard Théry) et économique (Thierry Breton) de la "société de l'information" et de ses modes de traitement. Quant au rapport Miléo, il se situe beaucoup plus dans une perspective d'organisation de la "société de l'information". Il traite en ce sens de la genèse et de l'institutionnalisation des acteurs des NTIC et du système de négociation qui en découle. A travers ce double processus d'interprétation et d'organisation, différentes hypothèses possibles d'ajustement entre les exigences de la logique technomarchande et celles de la société globale se construisent et se sélectionnent. C'est leur combinaison particulière qui permet la conception, la formulation et la mise en oeuvre des politiques publiques exposées dans les rapports officiels.\nA cet égard, il est à noter la forte convergence des conceptions et politiques de la "société de l'information" dans les principaux pays industriels. Emportées par l'enthousiasme d'avoir trouvé une issue à l'impasse industrielle de cette fin de siècle, toutes les régions industrialisées s'accordent à vanter dans leur rapports officiels respectifs les bienfaits des technologies de l'information et de la communication. Celles-ci sont devenues le fer de lance des nouvelles stratégies de développement socio-économique en Europe et leurs approches sont à bien des titres similaires. Nous proposons d'étudier incidemment ce point car il permet de mieux comprendre la dimension cognitive internationale qui a présidé à l'émergence, puis à l'affirmation de politiques dirigées vers la "société de l'information".\nLes facteurs de convergence européenne\nen matière de "société de l'information"\nThierry Vedel est l'auteur d'une analyse comparative approfondie des "facteurs de convergence" dans les politiques européennes d'inforoutes", qu'il développe dans deux textes parus en l996 et 1997. Il les présente comme étant issus d'une vision technologique déterministe, mais aussi de pratiques d'imitation et d'harmonisation européenne, et enfin comme ayant été en partie imposés par l'influence nord-américaine.\nConvergence par nécessité technique\nLe premier facteur est le déterminisme technologique qui semble largement répandu chez les différents rapporteurs, conseillers et décideurs politiques et industriels. Par exemple, le Livre Blanc de l'Union Européenne écarte même tout débat sur le progrès technique : "Il serait vain de s'engager dans un débat polémique sur l'âge de la machine" et, comme il ressort du rapport européen Bangemann remis en 1994, il s'agit avant tout de s'adapter aux évolutions techniques qui sont considérées comme inévitables. (Pour le "groupe Bangemann", essentiellement constitué d'industriels, les nouvelles technologies télématiques vont accroître la prospérité, la qualité de la vie et l'emploi grâce à une politique "market driven", i.e. dirigée par le marché).\nDans le même sens, François Fillon, ministre délégué à la Poste, aux Télécommunications et à l'Espace, déclarait le 4 juin 1996 lors de la discussion au Sénat sur la nouvelle réglementation des télécommunications : "Contrairement aux idées reçues, ce sont moins les contraintes européennes que les bouleversements technologiques qui rendent nécessaire l'évolution de la réglementation des télécommunications." Evolution qui nécessite une implantation rapide et massive des inforoutes, afin de connecter le plus grand nombre. En effet, les possibilités offertes par les services seront d'autant plus importantes que la communauté d'usagers sera large. Par exemple, l'utilisation du téléphone croît en fonction du nombre d'abonnés et de la possibilité qu'ils ont de se contacter. Il s'agit là de ce que l'on appelle la contrainte d'externalité de réseau. Pour faire face à cette contrainte on retrouve dans les principes d'action des politiques l'interconnexion et l'interopérabilité rapide des infrastructures de l'information comme dénominateur commun.\nAinsi, le progrès technique façonne le champ décisionnel des acteurs économiques et politiques de la "société de l'information". Toutefois, comme cela a été souligné par les sociologues de l'innovation, l'évolution technique reste au coeur des rapports sociaux. Elle définit un champ des possibles qui est modelé par les rapports sociaux, culturels et politiques.\nConvergence par imitation\nLe deuxième facteur est la convergence par l'imitation des politiques mises en oeuvre dans les autres pays. Ce mimétisme survient dans la mesure où les résultats des politiques engagées dans un pays ont été satisfaisants, ce qui facilite la légitimation de programmes d'action relativement semblables. A cet égard, on peut dire que le lancement des "superautoroutes de l'information" en Amérique a connu et connaît encore une émulation telle qu'il s'avère difficile pour les autres pays de rester en retrait et sans stratégie d'action en réponse. Cependant, la politique française ou européenne des autoroutes de l'information est loin d'être une imitation servile de l'expérience américaine.\nConvergence par harmonisation\nLe troisième facteur mis en avant pour expliquer la convergence des politiques est l'harmonisation, autrement dit la diffusion de modes opératoires identiques par une action concertée des autorités publiques de différents pays. En général, c'est au sein d'organisations internationales comme l'OMC, ou régionales comme l'Union Européenne, que les pays concernés tentent de trouver des accords communs visant l'harmonisation de leurs politiques. Dans le cas de l'Union Européenne, ce sont les règlements de la Commission européenne qui établissent une base commune à l'action des Etats membres. Cette convergence des politiques publiques en Europe a pu être sériée en trois point : l'apparition d'un agenda politique européen, une conformité croissante des modes de représentations et une convergence des modes de décision des différents acteurs (voir Pierre Muller, 1997). Cela donne lieu à l'émergence d'un espace commun de médiation. En ce sens les sociétés européennes vont penser leur rapport au monde selon des normes et des valeurs communes, mais qui n'engendrent pas pour autant un consensus sur les pratiques à suivre. Les spécificité nationales ou régionales ressurgissent à travers l'imbrication des processus politiques donnant plutôt lieu à une hybridation qu'à une véritable convergence.\nConvergence imposée de l'extérieur\nElle résulte de l'insertion délibérée d'acteurs extérieurs dans le processus décisionnel. Ces acteurs peuvent être des représentants d'autres gouvernements, de lobbies, d'organisations internationales. Leur présence au sein même du processus décisionnel influence le choix des calendriers, l'allocation des budgets voire la mise en oeuvre des politiques publiques. A cet égard, la concurrence et l'ouverture des marchés sont pour les américains un tapis rouge donnant accès aux plus hautes sphères décisionnelles de l'Europe Par exemple, à peine publié, le rapport Magaziner était déjà inscrit d'office à l'ordre du jour des délibérations des Européens. A Bonn, le 8 juillet l997, les représentants de vingt-neuf gouvernements du vieux continent, réunis pour débattre des réseaux mondiaux d'information, recevaient le secrétaire du commerce William Daley, venu leur signifier la détermination de Washington de "promouvoir le commerce électronique." On l'aura compris, on est là loin d'une harmonisation des politiques sous l'effet d'une action concertée.\nSi ces indications sur les facteurs de convergence sont importantes et méritent d'être creusées pour comprendre la dimension globale/planétaire des nouvelles technologies de l'information et de la communication, elles restent néanmoins insuffisantes pour apprécier localement les enjeux politiques de la "société de l'information". Tout porte à croire que celle-ci est défendue au nom de la nécessité, de l'urgence, et de moins en moins au nom de valeurs culturelles et d'aspirations sociales. Pour échapper à ce rétrécissement du débat sur la "société de l'information', pour que celui-ci se hisse au rang d'un enjeu de société et ne soit pas ravalé au niveau d'un jeu serré entre acteurs concurrents, il faut le situer par rapport à ses fondements politiques, sociologiques voire éthiques.\nDans ce débat essentiel, la réactivation des concepts de citoyenneté, de démocratie, de société civile active n'est pas neutre. De plus en plus de citoyens veulent savoir vers quoi on les mène et quels moyens d'accompagnement on se donne pour les conduire vers la "société de l'information'. Il y a là une demande de sens à laquelle la logique technomarchande ne paraît pas savoir répondre. Il est alors prévisible que cette distanciation critique des citoyens par rapport à la "société de l'information" risque de s'accentuer, au fur et à mesure que la dynamique globale des réseaux portera atteinte à des symboles et réalités plus ou moins enracinés selon les pays, tel que par exemple la demande de services publics. En effet, au nom de l'impératif catégorique techno-financier, les sociétés civiles se voient intimer l'ordre d'accepter les dérèglements de l'Etat de droit, présentés dans les rapports publics comme inexorables. Présentées aux citoyens comme des faits accomplis, explique Armand Mattelart, les mesures dérégulatoires les privent de voix et, par là même, font reculer les seuils de tolérance démocratique. Ainsi, l'enjeu de la faisabilité/acceptabilité politique est au coeur du projet de "société de l'information".\nBANGEMANN Report, Europe and the global information society, in serveur Web - ISPO, 1994.\nBAQUIAST Jean-Paul et GANNE Roger, La France dans la bataille des technologies de l'intelligence, Documentation Française, Paris, 1985.\nBRETON Thierry, Rapport sur les téléservices en France. Quel marché pour les autoroutes de l'information? Documentation Française, 1994.\nCOMMISSION EUROPEENNE, Croissance, compétitivité et emploi. Les pistes et les défis pour entrer dans le XXle siècle, Livre Blanc, Luxembourg, 1993.\nCOMMISSION EUROPEENNE, Green Paper. Living and Working in the Infonnation Society, in serveur Web -ISPO, 1995.\nMATTELART Armand, La nouvelle idéologie globalitaire, éd. La Découverte, Paris, 1997.\nMILEO Thierry, Les réseaux de la société de l'information, Commissariat Général au Plan, Paris, 1996.\nMULLER Pierre, L'européanisation des politiques publique,in Politiques et management public, vol.15, mars 1997.\nNORA Simon et MINC Alain, L'informatisation de la société, Documentation Française, Paris, 1978.\nSTOFFAES Christian (Rapport de la commission présidée par), Services publics, questions d'avenir, éd. Odile Jacob, Paris, 1995.\nTHERY Gérard, Rapport sur les autoroutes de l'information, Documentation Française, Paris, 1994.\nVEDEL Thierry, Les politiques des autoroutes de l'information en Europe, in Politiques et management public, vol. 15, mars 1997.


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