Bonbons Maquillage von Sadaharu Aoki | Beautyjagd\nWelche Beauty-Bloggerin könnte sich wohl bei einer Schminkpalette aus Schokolade zurückhalten? Ha, offensichtlich ich (ich weiß auch nicht, wie das kam 😉 ) ! Das konnte Reisebegleiter Chez Matze kaum fassen und kaufte kurzerhand eine der schokoladigen Paletten mit neun Nuancen.\nDass ich die außerordentlich schmucken Bonbons Maquillage von Sadaharu Aoki noch nicht vernascht habe, liegt ausschließlich daran, dass mich am Wochenende eine fiebrige Erkältung zur Bettruhe gezwungen hat, und ich bei Husten und Halsschmerzen keine Lust auf Schokolade hatte.\nSo kann ich euch nun diese – noch vollständige! – wunderbare Box mit Pralinen vorstellen, bei deren Gestaltung sich der japanisch-französische Patissier Sadaharu Aoki von einer Schminkpalette inspirieren ließ. Im weißen festen Umkarton mit Magnetverschluß befinden sich neun unterschiedlich parfümierte dunkle Ganaches (das ist eine Creme aus Kuvertüre und Rahm). Klassische Geschmäcker wie Himbeere oder Caramel werden durch japanisch inspirierte Nuancen ergänzt: Wasabi, Yuzu oder schwarzer Sesam.\nBeeindruckend finde ich die Philosophie von Sadaharu Aoki, der seit 1991 in Frankreich lebt: Er arbeitet täglich daran, die (vorgeblich) einfachen Dinge noch besser zu machen. Beste Rohstoffe und höchste Handwerkskunst stehen für ihn im Mittelpunkt seiner süßen Kreationen.\nDer Pinsel oben lag der Palette übrigens nicht bei, es handelt sich dabei um den Concealer-Pinsel von Hakuhodo, den ich mir in Tokyo gekauft habe und bereits in den damaligen Beauty-Notizen gezeigt habe. Aber er würde gut dazu passen, oder?\nEin bisschen werde ich die Bonbons Maquillage noch bewundern, dann aber einen „délicieux moment“ genießen, wie es Sadaharu Aoki auf der Innenseite des Deckels wünscht. Ich hoffe, ihr seid gesund und munter – und ich konnte euch mit dieser Beauty-Perle der anderen Art ein wenig unterhalten 🙂 .\nCleo sagt am 12. Januar 2015\nDie Bonbons Maquillage ist ja allerliebst!! Die Franzosen haben es einfach drauf mit ihrem tollen „Süßkram“. Dir gute Besserung.\nDanke! Und ja, genau das dachte ich mir auch: bei der Verbindung von Japan und Frankreich kommt dann eben so was Hübsches raus 🙂\nFayet sagt am 12. Januar 2015\nNein, wie – im wahrsten Sinne des Wortes – süß. Schön. Ich war ganz verwundert und konnte mich anhand des Photos erst gar nicht entscheiden, ob das jetzt Schokolade oder MakeUp ist. Der Laden wandert auf jeden Fall auf meinen nächsten Besuchszettel in Paris.\nHoffentlich geht es Dir bald wieder besser! Hier grassiert auch ein Virus nach dem anderen..\nDie Patisserie kann ich nur empfehlen! Ich habe vor Ort eine Matcha-Creme gegessen, hmmm. Und dann diese Genmaicha Matcha-Schokolade, ebenfalls ein Knaller. Alles aber sehr dezent, nicht aufdringlich parfümiert. Und der Service in dem Laden ist so, wie man in aus Japan gewohnt ist, einfach unglaublich nett und zuvorkommend.\nOh das klingt ja alles zauberhaft!!! Matcha-Schoki und Creme, herje… aufhören! 😀 Und die Palette ist herzallerliebst, die hätte ich auch mitgenommen.\n@ Ranunkel: Viel Spaß schon einmal, das wird ein herrlicher Trip! Und wie toll, dass deine Gressa-Bestellung schon da ist. Da bin ich so gespannt wie alle hier!\nRanunkel sagt am 12. Januar 2015\nHabe den Minimalist heute mal ausprobiert, ein Teufelszeug !!!\nDas bedeutet, Du bist begeistert?! 🙂\nHmmmm – ich habe glaube ich mit dem Ton 02 ein bisschen einen zu hellen und zu roséstichigen Ton erwischt. Ich werde im Alter irgendwie gelblich… Oje.\nAllerdings passt sich das Zeug schon gut dem Hautton an und ich habe gerademal 4 Tropfen mit der wunderbaren Buffing Brush von Gressa aufgetragen und das gab eine gute aber natürliche Deckung. Die Brush ist übrigens wirklich super, auch meine Vapour Foundation kann man damit prima einarbeiten.\nAnfangs hat sich die Farbe ein bisschen an trockenen schuppigen Hautstellen abgesetzt, das hatte ich schonmal in irgendeinem US Review gelesen. Habe dann den ML Toner drübergesprüht und 10 Minuten gewartet. Und dann ist das Ergebnis wirklich sehr schön glowig und natürlich. Das frappierendste ist, daß sich das bisschen Produkt wirklich völlig streifenfrei und leicht aufs Gesicht verteilen lässt, ich vermute, das liegt am Meadowfoamöl.\nDie Farbe 02 müsste für deinen Teint perfekt sein, hast du den bestellt? Ich habe ja auch noch den Illuminist mitbestellt, der schillert erstmal leicht rosalila, da war ich kurz verunsichert. Aber davon ist nach dem Verteilen nichts mehr zu sehen. Er gefällt mir fast besser als RMS, weil noch zarter und außerdem matter.\n@Ranunkel: Ja, ich habe auch 02 bestellt, einfach so, ohne genau zu wissen, ob das nun nicht doch zu hell ist – aber ich dachte mir, bis die Foundation hier eintrudelt, bin ich auch hell genug, haha. Und ich bin sehr gespannt, danke für deine ersten Eindrücke! Den Pinsel habe ich mir allerdings nicht mitbestellt.\nUiuiui, das klingt ja guuuut! Braucht frau denn diesen Pinsel (unbedingt) dazu? Menno, das nimmt ja echt kein Ende hier!\nUnd du meinst das Illuminating Serum? Das benutzt du doch nicht etwa zusätzlich zum Foundation-Öl, oder?\nUnd besser als das rms beauty Oil meinst du ist dieses Serum? Sorry, aber heute muss ich mich mal doof stellen, das interessiert mich einfach zu sehr 😉\nLiebe Ellalei, nee – den Pinsel muss Frau nicht unbedingt haben aber nett ist er schon, hihi.\nIch habe mir das alles als Weihnachtsgeschenk bestellt und nun ist es halt ein Neujahrsgeschenk geworden.\nAlso mit den ganzen Titeln der US NK stehe ich ja immer auf Kriegsfuß\nMINIMALIST Illuminating Serum ist der korrekte Name und es ist ein Highlighter so in der Art von RMS Living Luminizer bloß flüssig und etwas dezenter.\nDie Texturen von Gressa sind schon besonders.\nOha, ein Highlighter – na darauf wäre ich nun nicht gekommen. Also wird das Serum eher partiell aufgetragen, verstehe.\nDein Geschenk an dich klingt insgesamt sehr spannend und ich wünsche dir noch viel Spaß beim weiteren Austesten!\nSchade, dass es keine Proben gibt, da müsste man doch irgendwie herankommen ohne gleich die ganze Flasche (der Foundation meine ich jetzt erst einmal) kaufen zu müssen und dann wommöglich in der falschen Farbe… Hach, träum!\nPetra sagt am 12. Januar 2015\nBin ich froh, dass ich es nicht mit Ölen habe. Die Farbe 01 könnte passen oder nur minimal zu dunkel sein…\nhazel sagt am 12. Januar 2015\nHammer Palette… Von links nach rechts concealer, klar, aber huch, noch ein grünerer als Marie W.’s, naja, ok und dann halt Lippenstifte! Knaller-Farben, wo gibt’s die?\nÄh, doch nicht???? Eeeeeecht, was zu essen? Cool! 🙂\nMannmannmann, Ranunkel, jetzt ging’s aber doch schnell mit GRESSA, oder? 😉 du Glückliche! Wenn ich mich recht erinnere, hast du ja den Versand geschenkt bekommen. Weißt du noch, was er ausgemacht hätte? Wieviel Einfuhrumsatzsteuerdingens hast du bezahlt? Ging das alles problemlos mit der Post?\nDer Pinsel sieht dem HIRO Flattop top recht ähnlich. Mit dem finde ich die Vapour foundation ja auch so super aufzutragen.\nJa, die Farb/Wahl/Qual finde ich schon abschreckend. Mich hätte das ‚pink‘ in der Beschreibung etwas gestört… Und ich glaube, unsere Hautfarben sind ähnlich, nur deine etwas heller. Svetlana würde mir den 03 empfehlen (wg. Vapour 125), ich persönlich könnte auch mit der 04 liebäugeln. Aber man neigt ja immer zu zu dunklen Tönen, das weiß man ja… 🙂\nSchwierig, schwierig. Wenn du nochmal bestellst und die 03 auf der Liste hast, könnten wir uns die ja auch erstmal teilen.\nLiebe Hazel, das finde ich gar keine schlechte Idee !!\nWenn du Svetlana kontaktierst und das erste Mal bei Gressa bestellst, erlassen sie dir die Shipping Kosten und ich habe überhaupt keinen Zoll oder Umsatzsteuer bezahlt, ging erstaunlicherweise so durch, weil sie “ present“ außen draufgeschrieben hat.\nSvetlana hat mir 03 empfohlen, um die 02 etwas wärmer zu tönen. Im Sommer ist 04 dann sicher passend.\nWenn du magst füll ich dir ein bißchen von der 02 ab, damit du dir mal die Konsistenz und Deckkraft anschauen kannst. Sollte dich die Foundation überzeugen, könnten wir uns doch wirklich ein Fläschchen teilen.\nGressa hat übrigens auch ganz interessante Masken und Peelings mit Honig, etc.. und sehr belobte Lippenfarben.\nIch muß nochmal kurz korrigieren: es ist nicht Meadowfoamöl sondern Broccolisamenöl in der Foundation und bei Erstbestellung gibt es einen 15% Discount, so war’s richtig.\nWahahaha, ich bin natürlich reingefallen! Ich habe nur das Bild und den Titel angeschaut und gedacht: Hui, Tuschkasten, ich bin ja eigentlich schon mutig bei Farben aber das hätte ich mich im Leben nicht getraut… Und dann diese grün gestreift, was soll das denn verblendet werden, Kuhfladen? Was macht frau mit Ampelrot?!? …. Ayayayayay….\nWas Süßes ist das, wow – eigentlich zu schade zum Vernichten. Aber erst recht zu schade zum alt werden lassen. Wenn du wieder im Vollbesitz deiner olfaktorischen Kapazitäten bist ist das doch genau das richtige zu einer Tasse feinstem Genmaicha, evtl. noch mit Reiswaffeln zur Neutralisation und einer Schokolade-Honigmaske im Gesicht. Wobei – die könnte den edlen Spender verschrecken, ohne geht auch 😉\nDa bin ich erst genauso reingefallen, Petra – das war genau mein Gedankengang, hihi…\nOch, der ist durch keine Maske mehr zu verschrecken, der hat von Torfmasken bis zu grüne Erdemasken und Tuchmasken schon alles erlebt 😉\nHihi 😉 Mir sind die Verlinkungen auch immer entgangen. Wie auch immer, jetzt ist mir aber natürlich kalr, warum dir der Wurstsack sofort ein Begriff war 😉\n@Petra: Den Wurstsack kenne ich allerdings von der Biofach – aber andere Food/Wineblogger natürlich durch Matze.\nAgata sagt am 12. Januar 2015\nPetrina sagt am 12. Januar 2015\nWie entzückend 😉 … lass dir die Bonbon schmecken und gute Besserung!\nHahaha, ich dachte auf den ersten Blick auch, dass das jetzt die neueste Lidschatten-Generation ist. 😀 Solche Schmuckstücke! Lass sie dir gut schmecken, die Sorten klingen ja sehr verlockend. 🙂\nBesonders freue ich mich auf Yuzu 🙂\nHaha, mir gings wie Petra- ich hab schon gedacht, du wirst den Taupe Tönen untreu …;()\nDie Pralinés sind ja echte Schmuckstücke !!! Mit Konfekt kannst du mich immer locken.\nPralinen und Naturkosmetik passen ja irgendwie INCI mässig auch zusammen, oder ?!\nHihi, genau, ich werde den Taupe-Tönen untreu und lasse es dann gleich mal richtig krachen 😉\nNo jo, zum gölsche Garnewall hätt’s ja gepasst 😉\nDas Orange ist dem von Haut nicht unähnlich, ein schöner satter Hokkaido-Ton 😀\nSag mal Julie, ist dieser Chezmatze womöglich dein Langzeitlebensabschnittsgefährte (neuhochdeutsch für “ mein Freund“) ?\nDas würde jedenfalls gut passen….\nJa, klar 🙂 !\nHab ich’s mir doch gedacht. Der holde Gefährte schreibt ja ebenso betörend wie du…\nDa haben sich ja die richtigen gefunden !!!\n@Ranunkel: Na, das werde ich ihm mal ausrichten, sowohl dass er hold ist, als auch dass er betörend schreibt 😉\nUnd der Holde Gefährte schreibt über Wein! Habe ich das verpasst oder hast du ihn jetzt hier klammheimlich eingeführt? 😉\nSehr sehr charmant und liebendwürdig schaut er drein auf einem Foto seines Blogs und er ist ja auch so fleißig wie du mit dem Posten, wow!\nDa muss ich gleich mal in seine Weintipps schauen, denn seit ich Cocktails nicht mehr vertrage (bzw. einfach zu viel Alk) und an Bier geschmacklich nicht mehr rankomme bin ich, wenn schon alkoholisch und mit Genuss, dann doch bei Wein hängen geblieben. Wein und sehr dunkle Schoki sind momentan meine liebsten Abendbegleiter, jedenfalls von den kulinarischen.\nDanke für den schönen Tipp auch an Ranunkel. Hättest du nicht gefragt hätte ich nicht auf Chez Matze geklickt. Cooler Name übrigens!\n@Ellalei: Das hast Du verpasst 😉 bzw. kommt drauf an, wie lange Du schon mitliest 🙂 – ich hatte ihn schon öfter bei einigen Reisen verlinkt.\nOh, dann hatte ich wohl einfach nicht auf den Link geklickt, aber besser jetzt als nie. Ich finde es so toll, das ihr auf Reisen beide eure Ziele habt und auf die Pirsch geht. Dann kann ich künftige Reisen nun aus zwei Perspektiven nachlesen, wie schön!\nNun hab ich ihn auch entdeckt – schaut sehr nett aus dein Matze!\nNK, Wein und Kulinarisches passt doch super zusammen 🙂\nSehr, sehr, sehr sympathisch aussehend, dein Matzl-Schatzl!\nIhr gebt ein tolles Paar ab! Und dann diese 2 Blogs dazu…toll!\nIch häng schon länger bei Matze in Hongkong…. grad beim\nGurken-Quallen-Salat mit Sesam 😉\nSehr geniale Idee und très chique 🙂\nDir gute Besserung, Julie!\nDanke! Die Idee finde ich auch umwerfend, ob da vorher noch keiner drauf gekommen ist? Man kann die einzelnen Farben auch einfach so ohne Box nach „Verbrauch“ nachkaufen, gibt insgesamt 17 verschiedene Nuancen.\nSchade, dass es sich nicht um nachwachsende Rohstoffe handelt 😉\nAndrea sagt am 12. Januar 2015\nhier grassiert auch der Grippevirus. Meinen Sohn hat es erwischt, aber richtig heftig.\nDie Schwiegertochter kümmert sich gut und die Mama muss Muttergefühle hintenanstellen 🙂\nIch würde das Produkt nie essen, das sieht so toll aus !\nBei Dir lernt man immer noch dazu .\nIch kenne auch einige, die gerade flach liegen – aber ich glaube, ich habe mir den Virus aus Paris mitgebracht, tolles Andenken 😉 .\nBirgit sagt am 12. Januar 2015\nDiese Palette hätte ich mir auch sofort gekauft, lecker, lecker, lecker.\nDir gute Besserung und eine ruhige Woche.\nDanke! Die Palette gibt es dort übrigens in verschiedenen Größen, gab auch eine Dreier-Palette, die sah auch sehr hübsch aus.\nAorta sagt am 12. Januar 2015\nSadaharu Aoki ist wohl eine Pariser Institution für Naschkatzen, habe schon viel davon gehört. Ich war leider noch nicht in Paris, aber der Laden steht auf jeden Fall auf meiner Liste, sofern ich mal die Hauptstadt besuchen sollte.\nWas Pâtisserie betrifft, bin ich aber auch hier vor Ort sehr gesegnet: Für Wiesbaden-Besucher quasi Pflicht (pardon: Kür) ist das „L’art sucré“. Für Schokoladen-Fans selbstredend ein Muss ist das Xocoatl – beide Läden haben im Übrigen auch sehr freundliche Besitzer, mit denen ich immer wieder gerne schnacke.\nKäse und Wein kaufe ich gerne bei „Trüffel“, einem sehr schönen Feinkost-Laden.\nHey, eine Wiesbadenerin. Halli- Hallo !! Komme auch aus der hessischen Hauptstadt !\nDie Geschäfte, die du genannt hast, frequentiere ich auch öfters!!\nAorta sagt am 15. Januar 2015\nRanunkel, dann müssten wir uns eigentlich mal kennen lernen, sofern Du Lust hättest. 🙂\nJa, Sadaharu Aoki ist defintiv bekannt in der Pariser Gourmet-Szene, oder wie man das nennen mag. Und Wiesbaden scheint ja ein gutes Pflaster für Feinschmecker zu sein 🙂\nNaja, es geht so. Kann jetzt mit Großstädten wie Frankfurt, Berlin, Paris, etc. in puncto Vielfalt nicht ganz mithalten.\nIch wohne nicht direkt in Wiesbaden aber ich arbeite dort und bin auch dort geboren und aufgewachsen. Meine Heimat ist nun der vordere Rheingau und da gibts halt vor allem Wein, Spundekäs und gutbürgerliche Küche. Auch lecker, wir haben hier sogar einen total authentischen Japaner in einer ehemaligen Weinkneipe. Soll heißen: Inneneinrichtung urig rheinisch, Essen urig japanisch.\nJulia sagt am 12. Januar 2015\nOh man. Ich habs zuerst für nen Farbkasten gehalten 😀\nFarbkasten hätte auch gut gepasst bei der Farbauswahl 🙂\nNur mal kurz gucken sagt am 12. Januar 2015\nHaha, im ersten Moment dachte ich „Öhm ja, wandert sie nun auf neuen Beauty-Pfaden?!“ :-O Dieses hübsche Palettchen könnte ich als Schokojunkie nicht verspeisen 😉 Gute Besserung!!!\nHihi, sind ja eine Art neue (schokoladige) Beauty-Pfade 😉 . Und ich werde heute Abend eine Farbnuance davon verspeisen!\nmoiren atropos sagt am 12. Januar 2015\nEine schön gemachte Idee und auf den ersten Blick habe ich gar nicht an Schokolade gedacht. Ich hoffe es schmeckt genauso gut wie es aussieht.\nDa bin ich mir bei Sadaharu Aoki ganz sicher 🙂 Seine anderen Sachen, die ich in Paris schon gegessen habe, sind köstlich.\nAaaaaaaaahhhh!!!! Bei französischen bonbons de chocolat verliere ich sofort den Verstand und sowieso jegliche Vernunft – während meiner Zeit in Paris habe ich für eine Studentin wirklich beschämende Summen dafür ausgegeben. Unfassbar, wieviele tolle Chocolatiers es bei unseren Nachbarn gibt 😀\nGute Besserung, liebe Julie! Also wenn dich der Anblick dieser Box nicht schnell wieder auf die Beine bringt, dann weiß ich auch nicht! 😉\nJa, die Anzahl der hervorragenden Chocolatiers in Paris (und überhaupt in Frankreich) ist der Knaller. Denke ich mir jedes Mal, selbst in Kleinstädten in der Provinz.\nVera sagt am 13. Januar 2015\ndie sieht ja super aus, Deine Schoki, mir wäre sie auch fast zu schade zum Essen.\nEin Kompliment an die „Designer“. die sich sowas ausdenken und umsetzen. Ich kann kaum glauben, dass das wirklich Schokolade ist……\nWie Sadaharu Aoki auf die Idee gekommen ist, das würde mich auch interessieren…\nStefanie sagt am 17. Januar 2015\ndas sind ja krasse Farben 🙂


Wachstum und Glück | Psychosynthese Therapie und Training\n"Diejenigen aber, die den Bewegungen der eigenen Seele nicht aufmerksam folgen, müssen notwendig unglücklich sein."(Marc Aurel - Wege zu sich selbst.)\nDie Scheu vor Psychologie und Therapeuten ist weit verbreitet. Wer will sich schon gerne in der Seele "herumstochern" lassen? Lediglich im Sport und Businessbereich ist der "Mental-Trainer" oder der "Coach" von der Gesellschaft angenommen worden.\nAuf körperliche Fitness und Wohlbefinden wird allgemein großen Wert gelegt. Wellness und Yoga und eine Reihe von Ernährungs - Philosophien haben großen Zulauf. Doch Lebensqualität und das Empfinden von Glück hängen nicht allein von Fitness und Schönheit ab.\nDie Glücksforscher haben uns gezeigt, daß Glück und Zufriedenheit vor allem mit einem Erleben von persönlichem Wachstum einhergeht.\nDer Begleiter unterstützt Sie darin deutlich zu erkennen welche Potentiale gerade jetzt verwirklicht werden wollen, welche Schwelle gerade jetzt überschritten werden will, welche Gefühle ausgedrückt werden müssten, welche tieferen Bedürfnisse beachtet werden wollen, und was Sie möglicherweise daran hindert das zu tun. So findet sich in meiner Klientel eine grosse Anzahl von Menschen, die "mitten im Leben" stehen, erfolgreich sind und gelernt haben, daß ein beständiger Dialog mit der Innenwelt in allen Belangen des Lebens fruchtbar wird. Man muss nicht erst in eine tiefe Lebenskrise geraten sein um einen Psychosynthese - Begleiter aufzusuchen.\nUnterwegs sein, Stagnation erkennen und nicht darin steckenbleiben, sondern Ausschau halten nach den Entwicklungsabsichten der Seele. Ein Psychotraining das einen Zuwachs an Energie, Lebendigkeit ,Kreativität und Authentizität ins Leben bringt.\nNebenbei bemerkt, ist es Authentizität die uns für andere attraktiv macht.\nIn der Praxis lässt sich beobachten wie deutlich sich diese Art der "Seelenpflege" auf den Organismus auswirkt, was von einer Besserung bis zum Verschwinden psychosomatischer Symptome reicht und ganz allgemein seelisch wie körperlich erfrischt.


Das Yin und Yang des Fortschritts | Global\nCrop Science ist auf den Gebieten Saatgut, Pflanzenschutz und Schädlingsbekämpfung außerhalb der Landwirtschaft tätig.\nOrganigramm (PDF, 401 KB)\nDas Yin und Yang des Fortschritts\n2020 ist ein Jahr mit verheerenden Konsequenzen: Mehr als eine Million Menschen weltweit sind an den Folgen von COVID-19 gestorben. Millionen Jobs sind verloren. In vielen Ländern steht das soziale Leben still. Immerhin: Die Disziplin, Flexibilität und Solidarität, mit der viele Menschen, Unternehmen und gesellschaftliche Gruppen der Pandemie begegnen, ist bemerkenswert. Dies hat dazu geführt, dass etwa durch das Tragen von Masken und die Einhaltung von sozialer Distanz die Fallzahlen zurückgegangen sind. Besiegt ist das Virus damit aber nicht.\nDass es die Hoffnung gibt, COVID-19 ultimativ zu überwinden, verdanken wir der unermüdlichen Arbeit von Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern, die in einer nie dagewesenen Intensität an einem Impfstoff forschen. Wir dürfen heute annehmen, dass diese Arbeit erfolgreich sein wird – und das schneller, als selbst die größten Optimisten zu hoffen wagten. Zwei der globalen Hoffnungsträger sind die Vakzine der deutschen Biotech-Unternehmen Biontech und Curevac.\nDie Leistungen der Forscher sind nicht hoch genug einzuschätzen und wohl selten hat buchstäblich die gesamte Welt so gebannt auf die Ergebnisse von Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern geschaut und gebaut. Eine zentrale Bedingung für den Erfolg ist natürlich die Finanzierung. Deshalb wären die Impfstoffe, an denen nun so viele Hoffnungen hängen, undenkbar ohne die Kapitalgeber hinter den Unternehmen: Dietmar Hopp bei Curevac, Andreas und Thomas Strüngmann bei Biontech.\nEin Glücksfall für die Branche – und weit darüber hinaus\nDie drei Investoren eint eine eigene Zeit als Unternehmer: Die Gebrüder Strüngmann machten Hexal zum zweitgrößten Generikahersteller Deutschlands, Dietmar Hopp zählte zu den Gründervätern von SAP. Diese Leistungen alleine hätten schon gereicht, um als Hoffnungsträger gewürdigt zu werden – gerade in Deutschland, wo wir solche Geschichten viel zu selten erleben.\nDoch Dietmar Hopp und die Strüngmanns haben weitergedacht. Seit vielen Jahren engagieren sie sich erfolgreich als Mäzene, Stifter und Risikokapitalgeber – und zählen dabei zu den wenigen in diesem Land, die es wagen, erhebliche Summen in Biotechnologie zu investieren. Es ist ein Glücksfall für die Branche – und wie wir heute wissen: weit darüber hinaus.\nUnternehmen und Förderer, die in die Forschung und Entwicklung von Wirkstoffen investieren, dürfen nie ausschließlich betriebswirtschaftlich denken. Man muss auch bereit sein, sich mit der Technologie auseinanderzusetzen. Die Gebrüder Strüngmann bringen beides mit: Andreas hat Medizin studiert, Thomas BWL. So verkörpern sie gemeinsam die Erkenntnis, dass es stets beides braucht: Wissenschaft und Wirtschaft, Idee und Finanzierung – das Yin und Yang des Fortschritts.\nVermutlich werden wir gerade Zeitzeugen einer dieser Durchbruch-Momente, bei dem die Wissenschaft die Tür zu einer neuen Welt aufstößt. Dabei geht es um mehr als COVID-19. Denn beide Impfstoffe, von Biontech wie von Curevac, funktionieren nach dem neuartigen Wirkprinzip der Boten-RNA. Dahinter verbirgt sich eine Bauanleitung für den Körper, um ein Virusprotein herzustellen, das den Aufbau des erwünschten Immunschutzes auslöst. Die Impfstoffe gegen das Coronavirus beweisen zum ersten Mal, dass diese Technologie funktioniert. Sie könnte künftig gegen viele Krankheiten eingesetzt werden. Biontech arbeitet vor allem an Krebstherapien.\nEs gibt noch viele offene Fragen zu dieser Technologie genauso wie zum Impfstoff gegen COVID-19. Dennoch sollten wir den bisherigen Etappensieg dieses Jahres würdigen und daraus die richtigen Schlüsse ziehen:\n1. Das Potenzial der Bio-Revolution\nIn den Laboren weltweit sehen wir wissenschaftliche Erfolge, die früher undenkbar schienen. Fortschritte in der Biologie, der Zell- und Gentherapie und der künstlichen Intelligenz – Experten nennen es „Bio-Revolution“ – haben das Potenzial, Wirtschaft und Gesellschaft zu verändern und zur Bewältigung globaler Herausforderungen von Pandemien bis zum Klimawandel beizutragen. Tatsächlich ist der wissenschaftliche Kampf gegen COVID-19 – insbesondere die Geschwindigkeit, mit der das Genom des Virus sequenziert wurde – eng mit diesen Technologien verbunden. Biontech-Chef Ugur Sahin selbst sprach nach den positiven Phase III-Daten von einem „Sieg für die Innovation, Wissenschaft und weltweite Zusammenarbeit“.\n2. Die Bedeutung von Gesundheit\nWohl selten zuvor ist der Stellenwert von Gesundheit so in unser individuelles wie kollektives Bewusstsein gerückt wie im Jahr 2020. Wir bekamen drastisch vor Augen geführt, dass es die Voraussetzung für eigentlich alles darstellt, was wir als selbstverständlich empfinden, etwa Freunde zu treffen oder in den Urlaub zu fahren. In der Erfahrung der Pandemie und der wissenschaftlichen Erfolge, diese zu bekämpfen, steckt nun die Chance für eine neue Perspektive. Früher haben wir Innovationen im Gesundheitswesen häufig auf die Kosten reduziert. Mit dem Blick von heute sollten wir sie auch als Investitionen in Lebensqualität und Wohlstand begreifen.\n3. Der Weckruf für Europa\nMeine Hoffnung ist, dass der Erfolg von Biontech und Curevac, zu dem 2020 auch staatliche Förderung beigetragen hat, unser Bewusstsein in Deutschland und Europa verändert. Bislang mangelt es oft am Verständnis für Biotechnologie und einem konsistenten politischen Rahmen, um Innovationen zu fördern. „Man kann sich nur wundern“, sagte Andreas Strüngmann einmal, „dass Deutschland relativ zur Wirtschaftsleistung so wenig in neue Technologien investiert. Ausgerechnet Biotechnologie als eine der bedeutendsten Zukunftsindustrien ist ganz weit abgeschlagen.“\n2019 flossen in Deutschland 860 Millionen Euro Eigenkapital in die Biotech-Branche – in den USA waren es fast 50-mal so viel. Wenn deutsche Biotech-Firmen an die Börse gehen, geschieht das oft nicht hier. Sowohl Curevac als auch Biontech haben sich für die Nasdaq entschieden. So stolz wir darauf sein können, dass zwei deutsche Firmen im globalen Rennen um den Impfstoff vorne dabei sind, so sicher ist wohl die Erkenntnis, dass sie ohne Dietmar Hopp und die Gebrüder Strüngmann in Deutschland keine Chance gehabt hätten.\nWenn wir ehrlich sind, passt das ins Bild. Erst vor wenigen Tagen hat die Französin Emmanuelle Charpentier den Chemie-Nobelpreis für die Gen-Schere CRISPR/Cas erhalten. Die Grundlagen dieser Technologie erforschte sie einst in ihrem Heimatland. Die unternehmerischen Anwendungen finden sich heute vor allem an der US-Ostküste. Europa muss aufpassen, dass es nicht zu einem Technik-Museum verkommt, während andere für die Wertschöpfung sorgen.\nLaut Immanuel Kant benötigen wir drei Dinge, um die Mühseligkeiten des Lebens zu ertragen: die Hoffnung, den Schlaf und das Lachen. Zum Ende eines Jahres, in dem es wenig zu lachen gab und COVID-19 vermutlich viele um den Schlaf brachte, gibt es die begründete Hoffnung, dass zumindest perspektivisch wieder ein normales Leben möglich ist. Wir sollten nicht vergessen, wem wir diese Hoffnung verdanken: den unermüdlichen Forscherinnen und Forschern – und den Investoren, die an sie glauben.\nVorstandsvorsitzender von Bayer\nLetzte Aktualisierung: Montag, 11. Januar 2021


VG Trier: Erfolglose Klage auf Umbettung einer Urne | Religion – Weltanschauung – Recht [ RWR ]\nDie 7. Kammer des VG Trier hat die Klage eines Bürgers der Verbandsgemeinde Konz auf Umbettung der Urne seiner verstorbenen Ehefrau von Konz nach Tawern abgewiesen.\nDiese wurde im Juli 2019 zeitgleich mit ihrer kurz zuvor verstorbenen Mutter im Bestattungswald der Stadt Konz, dem „Waldfrieden Konz“, bestattet. Die betreffende Friedhofssatzung sieht u.a. vor, dass Um- und Ausbettungen unzulässig seien.\nDer Kläger, welcher an einem chronischen Rückenleiden erkrankt ist, hatte die Grabstätte vor der Bestattung nicht selbst vor Ort in Augenschein genommen, sondern seinen ehemaligen Arbeitgeber mit deren Auswahl betraut. Ende August 2019 beantragte er sodann bei der Verbandsgemeindeverwaltung Konz die Umbettung der Urne seiner verstorbenen Ehefrau auf den Friedhof in Tawern. Die letzten Besuche der Grabstätte hätten ihm deutlich vor Augen geführt, dass ihm ein Besuch des Grabes im „Waldfrieden Konz“ körperlich nicht mehr möglich sei. Die Grabstelle sei nur über einen hangabwärts gelegenen, steilen und unbefestigten Pfad zu erreichen und ihm nur unter großen Schmerzen möglich, da er wegen seines Rückenleidens körperlich stark eingeschränkt sei.\nDie Verbandsgemeindeverwaltung Konz lehnte den Antrag unter Berufung auf die entgegenstehende Satzungsregelung der Stadt Konz ab. Hiergegen hat der Kläger nach erfolgloser Durchführung eines Widerspruchverfahrens die vorliegende Klage gegen die Stadt Konz erhoben.\nDiese wurde nunmehr abgewiesen, da er keinen Anspruch auf Zustimmung der Stadt Konz zu der begehrten Umbettung habe. Hierbei könne offenbleiben, ob ein solcher Anspruch bereits durch § 9 Abs. 2 der Friedhofssatzung ausgeschlossen werde oder ob diese Regelung infolge des vollständigen Ausschlusses des grundrechtlich geschützten Totenfürsorgerechts, welches in Ausnahmefällen auch zu Umbettungen berechtigt, unwirksam sei. Selbst wenn Letzteres der Fall sei, lägen die Voraussetzungen für die Zustimmung zur Umbettung nicht vor, da es an einem wichtigen Grund, der von seinem Gewicht höher zu bewerten sei als die Achtung vor der Totenruhe, fehle. Ein solches Überwiegen sei nur gegeben, wenn zwingende, ganz persönliche Gründe für die Umbettung vorlägen, die auf einer atypischen, unerwarteten Entwicklung der Lebensumstände beruhen würden. Dies sei hier nicht der Fall. Vielmehr habe der Kläger bei der Auswahl der Grabstätte berücksichtigen können und müssen, dass er bereits seit ca. zehn Jahren an einem chronischen Rückenleiden erkrankt sei. Hierbei könne er sich auch nicht darauf berufen, dass der von ihm beauftragte ehemalige Arbeitgeber seinen Gesundheitszustand nicht bedacht habe, sondern müsse sich dessen Versäumnis zurechnen lassen. Überdies habe er es bei der Beauftragung selbst versäumt, dafür Sorge zu tragen, dass die Auswahl an seinen gesundheitlichen Einschränkungen orientiert werde. Auch wenn es sich für den Kläger in der Zeit nach dem Tod seiner Ehefrau um eine äußerst belastende psychische Ausnahmesituation gehandelt haben dürfe, sei schließlich nicht feststellbar, dass dies eine wohlüberlegte Entscheidung über den Bestattungsort unmöglich gemacht hätte. Im Übrigen gehe das Gericht im Hinblick auf die Beschaffenheit des Weges davon aus, dass es dem Kläger (gegebenenfalls unter Zuhilfenahme von Gehstützen, eines Rollators oder der Stütze durch eine Hilfsperson) trotz seiner gesundheitlichen Beschwerden möglich und zumutbar sei, die Grabstätte zu erreichen. Nach den dem Gericht vorliegenden Lichtbildern verteile sich die Steigung im Wesentlichen moderat über die gesamte Wegstrecke. Ferner berge der durch Hackschnitzel befestigte Weg keine besonderen Stolpergefahren.\nGegen die Entscheidungen können die Beteiligten innerhalb eines Monats die Zulassung der Berufung bei dem OVG Rheinland-Pfalz beantragen. (VG Trier, Urt. v. 15.07.2020 – 7 K 1042/20.TR)\nPressemitteilung des VG Trier Nr. 28 v. 22.07.2020\nVeröffentlicht in Aktuell, Rechtsprechung, Rheinland-Pfalz, VG Trier. Schlagwörter: Grab, Totenfürsorge, Totenruhe, Umbettung, Urne, Waldfrieden Konz. Kommentare deaktiviert für VG Trier: Erfolglose Klage auf Umbettung einer Urne\n« Bundestag: Zusammenarbeit mit dem Zentralrat der Muslime in Deutschland (ZMD)\nBundestag: Linke fragt nach Militärseelsorge »


Bester Samsung Fernseher 55 Zoll Bis 1000 Euro - IoCap\nDie besten 55-Zoll-Fernseher von Samsung unter 1000 € gehören zu den besten 4K-Fernsehern, die Sie bekommen können. Das liegt daran, dass 1.000 € der Sweet Spot für Fernseher sind, der Punkt, an dem die Flaggschiff-TV-Funktionen in den mittleren Bereich rieseln: Wenn Sie eine spektakuläre Bildqualität in einem 55-Zoll-Fernseher wünschen, finden Sie hier beides.\nDer große Unterschied zwischen den besten Fernsehern unter 1000 Euro und ihren teureren Geschwistern ist meist das Panel. Über 1000 € leben die allergrößten Fernseher und fast alle OLED-Fernseher. Aber Technologien wie Quantum Dot LED bedeuten, dass LED-Fernseher jetzt der Qualität von OLED ohne die Kosten sehr, sehr nahe kommen. Und sie verwenden oft dieselbe Smart-TV-Software wie ihre teureren Stallgefährten.\nWenn Sie sich unseren Leitfaden zu den besten Fernsehgeräten ansehen, werden Sie sehen, was wir meinen: Während die allerbesten Fernseher möglicherweise bessere Panels haben, tun die besten OLED-Fernseher und die besten 8K-Fernseher Dinge, die Sie im Sub einfach nicht bekommen können € 1000-Markt, wenn es um Bildqualität und Ausstattung geht, sind die Unterschiede nicht so dramatisch.\nDie Hardware ist natürlich der Schlüssel, aber wir haben auch die Software berücksichtigt, Ein gutes TV-Betriebssystem macht Ihren Fernseher nicht nur benutzerfreundlicher. Es kann oft auch Streaming-Optionen und Kompatibilität mit Ihrem anderen Kit eröffnen. Einige Fernseher unterstützen beispielsweise das Streamen von Videos von Ihrem Telefon sowie von Netflix.\nWir haben gute Nachrichten für Gamer: Die HDMI 2.1-Unterstützung hält jetzt Einzug in diesen Teil des Marktes und ist viel verbreiteter als noch vor ein paar Monaten. Das bedeutet, dass einige der besten Gaming-Fernseher es in diesen besten TV-Leitfaden geschafft haben, was praktisch ist, wenn Sie das Beste aus Ihren Spielekonsolen der nächsten Generation herausholen möchten.\nIst die Größe wichtig? Wir denken, dass die 55-Zoll-Fernseher zu diesem Preis die besten Käufe sind. Sie können für das gleiche Geld größer werden, aber es gibt einen leichten Einbruch in der Bildqualität, wenn Sie sich die besten 65-Zoll- und 75-Zoll-Fernseher ansehen. Sofern Sie diese zusätzlichen Zoll nicht wirklich benötigen, werden Sie wahrscheinlich feststellen, dass 55-Zoll-Modelle die beste Balance zwischen Größe und Bildschirmqualität bieten.\nWenn Sie lieber nicht bis zu 1000 € ausgeben möchten, machen Sie sich keine Sorgen: Wir haben einen Leitfaden zu den besten Fernsehern unter 500 €, von denen einige weit über ihrem Preisschild liegen. Und wenn Sie einen der hier empfohlenen Fernseher wollen, sich aber nicht ganz ausstrecken können, behalten Sie die besten TV-Angebote im Auge. Dies ist jetzt ein unglaublich wettbewerbsintensiver Markt, und das bedeutet, dass bei Fernsehern oft große Schnäppchen zu finden sind, die sonst möglicherweise nicht erschwinglich wären.\nSamsung Q80A 55 Zoll\nSamsung QN85A 55 Zoll\nDieses gut ausgestattete 55-Zoll-Gerät von Samsung hat seit seiner Einführung einige beeindruckende Preissenkungen erfahren und ist zum Zeitpunkt des Schreibens das insgesamt beste Preis-Leistungs-Verhältnis, da Bildqualität und Funktionen in Einklang gebracht werden. Und ein nettes Kleingeld bekommen Sie von unserem Preislimit. Es gibt unten Fernseher, die es in bestimmten Bereichen schlagen, aber als Gesamtpaket ist dies ein so gutes Preis-Leistungs-Verhältnis.\nEs ist ein QLED-Fernseher mit direkter Hintergrundbeleuchtung und lokalem Dimmen, was bedeutet, dass er sowohl beeindruckend hell als auch wirklich farbenfroh ist. Es kann heller werden als jeder OLED-Fernseher, der auch nur annähernd günstig ist, was ideal für das Fernsehen in helleren Räumen ist. Dank des kräftigen Bildschirms erhalten Sie so viel Blendung und Realismus – aber er kann auch schwarze Bereiche tief und satt dunkel erscheinen lassen. OLED-Fernseher sind immer noch der König der Nuancen in dunklen Bereichen, aber dieser Fernseher macht sich immer noch hervorragend.\nDie Bildverarbeitung ist ebenfalls fantastisch – der Quantum Processor 4K von Samsung ist so fortschrittlich wie alles andere in einem 4K-Fernseher und skaliert Bilder so hoch, dass sie auf 4K hervorragend aussehen, während Bewegungen natürlich aussehen.\nUnd der Ton wird von einer Reihe von Lautsprechern am Rand bereitgestellt, wobei der Fernseher das Bild analysiert und Töne in die richtige Richtung positioniert, um echte dynamische Action hinzuzufügen.\nSie haben das Tizen-System von Samsung, um Smart-TV-Funktionen bereitzustellen, was bedeutet, dass es mit nützlichen Streaming-Apps und -Diensten vollgepackt ist und wirklich einfach zu navigieren und herauszufinden ist.\nUnd Sie erhalten HDMI 2.1-Konnektivität an einem der HDMI-Anschlüsse, was bedeutet, dass 4K-120-Hz-Spiele und VRR für Konsolen der nächsten Generation unterstützt werden. Die Game Bar von Samsung macht es auch einfach, Ihr Gaming-Setup zu optimieren – dies ist derzeit einer der besten Fernseher für Spiele.\nBeachten Sie, dass die 50-Zoll-Version davon keinen so hellen Bildschirm oder fortgeschrittene Lautsprecher hat, weshalb wir die 55-Zoll-Version mögen. Beachten Sie auch, dass die 65-Zoll-Version unsere Preisgrenze gerade so durchbricht, also sollten Sie in Betracht ziehen, sich darauf auszudehnen, wenn Sie Ambitionen auf große Bildschirme im Sinn haben.\nSamsungs Einstiegs-QLED von 2021 schiebt einen echten Sweet Spot in Samsungs umfangreichem Angebot an 4K-Fernsehern voran. Bilder aus 4K-Quellen sind herausragend: lebendige und dennoch natürliche Farben, starke Kontraste, üppige Detailstufen und fließende Bewegungen. Die Hochskalierung von niedrigeren Auflösungen wird ebenfalls mit extrem niedrigem Bildrauschen und einer feinen Farbbalance erreicht.\nFügen Sie ein Tizen-basiertes Betriebssystem / eine Benutzeroberfläche hinzu, die mit den Besten der Welt mithalten kann – reaktionsschnell, logisch und nicht zu aufdringlich – sowie eine unglaublich schnelle Reaktionszeit von unter 10 ms im „Game“-Modus und dem Q60A beginnt überzeugend auszusehen. Dann gibt es die übliche Samsung-Qualität in Verarbeitung und Verarbeitung – nichts an der Art und Weise, wie sich dieser Fernseher präsentiert, deutet darauf hin, dass er gebaut wurde, um einen niedrigeren Preis zu erzielen.\nBetrachten Sie alles, was der Q60T brillant macht, und Sie werden leicht seine Mängel übersehen, zumal es nicht viele davon gibt: Der Sound, den dieses Samsung macht, wird den Bildern, die es liefert, in keiner Weise gerecht, wie alle Samsung-Fernseher es kommt ohne Dolby Vision aus, und obwohl es in Bezug auf seine schnellen Reaktionszeiten großartig für Spiele ist, unterstützt es nicht die neuen Funktionen 4K/120 fps und Variable Refresh Rate der PlayStation 5 oder Xbox Series X. Wenn Sie kein Next sind -Gen-Gaming-Nuss und freuen sich, es mit einer Soundbar aufzupeppen, das sind überhaupt keine Mängel.\nDas Samsung Q70A gleicht die hellen Bilder, für die QLED bekannt ist, mit High-End-Funktionen zu einem erschwinglichen Preis aus. Der Q70A liefert eine hohe Spitzenhelligkeit in HDR, was bedeutet, dass Sie satte Farben sowie ausdrucksstarke Bilder erhalten, die helles Sonnenlicht durchdringen, sodass er immer großartig aussieht, egal wann Sie ihn ansehen. Es verwendet den Quantum-Prozessor von Samsung, was bedeutet, dass Sie kristallklare 4K-Bilder erhalten, und das Hochskalieren von HD auf 4K ist wirklich beeindruckend. Es ist derselbe Chip, der in den High-End-4K-Geräten von Samsung verwendet wird.\nSie haben auch einen HDMI 2.1-Anschluss für 4K 120 Hz und VRR-Unterstützung von Konsolen der nächsten Generation und die Smart-TV-Plattform von Samsung, die eine der besten ist, wenn es um Benutzerfreundlichkeit und umfassende Streaming-App-Optionen geht.\nDer Kompromiss für den Preis besteht darin, dass es über eine kantenbeleuchtete LED-Hintergrundbeleuchtung verfügt, anstatt über eine direkte Beleuchtung wie beim Samsung Q80A. Das bedeutet, dass dunkle Szenen nicht ganz so tief und nuanciert sind – Schwarze können grauer wirken. Aber es bietet immer noch ein hervorragendes Preis-Leistungs-Verhältnis, insbesondere bei dieser großzügigen Bildschirmgröße.\nKann das Samsung QN85A die gleiche Mini-LED-Magie zu einem günstigeren Preis bringen? Ja, das kann es – tatsächlich ist es der Fernseher in dieser Preisklasse, den ich wählen würde, sogar gegenüber einigen der besten OLED-Fernseher. Es liefert unglaublich helle Bilder, die auch nuanciert und subtil sind, während die Mini-LED-Technologie eine präzisere Dimmung der Hintergrundbeleuchtung für einen besseren Kontrast bietet als andere LED-Fernseher zu diesem Preis.\nDer Preis ist gesunken und es kommt in diese Kategorie und das Samsung QN85A ist gut spezifiziert (HDR10+, HDMI 2.1-Kompatibilität und die vorbildliche Tizen-Smart-TV-Schnittstelle gehören zu den Highlights) und gut aussehend (insbesondere bei der Gehäusetiefe von nur 27 mm). ist besorgt). Wir haben einige kleine Bedenken, aber insgesamt verblassen sie im Vergleich zu dem visuellen Knall für das Geld, das Sie hier bekommen.\nAuch bei dieser Anordnung gibt es definitiv beeindruckende Helligkeitswerte – der Spitzenwert des 55-Zoll-QN85A von 1.500 Nits wird den Neid jeder einzelnen OLED-Alternative zu vergleichbaren Preisen hervorrufen, da sie nur etwa die Hälfte davon erreichen.\nDas QN85A verwendet ein IPS-Panel, das Ihr klassisches zweischneidiges Schwert ist. Auf der positiven Seite sollte es für schöne weite Betrachtungswinkel sorgen, aber IPS-Panels neigen auch dazu, ziemlich zu spiegeln.\nDas QN85A hat Dualband-WLAN und Bluetooth 5.2-Empfang an Bord. Die physischen Eingänge erstrecken sich auf vier HDMI-Buchsen, von denen eine alle HDMI 2.1-Funktionen enthält, die für ein vollständiges Spielkonsolenerlebnis der nächsten Generation unerlässlich sind, und eine andere mit eARC-Kompatibilität, zwei USB-Eingängen, einer Ethernet-Buchse und Antennenpfosten für ein paar On-Board-TV-Tuner.\nWie der Name schon sagt, wurde dieser Samsung-Fernseher so gestaltet, dass er einem Rahmen ähnelt. Während es also noch auf einem Ständer stehen kann, ist es das ideale Szenario, diesen Fernseher wie einen Rahmen an eine Wand zu hängen, aber so, dass er auch als Fernseher nützlich sein kann. Beeindruckende Smart-Features und ein umwerfendes Design machen das Angebot an Lifestyle-Fernsehern sehr überzeugend. Samsung The Frame ist da nicht anders, es ist ein 4K-Fernseher, der in verschiedenen Größen erhältlich ist und sich gut in die Einrichtung jedes modernen Zuhauses einfügt.\nDer Frame verfügt außerdem über einige einzigartige und interessante Funktionen. Zunächst einmal kann dies als eine Art PC dienen, wenn Sie sich bei Ihrem Windows-Konto auf dem Fernseher anmelden und mit der Verwendung von MS Word, Excel und anderen ähnlichen Produkten beginnen – Sie benötigen jedoch eine Bluetooth-Tastatur. In unserer Arbeit von zu Hause aus ist dies ein guter Weg, um sicherzustellen, dass es keine Pause vom Büro gibt.\nDie andere Funktion, die ich wirklich mag, ist, wie der Fernseher zum Leben erwacht, wenn jemand den Raum betritt. Diese Bewegungserkennungsfunktion bedeutet, dass es Strom sparen kann, indem es in den Standby-Modus wechselt, wenn niemand die Kunst auf dem Bildschirm bewundert.\nUm zusammenzufassen, was ich gefunden habe – dies ist einer der besten 55-Zoll-Fernseher, die Sie kaufen können.


Molekularbiologie I. PCR Klonierung Transformation Southern Blot Hybridisierung BIOCHEMISCHES ANFÄNGERPRAKTIKUM FÜR CHEMIKER UND BIOLOGEN V 2. - PDF\nDownload "Molekularbiologie I. PCR Klonierung Transformation Southern Blot Hybridisierung BIOCHEMISCHES ANFÄNGERPRAKTIKUM FÜR CHEMIKER UND BIOLOGEN V 2."\n1 V 2.6 Molekularbiologie I BIOCHEMISCHES ANFÄNGERPRAKTIKUM FÜR CHEMIKER UND BIOLOGEN PCR Klonierung Transformation Southern Blot Hybridisierung Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Fachbereich Chemie Universität Hamburg\n2 Molekularbiologie I - Inhalt 2 INHALT Seite Zeitplan... 3 Theoretische Grundlagen... 4 Polymerase Kettenreaktion... 4 Agarose Gelelektrophorese... 8 Plasmide... 9 Extraktion und Fällung von Nukleinsäuren DNA Minipräparation Restriktionsendonukleasen Klonierung von DNA Fragmenten in Plasmide Transformation Hybridisierung von Nukleinsäuren Das PhoA Gen Aufgabenstellung Durchführung Auswertung Anhang\n4 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 4 THEORETISCHE GRUNDLAGEN In diesem Praktikumsversuch sollen die Grundkenntnisse über die Vermehrung, Klonierung, Reinigung und Nachweis von Desoxyribonukleinsäure (DNA) vermittelt werden. Polymerase Kettenreaktion Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung von DNA. Mittels einer speziellen DNA Polymerase kann ein DNA-Segment amplifiziert werden, dass zwischen zwei Regionen bekannter Basensequenzen liegt. Gegen diese beiden Regionen werden komplementäre Oligonukleotide (Primer) eingesetzt, die nach ihrer Bindung an die vorher aufgetrennten DNA Einzelstränge als Starterkennung für die Polymerase dienen. Die Sequenzen der Primer werden so gewählt, dass sie an der einen Seite an den sense-strang und an der anderen Seite an den komplementären Strang hybridisieren. Dabei ist zu beachten, dass die DNA Polymerase den neuen Strang nur von 5' nach 3' synthetisiert. Erfunden wurde die PCR 1983 von Kary B. Mullis erhielt er dafür den Nobelpreis in Chemie. Als erster Schritt bei der PCR werden die Doppelstränge der DNA getrennt. Diese Denaturierung erfolgt bei einer Temperatur von 92 o C. Nach dem Abkühlen auf etwa o C kommt es zur Anlagerung der Primer (Annealing). Bei einer Temperatur um 72 o C entfaltet die Polymerase ihre maximale Aktivität und die Neusynthese (Elongation) des Doppelstranges beginnt an den Stellen, an denen die Primer gebunden haben. Diese drei Reaktionsschritte, Denaturierung, Annealing und Elongation, werden in der PCR zyklisch wiederholt, wobei in jedem Zyklus der zu amplifizierende DNA Abschnitt verdoppelt wird (Abb.1). Da das Elongationsprodukt eines Zyklus als Template für den nächsten Zyklus dienen kann, wird der von den Primern flankierte DNA Abschnitt exponentiell amplifiziert. Theoretisch könnte man in der PCR von einem einzelnen DNA Molekül ausgehen und nach n Zyklen eine Menge von 2 n Molekülen vorfinden (Abb.2). Dadurch wird die PCR zu einer sehr sensitiven Nachweismethode. Realisiert werden konnte die PCR erst mit der Entdeckung und Isolierung einer thermostabilen DNA-Polymerase, da durch die hohen Denaturierungstemperaturen die meisten DNA Polymerasen inaktiviert werden. Gefunden wurde diese thermostabile DNA Polymerase 1975 in dem Eubakterium Thermophilus aquaticus, welches in den\n5 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 5 heißen Quellen des Yellow Stone National Parks entdeckt wurde. Nach diesem Eubakterium wurde das Enzym Taq-Polymerase genannt. Es handelt sich dabei um ein 94 kda Protein mit einem Temperaturoptimum bei 72 o C. Für ihre Aktivität benötigt die Taq-Polymerase Mg 2+ Ionen. Bei zu hohen Konzentrationen ( 3 mm) wirken diese allerdings eher inhibitorisch. In einer Minute synthetisiert die Taq Polymerase etwa 1000 Basenpaare (1kb), so dass sich die Dauer der Elongation nach der Größe der zu amplifizierenden DNA richtet. Speziell für die PCR wurden Heizblöcke (Thermocycler) entwickelt, die automatisch ein programmiertes Temperaturprofil durchlaufen (Abb.3). Die Anzahl der Zyklen liegt üblicherweise bei und sollte 40 nicht überschreiten. Die Aktivität der Taq-Poylmerase ermüdet nach 40 Zyklen und man erhält keine Abb.1: Prinzip der Polymerase Kettenreaktion. 1: Denaturierung der DNA, 2: Anlagerung der Primer, 3: DNA-Synthese, 4: Produkte nach 2 Zyklen.\n6 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 1. Zyklus 2. Zyklus 3. Zyklus 6 4. Zyklus 30. Zyklus Ziel-Gen Exponentielle Amplifikation DNA Matrize Kopien Kopien 8 Kopien 16 Kopien Abb.2: Exponentielle Amplifikation bei der Polymerase Kettenreaktion. Abb.3: Temperaturprofil und Produkte einer Polymerase Kettenreaktion Milliarde Kopien\n7 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 7 exponentielle Amplifikation mehr. Außerdem nimmt der Hintergrund zu, d.h. es treten unspezifische Amplifikate auf. Darin liegt einer der Nachteile der PCR. Bei der extremen Varianz in der genomischen DNA kann es vorkommen, dass die Primer nicht nur an die Zielsequenz, sondern auch an zufällig sehr ähnliche Basenfolgen binden und somit zu unspezifischen Amplifikationen führen. Eine optimale Amplifikation ist sehr von der Sequenz der verwendeten Primer und die sich daraus ergebende Schmelztemperatur, welche die Annealing Temperatur im Anlagerungsschritt bestimmt, abhängig. Die Schmelztemperatur hängt von der Zahl der Basenpaare, dem Anteil an G/C Paaren, der Ionenstärke der Lösung und deren eventuellem Gehalt an Lösungsmitteln (Formamid) ab. Näherungsweise kann die Schmelztemperatur über folgende Formel berechnet werden: Tm = [(G + C) x 4] + [(A + T) x 2] (in o C) Die Primer haben in der Regel eine Länge von 18 bis 25 Basen. Ein großer Nachteil der PCR ist ihre Anfälligkeit gegenüber der Erzeugung von Mutationen durch Basenfehleinbau. Die Tabelle 1 zeigt einige Fehlerraten gängiger Polymerasen im Vergleich mit der DNA Polymerase I aus E. coli: Die PCR kann neben der spezifischen Amplifikation in vielfältiger Weise dazu benutzt werden, um DNA zu modifizieren. In einem Primer kann das 5 -Ende frei modifiziert werden um so z.b. Restriktionsschnittstellen anzufügen. Es genügt, wenn der 3 -Teil des Primers eine ausreichende Bindung ermöglicht, da an dieser Seite die Verlängerung durch die Polymerase erfolgt. Auch ein absichtlicher Austausch von einzelnen Basen in der Mitte eines Primers zur zielgerichteten Mutagenese ist möglich. Der Erfolg einer PCR wird üblicherweise mit einer Agarose Gelelektrophorese überprüft. Tab. 1: Fehlerraten einiger thermostabiler Polymerasen. Name Organismus 3-5 Fehlerkorrektur Fehler/bp Taq Thermus aquaticus - 1 x 10-4 Vent (exo-) Vent Pfu Thermococcus litoralis Thermococcus litoralis Pyrococcus - 2 x x x 10-6 furiosus DNA Polymerase I E. coli + 1 x 10-8\n9 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 9 der Zellteilung gestört wird. Bei Arbeiten mit Ethidiumbromid sind immer Handschuhe zu tragen! Abb.4: Strukturformel von Ethidiumbromid Plasmide Eine Grundvoraussetzung für molekularbiologische Arbeiten ist die Möglichkeit, genetisches Material zu isolieren und so zu amplifizieren, dass biochemische und molekularbiologische Analysen möglich sind. Dies bedingt, dass die DNA möglichst fehlerfrei amplifiziert wird (Tab.1), eine Voraussetzung, welche nur in vivo, d.h. in lebenden Organismen erfüllt wird. Die gängigste Methode ist es daher, das gewünschte DNA-Fragment in ein DNA-Trägermolekül zu integrieren, das in Bakterien extrachromosomal repliziert wird. Dieses Molekül muss die Möglichkeit bieten, selektiv nur solche Bakterien zu vermehren, die dieses DNA-Molekül enthalten. Diese Anforderungen werden von Plasmiden erfüllt, welche zur Familie der DNA-Vektoren gehören. Plasmide sind doppelsträngige, zirkuläre DNA-Moleküle, die in ihrer Größe zwischen 2 und 15 kb variieren. In der Natur werden Plasmide in einer Vielzahl von Bakterien gefunden, wo sie als zusätzliche genetische Einheiten fungieren, die repliziert und unabhängig vom Genom vererbt werden. Oft enthalten Plasmide Gene, die für Enzyme kodieren, die unter bestimmten Lebensbedingungen für das Bakterium vorteilhaft sind. Ohne diesen biologischen Vorteil würde das Plasmid unnötigen Ballast darstellen und das Bakterium würde das Plasmid wieder verlieren. Zu den Phänotypen, die durch Plasmide erzielt werden, gehören u.a. die Resistenzen gegen bestimmte Antibiotika. Zum Beispiel erzielt ein Plasmid welches die β-lactamase kodiert eine Resistenz gegenüber Ampicillin, da das Bakterium in der Lage ist das Antibiotikum\n10 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 10 durch Spaltung zu inaktivieren. In der Molekularbiologie verwendete Plasmide stellen stark modifizierte natürliche Plasmide dar, die im Ursprung fast alle von demselben Plasmid abstammen. Die Veränderungen beziehen sich auf Sicherheits- und Anwendungskriterien. So sind manche Plasmide auf reine DNA-Amplifikation, andere auf Sequenzierungs- oder Expressionsversuche optimiert. Drei Strukturelemente sind in allen molekularbiologisch eingesetzten Plasmiden zu finden: I) Replikationsursprung (ori), damit das Plasmid in Bakterien vermehrt werden kann. II) Resistenzgen, um die Selektion transformierter Bakterien zu ermöglichen. III) Klonierungsstelle, in die Fremd-DNA eingebaut werden kann (Multiple Cloning Site, MCS). Die Klonierungsstelle ist meist so konstruiert, dass dort viele Schnittstellen für gebräuchliche Restriktionsendonukleasen in einem kurzen DNA-Abschnitt liegen, welche sonst im Plasmid nicht vorkommen. In Abb.5 ist puc18, ein genereller Klonierungsund Sequenzierungsvektor dargestellt. Man erkennt die oben genannten Strukturmerkmale (Replikationsursprung, Resistenz-Marker β-lactamase (Amp r ) und die Klonierungsstelle) sowie die Positionen von Restriktionsendonuklease Schnittstellen. Bcg I Sca I Xmn I Bmp I BsrF I Bsa I Ampr Ssp I EcoO109 I Aat II puc bp lacz ori Nde I MCS Nar I / Kas I Sap I Afl III Hind III Sph I Pst I Sse8387 I BspM I Sal I Hinc II Acc I Xba I BamH I Ava I Xma I Sma I Kpn I Acc65 I Ban II Ecl136 II Sac I Apo I EcoRI Ahd I AlwN I Abb.5: Vektorkarte puc18\n11 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 11 Extraktion und Fällung von Nukleinsäuren Um Proteine aus Nukleinsäurelösungen zu entfernen, wird mit Phenol extrahiert. Phenol ist ein sehr guter Wasserstoffbrückenbildner und kann gleichzeitig hydrophobe Wechselwirkungen mit Aminosäureseitenketten eingehen. Es dissoziiert Protein- Nukleinsäure-Komplexe in die freien Komponenten. Die Proteine werden denaturiert und reichern sich in der Phenolphase an. Vor dem Gebrauch muss das Phenol mit einer wässrigen Pufferlösung auf einen ph-wert größer 7,8 äquilibriert werden, da sonst die DNA in die Phenolphase geht. Um Proteinverunreinigungen aus den Nukleinsäurelösungen zu entfernen, wird ein 1:1 Gemisch aus Phenol:Chloroform verwendet und dieses zu gleichen Volumenteilen mit der Nukleinsäurelösung gemischt. Chloroform denaturiert die Proteine und erleichtert die Phasentrennung, welche durch Zentrifugation erfolgt. Eine breite Interphase bildet sich aus, wenn der Proteingehalt in der Lösung besonders hoch ist. In solchen Fällen wird die Phenol/Chloroform Extraktion wiederholt, bis die Interphase verschwindet. Phenolreste können später enzymatische Reaktionen stören und müssen sorgfältig entfernt werden. Nukleinsäuren können entweder durch Zugabe von 2,5 Volumina 95 % Ethanol oder 1 Volumen Isopropanol gefällt werden. Ethanol fällt sowohl DNA als auch RNA, in 50 % Isopropanol ist RNA besser löslich als die DNA, die quantitativ ausgefällt wird. Die Zugabe von monovalenten Kationen, Na + auf 0,3 M Endkonzentration, K + auf 0,1 M Endkonzentration und NH + 4 auf 3,7 M Endkonzentration als Acetate oder Chloride ändert selektiv die Löslichkeit der DNA und erhöht dadurch die Effizienz der Fällung. Bei geringen Nukleinsäurekonzentrationen empfiehlt sich die Fällung in der Kälte (auf Eis oder bei -20 o C) durchzuführen, um die Ausbeute zu erhöhen. Bei höheren Nukleinsäurekonzentrationen ist die Fällung bei Raumtemperatur durchzuführen, weil in der Kälte neben der Nukleinsäure auch Salze ausfallen können. DNA Minipräparation Unter einer Minipräparation versteht man die Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli Zellen, die über Nacht gewachsen sind und dabei das Plasmid vermehrt haben. Je nach Replikationsursprung können sich die Plasmide unterschiedlich in den E. coli Zellen replizieren. puc Vektoren besitzen z.b. den Replikationsursprung pmb1 und gehören zu den High Copy Plasmiden mit replizierten Plasmiden pro Zelle.\n12 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 12 Bei einer Minipräparation werden die Zellen zuerst in eine Lösung aus Glucose und Tris/EDTA resuspendiert. Die Glucose hält dabei den osmotischen Druck aufrecht, während Tris die Zellen bei ph 8,0 puffert. EDTA bindet an zweiwertige Metallionen der Lipiddoppelschicht und schwächt dadurch die Zellwand. Bei späterer Lyse verhindert das EDTA die DNA Degradation, da es Mg 2+ bindet, welches ein Kofaktor für bakterielle Nukleasen ist. Die Zellen werden in einer alkalischen Lyse mit NaOH aufgeschlossen. Zusätzlich wird Natriumdodecylsulfat (SDS) zugegeben, welches zur Lösung von Lipiden der Zellmenbran und zellulären Proteinen beiträgt. Durch das NaOH wird die Chromosomale- und Plasmid-DNA in die Einzelstränge denaturiert. Die zirkularen DNA- Stränge des Plasmids bleiben jedoch miteinander verknäult. Durch Zugabe von Kaliumacetat und Essigsäure wird der ph neutralisiert, wodurch die DNA Stränge renaturieren. Die langen chromosomalen Stränge können dabei nicht optimal hybridisieren und kollabieren in einem teilweise hybridisierten Knäul. Gleichzeitig wird durch das Kaliumacetat das SDS präzipitiert, an dem Lipide und Proteine gebunden sind. Dadurch bleiben lediglich Plasmid DNA, kleine chromosomale Fragmente und RNA in Lösung. Eine weitere Reinigung der Plasmid DNA erfolgt durch Phenol/Chlorofom Extraktion, Ethanol Fällung und Ribonuklease Verdau. Restriktionsendonukleasen Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die doppelsträngige DNA spezifisch innerhalb von palindromen Erkennungssequenzen spalten. Sie werden von Bakterien hergestellt und bilden einen natürlichen Schutz, da sie eindringende fremde DNA Moleküle abbauen können. Die entsprechenden Erkennungssequenzen im Genom des Bakteriums selbst sind durch Methylierung an einem Adenin- oder Cytosinrest modifiziert, und dadurch vor einem Abbau durch eigene Restriktionsendonukleasen geschützt. Die Namen der Restriktionsenzyme leiten sich von dem Organismus ab, aus dem sie isoliert wurden. EcoRI stammt z.b aus dem Bakterium Escherichia coli. Die zahlreichen Restriktionsenzyme mit ihren vielen verschiedenen spezifischen Erkennungssequenzen haben sich zu dem wichtigsten und vielseitigsten Werkzeug der Molekularbiologen entwickelt. Durch sie ist es möglich, definierte DNA Fragmente herzustellen und zu klonieren. Restriktionsenzyme sind weiterhin nützlich bei der strukturellen Kartierung von DNA. In Kombination mit der Southern Blot Analyse\n13 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 13 erlauben sie die Bestimmung von Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLPs). Die Effizienz von Restriktionsenzymen hängt wesentlich von der Reinheit der DNA ab. Verunreinigungen wie Proteine, aber vor allem niedermolekulare Stoffe wie Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, SDS und hohe Salzkonzentrationen können die Enzymaktivität behindern. Diesem kann entgegengewirkt werden durch Erhöhung der Menge an Restriktionsenzym, längere Reaktionszeiten oder größeres Volumen des Reaktionsansatzes (Verdünnung der störenden Komponenten). Häufig ist jedoch ein weiterer Reinigungsschritt der DNA unumgänglich. Jedes Restriktionsenzym benötigt bestimmte Reaktionsbedingungen, um optimal arbeiten zu können. Typische Komponenten, die für viele Enzyme notwendig sind und im Reaktionspuffer enthalten sein sollten, sind MgCl 2, NaCl oder KCl, β- Mercaptoethanol oder Dithiothreitol und Rinderserumalbumin. Um den ph-wert einzuhalten, wird meist Tris-HCl als Puffersystem verwendet. Sulfhydryreagenzien und Albumin helfen, die Enzymaktivität zu stabilisieren. Viele Restriktionsenzyme sind sehr empfindlich gegenüber der Konzentration an Natrium- oder Kaliumionen. Manchmal existiert nur ein begrenzter Konzentrationsbereich, in dem das Enzym aktiv ist. Man verwendet in der Regel ein System aus 4-5 verschiedenen Puffern, die sich in Ihrer Salzkonzentration und ihrem ph-wert unterscheiden. Restriktionsenzyme sind, wie viele andere Enzyme, temperaturlabil. Sie werden bei - 20 o C aufbewahrt und sollten zur Entnahme möglichst nur für kurze Zeit Raumtemperatur ausgesetzt sein. Empfehlenswert ist die Verwendung von Kühlelementen zum Transport und zur Aufbewahrung am Arbeitsplatz. Ein wichtiges Kriterium für die Brauchbarkeit der Restriktionsenzyme ist ihre Spezifität für bestimmte Erkennungssequenzen und die daraus zu ziehenden analytischen Schlüsse. Es kann daher verheerende Folgen haben, wenn beim Arbeiten mit verschiedenen Restriktionsenzymen eine Kreuzkontamination auftritt. Geringe Anteile eines Fremdenzyms, die durch unsauberes Pipettieren verschleppt worden sind, können zu partiellen Spaltungsreaktionen führen, die eine Interpretation der Ergebnisse unmöglich macht. Es ist daher zwingend erforderlich, für jeden Pipettiervorgang eine neue Pipettenspitze zu verwenden. Die Aktivität von Restriktionsenzymen ist definiert als: 1 unit = die Menge an Enzym, die 1 µg Standard DNA pro Stunde umsetzt. Theoretisch sollte es sich gerade für teure Enzyme rentieren, wenn man wenig Enzym einsetzt und die Reaktion längere Zeit, z.b. über Nacht laufen lässt. Viele Enzyme haben aber unter den Inkubationsbedingungen\n15 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 15 Die PCR-Fragmente tragen an ihren 5 -Enden die integrierten Primer. Wurden diese nicht bei ihrer Synthese schon phosphoryliert, so müssen die Amplifikate vor dem Klonieren phosphoryliert werden, damit die eingesetzte T4-DNA Ligase die Bindung zum Plasmid knüpfen kann. Diese Phosphorylierung mit ATP wird durch das Enzym T4 Polynukleotidkinase katalysiert (Beide Enzyme wurden aus dem T4 Phagen isoliert und tragen daher ihre Bezeichnung). Das Plasmid wird hingegen mit einer Phosphatase oft dephosphoryliert (meist alkalische Phosphatase aus Kälbermagen, Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP) damit eine Rezirkularisierung unterdrückt wird. Transformation Das Einschleusen von Fremd-DNA in Bakterien wird Transformation genannt, wobei es zwei generelle Methoden gibt. Die klassische Methode ist die Hitzeschock-Methode. Bakterien werden kultiviert bis sie ihre maximale Vervielfältigungsgeschwindigkeit erreicht haben (logarithmische Phase). In dieser vitalen Phase werden sie auf Eis gekühlt und somit das Wachstum gestoppt. Es folgen mehrere Waschschritte mit kalten Puffern, die zweiwertige Calciumionen enthalten. Die so behandelten Bakterien werden als kompetent bezeichnet, da sie die Fähigkeit haben, DNA aufzunehmen. Kompetente Bakterien sind sehr empfindlich gegenüber mechanischer Beanspruchung und Wärme und müssen immer auf Eis aufbewahrt werden. Die kompetenten Bakterien werden dann mit DNA versetzt und auf Eis inkubiert. Man nimmt an, dass sich in dieser Zeit ein Calcium-DNA Präzipitat auf den Bakterien bildet. Bei kurzzeitiger Hitzeeinwirkung (90 sec, 42 o C) wird nun die DNA in das Bakterium aufgenommen. Der genaue Mechanismus dieser Aufnahme ist nicht genau aufgeklärt. Mit dieser Methode ist es möglich bis zu 10 6 transformierte Bakterien/µg DNA zu erhalten. Die zweite und effizientere Methode ist die Elektroporation. Bakterien werden hierbei wiederum bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert und anschließend möglichst salzfrei gewaschen. Sehr reine DNA wird hinzugefügt und die Suspension in einem speziellen Gerät für kurze Zeit in ein sehr hohes Spannungsfeld gebracht (ca. 5 msec bei 1,8 kv). Hierbei bilden sich Poren in den Bakterien durch die die DNA hineinwandert. Mit dieser Methode sind bis zu 10 9 Transformanten/ µg DNA möglich. Die Selektion der Transformanten von Bakterien ohne Plasmid geschieht durch die Antibiotikaselektion.\n16 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 16 Die Klonierungsstelle von puc18 liegt am Anfang eines modifizierten lacz Gens (Teil des Lactose-Operon), welches den N-terminalen Teil der β-galaktosidase kodiert (siehe Abb. 4). Wird keine Fremd-DNA insertiert und nur puc18 allein transformiert, so wird bei Induktion mit dem Lactose-Analog Isopropyl-β-D-Thiogalaktosid (IPTG) die kodierte Domäne der β-galaktosidase exprimiert. Wählt man den E. coli Stamm so aus, dass dieser die C-terminale Domäne exprimiert (z.b. DH5α), so kommt es zu der sogenannten α-komplementierung. Die beiden separaten Domänen der rekombinanten β-galaktosidase lagern sich zu einem funktionellen Enzym zusammen. Bietet man diesen transformierten und induzierten Bakterien das Substrat X-Gal (5- Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-galaktosid) an, so wird dieses zu einem blauen Farbstoff umgewandelt. Wird jedoch ein DNA-Fragment in die Klonierungsstelle eingefügt, so wird die Galaktosidase-Domäne als Fusionsprotein mit der klonierten Proteinsequenz exprimiert. Dies stört in der Regel die Komplementierung so stark, dass keine funktionelle Galaktosidase gebildet wird. D.h. ein Bakterium bzw. eine Kolonie, die ein nicht-rekombinantes puc18 trägt, ist blau, eine Kolonie mit rekombinantem puc18 bleibt weiß. Dieses Prinzip ist die Grundlage eines einfachen Screenings von transformierten Bakterien und wird Blau-Weiß Screening genannt. Hybridisierung von Nukleinsäuren Wenn man einzelsträngige DNA oder RNA mischt, die spezifische Nukleotidsequenzen gemeinsam besitzen, werden diese sich in Bereichen genetischer Homologie zusammenlagern und Duplexe bilden. Diese Hybridisierung kann dazu benutzt werden, um z.b. spezifische Gene in einem Nukleinsäurefragment zu lokalisieren. Bei vielen Hybridisierungsreaktionen wird die DNA oder RNA zuerst elektrophoretisch auf Flachgelen getrennt und auf einen Membranfilter transferiert. Die Moleküle werden auf der Membranmatrix als exakte Replikas der Gel-Trennung immobilisiert. Allgemein hängt die Wahl der für den Transfer und die Hybridisierung benutzten Membran von Parametern wie der Art und Größe der Nukleinsäure sowie die Anzahl der Hybridisierungsschritte und der angestrebten Empfindlichkeit ab. Als Southern-Blot wird der Transfer von DNA auf Membranen bezeichnet, eine Methode die 1975 von E. M. Southern publiziert wurde. In Anlehnung an diese Methode wurden andere Transfer Techniken als Northern-Blot (RNA) und Western-Blot (Proteine) bezeichnet.\n17 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 17 Zur permanenten Fixierung der DNA auf die Membran wird diese entweder durch UV- Strahlung oder durch Backen bei 120 o C für Minuten behandelt. Die Detektion der immobilisierten DNA erfolgt durch eine DNA-Sonde, welche an die immobilisierte DNA hybridisiert. Die DNA-Sonde trägt eine Markierung. Die klassische Markierung ist die radioaktive mit 32 P. Diese im Nachweis sehr sensitive Methode hat jedoch den Nachteil, dass sie sehr aufwendig (Sicherheit im Umgang mit radioaktiven Substanzen) und relativ teuer ist (keine lange Lagerung aufgrund von Halbwertszeiten, hohe Entsorgungskosten). Heutzutage gibt es eine Reihe nicht-radioaktiver Markierungen, die einen ausreichend sensitiven Nachweis erlauben. Ein Beispiel ist die Markierung mit Digoxigenin (DIG). DIG ist ein Steroid-Hapten welches aus der Pflanze Digitalis purpurea isoliert wurde. Es wird in die DNA als Konjugat mit dutp eingebaut (Abb.7). Es existiert ein monoklonaler Antikörper gegen DIG, welcher eine sehr hohe Affinität zu diesem Antigen aufweist und somit eine ideale Basis für ein Detektionssystem bietet. Dieses Hapten wird verwendet, da es kaum in der Natur vorkommt und somit keine unspezifischen Bindungen zu erwarten sind. Das im Praktikum verwendete DIG-11- dutp wird mittels der sogenannten Random-primed Markierungs-Methode in die DNA eingebaut. Hierbei wird die Template-DNA denaturiert und die Einzelstränge durch das Klenow Fragment (C-terminale Domäne der DNA-Polymerase I) synthetisiert. Als Primer dienen Hexanukleotide mit zufälliger Sequenz. Ein DIG-11-UTP wird dabei statistisch alle Basen in die neu synthetisierten Stränge eingebaut. Vor der Hybridisierung der Sonde mit der immobilisierten DNA wird ein Prähybridisierungsschritt durchgeführt, bei dem alle unspezifischen Bindungsstellen der Membran blockiert werden. Nukleinsäuren hybridisieren sehr effizient etwa 25 o C unterhalb der Schmelztemperatur, bei der sie zu 50% denaturiert (einzelsträngig) sind. Für DNA in wässrigen Lösungen werden die Hybridisierungen bei o C durchgeführt. Da Formamid die Schmelztemperatur erniedrigt, werden Hybridisierungen in Gegenwart von Formamid (50 %ige Lösungen) bei o C durchgeführt. Nachgewiesen wird die markierte DNA über die Bindung eines Antikörper-Enzym Konjugates und nachfolgende enzymatische Reaktionen. Im Praktikum wird ein anti-dig Antikörper-Konjugat mit alkalischer Phosphatase verwendet, welches durch die Farbstoffreaktion mit den Substraten NBT/BCIP nachgewiesen wird.\n18 Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 18 Abb.7: Strukturformel von DIG-11-dUTP Das PhoA Gen In dem Praktikumsversuch wird das Plasmid pbaphis6 (Abb.8) untersucht, welches für die rekombinante Expression der bakteriellen alkalischen Phosphatase aus E. coli konstruiert wurde. Dieses Protein wird von dem Gen PhoA kodiert. Es ist ein sehr gut untersuchtes ca. 50 kda Protein, das Phosphorsäureestergruppen abspaltet (E.C ). Es wurde kloniert (Shuttleworth et al., Nucleic Acid Res., 14, 8689ff, 1986) und Abb.8: Restriktionskarte des Vektors pbaphis6\n20 Molekularbiologie I - Aufgabenstellung 20 Abb. 9: Schematische Darstellung der Primer Hybrididsierung. Die Zellen werden vermehrt und die Plasmid DNA über eine DNA Minipräparation aus den Zellen isoliert. Die Plasmid DNA sowie der Vektor pbaphis6 werden anschließend mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und der Verdau gelelektrophoretisch überprüft (Abb.10). Anschließend erfolgt ein Southern Blot und die Hybridisierung mit der DIG markierten Sonde. Die Detektion des Digoxigenins erfolgt schließlich in einem Immunprint.\n21 Molekularbiologie I - Aufgabenstellung 21 Abb. 10: Übersicht zur Klonierung der PCR Fragmente in puc18.\n22 Molekularbiologie I - Aufgabenstellung 22 Abb. 11: Übersicht zur Analyse der PCR Fragmente.\n23 Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 23 DURCHFÜHRUNG Ansetzen der PCR Reaktion Jede Gruppe setzt eine PCR Reaktionen an, wobei die eine Hälfte des Kurses mit dem Primerpaar A und die andere Hälfte mit dem Primerpaar B arbeitet. Das 0,5 ml Tube mit dem Puffer (enthält 10 µl PCR Puffer) wird auf dem Deckel mit dem Namen/Gruppennummer o.ä. beschriftet. Das Tube wird auf Eis gestellt und folgender Ansatz dazu pipettiert: Puffer 10 µl MgCl 2 (50 mm) 3 µl H 2 O 26 µl dntps 20 µl Template pbaphis6 20 µl Primer 1 10 µl Primer 2 10 µl Taq-Polymerase 1 µl Endvolumen 100 µl Notieren Sie, welches Primerpaar Sie verwendet haben: Der Ansatz wird kurz anzentrifugiert, um Tröpfchen von der Gefäßwand zu entfernen. Als Kontrolle wird ein Ansatz zusammenpipettiert, bei dem kein Template enthalten ist. Das fehlende Volumen wird mit H 2 O ausgeglichen. Diese Kontrolle wird nur einmal im Kurs angesetzt. Im Thermocycler wird nun das PCR Programm Prakt gestartet: Schritt Temperatur Zeit 1. Primärdenaturierung 94 o C 1 min 2. Denaturierung 94 o C 10 sec 3. Hybridisierung 55 o C 30 sec 4. DNA-Synthese 72 o C 30 sec 5. Goto 2, Repeat 29x 6. DNA-Synthese 72 o C 10 min Für die PCR-Reaktion werden etwa 2,5 h benötigt.\n24 Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 24 Ansetzen von Medium und Agarplatten Im Laufe der beiden kommenden Versuchswochen werden sowohl Flüssigmedien (LB Medium, Luria Broth) als auch feste Medien (LB Agarplatten) zum Wachstum von E. coli Zellen benötigt. Für den gesamten Kurs werden 3 l LB Medium und 3 l LB Agar benötigt. Zum ansetzen des Mediums werden in sechs 500 ml Flaschen jeweils 12,5 g LB Pulver gegeben und auf 500 ml mit H 2 O aufgefüllt. Für den LB Agar werden wiederum in sechs 500 ml Flaschen 20 g LB Agar gegeben und auf 500 ml mit H 2 O aufgefüllt. Die Flaschen werden auf dem Deckel mit Autoklavierband versehen und beschriftet. Die Flaschen gut schütteln, so dass keine Rückstände am Boden kleben. Das Autoklavieren (Sterilisieren für 20 Minuten bei 120 C unter Druck) wird von dem Assistenten übernommen und dauert etwa 3 h. Analyse der PCR Reaktion Die Analyse der oben angesetzten PCR-Reaktion erfolgt mit einem 2 %igen Agarosegel, wobei ein Gel für den gesamten Kurs angesetzt wird. 4 g Agarose in einem 500 ml Erlenmeyerkolben abwiegen. 200 ml TAE-Puffer (1x) dazugeben und in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht überkocht! 20 µl Ethidiumbromid dazugeben. Da Ethidiumbromid mutagen ist, unbedingt Handschuhe anziehen! Die Gelgießkammer wird mit den Gießsperren und einem Kamm zusammengebaut (Handschuhe!) und die Agaroselösung in die Kammer gegossen, wenn sie sich auf etwa 50 o C abgekühlt hat. Die Polymerisation erfolgt während der Mittagspause. TAE-Puffer (50x): 121 g Tris, 28,5 ml HOAc, 50 ml 0,5 M EDTA ph 8,0 ad 500 ml H 2 O Mittagspause\n25 Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 25 Nach Beendigung der PCR werden die DNA Fragmente bei 150 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gießsperren und die Kämme werden von dem Agarosegel entfernt (Handschuhe) und das Gel in die Laufkammer mit den Taschen nach links gelegt. Die Kammer wird mit TAE-Puffer (1x) gefüllt, bis das Gel gerade eben bedeckt ist (etwa 1 l). 10 µl der PCR Reaktion werden mit 2 µl Beladungspuffer (6x) auf einem Streifen Parafilm vermischt und 10 µl davon auf das Gel aufgetragen. Als Standard werden 10 µl puc19/mspi aufgetragen. Notieren Sie sich, welche Bahnen Sie belegt haben, in der folgenden Tabelle. Die Fragmente werden bei 150 V getrennt. Bahn Probe 1. puc19/mspi Standard 2. Kontrolle Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel unter UV Licht betrachtet und dokumentiert.\n27 Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 27 Es werden 2 g Agarose abgewogen und analog zu der Vorschrift auf S.24 verfahren. Nach dem Erkalten wird das Gel mit etwas TAE Puffer überschichtet, damit es über Nacht nicht austrocknet. Gießen der Agarplatten Das Medium muss vor Zugabe des Antibiotikums auf etwa 50 o C abgekühlt werden. Zwei Flaschen werden mit Ampicillin (50 µg/ml Endkonzentrartion) und die anderen beiden mit Kanamycin (15 µg/ml Endkonzentration) und versetzt. Pro 500 ml LB Agarmedium werden 1,25 ml Ampicillin oder 300 µl Kanamycin zugegeben. Nach vorsichtigem Umschütteln (Vermeiden Sie Luftblasen zu erzeugen) werden die Platten im Schutz des Flammenkegels eines Bunsenbrenners gegossen. Die Platten mit dem Ampicillin werden an der Seite mit einem Strich, die Platten mit dem Kanamycin mit einem Doppelstrich markiert. Zum Erkalten werden die Platten über Nacht auf der Arbeitsplatte stehen gelassen und am nächsten Tag invertiert bei 4 o C gelagert. Ansetzen von Über-Nacht Kulturen (ÜNK) Am nächsten Tag sollen kompetente E. coli Zellen (Stamm: DH5α) hergestellt werden. Dazu müssen die Zellen über Nacht vermehrt werden. Von dem LB Medium werden 3 ml in ein steriles Kulturröhrchen gefüllt und dieses beschriftet. Dazu werden sterile 5 ml Pipetten benutzt und neben einem Bunsenbrenner gearbietet. Eine 200 µl Pipette wird an dem Schaft mit einem Ethanol getränkten Tuch gereinigt und eine Pipettenspitze aufgesetzt. Mit der Pipettenspitze wird von einer LB Platte mit DH5α Zellen eine Kolonie abgestreift und die Spitze in das Kulturröhrchen abgeworfen. Die Kultur wird über Nacht bei 37 o C und 220 rpm inkubiert.\n28 Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 28 Herstellung kompetenter Zellen Um das später klonierte PCR Produkt in E. coli zu transformieren, müssen die Zellen kompetent gemacht werden, d.h. sie besitzen dann die Fähigkeit, Plasmid DNA aufzunehmen. Dazu werden die Zellen bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert und anschließend mit einem Magnesiumchlorid-haltigen Puffer gewaschen. Das Wachstum der Zellen wird photometrisch bei 600 nm verfolgt und die Inkubation bei einer OD 600 von 0,3 abgebrochen. Es ist darauf zu achten, dass das Wachstum der Zellen exponentiell erfolgt. Die kompetenten Zellen müssen nach dem Waschen immer auf Eis bleiben, da sie sonst ihre Kompetenz verlieren! In einem sterilen Erlenmeyerkolben werden 50 ml LB Medium gefüllt. Von der Über-Nacht Kultur werden 500 µl in den Kolben gegeben. Die Kultur wird bei 37 o C und 220 rpm geschüttelt. Zur photometrischen Messung wird 1 ml der Kultur mit einer sterilen Pasteurpipette entnommen und die OD 600 bestimmt. Wenn eine OD 600 von 0,3 erreicht ist, wird die Kultur für 20 min auf Eis gestellt. Die Zellen werden in ein vorgekühltes 50 ml Tube überführt und für 10 min bei rpm und 4 o C zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig in den Erlenmeyerkolben abgegossen und die Zellen in 2 ml eiskalter TSS Lösung durch auf- und abpipettieren resuspendiert. Bis zur Transformation werden die Zellen auf Eis gelagert. TSS Lösung: 85 ml LB Medium, 5 ml DMSO, 10 g PEG 8000, 50 mm MgCl 2 ad 100 ml, ph 6,5 Analyse des Restriktionsverdaus Der Ansatz mit dem Restriktionsverdau wird kurz anzentrifugiert. Der Ansätze wird mit 4 µl Beladungspuffer (6x) versetzt, erneut kurz anzentrifugiert und die gesamte Menge auf das Gel aufgetragen. Als Standard werden 10 µl λdna/eco 130I aufgetragen. Notieren Sie sich in der unten stehenden Tabelle, welche Bahnen Sie belegt haben. Die Fragmente werden bei 150 V getrennt.\n29 Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 29 Bahn Probe 1. λdna/eco 130I Nach der Elektrophorese wird das Gel unter UV Licht betrachtet und das DNA Fragment aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Ein 1,5 ml Tube wird auf dem Deckel mit der Gruppennummer beschriftet. Der geschnittene Vektor wird mit einem Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten Dabei ist darauf zu achten, dass der Anteil an Agarose möglichst gering gehalten wird. Isolierung der DNA aus dem Agarosegel Um die DNA aus dem Agarosegel zu isolieren, wird das Agarosestück über einem Filter zentrifugiert und so die DNA abgetrennt: In dem Boden eines 0,5 ml Tubes wird mit einer heißen Kanüle ein Loch gestochen. Mit einer sterilen (abgeflammten) Pinzette wird etwas Glaswolle in das 0,5 ml Tube gestopft. Das Agarosestück wird auf die Glaswolle gelegt und das Tube in ein 1,5 ml Tube gestellt.\n30 Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 30 Es wird für 1 min bei rpm zentrifugiert. Im Durchlauf befindet sich die DNA. Ligation des PCR Produktes Für die Ligation wird in einem 0,5 ml Tube folgender Ansatz auf Eis zusammen pipettiert: puc19-t/xcmi verdaut 2 µl PCR Produkt 15 µl T4 Ligations Puffer 2 µl T4 DNA Ligase 1 µl Die Ligation wird für 3 h bei 16 o C inkubiert. Mittagspause Transformation Das in puc19-t ligierte PCR Fragment wird nun in die kompetenten E. coli DH5α Zellen mittels Hitzeschock transformiert. Drei 1,5 ml Tubes werden mit "L", "+" und "-" beschriftet und auf Eis gestellt. Durch kurzes Anschnippen mit dem Finger werden die E. coli Zellen resuspendiert und je 100 µl davon in die vorgekühlten 1,5 ml Tubes pipettiert. Von dem Ligationsansatz werden 10 µl zu den Zellen in dem Tube "L" pipettiert. Zusätzlich werden 1 µl (10 ng) puc19 als positiv Kontrolle zu dem Ansatz "+" gegeben. In die negativ Kontrolle wird keine DNA pipettiert. Die Ansätze werden für 30 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden für 90 sec bei 42 o C inkubiert und anschließend für 2 min auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 1 ml LB Medium wird für 45 min bei 37 o C inkubiert. Dabei etwa alle 10 min die Zellen durch Schütteln des Tubes resuspendieren.\n31 Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 31 Vier LB Amp Platten werden mit 20 µl IPTG und 40 µl X-Gal beschichtet. Von 3 Ansätzen werden jeweils 100 µl auf LB Amp Platten ausplattiert. Der Ansatz "L" wird für 2 min bei rpm zentrifugiert, der Überstand bis auf 100 µl abgesogen, die Zellen resuspendiert und der gesamte Ansatz auf eine LB Amp Platte ausplattiert. Die Platten werden invertiert bei 37 o C über Nacht inkubiert. IPTG: 100 mm in H 2 O X-Gal: 20 mg/ml in DMF Einfrieren von Zellen Die kompetenten E. coli werden zur Lagerung eingefroren: Es werden vier 1,5 ml Tubes auf dem Deckel mit der Gruppennummer beschriftet und auf Eis 1-2 min vorgekühlt. In die gekühlten Tubes werden jeweils 400 µl der Zellen gegeben und die Zellen in flüssigem Stickstoff gekühlt. Die Lagerung erfolgt bei -80 o C. Fällung der PCR-Produkte Die gestern angesetzte Fällung des PCR Produktes muss noch abgeschlossen werden. Die Ansätze (lagern bei -20 o C) werden für 20 min bei rpm und 4 o C zentrifugiert. Dabei auf die Orientierung des Tubes in der Zentrifuge achten! Der Überstand wird vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe abgesogen. Auf das Ende des Schlauches wird dabei eine frische, sterile Pipettenspitze gesetzt. Es werden 100 µl kaltes 70%iges Ethanol zugegeben und der Ansatz kurz gevortext. Der Ansatz wird für 2 min bei rpm und 4 o C zentrifugiert. Dabei wiederum auf die Orientierung des Tubes in der Zentrifuge achten.\n33 Molekularbiologie I - Durchführung (Mittwoch) 33 Auswertung der Transformation Zählen Sie die blauen Kolonien der puc19 Kontroll-Platte aus. Berechnen Sie die Transformationseffizienz in cfu/µg DNA (Colony Forming Units). Diese kann mit der benutzten Methode bis zu betragen. Vermehrung von Plasmid DNA Mit drei Kolonien von dem Transformationsansatz der Ligation werden nun Kulturen angesetzt, um die Zellen und somit auch die Plasmid DNA zu vermehren. Drei Kulturröhrchen werden mit 2 ml LB Medium gefüllt. Das Medium wird mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt. Mit einer Pipettenspitze wird eine weiße Kolonie von der Platte genommen und die Kultur damit angeimpft. Die Zellen werden bei 37 o C und 220 rpm inkubiert. DNA Minipräparation Die Isolierung des Plasmids erfolgt mittels einer DNA Minipräparation. Die Zelle wird dabei über eine alkalische Lyse aufgeschlossen. Jede Gruppe fertigt parallel drei Minipräparationen von den angesetzten Kulturen an. Die Zellsuspension wird in ein 2,0 ml Tube überführt und für 1 min bei rpm zentrifugiert. Der Überstand wird mit der Wasserstrahlpumpe abgesogen. Das Zellpellet wird in 100 µl Lösung I vollständig durch auf- und abpipettieren resuspendiert. Zu der Suspension werden 200 µl frisch angesetzte Lösung II zugegeben und zum Durchmischen das Tube kurz geschüttelt. Der Ansatz wird 5 min bei RT inkubiert. Anschließend werden 150 µl Lösung III zugegeben, kurz geschüttelt und für 5 min bei rpm zentrifugiert.\n35 Molekularbiologie I - Durchführung (Mittwoch) 35 In die restlichen vier Tubes werden je 25 µl Mastermix pipettiert und anschließend die DNA (Kloniertes PCR Produkt oder pbaphis6) zugegeben. Mastermix H 2 O 105µl Puffer EcoRI 15,0 µl EocRI 5,0 µl Restriktionsverdau Mastermix 125 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl pbaphis6 5 µl / / / puc19/pcr / 5 µl 5 µl 5 µl Endvolumen 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl Die vier Ansätze werden kurz anzentrifugiert und über Nacht bei 37 o C im Wasserbad inkubiert. Herstellung der Digoxigenin Sonde Die Markierung des PCR Fragmentes mit Digoxigenin erfolgt mit dem Random Primed DIG DNA Labeling Kit der Firma Roche. Dabei wird die DNA durch Aufkochen denaturiert. Nach Anlagerung von unspezifischen Hexanukleotiden als Primer erfolgt die DNA Synthese und Einbau des DIG 11'dUTP mit dem Klenow Fragment. Alle Gruppen, die das selbe Primerpaar untersuchen, vereinigen ihre gefällten PCR Produkte, so dass in dem Kurs lediglich zwei Labeling Reaktionen zur Herstellung der Sonden A und B angesetzt werden. Die Fällungsansätze von den PCR Reaktionen der gleichen Primerpaare werden vereinigt. In den Deckel des Tubes wird mit einer heißen Kanüle ein Loch gestochen. Der Ansatz wird 10 min im Wasserbad aufgekocht. Anschließend wird der Ansatz sofort auf ein Eis/Kochsalz Gemisch gestellt. Ein 0,5 ml Tube wird ebenfalls in das Eis/Kochsalz Gemisch gestellt und 15 µl der denaturierten DNA hineingegeben. Es wird folgender Ansatz auf dem Eis/Kochsalz Gemisch zusammen pipettiert:


Start « Ferienwohnungen Riedmann ****\nHeißer Sommer 2015\nNeue Heizung 2013\nKindertag auf dem Bauernhof 2013\nWillkommen auf unserem Bauernhof! Wir sind ein Familienbetrieb im Vollerwerb. Wir freuen uns, in unseren beiden Ferienwohnungen Gäste zu begrüßen, die sich auf unserem Hof mit den Pferden, Hühnern, Katzen, Hasen und Meerschweinchen wohlfühlen möchten, oder die einen Einblick in die aktive Landwirtschaft haben möchten. Natürlich steht auch viel Platz zum Entspannen in unserem kleinen ruhigen Dorf Massenbuch zur Verfügung. Aber überzeugen Sie sich selbst… viel Spaß auf unserer Internetseite. Wir freuen uns auf Ihre Kommentare.\nSieglinde und Arthur Riedmann\n8 comments to Start\n29. Mai 2016 at 17:14\nUnser 5. Urlaub in 6 Jahren geht heute zu Ende. Wieder einmal haben wir aufregende, aber auch entspannende und erholsame Tage bei Euch verbracht. In diesem Jahr sind wir das erste Mal die Fronleichnamsprozession mitgegangen. Bei herrlichem Sonnenschein war das für uns alle ein wunderschönes Erlebnis.\nUnsere beide Kinder (6 und 9 Jahre) waren wieder völlig begeistert: Kühe und Ziegen füttern, Hühner “eintreiben” und Eier suchen oder einfach nur in der Spielscheune oder auf Eurem kleinen aber feinen Spielplatz herumtollen. Derweil konnten wir Eltern uns entspannt im Liegestuhl ausruhen und am Ende sind alle zufrieden. Was will man mehr?! Wir freuen uns schon auf ein Wiedersehen mit Euch- Bis bald! Familie Schlüter aus Lippstadt\n4. Januar 2016 at 15:32\nLiebe Sieglinde, Lieber Arthur,\nVielen Dank für Euren herzlichen Empfang und die wunderbare Zeit bei Euch! Es hat uns einen riesigen Spass gemacht und wir freuen uns schon auf den nächsten Jahreswechel bei Euch!!\nLiebe Grüße von Lisa (Karin & David), Emilia (Peggy & Timo) sowie Louis, Matilda und Emilie (Anke & Staphan)\n6. Juli 2015 at 14:13\nBald kommen wir zum dritten Mal auf Euren schönen Bauernhof. Die Kinder können es kaum erwarten und zählen schon die Tage. Auch wir Erwachsenen freuen uns auf eine erholsame Zeit bei Euch. Liebe Grüße die Kaspers\n17. Mai 2015 at 18:40\nLiebe Familie Riedmann, im Namen meiner Familie mit Kindern und Enkelkindern möchte ich mich für den erholsamen Kurzurlaub, den wir Anfang Mai auf Ihrem Hof verbringen konnten, bedanken! Die Tiere, die Strohscheune für die Kids, Schwenkgrill und vieles Sehenswerte mehr in Ihrer Wirtschaft – alles war ideal … und wir kehren bestimmt wieder einmal bei Ihnen ein. Bleiben Sie schön gesund. Herzliche Grüße aus Magdeburg\n24. Dezember 2014 at 20:22\nWünsche ein Frohes Weihnachtsfest.lg von Wolfgang u.Kerstin.\n21. September 2013 at 10:28\nHallooo Herr und Frau Riedmann !!\nIch bin soeben auf ihre Seite gestoßen und dachte mir ich muss unbedingt ganz liebe Grüße hinterlassen!!\nIch hoffe sie erinnern sich an die Familie Hock:) Wir waren ja ständig bei ihnen damals..\nJetzt sind wir zwar alle fast erwachsen, allerdings sind sie und die wunderschöne Zeit bei ihnen immernoch oft Thema !\nIch hoffe ihnen geht es blendend.\nIch freue mich über eine email wenn sie die Zeit finden\nGanz, ganz liebe Grüße !\n26. April 2013 at 18:29\nWir haben ein herrlicher Urlaub gehabt in Massenbuch! Die Familie Riedmann ist sehr freundlich und behilfsam: die Gäste können alles sehen und selbst erleben. Der Bauernhof hat viele verschiedene Tiere und abwechselende Tätigkeiten (Obstanbau, Ackerbau, Production von Apfel- und Birnensaft). Dieser Betrieb ist nicht wirklich groß: damit bleibt der übersichtlich. Deswegen gerade geeignet für Kinder! Das appartement ist sehr breit, sauber und komplett möbliert. Die Umgebung ist ruhig und schön: mann lauft in wenige Minuten in den Wald oder stiegt bergabwärts nach die schöne kleine Stadt Gemünden am Main (nur 4 km. Weit!). Auch schöne Stadte wie Karlstad oder Lohr am Main sind sehr interessant. Mann kann bequem fahren mit einem Rad entlangs der Main und genießen von einem Kaffee oder Bier auf der Terasse. Unserem Urlaub auf diesem Bauernhof sollen wir nicht schnell vergessen. Familie Oosterhuis, Alkmaar, Die Niederlande\n26. April 2013 at 18:28\nHerrliche Ferien, vielen Dank, liebe Familie Riedmann! Die Kinder konnten sich von Hänsel und Luna kaum losreißen, wir Erwachsenen hatten daher erholsame Stunden im Liegestuhl…wir freuen uns schon auf den nächsten Aufenthalt in der schönen Katzenstube!\n0 queries. 1,099 seconds.


Auszug - Jahresabschluss 2018 sowie Gesamtentlastung der Bürgermeisterin bzw. des allgemeinen Stellvertreters\nSVV/0052/2019 Jahresabschluss 2018 sowie Gesamtentlastung der Bürgermeisterin bzw. des allgemeinen Stellvertreters\nDie Leiterin des Rechnungsprüfungsamtes, Frau Monika Langhammer, gab einen umfassenden Bericht zur Prüfung.\nAuf Bitte von Herrn Auerswald wird die Dokumentation der Niederschrift beigefügt.\nHerr Hay kündigte an, dass sich die AfD-Fraktion enthalten wird, da die Zeit zu knapp war die Jahresrechnung vollständig zu prüfen.\nHerr Kostrewa richtete seinen Dank an den gesamten Finanzbereich.\nDie Stadtverordnetenversammlung beschließt gemäß § 82 Absatz 4 der Kommunalverfassung des Landes Brandenburg (BbgKVerf) den geprüften Jahresabschluss der Stadt Forst (Lausitz) für das Haushaltsjahr 2018\nDie Stadtverordnetenversammlung Forst (Lausitz) erteilt der Bürgermeisterin der Stadt Forst (Lausitz) bzw. dem allgemeinen Stellvertreter entsprechend § 82 Absatz 4 der Kommunalverfassung des Landes Brandenburg (BbgKVerf) die Entlastung für das Haushaltsjahr 2018.\nAbstimmungsergebnis zu Beschlussvorschlag 1:\nAbstimmungsergebnis: 21/0/6, einstimmig, lt. Beschlussvorschlag 1 angenommen\nAbstimmungsergebnis zu Beschlussvorschlag 2:\nAbstimmungsergebnis: 19/0/7, einstimmig, lt. Beschlussvorschlag 2 angenommen


Du hast nach LIDIA gesucht « Befreit leben!\nSuchergebnisse für: LIDIA\nBrechen und das Gelenk operieren … so die Aussage der Ärzte!\nHeidelBear 5. Mai 2019 31. Dezember 2019 Besessenheit & Heilung, Kunden, die befreit leben!, Schmerzen\nKonventionell (v)erzogen! Ich komme als Kind von Winzern auf die Welt. Nach christlich-ethischen Moral-Vor-Stellungen erzogen, weiß ich schon früh: Ich soll einmal das Weingut meiner Eltern übernehmen. Mein zukünftiger Werdegang steht fest! So lasse ich mich dazu bringen, eine Ausbildung zum staatlich geprüften Weinbautechniker zu


DocSetMinder® auf der it-sa 2018 – drei Tage im Zeichen von BSI IT-Grundschutz und EU-DS-GVO - Deutscher Presseindex\nDocSetMinder® auf der it-sa 2018 – drei Tage im Zeichen von BSI IT-Grundschutz und EU-DS-GVO\nFirma Allgeier CORE GmbH (vormals GRC Partner GmbH) 30. Oktober 2018\t No comments\nInformationssicherheit deutlich im Fokus\nDas Auslaufen der BSI-Standards 100-x und der nun in vielen Organisationen bevorstehende Umstieg auf die Standardreihe 200-x sorgten für reges Interesse und hohe Besucherzahlen vor den Bildschirmen der Kieler Unternehmensberatung GRC Partner GmbH. Vertreter von Behörden, Forschungs- und Lehranstalten, kleinen Unternehmen und etabliertem Mittelstand tummelten sich zu Stoßzeiten zwischen Vorträgen und Keynotes am Stand 10.0-429, um sich die Umsetzung des modernisierten BSI IT-Grundschutzes mit IT-Grundschutz-Kompendium präsentieren zu lassen.\n„Das besondere Augenmerk der Besucher lag auf der Abbildung des überarbeiteten Schichtenmodells. Wir nahmen uns die Zeit und erstellten Zielobjekte, führten Schutzbedarfsfeststellung und -Vererbung durch, modellierten Bausteine aus dem Kompendium und zeigten auch die Risikoanalyse. Es war uns wichtig, unsere Vorstellung nicht mit PowerPoint und Hochglanzbroschüren, sondern mit konkreten Beispielen zu untermauern. Abschließend präsentierten wir das Ergebnis unserer exemplarischen Erhebungen als Management-Berichte, Export nach MS Office Word und in Web-Ansicht.“ – erklärte Detlef Hösterey, Leiter Beratung bei GRC Partner GmbH, nach Abschluss der Nürnberger IT-Sicherheits-Messe.\nZwar ist das neue, europäische Datenschutzrecht seit mittlerweile fünf Monaten wirksam, dennoch reißt das Interesse an einer geeigneten Lösung für die Planung, Umsetzung und Dokumentation der EU-DS-GVO nicht ab. Betriebliche Datenschutzbeauftragte und externe Berater mit Datenschutzmandat informierten sich auf der it-sa 2018 über die Möglichkeiten einer softwaregestützten Abbildung der Maßgaben zum Schutz personenbezogener Daten. Die GRC Partner GmbH präsentierte ihr unter Mitwirkung von Rechtsanwälten und mit Hilfestellungen der schleswig-holsteinischen Datenschutzbehörde konzipierte und entwickelte Rahmenwerk – das DocSetMinder®-Modul „EU-DS-GVO“. In den Vordergrund der Vorstellung rückten insbesondere ein generisches Verzeichnis von Verarbeitungstätigkeiten und die Reporting-Funktion für strukturierte Übersichten über die in der Organisation verarbeiteten Datenkategorien, betroffenen Personengruppen, ausstehenden Datenschutz-Folgenabschätzungen und unterstützenden DV-Systeme.\nSie haben es nicht geschafft, den Stand der GRC Partner auf der it-sa 2018 zu besuchen? Vereinbaren Sie einen kostenlosen Termin und lassen Sie sich in einem unverbindlichen Webinar die Umsetzung von BSI-Standards 200-x und EU-DS-GVO mit der Compliance Management Software DocSetMinder® vorführen -> DocSetMinder kennenlernen.\nPiotr W. Nürnberg\nPosted in SicherheitTagged bsi 200-2, bsi 200-3, BSI IT-Grundschutz, docsetminder, eu-ds-gvo, modernisierte IT-Grundschutz\nBeim Landeswettbewerb erfolgreich: 23 Handwerkerinnen und Handwerker landen ganz vorn\nWinterliche Bräuche der italienischen Schweiz


9. Juli 2018 | 11.51 Uhr\nAm Sonntag, dem 8. Juli, gegen 18:45 Uhr, kam es auf dem Kundenparkplatz eines Verbrauchermarktes an der Daniel- Goldbach- Straße in Ratingen- Tiefenbroich zu einem Verkehrsunfall mit zwei Verletzten.\nNach Angaben der Unfallbeteiligten "übte" eine 20- jährige Frau aus Düsseldorf, die nicht im Besitz einer gültigen Fahrerlaubnis ist, mit einem 3er BMW eines Bekannten das Autofahren auf der leeren Parkfläche. Dieser saß zu diesem Zeitpunkt auf dem Beifahrersitz.\nEr griff der Fahrerin während der Fahrt plötzlich ins Lenkrad und lenkte den BMW nach rechts, welcher daraufhin gegen einen Metallpfeiler einer Parküberdachung prallte. Durch die Wucht der Kollision wurde der Frontbereich des BMW massiv beschädigt. Hierbei wurde die 20- jährige Fahrerin leicht und der 22- jährige Beifahrer schwer verletzt. Er wurde mit einem Rettungswagen in ein Krankenhaus gebracht, in welchem er stationär verblieb.\nAn dem nicht mehr fahrbereiten BMW entstand ein Sachschaden in Höhe von 8.000 Euro. Die Ratinger Feuerwehr erschien vor Ort und streute ausgelaufene Betriebsmittel ab. Die Beamten fertigten gegen die 20- Jährige als auch gegen den Halter des Fahrzeuges eine Anzeige.


„Gott anders erleben“: Kulinarische Themen-Abende im ev.-luth. Kirchenkreis Hittfeld - Seevetal\n17. Mai 2022, 11:01 Uhr\nPastorin Anja-Désirée Lipponer ist eine der Oganisatorinnen der Themen-Reihe „Gott anders erleben“ der Ev.-luth. Kirchengemeinde Hittfeld\nFoto: A. Lipponer\nDie Ev.-luth. Kirchengemeinde Hittfeld lädt zu einer neuen Themen-Reihe mit dem Titel „Gott anders erleben“ ein. „Wir probieren kulinarisch gemeinsam etwas aus und lassen uns gleichzeitig von Bibeltexten dazu inspirieren“, sagt Pastorin Anja-Désirée Lipponer, die die Abende gemeinsam mit Pastorin Martina Wüstefeld organisiert. Der erste Abend dieser Reihe ist am Mittwoch, 18. Mai. Die weiteren Termine sind der 22. Juni und der 6. Juli.\nGott der Schöpfer – Ernährung der Zukunft – Mittwoch, 18. Mai um 19 Uhr\n„Wenn unser Planet langfristig erhalten bleiben soll, müssen wir überlegen, wie wir die Schöpfung besser bewahren können. Ein wichtiger Baustein ist dabei eine Ernährungsumstellung“, sagt Pastorin Lipponer. Am Abend werden Alternativen zum klassischen Fleischkonsum getestet. Treffpunkt ist das Gemeindehaus Fleestedt (Westpreußenweg 17).\nJesus Christus – Essen in Gemeinschaft – Mittwoch, 22. Juni um 19 Uhr\nJesus hat mit den unterschiedlichsten Menschen an außergewöhnlichen Orten zusammen gegessen und getrunken. Am Abend wird gemeinsam Brot gebacken und in gemütlicher Runde gegessen. „Und damit es nicht beim Brot allein bleibt, wäre es schön, wenn wir das Büffet durch selbstgemachte Leckereien ergänzen könnten“, sagt Anja-Désirée Lipponer. Treffpunkt ist das Gemeindehaus Hittfeld (Schillerplatz 4).\nUm Anmeldung bis 15. Juni wird gebeten: anja.lipponer@kirchengemeinde-hittfeld.de\nHeiliger Geist – Geistvolle Getränke – Mittwoch, 6. Juli um 16.45 Uhr\nDer Geist Gottes weht, wo er will. „Manchmal halten sich Menschen für besonders geistreich, wenn sie Alkohol getrunken haben. Wir finden: Das eine schließt das andere nicht unbedingt aus“, sagt Pastorin Lipponer. Gemeinsam macht sich die Gruppe auf die Suche nach dem Geist Gottes, bekommt in der NORDIC-Brennerei in Horneburg einen Einblick in das Handwerk der Destillierung und nimmt an einer Verkostung teil. Treffpunkt ist an diesem Abend der Bahnhof Hittfeld, mit dem Metronom geht es dann nach Horneburg.\nUm Anmeldung bis 29. Juni wird gebeten: martina.wuestefeld@kirchengemeinde-hittfeld.de\nMaschenFleestedtZeugen gesuchtSeevetalLandkreis HarburgGlüsingenKonzertMeckelfeldRamelslohKindertagesstätteUnfallPolizei


Apfel (Malus) ‚Golden Hornet‘ | Pflanzen Enzyklopädie\nBeschreibung: Apfel ‚Golden Hornet‘ ist eine schnell wachsende, dekorative Sorte mit lockerer Krone und aufrechten Zweigen, sie erreicht bis 5 m Höhe und 3,5 m Breite. Die hellrosafarbenen, einzelnen Blüten erscheinen im Mai. Die Blätter sind hellgrün, im Herbst färben sie sich rötlich, besonders zierlich sind die kleinen gelben Äpfel, die am Baum hängen bleiben auch wenn die Blätter schon abfallen.\nMan kann sie auch für Eingemachtes verwenden.\nPflege: Apfel ‚Golden Hornet‘ ist winterhart. Die Stelle sonnig. Der Boden fruchtbar, sandig-tonig, durchschnittlich feucht, der pH-Wert sollte bei 5-6,5 liegen. Dieser Apfel ist recht anspruchslos gegenüber der Bodenart. Apfel ‚Golden Hornet‘ muss nicht immer geschnitten werden. Den Schnitt kann man im Frühling (spätestens in Juni) durchführen. Mann sollte nur die wilden Triebe entfernen. Im Winter sollte man alle Obstbaüme kalken. Auf unserer Gartentipps-Seite erklären wir, wie wir Apfelbaum schneiden sollten.\nKrankheiten und Schädlinge: Diese Sorte ist resistent gegenüber Krankheiten. Äpfel werden meistens von Schorf, Mehltau oder Feuerbrand angegriffen. Erfahren Sie auch mehr zum Thema Apfelschorf bekämpfen.\napfelbaum beschneiden, apfelbaum kaufen, apfelbaum pflanzen, apfelbaum schneiden, apfelbaum schneiden wann, apfelbaum veredeln, apfelbäume, apfelbäume schneiden, apfelbaumschnitt, baum pflanzen, baum schneiden, bäume pflanzen, bäume schneiden, baumschnitt wann, Garten Pflanzen, heidelbeeren pflanzen, obstbaum pflanzen, obstbaum schneiden, obstbäume beschneiden, obstbäume düngen, obstbäume kaufen, obstbäume pflanzen, obstbäume schneiden, obstbäume veredeln, pflanze mit a, pflanze mit anfangsbuchstabe a, pflanzen mit a, wann apfelbaum schneiden, wann bäume schneiden, wann obstbäume schneiden, winterharte Pflanzen