Life Changes -1D - Rygter og shoppingtur - Movellas\n2. Rygter og shoppingtur\nJeg vågnede næste morgen, ved at min iPhone lå og ringede. Jeg åbnede mine øjne og kiggede forvirret rundt da jeg kom i tanke om at min iPhone ringede. Jeg rakte ud efter den da den lå mit sofabord, jeg tog den "Ja?" spurgte jeg træt "Hej Mollee, det er Louis" sagde Louis "Hej Louis, hva´ så?" spurgte jeg og kiggede efter Josefine, da hun ikke lå i sofaen mere "Jeg ville bare lige høre om du har set bladene her til morgen og nyhederne for den sags skyld?" spurgte han, jeg kiggede forvirret ud i luften "Nej? Skulle jeg det?" spurgte jeg og prrøvede rækkee ud efter min fjernbetjening, men røg i stedet på gulvet, med et skrig "Hvad skete der?" spurgte Louis "Ikke noget, men hvad står der i bladene?" spurgte jeg og ømmede mig "Kan du komme hen til mig og drengene?" spurgte han "Hvornår?" spurgte jeg "I dag, ved 13-14 tiden" sagde han "Hvad er klokken nu?" spurgte jeg "Den er 11" sagde han "Okay, det kan jeg godt" sagde jeg "Er du lige stået op eller hvad, du virker meget forvirret" sagde han "Du vækkede mig faktisk, jeg faldt i søvn på sofaen sammen med min bedsteveninde men hun er her ikke mere, så jeg skal lige have fundet hende, hun skal lave morgenmad til mig" sagde jeg, han grinte lidt "Okay, men jeg bliver nød til at løbe, jeg sms´er adressen til dig" sagde han "Okay, vi ses Louis" sagde jeg "Vi ses Molls" sagde han og lagde på, jeg lagde min iPhone op på mit sofabord og rejste mig for mit ellers så dejlige gulvtæppe. Jeg gik ind på mit værelse og kunne høre nogen ude på mit badeværelse, jeg åbnede døren og så Josefine stå og ligge make-up "Godmorgen Molls" sagde hun "Godmorgen Jose" sagde jeg og gik ud fra badeværelset igen. Jeg åbnede døren til mit Walk-in closet og kiggede rundt "Vi skal ud og shoppe i dag" sagde hun ude fra badeværelset "Hvorfor og hvornår?" spurgte jeg og fandt et par sorte shorts som jeg skiftede ud med de andre "Jeg mangler en kjole" sagde hun "Jamen, jeg skal nået klokken 13" sagde jeg "Hvad skal du?" spurgte hun, jeg tog min gamle bluse af og tog en croptop på i hvid med det amerikanske flag på. "Jeg skal hen til Louis og de andre drenge" sagde jeg og tog mine sorte lave Converse og gik ud og lukkede døren efter mig "Og hvad?" jeg satte mig hen til mit make-upbord og fjernede det gamle make-up og tog noget nyt på som bestod af et lag puder, en lys øjenskygge, et lag flydende eyeliner, et flot lag mascara og rød læbestift. Mit hår lod jeg hænge løst ned af min ryg og rejste mig, jeg gik ud og gjorder mig helt færdig ude på badeværelset "Er du klar Molls?" spurgte Josefine ude fra min gang af "Ja" sagde jeg og gik derud, jeg tog min Jakke på og min Day taske over skulderen, som Mollee altid pakker for mig. Vi gik ud af døren og ned af de mange trapper til vi kom ud på gaden.\nVi gik ned af gaden, jeg boede tæt på byen, så der var ikke så langt "Vi tager først på Starbucks så jeg kan få en kop kakao" sagde jeg "Okay" sagde hun, vi gik ind på Starbucks, jeg bestilte min kakao, og gik den også hurtigt, vi gik ud igen og længere ned. Jeg stoppede op ved en der sælger blade og fik store øjne da jeg så Louis og jeg på stort set alle forsiderne "Hvad sker der Molls?" spurgte Josefine forvirret, jeg pegede på bladene, og tog mine solbriller på. Hun fik også store øjne "Wow" sagde hun og trak mig med videre. Vi gik ind i en kjole butik "Når, hvis du kigger derhenne, så kigger jeg herhenne, den skal være kort men heller ikke for kort, den skal være, rød, mærkeblå, hvid eller sort" sagde hun, jeg nikkede og gik til venstre og kiggede, jeg fandt et par stykker, men jeg kunne ikke rigtig tænke på andet end de blade jeg så, det var nok dem Louis mente.\nJeg gik hen til Mollee som også havde fundet nogen "Jeg prøver dem lige" sagde hun, jeg nikkede bare og satte mig på stolen foran prøverummet. Hun kom ud med den første, "Hvad synes du?" spurgte hun og kiggede sig i spejlet "Du er flot" sagde jeg, hun nikkede og gik ind igen.\nJeg sagde det samme om de næste 25. Hun fandt den perfekte kjole en time senere, jeg kom til at kigge på klokken og fik store øjne "Jeg bliver nød til at smutte, vi ses Jose" sagde jeg og krammede hende "Vi ses Molls" sagde hun. Jeg skyndte mig ud af kjole butikken og tog min iPhone op af lommen, jeg kiggede på den besked jeg fik af Louis, og nikkede for mig selv. Hans lejlighed lå tæt på min, det var faktisk kun to blokke fra min. Jeg gik derhen og var der efter 7 minutter cirka. Jeg gik ind af den store dør og op af trapperne til jeg var på den øverste etage fuldstændig som hjemme ved mig. Jeg bankede på og ikke langtid efter åbnede døren. Det var af Liam "Hej Mollee" sagde han og åbnede døren helt så jeg kunne komme ind "Hej Liam" sagde jeg, han krammede mig. Jeg tog min jakke og sko af og satte min taske på gulvet. Jeg fulgte efter ham ind i deres stue "Hej Mollee" sagde Niall, de rejste sig alle fra sofaen og kom hen og krammede mig, vi satte os hen i sofaen og jeg sad i mellem Liam og Harry "Hvad var det jeg skulle komme for?" spurgte jeg "Der er kommet rygter" sagde Niall "Ja, det er jeg godt klar over men jeg ved ikke om hvad" sagde jeg "De handler om Louis og dig" sagde Niall "Ja? Hvad er der med Louis og mig?" spurgte jeg "De tror at i er sammen, som kærester" sagde Niall, jeg kiggede med store øjne på ham "Må, jeg se nogen af bladende?" spurgte jeg "Selvfølgelig" sagde han og rakte mig 3, jeg tog det første og kiggede på forsiden, det var et billede af Louis og mig, hvor jeg sad på skødet af ham, overskriften var ´Det nye par´ jeg tog det næste hvor billede var et hvor, vi sidder vedsiden af hinanden og smiler til hinanden med overskriften ´Louis Tomlinsons nye flirt´ jeg rullede med øjne og tog det sidste, hvor der stod ´Louis Tomlinson og Mollee Gray sammen´ med et billede hvor vi krammer. Jeg smilte lidt og grinte også en smule, jeg lagde bladene på bordet og kiggede op på drengene "Hvad skal vi gøre ved det?" spurgte jeg "Vi har et interview senere med Ellen og hun vil helt sikkert spørger indtil det og der kunne vi jo så bare sige det som det er" sagde Liam "God ide" sagde jeg "Hvornår er det?" spurgte jeg "Om 2 timer" sagde han "Altså klokken 15" sagde jeg "Ja" jeg nikkede og lænede mig tilbage i sofaen "Du kunne jo fortælle lidt om dig selv imens" sagde Harry, "Okay, jeg hedder Mollee Gray, jeg er 21 år, jeg har fødselsdag d. 15 maj, jeg er danser, skuespiller og sanger, jeg er ægte blondine, jeg ser ikke min familie mere, kun min lillebror med det er meget sjældent, min bedsteveninde hedder Josefine, jeg er en akavet person og kommer tit ud for pinlige ting, jeg elsker at have det sjovt, min livret er pizza, jeg er 1.67 høj og jeg har fotografisk hukommelse" sagde jeg "Så det vil sige at du kan huske alt" sagde Niall "Ja, vi jeg tænker mig om" sagde jeg "Gør du tit det?" spurgte han "Hvis jeg skal være ærlig så nej" sagde jeg, han grinte lidt "Er du single?" spurgte Harry "Ja, det er jeg" sagde jeg og smilte til ham "Cool, hvad skal vi lave?" spurgte han "Det ved jeg ikke" sagde Liam "Hvad med at spille sandhed eller konsekvens?" spurgte Louis "Yay!" sagde jeg og klappede af glæde i hænderne "Okay, vi sætter og ned på gulvet i en rundkreds" sagde han, vi satte os på gulvet "Jeg starter!" sagde Niall, jeg grinte lidt "Zayn, sandhed eller konsekvens?" spurgte Niall "Sandhed" svarede Zayn "Hvem er smukkest herinde i rummet?" spurgte Niall, Zayn kiggede rundt og tænkte lidt "Jeg er ikke til drenge så jeg siger Mollee" sagde han "Awww, Zayn-mus" sagde jeg og grinte "Sandhed eller konsekvens, Louis?" spurgte Zayn "Sandhed" sagde han "Hvad tænkte du første gang du så Mollee?" spurgte han, jeg kiggede interesseret hen på Louis som tænkte lidt "Jeg tænkte at hun så sød ud og jeg fik ret" sagde han "Awww, hvor er du sød Lou" sagde jeg og smilte sødt til ham "Når, Nialler, sandhed eller konsekvens?" spurgte Louis "Sandhed" sagde Niall hurtigt "Øv! Hvis du skulle vælge en herinde og blive bedsteven med hvem skulle det så være?" spurgte Louis "I er jo allerede mine bedstevenner, så jeg tager Mollee" sagde Niall, jeg lagde mig ned på gulvet og kiggede op i loftet "Sandhed eller konsekvens Mollee?" spurgte Niall "Konsekvens" sagde jeg "Du skal snave Louis i 10 sekunder" sagde Niall "Okay" sagde jeg og satte mig op, jeg kravlede tværs over cirklen og hen til Louis som sad i skrædderstilling, jeg satte mig på ham, med mine ben til den ene side, jeg lagde mine arme om hans nakke, og kiggede ham i øjne, han nikkede og jeg kyssede ham, jeg udviklede det til et snav, og jeg må sige at han kysser godt, jeg kunne se en blitz i øjenkrogen "Sådan" sagde Niall, jeg trak mig, og smilte til Louis "Du har lidt læbestift om munden" sagde jeg "Liam hent lige en serviet" sagde jeg "Okay" sagde Liam og rejste sig, han kom tilbage med en og rakte mig den, jeg tørrede læbestiften af og vendte mig om så jeg lå imellem Louis ben "Når, det er kedeligt at lege nu, hvad skal vi nu lave?" spurgte jeg "Hvad med at teste hvor meget du kan huske?" spurgte Niall "Okay" sagde jeg, han rejste sig og kom tilbage med et kort spil "Nu blander jeg kortene" sagde han og gjorder som han sagde, han satte sig foran mig og rakte mig kortene "Jeg kender den godt" sagde jeg og kiggede kortene igennem og nikkede, jeg gav ham dem igen. Han smilte og kiggede på mig "Start" sagde han "Klør 2" sagde jeg og fortsatte sådan til der ikke var flere kort, drengene kiggede imponerede på mig "Okay, så prøver vi noget andet" sagde han og rejste sig og kom tilbage med en bog, jeg kiggede forvirret på ham "Hvad skal du med den?" spurgte jeg "Vent, jeg skal ikke læse den vel?" spurgte jeg "Nej, du skal kun læse bagsiden også fortælle mig den fuldstændig ordret" sagde han, jeg nikkede og tog bogen, jeg læste bagsiden igennem og gav ham den igen, han vendte bogen og kiggede på bagsiden og nikkede "Denne bog handler om" sagde jeg og fortalte ham det "Rigtigt" sagde han og lagde bogen hen til kortene, Harry, Zayn og Liam havde sat sig hen omkring Louis og jeg også, jeg kunne mærke at min iPhone viderrede i min baglomme, jeg tog den op og så at jeg havde fået en besked fra twitter, jeg låste den op og gik på twitter, jeg var blevet taget i et opslag fra @niallofficial. Jeg gik ind på den og så et billede af Louis og jeg hvor vi kysser, jeg kiggede på Niall med øjne der kunne dræbe "Det gjorder du bare ikke!" sagde jeg "Jo, det gjorder jeg" sagde han "Gjorder hvad?" spurgte Louis "Han lagde et billede ud af os 2 med teksten #Love is in the air!<3.... Just kidding, we playing thruth or dare!<3<3 @MollsGrayy # og billede er et hvor vi kysser" sagde jeg og rakte ham min mobil, han grinte lidt og gav mig den igen "Har du set hvad Harry har lagt op?" spurgte han "Nej" sagde jeg og kiggede på min iPhone og det første jeg så var et billede af min røv hvor jeg kravler hen over gulvet med teksten #Looking good @MollsGrayy <3<3# jeg kiggede på Harry og rakte fuck til ham "Jeg for min hævn" sagde jeg "Det bliver efter interviewet for vi skal afsted nu" sagde Liam, vi rejste os op og gik alle sammen ud i gangen, jeg tog min jakke og Converse sko på, det samme gjorder de andre, vi gik sammen ud af døren og ned af trapperne, jeg stoppede da vi var noget halvvejs "Er der ikke en der vil bære mig?" spurgte jeg og lavede hundehvalpe øjne "Så lad mig" sagde Harry, jeg jublede og hoppede op på hans ryg.\nVi kom ned på gaden og jeg hoppede ned fra Harrys ryg. Vi gik hen til deres bil og satte os ind "Søde venner der er kun plads til 5" sagde jeg "Så sæt dig på skødet af en" sagde Niall, jeg trak på skulderene og satte mig på ham. Vi lukkede dørene og Liam kørte.\nVi var der efter en halvtime, vi steg ud af bilen og gik ind, vi blev straks vist hen til et omklædningsrum, drengene fik lagt noget make-up, og jeg prøvede at holde mit grin inde. Da de var færdige med det kom de om bag scenen og fik sat mikrofoner på sig "Vi ses Molls" sagde drengene "Ses" sagde jeg og satte mig hen i en sofa hvor der var et lille TV så jeg kunne se hvad der skete derude, jeg satte min taske vedsiden af mig. Hun præsenterrede drengene og de gik ind, de vinkede til publikum og hilste på Ellen, de satte sig og sad pænt klemt i den lille sofa. Hun spurgte indtil deres album osv. "Når drenge, eller Louis, jeg høre at du har mødt en sød pige" sagde hun og kiggede med et sjovt blik på Louis "Hun hedder Mollee Gray?" spurgte hun "Ja, det gør jeg" sagde han "Ja, det tror jeg vidst også" sagde hun, de grinte lidt "Og i er sammen?" spurgte hun "Nej, det er ikke helt rigtigt" sagde hun "Jo det er det" sagde han "Du kan selv spørger hende, hun sidder omme bag ved" sagde han "Ja, det kan jeg jo så gøre. Mollee Gray kom venligst her ud" sagde hun, jeg sukkede og tog min jakke af og lagde den ved min taske og rejste mig jeg, jeg gik hen hvor de der døre åbner og de åbnede sig, jeg gik ud og vinkede til publikum, jeg gik hen til hende, hun rejste sig og krammede mig kort, jeg vendte mig mod drengene og sukkede "Du må sidde på skødet" sagde Louis, jeg rullede med øjne og satte mig på hans skød "Når Mollee, er det rigtigt at dig og Louis ikke er sammen?" spurgte hun "Nej, vi er sammen og skal snart giftes" sagde jeg for sjovt, drengene kiggede med store øjne på og det samme gjorder alle andre "Ej, bare rolig, vi er ikke sammen på NOGEN tænkelig måde, vi mødte hinanden for første gang i går og blev så bare gode venner" sagde jeg og trak på skuldrene "Men, hvorfor sidder du så allerede på skødet af ham?" spurgte hun og viste et billede af mig der sidder på skødet af ham og vi smiler til hinanden "Og i smiler til hinanden" sagde hun "Fordi at han lige havde hjulpet mig op fra gulvet, og jeg sagde så tak til ham" sagde jeg, og løj en smule "I smiler jo til hinanden heletiden!" sagde hun og viste os en masse billeder, hvor vi smilte til hinanden "Ja, det er helt normalt at gøre, vi smiler da også til dig og du smiler til os" sagde Louis og grinte "Jamen det der er anderledes! Og her krammer i jo også og det ser altså også meget kæreste agtigt ud" sagde hun og viste os et endnu et billede hvor vi krammer "Der sagde vi altså bare farvel" sagde Louis "Hvad så med et her billede hvor du Mollee kravler hen i mod Louis, det ser altså også ret kæreste agtigt ud, prøv at se hvordan Louis smiler" sagde hun og viste os det "Vi legede sandhed eller konsekvens" sagde jeg og grinte lidt, jeg kunne mærke at Louis begyndte at nusse min ryg "Og det gjorder i også her?" spurgte hun og viste os et billede af os hvor vi kysser som var redigerede "De er falske, det eneste billede der er af hvor de kysser er det her" sagde Niall og rakte hende hans mobil "Aha, og der leger i også bare sandhed eller konsekvens?" spurgte hun "Ja" sagde jeg "Så må jeg vel tro på jer" sagde hun "Ja" sagde Louis "Men hvorfor sidder Louis så og nusser din ryg nu?" spurgte hun "Det ved jeg ikke spørg ham" sagde jeg "Louis?" spurgte hun "Det tænkte jeg ikke lige over at jeg gjorder, det gør jeg altid når der sidder en oven på mig" sagde han "Okay" sagde hun.\nDa interviewet var færdigt rejste vi os og gik om bag ved, jeg tog min jakke på og min taske over skulderen. Vi gik sammen ud til deres bil og satte os på de samme pladser som da vi kørte herhen. Da vi kom til drengenes lejlighed, steg vi alle sammen ud af bilen "Hvad er klokken?" spurgte Zayn, jeg tog min iPhone frem og kiggede "Den er lidt over 18" sagde jeg og så hvor mange opkald jeg har fået fra James, jeg ringede ham op og han tog den efter et par bib "Hej Mollee" sagde han "Hej, du har ringet et par gange" sagde jeg "Ja, det var for at spørger om hvad jeg skulle have på til Helenes og min date i aften men det har jeg fundet ud af, men jeg må løbe jeg skal ind til hende igen nu" sagde han "Er du på date nu?!" spurgte jeg overrasket og fulgte efter drengene op i deres lejlighed "Ja, men jeg må løbe. Vi ses" sagde han "Vi ses" jeg lagde på og lige som jeg havde gjort det ringede Josefine, jeg tog den "Molls? Jeg er mega nervøs!" sagde hun "Hør her! Det skal du ikke være, hvad er der at være nervøs for?" spurgte jeg og gik ind af døren, jeg fik med besvær min jakke og satte min taske og sko. Jeg gik ind i deres stue i mens jeg hørte hende snakke løs "Han er lækker, flot, klog og en masse andre gode ting" sagde hun "Du er da både lækker, flot, smuk, klog og en masse andre gode ting" sagde jeg "Det hjælper ikke! Han kan komme vært øjeblik! Tænk nu hvis han ikke kan lide mig" sagde hun "Og hvad så? Verden går ikke under bare fordi at en fyr ikke kan lide dig. Der er så mange andre lækre fyrer, hvis han ikke kan lide dig er det hans problem! Ikke dit! Du er en drømme pige! Jeg er sikker på at du nok skal finde en ny fyr hvis han ikke kan lide dig. Det er jo ikke fordi at det er dit livs kærlighed du skal møde nu vel?" sagde jeg "Tænk hvis han er mit livs kærlighed! Så møder jeg ham jo aldrig!" sagde hun "Nej, nej, nej! Det er ikke ham! Tro på mig! Det er ikke ham! Og hvis det er så er det jo bare dejligt! Hør her! Du er 23, du skal ikke tænke på det endnu, nu skal du bare tage ud og nyde en god date med god mad eller hvad i nu skal. Hvis han ikke kan lide dig er det hans problem, for du er en fantastisk pige og ikke mindst verdens bedsteveninde!" sagde jeg "Tusind tak Molls" sagde hun "Det var så lidt" sagde jeg og kiggede på drengene som fulgte intreseret med i vores samtale "Hov og lige et vigtigt råd!" sagde jeg "Hvad er det?" spurgte hun "Sørg for at det er HAM der betaler regningen hvis i skal spise noget eller bare noget der koster penge" sagde jeg "Hvorfor det?" "Fordi at hvis det er en skod date så har du ikke ofret noget andet end din tid" sagde jeg, hun grinte "Okay, vi ses Molls" sagde hun "Vi ses Jose, elsker dig" "Elsker også dig" jeg lagde på og lænede mig tilbage i sofaen med et suk "Var det din bedsteveninde der ringede?" spurgte Harry "Ja, hun var mega nervøs for en eller anden date med en fyr og ved i hvad? Lige før hun ringede havde James ringet til mig og sagt at han var på date med Helene" sagde jeg "Seriøst?" spurgte Louis "Ja! Men jeg synes at alle jeg kender skal på date lige i øjeblikket" sagde jeg, drengene grinte lidt "Jeg vil også på date" sagde jeg og lagde mit hoved i Louis skød og prøvede at spille trist "Så kan vi 6 dag bare tage på date" sagde Niall, jeg smilte og satte mig op "Kan vi?" spurgte jeg "Ja, vi skal vel også have noget aftensmad på et eller andet tidspunkt" sagde Louis "Yay! Kom!" sagde jeg og rejste mig, de andre gjorder det samme og gik med mig ud i gangen, vi fik hurtigt overtøj på, sammen med solbriller, vi skyndte os ned i bilen og vi sad på de samme pladser "Hvor køre vi hen?" spurgte jeg "Vi tager på Nandos" sagde Niall "Jaaa, Niall du er lige blevet min bedsteven!" sagde jeg og kyssede hans kind, han grinte og smilte til mig.\nVi kom derhen og drengene parkerede bilen, Niall og jeg nærmest væltede ud af bilen for at komme hurtigst muligt derind, de andre drenge grinte bare af os. Vi gik ind af døren og fandt et bord henne i hjørnet og satte os, jeg sad i mellem Niall og Louis med Harry overfor mig. Der kom hurtigt en tjener hen til os, vi bestilte og hun gik igen "Hvad skal du lave i morgen?" spurgte Harry "Hvorfor?" spurgte jeg "Spørger bare" sagde han "Okay, jeg skal træne, danse og ud og skøjte" sagde jeg "Ud at skøjte?" spurgte han "Ja" sagde jeg "Du ligner ikke en der kan skøjte" sagde han, jeg kiggede fornærmet på ham og sparkede ham over skinnebenet "Må jeg ikke komme med?" spurgte Niall "Selvfølgelig, jeg tror også at det bliver lidt sjovere hvis der er en med" sagde jeg og grinte, han nikkede.\nVores mad kom og vi begyndte at spise, Niall og jeg var de første færdige så vi begyndte at lege med suerørene i vores glas "Man skulle ikke tro at i var 21 og 22" sagde Liam "Man skulle heller ikke tro at du kun var 21" sagde jeg og rakte tunge, han rullede med øjne og kunne ikke lade være me at grine lidt, jeg fik pludselig et suerør lige i panden "Fik dig!" sagde Niall, jeg vendte hovedet om mod ham og tog mit suerør og prikkede ham på kinden "Hvorfor er du så god til denne her leg?" spurgte Niall "Det ved jeg ikke" sagde jeg "Hvad går det ud på?" spurgte Louis og lagde sin arm om på min stol "Det ved vi ikke" sagde vi i kor og grinte "I er skøre" sagde han "Ja, det er vi vel" sagde Niall.\nVi spiste færdigt og gik udenfor igen, vi satte os ind i bilen på vores pladser "Må jeg ikke få dit nummer?" spurgte Niall "Jo selvfølgelig" sagde jeg og vi udvekslede numre. Da vi holdte udenfor drengens lejlighed steg vi ud "Når drenge, jeg må nok hellere se at komme hjem" sagde jeg og smilte "Okay, men vi glæder os til at se dig igen" sagde Liam "I lige måde" smilte jeg, vi krammede farvel "Skal en af os følge dig hjem?" spurgte Louis "Det behøver i ikke, jeg bor lige derhenne" sagde jeg og pegede hen på nummer 2 blok "Okay, vi ses Molls" sagde Niall "Vi ses" sagde jeg og vendte mig om og begyndte at gå, da jeg var kommet hen til den miderste blok kunne jeg høre nogen komme løbene efter mig, jeg vendte hovedet og så Louis, jeg stoppede op og smilte "Jeg sagde at i ikke behøvede at følge mig hjem" sagde jeg "Det er jeg godt klar over, jeg var der selv" sagde han, jeg grinte lidt "Du har et sødt grin" sagde han og smilte til mig "Og du har et sødt smil" sagde jeg, han lagde armen om mig, vi gik lidt i tavshed, det var ikke en akavet tavshed, mere en hyggelig en.\nVi kom hen til døren indtil selve bygningen, jeg stoppede op og vendte mig mod ham "Så er vi her. Vi ses i morgen" sagde jeg "Vi ses Molls" sagde han og smilte, jeg bukkede mig ned da jeg stod på trappen for at kramme ham, men jeg fik overbalance og var stået på snotten hvis ikke Louis havde grebet mig på halvvejen. Jeg kiggede lige op i hans gråblå øjne "Du har egentlig nogen flotte øjne" sagde han "I lige måde" sagde jeg og smilte, og han gjorder det samme. Vi stod sådan i noget tid før han bukkede sig ned imod mig, vi kiggede hinanden i øjne hele tiden, indtil vores læber mødtes i et kys. Vi trak os og smilte, han hjalp mig op og stå "Vi ses Lou" "Vi ses Molls" vi smilte en sidste gang enden jeg gik ind af døren og op af de mange trapper.\nDa jeg kom op af trapperne åbnede jeg min dør, jeg smed mine sko og jakke og satte min taske. Jeg gik ind på mit værelse og ind i mit Walk-in closet og fandt mit nattøj som bestod af et par lyserøde bløde shorts, en lidt stor T-shirt med en enhjørning på. Jeg gik ud igen og ud på mit badeværelse, jeg tog nattøjet på og gjorder mig natklar. Jeg satte mit hår i en knold og lagde mig hen i min dejlige seng. Jeg lå og tænkte på mit og Louis kys, indtil jeg faldt i søvn.


Winston Churchill: fortaler for Europas Forenede Stater\nWinston Churchill, den tidligere britiske premierminister, der førte den britiske nation gennem anden verdenskrigs rædsler, var også fortaler for idéen om europæisk integration, og han var en af de første til at opfordre til oprettelsen af "Europas Forenede Stater".\n"Vi må opbygge en slags Europas Forenede Stater"\nNår man tænker på Winston Churchill, er det første, man kommer i tanke om, en respektindgydende skikkelse, der laver V-tegnet, mens han ryger en cigar. Denne populære gengivelse er dog blot én side af den tidligere militærofficer, krigsreporter og britiske premierminister. Churchill var en af de mange ledere, hvis oplevelser under krigen overbeviste ham om, at kun et forenet Europa kunne garantere fred.\nUnder en tale på Universitetet i Zürich i 1946 opfordrede Churchill europæerne til at vende ryggen til fortidens rædsler og rette blikket mod fremtiden. Han erklærede, at Europa ikke havde råd til at slæbe hadet og hævnlysten fra fortidens slag med sig. For ham var det første skridt mod genoprettelse af den "europæiske familie" med retfærdighed, barmhjertighed og frihed "at skabe en form for Europas Forenede Stater". Kun på denne måde ville flere hundrede millioner hårdtarbejdende mennesker kunne genvinde de enkle glæder og håb, der gør livet værd at leve.\nWinston Churchill på talerstolen i Zürich den 19. september 1946.\nLæs mere om Winston Churchills liv, arbejde og bidrag til det europæiske projekt\nTidligere premierministre – Sir Winston Churchill


E-Z Rent-A-Car - find billigste billeje fra E-Z Rent-A-Car i USA\nBiludlejningsfirmaer / E-Z Rent-A-Car\nSøg efter billeje hos E-Z Rent-A-Car\nE-Z Rent-A-Car som blev grundlagt i 1994, er i dag til stede i de fleste af de store lufthavne i USA samt en række andre lande, hvor de tilbyder et bredt bilsortiment.\nNem billeje i lufthavnen\nE-Z Rent-A-Car startede i 1994 med blot ni biler i Orlando Lufthavn i Florida. Her er de stadig til stede og har desuden oplevet en kraftig vækst, der betyder at du i dag kan bestille billeje fra E-Z Rent-A-Car i de fleste større lufthavne i USA og på en række internationale destinationer. I USA kan du udover Orlando for eksempel finde E-Z Rent-A-Car i Los Angeles Lufthavn (LAX) og John F. Kennedy Internationale Lufthavn.\nAt E-Z Rent-A-Car har valgt at satser på udlejning i lufthavne giver dog mening, da det for de fleste rejsende er det naturlige sted at afhente deres lejebil. Bestiller du din billeje hos E-Z Rent-A-Car, præsenteres du for et bredt udvalg af lejebiler i mange størrelser og prisklasser. Hvad enten du har brug for en lille, billig lejebil eller ønsker en eksklusiv køreoplevelse, er det således en mulighed.\nMarkedet for billeje i lufthavne er præget af hård konkurrence, og E-Z Rent-A-Car er da også blot et af mange biludlejningsselskaber, du kan finde i søgemaskinen her på Billeje.info.\nPriser på lejebiler fra E-Z Rent-A-Car\nI søgemaskinen på Billeje.info kan du hurtigt sammenligne priser på lejebiler fra E-Z Rent-A-Car med mange andre biludlejningsselskaber. Du skal blot vælge hvor og hvornår du ønsker at afhente din lejebil for at få et overblik over alle ledige biler og priser på biludlejning.\nE-Z Rent-A-Car startede i Orlando Lufthavn. Foto: brownpau, Creative Commons.\nKontaktinformation til E-Z Rent-A-Car\nVil du i kontakt med E-Z Rent-A-Car kan det ske på følgende adresse:\n2003 McCoy Road Suite A\nDu kan læse mere om E-Z Rent-A-Car på deres egen hjemmeside her\nDenne siden om E-Z Rent-A-Car blev sidst ajourført i sommeren 2014 med informationer indhentet fra firmaets egen hjemmeside, eksterne kilder og i mange tilfælde fra vores egne erfaringer. Har du tilføjelser eller gode tips til billeje igennem E-Z Rent-A-Car, som kan komme andre til gode, er du altid velkommen til at kontakte os, da vi ønsker at give så præcis og aktuel information som muligt. Du kan naturligvis også dele dine oplevelser ved at skrive et indlæg eller kommentar med anmeldelse af E-Z Rent-A-Car på vores blog om billeje. Brug eventuelt også vores blog til selv at få gode tips til finde den billigste biludlejning i USA, og ikke mindst til at få ideer til oplevelser på en bilferie.\nFor god ordens skyld tager vi forbehold for fejl og ændringer og anbefaler, at du altid læser aktuelle betingelser i lejekontrakten godt igennem, når du bestiller en lejebil hos E-Z Rent-A-Car eller andre selskaber.\nFind den billigste lejebil hos E-Z Rent-A-Car Sammenlign priser her


Inspiration - Woodif.dk\nDet kvadratiske bord\nVores bord og bænkeset er, hvis vi selv skal sige det, simpelthen så smart og praktisk. Kombiner det kvadratiske bord med bænke og taburetter som passer jer bedst.\nBordet, bænke og taburetter er alle lavet i vores smarte “klik”-koncept, så gør det simpelthen så nemt at finde frem når der er behov for at skabe ekstra spisepladser, skabe et rum for kreativitet, eller bare fri leg.\nDen lille skammel\nDen lille skammel er næsten magisk, den skaber forbindelse mellem de mindste og de voksne ved køkkenbordet, og gør det legende nemt at få teamworket omkring aftensmaden til at køre på skinner. Den er let og nem for selv små børn at flytte rundt på, det kan dog give lidt udfordringer hvis slikskabet ikke er placeret højt nok.\nDen gør mange andre opbevaringsmuligheder mere tilgængelige på børneværelset, så ungerne selv kan tage deres yndlings bog ned fra hylden.\nNår den ikke er i brug, står den bare i hjørnet og ser godt.


Undgå at blive snydt, når du lejer bolig – Gladsaxebladet\n18. sep 2019, 14:29\nSPONSORERET INDHOLD: Der kan være stor kamp om lejlighederne i de større danske byer. Det betyder desværre, at der er mange boligsøgende, som bliver snydt på forskellige måder, når de lejer bolig.\nHer er der nogle gode råd, som kan hjælpe dig med at undgå at blive snydt – både før og efter at du overtager boligen.\nDu kan også læse mere her, hvis du bare vil have gode råd til at finde den helt rigtige bolig.\nVær opmærksom, selvom du lejer gennem boligselskab\nMange føler sig mere trygge, når de finder en lejebolig igennem et boligselskab, men det er farligt at lade sig lulle ind i en falsk tryghed, fordi man handler med et boligselskab. Der findes mange boligselskaber, som ikke har et godt ry, og derfor skal du altid være opmærksom.\nKort sagt – følg også de følgende råd, selvom du vælger at leje bolig igennem en boligforening.\nTag altid ud og se boligen\nMange vælger at leje en bolig ud fra billeder, hvis de skal flytte til en by, som ligger langt væk. Det er dog risikabelt, for billeder kan snyde rigtig meget, og derfor bør du altid prioritere at tage ud og se lejligheden.\nDette trin er også vigtigt, fordi de gør dig i stand til at opdage eventuelle svindlere, som hverken ejer eller har adgang til den lejlighed, som skal udlejes.\nDet er en god idé at tage en snak med naboerne, når du er ude for at kigge på en lejlighed. Naboerne er ofte de personer, som kan fortælle mere om livet i lejlighedskomplekset, og som det vigtigste kan de fortælle, hvis der er ting, som ikke er optimalt – for eksempel, hvis det er svært at komme i kontakt med udlejeren, når der er problemer med lejligheden.\nBetal aldrig penge uden at have en kontrakt\nDu bør altid være på vagt, hvis en udlejer vil have dig til at udbetale penge, før lejekontrakten er underskrevet. Kontrakten er dit bevis på, at der er indgået en aftale, og uden den kontrakt kan udlejeren i princippet smutte med dine penge og blot sige, at det var en gave.\nDu må aldrig give penge før kontrakten er underskrevet, og du må aldrig betale kontant. Du bør øjeblikkeligt blive mistænksom, hvis udlejer vil have pengene kontant, for det vil betyde, at du ikke har noget bevis for, at pengene er blevet betalt.\nNår du overfører pengene via din netbank, har du et bevis på, at udlejer har modtaget pengene i overensstemmelse med lejekontrakten. Hvis udlejer bryder sin del af aftalen, vil du endda have mulighed for at tilbageføre pengene i nogle tilfælde.\nLejekontrakter ligner ofte hinanden, og du kan være tilbøjelig til bare at underskrive, hvis den ligner dine tidligere lejekontrakter. Du bør dog altid gennemlæse lejekontrakten, for der kan være punkter, der er anderledes end i din nuværende lejebolig.\nHusk på – en lejekontrakt er en et bindende juridisk dokument, og det er ikke en undskyldning, at du ikke har læst lejekontrakten.\nTag billeder af eventuelle fejl og mangler\nHvis du har fulgt de tidligere punkter, så har du forhåbentligt fået underskrevet din lejekontrakt og overtaget lejligheden. Det betyder dog ikke, at dit arbejde er forbi, for du venter det absolut vigtigste punkt, hvor mange bliver snydt.\nI de fleste tilfælde binder lejekontrakten dig til at tilbagelevere lejligheden i samme stand som ved modtagelsen. Derfor er det rigtig vigtigt, at du tager billeder af alle fejl og mangler, som der er ved overtagelsen. Ellers kan udlejer kræve, at du skal betale for reparationerne af fejlene, når du fraflytter lejligheden.\nFor at bevise, at fejlene var til stede ved overtagelsen, skal du tage billeder og sende dem med anbefalet brev til udlejer indenfor 14 dage fra overtagelsen.


Variationsinflationsfaktor (VIF) - Oversigt, formel, anvendelser\nVariationsinflationsfaktoren (VIF) måler sværhedsgraden af multikollinearitet i regressionsanalyse. Regressionsanalyse Regressionsanalyse er et sæt statistiske metoder, der anvendes til estimering af sammenhænge mellem en afhængig variabel og en eller flere uafhængige variabler. Det kan bruges til at vurdere styrken af forholdet mellem variabler og til modellering af det fremtidige forhold mellem dem. . Det er et statistisk koncept, der indikerer stigningen i variansen af en regressionskoefficient som et resultat af kollinearitet.\nVariansinflationsfaktor (VIF) bruges til at detektere sværhedsgraden af multikollinearitet i den almindelige mindst firkantede (OLS) regressionsanalyse.\nMultikollinearitet puster variansen og type II-fejlen op. Det gør koefficienten for en variabel konsistent, men upålidelig.\nVIF måler antallet af oppustede afvigelser forårsaget af multikollinearitet.\nVariationsinflationsfaktor og multikollinearitet\nI almindelig mindst kvadratisk (OLS) regressionsanalyse eksisterer multikollinearitet, når to eller flere af de uafhængige variabler Uafhængig variabel En uafhængig variabel er en input, antagelse eller driver, der ændres for at vurdere dens indvirkning på en afhængig variabel (resultatet) . demonstrere et lineært forhold mellem dem. For eksempel for at analysere forholdet mellem virksomhedsstørrelser og indtægter til aktiekurser i en regressionsmodel er markedsværdier og indtægter de uafhængige variabler.\nEn virksomheds markedsværdi Markedsværdi Markedsværdi (Market Cap) er den seneste markedsværdi af en virksomheds udestående aktier. Market Cap er lig med den aktuelle aktiekurs ganget med antallet af udestående aktier. Investeringssamfundet bruger ofte markedsværdien til at rangere virksomheder, og dets samlede indtægter er stærkt korreleret. Da en virksomhed tjener stigende indtægter, vokser den også i størrelse. Det fører til et multikollinearitetsproblem i OLS-regressionsanalysen. Hvis de uafhængige variabler i en regressionsmodel viser et perfekt forudsigeligt lineært forhold, er det kendt som perfekt multikollinearitet.\nMed multikollinearitet er regressionskoefficienterne stadig konsistente, men er ikke længere pålidelige, da standardfejlene er oppustet. Det betyder, at modelens forudsigelige effekt ikke reduceres, men koefficienterne er muligvis ikke statistisk signifikante med en type II-fejl Type II-fejl I statistisk hypotesetest er en type II-fejl en situation, hvor en hypotesetest ikke afviser nulhypotesen er falsk. I andre .\nDerfor, hvis koefficienterne for variabler ikke er individuelt signifikante - kan ikke afvises i henholdsvis t-testen - men kan sammen forklare variansen af den afhængige variabel med afvisning i F-testen og en høj bestemmelseskoefficient (R2), multikollinearitet kan eksistere. Det er en af metoderne til at detektere multikollinearitet.\nVIF er et andet almindeligt anvendt værktøj til at opdage, om der findes multikollinearitet i en regressionsmodel. Det måler, hvor meget variansen (eller standardfejl) af den estimerede regressionskoefficient er oppustet på grund af kollinearitet.\nBrug af variationsinflationsfaktor\nVIF kan beregnes ved hjælp af nedenstående formel:\nHvor R i 2 betegner den ujusterede determinationskoefficienten for regression den i'te uafhængig variabel på de resterende. Gensidigheden af VIF er kendt som tolerance . Enten VIF eller tolerance kan bruges til at opdage multikollinearitet afhængigt af personlig præference.\nHvis R i 2 er lig med 0, kan variansen af de resterende uafhængige variable ikke forudsiges ud fra den i'te uafhængige variabel. Derfor, når VIF eller tolerance er lig med 1, er den uafhængige variabel ikke korreleret med de resterende, hvilket betyder, at multikollinearitet ikke findes i denne regressionsmodel. I dette tilfælde pumpes ikke variansen af ith-regressionskoefficienten op.\nGenerelt indikerer en VIF over 4 eller tolerance under 0,25, at multikollinearitet muligvis eksisterer, og yderligere undersøgelse er påkrævet. Når VIF er højere end 10, eller tolerancen er lavere end 0,1, er der signifikant multikollinearitet, der skal rettes.\nDer er dog også situationer, hvor høje VFI'er sikkert kan ignoreres uden at lide af multikollinearitet. Følgende er tre sådanne situationer:\n1. Høje VIF'er findes kun i kontrolvariabler, men ikke i variabler af interesse. I dette tilfælde er variablerne af interesse ikke sammenhængende med hinanden eller kontrolvariablerne. Regressionskoefficienterne påvirkes ikke.\n2. Når høje VIF'er forårsages som følge af inkludering af produkter eller beføjelser fra andre variabler, forårsager multikollinearitet ikke negative virkninger. For eksempel inkluderer en regressionsmodel både x og x2 som dens uafhængige variabler.\n3. Når en dummyvariabel, der repræsenterer mere end to kategorier, har en høj VIF, findes der ikke nødvendigvis multikollinearitet. Variablerne vil altid have høje VIF'er, hvis der er en lille del af sagerne i kategorien, uanset om de kategoriske variabler er korreleret med andre variabler.\nKorrektion af multikollinearitet\nDa multikollinearitet opblæser variationen i koefficienter og forårsager type II-fejl, er det vigtigt at opdage og rette det. Der er to enkle og almindeligt anvendte måder til at korrigere multikollinearitet, som angivet nedenfor:\n1. Den første er at fjerne en (eller flere) af de stærkt korrelerede variabler. Da informationen fra variablerne er overflødig, vil bestemmelseskoefficienten ikke blive væsentligt forringet af fjernelsen.\n2. Den anden metode er at anvende hovedkomponentanalyse (PCA) eller delvis mindst kvadratisk regression (PLS) i stedet for OLS-regression. PLS-regression kan reducere variablerne til et mindre sæt uden sammenhæng mellem dem. I PCA oprettes nye ikke-korrelerede variabler. Det minimerer tab af information og forbedrer forudsigeligheden af en model.\nPrognosemetoder Prognosemetoder Topprognosemetoder. I denne artikel vil vi forklare fire typer indtægtsprognosemetoder, som finansielle analytikere bruger til at forudsige fremtidige indtægter.\nMultipel lineær regression Multipel lineær regression Multipel lineær regression refererer til en statistisk teknik, der bruges til at forudsige resultatet af en afhængig variabel baseret på værdien af uafhængige variabler\nTilfældig variabel Tilfældig variabel En tilfældig variabel (stokastisk variabel) er en type variabel i statistik, hvis mulige værdier afhænger af resultatet af et bestemt tilfældigt fænomen


VRANGFORESTILLINGER ➜ MAD\nIndmad er længe blevet spist, er en del af de foretrukne retter fra forskellige folkeslag i verden. På trods af dette er mange mistænksomme over for leveren, og foretrækker ikke at inkludere den i deres kost. I dag vil vi fjerne myterne om dette emne...\n5 Salt Myter\nBordsalt har været kendt siden oldtiden. På trods af folks mere end tætte bekendtskab med salt, har det længe været omgivet af mange myter og misforståelser. Lad os tale om de mest almindelige af dem...\nSeparat ernæring: misforståelser og fakta\nNæsten alle har hørt om, hvad separat ernæring er, hvis grundlægger er Herbert Shelton. Lad os se på essensen af denne teori, er det muligt at tabe sig med det, og er der en videnskabelig begrundelse for et sådant ernæringssystem...\nJo længere kommunisterne regerede i vores land, jo færre mennesker var der tilbage, som ville forstå vine, forviklingerne ved deres fremstilling og brug. Derfor har vi mange myter om vin, som vi vil overveje i denne artikel...\nMisforståelser og fakta om champagne\nDen champagne, der oftest pryder vores gilder, kan roligt kaldes mytisk, fordi det bare er mousserende vin, men ikke champagne. I denne artikel tager vi et kig på de vigtigste misforståelser og fakta om denne historiske drink...\nMisforståelser og fakta om kartofler\nKartofler er blevet kritiseret af nogle ernæringseksperter for deres høje stivelsesindhold, som angiveligt forstyrrer fordøjelsen. Der er også en opfattelse af, at kartofler bliver fede. Faktisk er dette ikke sandt, og i dag vil vi tale om fordelene ved dette produkt...\nInteressante fakta og misforståelser om yoghurt\nEt fermenteret mælkeprodukt kaldet yoghurt siges at være blevet drukket af de gamle babyloniere. Og selv da var yoghurtens gavnlige egenskaber kendt. I denne artikel vil vi se på alle de sundhedsmæssige fordele ved yoghurt og nogle misforståelser om yoghurt...\n10 grunde til at inkludere smør i din kost\nI flere årtier var vores landsmænd overbevist om, at brugen af smør har en negativ indvirkning på koronarkarrenes tilstand. Nylige undersøgelser har dog vist, at skaden af smør er meget overdrevet...\nDen bedste af diæter – sig til brød: "Nej!"\nFlere og flere sundhedsprofessionelle kommer til den konklusion, at brød i bedste fald er potentielt skadeligt eller ubrugeligt. I denne artikel vil vi tale om, hvorfor du skal gøre en fuldstændig afvisning af brød og melprodukter...\nHvorfor mælk er dårligt for helbredet\nHvis du bekymrer dig om dit helbred og foretrækker at leve længe, skal du kende sandheden om mælk. Der er al mulig grund til helt at fjerne det fra din kost. Læs mere om, hvad der er skaden ved mælk i denne artikel...\nVegetarisme forbyder eller begrænser forbruget af animalske produkter. I denne artikel vil vi ved hjælp af videnskabelige data tilbagevise alle vegetarernes argumenter om fordelene ved en plantebaseret kost...\nHvorfor frugtjuice ikke er sundt\nFrugtjuice anses for at være sundt på baggrund af, at de er lavet af naturlige frugter. Faktisk bør de udelukkes fra listen over sunde fødevarer. Hvorfor det? Find svaret i denne artikel...\n5 myter om bio-mærkede produkter\nMange mennesker er helt sikre på, at de og deres familier er sikret økologisk mad ved at vælge produkter mærket "bio", "øko" eller "økologisk". Desværre er dette ikke tilfældet, og i denne artikel vil vi aflive myterne om produkter af denne art...\nTe til vægttab: fremmer det vægttab?\nDer er påstande om, at slankende teer fjerner giftstoffer fra kroppen, stabiliserer og fremskynder stofskiftet og forhindrer optagelsen af fedtstoffer. Vi vil forsøge at finde ud af, hvor effektivt og sikkert det er for sundheden i denne artikel...\nTe er en af de mest almindeligt indtagede drikkevarer i mange lande rundt om i verden. Og, som det ofte er tilfældet, er nogle påstande blevet dannet blandt folket om brugen af te, som ikke har nogen videnskabelig bekræftelse...\nHvordan brygger man te korrekt?\nMange mennesker tror, at det ikke er svært at lave te. Vand kogte, hældte det i en tekande med teblade – og hele hemmeligheden. Faktisk, for at lave te af høj kvalitet, skal du kende nogle hemmeligheder og følge en række vigtige regler...\nHvad bestemmer farven på te? Fire typer te og deres forskelle\nSom du ved, kan te være af forskellige farver. Nogle mennesker tror, at det er forskellige teer, der er lavet af forskellige typer tebuske. Det er det faktisk ikke. Læs om hvordan grøn, sort, gul og rød te fås i denne artikel...\nEr krydret mad skadeligt?\nDet er generelt accepteret, at krydret mad er skadeligt for menneskets mave, og at krydret mad er fuldstændig kontraindiceret til patienter med mavesår. Imidlertid tvivlede amerikanske og indiske læger på dette...\nEr det godt at drikke mineralvand hele tiden?\nDe, der konstant bruger mineralvand til at slukke deres tørst, tager fejl og tror, at det er godt for helbredet. Dette er ikke helt sandt, og der er grunde til dette...\nInden for madlavning, som er så tæt på mange af os, da de fleste, hvis ikke alle, elsker at spise lækker mad, er der mange misforståelser. I denne artikel vil vi opdele nogle af dem...\n10 myter om kaffens effekt på menneskekroppen\nI løbet af de sidste årtier er kaffe gentagne gange blevet erklæret for enten meget skadelig eller yderst gavnlig. I denne henseende er der dukket mange myter om kaffens egenskaber og dens virkning på menneskekroppen op...\nPopulære misforståelser om alkoholholdige drikkevarer\nVi afkræfter de vigtigste misforståelser om fordelene ved alkoholiske drikke, nemlig at alkohol lindrer stress, forbedrer søvnen og sænker blodtrykket, og at alkohol ikke forårsager allergi og er nærende for vores krop...\nAlmindelige misforståelser om æg\nVi gør dig opmærksom på en række misforståelser forbundet med at spise et så populært produkt som æg...\nCadillac Lyriq den nye amerikanske luksus\nInteressante fakta om palmeolie\nSociale medier er ikke til at udsætte\nInteressante fakta om mariehøns\nHvordan krabber flygter fra muræner og blæksprutter\nForbedrer træningsbriller synet?\nChronophages: hvor bliver din tid af?\nMisforståelser om citroner


in\tMadplan\ton\t maj 8, 2016\t maj 8, 2016\nHvor er det ærgerligt, at den forlængede weekend med FANTASTISK vejr, er ved at være slut. Imorgen tager vi hul på en ny uge, som byder på en helt uges gæstedagpleje for Luca, en eksamen til Martin og en masse bachelor arbejde til mig. Jeg håber, at Luca kommer til at trives i gæstedagpleje. Det er første gang nogensinde, så jeg er meget spændt på at se hvordan hun reagerer på det ♥ I madplanen er der lidt mere sommermad, end der plejer. Det er slut med supper herhjemme, jeg synes, simpelthen ikke solskinsvejr giver lyst til en varm suppe. Vi kan dog da selvfølgelig stadig støde på kolde, blæsende regnvejrsdage, hvor det alligevel ender med en god suppe.\nMandag: Friskpasta vendt fløde, spinat og kylling. Dertil en salat af rucula, friske asparges, cherrytomater, frisk feta og basilikum\nTirsdag: Grillede rødspættefileter med timian, citron, salt og peber (pakkes ind i staniol) og grillede halverede kartofler med krydderi. Salat fra mandag\nOnsdag: Wok med oksekødstrimler, rødpeber, majs fra kolbe og forårsløg. Dertil basmatiris og hvidløgsbrød\nTorsdag: Rugbrød med stegt medister og rødkål eller rester\nFredag: Svinefars i savoykålspakker med kogte nye kartofler vendt i smør og dild. Dertil ovnbagte porrer med hvidløg, timian, salt, peber, smør, som vendes i en blanding af olie, eddike, salt og peber til sidst\nLørdag: Falafler i fladbrød med masser af frisk salat, grøntsager og cremefraiche\nSøndag: Sandwich med pocherede æg, røget laks, avokado, dild og salat\n← Rabarbertærte med marengs\nLækker wokret med oksekød →


Designers & Friends samarbejder med Novicell\nOnline mode- og designoutlet\nDesigners & Friends tiltrækker kunder med et fuldt optimeret website, en stærk webshop og effektiv online markedsføring.\nDa den danske modeshop og kundeklub Designers & Friends havde et behov at supplere kundeklubbens udslagsprodukter med flere nye sæsonvarer til de forskellige køn og aldersgrupper måtte der nye midler til: Justeringerne krævede en helt ny arkitektur, som kunne tage højde for at bazaren med ekstra nedsatte varer blev en fast del af webløsningen.\nI samarbejde med Novicell fik Designers & Friends bygget et nyt website med et lækkert design og en ny, konverteringsoptimeret webshop. Novicell lavede det nye website som en Umbraco webløsning med en integreret uCommerce shop.\nNyt webløsning understøtter forretningsmodel\nI forhold til valget af platform faldt det på en fleksibel open source-løsning, så Designers & Friends selv kan foretage hovedparten af ændringerne på sitet. Herudover er det vigtigt, at den nye shopløsning er skalérbar og indeholder sprogversionering, så virksomheden på sigt kan lancerer i udlandet.\nBlandt smarte features har den nye webløsning:\nSigns of trust (e-handelsmærket, trustpilot, facebook likes)\nLazy load af produktsider, hvor vigtigste elementer hentes først for at øge hastigheden på shoppen\nDertil kommer en langt hurtigere loadtid, hvilket er afgørende for både visninger i søgemaskinerne, brugervenlighed og konverteringsfrekvens.\nAdfærdsdata fra marketing styrker udviklingsprocessen\nOnline marketing-samarbejdet startede op 3 måneder inden launch af det nye website.\nAnalyse af trafikdata og brugeradfærd har været fundamentet til at kunne strukturere sitets indhold og udvikling af nye features på baggrund af data. Det er da også en metode, Novicell anbefaler alle sine kunder.\nSamarbejdet mellem Novicell og Designers & Friends har både indebåret lanceringen af et responsivt website, en brugervenlig webshop og en række online marketingindsatser.\nFleksibelt website med gode søge- og filtreringsmuligheder samt hurtig loadtid.\nWebshop integreret med Post Danmark og med relevante 'signs of trust'.\nSEO, konverteringsoptimering, e-mail marketing og online kampagner.\nOnline marketing skaffer medlemmer og salg\nForuden selve udviklingsopgaven har Designers & Friends en fast samarbejdsaftale med Novicells online markedsføringsafdeling om en kombineret indsats, der øger trafikken på websitet, skaffer nye medlemmer til kundeklubben og i sidste ende genererer mere omsætning.\nDet dækker blandt andet over e-mail marketing med løbende tests af indhold og udsendelsesfrekvens.\nAdWords søgeannoncer, remarketing og display-kampagner, der sikrer medlemstilgang og øget salg.\nDer hjælpes til med social media marketing, herunder Facebook opslag og annoncer.\nSidst men ikke mindst arbejdes der med vedvarende søgemaskineoptimering og konverteringsoptimering af website og shop, som sikrer synlighed og salg.\nBesøg Online Marketing hos Novicell\nEfter skiftet til den nye platform har vi blandt andet opnået en forberedt konverteringsrate på ca 30 % på desktopplatformen og ca 50 % på mobilplatformen hvor der er integreret responsive design. En forbedring der betyder at investeringen allerede er tjent hjem efter 1 år.\nFrederik Kolenda, Direktør\nVil du vide mere om løsningen og samarbejdet med Designers & Friends, så send mig hellere end gerne en mail.


ADW: Acanthurus triostegus: INFORMATION - Actinopterygii\nAf Rex Gamoke\nConvict tangs findes i hele Indo-Stillehavsområdet såvel som det østlige Stillehav fra den nedre Californiske Golf til Panama. De er også kendt som fange surgeonfish eller Manini.(Froese og Pauly, 2011; Lecchini og Galzin, 2005)\nConvict tangs er kirurgfisk, der foretrækker at besætte koralrev, men findes også i tidepools og andre nærtliggende habitater såsom lavvandede strandstrømsamfund. De er tropiske revfisk, hvis breddeområde er 26ºN til 36ºS med et længdeområde fra 25ºE til 85ºW. Convict tangs findes hovedsageligt i temperaturer fra 24-26 ° C og i dybder på 0-90 m.(Undervisningsafdelingen Waikiki Aquarium, 2012; Fauvelot and Planes, 2002; Froese and Pauly, 2011; Lecchini and Galzin, 2005)\n90 til 0 m\n295,28 til 0,00 fod\nConvict tangs har en bleg kropsfarve, der varierer fra hvid / grønlig-hvid til grå eller endda gul. Denne baggrund er overlejret med tydelige, lodrette sorte striber, inklusive en der går gennem hvert øje. De er stærkt lateralt komprimeret og har små skalaer, gæller, rygsøjler og analhvirvler. Deres gennemsnitlige længde er 17,0 cm med en maksimal længde på 27,0 cm.('Convict Tang - Acanthurus triostegus', 2012; Uddannelsesafdeling Waikiki Aquarium, 2012; Fishelson, 1999; Froese og Pauly, 2011; Kiflawi og Mazeroll, 2006)\n27,0 (høj) cm\n10,63 (høj) i\nConvict tang æg klækkes ud i klare pelagiske larver. I hawaiiske populationer tager det cirka 2,5 måneder for disse planktonale larver at udvikle sig til unge i et rev eller tidepool; larver tilpasser sig typisk til deres bentiske omgivelser inden for 24 timer. Oprindeligt mangler unge de lodrette stænger, der er til stede hos voksne.(Uddannelsesafdelingen Waikiki Aquarium, 2012; Nakamura, et al., 2009)\nConvict tangs gyder i bosiddende gydeaggregationer. Gydegrupper kan være så store som titusinder af fisk med undergrupper på 10-20 fisk, selvom pargydning også er blevet observeret. Forskning på Hawaii viste, at enkeltpersoner kan migrere op til 2 km for at nå gydesteder på søsiden af et rev eller i kanaler, der forbinder laguner med åbent hav.(Domeier og Colin, 1997)\nConvict tang-populationer nær ækvator kan gyde når som helst i løbet af året, mens befolkninger andre steder kun kan gyde sæsonmæssigt (i Hawaii forekommer gydning omkring fuldmåner i februar og marts).(Eble, et al., 2009; Uddannelsesafdeling Waikiki Aquarium, 2012; Froese and Pauly, 2011)\nConvict tangs yngler årligt.\nGydning kan forekomme året rundt i ækvatoriale levesteder og sæsonmæssigt i andre dele af området.\nConvict tangs er udsendt gyde og giver ingen forældrenes investering til afkom.(Froese og Pauly, 2011)\nConvict tangs har en typisk levetid på 5-7 år i fangenskab. Deres gennemsnitlige levetid i naturen er i øjeblikket ukendt.('Convict Tang - Acanthurus triostegus', 2012)\nConvict tangs findes ofte i skoler (store og små), men kan også findes individuelt. Mens mindre territoriale end andre tangs, er tankstørrelse stadig en vigtig overvejelse for dem, der holder denne art. Convict tangs er blevet observeret i naturen, der udviser tonisk immobilitet (death feigning).('Convict Tang - Acanthurus triostegus', 2012; Uddannelsesafdeling Waikiki Aquarium, 2012; Howe, 1992; Reebs, 2007)\nDer er i øjeblikket ingen offentliggjorte oplysninger om hjemmet eller størrelsen på Convict tangs.\nConvict tangs er i stand til at opfatte deres omgivelser gennem en række sensoriske veje, herunder syn, olfaction, lyd og vibrationer (detekteret af deres laterale linjer). Oplysninger om hvilke af disse sanser der er vigtige i intra- og interspecifik kommunikation er i øjeblikket utilgængelige.(Bond, 1996)\nConvict tangs er planteædere, der græsser på alger, der findes på klipper og koraller. Tilpasninger til deres bekymrende kost inkluderer mund, der er let nedadrettet og fleksible, kamlignende tænder.(Uddannelsesafdelingen Waikiki Aquarium, 2012; Froese and Pauly, 2011)\nConvict tangs er blevet observeret, der udviser tonisk immobilitet, hvilket kan være et svar på tilstedeværelsen af et rovdyr. Som med andre kirurgfisk har de skarpe knive på hver side af halen; disse knive er dog dårligt udviklet i fængselstang og bruges typisk ikke til forsvar. I stedet er denne art afhængig af at rejse i store skoler såvel som dets forstyrrende farvemønster for beskyttelse. Selvom det utvivlsomt ikke er en komplet liste over rovdyr, er det kendt, at fængslende tang er byttet ud af argusgrouper, askefarvet koniskål, honeycomb-grouper, cornet fisk og sort-halen snapper. Eagle stråler er også kendt for at fodre på fange tang gameter under gydning.(Uddannelsesafdelingen Waikiki Aquarium, 2012; Froese and Pauly, 2011; Reebs, 2007)\nArgus gruppe ( Cephalopholis argus )\nAskefarvet kongeål ( Conger cinereus )\nHoneycomb grouper ( Epinephelus merra )\nCornet fisk ( Fistularia petimba )\nSorte snapper ( Lutjanus fulvus )\nØrnestråle (Myliobatidae sp.)\nAfgræsning af fængslet tang på alger hjælper med at holde algpopulationer i skak. Convict tangs er også vært for symbiotiske encellede organismer i deres tarm, inklusive en af de største kendte bakteriearter (Epulopiscium fishelsoni). Convict tangs er vært for endoparasitiske nematoder og trematoder såvel som mindst en ektoparasitisk copepod-art.(Arthur og Lumanlan-Mayo, 1997; Uddannelsesafdeling Waikiki Aquarium, 2012; Fishelson, 1999; Lewis, 1964; Rigby og Adamson, 1997)\nEpulopiscium fishelsoni(Klasse Clostridia, Kingdom Bacteria)\nSpirocamallanus hun(Klasse, klasse Insecta)\nCaligus flexispina (Underklasse Copepoda, Subphylum Crustacea)\nConvict tangs er en del af den menneskelige diæt i tropiske regioner. De sælges også i akvariet.(Froese og Pauly, 2011)\nDer har været rapporter om mennesker, der lider af ciguatera-forgiftning efter indtagelse af fangen, selvom arten generelt betragtes som sikker at spise.(Froese og Pauly, 2011; Halstead, et al., 1990)\nConvict tangs har i øjeblikket ingen særlig bevaringsstatus.\nGenetiske undersøgelser af polynesiske populationer af fængselsangs indikerer, at på trods af det pelagiske larvestadium udviser de fleste populationer begrænset rekruttering gennem spredning.(Bresler et al., 1998; Fishelson, 1999)\nDen store bakterieEpulopiscium fishelsoniblev først isoleret fra tarmen af brun kirurgfisk ( A. nigrofuscus ); lignende morfotyper, kollektivt kaldet 'euplos', er siden blevet fundet i andre arter af kirurgfisk, herunder fængselsangs. Euplo-morfotyper, der findes i fangen, er 20 gange længere, end de er brede, hvilket er meget længere og tyndere end dem, der findes i andre arter af kirurgfisk.(Planes et al., 1994)\nRex Gamoke (forfatter), Sierra College, Jennifer Skillen (redaktør), Sierra College, Jeremy Wright (redaktør), University of Michigan-Ann Arbor.\n13 stribe jorden egern\nDelphinidaedolphins, spækhuggere, pilothvaler og slægtninge\nLæs om Delphinidae (delfiner, spækhuggere, pilothvaler og slægtninge) på dyre agenterne\nLutra lutra europæisk odder\nLæs om Lutra lutra (europæisk odder) på Animal Agents\nLæs om Procolobus verus (oliven colobus) på Animal Agents\nTetrao urogallus vestlige capercaillie\nLæs om Tetrao urogallus (western capercaillie) om dyreformidlere\nremora fisk og haj forhold\nørken græsareal whiptail firben\nhvad spiser lingcod\nstink pot moskus skildpadde


Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers | Protocol (Translated to Danish)\nEn enkelt-molekyle magnetiske pincet platform til at manipulere G-quadruplexes er rapporteret, som giver mulighed for undersøgelse af G4 stabilitet og regulering af forskellige proteiner.\nIkke-kanoniske nukleinsyre sekundærstruktur G-quadruplexes (G4) er involveret i forskellige cellulære processer, såsom DNA-replikation, transskription, RNA forarbejdning og telomere brudforlængelse. Under disse processer, forskellige proteiner binde og løse G4 strukturer til at udføre deres funktion. Funktionen af G4 ofte afhænger af stabiliteten i sine foldede struktur, er det vigtigt at undersøge, hvordan G4-bindende proteiner regulere stabilitet af G4. Dette arbejde præsenterer en metode til at manipulere enkelt G4 molekyler ved hjælp af magnetiske pincet, som giver studier af reguleringen af G4-bindende proteiner på en enkelt G4 molekyle i realtid. I almindelighed, er denne metode velegnet til et bredt anvendelsesområde applikationer i undersøgelser for proteiner/ligander interaktioner og forordninger om forskellige DNA eller RNA sekundære strukturer.\nFire-strenget DNA eller RNA G4 strukturer spiller en kritisk rolle i mange vigtige biologiske processer1. Mange proteiner er involveret i G4 bindende og regulering, herunder Telomer-bindende proteiner (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transskriptionsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA forarbejdning proteiner (hnRNP A1, hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5og DNA-replikation relaterede proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Protein binding kan stabilisere eller destabilisere G4 strukturer; dermed regulerer de efterfølgende biologiske funktioner. Stabiliteten af G4 blev målt ved termisk smelter ved hjælp af ultraviolet (UV) eller cirkulær dichroism (CD) metoder7. Sådanne forhold er imidlertid ikke fysiologisk relevante og er vanskelige at anvende til at studere virkningerne af bindende proteiner7.\nDen hurtige udvikling i enkelt-molekyle manipulation teknologier har aktiveret undersøgelser af folde og udfoldelsen af et biomolekyle, såsom en DNA eller et protein, på en enkelt-molekyle niveau med nanometer opløsning i realtid8. Atomic force mikroskopi (AFM), Optisk pincet og magnetiske pincet er de mest almindeligt anvendte metoder til enkelt-molekyle manipulation. I forhold til AFM og optiske pincet9, tillade magnetiske pincet stabile målinger af folde udfoldning dynamikken i et enkelt molekyle over dage ved hjælp af en anti-drift teknik10,11.\nHer, er en enkelt-molekyle manipulation platform ved hjælp af magnetiske pincet til at undersøge regulering af G4 stabilitet af bindende proteiner rapporteret12,13. Dette arbejde skitserer de grundlæggende metoder, herunder prøve og flow-kanal forberedelse, opsætning af magnetiske pincet og kraft kalibrering. Kontrolelementet kraft og protokollerne anti-drift som beskrevet i trin 3 giver mulighed for lang tidsmålinger under forskellige kraft kontrolelementer, som konstant kraft (force klemme) og konstant lastning Vurder (kraft-rampe) og force-jump måling. Kraft kalibrering protokollen beskrevet i trin 4 giver kraft kalibrering af < 1 µm kort bindsler over en bred kraft rækkevidde op til 100 pN, med en relativ fejl inden for 10%. Et eksempel på lovgivning om stabilitet af RNA-Helicase forbundet med AU-rige element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1), spiller væsentlige roller i løsningen af RNA G4 bruges til at demonstrere applikationer på denne platform13.\n1. forberedelse af G4 DNA for enkelt-molekyle strækning\nForbered 5 '-thiol mærket og 5 '-biotin mærket dsDNA håndtag ved PCR ved hjælp af DDNA polymerase på en lambda phage DNA skabelon ved hjælp af 5 '-thiol og 5 '-biotin primere 14 ( figur 1). Begge dsDNA håndtag har højt indhold af GC (> 60%) for at forhindre DNA smelter når DNA holdes på høje styrker eller under DNA overstretching overgang 15.\nRense PCR produkter ved hjælp af en kommerciel rensning kit og fordøje med BstXI begrænsning enzym ifølge producenten ' s protokol.\nLigate G4 danner ssDNA og flanke ssDNA og dsDNA håndtag ved hjælp af T4 DNA ligase ifølge producenten ' s protokol. Rense den sammenskrevne produkt af gel udvinding ved hjælp af en kommerciel rensning kit ifølge producenten ' s protokol.\n2. Forberedelse af Flow kanal\nCoverslip rengøring og overflade functionalization\nsted i bunden coverslips (#1.5, 22 mm × 32 mm) og top coverslips (#1.5, 20 mm x 20 mm) i dækslet glas farvning krukker (hver krukke kan rumme 7 stykker af coverslips, diskenheden er ~ 20 mL). Skyl coverslips i krukker med destilleret vand 2 - 5 gange.\nTilføj ~ 20 mL 5-40% rengøringsmiddel til hver krukke, og derefter sted i et ultralydsbad i 30 min. rengøring skylles med destilleret vand til > 10 gange for at fjerne vaskemidlet.\nTør coverslips i krukker i ovn (~ 150 ° C; Forsigtighed, hot), eller af N 2 gas. Gemme den tørrede top coverslips i en tør kabinet.\nBrug plasma (O 2 gas) til at rense coverslips i krukke i 10 min. I løbet af 10 min, forberede 20 mL af 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) opløsning i methanol (forsigtighed, giftig/brandfarlig). Bruge en kemisk stinkskab for at opløse APTES i methanol.\nBemærk: Undgå fugt når lagring APTES løsning. Gamle APTES ofte forårsager problemet i overfladen functionalizing af coverslips.\nUmiddelbart efter plasma rengøring, tilføje alle 1% APTES løsning i krukker og inkuberes for 1 h. Hæld affald i affald flasken specifikke for 1% APTES methanol. Udfør methanol-relaterede trin i stinkskab for brandfarlige kemikalier.\nSkylles krukker med methanol og > 10 gange med destilleret vand og derefter tørre af ovnen (~ 150 ° C; Forsigtighed, varm). Gemme APTES-belagt bunden coverslips i en tør fryser, hvis ikke i brug i op til to uger.\nBemærk: Efter hver sub skridt fra 2.1.1 til 2.1.4, renseprocessen kan være standset før det næste skridt.\nforberede to " afstandsstykker ", dvs., parafilm eller dobbelt-side bånd (~ 4 mm × 20 mm) for hver kanal. Læg de to stykker af afstandsstykker på en bunden coverslip langs den lange kant. Placer en top coverslip på spacer, danner en flow-celle i mellem (~ 10 mm × 20 mm område, figur 2A , B).\nHvis parafilm bruges som en spacer, placere flow-kanal på en vandvarmer (60-120 ° C; Forsigtighed, hot) for 5-10 s mens forsigtigt at trykke på siderne af den øverste coverslip til at holde de to coverslips sammen med parafilm. Den resulterende strøm kanal har en højde på ~ 100 µm, og dermed omfanget af kanalen er ~ 20 µL.\nForsegle den lange kant af kanalen med silikone lim til at undgå udsivning. Bruge silikone lim til at gøre en lille vask-lignende struktur på hver åbne kant af flow-kanal, der fungerer som en indgang og en udgang opløsning.\nBemærk: Ind- og udrejse kan også laves af andre måder, fx ved vedhængende små plastik ringe ved hjælp af voks.\nGemme kanaler i en tør kabinet i op til 4 uger.\nTether DNA bunden overfladen af flow-kanal\nfortyndes de amino-belagt polystyren perler (diameter: 3 µm) af 200 X i destilleret 1 X phosphat bufferet saltvand (PBS) buffer. Vortex perle løsning og derefter strøm til kanaler. Inkuber perle løsning i kanaler for ~ 30 min. Fjern eventuelle galt perler ved at vaske med 200 µL 1 X PBS buffer.\nJuster (stigning/fald) inkubationstiden at opnå en overflade tæthed af 1-5 perler pr. 50 mm x 50 mm område. Gemme de kanaler, der er deponeret hos reference perler i op til 3 dage.\nDilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-carboxylat (Sulfo-Investeringsfondene) pulver til 1 X PBS løsning (~ 0,5 mg/mL). Vortex løsningen og derefter flow ind i kanalen.\nBemærk: Forberede frisk Sulfo-Investeringsfondene løsning før brug og straks tilføje det til kanal for at undgå hydrolyzation af Investeringsfondene.\nIncubate Investeringsfondene løsning i den engelske kanal i 30 min. Fjern Investeringsfondene løsning ved at vaske med en stor mængde (1 mL, ~ 50 X kanal lydstyrken) 1 X PBS løsning.\nBemærk: Vask det overskydende Investeringsfondene omhyggeligt. Dette trin er meget afgørende for binding af DNA på coverslip.\nfortyndes thiol-biotin mærket DNA i 1 X PBS, med en deraf følgende DNA koncentration af ~ 0,3 nM. Forsigtigt afpipetteres for at blande løsningen, flow DNA løsning til Investeringsfondene-belagt kanalen og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur (~ 23 ° C).\nForsigtigt vaske væk gratis DNA med 200 µL blokerende løsning, der indeholder 1 X PBS med 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) og 0,01% 2-Mercaptoethanol.\nBlokere kanal overflade ved at inkubere kanal i blokerende løsning (10 mg/mL BSA, 0,01% 2-Mercaptoethanol) for > 2 h; efter dette trin, kanalen er klar til eksperimenter. Rede Kanalen kan opbevares ved 4 ° C for ~ 1 dag.\nBemærk: Den blokerende trin er vigtigt for at reducere ikke-specifik binding af DNA og magnetiske perler til coverslips.\n3. Magnetiske pincet Setup og identifikation af enkelt dsDNA Tether\nmagnetiske pincet setup\nStart den magnetiske pincet styre programmet. Her, de magnetiske pincet var kontrolleret af en in-House skrevet LabVIEW program.\nJuster magnet Centre før montering kanalen. Bruge en 4 X mål linse til at justere x - og y - aksen af magneter på den optiske akse på mikroskopet.\nBruge en computer-styrede motoriseret manipulator til at flytte magneter langs z-retning ( figur 2A) og indstille afstanden d = 0 (d: afstand mellem magneter og coverslip) når magneterne tillægger en coverslip på mikroskopet.\nProgram bevægelse af magneter gennem manipulator til at opnå kontrol over den kraft, herunder konstant kraft (dvs., konstant d) og tid varierende kraft F (t) (dvs. tid varierende d(t )).\nBruge lyse en lysdiode (LED) lyskilde for back-spredt belysning af perle gennem målet. Indsamle perle billeder på en samplingfrekvens på 100 Hz ved en afgift - sammen enhed (CCD) kamera. < / lJeg >\nprøve setup og identificere enkelt dsDNA tether\nforsigtigt flow i 200 X fortyndet M-280, Paramagnetiske perler i assay løsning (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) i en kanal. Der inkuberes i 10 min. at lade perlerne til at binde til biotin-mærket DNA molekyler immobiliseret på Investeringsfondene-belagt overflade gennem thiol-mærket slutningen. Forsigtigt vaske væk un-tøjret perler bruger 200 µL af standard reaktion løsning.\nBemærk: M-280 perler vise lavere ikke-specifik binding til overfladen i forhold til andre kommercielle magnetiske perler såsom M-270.\nMount kanal på mikroskop-scenen. Søg efter perler på bunden overfladen ved hjælp af 100 X oliebestandighedsobjektet.\nVælg en reference perle på overfladen og en bevægende tøjret perle. Bygge indledende billede biblioteker af både reference perle og tøjret perle på forskellige defocus planes.\nKalibrering af perler billede\nfør eksperimenter, bruge en objektiv piezo aktuator til at få billeder af både reference og tøjret perler på forskellige defocus fly fordelt med 20-50 nm, som er gemt som to separate perle billede biblioteker og er henholdsvis indekseret med defocus afstand ( figur 2D).\nx, y, z stilling bestemmelse\nunder forsoeg, fastlægge placeringen af perle i x-y plane af perle barycentrum. Bestemme højden ændringen af tøjret perle ved at sammenligne den aktuelle perle billede med dem gemt i biblioteket. Bruge auto-korrelationen funktion analyse af magt spektret af Fouriertransformation af perle billeder 16.\nAnti-drift feedback ved hjælp af reference perle\nunder eksperimenter, bruge piezo til " lås " afstanden mellem mål og en specifik reference perle billedet er gemt i biblioteket via en lav frekvens feedback kontrol, således at stak perle billedet har den bedste korrelation med et bestemt billede gemt i biblioteket ( figur 2D).\nAfgøre, om tether er en enkelt dsDNA molekyle ved at anvende ~ 65 pN kraft bestemme en enkelt dsDNA molekyle hvis tether gennemgår den karakteristiske DNA overstretching overgang 17 , 18 , 19. Gentag processen indtil der findes en enkelt dsDNA tøjr. (Der henvises til næste afsnit for kraft kalibrering og DNA overstretching overgang).\n4. Magnetiske pincet tvinge kalibrering\ndirekte bestemme kraften (op til 100 pN) for lange DNA (48,502 bp λ-DNA) molekyler ved hjælp af perle udsving gennem:\n, hvor k B er Boltzmann konstant, T er temperaturen i Kelvin skala, δ 2 y er variansen af perle udsving i retningen vinkelret på det magnetiske felt og force retning. I denne retning, kan bevægelse af perlen betegnes som et pendul udsving med en længde på l + r 0, hvor l er den ende til afstand langs kraft ledelse (udvidelse) af DNA, og r 0 er radius af perle 10 ( figur 3A).\nBestem kalibreringskurven for kraft F som en funktion af magneter til perle afstand d og F (d) for forskellige perler ved hjælp af de lange λ-DNA. Normalt, anvendes afstanden mellem magnet og coverslip som DNA tether længde kan ignoreres. Fit F-d kurve af funktionen dobbelt-eksponentiel henfald:\n, hvor montering parametre en1, en2, γ1, γ2 bestemmes af den magnetiske pincet og parameteren C bestemmes af egenskaben heterogene af de magnetiske perler. Ved at flytte C, F-d kurve fremstillet af forskellige perler kan være overlappede 10 ( figur 3B).\nKalibrering af parameteren C for individuelle magnetiske perler for korte DNA eksperimenter.\nBestemmelse af den kraft, der er baseret på udsving kræver optagelse perle position på en frekvens højere end hjørne frekvens:\n, hvor γ er træk koefficient af perle. For korte DNA på høj kraft, det kræver optagelse frekvens hurtigere end 100 Hz, derfor, kraften kan ikke direkte måles baseret på udsving med kameraet. Imidlertid parameteren C kan bestemmes ved at måle kraften en lav tvinge vifte (< 15 pN) ved hjælp af udsving og montering data med en kalibreret F-d kurve at opnå parameter C 20.\nAlternativt for eksperimenter med dsDNA, bestemme parameteren C ved hjælp af DNA overstretching overgangen på en kraft på ~ 65 pN ( figur 3 c) 21 , 22 , 23 ved at optage d position på hvilke dsDNA viste udvidelse hoppe (0,6 X længde stigning af contour længde). Efter bestemmelse af parameteren C, beregne kraften for tøjret perlerne.\nStyre belastningsgraden af programmering bevægelse af magneter gennem den inverse funktionen af F (d). Magneten bør nærmer prøven dobbelt eksponentielt.\nBemærk: Den relative fejl af kraft bestemmes af sådan en ekstrapolation metode er ~ 10%, og er hovedsageligt forårsaget af perle radius heterogenitet 20.\n5. Enkelt-molekyle Manipulation af G4 i tilstedeværelse og fravær af bindende proteiner\nefter at identificere dsDNA tether, udføre en kraft-stigning scanning på et belastningsgraden af 0,2 pN/s efterfulgt af en kraft-død scanning på-0.2 pN/s. Efter hver strækker cyklus, holde DNA-molekylet på 1 pN for 30 s til at tillade ssDNA at refold til G4.\ncyklus i kraft mellem 54 pN for 30 s som en foldet G4 kunne være udfoldet og 1 pN til 60 ' erne, hvorefter en foldet G4-15T kunne refold.\nStrømmende protein løsning\nFlow protein løsning når på ~ 20 pN kraft til at undgå udlæg i perlerne til coverslip. Niels Henrik-box RHAU helicase, som viste høj specificitet G4 struktur, var brugte 24. Rekombinant Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase blev udtrykt i Escherichia coli og renset som tidligere beskrevet 25. G4 tilbageføring aktivitet af DmRHAU blev analyseret på en tetramolecular G4 DNA substrat 13.\nAnalysere den unfolding kraft ved hjælp af en in-house skrevet Matlab program 14.\nOpsætningen eksperiment for at strække en enkelt G4 molekyle er vist i figur 4. En enkelt-strenget G4 danner sekvens strakte sig mellem to dsDNA håndtag var bundet mellem et coverslip og en Paramagnetiske perle. For at finde en enkelt dsDNA tøjret perle, blev en overstretching analyse udført ved at øge kraft til konstant ladning priser. Tre typer af målinger blev ofte brugt til at studere folde og udfoldelsen af biomolekyler: (i) konstant kraft måling, (ii) kraft-rampe måling og (iii) kraft-jump måling. På grund af de ekstremt langsom udfoldelsen satser for denne G4 struktur, ligevægten folde udfoldning overgang kunne kun ske for tiden over dage, så kraft-rampe og kraft-jump målinger blev brugt til kendetegner udfoldelsen kinetik og stabilitet af G4 strukturer.\nKraft-rampe målinger af G4 udfolder sig i tilstedeværelse eller fravær af RHAU Protein:\nFigur 4B viser typiske force-udvidelsen kurver fremstillet ved en kraft-stigning scanne på en belastningsgraden af 0,2 pN/s efterfulgt af en kraft-død scanning på-0.2 pN/s. Efter hver strækker cyklus, DNA-molekylet blev afholdt på 1 pN for 30 s til at tillade ssDNA at refold til G4. Udvidelse hoppe i kraft-stigning scan angivet en udfoldelsen overgang af G4. Når du bruger en ikke-G4 danner sekvens, ikke kan den pludselige udvidelse hoppe iagttages. Den udfolder sig force distribution kunne opnås ved at optage kræfter, som udspiller sig fandt sted. Udfoldelsen tvinge distribution af G4-15T fremstillet på 0,2 pN/s viste en enkelt peak på ~ 52 pN. Men, i nærværelse af 10 nM RHAU, G4-15T forblev foldede under force-stigning scanning for op til 60 pN, der angiver G4 stabilisering af RHAU bindende. 10 nM RHAU og 1 mM ATP, blev den udfolder sig force distribution flyttet til en lavere styrke, vejledende for en ATP-afhængig af destabilisering af G4 af RHAU.\nKraft-jump målinger af G4 udfolder sig i tilstedeværelse eller fravær af RHAU Protein:\nFigur 5 viser et repræsentativt spor af perle højde under fire kraft-jump cykler (figur 5, venstre panel); den kraft, at molekylet var cyklet mellem 54 pN for 30 s som en foldet G4 kunne være udfoldet og 1 pN for 60 s, hvorunder en foldet G4-15T kunne refold. Den gennemsnitlige levetid for foldede G4-15T på 54 pN var ~ 6.4 s, anslået ved at montere levetid histogrammet med en eksponentiel henfald funktion13. Efter flyder i en opløsning af 10 nM RHAU helicase uden ATP, udvidelse af tøjret DNA forblev på et foldet niveau i hele den 30 s bedrift tid på 54 pN, der angiver, at RHAU kraftigt stabiliserer G4-15T struktur mod mekaniske udfolder sig i den fravær af ATP. Efter flyder i 10 nM RHAU og 1 mM ATP, var udvidelse af den samme molekyle lige efter hoppe fra 1 pN til 54 pN på niveau med udfoldet ssDNA, der angiver, at RHAU destabiliserer G4 struktur i overværelse af ATP.\nFigur 1: Forberedelse af G4 DNA for enkelt-molekyle strækker eksperimenter.\nDsDNA håndtag blev udarbejdet af PCR ved hjælp af 5'-thiol og 5'-biotin primere. PCR produkter blev renset og fordøjes med BstXI begrænsning enzym og blev renset ved gel ekstraktion. G4 danner ssDNA, to flanke ssDNA og dsDNA håndtag var forbundet ved hjælp af T4 DNA ligase. Den sammenskrevne produkt blev renset ved gel ekstraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 2: Skitser af grundlæggende magnetiske pincet apparater.\n(A) skitse af en flow-kanal med et par magneter placeret ovenfor og en mikroskopi mål placeret nedenfor. (B) skitse af et samlet flow kanal hvor de blå farvede rektangler repræsenterer den øverste og nederste coverslips, og grå elliptisk linjer repræsenterer ind- og udrejse af flow-kanal. (C) skitse af styrkegenerering og kalibrering af opsætningen af magnetiske pincet. (D) eksempler på billeder af både reference perle og bevægende perle på forskellige nedtrapning fokus holdninger gemt i perle billede biblioteker. Det røde skilt betegner den perle-referenceafbildning, der er fremstillet på en bestemt nedtrapning fokus flyet bruges til brændplanet låsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 3: Tvinge kalibrering af magnetiske pincet.\n(A) kalibrering af kraft ved hjælp af svingninger af perle langs en rotation-fri y-retning. X-aksen er langs samme retning som det magnetiske felt. Kraft er langs z-aksen og styres ved at justere afstanden, d, mellem permanent magnet par og coverslip. (B) kalibrering af ved hjælp af en lang 48,502 bp-DNA. Heterogene magnetisk bead ejendom kan beskrives ved en enkelt-parameter C. Dette tal er blevet ændret fra10. (C) kalibrering af parameteren C med en magnetisk bead fastgjort på en 2 kb-DNA ved hjælp af B til S overstretching overgang. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 4: Enkelt-molekyle manipulation af en G4.\n(A) skitse af en stretching enkelt G4 struktur og måle de unfolding begivenheder. (B) typiske eksempel på kraft-stigning (cyan) og force-fald kurven af en tøjret G4. Dette tal er blevet ændret fra12. (C) kraft-udvidelse kurve af G4 i fravær (grå) eller tilstedeværelse (pink) af RHAU protein. (D) Unfolding tvinge distribution af G4 i fravær (grå) (n = 140) eller tilstedeværelse (rød) RHAU og ATP (n = 117). Dette tal er blevet ændret fra13. Venligst klik påher for at se en større version af dette tal.\nFigur 5: Force-jump målinger af G4 udfoldning.\n(A) repræsentative tid spor af perle højde ændring under force hoppe cyklusser mellem 1 pN og 54 pN målt uden DmRHAU, med 10 nM DmRHAU men uden ATP og med både 10 nM DmRHAU og 1 mM ATP, som angivet i panelet figur. (B) repræsentative tid spor af udvidelse ændres en G4 molekyle (grå data) efter at hoppe til 54 pN i flere kraft-jump cyklusser taget fra data i (A). Extensions svarende til foldet (F) og udfoldet (U) G4 er også angivet; G4 unfolding begivenheder er angivet med pile. Dette tal er blevet ændret fra13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nSom beskrevet ovenfor, en platform for at studere den mekaniske stabilitet af G4 DNA og samspillet mellem protein til G4 ved hjælp af er enkelt-molekyle magnetiske pincet rapporteret. Ledsager platformen, er højeffektive protokoller for at finde G4 DNA tether og måling af folde udfoldning dynamik og stabilitet af G4 struktur med nanometer særlig beslutning udviklet. Brændplanet låsning muliggør yderst stabil anti-drift kontrol, hvilket er vigtigt for påvisning af en lille struktur overgang som G4 (trin størrelse ~ 7 nm) og interaktioner med proteiner i buffer exchange eksperimenter. Denne platform er for nylig blevet ansat til undersøgelser af folde og udfoldelsen dynamikken i telomeric G414 og c-Myc promotor G412, samt undersøgelser af G4 bindende protein RHAU helicase13.\nEn typisk eksperiment fejl er ikke-specifik binding af DNA og perler på coverslip eller flere DNAs binde til magnetiske perler. At reducere de ikke-specifik binding, først, opbevaring af kemikalier, såsom APTES og Investeringsfondene skal kontrolleres rutinemæssigt. For det andet er det vigtigt at vælge en passende type af magnetisk bead og blokere ikke-specifik binding. Ved hjælp af 10 mg/mL BSA buffer eller små DNA oligo, såsom poly T, kan for at blokere den hydrofobe overfladen af perlerne reducere ikke-specifik binding. Endelig, en enkelt DNA tether kan let skelnes fra flere DNA bindsler af karakteristiske DNA overstretching overgang17,18,19.\nI øjeblikket, stilling bestemmelse af platformen er baseret på perlen imaging analyse, som har en begrænset rumlige opløsning af ~ 2 nm. Derudover har det en begrænset samplefrekvensen ~ 100 Hz, hovedsagelig på grund af begrænset erhvervelse sats af typiske CCD kameraer og korrelation analyse af billederne. Disse begrænsninger kan overvindes ved hjælp af total interne reflection mikroskopi (JOHANNAS) belysning. Det producerer et tyndt lag af flygtige lys, der eksponentielt henfalder med højden fra overfladen, som kan bruges til at bestemme den forlængelse ændring af korte molekyler på en høj signal-støj-forhold, samtidig undgå perle billede erhvervelse og analyse26 . En anden begrænsning er, at det er udfordrende at direkte visualisere tøjret molekyle eller ligand bundet til tøjret molekyle ved hjælp af fluorescens imaging i lodret stretching design, som kan overvindes ved at strække molekyler i brændplanet ved hjælp af tværgående magnetiske pincet27. Endelig, den nuværende udformning af reaktion kanal ikke tillader hurtig løsning exchange på grund af den flow undertrykkelse af netbårne til molekylet. Desuden kan en stor kraft genereret på høj hastighed flow endda bryde bindsler. Denne begrænsning kan overvindes ved at manipulere bindsler inde microwells placeret på den nederste overflade af kanal28.\nG4 stabiliserende forbindelser er i øjeblikket betragtes som potentielle terapeutiske mål for sygdomme, herunder kræft, virus relateret sygdomme, og neurodegeneration sygdomme29,30,31. Protokollen kan anvendes til en bred vifte af G4 bindende proteiner2 og små ligander32. Ud over ansøgninger i G4 undersøgelser, kan denne platform samt protokollerne, der i princippet bruges til undersøgelser af andre nukleinsyrer sekundære strukturer, herunder DNA og RNA Hårnåle, triplex, og jeg-motiv33.\nForfatterne takke Meng Pan til korrekturlæsning af håndskriftet. Dette arbejde er støttet af Singapore Ministeriet for uddannelse akademisk forskning fond Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) til J.Y.; Grundforskningsfond gennem Mechanobiology Institut Singapore til J.Y.; Danmarks Grundforskningsfond, premierministerens kontor, Singapore, under sit NRF Investigatorship program (NRF Investigatorship Award nr. NRF-NRFI2016-03 til J.Y.; den grundlæggende forskningsfonden for Central universiteterne (2017KFYXJJ153) til H. Y.