NICHTTOXISCHE MUTANTEN PATHOGENER GRAM-NEGATIVER BAKTERIEN - Dokument DE69635352T2\nDokumentenidentifikation DE69635352T2 27.07.2006\nTitel NICHTTOXISCHE MUTANTEN PATHOGENER GRAM-NEGATIVER BAKTERIEN\nAnmelder University of Iowa Research Foundation, Iowa City, Ia., US;\nThe Regents of the University of California, Oakland, Calif., US;\nWyeth Holdings Corp., Madison, N.J., US\nErfinder APICELLA, A., Michael, Solon, US;\nSUNSHINE, G., Melvin, Iowa City, US;\nLEE, Na-Gyong, Sindong-a, Incheon, KR;\nARUMUGHAM, Rasappa, Pittsford, US;\nGIBSON, W., Bradford, Berkeley, US\nIPC-Hauptklasse A61K 39/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP\nDie vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die verändertes Endotoxin (Lipooligosaccharid (LOS); Lipopolysaccharid (LPS)) von gram-negativen bakteriellen Pathogenen umfassen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung einer Form von Endotoxin durch ein gentechnisches bearbeitetes, gram-negatives Pathogen, dem ein im wesentlichen toxischer Lipid A-Bereich fehlt. Ferner werden prophylaktische und therapeutische Anwendungen des erheblich detoxifizierten Endotoxins und von mutanten gram-negativen Bakterien, die das erheblich detoxifizierte Endotoxin erzeugen, beschrieben.\nGram-negative Bakterien weisen eine äußere Membran auf, die aus Komponenten mit einem Gehalt an Proteinen, Lipoproteinen, Phospholipiden und Glycolipiden besteht. Die Glycolipide umfassen vorwiegend Endotoxin-Lipopolysaccharide (LPS) oder -Lipooligosaccharide (LOS), je nach der Gattung der Bakterien. LPS sind Moleküle, die bestehen aus\na) einem Lipid A-Teil, der aus einem Glucosamindisaccharid besteht, das mit Phosphatgruppen und langkettigen Fettsäuren in Ester- und Amidbindungen substituiert ist;\nb) einem Kernpolysaccharid, das an das Lipid A durch einen Zucker mit 8 Kohlenstoffatomen, KDO (Ketodesoxyoctanoat) und Heptose, Glucose, Galactose und N-Rcetylglucosamin gebunden ist; und\nc) eine O-spezifische Seitenkette, die aus Oligosaccharid-Struktureinheiten besteht, die je nach Gattung und Spezies der Bakterien Mannose, Galactose, D-Glucose, N-Acetylgalactosamin, N-Acetylglucosamin, L-Rhamnose und eine Didesoxyhexose (Abequose, Colitose, Tyvelose, Paratose, Trehalose) enthalten kann. LOS weist eine ähnliche Struktur wie LPS auf und enthält einen Lipid A-Teil und eine komplexe Kohlenhydratstruktur, unterscheidet sich aber darin, dass es keine O-Seitenketten-Struktureinheiten enthält.\nMan nimmt an, dass die hauptsächlichen antigenen Determinanten von gram-negativen Bakterien sich in der Kohlenhydratstruktur der O-spezifischen Seitenkette von LPS und in der komplexen Kohlenhydratstruktur von LOS befinden. Diese Kohlenhydratstrukturen können sich bei verschiedenen Spezies der gleichen Gattung von gramnegativen Bakterien unterscheiden, und zwar in einem oder mehreren der folgenden Punkte: Zuckerzusammensetzung; Sequenz von Oligosacchariden; Verknüpfung zwischen den Oligosacchariden; und Substitutionen/Modifikationen eines Oligosaccharids (insbesondere eines terminalen Oligosaccharids).\nLPS und LOS werden als bakterielle Komponenten angesehen, die ein Potential als Vakzin-Immunogene besitzen, und zwar aufgrund der antigenen Determinanten ("Epitope"), die sich in ihren Kohlenhydratstrukturen befinden. Jedoch verhindert die chemische Natur von LPS und LOS die Verwendung dieser Moleküle in Vakzineformulierungen; d. h. eine aktive Immunisierung mit LPS oder LOS ist aufgrund der naturgegebenen Toxizität des Lipid A-Teils inakzeptabel. Die pathophysiologischen Effekte, die (direkt oder indirekt) durch Lipid A von LPS oder LOS im Blutkreislauf herbeigeführt werden, umfassen Fieber; Leukopenie; Leukozytose; die Shwartzman-Reaktion; eine verbreitete intravaskuläre Koagulation; Abort; und in höheren Dosen Schock und Tod. Demzufolge sind derzeit keine Vakzinen verfügbar, die Antikörperreaktionen gegen LPS- oder LOS-Epitope induzieren.\nWie in 1 dargestellt, umfasst der Lipid A-Teil von Endotoxin im allgemeinen ein hydrophiles Gerüst von Glucosamindisaccharid, das entweder monophosphoryliert oder diphosphoryliert ist (Positionen 1 und 4'); und das mindestens 6 Moleküle von ester- und amidgebundenen Fettsäuren trägt. Vier Moleküle von (R)-3-Hydroxytetradecanoat (z. B. 3-Hydroxymyristoyl oder &bgr;-Hyroxymyristinsäure oder &bgr;-OH) sind direkt an das Lipid A-Gerüst in den Positionen 2, 3, 2' und 3' gebunden. Hydroxylgruppen von zwei der vier Moleküle von &bgr;-OH sind mit normalen Fettsäuren (bezeichnet als "sekundäre Acylketten", die Dodecanoat, Tetradecanoat und Hexadecanoat umfassen) unter Bildung von Acyloxyacylgruppen substituiert.\nEin Weg zur Herstellung eines detoxifizierten Endotoxin-Moleküls beinhaltet die Isolierung des Endotoxins und die enzymatische Behandlung des isolierten Endotoxins mit einer humanen neutrophilen Acyloxyacylhydrolase (US-Patente 4 929 604, 5 013 661 und 5 200 184). Die Acyloxyacyl-hydrolase hydrolysiert die Fettsäuren (nicht-hydroxylierte, sekundäre Acylketten) von ihren Esterbindungen zu Hydroxygruppen von &bgr;-OH (hydroxyliert). Das durch die enzymatische Behandlung erhaltene veränderte Endotoxin enthielt einen Lipid A-Rest, dem nicht-hydroxylierte Fettsäuren fehlten. Diese veränderte Endotoxin wies eine verringerte in vivo-Toxizität auf, behielt aber seine Antigenizität.\nEin weiterer Weg beinhaltet ein Verfahren zum Modifizieren von isoliertem Endotoxin durch selektive Entfernung von &bgr;-OH, das mit dem reduzierenden Ende des Glucosamin-Gerüstes in Position 3 durch eine Esterbindung verknüpft ist (US-Patent 4 912 094; Reexamination B1 4 912 094). Die selektive Entfernung von &bgr;-OH wurde durch alkalische Hydrolyse erreicht. Das erhaltene modifizierte Endotoxin wies eine verringerte in vivo-Toxizität auf, behielt aber seine Antigenizität.\nBeide Wege beinhalten eine chemische Behandlung des isolierten Endotoxins. Keiner der Wege beschreibt die Erzeugung eines Endotoxins mit erheblich verringerter Toxizität, das aber noch seine Antigenizität behält, in einem gram-negativen bakteriellen Pathogen. Ferner gibt es keine Offenbarung über die Verwendung eines gram-negativen Bakteriums, das gentechnisch bearbeitet worden ist, um ein Endotoxin, das eine erheblich verringerte Toxizität aufweist, aber doch seine Antigenizität behält, in einer prophylaktischen oder therapeutischen Vakzine gegen endotoxischen Schock und gram-negative Bakterämie zu erzeugen.\nGemäß einem ersten Aspekt wird erfindungsgemäß eine Vakzineformulierung bereitgestellt, die eine Endotoxinmutante umfasst, die aus einer htrB-Mutante eines gram-negativen bakteriellen Pathogens gereinigt wurde und dadurch gekennzeichnet ist, dass Lipid A der Endotoxinmutante das gleiche ist wie Lipid A des Wildtyp-Endotoxins, ausgenommen, dass eine oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen, und ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Endotoxinmutante an ein Trägerprotein konjugiert ist, wobei die Endotoxinmutante eine wesentlich verminderte Toxizität im Vergleich zu dem Endotoxin des gram-negativen bakteriellen Pathogens vom Wildtyp aufweist.\nEs wurde festgestellt, dass bei Lipid A, das durch die htrB-Mutante erzeugt wird, eine oder beide Fettsäuren (nicht-hydroxylierte oder sekundäre Acylketten) fehlen, wodurch das Endotoxin in einer isolierten Form oder das mutante, gram-negative, bakterielle Pathogen, das das Endotoxin trägt, eine erheblich verringerte Toxizität aufweisen und dennoch seine Antigenizität behalten, verglichen mit dem Wildtyp. Aus htrB-Mutanten isoliertes Endotoxin oder die htrB-Mutanten selbst (Vollzell-Vakzine) können zur Immunisierung von Individuen verwendet werden, bei denen ein Risiko einer gram-negativen Bakterämie besteht, indem man Antikörper gegen die hauptsächlichen antigenen Determinanten induziert, die sich in der Kohlenhydratstruktur der O-spezifischen Seitenkette von LPS und der komplexen Kohlenhydratstruktur von LOS befinden. Ferner können die hrtB-Mutanten gentechnisch so bearbeitet werden, dass sie heterologe Antigene von anderen mikrobiellen Pathogenen an der Oberfläche der htrB-Mutante exprimieren, um sie dem Immunsystem eines geimpften Individuums in einer multivalenten Vakzine darzureichen. Ferner kann das Endotoxin, das aus den erfindungsgemäßen htrB-Mutanten isoliert worden ist, zur Erzeugung eines LPS- oder LOS-spezifischen Antikörpers verwendet werden, der sich für die passive Immunisierung und als Reagenz für diagnostische Tests, die zum Nachweis der Anwesenheit von gram-negativen, bakteriellen Pathogenen in klinischen Proben bestimmt ist, eignet.\n1 ist eine schematische Darstellung der allgemeinen Struktur von Lipid A von gram-negativen Bakterien der Familie Enterobacteriaceae.\n2A ist eine schematische Darstellung der allgemeinen Struktur einer Spezies von Lipid A aus der LOS einer htrB-Mutante, die Pentaacyldiphosporyllipid A umfasst.\n2B ist eine schematische Darstellung der allgemeinen Struktur einer Spezies von Lipid A aus dem LPS einer htrB-Mutante, die Tetraacyldiphosphoryllipid A umfasst.\n3 ist ein Diagramm zur Darstellung der relativen Toxizität einer htrB-Mutante, (O, &Dgr;) im Vergleich zum Wildtyp-Bakterium (⧠) in einem TNF&agr;-Freisetzungstest.\n4 ist eine photographische Aufnahme von humanen, primären, respiratorischen Epithelzellen, die unstimuliert (Kontrolle), mit NTHi 2019-LOS oder mit mutantem htrB-B29-LOS behandelt sind und entweder mit einer fluoreszierenden Sonde, die mit TNF&agr;-mRNA (Sonde 1) hybridisiert, oder mit einer fluoreszierenden Kontrollsonde (Sonde 2) umgesetzt worden sind.\n5 ist ein Diagramm zur Darstellung der durchschnittlichen Titer von anti-LOS-Antikörper gegen NTHi 2019-LOS (Antigen-Beschichtung) (in einem ELISA-Test) von Mäusen, die mit NTHi 2019 (Pool 595), der htrB-Mutante B29-LOS (Pool 597) oder der htrB-Mutante B29-LOS unter Konjugation an ein Trägerprotein (Pool 606) zusammen mit Adjuvans immunisiert worden sind.\n6 ist ein Diagramm zur Darstellung der durchschnittlichen Titer von anti-LOS-Antikörper gegen die htrB-Mutante B29-LOS (Antigenbeschichtung) (in einem ELISA-Test) aus Mäusen, die mit NTHi-2019 (Pool 595), der htrB-Mutante B29-LOS (Pool 597) oder der htrB-Mutante B29-LOS unter Konjugation an ein Trägerprotein (Pool 606) zusammen mit einem Adjuvans immunisiert worden sind.\n7 ist eine schematische Darstellung zum Vergleich der Strukturen von Wildtyp-Salmonella-Lipid A und mutantem htrB-Lipid A.\nAusführliche Beschreibung der Erfindung Definitionen\n"Endotoxin" ist ein Ausdruck, der für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche so verwendet wird, dass er sich auf das LPS oder LOS von gram-negativen, bakteriellen Pathogenen bezieht, wobei das Endotoxin entweder in einer zellassoziierten oder isolierten Form vorliegt. Die Ausdrücke "htrB-Endotoxin" und "htrB-Endotoxinmutante" beziehen sich auf Endotoxin, das aus einer gram-negativen, bakteriellen, pathogenen htrB-Mutante isoliert und gereinigt worden ist.\n"Vakzinekandidat oder Vakzineantigen" ist ein hier in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeter Ausdruck, der sich auf ein Endotoxin-Epitop mit einer oder mehreren der folgenden Eigenschaften (a–d) bezieht: (a) immunogene Beschaffenheit; (b) an der Oberfläche exponiert (was durch bekannte Techniken gezeigt werden kann, einschließlich durch Immunofluoreszenztests, elektronenmikroskopische Färbeverfahren und bakterizide Tests); (c) Induktion von Antikörper mit bakterizider Aktivität in Gegenwart von Komplement und/oder Funktionen bei Immunclearance-Mechanismen; (d) Induktion von Antikörper, der eine weitere funktionelle Aktivität des Epitops neutralisiert (Immunogenizität oder Toxizität und dergl.)\n"Gram-negatives, bakterielles Pathogen" ist ein in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeter Ausdruck, der sich auf ein oder mehr pathogene (für Menschen oder Tiere) Bakterien einer Gattung und Spezies bezieht, die folgendes umfassen: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, andere Haemophilus-Spezies, Moraxella catarrhalis, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, andere Salmonella-Spezies, Shigella dysenteriae und andere Shigella-Spezies und Pseudomonas aeruginosa.\nDer hier verwendete Ausdruck "erheblich verringerte Toxizität" bezieht sich in der Beschreibung und den Ansprüchen auf eine Verringerung der Bioaktivität um einen Faktor von mindestens 10 bis 100 oder mehr im Vergleich zum Wildtyp-Endotoxin.\n"Trägerprotein" ist ein in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeter Ausdruck, der sich auf ein Protein bezieht, das mit der htrB-Endotoxinmutante konjugiert ist. Während die htrB-Endotoxinmutante von sich aus immunogen ist, ist es aus dem Stand der Technik bekannt, dass eine Konjugation mit einem Trägerprotein die Immunogenizität erleichtern kann. Proteine, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen beliebige Proteine, die eine sichere Verabreichung an Säuger gewährleisten und die als ein immunologisch wirksames Trägerprotein dienen können. Bei speziellen Ausführungsformen können Zelloberflächenproteine, Membranproteine, Toxine und Toxoide verwendet werden. Kriterien für die Sicherheit umfassen das Fehlen einer primären Toxizität und das minimale Risiko einer allergischen Reaktion. Diphtherie- und Tetanus-Toxoide erfüllen diese Kriterien; d. h. sie sind bei geeigneter Präparation nicht-toxisch und das Auftreten von allergischen Reaktionen ist in akzeptabler Weise gering. Obgleich die Gefahr einer allergischen Reaktion bei Erwachsenen erheblich sein kann, ist sie bei Kindern minimal.\nGemäß weiteren speziellen Ausführungsformen der Erfindung umfassen geeignete Trägerproteine (ohne Beschränkung hierauf) Salmonella-Flagellin, Haemophilus-pilin, Pseudomonas-pili, Pseudomonas-Exotoxin, äußere Membranproteine von Haemophilus (15 kDa-, 28–30 kDa- und 40 kDa-Membranproteine) oder N. meningitidis oder N. gonorrheae, wärmelabiles Enterotoxin-LTB von Escherichia coli, Cholera-Toxin, Pneumolysin von S. pneumoniae und virale Proteine, einschließlich Rotavirus VP7 und respiratorische, synzytiale Virus F- und G-Proteine. Ferner sind aus dem Stand der Technik zahlreiche Trägerproteine bekannt, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Rinderserumalbumin und mit Diphtherie-Toxin kreuzreaktives mutantes Protein ("CRM"). Ferner sind aus dem Stand der Technik verschiedene Verfahren zum Konjugieren von Endotoxin mit einem Trägerprotein bekannt. Derartige Verfahren umfassen (ohne Beschränkung hierauf) die Verwendung von Glutaraldehyd oder Succinimidyl-m-maleinimidobenzoat oder 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid oder die Verwendung von bromacetyliertem Trägerprotein (vergl. z. B. Robey et al., Anal. Biochem., Bd. 177 (1989), S. 373–377). Eine Konjugation von htrB-Endotoxin mit einem Trägerprotein-Toxin kann die Toxizität des Trägerprotein-Toxins verringern, wobei aber eine Resttoxizität zurückbleiben kann. Eine weitere Detoxifizierung kann durch aus dem Stand der Technik bekannte Maßnahmen erreicht werden, z. B. durch Verwendung von Formalin, das mit freien Aminogruppen des Trägerprotein-Toxins reagiert.\nAlternativ kann ein natives Trägerprotein-Toxin mit Formalin unter Bildung eines herkömmlichen Toxoids detoxifiziert werden, bevor eine Konjugation mit der htrB-Endotoxinmutante vorgenommen wird. Jedoch verringert eine vorherige Behandlung mit Formalin die Anzahl der freien Aminogruppen, die für die Umsetzung während des Konjugationsvorgangs verfügbar sind. CRMs sind insofern vorteilhaft, als sie keine naturgegebene Toxizität aufweisen und doch keine ihrer Aminogruppen durch Formalin besetzt ist. Im Fall von CRM197, das immunologisch mit dem nativen Toxin identisch ist, verstärkt eine Behandlung mit Formalin (obgleich keine Notwendigkeit zur Detoxifikation besteht) in starkem Maße die immunologische Reaktion. Es wird angenommen, dass dies auf eine Stabilisierung des Moleküls gegen einen Abbau durch Mechanismen des Körpers und/oder durch Aggregation durch Vernetzung (die Immunogenizität von Teilchen nimmt mit der Größe zu) zurückzuführen ist. Obgleich Tetanus- und Diphtherie-Toxine erstrebenswerte Trägerproteine darstellen, kann es andere, als Kandidaten in Frage kommende Trägerproteine geben, die ebenfalls geeignet sein können. Zu derartigen weiteren Kandidaten für Träger gehören Toxine und Proteine von Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Pertussis und E. coli.\nEine Konjugation von Endotoxin an Trägerproteine kann durch verschiedene Maßnahmen durchgeführt werden, z. B. mittels direkter Konjugation mit dem Trägerprotein durch Bromcyan, durch reduktive Aminierung oder unter Verwendung von bifunktionellen Linkern. Zu derartigen bifunktionellen Linkern gehören (ohne Beschränkung hierauf) Linker auf der Basis von N-Hydroxysuccinimid, Cystamin, Glutaraldehyd und Diaminohexan. htrB-Endotoxin wird so modifiziert, dass es Sulfhydrylgruppen enthält, wobei Linker auf der Basis von N-Hydroxysuccinimid verwendet werden oder man sich einer durch Carbodiimid vermittelten Kondensation von Cystamin bedient. Die sulfhydrylhaltigen htrB-Endotoxin-Zwischenprodukte werden sodann mit einem Trägerprotein umgesetzt, das mit N-Hydroxysuccinimidylbromacetat derivatisiert worden ist. Vorzugsweise liegen die Sulfhydrylgruppen am konjugierenden htrB-Endotoxin frei, um eine Thiolverknüpfung mit dem bromacetylierten Trägerprotein herzustellen.\nIn einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann die htrB-Endotoxinmutante mit einem Trägerprotein, wie CRM, konjugiert werden, indem man ein langkettiges Sulfo-N-succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat verwendet, um die primäre Aminogruppe(n) des Endotoxins zu thiolieren. Langkettiges Sulfo-N-succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat wurde an etwa 13 mg der Saccharidkomponente des htrB-Endotoxins in 0,1 M NaHCO3 vom pH-Wert 7,0 in einem Verhältnis von 1:1 (Gew./Gew.) addiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch durch Gelfiltration gereinigt. Die mit dem langkettigen Sulfo-N-succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat derivatisierten Fraktionen wurden vereinigt. Die in den derivatisierten Fraktionen vorhandenen N-Pyridyldisulfide wurden mit 100 mM Dithiothreit reduziert und durch Gelfiltration gereinigt. Die thiolierten Endotoxinfraktionen wurden sodann gewonnen. CRM197 wurde bromacetyliert, indem Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimid in einem geringen Volumen an Dimethylformamid tropfenweise zu CRM (in 0,1 M NaHCO3) bei 4 °C in einem Verhältnis von 1:1 (Gew./Gew.) gegeben wurde. Die Lösung wurde vermischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde sodann durch Gelfiltration gereinigt und die das bromacetylierte Protein enthaltenden Fraktionen wurden gewonnen. Die Derivatisierung der Aminogruppen am Trägerprotein zu Bromacetylgruppen wurde anhand der abnehmenden Menge an freien Aminogruppen überwacht. Bromacetyl-CRM in 0,1 M NaHCO3 wurde zu der thiolierten htrB-Endotoxinmutante in einem Verhältnis von 1:1,5 von Protein zu Endotoxin (Gew./Gew.) in 0,1 M NaHCO3/1 mM EDTA gegeben und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert. Das endgültige Konjugat wurde sodann durch Gelfiltration in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 6,9 gereinigt.\nDie erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen beziehen sich auf die biosynthetischen LPS- und LOS-Wege von gram-negativen, bakteriellen Pathogenen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Mutationen im htrB-Gen von gram-negativen, bakteriellen Pathogenen, die zu mutanten Bakterien führen, die Endotoxin aufweisen, dessen Toxizität erheblich verringert ist und dennoch seine Antigenizität behält, verglichen mit Wildtyp-Bakterien der gleichen Spezies.\nDie Genetik der Lipid A-Biosynthese von enterischen Bakterien ist, soweit sie zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung bekannt war, bei Schnaitman und Klena (Microbiol. Rev., Bd. 57 (1993), S. 655–682) zusammengestellt. Die Gene lpxA, lpxB, lpxC und lpxD kodieren für Genprodukte, die auf das Glucosamin-Gerüst von Lipid A unter Einschluss des Transfers von &bgr;-Hydroxymyristinsäure auf Glucosamin einwirken. Das htrB-Gen wurde als ein Gen beschrieben, das die innere Kernstruktur (KDO, Heptose, Phosphorylethanolamin (PEA)) beeinflusst, was während eines Screenings auf Gene, die für das Wachstum von Escherichia coli bei erhöhten Temperaturen erforderlich sind, festgestellt wurde. Knockout-Mutationen von htrB führten zu mutantem E. coli, das eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Desoxycholat, eine Unfähigkeit zum Wachstum bei Temperaturen über 32,5 °C und eine Verringerung der LPS-Färbeintensität aufwies (Schnaitman et al., (1993), a.a.O.; Karow et al., J. Bacteriol., Bd. 174 (1992), S. 7407–7418). Karow et al. stellten ferner fest, dass bei Temperaturen von etwa 30 °C bis etwa 42 °C E. coli-htrB-Mutanten Veränderungen der Fettsäurezusammensetzungen sowohl von LPS als auch von Phospholipiden unterliegen und insbesondere im Vergleich zum Wildtyp eine Überproduktion von Phospholipiden zeigen. Es war jedoch weder bekannt noch lag es nahe, dass eine oder mehrere der mindestens sechs Moleküle der ester- oder amidgebundenen Fettsäuren im Lipid A-Teil von LPS von htrB-Mutanten fehlen. Ferner findet sich kein Hinweis darauf, dass htrB-Mutanten einen Lipid A-Rest enthalten, dem spezifisch eine oder beide nicht-hydroxylierten (sekundäre Acylkette) Fettsäuren, die für die Endotoxizität verantwortlich sind, fehlen; d. h. dass die htrB-Mutante ein verändertes Endotoxin enthält, das eine verringerte in vivo-Toxizität aufweist, jedoch seine Antigenizität behält ("htrB-Endotoxin"), verglichen mit dem Wildtyp.\nDie erfindungsgemäßen Feststellungen umfassen die unerwarteten Ergebnisse, dass Knockout-Mutationen des htrB-Gens von gram-negativen Bakterien (einschließlich der Familie Enterobacteriaceae) zu htrB-Mutanten führen, denen spezifisch eine oder mehrere sekundäre Acylketten-Fettsäuren fehlen, die in Esterbindung an den Hydroxylgruppen von zwei der vier Moleküle von &bgr;-OH stehen (wie in 2 dargestellt). Somit hat es den Anschein dass das htrB-Protein entweder Acyltransferase-Aktivität aufweist oder indirekt oder direkt die Regulierung der Acyltransferase-Aktivität beeinflusst. Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Aspekte und sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken. Insbesondere besteht eine bevorzugte Ausführungsform in der Herstellung einer H. influenzae-htrB-Mutante und in Verfahren zur Verwendung dieser Mutante in Form einer vollständigen Zelle oder in Verfahren zur Isolierung eines Endotoxins daraus, den Vakzinepräparaten oder in der Erzeugung von Antikörpern für therapeutische oder diagnostische Anwendungen. Da jedoch der Lipid A-Rest unter Bakterien der Familie Enterobacteriaceae und eng verwandten gramnegativen Bakterien hochgradig konserviert ist, betrifft die Erfindung gram-negative, bakterielle Pathogene gemäß der vorstehenden Definition. Es besteht eine geringfügige Heterogenität in Bezug auf die Länge der sekundären Acylkette (12 oder 14 Kohlenstoffatome) und in Bezug auf die Frage, welche der R-OH-Gruppen substituiert sind (1, 2 oder 4) (Erwin et al., Infect. Immun., Bd. 59 (1991), S. 1881–1887). Jedoch ist die Natur der Substitution die gleiche und somit sind die speziellen Stufen (Gene und Genprodukte), die beim biosynthetischen Stoffwechselweg beteiligt sind, offenbar konserviert. Beispielsweise führte eine Entfernung von sekundären Acylketten aus verschiedenen gram-negativen, bakteriellen Pathogenen (E. coli, H. influenzae, P. aeruginosa, S. typhimurium, und N. meningitidis) unter Verwendung von humaner Acyloxyacyl-hydrolase zu desacyliertem LPS aus sämtlichen getesteten Spezies mit signifikant verringerter mitogener Aktivität (Erwin et al., (1991), a.a.O.), verglichen mit dem entsprechenden Wildtypstamm.\nBeispiel 1 Identifizierung eines htrB-Gens und Erzeugung von htrB-Mutanten\nDurch Komplementieren eines nicht-typisierbaren H. influenzae-Stammes 2019 mit einem S. typhimurium rfaE-Mutantenstamm wurde das rfaE-Gen von H. influenzae Stamm 2019 kloniert (Lee et al., Infect. Immun., Bd. 63 (1995), S. 818–824). Eine Sequenzanalyse der strangaufwärtigen Region des H. influenzae-rfaE-Gens ergab einen offenen Leseraster, der hochgradig homolog zum E. coli-htrB-Gen war. Das H. influenzae-htrB-Gen umfasst 933 Basen und kodiert für ein Protein HtrB mit 311 Aminosäuren (SEQ ID NO:1) und einer geschätzten Molekülgröße von 36 Kilodalton (kDa). Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von H. influenzae-HtrB mit E. coli-HtrB ergab eine gemeinsame Homologie (56 % Identität und 73 Ähnlichkeit). Eine Klonierung des htrB-Gens von H. influenzae in ein Plasmid und eine anschließende in vitro-Transkriptions-Translationsanalyse ergab, dass HtrB eine scheinbare Molekülgröße von 32-33 kDa aufweist.\nEs gibt verschiedene, dem Fachmann geläufige Standardtechniken zur Mutation eines bakteriellen Gens. Diese Techniken umfassen die positionsgerichtete Mutagenese und die Shuttle-Mutagenese unter Verwendung von Transposons. Gemäß einem Aspekt dieser Ausführungsform wurde die Mutagenese des htrB-Gens durch Shuttle-Mutagenese durchgeführt. Ein Derivat des bakteriellen Transposons Tn3, mini-Tn3 (Seifert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986), S. 735–739), wurde als Insertionssequenz verwendet, um das htrB-Gen zu mutieren. Ein BglII-Produkt mit 2,4 Kilobasen (kb), das das htrB-Gen von H. influenzae enthielt, wurde in ein Plasmid kloniert, das als Ziel für die mini-Tn3-Transposon-Mutagenese verwendet wurde. Kurz zusammengefasst, in eine einzelne bakterielle Zelle (E. coli) werden eingeführt: das das htrB-Gen enthaltende Plasmid; ein gegenüber einer Tn3-Transposition immunes Plasmid mit einem Gehalt an Transposane (die die Cointegration zwischen Tn3 und den Zielmolekülen vermittelt); und ein Plasmid mit einem Gehalt an mini-Tn3.\nNach Durchführung der Transposition werden die bakteriellen Zellen mit einem E. coli-Stamm gepaart, der das cre-Enzym, das zur Auflösung von Cointegraten bei der Shuttle-Mutagenese verwendet wird, enthält. Transkonjugate werden einer Selektion mit Antibiotika (Kanamycin, Ampicillin und Streptomycin) unterworfen und durch Restriktionsendonuclease-Verdau analysiert.\nZwei Plasmide mit den Bezeichnungen pB28 und pB29, jeweils mit einem mini-Tn3-Transposon mit einem Gehalt an dem Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen wurden in den offenen htrB-Leseraster an einer unterschiedlichen Position inseriert. Jedes Plasmid wurde zur Transformation des nicht-typisierbaren H. influenzae-Stamms 2019 verwendet und bakterielle Zelltransformanten wurden in Bezug auf Wachstum in Gegenwart von Chloramphenicol (1,5 &mgr;g/ml) selektiert, was zur Identifikation von Mutantenstämmen mit den Bezeichnungen NTHi-B28 bzw. -B29 führte. Die Positionen der mTn3-Insertion in den Chromosomen der NTHi-Mutanten wurden durch genomische Southern-Hybridisierung unter Verwendung des 2,4 kb-BglII-Fragments als Sonde bestätigt. Insbesondere führte ein BglII-Verdau der DNA von NTHi-Stamm 2019 zu einem 2,4 kb-Fragment, während ähnliche Verdauungsvorgänge von DNA aus den mutanten NTHi-B28 und -829 zu 4,0 kb-Fragmenten führten. Ferner wurden die 4,0 kb-Fragmente mit EcoRI; das in mTn3 vorhanden ist, verdaut.\nAlternativ sind aus dem Stand der Technik Verfahren zur positionsgerichteten Mutagenese in ein bakterielles Gen (vergl. beispielsweise Halladay, J. Bacteriol., Bd. 175 (1993), S. 684–692) und zur Rekombination des mutierten bakteriellen Gens in das bakterielle Chromosom bekannt. Eine selektierbare Kanamycin-Resistenz-Kassette kann zur Insertion in (und zur Mutation) das htrB-Gen, das in einem Shuttle-Plasmid enthalten ist, verwendet werden. Eine anschließende Transformation in eine bakterielle Wirtszelle mit dem Shuttle-Plasmid und eine Rekombination des bakteriellen Genoms (am Ort der Genomkopie des htrB-Gens) mit der Kassette über htrB-Flankierungssequenzen führt zur positionsgerichteten Mutagenese des bakteriellen htrB-Gens.\nEine Primer-Extension zur Analyse kann zur Bestimmung der Promotorregion des htrB-Gens verwendet werden. Die Promotorregion von H. influenzae-htrB wurde durch Primer-Extensionsanalyse bestimmt, indem zunächst die Bakterien gezüchtet, geerntet und einer Reinigung der RNA unterzogen wurden, wonach eine handelsübliche Testpackung zur Primerextension gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet wurde. Eine einzige Transkriptionsstelle wurde unter Verwendung eines Primers (SEQ ID NO:2), der komplementär zur 5'-Region des offenen htrB-Leserasters war, gefunden. Beim ersten Nucleotid handelte es sich um einen Cytosin (C)-Rest in einer Position von 21 bp strangaufwärts zur mutmaßlichen Translationsstartstelle, ATG. Die Region strangaufwärts von der Transkriptionsstartstelle enthielt eine Sequenz (SEQ ID NO:1, Basen 13 bis 29), die ähnlich der -10-Konsensusregion der bakteriellen &sgr;70-abhängigen Promotoren war, in einem entsprechenden Abstand. Ein Element (SEQ ID NO:1, Basen 1 bis 6) ähnelt der Konsensussequenz der -35-Region.\nBeispiel 2 Charakterisierung von htrB-Mutanten Wachstumseigenschaften\nDie Stämme NTHi-B28 und -B29 wurden zunächst bei 30 °C selektiert. Sie waren zum Wachstum bei 37 °C unfähig. Unter weiteren Passagen bei 30 °C verloren die NTHi-htrB-Mutanten allmählich ihre Temperaturempfindlichkeit und zeigten eine langsame Wachstumsgeschwindigkeit, verglichen mit NTHi 2019 bei 37 °C. Jedoch blieb für Wachstumstemperaturen von 38,5 °C oder darüber die Temperaturempfindlichkeit für die htrB-Mutanten bestehen.\nFrüher wurde berichtet, dass E. coli-htrB-Mutanten eine Veränderung der Membranpermeabilität gegenüber verschiedenen Verbindungen, einschließlich Kanamycin und Desoxycholat, zeigen (Karow et al., (1992), a.a.O.). Die NTHi-htrB-Mutanten wurden auch auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Kanamycin und Desoxycholat getestet. Über Nacht bei 30 °C gezüchtete Kulturen wurden sodann verdünnt und in Gegenwart von 5 &mgr;g/ml Kanamycin entweder bei 30 °C oder bei 37 °C gezüchtet. Bei 30 °C wurde kein Unterschied in der Wachstumsgeschwindigkeit zwischen NTHi-2019 und den NTHi-htrB-Mutantenstämmen in Abwesenheit von Kanamycin festgestellt. Jedoch wurde das Wachstum der htrB-Mutanten signifikant in Gegenwart von Kanamycin gehemmt, während NTHi-2019 nicht beeinträchtigt wurde. Für die htrB-Mutanten war die Empfindlichkeit gegenüber Kanamycin bei 37 °C noch größer, da die Mutanten in Gegenwart von Kanamycin bei 37 °C kein Wachstum zeigten. Gleichermaßen waren die htrB-Mutanten bei 30 °C, verglichen mit dem NTHi-Stamm 2019, bei Konzentrationen von mehr als 500 &mgr;g/ml Desoxycholat empfindlich und zeigten kein Wachstum bei 1000 &mgr;g/ml. Bei 37 °C zeigten die htrB-Mutanten eine fast vollständige Wachstumshemmung in Gegenwart von nur 250 &mgr;g/&mgr;g/ml Desoxycholat.\nDas LPS von E. coli-htrB-Mutanten wurde durch eine schwache Färbung an silbergefärbten Polyacrylamidgelen charakterisiert, wobei aber das Wanderungsmuster bei Vergleich von LPS mit Wildtyp nicht variierte. Im Gegensatz dazu wanderte das LOS aus den NTHi-Mutanten B28 und B29 an silbergefärbten Gelen rascher als das LOS aus dem NTHi-Stamm 2019. Ferner zeigte das LOS aus den B28- und B29-Mutanten eine braunstichige Färbung anstelle der schwarzen Färbung von NTHi 2019. Eine Rekonstitution (durch Einführung eines Plasmids mit einem intakten htrB-Gen in die Mutante) der NTHi-Mutante B29 bestätigte, dass die Unterschiede in den Wachstumseigenschaften sowie in der LOS-Wanderung und -Färbung auf eine Mutation des htrB-Gens zurückzuführen waren.\nLOS der NTHi-htrB-Mutante und Wildtyp-LOS wurden jeweils durch Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) analysiert, um für die verschiedenen Komponenten von LOS Molekülmassenprofile bereitzustellen. Zunächst wurde LOS aus den entsprechenden Stämmen isoliert. LPS oder LOS können durch das Phenol-Wasser-Verfahren isoliert werden (Westphal et al., Methods in Carbohydrate Chemistry, Bd. 5 (1965), S. 83–91); oder unter Anwendung eines alternativen Reinigungsverfahrens (unter Verwendung einer Protease; Hitchcock et al., J. Bacteriol., Bd. 154 (1983), S. 269–277). Die isolierte LOS-Spezies wurden sodann durch milde Behandlung mit Hydrazin (20 Minuten bei 37 °C; vergl. Phillips et al., Biomed. Environ. Mass Spectrom., Bd. 19 (1990), S. 731–745) O-desacyliert. Eine Analyse durch ESI-MS der verschiedenen LOS-Spezies ergab, dass das O-desacylierte LOS aus der NTHi-Mutante B29 und aus NTHi 2019 zwar ein ähnliches Molekülmassenprofil aufwiesen, dass aber klar zwei Unterschiede festgestellt werden konnten. In der htrB-Mutante lag eine Abnahme (50%ige Verringerung) der Menge an LOS mit einem Gehalt an zwei Phosphoethanolaminen (PEA) in der inneren Kernstruktur vor; und es ergab sich eine Verschiebung zu einer LOS-Spezies mit höherem Molekulargewicht mit mehr Hexosen. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass der Grad der Phosphorylierung die Kettenprogression aus spezifischen Heptoseresten beeinflussen kann, und dass HtrB entweder direkt oder indirekt die Phosphorylierung von LOS beeinflusst.\nEine Massenspektrometrie wurde zur Analyse des Lipids A herangezogen. Speziell wurden Lipid A aus LOS der htrB-Mutante und aus Wildtyp-LOS durch Flüssig-Sekundärionen-Massenspektrometrie (LSIMS) im negativen Ionenmodus analysiert, um ein Spektrum von Molekülionen für die verschiedenen Komponenten von Lipid A bereitzustellen. Zunächst wurden die LOS-Spezies jeweils in 1 % Essigsäure 2 Stunden bei 100 °C bei einer Konzentration von 2 mg/ml hydrolysiert. Die Hydrolysate wurden zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt. Die wasserlöslichen, rohen Lipid A-Fraktionen wurden 2-mal in Wasser und 1-mal in einem organischen Gemisch (Chloroform/Methanol/Wasser; 2:1:1 Volumenteile) gewaschen und sodann zur Trockne eingedampft. Für die Analyse wurden die Lipidproben erneut in CH2Cl2/CH3OH (3:1, Vol./Vol.) und 1 &mgr;l Nitrobenzylalkohol/Triethanolamin (1:1, Vol./Vol.) gelöst und als eine flüssige Matrix auf ein Massenspekrometer aufgesetzt. Eine LSIMS des Wildtyps (NTHi 2019) ergab ein Spektrum mit einem Gehalt an zwei deprotonierten Molekülionen in Übereinstimmung mit einer Hexaacyl-Lipid A-Struktur mit einem Gehalt an entweder einem (Hexaacylmonophosphoryl-Lipid A, Mr=1744) oder zwei Phosphaten (Hexaacyldiphosphoryl-Lipid A, Mr=1824). Dieses Spektrum ist im wesentlichen identisch mit dem, das für die Lipid A-Struktur von LOS von H. ducreyi angegeben wurde (Melaugh et al., J. Biol. Chem., Bd. 267 (1992), S. 13434–13439). Es wird angenommen, dass es sich bei den kleineren Massefragmenten um Ionen handelt, die durch LSIMS-induzierte Fragmentierung von mono- und diphosphorylierten Molekülionenspezies von höherer Masse entstehen.\nIm Gegensatz dazu fehlen im LSIMS-Spektrum für das Lipid A-Präparat aus mutantem LOS von htrB die Molekülionen, die der Wildtyp-Hexaacyl-Lipid A-Spezies entsprechen. Es gibt zwei große Masseionen, die den Molekülionen für eine Mono- und Diphosphorylpentaacyl-Lipid A-Spezies, der eine der sekundären Acylketten fehlt (z. B. der Myristinsäurerest), entsprechen. Ferner ergeben sich bei den geringeren Massen zwei zusätzliche Molekülionen-Spezies, die einer Mono- und Diphosphoryltetraacyl-Lipid A-Spezies, der beide sekundären Acylketten fehlen, entsprechen. Zusammengefasst, handelt es sich bei der Lipid A-Struktur des Wildtyp-LOS um Hexaacyl; während die Lipid A-Struktur der htrB-Mutante zwei Spezies zeigt, eine Tetraacyl-Spezies (2A) und eine Pentaacyl-Spezies (2B), was auf den Verlust von mindestens einer und gelegentlich von beiden sekundären Acylketten hinweist. Die htrB-Mutante besteht aus annähernd 90 % Tetraacyl-Lipid A mit lediglich den vier hydroxymyristinsäureester- und -amidverknüpften Fettsäuren und annähernd 10 % Pentaacyl-Lipid A mit einer Myristinsäuresubstitution.\nBeispiel 3 Erheblich reduzierte Toxizität von htrB-Mutanten\nDer aufgrund des Fehlens von einer oder mehreren sekundären Alkylketten bestehende Einfluss auf die Toxizität eines gram-negativen, bakteriellen Pathogens wurde unter Anwendung eines üblichen in vitro-Tests zur Messung der in vivo-Toxizität geprüft. Die murine markophagenartige Zelllinie J774 sezerniert bei Stimulation durch Endotoxin TNF&agr;. Die Menge an TNF&agr;, die direkt proportional zur Toxizität des stimulierenden LPS oder LOS ist, kann gemessen werden, indem man (a) den zellfreien Überstand, der das TNF&agr; enthält, entfernt; (b) den Überstand zu einer TNF&agr;-empfindlichen Zelllinie, wie WEHI 164, gibt; und (c) die sich ergebende Zytotoxizität misst (vergl. beispielsweise Espevik et al., J. Immunol. Methods, Bd. 95 (1986), S. 99; Sakurai et al., Cancer Immunol. Immunother., Bd. 20 (1985), S. 6–10; Adams et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 28 (1990), S. 998–1001; Adams et al., J. Leukoc. Biol., Bd. 48 (1990), S. 549–556; Tsai et al., Cell Immunol., Bd. 144 (1992), S. 203–216; und Pfister et al., Immunol., Bd. 77 (1992), S. 473–476).\nBei diesem Test wurden anhaftende J774-Zellen aus der Kultur entfernt, mit PBS-1 mM EDTA gewaschen und sodann 2-mal mit vollständigem Gewebekulturmedium ohne Antibiotika gewaschen. 2 × 106 bis 4 × 106 J774-Zellen/100 mm Kulturschale wurden in Gewebekulturmedium über Nacht in einem CO2-Inkubator inkubiert. Anhaftende J774-Zellen wurden mit PBS-1 mM EDTA entfernt, 3-mal in Gewebekulturmedium gewaschen und auf 5 × 105/ml eingestellt. Aliquotanteile von 50 &mgr;l wurden pro Vertiefung einer Platte mit 96 rundbödigen Vertiefungen zugesetzt. Die Platte wurde sodann 1 Stunde bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Pro Vertiefung wurden entweder eine htrB-Mutante oder der Wildtypstamm in verschiedenen kolonienbildenden Einheiten (cfu, Infektionsdosis) zugesetzt. Anschließend wurde die Platte 1 Stunde bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden pro Vertiefung 100 &mgr;l Kulturmedium mit einem Gehalt an 50 &mgr;g/ml Gentamycin zugegeben. Anschließend wurde die Platte über Nacht bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Aliquotanteile von 50 &mgr;l des J774-Überstands wurden pro Vertiefung entnommen und auf Vertiefungen einer Platte mit 96 flachbödigen Vertiefungen übertragen. Serielle, 10-fache Verdünnungen wurden mit dem J774-Überstand hergestellt. Als Kontrolle wurde eine Verdünnungsreihe von rekombinantem TNF&agr; (rTNF&agr;) mitgeführt. Pro Vertiefung wurden 50 &mgr;l der WEHI 164-Klon 13-Zellen mit 6 × 105 Zellen/ml in Gewebekulturmedium + 25 mM LiCl + 2 &mgr;g/ml Actinomycin D zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 &mgr;l Alomar-Blau zugegeben. 5–7 Stunden später wurde die optische Dichte bei 570 nm abgelesen. Der Test verwendet Alomar-Blau als Farbindikator, d. h. Alomar-Blau wird durch lebende Zellen in eine rote Farbe umgewandelt, während die blaue Farbe bestehen bleibt, wenn die Zellen abgetötet sind.\n3 zeigt einen Vergleich zwischen der Anzahl an bakteriellen Zellen des H. influenzae-Stammes 2019 (Wildtyp, ⧠) und von bakteriellen Zellen der htrB-Mutante NTHi-B29 (O und &Dgr;), die zur Stimulation der Freisetzung einer ausreichenden Menge von TNF&agr; aus J774-Zellen zur Abtötung der TNF&agr;-empfindlichen Zelllinie WEHI 164 erforderlich sind. B29hi (&Dgr;) und B29LO (O) beziehen sich auf eine hohe Anzahl (>3) und eine geringe Anzahl (<3) von Passagen der jeweiligen htrB-Mutante. Wie in 3 dargestellt, zeigt die htrB-Mutante eine verringerte Fähigkeit zur Stimulation der TNF&agr;-Freisetzung, d. h. zwischen einer etwa 10-fachen Verringerung (B29LO) zu einer etwa 100-fachen Verringerung (B29hi). Diese verringerte Fähigkeit zur Stimulation von TNF&agr; ist ein Anzeichen dafür, dass die htrB-Mutante eine wesentlich verringerte Toxizität aufgrund des Fehlens von einer oder mehreren sekundären Acylketten im Lipid A-Teil des Endotoxins aufweist.\nDer sich aufgrund des Fehlens von einer oder mehreren sekundären Acylketten ergebende Einfluss auf die Toxizität eines gram-negativen bakteriellen Pathogens wurde ferner unter Anwendung eines üblichen in situ-Tests zur Messung der in vivo-Toxizität geprüft. Mit SV-40 transformierte, humane, respiratorische Epithelzellen und humane, primäre, respiratorische Epithelzellen erzeugen bei Stimulation durch Endotoxin TNF&agr;, wobei die Bildung durch Nachweis von TNF&agr;-mRNA unter Anwendung von dem Fachmann auf dem Gebiet der in situ-Hybridisierung bekannten Techniken nachgewiesen werden kann (eine Modifikation von MacNaul et al., J. Immunol., Bd. 145 (1990), S. 4154–4166). Die Zellen werden in einer Monolayer in Vertiefungen in einer Platte mit 24 Vertiefungen bis zum annähernd konfluenten Zustand gezüchtet. Zur Stimulation der Zellen wird 1 &mgr;g/ml LOS zugegeben. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Eine Gegenfärbung (z. B. Membranfärbung) wird zugegeben und die Zellen werden sodann mit 0,5 ml 2 % Paraformaldehyd in Puffer so fixiert, dass die Gegenfärbung direkt in den Zellen fixiert wird. Anschließend wird eine Hybridisierung unter Verwendung einer für TNF&agr;-RNA spezifischen Oligonucleotidsonde (SEQ ID NO:4) und einer Kontrollsonde (SEQ ID NO:5) durchgeführt. Die Menge an TNF&agr;-mRNA, die visuell nachgewiesen wird, ist direkt proportional zur Toxizität des stimulierenden LPS. TNF&agr;-mRNA wurde minimal induziert in SV-40-transformierten, humanen, respiratorischen Epithelzellen und humanen, primären, respiratorischen Epithelzellen (4), die LOS, das aus der htrB-Mutante NTHi-B29 isoliert worden war, ausgesetzt waren. Dies steht im Gegensatz zu LOS, das aus dem Ausgangsstamm NTHi-2019 isoliert worden war, das hohe Konzentrationen an TNF&agr;-mRNA in diesen humanen, respiratorischen Zellen (4) und Zelllinien induzierte.\nDie wesentliche Verringerung der bei den TNF&agr;-Tests festgestellten Verringerung der Toxizität der htrB-Mutante, die auf das Fehlen von einer oder mehreren sekundären Acylketten zurückzuführen ist, wird ferner durch früher beschriebene Tests der Bioaktivität von Endotoxin gestützt, wobei das Endotoxin mit Acyloxyacyl-hydrolase, das selektiv die sekundären Acylketten von Endotoxin entfernt, behandelt worden ist. Desacylierte Endotoxine aus E. coli, H. influenzae, N. meningitidis, und S. typhimurium unterlagen (a) gleichermaßen einer Verringerung ihrer Wirkungsstärke im Limulus-Lysattest, im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-Endotoxin; (b) einer Verringerung ihrer Fähigkeit zur Stimulation der Haftung von Neutrophilen an humanen Endothelzellen, verglichen mit dem entsprechenden Wildtyp-Endotoxin; und (c) einer Verringerung ihrer mitogenen Aktivität bei murinen Splenocyten (Erwin et al., Infect. Immun., Bd. 59 (1991), S. 1881–1887); wobei aber die Expression von antigenen Epitopen erhalten blieb. Gleichermaßen zeigte mit Acyloxacylhydrolase behandeltes S. typhimurium-LPS eine Verringerung der Toxizität um den Faktor 100 oder mehr bei der dermalen Shwartzman-Reaktion; war beim thermischen Reaktionsmodell weniger pyrogen; zeigte eine 5- bis 12-fache Verringerung der B-Zell-Mitogenizität; und zeigte eine 10- bis 20-fache Verringerung der Freisetzung von Prostaglandin E2, verglichen mit Wildtyp-Endotoxin woraus sich schließen lässt, dass maximal desacyliertes LPS mindestens 10-fach weniger toxisch ist als Wildtyp-Endotoxin (US-Patent 4 929 604).\nBeispiel 4 Verwendung von htrB-Mutanten als Immunogene\nGemäß einem Aspekt dieser Ausführungsform wird die htrB-Mutante eines gram-negativen, bakteriellen Pathogens als Vollzellen-Vakzine verwendet. Der Vorteil der Verwendung von lebenden, abgeschwächten (bezüglich ihrer Fähigkeit zur Herbeiführung einer Pathogenese abgeschwächt) Bakterien als Immunogen in einer Vakzineformulierung besteht darin, dass sie zum Überleben befähigt sind und im menschlichen oder tierischen Körper existieren können und somit zu einer verlängerten Immunität gegen die Krankheit beitragen. In Verbindung mit dem Vorteil der Verwendung von lebenden Bakterien zur Verlängerung der Immunreaktion haben gram-negative, bakterielle Pathogen-htrB-Mutanten den zusätzlichen Vorteil, dass sie eine erheblich verringerte Toxizität aufweisen. Ein weiterer Vorteil im Vergleich zu einer Vakzineformulierung, die ein ein bakterielles Antigen repräsentierendes, isoliertes Peptid umfasst, besteht darin, dass ein an der Oberfläche einer bakteriellen Zelle exprimiertes bakterielles Antigen häufig eine stärkere Stimulation der Immunreaktion ergibt. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Oberfläche von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae als natürliches Adjuvans zur Verstärkung der Immunreaktion gegen ein dort dargereichtes Antigen wirkt (Wezler, Ann. NY Acad. Sci., Bd. 730 (1994), S. 367–370). Somit ist es wahrscheinlich, dass durch Verwendung einer lebenden, bakteriellen Vakzine, z. B. einer htrB-Mutante, zur Expression von vollständigen Proteinen in einer nativen Konformation (d. h. als Teil der äußeren bakteriellen Membran) eine stärkere schützende Immunreaktion als das ioslierte Protein allein hervorgerufen wird.\nZu lebenden bakteriellen Vakzinevektoren der Familie Enterobacteriaceae, die bisher beschrieben worden sind, gehören abgeschwächte Salmonella-Stämme (Stocker et al., US-Patente 5 210 035; 4 837 151; und 4 735 801; und Curtiss et al., Vaccine, Bd. 6 (1988), S. 155–160; durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) und Shigella flexneri (Sizemore et al., Science, Bd. 270 (1995), S. 299–302; durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Eine bevorzugte Ausführungsform besteht in der Bereitstellung eines Vakzine-Abgabesystems für humane oder tierische (je nach der Gattung und der Spezies des gramnegativen, bakteriellen Pathogens) mukosale Pathogene. Somit kann eine Immunisierung auf parenteralem Wege oder auf mukosalem Wege mit einer prophylaktisch wirksamen Menge der htrB-Mutante oder einer htrB-Mutante, die so transformiert ist, dass sie in rekombinanter Weise zusätzliche bakterielle Antigene exprimiert (die das Wachstum oder die Replikation der transformierten htrB-Mutante nicht negativ beeinflussen), zu einer Kolonisierung von Schleimhautoberflächen führen, um eine mukosale Immunität gegen die an der Oberfläche der htrB-Mutante auftretenden oder aus der htrB-Mutante sezernierten Antigene zu induzieren. Die erhaltene htrB-Mutante kann in einer Vakzineformulierung, die das oder die bakteriellen Antigene exprimiert, verwendet werden.\nÄhnliche Verfahren können zur Konstruktion einer inaktivierten htrB-Mutanten-Vakzineformulierung verwendet werden, mit der Ausnahme, dass die htrB-Mutante inaktiviert ist, z. B. durch aus dem Stand der Technik bekannte chemische Maßnahmen, bevor sie als Immunogen verwendet wird, wobei die Immunogenizität der exprimierten Immunogene im wesentlichen nicht beeinflusst wird. Beispielsweise wurde eine humane, bronchiale, mukosale Immunität mit einer Aerosolvakzine mit einem Gehalt an lysiertem H. influenzae stimuliert (Latil et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 23 (1986), S. 1015–1021). Entweder die lebende htrB-Mutante-Vakzine oder die inaktivierte htrB-Mutante-Vakzine können auch mit einem geeigneten Adjuvans zubereitet werden, um die immunologische Reaktion des oder der Antigene, die durch den Vakzine-Vektor exprimiert werden, weiter zu verstärken, wie nachstehend ausführlich beschrieben wird.\nGemäß einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform wird das Endotoxin aus der htrB-Mutante unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert. Das isolierte htrB-Endotoxin wird in einer Vakzineformulierung verwendet. Wie vorstehend erwähnt, wird angenommen, dass hauptsächliche antigene Determinanten von gram-negativen Bakterien in der Kohlenhydratstruktur der O-spezifischen Seitenkette von LPS und der komplexen Kohlenhydratstruktur von LOS sitzen. Jedoch verhindern die chemische Natur von LPS und LOS die Verwendung dieser Moleküle in Vakzineformulierungen; d. h. die aktive Immunisierung mit LPS oder LOS ist aufgrund der naturgegebenen Toxizität der sekundären Acylketten des Lipid A-Teils von Endotoxin inakzeptabel. Dem aus einer htrB-Mutante eines gram-negativen, bakteriellen Pathogens isolierten Endotoxin fehlen eine oder mehrere sekundäre Acylketten; es weist somit eine erheblich verringerte Toxizität auf, verglichen mit Endotoxin, das aus den entsprechenden Wildtyp-Bakterien isoliert worden ist. Daher kann Endotoxin, das aus einer htrB-Mutante eines gram-negativen, bakteriellen Pathogens isoliert worden ist, in einer Vakzineformulierung zur Induktion von Immunität gegen das entsprechende gram-negative, bakterielle Wildtyp-Pathogen verwendet werden. LPS oder LOS können durch das Phenol-Wasser-Verfahren (Westphal et al., Methods in Carbohydrate Chemistry, Bd. 5 (1965), S. 83–91) oder unter Anwendung eines alternativen Reinigungsverfahrens (unter Verwendung einer Protease; Hitchcock et al., J. Bacteriol., Bd. 154 (1983), S. 269–277) isoliert werden.\nEs sind zahlreiche Verfahren zur Einführung einer Vakzineformulierung in zu impfende Menschen oder Tiere (gemeinsam als "Individuum" bezeichnet) bekannt. Hierzu gehören (ohne Beschränkung hierauf) eine intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, okulare, intranasale und orale Verabreichung. Herkömmlicherweise werden Vakzineformulierungen, die entweder lebende Bakterien oder abgeschwächte oder inaktivierte Bakterien enthalten, durch Injektion oder durch orale Verabreichung verabfolgt. Beispielsweise lässt sich eine respiratorische Immunität durch intestinale Immunisierung mit gereinigten H. influenzae-Antigenen stimulieren (Cripps et al., J. Infect. Dis., Bd. 165S1 (1992), S. S199–201).\nDie Vakzineformulierung kann eine physiologisch verträgliche Lösung als Träger enthalten, in der die mutanten bakteriellen htrB-Zellen oder isoliertes Endotoxin der htrB-Mutante suspendiert sind. Verschiedene Adjuvantien können zusammen mit Vakzineformulierungen verwendet werden. Die Adjuvantien üben durch Modulation der Immunreaktion und unter Erzielung einer dauerhafteren und hochgradigeren Immunität bei Verwendung geringerer Mengen an Vakzine-Antigen und weniger Dosen, verglichen mit einer alleinigen Verabreichung des Vakzine-Antigens, eine unterstützende Wirkung aus. Beispiele für Adjuvantien umfassen inkomplettes Freund-Adjuvans, Adjuvans 65 (mit einem Gehalt an Erdnussöl, Mannitmonooleat und Aluminummonostearat), Ölemulsionen, Ribi-Adjuvans, Pluronic-Polyole, Polyamine, Avridine, Quil A, Saponin, MPL, QS-21 und anorganische Gele, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und dergl. Die Vakzineformulierung wird in einer prophylaktisch wirksamen Menge, um eine immunogene Wirkung zu erzielen, verabreicht, wobei die Menge von Faktoren abhängt, zu denen die Fähigkeit des Individuums zum Aufbau einer Immunreaktion, der Grad der zu induzierenden Schutzwirkung und der Verabreichungsweg gehören.\nDie erfindungsgemäße Vakzineformulierung kann oral verabreicht werden, indem man sie als Bestandteil des Futters, das einem wirtschaftlich bedeutenden Viehbestand gegeben wird, vorsieht. Wie es dem Fachmann bekannt ist, sind Spezies von Haemophilus, Campylobacter, Pseudomonas und Salmonella für wirtschaftlich bedeutende Viehbestände pathogen. Unter Anwendung der Verfahren, die in den nachstehenden Beispielen erläutert sind, können htrB-Mutanten derartiger tierischer Pathogene erzeugt werden. Die erhaltenen htrB-Mutanten oder das daraus isolierte Endotoxin können in einer Vakzineformulierung verwendet werden. Die Verwendung von Vakzineformulierungen, die ein oder mehr Antigene von verschiedenen mikrobiellen Pathogenen enthalten, in Tierfutter wurde beschrieben; (vergl. beispielsweise Pritchard et al., Avian Dis., Bd. 22 (1978), S. 562–575).\nBeispiel 5 H. influenzae-htrB-Mutanten als Immunogene\nGemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der htrB-Mutante um eine H. influenzae-htrB-Mutante. Haemophilus influenzae ist ein wichtiges Pathogen des menschlichen Atmungstrakts bei Krankheiten, einschließlich Otitis media, chronischer Sinusitis und chronischer, obstruktiver Lungenkrankheit. Bestimmte, an der Oberfläche freiliegende, bakterielle Komponenten, einschließlich P2, P6 und LOS, wirken offensichtlich als Antigene, die eine schützende Immunreaktion bei immunisierten Menschen herbeiführen können. von derartigen Antigenen wurde gezeigt, dass sie Ziele eines bakteriziden Antikörpers sind. Die Anwesenheit von bakteriziden Serum-Antikörpern ist mit einem Schutz gegen eine Infektion durch H. influenzae verbunden (Faden et al., J. Infect. Dis., Bd. 160 (1989), S. 999–1004).\n5.1 Gemäß einem Aspekt dieser Ausführungsform wird das aus einer htrB-Mutante isolierte Endotoxin als Immunogen in einer Vakzineformulierung verwendet. Wie im vorstehenden Beispiel 3 dargelegt, fehlen dem Endotoxin, das aus einer htrB-Mutante eines gram-negativen, bakteriellen Pathogens isoliert worden ist, eine oder mehrere sekundäre Acylketten, so dass es eine erheblich verringerte Toxizität aufweist, verglichen mit Endotoxin, das aus einem entsprechenden bakteriellen Wildtyp-Pathogen isoliert worden ist. Daher kann Endotoxin, das aus einer htrB-Mutante von H. influenzae isoliert worden ist, in einer Vakzineformulierung zur Herbeiführung von Immunität gegen den entsprechenden Wildtypstamm verwendet werden. Das htrB-Mutanten-LOS kann nach einem Verfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung von LOS bekannt ist, isoliert werden. Das htrB-Mutanten-LOS kann in einer Vakzineformulierung verwendet werden, die eine oder mehrere Mittel enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem pharmazeutisch verträglichen Träger (z. B. eine physiologische Lösung), einem Adjuvans oder einem Trägerprotein besteht.\nUm die Einflüsse der Immunisierung mit htrB-Mutanten-LOS zu erläutern, wurde ein Mäusemodell herangezogen. NTHi-2019-LOS und htrB-Mutanten-NTHi-B29-LOS wurden jeweils aus den entsprechenden Stämmen unter Anwendung des Phenol-Wasser-Verfahrens isoliert. Gruppen von mindestens 5 Swiss Webster-Mäusen wurden subkutan mit 1 &mgr;g entweder NTHi-2019, htrB-Mutanten-B29-LOS oder htrB-Mutante, die mit einem Trägerprotein konjugiert war, zusammen mit Adjuvans QS-21 immunisiert. Seren wurden aus jeder Gruppe 5 Wochen nach der Immunisierung gewonnen. Die Seren von Tieren einer Gruppe wurden vereinigt. Die vereinigten Seren wurden einer Bestimmung des anti-LOS-Antikörpertiters durch einen enzymgebundenen Immunosorbenstest (ELISA) unterzogen. Mikrotitervertiefungen von ELISA-Platten wurden mit 10 &mgr;g NTHi-2019-LOS oder htrB-Mutanten-B29-LOS beschichtet. 5 erläutert die durchschnittlichen Titer von anti-LOS-Antikörper gegen NTHi-2019-LOS (Antigenbeschichtung) im ELISA-Test von Mäusen, die mit NTHi-2019 (Pool 595), htrB-Mutanten-B29-LOS (Pool 597) oder htrB-Mutanten-B29-LOS unter Konjugation an ein Trägerprotein (Pool 606) immunisiert worden waren. 6 erläutert die durchschnittlichen Titer von anti-LOS-Antikörpern gegen htrB-Mutanten-B29-LOS (Antigenbeschichtung) in einem ELISA-Test von Mäusen, die mit NTHi-2019 (Pool 595), htrB-Mutanten-B29-LOS (Pool 597) oder htrB-Mutanten-B29-LOS unter Konjugation mit einem Trägerprotein (Pool 606) immunisiert worden waren. Ferner wurde Präimmunserum als Kontrolle mitgeführt ("Woche 0" oder "Zeitpunkt 0").\nDer durch die verschiedenen LOS-Präparate induzierte Antikörper wurde sodann auf seine funktionelle Aktivität getestet, indem bakterizide Tests unter Verwendung von NTHi-2019 als Ziel durchgeführt wurden. In die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen wurden 0,150 ml Puffer, 0,040 ml gepooltes Humanserum als Komplementquelle und 0,01 ml NTHi-2019 gegeben. Typischerweise wird der Organismus in einer Verdünnung (z. B. 20 bis 200 cfu) ausgestrichen. In die Testvertiefungen werden die entsprechenden Antiseren entweder in unverdünntem Zustand ("Reinsubstanz"), in einer 1/10-Verdünnung oder in einer 1/100-Verdünnung gegeben. Die Platte wird sodann 30 Minuten bei 37 °C heftig gedreht (175-200 U/min). Aliquotanteile aus entsprechenden Vertiefungen werden auf Medium ausgestrichen und gezüchtet, um die prozentuale Überlebensrate und den "log kill"-Wert zu bestimmen. Der "log kill"-Wert wird berechnet als log(cfu 30 Minuten/cfu Zeitpunkt 0). Die Ergebnisse des bakteriziden Tests sind in Tabelle 1 aufgeführt, wobei es sich bei der Gruppe R595 um das durch NTHi-2019-LOS induzierte Antiserum, bei der Gruppe R597 um das durch htrB-Mutanten-B29-LOS und bei der Gruppe 606 um das durch htrB-Mutanten-B29-LOS unter Konjugation an ein Trägerprotein induzierte Antiserum handelt.\nJe größer der "log kill"-Wert ist (je negativer die Zahl ist, z. B. –4,49), desto größer ist die bakterizide Aktivität des entsprechenden Antikörpers. Somit beträgt zu Vergleichszwecken in der Woche 7 und bei einer 1/10-Verdünnung der "log kill"-Wert für das durch NTHi-2019-LOS indizierte Antiserum –4,62, der "log kill"-Wert für das durch NTHi-htrB-Mutanten-B29-LOS induzierte Antiserum –4,49 und der "log kill"-Wert des durch htrB-Mutanten-B29-LOS unter Konjugation an ein Trägerprotein induzierte Antiserum –3,44. Beim ELISA-Test hat es den Anschein, dass das Antiserum, das durch htrB-Mutanten-B29-LOS induziert worden ist, einen geringen Antikörpertiter aufweist, jedoch belegen die bakteriziden Tests, dass durch die Immunisierung mit htrB-Mutanten-B29-LOS ein signifikanter, funktioneller Antikörper entstanden ist.\n5.2 Gemäß einem weiteren Aspekt werden bakterielle htrB-Mutantenzellen als Immunogen in einer Vakzineformulierung verwendet. Zur Erläuterung der Einflüsse der Immunisierung mit bakteriellen htrB-Mutantenzellen wurde ein Modell mit Rattenjungen verwendet. Die Anwendung des Modells mit Rattenjungen als Modell für bakterämische Infektionen aufgrund von Typ b-H. influenzae (Hib) beim Menschen und zur Bestimmung der Virulenz der Typ b-H. influenzae-Stämme wird von der Fachwelt anerkannt (vergl. z. B. Smith et al., Infect. Immun., Bd. 8 (1973), S. 278–290; Moxon et al., J. Infect. Dis., Bd. 129 (1974), S. 154–162; Rubin et al., Infect. Immun., Bd. 41 (1983), S. 280–284; Zwahlen et al., J. Infect. Dis., Bd. 152 (1985), S. 485–492).\nDer Typ b-Stamm A2 von H. influenzae wurde früher als hochgradig virulenter Stamm im Modellsystem mit Rattenjungen, das nach der Inokulation (z. B. intraperitoneal oder intranasal) Bakterämie und Meningitis hervorruft, und als ein klinisches Isolat aus Menschen (es wurde von einem Kind, das durch H. influenzae hervorgerufene Meningitis hatte, isoliert) charakterisiert. Unter Verwendung der Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde eine htrB-Mutante aus Hib-Stamm A2 hergestellt. Sprague-Dawley-Albinoratten im Alter von 1 Woche erhielten eine intraperitoneale Inokulation mit 107 Hib-Stamm A2 oder 107 htrB-A2-Mutante. Anschließend wurde die intravaskuläre Clearance bestimmt, indem die Anzahl an kolonienbildenden Einheiten (cfus) pro ml Blut 48 Stunden nach der Inokulation gemessen wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass alle 20 Rattenjungen, die mit Hib-Stamm A2 inokuliert worden waren, Bakterämie aufwiesen, wobei sämtliche Ratten mehr als 105 cfu/ml Stamm A2 zeigten. Im Gegensatz dazu zeigten nur 13 von 20 Rattenjungen, die mit der htrB-A2-Mutante inokuliert worden waren, Bakterämie, wobei nur 10 der 13 Tiere einen Wert von mehr als 105 cfu/ml htrB-A2-Mutante aufwiesen.\nGleichermaßen wurden Sprague-Dawley-Albinoratten im Alter von 1 Woche intranasal mit 107 Hib-Stamm A2 oder 107 htrB-A2-Mutante inokuliert und anschließend einer Bestimmung der intravaskulären Clearance unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass 8 von 20 Rattenjungen, denen Hib Stamm A2 inokuliert worden war, Bakterämie aufwiesen, wobei 7 dieser 8 Ratten einen Wert von mehr als 105 cfu/ml Stamm A2 zeigten. Im Gegensatz dazu wies keines der 30 Rattenjungen, denen die htrB-A2-Mutante inokuliert worden war, Bakterämie auf. Zusammengefasst lässt sich aus diesem Modellsystem der Schluss ziehen, dass htrB-Mutanten eine abgeschwächte Virulenz zeigen, verglichen mit dem Wildtypstamm, wie die verringerte Fähigkeit zur Herbeiführung von Bakterämie anzeigt (z. B. eine 30%ige Verringerung des Auftretens von Bakterämie).\nUm den Einfluss der Immunisierung mit bakteriellen htrB-Mutantenzellen weiter zu erläutern, wurde ein Chinchilla-Modell herangezogen. Die Verwendung des Chinchilla-Modells als Modell für Mittelohrinfektionen aufgrund von nicht-typisierbarem H. influenzae (NTHi) bei Menschen und zur Bestimmung der Virulenz von NTHi-Stämmen ist in der Fachwelt anerkannt (vergl. beispielsweise Bakaletz et al., Acta Otolaryngol., Bd. 107 (1989), S. 235–243; Madore et al., Pediatrics, Bd. 86 (1990), S. 527–534; Barenkamp, Infect. Immun., Bd. 52 (1986), S. 572–578; Green et al., Methods Enzymol., Bd. 235 (1994), S. 59–68).\nNTHi-2019 ist ein in der Literatur beschriebenes klinisches Isolat (vergl. beispielsweise Murphy et al., Infect. Immun., Bd. 54 (1986), S. 774–779). Die einzelnen gesunden erwachsenen Chinchilla-Tiere erhielten eine Inokulation verschiedener log-Dosen von NTHi-2019 oder htrB-Mutanten-NTHi-B29 über die Epitympanon-Bulla in den Mittelohrraum. Der Verlauf der Mittelohrkrankheit wurde sodann durch periodische otoskopische Prüfung auf eine Tympanonmembran-Entzündung oder durch Mittelohr-Infusion und Aspiration aus dem Mittelohr unter anschließender Züchtung bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zu NTHi-2019 eine bis zu um 3 log größere Dosis von htrB-Mutanten-NTHi-B29 (107 cfu/Ohr) zur Herbeiführung einer Mittelohrinfektion aufgenommen wird. Aus diesem Modellsystem lässt sich der Schluss ziehen, dass htrB-Mutanten eine abgeschwächte Virulenz zeigen, verglichen mit dem Wildtypstamm, wie sich aus der verringerten Fähigkeit zur Herbeiführung der Mittelohrerkrankung ergibt.\nGemäß einem weiteren Aspekt wird die H. influenzae-htrB-Mutante gentechnisch so bearbeitet, dass sie ein oder mehr heterologe, bakterielle Antigene exprimiert. Wie nachstehend ausführlich erläutert, weist H. influenzae einen natürlichen genetischen Transformationsprozess auf, der eine Bindung von linearisierter DNA, die Aufnahme über eine oder mehrere Aufnahmesequenzen (z. B. AAGTGCGGT-SEQ ID NO:3), eine Translokation und eine Rekombination beinhaltet. Somit besteht ein Mechanismus zur Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls mit einem Gehalt an dem mindestens einen zu exprimierenden, heterologen, bakteriellen Antigen darin, die Wirts-H. influenzae-htrB-Mutante mit einem linearisierten, rekombinanten DNA-Molekül zu transformieren, das die DNA enthält, die für das mindestens eine heterologe, bakterielle Antigen ("die Kodierungssequenz") kodiert. Alternativ kann das rekombinante DNA-Molekül, das die zu exprimierende, kodierende Sequenz enthält, in einen Plasmidvektor inseriert werden und als linearisiertes, rekombinantes Molekül durch den natürlichen Transformationsvorgang; als zirkularisiertes, rekombinantes Plasmid unter Anwendung von Elektroporation von nicht-kompetenten H. influenzae-htrB-Mutanten; oder als ein zirkularisiertes, rekombinantes Plasmid, das in kompetente H. influenzae-htrB-Mutanten transformiert worden ist, eingeführt werden.\nPlasmide, die sich für die Klonierung von rekombinanten DNA-Molekülen und deren Expression in H. influenzae eignen, sind dem Fachmann geläufig. Zu derartigen Plasmiden gehören:\npRSF0885 verleiht Ampicillin-Resistenz und enthält eine PvuII-Klonierungsstelle und eine defektive TnA-Sequenz (Setlow et al., J. Bacteriol., Bd. 148 (1981), S. 804–811) und kann sowohl in H. influenzae als auch in E. coli replizieren (Trieu et al., Gene, Bd. 86 (1990), S. 99–102);\npDM2 wurde durch Klonierung von Chloramphenicol-Resistenz in pRSF0885 konstruiert; und pDM5 wurde durch Klonierung von Tetracyclin-Resistenz in pRSF0885 konstruiert (McCarthy et al., J. Bacteriol., Bd. 168 (1986), S. 186–191).\npVT63, pVT64, pVT65 und pVT66 sind verbesserte Shuttle-Vektoren für H. influenzae und E. coli auf der Basis von pDM2 (Trieu et al., Gene, Bd. 86 (1990), S. 99–102) und enthalten das pUC-Derivat von ColE1 ori und den pRSF0885-rep-Locus. Ferner weist jedes Plasmid Arzneistoffmarker mit besonderen Restriktionsstellen für eine Insertionsinaktivierung des Arzneistoffmarkers gemäß folgenden Angaben auf: pVT63-ApR (HincII, PstI, ScaI), KmR (ClaI, HindIII, NruI, SmaI, XhoI); pVT64-ApR (HincII, PstI, ScaI, SspI), SpR; pVT65-ApR (HincII, PstI, ScaI, PvuI, SspI), CmR (BalI, NcoI); pVT66-ApR (HincII, PstI, ScaI, PvuI), CmR (SmaI).\npACYC177, pACYC184, pSU2718 und pSU2719 sind verbesserte Shuttle-Vektoren für H. influenzae und E. coli auf der Basis von p15A (Chandler, Plasmid, Bd. 25 (1991), S. 221–224). Sie weisen das p15A ori auf und waren mit einem Plasmid mit einem Gehalt an der RSF0885-Replikationsursprungsstelle verträglich. Ferner weist jedes Plasmid mehrfache Klonierungsstellen-Restriktionsstellen und Arzneistoffmarker gemäß den folgenden Angaben auf: pACYC177-ApR, KmR (Hinterlegungsnummer X06402); pACYC184-CmR, TcR (Hinterlegungsnummer X06403); pSU2718-CmR und eine Polyklonierungsstelle aus pUC18 (Hinterlegungsnummer M64731); und pSU2719-CmR und eine Polyklonierungsstelle aus pUC19 (Hinterlegungsnummer M64732).\npQL1 ist ein verbesserter Shuttle-Vektor zur Verwendung in H. influenzae und E. coli, der sowohl das pMB1 ori als auch P15a ori, KmR, das durch H. influenzae-Aufnahmesequenzen flankiert ist, eine mehrfache Klonierungsstelle mit einem Gehalt an einer einzigen BamHI- und SmaI-Restriktionstelle enthält und der sich insbesondere zur Analyse der H. influenzae-Promotorstärke in H. influenzae eignet (Heidecker et al., Gene, Bd. 150 (1994), S. 141–144).\nBei der Klonierung des rekombinanten DNA-Moleküls, das die Kodierungssequenz enthält, in einen Plasmidvektor wird der Fachmann berücksichtigen, dass die Wahl der Restriktionsenzyme für den Verdau sowohl des rekombinanten DNA-Moleküls als auch des Plasmids zu für die Ligation verträglichen Enden abhängt von: den besonderen Restriktionsenzymstellen an den Enden des rekombinanten DNA-Moleküls, die entweder natürlich auftreten oder gentechnisch manipuliert worden sind, z. B. während der enzymatischen Amplifikation; einer oder mehreren besonderen Restriktionsenzymstellen innerhalb des Plasmidvektors; und davon, ob die Insertion in den Plasmidvektor den Selektionsvorgang unterstützt (vergl. z. B. pVT66); und ob ein von einem Plasmid abgeleiteter Promotor allein oder zusätzlich zu dem oder den Promotoren der Kodierungssequenzen verwendet wird, um die Expression ausgehend vom rekombinanten DNA-Molekül anzutreiben. Eine Selektion und ein Screening von transformierten H. influenzae-htrB-Mutanten kann gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erreicht werden, wozu der Nachweis der Expression eines Markergens (z. B. eines Arzneistoff-Resistenzmarkers), das im Plasmid vorliegt und der Immunonachweis des exprimierten und angezeigten, heterologen, bakteriellen Antigens gehören. Obgleich dieser Aspekt der Ausführungsform erläutert, dass das rekombinante DNA-Molekül, das die Kodierungssequenz enthält, in ein Plasmid inseriert und in H. influenzae-htrB-Mutanten exprimiert werden kann, ist es für den Fachmann ersichtlich, dass Vektoren, die von Plasmiden abweichen, verwendet werden können, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Bakteriophagen-Vektoren.\nEine erfolgreiche Expression des mindestens einen heterologen, bakteriellen Antigens macht es erforderlich, dass entweder das rekombinante DNA-Molekül, das die Kodierungssequenz umfasst, oder der Vektor selbst die erforderlichen Kontrollelemente für die Transkription und Translation enthalten, die mit dem für die Expression verwendeten speziellen Wirtssystem verträglich sind und von diesem erkannt werden. Unter Anwendung von auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannten Verfahren, einschließlich der vorstehend beschriebenen Verfahren, können verschiedene Promotoren und Enhancer dem Vektor oder dem rekombinanten DNA-Molekül, das die Kodierungssequenz zur Verstärkung der Expression des heterologen, bakteriellen Antigens enthält, einverleibt werden, mit der Maßgabe, dass die verstärkte Expression des oder der heterologen, bakteriellen Antigene mit der htrB-Mutante verträglich sind (z. B. für sie nicht toxisch sind). Wie ausgeführt, kann die Kodierungssequenz DNA enthalten, die für mehr als ein heterologes, bakterielles Antigen kodiert, und sie kann virale und/oder fungale antigenkodierende Sequenzen enthalten, um ein multivalentes Antigen zur Verwendung als eine verbesserte Vakzinezusammensetzung zu schaffen.\nDie Wahl des Promotors hängt vom verwendeten Expressionssystem ab. Beispielsweise kann es sich bei einem bevorzugten Promotor in einem H. influenzae-Expressionssystem um den P2- oder P6-Promotor handeln, der funktionell mit der Kodierungssequenz verknüpft ist. Promotoren variieren bezüglich ihrer Stärke, d. h. ihrer Fähigkeit zur Erleichterung der Transkription. Im allgemeinen ist es für die Expression eines klonierten Gens erstrebenswert, einen starken Promotor zu verwenden, um ein hohes Niveau der Transkription des Gens und der Expression zum Genprodukt zu erzielen. Beispielsweise umfassen Bakterien-, Phagen- oder Plasmid-Promotoren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind und bei denen ein hohes Niveau der Transkription in einem Wirtszellsystem mit einem Gehalt an E. coli festgestellt worden ist, den lac-Promotor, den trp-Promotor, den recA-Promotor, den ribosomalen RNA-Promotor, die PR- und PL-Promotoren, lacUV5, ompF, bla, lpp und dergl. Sie können zur Herbeiführung der Transkription der inserierten Kodierungssequenz verwendet werden.\nWeitere Kontrollelemente für eine wirksame Gentranskription oder Translation einer Botschaft umfassen Enhancer und regulatorische Signale. Enhancer-Sequenzen sind DNA-Elemente die offensichtlich den transkriptionellen Wirkungsgrad in einer von ihrer Position und Orientierung in Bezug auf ein benachbartes Gen relativ unabhängigen Weise verstärken. Somit kann in Abhängigkeit vom verwendeten Wirtszell-Expressionsvektor-System ein Enhancer strangaufwärts oder strangabwärts von der Kodierungssequenz angebracht werden, um den transkriptionellen Wirkungsgrad zu erhöhen. Diese oder andere regulatorische Stellen, z. B. Transkriptions- oder Translationsinitiationssignale, können verwendet werden, um die Expression der Kodierungssequenz zu regulieren. Derartige regulatorische Elemente können in das rekombinante DNA-Molekül, das die Kodierungssequenz enthält, oder in benachbarte Vektor-DNA-Sequenzen unter Anwendung der hier beschriebenen rekombinanten DNA-Verfahren, die dem Fachmann bezüglich einer Insertion von DNA-Sequenzen geläufig sind, inseriert werden.\nDemzufolge kann ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Kodierungssequenz enthält, in einen Expressionsvektor an einer spezifischen Stelle in Bezug auf Promotor-, Kontroll- und Regulationselemente des Vektors so ligiert werden, dass dann, wenn der rekombinante Vektor in die htrB-Mutante eingeführt wird, das heterologe, bakterielle Antigen in der Wirtszelle exprimiert werden kann. Der rekombinante Vektor wird sodann in die htrB-Mutante eingeführt und die transformierten htrB-Mutanten werden ausgewählt und einem Screening auf solche Zellen, die den rekombinanten Vektor enthalten, unterworfen. Die Selektion und das Screening können nach dem Fachmann geläufigen Verfahren und in Abhängigkeit vom verwendeten Vektor- und Expressionssystem vorgenommen werden.\nDie Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die Kodierungssequenz (einschließlich einen Expressionsvektor oder ein Plasmid, die diese Sequenz enthalten) enthält, in H. influenzae-htrB-Mutanten kann nach einem von drei Verfahren durchgeführt werden: ein natürlicher genetischer Transformationsprozess; Transformation von kompetenten bakteriellen Zellen; und Elektroporation von nicht-kompetenten bakteriellen Zellen.\nDer natürliche genetische Transformationsprozess von H. influenzae beinhaltet die Bindung von linearisierter DNA, die Aufnahme über eine oder mehrere Aufnahmesequenzen, die Translokation und die Rekombination. Somit besteht ein Mechanismus zur Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die zu exprimierende Kodierungssequenz enthält, in ein heterologes, bakterielles Antigen in der Transformation des Wirts H. influenzae mit einem linearisierten, rekombinanten DNA-Molekül, das die Kodierungssequenz enthält; oder die Transformation erfolgt mit einem linearisierten Vektor, in den das rekombinante DNA-Molekül, das die zu exprimierende Kodierungssequenz enthält, inseriert ist. Wenn bei diesem natürlichen Prozess die linearisierte DNA intrazellulär transloziert wird, wird einer der translozierten Stränge der DNA offensichtlich durch Exonuclease-Aktivität abgebaut (Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 7274–7278). Wenn dem translozierten Strang eine für die Rekombination in das H. influenzae-Chromosom ausreichende Homologie fehlt, wird der translozierte Strang gegenüber einem weiteren Abbau empfindlich (Pifer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 3731–3735). Unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren (z. B. Barany et al., (1983), a.a.O.; durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) kann linearisierte DNA, die die Kodierungssequenz enthält, in H. influenzae-htrB-Mutanten eingeführt werden. Da die Kodierungssequenz durch H. influenzae-Sequenzen flankiert sein kann, kann die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Rekombination der Kodierungssequenz in das Genom der H. influenzae-htrB-Mutanten leicht erhöht werden.\nTransformation von kompetenten bakteriellen Zellen\nEin weiterer Mechanismus zur Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die zu exprimierende Kodierungssequenz enthält, in mindestens ein heterologes bakterielles Antigen besteht darin, kompetente Wirt-H. influenzae-htrB-Mutanten mit einem zirkulären Vektor, z. B. mit einem Plasmid, zu transformieren, in das das rekombinante DNA-Molekül, das die zu exprimierende Kodierungssequenz enthält, inseriert ist. Die Kompetenz von H. influenzae entwickelt sich am besten unter Bedingungen, bei denen die bakterielle Zellverdoppelung gehemmt wird, z. B. in Form eines zeitweiligen Übergangs auf anaerobe Bedingungen, durch eine physiologische Veränderung, die während der späten logarithmischen Wachstumsphase auftritt, und durch eine Übertragung von Zellen auf ein nährstoffarmes, chemisch definiertes Medium. Derartige definierte Medien zur Entwicklung von Kompetenz von H. influenzae sind in der Literatur ausführlich beschrieben (Herriott et al., J. Bacteriol., Bd. 101 (1970), S. 517–524; durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Es hat den Anschein, dass nur kurze Zeit nach Auftreten von kompetentem H. influenzae ein Plasmid, das zum bakteriellen Chromosom homologe Sequenzen enthält, seine homologe Sequenz (z. B. die durch H. influenzae-Sequenzen flankierte Kodierungssequenz) in das Chromosom über eine Rekombination (Setlow et al., (1981), a.a.O.) für die Expression inserieren kann. Somit wird bei dieser Ausführungsform ein Plasmid, das die Kodierungssequenz enthält, die zur Transformation in kompetente H. influenzae-htrB-Mutanten befähigt ist, durch aus dem Stand der Technik bekannte Transformationsverfahren eingeführt (Karudapuram et al., J. Bacteriol., Bd. 177 (1995), S. 3235–3240; Setlow et al., (1981), a.a.O.). Die Kodierungssequenz kann sodann in das Genom von H. influenzae-htrB-Mutanten rekombiniert werden, wo es unter der Kontrolle seines eigenen Promotors oder eines H. influenzae-Promotors, der sich nahe an der Insertionsstelle befindet, exprimiert wird. Eine derartige Transformation soll mit relativ hoher Frequenz erfolgen (McCarthy und Cox, J. Bacteriol., Bd. 168 (1986), S. 186–191).\nAlternativ kann eine Transformation von kompetenten H. influenzae-htrB-Mutanten durch ein zirkuläres Plasmid mit der oder den entsprechenden Replikationsursprungsstellen, das die Kodierungssequenz enthält, zur Plasmid-Bereitstellung führen; d. h. zu einem Plasmid, das als extrachromosomales Element ohne Rekombination koexistiert. Beispiele für derartige Plasmide wurden vorstehend beschrieben. Somit wird bei dieser Variation ein Plasmid, das die Kodierungssequenz enthält, die zur Transformation in kompetente H. influenzae-htrB-Mutanten und zur Etablierung darin befähigt ist, durch aus dem Stand der Technik bekannte Transformationsverfahren eingeführt. Anschließend wird die Kodierungssequenz aus dem Plasmid unter der Kontrolle seines eigenen Promotors oder eines Promotors innerhalb des Vektors exprimiert.\nElektroporation von nicht-kompetenten bakteriellen Zellen\nEin weiterer Mechanismus zur Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die zu exprimierende Kodierungssequenz enthält, in mindestens ein heterologes bakterielles Antigen besteht in der Einführung eines zirkulären Vektors, z. B. eines Plasmids, in das das rekombinante DNA-Molekül, das die zu exprimierende Kodierungssequenz enthält, inseriert ist, in nicht-kompetente Wirt-H. influenzae-htrB-Mutanten durch Elektroporation. Eine Elektroporation wurde in wirksamer Weise zur Einführung von Plasmid-DNA in Bakterien verwendet. Jedoch können sich die optimalen Bedingungen je nach der verwendeten Wirtszelle unterscheiden. Optimale Bedingungen für die Elektroporation von Plasmid-DNA in H. influenzae sind in der Literatur beschrieben (Mitchell et al., Nucl. Acids Res., Bd. 19 (1991), S. 3625–3628; durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Es wurde festgestellt, dass eine Elektroporation von Plasmid in H. influenzae, das durch definierte, nährstoffarme Medien kompetent gemacht worden ist, um mehrere Größenordnungen weniger wirksam war, als eine Elektroporation in nicht-kompetentes H. influenzae. Somit ist es bei dieser Variation der Ausführungsform bevorzugt, dass ein Plasmid, das die Kodierungssequenz enthält, in nicht-kompetente H. influenzae-htrB-Mutanten durch Elektroporation eingeführt wird. Das Plasmid ist zur Etablierung in X. influenzae-htrB-Mutanten befähigt oder es wird abgebaut, nachdem die Kodierungssequenz in das Genom der H. influenzae-htrB-Mutanten rekombiniert worden ist. In beiden Fällen steht die Kodierungssequenz unter der Kontrolle ihres eigenen Promotors; bzw. unter der Kontrolle eines Promotors innerhalb des Vektors oder Genoms.\nBeispiel 6 Neisseria-htrB-Mutanten als Immunogene\nBei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der htrB-Mutante um eine Neisseria-htrB-Mutante, die aus der Gruppe Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis ausgewählt ist. N. gonorrhoeae ist ein gram-negatives, bakterielles Pathogen, das die Geschlechtskrankheit Gonorrhoe hervorruft, die anschließend bei Frauen zu einer Beckenentzündung führen kann. N. meningitidis ist ein gram-negatives, bakterielles Pathogen, das verschiedene klinische Infektionen hervorrufen kann, einschließlich Bakterämie, Septikämie, Meningitis und Pneumonie. Es wird angenommen, dass Veränderungen in der terminalen Glycosylierung des LOS von Neisseria in Korrelation mit der Serumempfindlichkeit und der Serumresistenz des Organismus stehen. Ferner ist ein schützender, bakterizider Antikörper gegen typspezifische Antigene von N. meningitidis gerichtet, wobei die typspezifischen Antigene als äußere Membranproteine und/oder LOS identifiziert worden sind.\nUnter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie sie in den Beispielen 1–3 und 10 erläutert sind, lassen sich htrB-Mutanten von Neisseria-Spezies erzeugen und identifizieren. Der Fachmann kann unter Verwendung des htrB-Gens von H. influenzae das htrB-Gen der Neisseria-Spezies isolieren und ein mutiertes htrB-Gen (das zur Kodierung von funktionellem HtrB unfähig ist) unter Anwendung von Transposon-Mutagenese unter anschließender Rekombination erzeugen, wodurch man eine Neisseria-htrB-Mutante erhält, der eine oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen. Alternativ kann eine ausreichende Homologie zwischen Neisseria und Haemophilus bestehen, um die Plasmide pB28 und pB29 zu verwenden, die jeweils ein mini-Tn3-Transposon mit einem Gehalt an dem Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen, das in den offenen htrB-Leseraster an einer unterschiedlichen Stelle inseriert ist, enthalten, um die Neisseria-Spezies für die Rekombination des mutanten htrB-Gens in das Neisseria-htrB-Gen zu transformieren. Neisseria-Transformanten werden dann aufgrund ihres Wachstums in Gegenwart von Chloramphenicol (1,5 &mgr;g/ml) ausgewählt, was zur Identifikation von Neisseria-htrB-Mutantenstämmen führt. Die Positionen der mTn3-Insertion in die Chromosomen der Neisseria-htrB-Mutanten kann durch genomische Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die htrB-Sequenzen enthält, bestätigt werden. Die erhaltenen Neisseria-htrB-Mutanten können einem Test auf eine im wesentlichen verringerte Toxizität unterzogen werden, wobei man Tests heranzieht, die von Fachleuten auf dem Gebiet der Messung der toxischen Wirkungen, die durch Endotoxin induziert werden, beschrieben wurden.\nUnter Anwendung der in den Beispielen 4 und 5 erläuterten Verfahren kann aus einer Neisseria-htrB-Mutante isoliertes Endotoxin in einer Vakzineformulierung zur Induktion von Immunität gegen die Wildtypstämme von Neisseria-Pathogenen verwendet werden. Das mutante htrB-LOS kann durch Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Isolierung von LOS bekannt sind, isoliert werden. Das mutante htrB-LOS kann in einer Vakzineformulierung verwendet werden, die ein oder mehr Mittel enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem pharmazeutisch verträglichen Träger (z. B. einer physiologischen Lösung), einem Adjuvans oder einem Trägerprotein besteht.\nAlternativ können Neisseria-htrB-Mutanten in einer bakteriellen Lebendvakzinezubereitung oder in einer bakteriellen inaktivierten Vakzinezubereitung verwendet werden und können gentechnisch so bearbeitet werden, dass sie mindestens ein heterologes bakterielles Antigen in einer multivalenten Vakzinezubereitung exprimieren. Bezüglich des letztgenannten Aspekts sind Plasmide, die sich zum Klonieren von rekombinanten DNA-Molekülen in Neisseria-Spezies und zu deren Expression eignen, der Fachwelt bekannt. Hierzu gehören:\npLES2 verleiht Ampicillin-Resistenz, ist ein Shuttle-Vektor, der sowohl in E. coli als auch in N. gonorrhoeae funktionell ist und einen Polylinker mit Restriktionsstellen für EcoRI, SmaI und BamHI enthält (Stein et al., Gene, Bd. 25 (1983), S. 241–247). Neisseria-Spezies enthalten ebenfalls einen natürlichen Transformationsprozess (Rudel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 92 (1995), S. 7896–7890; Goodman et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), S. 5921–5923); und können ferner unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren kompetent gemacht oder der Elektroporation unterzogen werden.\nBeispiel 7 Haemophilus ducreyi-htrB-Mutanten als Immunogene\nBei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Mutante um eine H. ducreyi-htrB-Mutante. H. ducreyi ist ein gram-negatives, bakterielles Pathogen, das zu einer genitalen Ulcus-Krankheit, nämlich Ulcus molle, führt. Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, die in den Beispielen 1–3 und 10 erläutert sind, lassen sich H. ducreyi-htrB-Mutanten erzeugen und identifizieren. Der Fachmann kann unter Verwendung des htrB-Gens von H. influenzae das htrB-Gen von H. ducreyi isolieren und ein mutiertes htrB-Gen (unfähig zur Kodierung von funktionellem HtrB) unter Anwendung von Transposon-Mutagenese unter anschließender Rekombination erzeugen, wodurch man eine H. ducreyi-htrB-Mutante erhält, der eine oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen. Alternativ gibt es wahrscheinlich eine ausreichende Homologie zwischen H. ducreyi und H. influenzae, um die Plasmide pB28 und pB29 zu verwenden, bei denen jeweils ein mini-Tn3-Transposon mit einem Gehalt an dem Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen in den offenen htrB-Leseraster an einer unterschiedlichen Position inseriert ist. Damit wird H. ducreyi für eine Rekombination des mutanten-htrB-Gens in das H. ducreyi-htrB-Gen transformiert. H. ducreyi-Transformanten werden sodann in Bezug auf ihr Wachstum in Gegenwart von Chloramphenicol (1,5 &mgr;g/ml) ausgewählt, was zur Identifikation von mutanten H. ducreyi-htrB-Stämmen führt. Die Positionen der mTn3-Insertion in den Chromosomen der H. ducreyi-htrB-Mutanten kann durch genomische Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde mit einem Gehalt an htrB-Sequenzen bestätigt werden. Die erhaltenen H. ducreyi-htrB-Mutanten können sodann in Bezug auf eine im wesentlichen verringerte Toxizität unter Anwendung von Tests getestet werden, die aus der Fachliteratur als Tests zum Messen der toxischen Wirkungen, die durch Endotoxin induziert werden, beschrieben sind.\nUnter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, die in den Beispielen 4 und 5 erläutert sind, kann Endotoxin, das aus einer H. ducreyi-htrB-Mutante isoliert worden ist, in einer Vakzineformulierung zur Herbeiführung von Immunität gegen Wildtypstämme von H. ducreyi verwendet werden. Das mutante htrB-LOS kann durch ein Verfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung von LOS bekannt ist, isoliert werden. Das mutante htrB-LOS kann in einer Vakzineformulierung verwendet werden, die ein oder mehr Mittel enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: pharmazeutisch akzeptabler Trägerstoff (z. B. eine physiologische Lösung), ein Adjuvans oder ein Trägerprotein.\nAlternativ können H. ducreyi-htrB-Mutanten in einem bakteriellen Lebendvakzinepräparat oder in einem inaktivierten bakteriellen Vakzinepräparat verwendet werden und sie können gentechnisch so manipuliert werden, dass sie mindestens ein heterologes bakterielles Antigen in einem multivalenten Vakzinepräparat exprimieren. Was den letztgenannten Aspekt betrifft, so sind Plasmide, die sich für die Klonierung von rekombinanten DNA-Molekülen in eine Haemophilus-Spezies und zur Expression dieser Moleküle eignen, dem Fachmann geläufig, wie in Beispiel 5 ausgeführt wird. Ferner können die Haemophilus-Spezies kompetent gemacht werden oder der Elektroporation unterworfen werden, indem man Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, heranzieht, wie sie beispielsweise in Beispiel 5 beschrieben sind.\nBeispiel 8 Campylobacter jejuni-htrB-Mutanten als Immunogene\nGemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Mutante um eine C. jejuni-htrB-Mutante. Campylobacter jejuni ist ein gram-negatives bakterielles Pathogen, das humane Enteritis verursacht. Eine Infektion durch C. jejuni wurde auch mit dem Einsetzen von neurologischen Störungen, wie dem Guillian-Barre-Syndrom, in Verbindung gebracht. C. jejuni-htrB-Mutanten lassen sich unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie sie in den Beispielen 1–3 und 10 erläutert sind, erzeugen und identifizieren. Der Fachmann kann unter Verwendung des htrB-Gens von H. influenzae das htrB-Gen von C, jejuni isolieren und ein mutiertes htrB-Gen (unfähig zur Kodierung von funktionellem htrB) unter Anwendung der Transposon-Mutagenese unter anschließender Rekombination erzeugen, wodurch man eine C. jejuni-htrB-Mutante erhält, der eine oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen. Alternativ kann eine ausreichende Homologie zwischen C. jejuni und H. influenzae bestehen, um die Plasmide pB28 und pB29 zu verwenden, bei denen jeweils ein mini-Tn3-Transposon mit einem Gehalt an dem Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT)-Gen in den offenen htrB-Leseraster an einer verschiedenen Position inseriert ist. Damit wird C. jejuni für eine Rekombination des mutanten htrB-Gens in das C. jejuni-htrB-Gen transformiert. C. jejuni-Transformanten werden sodann in Bezug auf das Wachstum in Gegenwart von Chloramphenicol (1,5 &mgr;g/ml) ausgewählt, was zur Identifikation von C. jejuni-htrB-Mutantenstämmen führt. Die Positionen der mTn3-Insertion in den Chromosomen der C. jejuni-htrB-Mutanten kann durch genomische Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde mit einem Gehalt an htrB-Sequenzen bestätigt werden. Die erhaltenen C. jejuni-htrB-Mutanten können sodann auf eine erheblich verringerte Toxizität unter Anwendung von Tests getestet werden, die in der Fachliteratur zur Messung der toxischen Wirkungen, die durch Endotoxin induziert werden, beschrieben sind.\nUnter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, die in den Beispielen 4 und 5 erläutert sind, kann Endotoxin, das aus einer C. jejuni-htrB-Mutante isoliert worden ist, in einer Vakzineformulierung zur Herbeiführung von Immunität gegen Wildtypstämme von C. jejuni verwendet werden. Das mutante htrB-LPS kann durch ein Verfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung von LPS bekannt ist, isoliert werden. Das mutante htrB-LPS kann in einer Vakzineformulierung verwendet werden, die ein oder mehr Mittel enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: pharmazeutisch akzeptabler Trägerstoff (z. B. eine physiologische Lösung), ein Adjuvans oder ein Trägerprotein.\nAlternativ können C. jejuni-htrB-Mutanten in einem bakteriellen Lebendvakzinepräparat oder in einem inaktivierten bakteriellen Vakzinepräparat verwendet werden und sie können gentechnisch so manipuliert werden, dass sie mindestens ein heterologes bakterielles Antigen in einem multivalenten Vakzinepräparat exprimieren. Bezüglich des letztgenannten Aspekts sind Plasmide, die sich zum Klonieren von rekombinanten DNA-Molekülen in C. jejuni und zur Expression eignen, dem Fachmann geläufig. Hierzu gehören:\npUA466 verleiht Tetracyclin-Resistenz und enthält eine einzige AvaI-Stelle und eine AvaII-Ste11e (Taylor, J. Bacteriol., Bd. 165 (1986), S. 1037–1039). C. jejuni kann auch kompetent gemacht werden oder der Elektroporation unterworfen werden, wobei man sich Techniken bedient, die dem Fachmann geläufig sind.\nBeispiel 9 Moraxella catarrhalis-htrB-Mutanten als Immunogene\nBei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Mutante um eine M. catarrhalis-htrB-Mutante. Moraxella catarrhalis ist ein gram-negatives, bakterielles Pathogen, das Mittelohrentzündung bei Kindern; Sinusitis und Konjunktivitis bei Kindern und Erwachsenen; und Infektionen des unteren Atmungstrakts, Septikämie und Meningitis bei immungeschwächten Wirten hervorruft. M. catarrhalis-htrB-Mutanten können unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie sie in den Beispielen 1–3 und 10 erläutert sind, hergestellt und identifiziert werden. Der Fachmann kann unter Verwendung des htrB-Gens von H. influenzae das htrB-Gen von M. catarrhalis isolieren und ein mutiertes htrB-Gen (unfähig zur Kodierung von funktionellem HtrB) unter Anwendung von Transposon-Mutagenese unter anschließender Rekombination erzeugen, wodurch man eine M. catarrhalis-htrB-Mutante erhält, der eine oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen. Alternativ gibt es wahrscheinlich eine ausreichende Homologie zwischen M. catarrhalis und H. influenzae, um die Plasmide pB28 und pB29 zu verwenden, bei denen jeweils ein mini-Tn3-Transposon mit einem Gehalt an dem Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT)-Gen in den offenen htrB-Leseraster an einer unterschiedlichen Position inseriert ist. Damit wird M. catarrhalis für eine Rekombination des mutanten-htrB-Gens in das M. catarrhalis-htrB-Gen transformiert. M. catarrhalis-Transformanten werden sodann in Bezug auf ihr Wachstum in Gegenwart von Chloramphenicol (1,5 &mgr;g/ml) ausgewählt, was zur Identifikation von mutanten M. catarrhalis-htrB-Stämmen führt. Die Positionen der mTn3-Insertion in den Chromosomen der M. catarrhalis-htrB-Mutanten kann durch genomische Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde mit einem Gehalt an htrB-Sequenzen bestätigt werden. Die erhaltenen M. catarrhalis-htrB-Mutanten können sodann in Bezug auf eine im wesentlichen verringerte Toxizität unter Anwendung von Tests getestet werden, die aus der Fachliteratur als Tests zum Messen der toxischen Wirkungen, die durch Endotoxin induziert werden, beschrieben sind.\nUnter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, die in den Beispielen 4 und 5 erläutert sind, kann Endotoxin, das aus einer M. catarrhalis-htrB-Mutante isoliert worden ist, in einer Vakzineformulierung zur Herbeiführung von Immunität gegen Wildtypstämme von M. catarrhalis verwendet werden. Das mutante htrB-LOS kann durch ein Verfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung von LPS bekannt ist, isoliert werden. Das mutante htrB-LOS kann in einer Vakzineformulierung verwendet werden, die ein oder mehr Mittel enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: pharmazeutisch akzeptabler Trägerstoff (z. B. eine physiologische Lösung), ein Adjuvans oder ein Trägerprotein.\nAlternativ können M. catarrhalis-htrB-Mutanten in einem bakteriellen Lebendvakzinepräparat oder in einem inaktivierten bakteriellen Vakzinepräparat verwendet werden und sie können gentechnisch so manipuliert werden, dass sie mindestens ein heterologes bakterielles Antigen in einem multivalenten Vakzinepräparat exprimieren. Was den letztgenannten Aspekt betrifft, sind Plasmide, die sich zum Klonieren von rekombinanten DNA-Molekülen in M. catarrhalis und zu deren Expression eignen, dem Fachmann geläufig. M. catarrhalis enthält einen natürlichen Transformationsprozess (J. Clin. Microbiol., Bd. 5 (Juni 1977), S. 227–235) und kann unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Techniken kompetent gemacht oder einer Elektroporation unterzogen werden.\nBeispiel 10 Salmonella-htrB-Mutanten als Immunogene\nIn einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Mutante um eine Salmonella-htrB-Mutante. Salmonella-Spezies umfassen gram-negative Bakterien, die verschiedene klinische Krankheiten bei Menschen und Tieren hervorrufen können. Beispielsweise ist S. typhi ein Verursacher von Typhus bei Menschen. S. paratyphi ist ein Organismus, der beim Menschen Fieber, das als Salmonella-Fieber bekannt ist, hervorruft. Salmonellose, eine Gastroenteritis bei Menschen, kann durch verschiedene Spezies der Gattung Salmonella (Typhimurium, Newport, Heidelberg und Enteritidis) hervorgerufen werden. Salmonella-htrB-Mutanten können erzeugt und identifiziert werden. Der Fachmann kann unter Verwendung des htrB-Gens eines gram-negativen, bakteriellen Pathogens ein mutiertes htrB-Gen (unfähig zur Kodierung von funktionellem HtrB) unter Anwendung von Transposon-Mutagenese unter anschließender Rekombination herstellen, wobei man letztlich eine Salmonella-htrB-Mutante mit einer Modifikation in einer oder mehreren sekundären Acylketten erhält. Die erhaltenen Salmonella-htrB-Mutanten können in Bezug auf eine erheblich verringerte Toxizität getestet werden, indem man sich der in der Fachwelt zum Messen der toxischen Effekte, die durch Endotoxin induziert werden, beschriebenen Tests bedient.\nZur Erläuterung dieser Ausführungsform und unter Anwendung ähnlicher Verfahren wie in Beispiel 1 wurde eine Mutagenese des htrB-Gens durch Shuttle-Mutagenese unter Verwendung von mini-Tn10 (verleiht Tetracyclin-Resistenz) als Insertionssequenz durchgeführt, um das htrB-Gen zu mutieren. Das htrB:Tn10 wurde sodann aus E. coli durch Transduktion auf ein virulentes S. typhimurium übertragen. Unter Anwendung von bekannten Verfahren (Masters, in E. coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Bd. 2, 2. Auflg., (1996), S. 2421, ASM Press) wurde ein rm+ galE mutS recD-S. typhimurium (SL5283) sequenziell mit MST3488 (recD542:Tn10d, das Chloramphenicol-Resistenz verleiht (cmr)) über den Salmonella-Phagen P22 unter Erhalt eines rm+ galE mutS recD cmr-S. typhimurium ("MGS-1") und anschließend mit MST3063 (mutS:Tn10, das Tetracyclin-Resistenz (tetr) verleiht) unter Erhalt einer rm+ galE mutS recD cmr tetr-S. typhimurium ("MGS-3") transduziert. S. typhimurium-MGS-3 wurde von Tn10 durch Selektion auf Tetracyclin-Empfindlichkeit auf Medien unter Anwendung bekannter Verfahren (Bochner et al., J. Bacteriol., Bd. 143 (1990), S. 926–933) befreit, wodurch man ein rm+ galE mutS recD cmr-S. typhimurium ("MGS-7") erhielt. Zur Bestätigung wurde gezeigt, dass S. typhimurium-MGS-7 die gleiche Reaktion auf UV-Licht wie der Ausgangsstamm MGS-3 aufwies.\nEin E. coli-Stamm ("MLK217") mit einem Gehalt an htrB:mini-Tn10 wurde zur Übertragung des htrB:Tn10 durch Transduktion in S. typhimurium-MGS-7 über den Coliphagen P1 gemäß in der Literatur beschriebenen Verfahren (Masters, (1996), a.a.O.) verwendet. Eine Selektion auf Wachstum bei 30 °C wurde auf Medienplatten mit einem Gehalt an Tetracyclin durchgeführt. Das Ergebnis der Transduktion bestand nach Reisolation von Tetracyclin-resistenten Klonen in der Schaffung eines rm+ galE mutS recD htrB:mini Tn10 cmr tetr-S. typhimurium ("MGS-23"). S. typhimurium-MGS-23 wurde auf eine oder mehrere der phänotypischen Eigenschaften in Verbindung mit der htrB-Mutation getestet (nämlich (1) Temperaturempfindlichkeit; (2) Filamentbildung und Anschwellen bei nicht-permissiven Temperaturen; und (3) Desoxycholat-Resistenz. Die Ergebnisse der phänotypischen Analyse zeigten, dass MGS-23 eine Insertion des mini-Tn10-Elements im S. typhimurium-htrB-Gen trug, da MGS-23 zum Wachstum bei 30 °C, jedoch nicht bei 37 °C befähigt war; zahlreiche filamentöse Formen beim Übergang auf die nicht-permissive Temperatur bildete; und Resistenz gegenüber höheren Konzentrationen an Desoxycholat (7,5 bis 10 %) als der isogene Ausgangsstamm (2,5 %) zeigte. Die Mutation des htrB wurde ferner durch Analyse unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion bestätigt.\nEin virulenter S. typhimurium-Stamm (SL1344) wurde in htrB:Tn10 aus S. typhimurium-MGS-23 über den Salmonella-Phagen P22 und durch Selektion bei 30 °C auf Medienplatten mit einem Gehalt an Tetracyclin transduziert. Nach der Isolation wurden die erhaltenen Tetracyclin-resistenten Klone mit dem gleichen Phänotyp wie MGS-23 weiter analysiert. von einem derartigen Klon, nämlich MGS-31, wurde gezeigt, dass er ein mutiertes htrB-Gen aufwies, indem der Klon unter Verwendung eines Plasmids mit einem Wildtyp-htrB-Gen komplementiert wurde (Karow et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), S. 741–750; Karo et al., Mol. Microbiol., Bd. 5 (1991), S. 2285–2292), wodurch der Klon zum Wildtyp-Phänotyp mit normalem Wachstum, normaler Zellmorphologie, Desoxycholat-Empfindlichkeit bei 37 °C und Wildtyp-Virulenz zurückkehrte.\nZur Analyse des Lipids A wurde eine Massenspektrometrie gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt. Insbesondere wurde Lipid A aus S. typhimurium-htrB-Mutante-LPS und aus Wildtyp-S. typhimurium-LPS durch sekundäre Flüssig-Ionenmassenspektrometrie (LSIMS) im negativen Ionenmodus analysiert, um ein Spektrum von Molekülionen für die verschiedenen Komponenten von Lipid A bereitzustellen. Die chemische Analyse des Lipids A der S. typhimurium-htrB-Mutante ergab, dass die Modifikationen in der Lipid A-Struktur, die aufgetreten waren, ähnlich, jedoch nicht identisch mit Modifikationen in der Lipid A-Struktur, die bei H. influenzae-htrB-Mutanten auftreten, waren. Im Wildtyp-S. typhimurium enthält Lipid A entweder sechs (Hexaacyl) oder sieben (Heptaacyl) Fettsäuresubstitutionen am Diglucosamingerüst (7). Beim Wildtypstamm handelt es sich am Glucosamin II bei der 3'-Substitution an der N-verknüpften C14-Fettsäure (Hexaacyl oder Heptaacyl) um eine C12-Fettsäure. Im Gegensatz dazu und wie in 7 gezeigt, ist die C12-Fettsäure durch eine C16-Fettsäure ersetzt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das S. typhimurium-htrB-Gen für eine Acyltransferase kodiert, die für die Platzierung der C12-Fettsäure an der 3'-Position der N-verknüpften C14-Fettsäure verantwortlich ist. Eine Mutation des S. typhimurium-htrB-Gens führt zur funktionellen Induktion einer weiteren Acyltransferase, die eine C16-Fettsäure an der 3'-Position an der N-verknüpften C14-Fettsäure platziert. Dem Fachmann ist es bekannt, dass Lipid A für das Überleben eines gram-negativen Organismus und für die einwandfreie Organisation seiner äußeren Membran von entscheidender Bedeutung ist. Auf diese Weise wurden in Verbindung mit der Virulenz und der Toxizität des Organismus die Einflüsse der htrB-Genmutation in S. typhimurium analysiert.\nEin Mäuse-Modellsystem, das von der Fachwelt als relevant für eine humane Erkrankung herangezogen wird, ist das D-Galactosamin-Modell. Beim D-Galactosamin-Modell wird die Empfindlichkeit gegenüber LPS durch Belastung mit D-Galactosamin erhöht (Galanos et al., Infect. Immun., Bd. 51 (1986), S. 891–896), wobei die gleiche Letalität und TNF-Induktion mit geringen LPS-Dosen erreicht wird, d. h. mit Endotoxin-Konzentrationen, die gleich groß sind wie die Konzentrationen, die im Blut von septischen Patienten identifiziert wurden. Somit stellen mit D-Galactosamin behandelte Mäuse, die LPS ausgesetzt werden, ein übliches, von der Fachwelt als relevant für den endotoxischen Schock beim Menschen anerkanntes Tiermodellsystem dar. Bei diesem Modell wurden Gruppen von vier Mäusen mit D-Galactosamin (8 mg) behandelt und erhielten gleichzeitig eine Verabreichung der zu testenden LPS-Dosis. Gruppen von vier Mäusen erhielten jeweils eine Injektion von entweder 0,001 &mgr;g, 0,01 &mgr;g, 0,1 &mgr;g, 1 &mgr;g oder 10 &mgr;g des gereinigten, zu testenden LPS. Die Anzahl der Mäuse, die die Belastung bei den einzelnen Dosen überlebten, wurde alle 24 Stunden für einen Zeitraum von 5 Tagen nach der Injektion geprüft. Die LD50-Dosis (letale Dosis, bei der 50 % der Mäuse getötet werden) wird sodann berechnet. Das gereinigte, getrennt zu testende LPS umfasste LPS aus dem virulenten Wildtyp-S. typhimurium-Stamm 1344; und der S. typhimurium-htrB-Mutante (MGS-31). Die Ergebnisse zeigen, dass der LD50-Wert für Mäuse, die eine Injektion von LPS aus dem S. typhimurium-Stamm 1344 erhalten haben, 0,01 &mgr;g beträgt. Im Gegensatz dazu beträgt der LD50-Wert für Mäuse, die eine Injektion mit LPS aus der S. typhimurium-htrB-Mutante MGS-31 erhalten haben, 0,1 &mgr;g. Somit ist das Lipid A aus der S. typhimurium-htrB-Mutante mindestens 10-fach weniger toxisch als das Lipid A aus dem Wildtypstamm.\nDa Mäuse von Natur aus wie Menschen gegenüber einer Infektion durch S. typhimurium empfindlich sind, wurde ein zweites Mäusemodell zur Bestimmung der Einflüsse der htrB-Mutation auf die Virulenz von S. typhimurium herangezogen. Typischerweise werden mit etwa 50 cfu bis 100 cfu 50 bis 100 % der Mäuse mit Injektion getötet. Die verwendeten Stämme umfassten S. typhimurium-Stamm 1344; die S. typhimurium-htrB-Mutante (MGS-31) und die S. typhimurium-htrB-Mutante, die mit dem Plasmid mit einem Gehalt an dem intakten htrB-Gen komplementiert worden war (MGS-43). Die entsprechenden Organismen erhielten eine intraperitoneale Injektion in einer Dosierung von 5 × 101 bis 5 × 107 cfu und wurden 5 Tage beobachtet. Im allgemeinen tritt der Tod der Tiere, die an Bakterämie sterben, zu 100 % innerhalb dieser Zeitspanne ein. Erwartungsgemäß betrug der LD50-Wert für den virulenten S. typhimurium-Stamm 1344 weniger als 5 × 101 cfu. Gleichermaßen betrug der LD50-Wert für die S. typhimurium-htrB-Mutante, die mit dem intakten htrB-Gen komplementiert worden war, nämlich MGS-43, ebenfalls weniger als 5 × 101 cfu. Im Gegensatz dazu betrug der LD50-Wert für die S. typhimurium-htrB-Mutante MGS-31 9,7 × 106 cfu, was im Vergleich zum virulenten Wildtypstamm eine Verringerung der Virulenz von etwa 2 × 105 bedeutet. Das in vivo-Wachstum der S. typhimurium-htrB-Mutante in Mäusen wurde durch Züchtung und Bestimmung von Leber und Milz zur Vornahme von Bakterienzählungen bestätigt. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die htrB-Mutation in Salmonella einen ausgeprägteren Einfluss auf Virulenzfaktoren als nur eine Modifikation des LPS aufweist.\nUnter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, die in den Beispielen 4 und 5 erläutert sind, kann aus einer Salmonella-htrB-Mutante isoliertes Endotoxin in einer Vakzineformulierung zur Induktion von Immunität gegen die Wildtypstämme der Salmonella-Spezies herangezogen werden. Das mutante htrB-LPS kann gemäß Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung von LPS geläufig sind, isoliert werden. Das mutante htrB-LPS kann in einer Vakzineformulierung mit einem Gehalt an einem oder mehreren Mitteln verwendet werden, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem pharmazeutisch verträglichen Träger (z. B. einer physiologischen Lösung), einem Adjuvans oder einem Trägerprotein besteht.\nAlternativ können Salmonella-htrB-Mutanten in einem bakteriellen Lebendvakzinepräparat oder in einem bakteriellen inaktivierten Vakzinepräparat verwendet werden und sie können gentechnisch so manipuliert werden, dass sie mindestens ein heterologes bakterielles Antigen in einem multivalenten Vakzinepräparat exprimieren. Bezüglich des letztgenannten Aspekts sind Plasmide, die sich zur Klonierung und Expression von rekombinanten DNA-Molekülen in Salmonella eignen, dem Fachmann geläufig. Hierzu gehören:\npYA260, das in einen trc-Promotor kloniertes lacZ enthält; und\npJW270, das Tetracyclin-Resistenz verleiht und lacI enthält (Ervin et al., Microb. Pathogen., Bd. 15 (1993), S. 93–101).\npB7 verleiht Kanamycin- und Chloramphenicol-Resistenz und enthält eine Klonierungsstelle, die von einer BalI-Stelle und einer HindIII-Stelle flankiert ist (Purcell et al., Infect. Immun., Bd. 39 (1983), S. 1122–1127).\npACK5 enthält das Replikon von pAC1 aus Acetobacter pasteurianus und verleiht Kanamycin-Resistenz (Grones et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 206 (1995), S. 942–947).\npVAC468 ist ein Suizidvektor für die chromosomale Insertion von heterologen Antigenen in Salmonella und enthält einen Polylinker mit den folgenden Restriktionsstellen: ClaI, EcoRV, XhoI, SacI, SalI, SmaI, XbaI und BglII (Hohmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 92 (1995), S. 2904–2908).\nBeschrieben wird ferner ein Bakteriophagensystem, ein "chromosomaler Expressionsvektor", zur Insertion von Genen, die für fremde Antigene kodieren, in das Chromosom von Salmonella, wobei man sich eines defektiven transponierbaren Elements, das sich am lambda-Bakteriophagen befindet, bedient (Flynn et al., Mol. Microb., Bd. 4 (1990), S. 2111–2118). Salmonella kann auch kompetent gemacht werden (vergl. beispielsweise Purcell et al., (1983), a.a.O.) oder der Elektroporation unterworfen werden, wobei man Verfahren heranzieht, die dem Fachmann geläufig sind (vergl. beispielsweise Grones et al., (1995), a.a.O.; Coulson et al., (1994), a.a.O.).\nBeispiel 11 Shigella-htrB-Mutanten als Immunogene\nIn einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Mutante um eine Shigella-Spezies-htrB-Mutante. Mitglieder der Gattung Shigella sind gram-negative Bakterien, die Krankheiten, wie Dysenterie (zu den pathogenen Spezies gehören dysenteriae, sonnei, und flexneri), vorwiegend bei Menschen hervorrufen. Shigella-htrB-Mutanten können unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie sie in den Beispielen 1–3 und 10 erläutert sind, erzeugt und identifiziert werden. Der Fachmann kann unter Verwendung des htrB-Gens von H. influenzae das htrB-Gen von Shigella isolieren und ein mutiertes htrB-Gen (unfähig zur Kodierung von funktionellem HtrB) unter Anwendung von Transposon-Mutagenese unter anschließender Rekombination erzeugen, wodurch man eine Shigella-htrB-Mutante erhält, der eine oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen. Alternativ gibt es wahrscheinlich eine ausreichende Homologie zwischen Shigella und H. influenzae, um die Plasmide pB28 und pB29 zu verwenden, bei denen jeweils ein mini-Tn3-Transposon mit einem Gehalt an dem Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT)-Gen in den offenen htrB-Leseraster an einer unterschiedlichen Position inseriert ist. Damit wird Shigella für eine Rekombination des mutanten-htrB-Gens in das Shigella-htrB-Gen transformiert. Shigella-Transformanten werden sodann in Bezug auf ihr Wachstum in Gegenwart von Chloramphenicol (1,5 &mgr;g/ml) ausgewählt, was zur Identifikation von mutanten Shigella-htrB-Stämmen führt. Die Positionen der mTn3-Insertion in den Chromosomen der Shigella-htrB-Mutanten kann durch genomische Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde mit einem Gehalt an htrB-Sequenzen bestätigt werden. Die erhaltenen Shigella-htrB-Mutanten können sodann in Bezug auf eine im wesentlichen verringerte Toxizität unter Anwendung von Tests getestet werden, die aus der Fachliteratur als Tests zum Messen der toxischen Wirkungen, die durch Endotoxin induziert werden, beschrieben sind.\nUnter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, die in den Beispielen 4 und 5 erläutert sind, kann Endotoxin, das aus einer Shigella-htrB-Mutante isoliert worden ist, in einer Vakzineformulierung zur Herbeiführung von Immunität gegen Wildtypstämme von Shigella verwendet werden. Das mutante htrB-LPS kann durch ein Verfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung von LPS bekannt ist, isoliert werden. Das mutante htrB-LPS kann in einer Vakzineformulierung verwendet werden, die ein oder mehr Mittel enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: pharmazeutisch akzeptabler Trägerstoff (z. B. eine physiologische Lösung), ein Adjuvans oder ein Trägerprotein.\nAlternativ können Shigella-htrB-Mutanten in einem bakteriellen Lebendvakzinepräparat oder in einem inaktivierten bakteriellen Vakzinepräparat verwendet werden und sie können gentechnisch so manipuliert werden, dass sie mindestens ein heterologes bakterielles Antigen in einem multivalenten Vakzinepräparat exprimieren. Bezüglich des letztgenannten Aspekts sind dem Fachmann Plasmide geläufig, die zur Klonierung und Expression von rekombinanten DNA-Molekülen in Shigella geeignet sind. Hierzu gehören:\npACKS enthält das Replikon aus pAC1 aus Acetobacter pasteurianus und verleiht Kanamycin-Resistenz (Grones et al., (1995), a.a.O.).\nShigella kann auch unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren kompetent gemacht oder der Elektroporation unterworfen werden.\nBeispiel 12 Pseudomonas aeruginosa-htrB-Mutanten als Immunogene\nBei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Mutante um eine Pseudomonas aeruginosa-htrB-Mutante. Pseudomonas aeruginosa ist ein gram-negatives, bakterielles Pathogen, das Krankheiten, wie Infektionen des Atmungstrakts und Sepsis, insbesondere bei immunologisch geschädigten Patienten, hervorruft. Zu weiteren pathogenen Spezies für Menschen und Tiere gehören pseudomallei und mallei. Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie wurden zur Bestimmung der Struktur von Lipid A aus Pseudomonas aeruginosa-LPS herangezogen. Es wurde festgestellt, dass die Struktur von P. aeruginosa-Lipid A die gleiche wie die von enterobakteriellem Lipid A ist: ein Gerüst aus einem Glucosamindisaccharid, das entweder monophosphoryliert oder diphosphoryliert ist (Positionen 1 und 4'); und das mehrere Moleküle von ester- und amidgebundenen Fettsäuren trägt. Zusätzlich zu den Hexaacyl- und Pentaacyl-Lipid A-Spezies wurde eine Tetraacyl-Spezies identifiziert (Karunaratne et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 299 (1992), S. 368–376).\nPseudomonas-htrB-Mutanten (z. B. P. aeruginosa) lassen sich unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie sie in den Beispielen 1–3 und 10 erläutert sind, erzeugen und identifizieren. Der Fachmann kann unter Verwendung des htrB-Gens von H. influenzae das htrB-Gen von P. aeruginosa isolieren und ein mutiertes htrB-Gen (unfähig zur Kodierung von funktionellem HtrB) unter Anwendung von Transposon-Mutagenese unter anschließender Rekombination erzeugen, wodurch man eine P. aeruginosa-htrB-Mutante erhält, der eine oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen. Alternativ gibt es wahrscheinlich eine ausreichende Homologie zwischen P. aeruginosa und H. influenzae, um die Plasmide pB28 und pB29 zu verwenden, bei denen jeweils ein mini-Tn3-Transposon mit einem Gehalt an dem Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT)-Gen in den offenen htrB-Leseraster an einer unterschiedlichen Position inseriert ist. Damit wird P. aeruginosa für eine Rekombination des mutanten-htrB-Gens in das P. aeruginosa-htrB-Gen transformiert. P. aeruginosa-Transformanten werden sodann in Bezug auf ihr Wachstum in Gegenwart von Chloramphenicol (1,5 &mgr;g/ml) ausgewählt, was zur Identifikation von mutanten P. aeruginosa-htrB-Stämmen führt. Die Positionen der mTn3-Insertion in den Chromosomen der P. aeruginosa-htrB-Mutanten kann durch genomische Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde mit einem Gehalt an htrB-Sequenzen bestätigt werden. Die erhaltenen P. aeruginosa-htrB-Mutanten können sodann in Bezug auf eine im wesentlichen verringerte Toxizität unter Anwendung von Tests getestet werden, die aus der Fachliteratur als Tests zum Messen der toxischen Wirkungen, die durch Endotoxin induziert werden, beschrieben sind.\nUnter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, die in den Beispielen 4 und 5 erläutert sind, kann Endotoxin, das aus einer P. aeruginosa-htrB-Mutante isoliert worden ist, in einer Vakzineformulierung zur Herbeiführung von Immunität gegen Wildtypstämme von P. aeruginosa verwendet werden. Das mutante htrB-LPS kann durch ein Verfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung von LPS bekannt ist, isoliert werden. Das mutante htrB-LPS kann in einer Vakzineformulierung verwendet werden, die ein oder mehr Mittel enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: pharmazeutisch akzeptabler Trägerstoff (z. B. eine physiologische Lösung), ein Adjuvans oder ein Trägerprotein.\nAlternativ können P. aeruginosa-htrB-Mutanten in einem bakteriellen Lebendvakzinepräparat oder in einem inaktivierten bakteriellen Vakzinepräparat verwendet werden und sie können gentechnisch so manipuliert werden, dass sie mindestens ein heterologes bakterielles Antigen in einem multivalenten Vakzinepräparat exprimieren. Bezüglich des letztgenannten Aspekts sind Plasmide, die sich zur Klonierung und Expression der rekombinanten DNA-Moleküle in P. aeruginosa eignen, dem Fachmann geläufig. Hierzu gehören:\npPAH121 verleiht Carbenicillin-Resistenz und enthält eine einzige HpaI-Restriktionsstelle (Hoyne et al., J. Bacteriol., Bd. 174 (1992), S. 7321–7327.\nP. aeruginosa kann auch kompetent gemacht werden (vergl. z. B. Hoyne et al., (1992), a.a.O.) oder der Elektroporation unterworfen werden, wobei man Verfahren heranzieht, die dem Fachmann geläufig sind.\nBeispiel 13 Multivalente htrB-Mutante-Vakzineformulierung\nIn einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, die in den Beispielen 4 und 5 erläutert ist, wird die htrB-Mutante gentechnisch unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren so bearbeitet, dass sie ein oder mehr heterologe bakterielle Antigene exprimiert, so dass eine multivalente Vakzine entsteht, wobei man sich aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren bedient. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann ein mikrobielles Pathogen ein respiratorisches Pathogen umfassen, das aus der Gruppe der Pathogene von Tabelle 2 (mit den entsprechenden Antigenen) ausgewählt ist.\n1- (Flack et al., 1995 Gene 156:97–99; Panezutti et al., 1993, 61:1867–1872; Nelson et al., 1988, Rev Infect Diseases 10:S331–336).\n2- (Pruksakorn et al., 1994, Lancet 344:639–642; Dole et al., 1993, J Immunol 151:2188–94).\n3- (Murphy et al., 1989, Infect Immun 57:2938–2941; Faden et al., 1992, Infect Immun 60:3824–3829).\n4- (Lock et al., 1992, Microb Pathog 12:137–143).\n5- (Novotny et al., 1991, Dev Biol Stand 73:243–249; Lipscombe et al., 1991, Mol Microbiol 5:1385–1392; He et al., 1993, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 12:690–695).\n6- (Rawling et al., 1995, Infect Immun 63:38–42; Pennington et al., 1988, J Hosp Infect 11A:96–102).\n7- (Weeratna et al., 1994, Infect Immun 62:3454–3462).\n8- (Jacobs et al., 1990, Infect Immun 58:2464–2469; 1990, J Clin Microbiol 28:1194–1197).\n9- (Kulkarni et al., 1995, J Virol 69:1261–1264; Leonov et al., 1994, J Gen Virol 75:1353–1359; Garcia et al., 1993, Virology 195:239–242; Vaux-Peretz et al., 1992, Vaccine 10:113–118).\n10- (Kaly et al., 1994, Vaccine 12:753–760; Bucher et al., 1980, J Virol 36:586–590).\n11- (Francis et al., 1987, J Gen Virol 68:2687–2691).\n12- (Morein et al., 1983, J Gen Virol 64:1557–1569).\n13- (Garbe et al., 1994, Infect Immun 62:3092–3101).\nGemäß einer weiteren Ausführungsform kann ein mikrobielles Pathogen ein Pathogen umfassen, das eine Geschlechtskrankheit überträgt, wobei die Pathogene (mit den entsprechenden Antigenen) aus der Gruppe von Tabelle 3 ausgewählt sind.\n1- (Lomholt et al., 1994, Infect Immun 62:3178–83).\n2- (Heckels et al., 1990, Vaccine 8:225–230).\n3- (Blacker et al., 1985, J Infect Dis 151:650–657).\n4- (Wetzler et al., 1992, Vaccine 8:225–230).\n5- (Campos et al., 1995, Ophthamol Vis Sci 36:1477–92; Murdin et al., 1995, Infect Immun 63:1116–21).\n6- Taylor et al., 1990, Infect Immun 58:3061–3).\nDie Tabellen 2 und 3 und die in den Fußnoten angegebenen Literaturstellen erläutern verschiedene Protein-Antigene oder Peptide davon, die vom Fachmann als geeignete Vakzine-Kandidaten gegen das entsprechende mikrobielle Pathogen angesehen werden. Typischerweise wird die Immunopotenz eines Epitops (von einem Protein oder Peptid) eines mikrobiellen Pathogens festgestellt, indem man die Immunreaktion eines Tiers im Anschluss an eine Immunisierung mit dem Epitop überwacht und/oder indem man Seren von humanen Rekonvaleszenten in Verbindung mit Präimmunseren analysiert. Auf diese Weise kann der Fachmann Protein- oder Peptid-Antigene aus mikrobiellen Pathogenen bestimmen, bei denen es erstrebenswert wäre, sie unter die heterologen Antigene aufzunehmen, die durch eine erfindungsgemäße htrB-Mutante zu exprimieren sind. Eine entsprechende Nucleinsäuresequenz, die Kodierungssequenz, kann von der Aminosäuresequenz des Protein- oder Peptid-Antigens abgeleitet werden, wobei die Kodierungssequenz zur Expression in die htrB-Mutante eingeführt wird.\nBeispiel 14 Verwendung von htrB-Mutanten zur Erzeugung von Antiseren\nDie htrB-Mutante oder daraus gereinigtes Endotoxin können zur Erzeugung von Endotoxin-spezifischen Antiseren, die auf das spezielle, gram-negative, bakterielle Pathogen abgestellt sind, verwendet werden. Die Antiseren können dann in einem Immunoassay zum Nachweis des Antigens (dieses speziellen, gram-negativen, bakteriellen Pathogens), das in der Körperflüssigkeit eines Individuums, bei dem ein Verdacht auf eine Infektion durch dieses gram-negative, bakterielle Pathogen vorliegt, vorhanden ist, verwendet werden. Die für die Analyse gewonnene(n) Körperflüssigkeit(en) hängen vom nachzuweisenden Mikroorganismus, der vermuteten Infektionsstelle und davon ab, ob für die Körperflüssigkeit ein Verdacht besteht, dass sie das Antigen oder Antiserum enthält. Unter Einbeziehung dieser Überlegungen kann die Körperflüssigkeit einen oder mehrere der Bestandteile Sputum, Blut, zerebrospinale Flüssigkeit, Läsionsexsudat, Abstrichmaterial von der vermuteten Infektionsstelle und Flüssigkeiten des oberen Atmungstrakts umfassen. Immunoassays für einen derartigen Nachweis umfassen beliebige Immunoassays, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Radioimmunoassay, ELISA, "Sandwich"-Test, Präzipitin-Reaktion, Agglutinationstest, fluoreszierender Immunoassay und Immunoassay auf der Basis von Chemilumineszenz.\nAlternativ kann dann, wenn ein immunologisch beeinträchtigtes Individuum an einer möglicherweise lebensbedrohenden Infektion leidet, die durch ein spezielles gram-negatives, bakterielles Pathogen hervorgerufen worden ist, eine passive Immunisierung erfolgen, d. h. eine Immunisierung, die die Verabreichung von gereinigtem, humanem Immunoglobulin mit einem Gehalt an Antikörper gegen eine htrB-Mutante oder mit einem Gehalt an isoliertem htrB-Endotoxin dieses speziellen, gram-negativen, bakteriellen Pathogens umfasst.\nEs ist darauf hinzuweisen, dass die Erfindung zwar vorstehend ausführlich beschrieben worden ist, dass die Beispiele aber nur erläuternden Zwecken dienen. Weitere Modifikationen der erfindungsgemäßen Ausführungsformen, die für Fachleute auf den Gebieten der Molekularbiologie, der medizinischen Diagnostik und verwandter Disziplinen offensichtlich sind, fallen unter den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche.\nMelvin G. Sunshine\n(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Non-Toxic Mutants of Pathogenic Gram-Negative Bacteria\n(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5\n(A) Adressat: Hodgson, Russ, Andrews, Woods & Goodyear\n(B) Straße: 1800 One M& T Plaza\n(C) Ort: Buffalo\n(D) Staat: New York\n(F) Postleizazhl: 14203-2391\niv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:\n(A) DATENTRÄGER: Floppy Disk, 3,5 Zoll, 1,4 Mb Speicher\n(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel\n(C) BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS/Microsoft Windows 3.1\n(D) SOFTWARE: Wordperfect for Windows 5.1\n(vi) DATEN DER ANMELDUNG:\n(viii) ANGABEN ÜBER DEN ANWALT/VERTRETER:\n(A) NAME: Nelson, M. Bud\n(B) REGISTRIERNUMMER: 35,300\n(C) AKTENZEICHEN: 22244.0002\n(A) TELEFON: (716) 856-4000\n(B) TELEFAX: (716) 849-0349\n(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:\n(A) LÄNGE: 969 Nucleotide\n(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA\n(iv) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:\n(A) ORGANISMUS: H. influenzae\n(B) STAMM: 2019\n(C) ZELLTYP: Bacterium\n(3) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:\n(A) LÄNGE: 319 Nucleotide\n(C) STRANGFORM: Einzelstrang\n(ii) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:\n(iii) UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisiert\n(iv) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2\nCCAATATGGC GCAAAATAGG ATAGGGAAGA C 31\n(4) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:\n(A) LÄNGE: 9 Nucleotide\n(A) Weitere Informationen: Aufnahmesequenz für die Transformation\n(iv) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3\n(5) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:\n(A) LÄNGE: 30 Nucleotide\n(A) Weitere Informationen: hybridisiert mit TNF&agr;-mRNA\n(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4\nATCTCTCAGC TCCACGCCAT TGGCCAGGAG 30\n(6) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:\n(A) weitere Informationen: hybridisiert nicht mit TNF&agr;-mRNA\n(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5\nCTCCTGGCCA ATGGCGTGGA GCTGAGAGAT 30\nVakzineformulierung, umfassend eine Endotoxinmutante, die aus einer htrB-Mutante eines gramnegativen bakteriellen Pathogens gereinigt wurde, dadurch gekennzeichnet, dass Lipid A der Endotoxinmutante das gleiche ist wie Lipid A des Wildtyp-Endotoxins, ausgenommen dass ein oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen, und dadurch, dass die Endotoxinmutante an ein Trägerprotein konjugiert ist, wobei die Endotoxinmutante eine wesentlich verminderte Toxizität im Vergleich zu dem Endotoxin des gramnegativen bakteriellen Pathogens vom Wildtyp aufweist.\nVakzineformulierung nach Anspruch 1, die weiterhin einen physiologischen Träger und ein Adjuvans enthält.\nVerfahren zur Herstellung einer Vakzineformulierung, umfassend das Mutieren eines htrB-Gens, welches ein Wildtyp-Endotoxin in einem gramnegativen bakteriellen Pathogen vom Wildtyp kodiert, um eine Endotoxinmutante bereitzustellen; gekennzeichnet durch Reinigen der Endotoxinmutante und Konjugieren der gereinigten Endotoxinmutante an ein Trägerprotein, wobei Lipid A der Endotoxinmutante das gleiche wie Lipid A des Wildtyp Endotoxins ist, ausgenommen dass ein oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen, und wobei die Endotoxinmutante eine wesentlich verminderte Toxizität im Vergleich zu dem Endotoxin des gramnegativen bakteriellen Pathogens vom Wildtyp aufweist.\nVerfahren nach Ansprach 3, weiterhin umfassend das Reinigen mittels einer Phenol-/Wasser-Extraktion oder einem Proteaseverdau.\nVerwendung einer Endotoxinmutante bei der Herstellung einer Vakzine zur Immunisierung eines Individuums, um eine von einem gramnegativen bakteriellen Pathogen verursachte Erkrankung zu verhindern, wobei die Endotoxinmutante durch ein htrB-Gen von einem gramnegativen bakteriellen Pathogen kodiert wird, und wobei die Endotoxinmutante eine im wesentlichen verminderte Toxizität im Vergleich zu dem Endotoxin des gramnegativen bakteriellen Pathogens vom Wildtyp aufweist, und an ein Trägerprotein konjugiert ist;\ndadurch gekennzeichnet, dass Lipid A der Endotoxinmutante das gleiche ist wie Lipid A des Wildtyp-Endotoxins, ausgenommen dass ein oder mehrere sekundäre Acylketten fehlen.\nVerwendung nach Anspruch 5, wobei das Individuum ein Mensch ist.\nVerwendung nach Anspruch 5, wobei das Individuum ein Tier ist, und die Vakzine zum Einführen über einen Verabreichungsweg formuliert ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus intradermaler, intramuskulärer, intraperitonealer, intravenöser, subkutaner, okularer, intranasaler und oraler Verabreichung.\nVerwendung nach Anspruch 5, wobei die Vakzineformulierung weiterhin einen physiologischen Träger und ein Adjuvans enthält.