Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing | Protocol (Translated to Arabic)\nيتم عرض المقارنة والاستفادة المثلى من اثنين من أساليب التخصيب دنا النبات العضوي: الطرد المركزي التفاضلي التقليدي وتجزئة من غنا الكلي على أساس حالة مثيلة. نقوم بتقييم كمية الحمض النووي الناتجة والجودة، وإظهار الأداء في قراءة قصيرة الجيل القادم التسلسل، ومناقشة إمكانات للاستخدام في قراءة طويلة تسلسل جزيء واحد.\nيحتوي الجينوم العضوي النباتي على عناصر كبيرة ومتكررة قد تخضع لعملية الاقتران أو إعادة التركيب لتشكيل هياكل معقدة و / أو شظايا دون الجينومية. توجد جينومات أورغانيلار أيضا في خلطات داخل خلية أو نوع معين من الأنسجة (هيتيروبلاسمي)، وقد تتغير وفرة الأنواع الفرعية في جميع مراحل التنمية أو عندما تكون تحت الضغط (التحول شبه المتكافئ). مطلوب الجيل التالي من تقنيات التسلسل (نغس) للحصول على فهم أعمق لهيكل الجينوم العضوي وظيفة. تستخدم دراسات التسلسل التقليدية عدة طرق للحصول على الحمض النووي العضوي: (1) إذا تم استخدام كمية كبيرة من الأنسجة بدءا، فمن المتجانسة وتعرض الطرد المركزي التفاضلي و / أو تنقية التدرج. (2) إذا تم استخدام كمية أقل من الأنسجة ( أي إذا كانت البذور أو المواد أو الفضاء محدودة)، يتم تنفيذ نفس العملية كما هو الحال في (1)، تليها تضخيم الجينوم كله للحصول على الحمض النووي كافية. (3) التحليل المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها ليقوموبالتالي الحمض النووي الجيني الكلي وتحليل قراءات أورغانيلار. كل هذه الأساليب لها تحديات ومواقف متأصلة. في (1)، قد يكون من الصعب الحصول على كمية كبيرة من الأنسجة بدءا. في (2)، يمكن أن تضخيم الجينوم كله إدخال التحيز التسلسل. وفي (3)، يمكن التماثل بين الجينوم النووية والعضلية التداخل مع التجمع والتحليل. في النباتات ذات الجينومات النووية الكبيرة، من المفيد إثراء الحمض النووي للعضلات للحد من تكاليف التسلسل وتعقيد تسلسل لتحليلات المعلوماتية الحيوية. هنا، قارنا طريقة الطرد المركزي التفاضلية التقليدية مع الطريقة الرابعة، نهج كبغ الميثيل المنسدلة تكييفها، لفصل الحمض النووي الجيني الكلي إلى الكسور النووية والعضلات. كلا الطرازين تعطي الحمض النووي كافية ل نغس، الحمض النووي التي هي المخصب للغاية لتسلسل أورغانيلار، وإن كان بنسب مختلفة في الميتوكوندريا والبلاستيك الكلور. نقدم الأمثل لهذه الأساليب لنسيج أوراق القمح ومناقشة المزايا الرئيسية و دوعيوب كل نهج في سياق مدخلات العينة، وسهولة البروتوكول، وتطبيق المصب.\nتسلسل الجينوم هو أداة قوية لتشريح الأساس الجيني الكامن وراء الصفات النباتية الهامة. تركز معظم الدراسات التسلسل الجينوم على محتوى الجينوم النووي، حيث أن غالبية الجينات تقع في النواة. ومع ذلك، فإن الجينوم العضوي، بما في ذلك الميتوكوندريا (عبر حقيقيات النوى) والبلاستيدات (في النباتات، والشكل المتخصص، والكلوروبلاست، ويعمل في عملية التمثيل الضوئي) يسهم معلومات وراثية هامة ضرورية لتنمية الكائنات الحية، والاستجابة للضغط، واللياقة البدنية العامة 1 . وعادة ما يتم تضمين جينومات أورغانيلار في الاستخراج الكلي للحمض النووي المقصود لتسلسل الجينوم النووي، على الرغم من أن أساليب للحد من عدد العضيات قبل استخراج الحمض النووي تستخدم أيضا 2 . وقد استخدمت العديد من الدراسات نتائج التسلسل من مجموع الاستخراج غنا لتجميع جينوم أورغانيلار 3 ، 4 ، 5 ،كريف "> 6 ، 7. ومع ذلك، عندما يكون الهدف من الدراسة هو التركيز على الجينوم العضلي، وذلك باستخدام مجموع غنا يزيد من تكاليف التسلسل لأن العديد من يقرأ" فقدت "تسلسل الحمض النووي النووي، وخاصة في النباتات ذات الجينوم النووية الكبيرة ، وعلاوة على ذلك، نظرا للازدواجية ونقل تسلسل الكيس العضلي في الجينوم النووي وبين العضيات، وحل موقف رسم الخرائط الصحيح من تسلسل يقرأ إلى الجينوم الصحيح هو بيوانفورماتيكالي تحدي 2 ، 8. تنقية جينوم عضوي من الجينوم النووي هو واحد استراتيجية للحد من هذه المشاكل.ويمكن استخدام مزيد من الاستراتيجيات المعلوماتية الحيوية لفصل يقرأ تلك الخريطة إلى مناطق التماثل بين الميتوكوندريا والكلوروبلاست.\nفي حين أن الجينوم العضوي من العديد من الأنواع النباتية قد تم تسلسلها، لا يعرف إلا القليل عن اتساع تنوع جينوم عضويالمتاحة في مجموعات البرية أو في تربية تربية المزارع. ومن المعروف أيضا جينومات أورغانيلار أن تكون الجزيئات الحيوية التي تخضع لإعادة ترتيب هيكلية كبيرة بسبب إعادة التركيب بين تسلسل تكرار 9 . وعلاوة على ذلك، يتم تضمين نسخ متعددة من الجينوم العضلي داخل كل عضلة، وترد عضيات متعددة داخل كل خلية. ليس كل نسخ هذه الجينوم متطابقة، والتي تعرف باسم هيتيروبلاسمي. على النقيض من الصورة الكنسي "الدوائر الرئيسية"، هناك الآن أدلة متزايدة على صورة أكثر تعقيدا من الهياكل الجينوم العضوي، بما في ذلك الدوائر شبه الجينومية، الكروموسومات الخطية، الخطية كونكاتامرس، والهياكل المتفرعة 10 . وتجدر الإشارة إلى أن تجميع الجينوم العضوي النباتي يزداد تعقيدا بسبب أحجامها الكبيرة نسبيا وتكرارها المقلوب والمباشر الكبير.\nالبروتوكولات التقليدية لعزل العضل، وتنقية الحمض النووي، والجنوم اللاحقة e التسلسل غالبا ما تكون مرهقة وتتطلب كميات كبيرة من إدخال الأنسجة، مع عدة غرامات إلى ما يزيد عن مئات غرام من الأنسجة ورقة الشباب اللازمة كنقطة انطلاق 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . وهذا يجعل التسلسل الجينوم العضوي لا يمكن الوصول إليها عندما الأنسجة محدودة. في بعض الحالات، تكون كميات البذور محدودة، مثل عندما يكون ذلك ضروريا للتسلسل على أساس الأجيال أو في الخطوط العقيمة الذكرية التي يجب الحفاظ عليها عبر المعبر. في هذه الحالات، يمكن تنقيته الحمض النووي العضلي ثم تعرض لتضخيم الجينوم كله. ومع ذلك، يمكن أن تضخيم الجينوم كله إدخال التحيز تسلسل كبير، وهو مشكلة خاصة عند تقييم التباين الهيكلي، والهياكل شبه الجينومية، ومستويات هيتيروبلاسمي> 18. وقد ساهمت التطورات الحديثة في إعداد المكتبة للتكنولوجيات التسلسلية القصيرة القراءة في التغلب على الحواجز ذات المدخلات المنخفضة لتجنب تضخيم الجينوم بأكمله. على سبيل المثال، مجموعة إعداد مكتبة إلومينا نكستيرا شت تسمح بأقل من 1 نانوغرام من الحمض النووي لاستخدامها كمدخل 19 . ومع ذلك، فإن الاستعدادات القياسية للمكتبات لتطبيقات تسلسل قراءة طويلة، مثل تقنيات تسلسل باكبيو أو أكسفورد نانوبور، لا تزال تتطلب كمية عالية نسبيا من الحمض النووي المدخلات، والتي يمكن أن تشكل تحديا لتسلسل الجينوم العضوي. في الآونة الأخيرة، تم تطوير بروتوكولات تسلسل جديدة طويلة الصنع الصنع وقراءة طويلة للحد من كميات المدخلات والمساعدة في تسهيل تسلسل الجينوم في العينات حيث الحصول على كميات ميكروغرام من الحمض النووي صعب 20 ، 21 . ومع ذلك، لا يزال الحصول على الوزن الجزيئي عالية، الكسور العضوي النقي لتغذية هذه الاستعدادات مكتبة تحديا.\nسعينا رo مقارنة وتحسين التخصيب الحمض النووي العضلي وطرق العزل مناسبة ل نغس دون الحاجة إلى تضخيم الجينوم كله. على وجه التحديد، كان هدفنا هو تحديد أفضل الممارسات لإثراء الحمض النووي العضلي عالي الوزن الجزيئي من مواد البدء المحدودة، مثل عينة فرعية من ورقة. يقدم هذا العمل تحليلا مقارنا لأساليب إثراء الحمض النووي العضوي: (1) تعديل، بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي المعدل مقابل (2) بروتوكول تجزئة الحمض النووي على أساس استخدام دنا المتاحة تجاريا كبغ الميثيل ملزم نهج سحب البروتين المجال 22 تطبق على الأنسجة النباتية 23 . نوصي أفضل الممارسات لعزل الحمض النووي العضوي من الأنسجة ورقة القمح، والتي يمكن أن تمتد بسهولة إلى النباتات وأنواع الأنسجة الأخرى.\n1. جيل من المواد النباتية لعزل أورغانيلار واستخراج الحمض النووي\nالنمو القياسي لشتلات القمح\nبذور النبات في الفيرميكوليت في الأواني الصغيرة، مربع مع 4 - 6 بذور لكل ركن. نقل إلى الدفيئة أو غرفة النمو مع دورة ضوء 16 ساعة، 23 ºC يوم / 18 ºC ليلة.\nالمياه النباتات كل يوم. تسميد النباتات مع ¼ ملعقة صغيرة من الحبيبية 20-20-20 الأسمدة نيك عند الإنبات وفي 7 أيام بعد الإنبات.\nالبدائل البديلة لشتلات القمح\nاتبع الخطوة 1.1، ولكن وضع الأواني في غرفة النمو المظلمة، 23 درجة مئوية لمدة 16 ساعة / 18 درجة مئوية لمدة 8 ساعات. بدلا من ذلك، تغطية النباتات في الاحتباس الحراري (على سبيل المثال، مع حاوية التخزين، ومع ذلك، يجب الحفاظ على التهوية المناسبة).\nالنمو وجمع الأنسجة\nتنمو النباتات لمدة 12-14 أيام. بالنسبة لمعظم النمط الوراثي للقمحs، 75 - 100 الشتلات تنتج حوالي 10 - 12 غرام من الأنسجة، وهو ما يكفي لاستخراج اثنين من الخلايا العضلية باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلية (القسم 2). مصنع واحد فقط هو ضروري إذا كان استخدام نهج الحمض النووي كبغ القائم على مثيلة القائم على مثيلة لكسر عضوي من الحمض النووي النووي (القسم 3).\nإذا كان استخدام نهج الطرد المركزي التفاضلي، وجمع الأنسجة الطازجة والمضي قدما على الفور لمعالجة العينات، كما هو موضح في القسم 2.\nإذا كان استخدام نهج كبغ ميثيل المنسدلة، وحصاد 20 ملغ أقسام من الأنسجة ورقة الشباب إلى أنابيب ميكروسنتريفوج (استخدام إما نمت القياسية أو الأنسجة المعتادة، انظر ممثل النتائج ). تجميد المفاجئة على النيتروجين السائل وتجميد في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. انتقل إلى تجزئة الدنا، كما هو موضح في القسم 3.\n2. الطريقة رقم 1: استخراج الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي التفاضلي (دس)\nملاحظة: الفرقتم تعديل بروتوكول الطرد المركزي إرجنتي من منشورين أن الظروف الأمثل لعزل كل من العضيات ولكن إثراء للميتوكوندريا 17 ، 24 . والبروتوكول الناتج أقل استهلاكا للوقت ويستخدم عددا أقل من المواد الكيميائية السامة مقارنة بالطرق السابقة. على وجه التحديد، أجرينا تعديلات على المخازن المؤقتة وغسل الخطوات، بما في ذلك إضافة البولي فينيل بيروليدون (بب) إلى العازلة استخراج ستي والقضاء على الخطوة غسل النهائي في نيتف العازلة، والذي يحتوي على فلوريد الصوديوم (ناف).\nالحذر: إعداد واستخدام العازلة ستي ينبغي أن يؤديها تحت غطاء الدخان الكيميائية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة، وهذا المخزن المؤقت يحتوي على 2-ميركابتويثانول (بمي).\nأشياء يجب القيام بها قبل البدء\nتأكد من أن جميع المعدات نظيفة للغاية، وأوتوكلاف أي المعدات التي يمكن تعقيمها (على سبيل المثال، طحن اسطوانات، عالية السرعة سنتريأنابيب فوج، الخ ).\nملاحظة: ينصح نصائح تصفية لجميع الخطوات التي تتطلب بيبتينغ لتجنب انتقال التلوث.\nانظر قائمة المعدات والكواشف المطلوبة وإعداد المخازن المؤقتة ومخزونات العمل المطلوبة للطريقة رقم 1 ( الجدول 1 ). برد كتل طحن المبردة إلى -20 درجة مئوية والدوار ومخازن إلى 4 درجة مئوية، تعيين ميكروسنتريفوج إلى 4 درجة مئوية، وتشغيل حمام المياه 37 ºC.\nحصاد 5 غرام من الأنسجة الطازجة وشطفه في الماء البارد والمعقم في كوب بارد على الجليد.\nملاحظة: احتفظ دائما بالعينات على الجليد أثناء جميع العمليات وعمليات النقل من وإلى أجهزة الطرد المركزي، وأغطية الدخان، الخ. بدلا من ذلك، العمل في غرفة باردة إذا كان هناك الوصول إلى مساحة كافية والمعدات لتنفيذ البروتوكول.\nباستخدام مقص، وقطع الأنسجة الورقية إلى ~ 1 سم قطعة مباشرة إلى أنبوب 50 مل تحتوي على اثنين من طحن السيراميكاسطوانات.\nملاحظة: تنظيف أو تغيير مقص بين العينات لتجنب التلوث المتبادل.\nإذا لم يكن هناك الخالط الأنسجة، واستخدام هاون ومدقة واتبع لتحل محل الخطوات 2.2.4 - 2.2.9.\nقطع الأنسجة ورقة إلى هاون قبل المبردة على الجليد. طحن العينات لمدة 2 - 3 دقائق في 15 مل من ستي (في غطاء الدخان).\nصب قبالة العازلة (ترك الأنسجة في هاون) من خلال قمع تحتوي على طبقة واحدة من قبل الرطب، القماش الترشيح العقيمة (~ 22- إلى 25 ميكرون حجم المسام؛ انظر البروتوكول الرئيسي لمزيد من التفاصيل) إلى أنبوب 50 مل آخر . إضافة 10 مل إضافية من ستي إلى هاون ومدقة والتجانس مرة أخرى.\nصب الأنسجة المتجانسة والعازلة في نفس القمع. شطف هاون ومدقة مع 10 مل من ستي وتصب في قمع. قم بضغط قطعة القماش في القمع واستخراجها قدر المستطاع.\nملاحظة: تغيير قفازات بين العينات لتجنب التلوث المتبادل. مواصلة مع المواليةتوكول في الخطوة 2.2.10.\nإضافة 20 مل من ستي (في غطاء الدخان) لكل أنبوب 50 مل.\nوضع العينات في كتل طحن المبردة قبل المبردة في جهاز طحن الأنسجة وطحن العينات لمدة 2 × 30 ثانية في 1750 دورة في الدقيقة. تدوير المواقع عينة ووضع العينات على الجليد لمدة ~ 1 دقيقة بين طحن.\nملاحظة: هاون ومدقة، خلاط، أو غيرها من الأنسجة طحن / التجانس الجهاز يمكن استخدامها في هذه الخطوة. ومع ذلك، فإن كل طريقة تؤثر على جودة الحمض النووي الناتجة لدرجات مختلفة، وبالتالي يجب تقييم طول الحمض النووي والجودة قبل الاستمرار مع التطبيقات المصب.\nإدراج قمع في أنبوب نظيفة 50 مل وضعت في الجليد. وضع طبقة واحدة من القماش الترشيح في قمع وقبل الرطب مع 5 مل من ستي. لا تتجاهل تدفق من خلال.\nصب الأنسجة المتجانسة في قمع. شطف أنبوب طحن مع 15 مل من ستي، خلاصة وعكس الأنبوب لشطف الجدران والغطاء، وتصب في فونايل\nإزالة بعناية من الحجارة السيراميك ثم الضغط والخروج من القماش الترشيح في قمع.\nملاحظة: تغيير قفازات بين العينات لتجنب التلوث المتبادل.\nالتفاف قبعات أنبوب مع بارافيلم لتجنب تسرب. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.\nنضح بعناية طاف باستخدام ماصة المصلية (تجنب إزعاج بيليه) ووضعه في 50 مل عالية السرعة أنبوب الطرد المركزي (إذا لم يكن لديك أنابيب حشوات ختم ضيق، والتفاف قبعات أنبوب مع بارافيلم لتجنب تسرب). تجاهل الكريات.\nتوازن الأنابيب إلى داخل 0.1 غرام باستخدام ستي والطرد المركزي الناتجة طاف لمدة 20 دقيقة في 18،000 x ج و 4 درجة مئوية. لتحقيق التوازن بين الأنابيب، ووضع كوب صغير من الجليد على التوازن، الفارغة الحجم، وتزن العينات على الجليد للحفاظ على البرد. بدلا من ذلك، استخدم ميزان وغطاء الدخان في غرفة باردة.\nتجاهل طاف. إضافة 1 مل من ست إلى بيليه وإعادة تعليق بلطف لناأداة تعريف إنجليزية غير معروفة، خشن، بينتبروش. إضافة 24 مل من ست (الحجم النهائي من 25 مل) ومزيج / دوامة ( أي، اضغط على فرشاة الطلاء على جانب الأنبوب لإزالة جميع السائل).\nتوازن الأنابيب إلى داخل 0.1 غرام باستخدام ست. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 18،000 x ج و 4 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه، وإعداد حل دنازي (انظر الجدول 1 للأسهم وحل وصفات العمل). لكل عينة، وجعل واحد 200 قسامة ميكرولتر في أنبوب 1.5 مل.\nتجاهل طاف، وصمة عار الأنبوب، وإعادة تعليق بيليه (لا يزال في أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة) في 300 ميكرولتر من ست باستخدام فرشاة الطلاء لينة. وضع فرشاة الطلاء في أنبوب 1.5 مل أعدت مسبقا تحتوي على 200 ميكرولتر من محلول دنازي ودوامة فرشاة الطلاء لإزالة أي بيليه المتبقية عالقة في الفرشاة. ماصة الحل دنازي مرة أخرى في أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة ودوامة بلطف لخلط.\nاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي (التفاف بارافيلم حول الجزء العلوي من أنبوب لمنع تسرب التكثيفز في الغطاء). مزيج بلطف عن طريق تحوم 2 مرات خلال الحضانة.\nماصة بلطف خليط بيليه من الأنبوب باستخدام طرف ماصة مع فتحة واسعة ووضعه في أنبوب منخفض ربط 1.5 مل. إضافة 500 ميكرولتر من 400 ملي إدتا، ودرجة الحموضة 8.0، إلى أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة وماصة بلطف للحصول على كل من بيليه المتبقية من الأنبوب. نقل إدتا لنفس 1.5 مل، وانخفاض ربط أنبوب كما خليط بيليه ومزيج بلطف عن طريق انقلاب.\nأجهزة الطرد المركزي في 18،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل طاف، وصمة عار الأنبوب، واستخدامها مرة واحدة لعزل الحمض النووي. إذا لزم الأمر، وتجميد الكريات في -20 درجة مئوية، ولكن هذا قد يؤدي إلى انخفاض العائد، كما دنازي المتبقية قد تتحلل من الحمض النووي العينة إذا لم يتم معالجتها على الفور.\nاستخراج الحمض النووي من عضيات معزولة باستخدام نهج قائم على العمود التجاري\nملاحظة: انظر كتيب كيت للبروتوكول الكامل 25 ، ونرى أدناه لإجراء تعديلات. العلاقات العامةويعود مباشرة من العزلة العضلية إلى استخراج الحمض النووي. والتجميد المتكرر والذوبان يقلل من الأحجام الحمض النووي جزء ويؤدي إلى تدهور الحمض النووي من قبل دنازي المتبقية. الحد فورتيكسينغ أو بيبتينغ قوية، وهذا يمكن قص الحمض النووي. ويوصى باستخدام أنابيب ميكروسنتريفوج منخفضة ربط لتعظيم الانتعاش الحمض النووي.\nإجراء استخراج الحمض النووي\nملاحظة: قراءة بروتوكول تجاري مفصل 25 قبل البدء في التأكد من أن المخازن المؤقتة يتم بشكل صحيح / تخزين وأن يتم فهم إجراءات عمود الدوران.\nإضافة 180 ميكرولتر من العازلة أتل مباشرة في أنبوب مع بيليه (إذابة إذا تجمد سابقا ومعايرة إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء).\nالمضي قدما مع الخطوة 3 في بروتوكول "تنقية الحمض النووي من الأنسجة" في كتيب عدة، مع التعديلات التالية: تحلل 30 دقيقة في الخطوة 3، وتشمل اختياري ريبونوكلياز الهضم، وأزل في 3 × 200 ميكرولتر من إ كل في سيأنبوب باريت ومن ثم الجمع بين إلوتيونس).\nحفظ قسامة (20 ميكرولتر على الأقل) ل قر (انظر الخطوة 4.1). لتحديد كمية قبل التركيز، حفظ إضافية 1 ميكرولتر لقياس حساسية عالية.\nإذا رغبت في ذلك، المضي قدما مع تركيز العينة.\nتركيز العينة مع وحدات تصفية التجارية\nملاحظة: انظر البروتوكول التجاري 26 لمزيد من التفاصيل. اعتمادا على استخدام المصب، قد لا يكون من الضروري لأداء تركيز العينة (على سبيل المثال، لتطبيقات نهاية نقطة ير و قر). ومع ذلك، لبناء مكتبة نغس، فإنه من المرجح أن يكون من الضروري تركيز الحمض النووي العضلي المخفف تم الحصول عليها بعد استخراج الحمض النووي.\nإجراء عمود التركيز\nبعناية قبل وزن (انظر الجدول 2 ) وحدة تصفية فارغة (بدون أنبوب) على قطعة نظيفة من وزنها ورقة على التوازن التحليلي الرقمي. سجل الوزن.\nمتزمتبيت إلوتيونس مجتمعة في وحدة التصفية وتزن بعناية مرة أخرى.\nملاحظة: يقول الدليل التجاري 26 أن وحدة تصفية الحد الأقصى لحجم 500 ميكرولتر، ولكن ما يصل إلى 575 ميكرولتر يمكن أن تضاف إلى وحدة في وقت واحد مع عدم وجود تجاوز.\nوضع بعناية وحدة تصفية شغل في أنبوب (المقدمة مع الأعمدة). أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج الوقت المطلوب لتحقيق حجم التركيز المطلوب. لعينة حجم من ~ 575 ميكرولتر، و 20 دقيقة تدور عادة ما يؤدي إلى تركيز حجم 15-30 ميكرولتر.\nإزالة وحدة التصفية من الأنبوب وتزن مرة أخرى. استخدام الجدول لتحديد ما إذا كان قد تم تحقيق حجم التركيز المطلوب. إن لم يكن، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 500 x ج لمدة أقصر من الوقت وتزن مرة أخرى؛ كرر حتى يتم التوصل إلى حجم التركيز المطلوب.\nوضع أنبوب جديد (المقدمة مع الأعمدة) على الجزء العلوي من وحدة التصفية وعكس. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1000 x ج لنقل الشركةنسنترات إلى الأنبوب.\nتحديد الحمض النووي باستخدام قياس حساسية عالية (لكل تعليمات الشركة المصنعة).\n3. الأسلوب رقم 2: ميثيل-تجزئة (مف) نهج لإثراء للحمض النووي العضوي من الحمض النووي الجيني الكلي\nملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول استخراج الحمض النووي كيت مجموعة الحمض النووي جينوميوم المستخدم للنباتات والفطريات 27 والبروتوكول ميكروبيوم الدنا كيت التخصيب التجاري 28 . من الناحية النظرية، أي بروتوكول عزل الحمض النووي الذي ينتج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي يمكن أن تستخدم لسحب. وبالنسبة للتسلسل القصير القراءة، فإن أي استخراج ينتج في الغالب أكثر من 15 كيلو بايت شظايا كافية للاستخدام في السحب. لوNG- قراءة التسلسل، شظايا أكبر قد يكون مرغوبا فيه. لذلك، نحن الأمثل هذا البروتوكول لانتاج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي.\nعزل الحمض النووي الكلي\nملاحظة: انظر قائمة المعدات والكواشف المطلوبة وإعداد المخازن المؤقتة ومخزونات العمل المطلوبة للطريقة رقم 2 ( الجدول 1 ). إضافة الإنزيمات ليسينغ إلى المخزن المؤقت تحلل لجعل الحل تحلل العازلة العمل. بدوره على ثيرموميكسر وتعيينه إلى 37 درجة مئوية. بدوره على حمام الماء إلى 50 درجة مئوية ووضع العازلة قف في الحمام. وضع إتوه 70٪ في الثلاجة وتعيين ميكروسنتريفوج إلى 4 درجات مئوية.\nمجموع استخراج الحمض النووي باستخدام أعمدة استخراج الحمض النووي التجارية\nملاحظة: قبل البدء، اقرأ الكتيب التجاري 29 للحصول على معلومات مفصلة حول استخدام الأعمدة أنيون تبادل الصرف الجاذبية. قد يتم إعداد الأعمدة باستخدام رف متخصص أو موضوعة فوق الأنابيب باستخدام حلقات بلاستيكية مقدمة. جميع الخطوات، بما في ذلك زيجب أن يسمح لها بالمضي قدما عن طريق تدفق الجاذبية، وينبغي أن لا تضطر السائل المتبقية من خلال.\nطحن 20 ملغ من الأنسجة المجمدة في النيتروجين السائل في أنبوب منخفض ربط 2 مل باستخدام بيستليس طحن باليد مصممة للأنابيب 2 مل.\nإضافة 2 مل من تحلل العازلة حل العمل (الأنابيب سوف تكون كاملة جدا).\nاحتضان في ثيرموميكسر في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف في 300 دورة في الدقيقة. إذا كان ثيرموميكسر غير متوفر، احتضان على كتلة الحرارة والاختلاط عن طريق عبها لطيف كل 15 دقيقة هو بديل مناسب.\nإضافة 4 ميكرولتر من ريبونوكلياز (100 ملغ / مل، تركيز النهائي من 200 ميكروغرام / مل). عكس لخلط واحتضان في ثيرموميكسر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، مع التحريض لطيف في 300 دورة في الدقيقة.\nإضافة 80 ميكرولتر من بروتين K (20 ملغ / مل، تركيز النهائي من 0.8 ملغ / مل)، عكس لخلط، واحتضان في ثيرموميكسر لمدة 2 ساعة عند 50 درجة مئوية، مع التحريض لطيف في 300 دورة في الدقيقة.\nأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية و 15000 زغ لبيليه الحطام غير قابلة للذوبان.\nفي حين أن العينات هي الطرد المركزي، موازنة الأعمدة مع 1 مل من العازلة كبت والسماح للعمود لتفريغ عن طريق تدفق الجاذبية.\nاستخدام واسعة-- تتحمل غيض ماصة لتطبيق فورا العينة (تجنب بيليه) إلى عمود معاير والسماح لها تدفق كامل من خلال العمود. إذا أصبحت العينة غائمة، مرشح أو الطرد المركزي مرة أخرى قبل تطبيق على العمود (انظر الكتيب التجاري لمزيد من التفاصيل 29 ).\nمرة واحدة وقد دخلت العينة بالكامل الراتنج، وغسل العمود مع 4 × 1 مل من عازلة ق.\nتعليق العمود على نظيفة، 2 مل، وانخفاض ربط أنبوب ميكروسنتريفوج. أزل الحمض النووي الجيني مع 0.8 مل من العازلة قف بريوارمد في 50 درجة مئوية.\nيعجل الحمض النووي بإضافة 0.56 مل (0.7 مجلدات من العازلة شطف) من الأيزوبروبانول درجة حرارة الغرفة إلى الحمض النووي إلوتد.\nمزيج عن طريق انقلاب (10X) وأجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 20 دقيقة في 15،000 x ج و 4 درجة مئوية. رعايةتماما إزالة طاف دون إزعاج الزجاجي، المرفقة فضفاضة بيليه.\nغسل بيليه دنا الطرد المركزي مع 1 مل من الإيثانول البارد 70٪. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 15،000 زغ و 4 درجات مئوية.\nإزالة بعناية طاف (كن حذرا مع هذه الخطوة كذلك) دون إزعاج بيليه. الهواء الجاف لمدة 5-10 دقيقة و ريسوسبيند الحمض النووي في 0.1 مل من العازلة شطف (إب). حل الحمض النووي بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تجنب بيبتينغ، والتي قد القص الحمض النووي.\nقياس العينات باستخدام عالية الحساسية الحمض النووي فحص الكمي (لكل تعليمات الشركة المصنعة).\nتجزئة مستندة إلى حبة من الحمض النووي ميثليته و أونميثيلاتد\nملاحظة: أظهر منشور صدر مؤخرا استخدام مجموعة متوفرة تجاريا 28 التي تستفيد من نهج المنسدلة باستخدام كبغ محددة النطاق الميثيل ملزمة المجال البروتين تنصهر إلى الإنسان مفتش فك جزء (MBD2-فك البروتين) إلى جزء(ونميثيلاتد) من محتوى الجينوم النووي (المميثلي للغاية) 23 . لم يتم اختبار كفاءة التجزئة في عينات القمح سابقا باستخدام هذه المجموعة من الأدوات التجارية التجارية 28 .\nإعداد طازجة 80٪ من الإيثانول (800 ميكرولتر على الأقل لكل رد فعل). تعيين 5x ربط / غسل العازلة للذوبان الجليد على الجليد وإعداد 5 مل من العازلة 1X لكل عينة (تمييع 5X العازلة مع العقيمة، نوكليس خالية من المياه والحفاظ على الجليد خلال البروتوكول).\nإعداد MBD2-فك البروتين ملزمة الخرز المغناطيسي\nإعداد العدد المطلوب من مجموعات حبة. مقياس ردود الفعل للاستخدام بين 1 و 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي المدخلات، التي تتطلب 160 - 320 ميكرولتر من الخرز. لاحظ أن ردود الفعل المذكورة أدناه هي ل 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي المدخلات، لذلك فإنها تتطلب 160 ميكرولتر من الخرز. مقياس ردود الفعل وفقا للاحتياجات.\nباستخدام نصائح واسعة تتحمل، ماصة بلطف البروتين A المغناطيسي Bإيد الطين صعودا وهبوطا لإنشاء تعليق متجانس. كبديل، وتدوير بلطف أنبوب من الخرز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.\nملاحظة: لا دوامة الخرز.\nتابع الإرشادات وفقا لتعليمات المصنع 28 .\nالتقاط الحمض النووي النووي ميثليته\nلكل عينة على حدة، إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي المدخلات إلى أنبوب يحتوي على 160 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي MBD2-فك.\nإضافة 5X ربط / غسل العازلة حسب الاقتضاء نظرا لحجم عينة المدخلات الحمض النووي للتركيز النهائي من 1X (حجم 5X ربط / غسل العازلة لإضافة (ميكرولتر) = حجم المدخلات الحمض النووي (ميكرولتر) / 4). ماصة العينة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط باستخدام واسعة-- تتحمل طرف ماصة.\nتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ماصة بلطف العينات مع طرف ماصة تتحمل واسعة ونفض الغبار العينات 2-3 مرات في جميع أنحاء الحضانة لمنع حبة التثاقل.\nملاحظة: بيبتينغ وفليكينغ أمر بالغ الأهمية لضمان سحب فعالة من الحمض النووي ميثليته.\nجمع المخصب، ونميثيلاتد الحمض النووي العضلي\nتدور لفترة وجيزة الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي و MBD2-فك ملزمة خليط حبة المغناطيسي. وضع أنبوب على الرف المغناطيسي لمدة لا تقل عن 5 دقائق لجمع الخرز إلى جانب الأنبوب. يجب أن يظهر الحل واضح.\nباستخدام واسعة-- تتحمل نصائح، إزالة بعناية طاف مسح دون إزعاج الخرز. نقل طاف (يحتوي أونميثيلاتد، الدنا المخصب العضوي) إلى نظيفة، وانخفاض ربط، أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل. تخزين هذه العينة في -20 أو -80 درجة مئوية، أو المضي قدما مباشرة إلى الخطوة 3.2.6 لتنقية.\nألقي القبض على الحمض النووي النووي من الخرز المغناطيسي MBD2-فك\nإذا كان المطلوب أيضا جزء نووي، اتبع تعليمات الشركة المصنعة 28 لاستئصال الحمض النووي النووي من الخرز المغناطيسي MBD2-فك. تنقية كما هو موضح في الخطوة 3.2.7.\nحبة الحمض النووي تنقية\nتأكد من أن الخرز تنقية في درجة حرارة الغرفة ويتم خلطها بدقة. تابع البروتوكول وفقا للتعليمات الواردة في دليل مجموعة مف 28 .\nملاحظة: يمكن الآن أن تستخدم العينة لبناء مكتبة نغس أو تحليل المصب آخر.\n4. عينة الكمي ومراقبة الجودة\nقر فحص لتقييم تخصيب العضل\nملاحظة: تم تصميم رد فعل قر ومعلمات الفحص المدرجة هنا للاستخدام على روش ليتسيكلر 480، وربما تحتاج إلى تعديل لمختلف المعدات والكواشف. إذا قر غير متوفر، يمكن استخدام ير نقطة نهاية والتصور على هلام الاغاروز كمقياس نوعي من نقاء العينة، وذلك باستخدام نفس الاشعال والشروط الموصوفة هنا. أحجام أمبليكون سيكون ~ 150 نقطة أساس لجميع مجموعات التمهيدي. انظر الجدول 3 لترتيب التمهيديسيس و بيرينغس.\nقر رد فعل الإعداد\nلإعداد الفردية 20 ميكرولتر رد فعل قر، ماصة بعناية ما يلي في بئر واحدة من لوحة قر 96 جيدا: 10 ميكرولتر من 2X سيبر الأخضر أنا سيد. 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيدي مزيج (للتركيز النهائي من 0.5 ميكرومتر). 2 ميكرولتر من قالب (ضمن مجموعة من منحنى القياسية). و 6 ميكرولتر من العقيمة، نوكليس خالية H 2 O. للحد من الأخطاء بيبتينغ، فمن الأفضل لجعل مزيج الرئيسي مع جميع مكونات رد الفعل باستثناء القالب. إضافة مزيج الرئيسي إلى لوحة قر ومن ثم إضافة قالب من الفائدة لكل بئر. يجب إجراء ثلاث مكررات تقنية لكل عينة للتقليل إلى أدنى حد من آثار الخطأ بيبتينغ.\nملاحظة: في نهاية المطاف، يتم مقارنة نسبة النووي إلى دورات القياس الكمي العضوي بين العينات، لذلك الاختلافات الطفيفة في تركيز مقبولة. ومع ذلك، يجب أن تكون تركيزات الحمض النووي تقريبا داخل نطاق إيتش أخرى.\nختم لوحة مع عالية الجودة قر ختم الفيلم. دوامة بلطف العينات، مع الحرص على تجنب إنشاء أي فقاعات. تدور لفترة وجيزة لوحة أسفل لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية لجمع العينة والقضاء على أي فقاعات صغيرة.\nتحميل لوحة في الجهاز. قم بتشغيل برنامج قر وفقا للإرشادات المدرجة أدناه.\nقر معلمات رد الفعل\nملاحظة: هذه هي المعلمات الافتراضية، باستثناء دورة الصلب لمرحلة التضخيم. ضبط هذا الإعداد لاستيعاب الاشعال محددة إذا كانت تلك المستخدمة تختلف عن الاشعال المعروضة في هذا البروتوكول.\nقبل احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، مع معدل منحدر من 4.4 درجة مئوية / ثانية.\nأداء 45 دورات التضخيم من (1) 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، مع معدل منحدر من 4.4 درجة مئوية / ثانية. (2) 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، مع معدل منحدر من 2.2 درجة مئوية / ثانية؛ و (3) 72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، مع معدل منحدر 4.4 درجة مئوية / ثانية (البيانات المكتسبة خلال (3)).\nاستخدام أوبتيونال تذوب دورة منحنى 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانى، مع معدل منحدر 4.4 درجة مئوية / ثانية؛ 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، مع معدل منحدر من 2.2 درجة مئوية / ثانية؛ و 97 درجة مئوية، مع وضع الاستحواذ المستمر.\nاستخدام دورة التبريد من 40 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، مع معدل منحدر من 1.5 درجة مئوية / ثانية.\nحدد قالب سيبر. تحقق من معلمات البرنامج في زر التجربة. مرة واحدة يتم تحميل لوحة، يمكن أن تبدأ الفحص، ويمكن ضبط الإعدادات أثناء الفحص قيد التشغيل.\nتعيين عينات باستخدام محرر نموذج. حدد عبس كوانت كما سير العمل وتعيين العينات كما غير معروف، والمعايير، أو الضوابط السلبية. تعيين النسخ المتماثل وملء أسماء عينة من الأول من كل تكرار. إضافة تركيزات ووحدات إلى المعايير.\nإعداد مجموعات فرعية للتحليل؛ يتم تعيين هذه في محرر مجموعة فرعية.\nللتحليل، حدد عبس كوانت / 2 مشتق ماكس من قائمة "إنشاء تحليل جديد".استيراد منحنى القياسية حفظها خارجيا (إن وجدت) ومن ثم ضرب حساب. سيحتوي التقرير على المعلومات المختارة.\nولإجراء قياس دقيق مطلق لتحديد عدد النسخ أو تركيزها، استخدم منحنيا قياسيا يمثل العينة التي يجري اختبارها ( مثل الحمض النووي العضوي المعزول عن الأساليب المذكورة أعلاه). منذ كمية من الحمض النووي الميتوكوندريا المطلوبة لإعداد منحنى القياسية مرتفعة جدا لتحقيقها مع كمية معقولة من الأنسجة، لا تستخدم نسخ عدد النسخ التي يقدمها البرنامج، ولكن بدلا من ذلك فحص نقاط العبور (كب) القيم لتحديد الإثراء النسبي من أورغانيلار بالمقارنة مع الحمض النووي النووي في العينات. قارن هذه المبالغ النسبية لتلك التي من الحمض النووي الجيني الكلي (انظر ممثل النتائج ). اختبار كفاءة التمهيدي على خمس التخفيفات 1:10 من الحمض النووي الجيني الكلي من شتلات القمح التي نمت بشكل كامل، والتي تبلغ من العمر أسبوعين،ه أسطورة من الشكل 2 ).\nنابض المجال الكهربائي هلام (بفج)\nملاحظة: ويستند هذا البروتوكول على المبادئ التوجيهية المصنعة لأداء بفج لحل ارتفاع الحمض النووي الوزن الجزيئي. انظر جدول المواد.\nإعداد الجل والعينات\nاتبع الإرشادات الخاصة بالهلام وإعداد العينات وتكييفها مع النظام المتاح.\nاتبع المبادئ التوجيهية لإعداد نظام الكهربائي واستخدام المعلمات التالية: وقت التبديل الأولي من 2 ثانية، وقت التبديل النهائي من 13 ثانية، تشغيل الوقت من 15 ساعة و 16 دقيقة، V / سم من 6، وشملت زاوية 120 درجة .\nوصمة عار وصورة هلام\nوصمة عار هلام مع صبغ الاختيار (على سبيل المثال، بروميد إثيديوم أو بديل مناسب) والصورة مع نظام التوثيق هلام مناسبة.\nاستخدام 1 نانوجرام من الحمض النووي كمدخلات لمجموعة دنا مكتبة الإعدادية، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.\nالباركود وبركة عينات للتسلسل في تشغيل واحد. أداء التسلسل وفقا للمبادئ التوجيهية الشركة المصنعة.\nملاحظة: يمكن تغيير معلمات التجميع والتسلسل تبعا لنوع الاهتمام، ومستوى التغطية المطلوب، والمنصة المستخدمة لتسلسل المكتبات. على سبيل المثال، حارة هيس لديها مخرجات أكثر بكثير من حلبة ميسق، لذلك العديد من العينات يمكن مضاعفة. تسلسل مجموعة فرعية أصغر من العينات لتحديد ما إذا كانت مستويات التغطية من جينوم عضوي كافية لتحليل المصب.\nفحص جودة القراءة باستخدام فاستق 31 لتحديد مدى التشذيب والتصفية المطلوبة للبيانات.\nتقليم وتصفية يقرأ الخام باستخدام تريمموماتيك 32 أو برنامج آخر مماثل. استخدم الإعدادات التالية: إلوميناكليب 2:30:10 (لإزالة المحولات)، ليدينغ 3، ترايلينغ 3، سليدينغويندو 4:10، و مينلين 100.\nقم بتعيين نهاية المزاوجة التي تمت تصفيتها و المقلدة بنقطة المحول (بي) إلى الميتوكوندريا الربيعية الصينية (تسلسل مرجع نسبي NC_007579.1 33 )، و كلوروبلاست (نسبي المرجع المرجعي NC_002762.1 34 )، و الجينوم المرجعي النووي 35 باستخدام Bowtie2 36 ، مع الإعدادات التالية: -I 0 -X 800 - حساس.\nتحويل ملفات محاذاة سام إلى تنسيق بام (سامتولس) وفرز ملفات بام. استخدام ملفات بام لحساب التغطية على نطاق الجينوم والتغطية لكل قاعدة مع بيدتولز. تصور النتائج مع وظيفة R- مؤامرة.\nالبروتوكولات الواردة في هذه المخطوطة تصف طريقتين متميزتين لإثراء الحمض النووي العضوي من الأنسجة النباتية. وتعكس الشروط المعروضة هنا التحسين لأنسجة القمح. يتم وصف مقارنة بين الخطوات الرئيسية في البروتوكولات، والمدخلات الأنسجة المطلوبة، وإخراج الحمض النووي في الشكل 1 . خطوات بروتوكول دس اختبرنا اتباع ظروف مماثلة لتلك المذكورة سابقا ( الشكل 1A ). يجب معالجة الأنسجة المحصودة بشكل طازج وتعريضها للطرد المركزي التفاضلي و / أو التدرجات لعزل أورغانيلس سليمة. يتم القضاء على الحمض النووي النووي قبل العضلات هي ليسد، وأخيرا، يتم استخراج الحمض النووي واستخدامها لتطبيقات المصب. في المقابل، في بروتوكول مف، يمكن حصاد الأنسجة النباتية وتخزينها قبل الاستخدام، ولا يلزم العضيات سليمة. بدلا من ذلك، يتم تجزئة الحمض النووي النووي وعضوي من مجموع غنا على أساس وضع مثيلة من الحمض النووي. كلا بروتوكولات تنتج كميات متساوية تقريبا من الحمض النووي العضلي ( الشكل 1C ). من حيث إجمالي الناتج الحمض النووي العضلي بالنسبة لإدخال الأنسجة، وبروتوكول مف مفيد عندما الأنسجة محدودة، كما يمكن استخدام عينة صغيرة من مصنع واحد، ويمكن أن يسمح للنبات أن ينمو لمزيد من التحليل. عادة، في بروتوكولات دس، مطلوب جميع الأنسجة الهوائية من العديد من الشتلات، ويتم تجاهل هذه النباتات. ومع ذلك، فإن طريقة دس يمكن أن يكون الأمثل لإثراء على وجه التحديد لنوع واحد عضوي على الآخر، وهو أمر غير ممكن مع نهج مف. ومن الجدير بالذكر أن الوقت الإجمالي لكل بروتوكول هو ما يعادل تقريبا، على الرغم من أن هناك أقل التدريب العملي على الوقت في نهج مف.\nكلا الأسلوبين إثراء للحمض النووي أورغانيلار، وإن كان مع نسب مختلفة من الميتوكوندريا وسلاسل بلاستيد:\n"> يتم الحصول على كميات قليلة جدا من الحمض النووي العضوي النقي من أي طريقة (على الترتيب من ~ 50-100 نانوغرام؛ الشكل 1C ) لتقييم مستويات تخصيب الجينوم العضوي والتلوث الجينوم النووي في الحمض النووي معزولة عن كل من دس و مف تم استخدام مقايسة قر في هذا الفحص، وفرة النسبية من ثلاثة أمبليكونس ( أي النووية محددة، أكتين ، الميتوكوندريا محددة، NAD3 ؛ و كلوروبلاست محددة، بسب ) في الحمض النووي الجيني الكلي، وتم الحصول على جزء الحمض النووي العضلي من كلا الطريقتين ( الشكل 2 ). تم فحص قيم الكمي (C q ) لكل عينة ( الشكل 2A )، ولأن C q تعرف على أنها دورة ير حيث مضان من التضخيم الهدف يزيد فوق مستوى مضان الخلفية، C ف وفرة الهدف لديها علاقة عكسية. فيالعينة العاصمة، C ف من NAD3 وPSBB، على التوالي، في وقت سابق ~ 17 و 15 ~ دورات من الأكتين (التي لديها ف C من ~ 36) (انظر الشكل 2B للقيم س C ومستويات التخصيب). وهذا يعادل النظرية 167،181- و 47،790 أضعاف التخصيب ل NAD3 و بسب ، على التوالي، نسبة إلى أكتين في عينة العاصمة ( الشكل 2B ، انظر أسطورة الشكل 2 لحساب). في مجموع عينة الحمض النووي الجيني، وإثراء طية ل NAD3 و بسب نسبة إلى أكتين هي فقط 158 و 10،701، على التوالي. ليس من المستغرب أن تجد وفرة أعلى من أمبليكونس العضلي بالنسبة للأمبليكون النووي في الحمض النووي الجيني الكلي، بالنظر إلى أن الجينوم العضلي موجودة في أعداد أكبر نسخة في الخلية من الجينوم النووي 37 وأن عدد العضيات بيR قد تختلف تبعا لنوع الأنسجة أو المرحلة التنموية 38 ، 39 . عموما، تشير البيانات إلى أن طريقة دس تفضي تفضيلي للميتوكوندريا، وهو أمر متوقع، وسرعة الطرد المركزي هي الأمثل لعزل انتقائي الميتوكوندريا والحد من التلوث النووي والكلوروبلاست ".\nيظهر جزء ونميثيلاتد من غفنا الكلي مف أيضا إثراء كبير من كل من أمبليكونس أورغانيلار ومن المتوقع أن يحتفظ الكميات النسبية الأصلية من هذه الأهداف. التخصيب طية ل NAD3 و بسب نسبة إلى أكتين في جزء ونميثيلاتد هي 20،551 و 1،703،253، على التوالي ( الشكل 2A و 2 B ). في جزء ميثليته، وإثراء طية ل NAD3 و بسب نسبة إلى أكتين هي 31 و 823، على التوالي، إنديمشيرا إلى أن البروتين MBD2-فك هو كفاءة عالية في سحب من الحمض النووي النووي ميثليته. كما amplicon بلاستيدات الخضراء لديه وفرة أعلى من amplicon الميتوكوندريا في مجموع الحمض النووي الجيني (~ 6 C ف سابقا)، جزء الميثيلي (~ 5 C ف سابقا)، وجزء unmethylated (~ 6 C ف سابقا) عينات، وهذا يشير إلى أن وفرة الأم من هذه أمبليكونس لا تتغير بشكل كبير من قبل MDB2 المنسدلة. ونحن نركز هنا على أونميثيلاتد (أورغانيلار) جزء بسبب الاهتمام في تسلسل هذه الجينوم على وجه التحديد. ومع ذلك، إذا كان الجينوم النووي هو الفائدة الرئيسية، فإن مف والتسلسل اللاحق للجزء ميثليته سيؤدي إلى تغطية أعلى بكثير من الجينوم النووي من تسلسل الحمض النووي الجيني الكلي، وذلك بسبب انخفاض في دنا "التلوث".\nومن الجدير بالذكر أنه إذا قر غير متوفر، نهاية نقطة ير (باستخدام نفس الاشعال كما ل قر) يوفر كواليتاتقييم النقاء من عضوي. في هذه الحالة، سوف عينات الحمض النووي العضلي النقي تظهر التضخيم لل أمبليكونس الميتوكوندريا والبلاستيد، ولكن لا تضخيم كشفها من أمبليكون النووية على هلام الاغاروز، في حين يظهر الحمض النووي الجيني الكلي التضخيم لجميع مجموعات التمهيدي الثلاثة، كما هو موضح في الدراسات السابقة 11 ، 12 -\nأورغانيلار الحمض النووي معزولة من كلا الأسلوبين هو مناسبة ل نغس:\nتم تعيين تسلسل بي المقطوعة والمنقحة (انظر الخطوة 4.3) إلى الجينوم المرجعي للقمح العضوي المنشور سابقا، وتراوحت كمية القراءات المستخدمة لرسم الخرائط لكل عينة من 800،000 إلى 1100،000 قراءة ( الشكل 3I ). النتائج من رسم الخرائط دي نوفو تسلسل إلومينا يقرأ إلى كلوروبلاست القمح المتاحة والميتوكوندريا الجينومات تتفق مع قر قر( الشكل 3A و 3 B ، ~ 80٪ و ~ 10٪ من يقرأ خريطة للميتوكوندريا (طن متري) والكلوروبلاست (كب) الجينوم، على التوالي) وطريقة مف مما يعطي الحمض النووي الذي يعكس على الأرجح وفرة الأصلي من الجينوم العضلي اثنين ( أرقام 3A و 3 B ، ~ 20٪ و ~ 80٪ من يقرأ خريطة لالجينوم مت و كب جينوم، على التوالي). في كلا الطريقتين، والتغطية النظرية (انظر أسطورة الشكل 3 لحساب) من كل من الجينوم أورغانيلار القمح يتجاوز 100X التغطية (وتتراوح ما يصل إلى ~ 2000X تغطية لجينوم كلوروبلاست في جزء ونميثيلاتد من طريقة مف)، حتى عندما يتم مضاعفة 12 مكتبة ( الشكل 3C و 3D ؛ تم تجميع 6 مكتبات المدرجة في هذا التحليل مع 6 مكتبات إضافية لتحليل منفصل، لما مجموعه 12 المكتباتمجمعة في حارة تسلسل واحد). وقد تم الحصول على عرض أكثر تفصيلا للتغطية من خلال فحص جزء من الجينوم مغطاة في أعماق محددة، وكذلك في مستويات التغطية لكل قاعدة ( الشكل 3E -3I ). وبالنسبة لطريقة الموجات الهكتومترية (مف)، كان متوسط التغطية لكل قاعدة 300 ~ 450X لجينوم الطن المتري و 4000 - 5،000X لجينوم كب. بالنسبة لطريقة دس، كان متوسط التغطية لكل قاعدة 900 ~ 1،300 و ~ 500 - 700X ل جينوم مت و كب، على التوالي. ومع ذلك، كان هناك جزء صغير من كل من الجينوم مت و كب الجينوم التي كانت منخفضة للغاية أو تغطية عالية، وهذا كان ينظر في الحمض النووي العضوي المستمدة من أي من الأسلوبين ( الشكل 3I ). أما المناطق ذات التغطية الأعلى من المتوسط فهي على الأرجح تتوافق مع مناطق التماثل بين الجينوم العضوي، والأقاليم ذات التغطية المنخفضة قد تشير إلى تعدد الأشكال أو المتغيرات الصغيرة الأخرى بين الأصناف التي تتسلسلها والمراجع المنشورة. دعما لهذه الفكرة، هذه المساميرمن التغطية العالية كانت أكثر وضوحا للحمض النووي طن متري مشتقة من طريقة مف ( أرقام 3E و 3 I )، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التغطية العالية من الجينوم كب في هذه الطريقة. غير المبررة، وتغطية الجينوم كب هي أكثر تفاوتا في طريقة مف من طريقة العاصمة ( الشكل 3g و 3 H )، والتي يمكن أن تكون بسبب التحيز طفيف في MBD2-فك المنسدلة على طول الحمض النووي كب. سوف تكون هناك حاجة لمزيد من التجارب لتحديد لماذا هذا هو الحال. وبغض النظر عن ذلك، كان الجينوم مت و كب الجينوم تغطية نسبيا نسبيا مع كل من الطرق ولا مناطق واسعة من التغطية المفقودة، والتي يمكن أن يتضح من فحص جزء من الجينوم تسلسل في عمق معين ( الشكل 3E -3H ). بالإضافة إلى ذلك، تعتبر مستويات التغطية لكل من الجينوم كافية لتحليل المصب، مثل تحليل المتغيرات. إذا اعتبر ذلك ضروريا لتحليل المتغيرات النادرة، والحد من خدرمن العينات المجمعة سيحقق تغطية أكبر. بدلا من ذلك، قد يتم تجميع عدد أكبر بكثير من العينات على حارة هيسق، مع تحقيق المزيد من عمق تسلسل، وإن كان في التضحية إلى طول تسلسل، والمكتبات هيسق محدودة حاليا في طول PE150 على النقيض من المكتبات PE300 ميسك.\nلفحص مستويات تلوث الجينوم النووي باستخدام نهج رسم الخرائط، تم فحص الفئات بي قراءة الخرائط. بي يقرأ يمكن رسم خريطة الجينوم في مجموعة متنوعة من التكوينات. عندما يقرأ 1 و 2 محاذاة إلى المرجع في الأزياء رأسا لرأس، مع مسافة معينة "المتوقعة" بين اثنين من الاصحاب (على أساس متوسط حجم إدراج المكتبة وعادة ما يتم تحديدها كمعلمة الإدخال في برنامج رسم الخرائط )، ويقال هذه بي يقرأ لرسم خريطة "كونكوردانتلي". وعلى النقيض من ذلك، فإن رسم الخرائط "المتناقضة" هو الوضع الذي يضع فيه زملائه خريطة ديس أقل من المتوقعتانس إلى الجينوم المرجعي أو الخريطة في تكوينات بديلة (من الرأس إلى الذيل أو الذيل إلى الذيل). إذا كان زميل واحد فقط محاذاة إلى الجينوم المرجعي، ثم يقال أن قراءة بي لرسم لا متفق أو متنازع على الجينوم المرجعي. في جميع الفئات الثلاث قراءة الخرائط، بي يقرأ يمكن محاذاة إلى الجينوم إشارة واحدة أو عدة مرات.\nبالنسبة لكل من الحمض النووي للعضلات المعزولة و DC- و مف، كانت قراءة الخرائط لجينوم الميتوكوندريا في الغالب في الطبقة المتناغمة بشكل متناغم ( الشكل 4A )، في حين يقرأ يقابل إلى الجينوم كلوروبلاست في نسب متساوية نسبيا من متفق مرة واحدة وبطريقة متقاربة أكثر من مرة واحدة ( الشكل 4B )، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تكرار مقلوب كبير موجود في جينوم كلوروبلاست وأيضا إلى مستويات التغطية عالية للغاية. ومع ذلك، عدد أقل من بي يقرأ تعيينها إلى الجينوم النووي وتعيينها إلى حد كبير أكثر من مرة واحدة فيلا مطابقة أو أزياء متعارضة ( أي زميل واحد فقط هو قادر على الخريطة). هذه هي الأكثر احتمالا رسم الخرائط "خارج الهدف" إلى تسلسل في الجينوم النووي، والتي هي متماثلة للجينوم العضوي أو المناطق المفقودة. فقط كمية صغيرة من يقرأ (<5٪) تعيينها إلى الجينوم النووي بشكل متفق، مشيرا إلى مستويات منخفضة من التلوث الجينوم النووي في الحمض النووي العضوي معزولة عن طريقة دس أو مف ( الشكل 4C )، كما ينعكس أيضا من نتائج قر ( الشكل 2A ). تم أيضا تسلسل الجزء النووي بعد MBD2-فك المنسدلة من الربيع الصيني الأنسجة غير متحرك لتحديد مدى كفاءة الانسحاب هو في إزالة الحمض النووي ونميثيلاتد. أقل من 1٪ من يقرأ في المكتبة المستمدة من جزء نووي مقسمة إلى جينومات مرجعية عضوية، في حين أن 45٪ من جميع يقرأ تعيينها إلى الجينوم النووي ( الشكل 4 ). ومع ذلك، فإن معظم يقرأ تعيين بطريقة متناغمة، ثعلى الأرجح يعكس مستويات عالية من سوء التفكيك والتجزؤ في الجينوم المرجعي النووي القمح. وبصرف النظر عن ذلك، تشير النتائج إلى أن الانسحاب MBD2-فك هو كفاءة عالية في إزالة الحمض النووي العضلي ونميثيلاتد من الحمض النووي النووي ميثليته. ومن الجدير بالذكر أنه لأن الحمض النووي التخصيب العضوي الناجم عن هذه الأساليب يحتوي على مزيج من الميتوكوندريا وسلاسل كلوروبلاست، ولأن التشابهات التسلسل الناتجة عن نقل الجينات القديمة بين هذه العضيات تبقى في الجينوم، والتعيين المناسب للقراءة إلى محددة الجينومات يجب أن تحل بيوانفورماتيكالي.\nانبعاث الأنسجة ورقة لا يغير بشكل كبير وفرة أورغانيل:\nتقليديا، يفضل أن الأنسجة المحورة لعزل الحمض النووي الميتوكوندريا النبات من أجل خفض مستويات الفينول والنشا، والتي قد تتداخل مع استخراجn أو التطبيقات المصب 13 . ولتحديد ما إذا كان يمكن تغيير مستويات إثراء الجينوم العضوي أو تحسينها من خلال ظروف النمو، تعرضت كل من الأنسجة المقيدة وغير المحورة لبروتوكول مف والتسلسل. ومن المثير للاهتمام، إتيولاتيون لم يغير بشكل ملحوظ نسبة من يقرأ التي تم تعيينها إلى الجينوم المرجعية أورغانيلار ( أرقام 3A و 3 B ) أو تغطية لكل قاعدة ( الشكل 3I ) مقارنة مع ظروف غير متحررة. نحن أيضا عزل الحمض النووي الخلايا العضلية باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، مع كل من الأنسجة إتيولاتد وغير المحرقة، وتم العثور على اختلاف بسيط في تخصيب اليورانيوم بين الأنسجة المختلفة باستخدام قر (لا تظهر البيانات). هذا يشير إلى أن الأنسجة ذات الصلة غير ذات الصلة أكثر من الناحية الفسيولوجية يمكن استخدامها لدراسات تسلسل أورغانيلار، مع عدم وجود تغيير ملموس في تخصيب اليورانيوم.\nمراقبة الجودة يقترح ذلكمف الحمض النووي هو الأكثر مناسبة للتسلسل قراءة طويلة:\nكما يصبح تسلسل قراءة طويلة يصبح أكثر سهولة للباحثين، وعزل الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي أصبحت ذات أهمية متزايدة. لتقييم الحمض النووي العضلي معزولة مع أي من طريقة لنعومة والجودة، وقد تم توظيف بفج. مجموع الحمض النووي الجيني يهاجر عادة كما تشويه منتشر في بفغ، ويتم تحديد الوزن الجزيئي من قبل البروتوكول وكيف تم تخزين الحمض النووي والتعامل معها بعد الاستخراج. يجب أن يتجاوز الحمض النووي الجيني الكلي معزولة مع نصائح الجينومية 50 كيلو بايت، والتي تم التحقق منها باستخدام بفج ( الشكل 5 ، حارة 2). يتم استخدام الحمض النووي الجيني الكلي من النصائح الجينومية كمدخلات في مجموعة التخصيب ميكروبيوم لكسر النووية من الحمض النووي العضوي. الجزء النووي التي تم الحصول عليها بعد تجزئة لا تنخفض في الحجم، ولكن لا تزال تتمحور حول 50 كيلوبايت ( الشكل 5 ، حارة 4). هذا ليس سو، بالنظر إلى أن معالجة أكثر صرامة نسبيا للجزء النووي كما شطف من الخرز MBD2-فك ملزمة يتطلب الحرارة والبروتين K الهضم. ونظرا للكتلة المحدودة، لم يتم تشغيل جزء الكائن العضلي على بفغ، ولكن التحليل اللاحق مع تابستاتيون أشار الحمض النووي> 50 كيلوبايت (لا تظهر البيانات). الحمض النووي العضلي التي تم الحصول عليها مع الطرد المركزي التفاضلي لديها كتلة متوسطة من ~ 20 كيلو بايت، على الأرجح الناجمة عن بروتوكول العزلة العضلية الموسعة واستخراج الحمض النووي المستندة إلى العمود اللاحقة والتركيز. يمكن عزل العزلة العضلية المستندة إلى التدرج وأساليب استخراج الحمض النووي البديلة الحفاظ على أحجام أكبر جزء الحمض النووي. بغض النظر، الحمض النووي من حجم الحصول عليها في هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتوليد 10- أو 15 كب تسلسل يقرأ إذا تم أخذ الرعاية أثناء إعداد المكتبة.\nالشكل 1: عرض مقارن لميثو اثنيندس لإثراء ل دنا النبات أورغانيلار. ويتناقض بروتوكول دس التقليدي ( A ) مع بروتوكول الموجات الهكتومترية ( B ). فمن المستحسن لتجنب تجميد ذوبان العينات؛ ومع ذلك، يتم الإشارة إلى الخطوات التي يمكن تخزين العينات على المدى الطويل مع الأسهم المتقطعة ( A و B ). يتم تمييز الاختلافات الرئيسية بين البروتوكولات باللون الأحمر ( B ). ( C ) يقارن الجدول الطرق من حيث إدخال الأنسجة، وعدد من النباتات المطلوبة، خرج الحمض النووي، وحجم الحمض النووي الناتجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.\nالشكل 2: تقييم تلوث الحمض النووي النووي في الدنا الحبيبي المعزولة باستخدام طريقتين. ( ف (محور Y) هي دورة ير التي مضان من التضخيم الهدف يزيد فوق مستوى مضان الخلفية. أكتين هو الجينات المستهدفة النووية محددة، و NAD3 و بسب هي الميتوكوندريا - و كلوروبلاست محددة، على التوالي. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري بين ثلاث مكررات تقنية لكل عينة. دس - طريقة الطرد المركزي التفاضلي، ونميثيلاتد - جزء من الحمض النووي غير ملزمة MBD2-فك، مجموع غنا - الحمض النووي الجيني لم يعالج مع MBD2-فك، ميثيلد - جزء من الحمض النووي ملزمة MBD2-فك.\n( B ) ويبين الجدول القيم C ف ، والتي تظهر على الرسم البياني في ( A )، وإثراء طية من أمبليكونس الكونلي العضوي نسبة إلى أكتين . * طية تخصيب = 2 (سك أكتين - سك الهدف) . الصيغة يفترض كفاءة مثالية من 2 لكل مجموعة التمهيدي، منذ ديفيات قاصرأيون من كل مجموعة التمهيدي من 2 لا يكاد يذكر وسيكون له تأثير يذكر على الحساب والاتجاه العام ( أكتين = 1.961، NAD3 = 1.95، و بسب = 1.989 ). تم تقييم الكفاءات التمهيدي من خلال جعل منحنى القياسية مع سلسلة من خمس التخفيفات 1:10 من الحمض النووي الجيني الكلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.\nالشكل 3: قراءة الخرائط والتغطية النظرية للكلوروبلاست والميتوكوندريا الجينومات. النسبة المئوية للقراءات التي تم تعيينها إلى الميتوكوندريا ( A ) أو كلوروبلاست ( B ) الجينوم المرجعي الربيع الصيني. المقابلة التغطية النظرية للميتوكوندريا الربيع الصيني ( C ) أو كلوروبلاست ( D ) الجين المرجعيميس، على افتراض أحجام الجينوم من 450 و 135 كيلو بايت، على التوالي، محسوبة باستخدام مجموع قراءة الأرقام ونسبة من يقرأ رسم الخرائط لمختلف الجينومات. توزيع الجينوم على نطاق واسع لتغطية الحمض النووي العضوي من طريقة مف ( E و G ) أو طريقة العاصمة ( F و H ). البيانات في لوحات E - H هو من عينة الربيع الصينية المحرقة، ولكن أظهرت جميع العينات الأخرى اتجاها مماثلا. ( I ) متوسط، أدنى، وأعلى تغطية لكل قاعدة لجميع العينات في لوحات A - D. تسميات العينات بما في ذلك عينات "E" تعيين إتيولاتد، و "ن" يعين عينات غير إتيولاتد. دس يشير إلى الحمض النووي معزولة مع طريقة الطرد المركزي التفاضلية و أونميثيلاتد يشير إلى الحمض النووي الذي هو في جزء ونميثيلاتد بعد الانسحاب مع MBD2-فك (بروتوكول مف). عينات المسمى "كريس" تعيين القمح تريتيكوم استيفوم"كريس". كس يعين عينات من القمح تريتيكوم استيفوم "الربيع الصيني. ملاحظة: بسبب تسلسل التماثل بين كلوروبلاست، الميتوكوندريا، والجينومات النووية الناتجة عن نقل الجينات القديمة بين جينوم عضوي، وكذلك بين الجينوم العضوي والنووي، نسبة صغيرة من القراءات الخام قد خريطة لعدة جينومات. وبالإضافة إلى ذلك، يقرأ أن لا ترسم إما الجينوم مرجعي عضوي غير ممثلة في هذا الرقم. وبالتالي، فإن النسب المعروضة هنا ( A و B ) لا مجموع 100٪. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.\nالشكل 4: رسم بي للقراءة على الجينوم النووي القمح. النسبة المئوية لفئات بي قراءة أنواع الخرائط إلى الميتوكوندريا (A) ، كلوروبلاست (B) ، أو النووية (C) الجينوم إشارة الربيع الصيني. - E يعين عينات مقيسة و - ن يعين عينات غير متحرك. دس يشير إلى الحمض النووي معزولة مع طريقة الطرد المركزي التفاضلي، ونميثيلاتد يشير إلى الحمض النووي الذي هو في جزء ونميثيلاتد بعد الانسحاب مع MBD2-فك في بروتوكول مف، والمميثيل يعين الجزء النووي بعد MBD2-فك الانسحاب. عينات المسمى "كريس" تعيين القمح تريتيكوم استيفوم "كريس". كس يعين عينات من القمح تريتيكوم استيفوم "الربيع الصيني." لا يتم عرض قراءة غير محددة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.\nأواد / 55528 / 55528fig5.jpg "/>\nالشكل 5: فحص جودة الحمض النووي باستخدام بفج. القمح النووي الحمض النووي الكلي (حارة 2)، والحمض النووي العضوي القمح التي تم الحصول عليها من الطرد المركزي التفاضلي (حارة 3)، والجزء النووي بعد مف مع نهج الانسحاب MBD2-فك (حارة 4) تعرضت ل بفج على هلام الاغاروز 1٪ مع 1 كيلو بايت سلم الموسعة تستخدم علامة (الممرات 1 و 5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.\nاسم المخزن المؤقت وصفة ملاحظات طريقة\nستي العازلة 400 ملي سكروز، 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.8، 20 ملي إدتا درجة الحموضة 8.0، 0.6٪ (ث / ت) بوليفينيلبيروليدون (بب)، 0.2٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (بسا)، 0.1٪ (v / v) β-ميركابتوثانول (بمي) مزيج العازلة التي تحتوي على السكروز فقط، تريس، و إدتا يمكن إجراء ما يصل إلى شهر مقدما والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية. بب، بسا، و بمي يجب أن تضاف طازجة إلى قسامة من المبلغ المطلوب من المخزن المؤقت قبل الاستخدام. طريقة 1\nست العازلة 400 ملي سكروز، 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.8، 0.6٪ (ث / ت) بوليفينيلبيروليدون (بب)، 0.1٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (بسا) مزيج العازلة التي تحتوي على السكروز فقط و تريس يمكن إجراء ما يصل إلى شهر مقدما وأبقى في 4 درجات مئوية. لاحظ أن العازلة ست لا تحتوي على إدتا أو بمي، ويحتوي على تركيز أقل من بسا. طريقة 1\nالأسهم الدناز 2 مغ / مل الدناز في 0.15 M كلوريد الصوديوم إلى تركيز الأسهم من 2 ملغ / مل مخزن 200 أول أليكوتس في -20 درجة مئوية. لإعداد الدناز حل العمل (200 ميكرولتر من محلول الدناز لكل عينة) انظرالجدول 1 أدناه. انظر البروتوكول الكامل أدناه للحصول على تفاصيل كاملة من الهضم الدناز. يجب أن يتم إعداد الدناز حل العمل طازجة. لوقف رد فعل الدناز مطلوب 400 ملي إدتا الرقم الهيدروجيني 8.0 الحل (تركيز النهائي اللازمة لوقف رد فعل هو 0.2 M إدتا، انظر بروتوكول كامل لمزيد من التفاصيل). طريقة 1\nالدناز حل العمل 0.25 ملغ / مل دناز و 20 ملي مغكل 2 في ست العازلة إعداد الطازجة، 200 أول لكل عينة. التراكيز المعروضة هي لحجم التفاعل النهائي، لذلك خلط: 62.5 ميكرولتر 2 ملغ / مل الدناز (على أساس النهائي 500 ميكرولتر حجم رد الفعل)، 4 ميكرولتر 1M مغكل 2 (على أساس 200 ميكرولتر حجم حل الدناز)، و 133.5 ميكرولتر من العازلة ست ل حجم النهائي من 200 ميكرولتر. طريقة 1\nتحلل العازلة 20 ملي إدتا الرقم الهيدروجيني 8.0؛ 10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.9؛ 500 ملي غوانيدين-هكل؛ 200 ملي كلوريد الصوديوم؛ 1٪ تريتون X-100؛ 0.5 ملغ / مل إنزيمات ليزينغ منتريتشوديرما هارزيانوم مزيج جميع المكونات باستثناء الإنزيمات ليسينغ وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تضاف الإنزيمات ليسينغ طازجة إلى قسامة صغيرة للاستخدام الفوري. الطريقة الثانية\nالجدول 1: وصفات المخازن المؤقتة محلية الصنع والأسهم العاملة.\nورقة عمل التركيز\nاسم العينة وزن الجهاز الفارغ (g) وزن الجهاز معبأ (ز) ملء حجم (أول، شغل ناقص الأوزان الفارغة) الوزن بعد 1 تدور (20 دقيقة *، ز) حجم بعد 1 تدور (أول، شغلناقص الأوزان الفارغة) الوزن بعد 2 تدور (X دقيقة *، ز) حجم بعد 2 تدور (أول، شغل ناقص الأوزان الفارغة)\nلاحظ أن حجم استردادها الفعلي سيكون عدد قليل من أول أقل من حجم المحسوب.\nالجدول 2: ورقة عمل الترآيز.\nاسم خصوصية الجينوم مصدر تسلسل الجينات تسلسل (5 '- 3')\nTa_ACTIN - F نووي غرامين سكافولد IWGSC_CSS_1AS_scaff_3272162: 10،663-12،557 CAGGTATCGCTGACCGTATGA\nTa_ACتين - R نووي كما في الأعلى GAAGGTAGGGCTGAACAAGAAAC\nTa_NAD3 - F الميتوكوندريا انضمام نسبي EU534409.1 GGTGATGCCAGAAGTCGTTT\nTa_NAD3 - R الميتوكوندريا كما في الأعلى CAGATCAATCTTGTTAGGAGGTACTG\nTa_PSBB - F بلاستيدات الخضراء انضمام نسبي KJ592713.1 GCTACCTTTGCTTTGCTCTTCT\nTa_PSBB - R بلاستيدات الخضراء كما في الأعلى GCTGCCTGTTTCCTTGTAGTT\nالجدول 3: قائمة الاشعال قر.\nحتى الآن، تركز معظم الدراسات التسلسل العضوي على أساليب دس التقليدية لإثراء الحمض النووي المحدد. وقد وصفت طرق لعزل العضيات من النباتات المتنوعة، بما في ذلك الطحلب 40 ؛ مونوكوتس مثل القمح 15 والشوفان 11 ؛ و ديكوتس مثل أرابيدوبسيس 11 ، عباد الشمس 17 ، وبذور اللفت 14 . تركز معظم البروتوكولات على الأنسجة الورقية 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، مع بعض قد تم تكييفها لمجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة، بما في ذلك البذور 11 . وقد ثبت أيضا عزل عضيات من بروتوبلاستس 41 . ومع ذلك، وهذا ليس قابلا لجميع النظم، ولا هو ممكن عندما الأنسجة من الفائدة محدودة. العديد من هذه أورغاتم تصميم طرق عزل نيلار لاستعادة العضيات سليمة لتجارب محددة، مثل الدراسات الفسيولوجية. هذه البروتوكولات هي مرهقة وعادة ما تتطلب استخدام التدرجات الكثافة، مثل السكروز أو التدرجات بيركول، والتي هي فعالة جدا في عزل الكسور العضلية محددة ولكنها تتطلب إدخال الأنسجة الكبيرة ( أي ما يزيد على 5 غرام وأعلى من كيلوغرام، اعتمادا على نوع الأنسجة). ومع ذلك، قد يكون الأمثل طريقة دس لإثراء لكسور الخلوية محددة، مثل الميتوكوندريا أو كلوروبلاست، عن طريق تغيير سرعة الدوران وتدرجات الكثافة. في المقابل، فإن نهج مف يتطلب أقل بكثير المواد انطلاق (20 ملغ)، ولكن الحمض النووي الميتوكوندريا والبلاستيد تكون موجودة في وفرة النسبية في الأنسجة المستخدمة لاستخراج الحمض النووي. ومع ذلك، فإن بروتوكول مف يقدم نهجا بديلا لعزل الحمض النووي العضلي المختلط، وهو مفيد بشكل خاص للبدء مع كميات صغيرة من الأنسجة.\nتي س تقييم عينة نقاء التالية العزلة عضية، معظم الدراسات حتى الآن فقط استخدام نهاية نقطة ير وهلام الكهربائي 11 ، 12 . وهذا يعطي مقياس نوعي عادل لنقاء العينة. ومع ذلك، قد لا تصور مستويات منخفضة من التضخيم على هلام الاغاروز. عدد قليل من التقارير تشمل المزيد من التدابير الكمية لمراقبة الجودة، مثل قر 14 . لتقييم كمي لنقاء عينة الحمض النووي معزولة من كلتا الطريقتين، استخدمنا قر والتسلسل لتحديد مدى الحمض النووي النووي لا يزال في العينة، وكذلك النسب النسبية للميتوكوندريا مقابل الحمض النووي الكلوروبلاست. كلا الأسلوبين تقييمها هنا هي فعالة في إزالة الحمض النووي النووي. كلا الطريقتين تنتج مزيجا من الحمض النووي الميتوكوندريا والكلوروبلاست، وإن كان ذلك بنسب مختلفة.\nوتفيد التقارير أن النباتات المتنامية في الظلام (إتيولاتيون) تساعد على تسهيل العزلة العضلية بسبب انخفاض الفينولياتريف "> 13. ومع ذلك، في هذه المقارنة، لم نجد ميزة كبيرة للعمل مع الأنسجة المحرف على عينات نمت ضوء على الرغم من أن نسبة الكلوروبلاستات المتخصصة من المرجح أن تكون أعلى عندما نمت ضوء، وعدد بلاستيد الكلي، كما وهو ما يتجلى في نسبة قراءة المقارنات إلى جينوم كلوروبلاست، دون تغيير في ظروف ضوء مختلفة، لذلك، بالنسبة للتحليلات الوظيفية المصب، مثل تقييم هيتيروبلاسمي في الأنسجة المختلفة أو تحت الضغوطات المختلفة أو لتحليل التعبير، نوصي بإجراء تسلسل الجينوم على النباتات التي تزرع تحت ظروف ذات صلة فسيولوجيا.\nللتطبيق مع تقنيات التسلسل قراءة قصيرة، وتقارن كل من التقنيات هنا تنتج كمية كافية من الحمض النووي والجودة. ومع ذلك، لتحقيق قراءات طويلة من> 20 كيلوبايت لتطبيقات تسلسل جزيء واحد، وكمية أكبر من الحمض النووي ذات جودة أعلى ضروري. على سبيل المثال، من الناحية المثالية،> 1 ميكروغرام من أورغا نقيةدنا القمح نيلار مع الوزن الجزيئي> 20 كيلو بايت ضروري لبروتوكولات في الداخل، وانخفاض المدخلات ل 20 كب إدراج الاستعدادات مكتبة 42 . وقد تؤدي البروتوكولات الجديدة التي تم تطويرها من قبل المستخدم والمدخلات المنخفضة إلى تقليل متطلبات الحمض النووي ( أي إلى 50 نانوجرام أو أقل 20 )، ولكن يبقى التحدي يتمثل في وجود دنا عالي الجودة وعالي الوزن الجزيئي في الاستعدادات المكتبية. فمن الضروري أن غالبية الحمض النووي هو> 20 كيلوبايت، كما سيتم إدراج شظايا أصغر بشكل تفضيلي في سمرتبيل وإلقاء حجم توزيع المكتبة 43 . حاولنا عددا من بروتوكولات استخراج الحمض النووي محلية الصنع وعدد من البروتوكولات التجارية لاستخراج الحمض النووي (لا يظهر). وبالنسبة لأنسجة أوراق القمح، تم الحصول على أفضل توازن بين كمية الحمض النووي ونوعيته، وخاصة الطول، باستخدام مجموعة تجارية 27 ، 29 . اعتمادا على أنواع النباتات والأنسجة من الفائدة، البديلفي البروتوكولات استخراج قد تكون على قدم المساواة مناسبة أو أكثر مثمرة. ومع ذلك، فإننا نخلص إلى أن الاستخراج الكلي من الحمض النووي الجيني ذات الوزن الجزيئي العالي> 50 كيلوبايت في الحجم، تليها تجزئة مع النهج MDD2-فك المنسدلة 28 ، هو قابل للقراءة طويلة تسلسل من المواد بدءا محدودة. يجب أن يختبر العمل المستقبلي حدود المواد الأولية المطلوبة بعد التجزؤ لإعداد مكتبة طويلة الأمد وتسلسل القراءة اللاحقة. والأهم من ذلك، أن هذا النهج يمكن أن يوفر طريقة قوية لعزل الحمض النووي من عينة فرعية من ورقة واحدة مناسبة للتسلسل قراءة طويلة، دون تضخيم الجينوم كله. ونحن نتوقع أن هذا النهج سوف تكون قابلة للتكيف بسهولة إلى أنواع الأنسجة إضافية وتنطبق على نطاق واسع على أنواع النباتات الأخرى. وسوف يكون مفيدا بشكل خاص في الحالات التي تكون فيها كميات الأنسجة تحد، مثل التسلسل في الأجيال الفردية في مخطط عبور أو في أنواع الأنسجة النادرة.\nإن ذكر الأسماء التجاریة أو المنتجات التجاریة في ھذا المنشور ھو فقط لغرض تقدیم معلومات محددة ولا یعني التوصیة أو المصادقة من قبل وزارة الزراعة الأمریکیة. وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود فرص متساوية وصاحب العمل.\nونود أن نعترف بتمويل من وزارة الزراعة الأمريكية - دائرة البحوث الزراعية ومن المؤسسة الوطنية للعلوم (يوس 1025881 و يوس 1361554). نشكر R. كاسبرز لصيانة الدفيئة ورعاية النبات. كما نشكر جامعة مينيسوتا مركز الجينوميات، حيث تم إجراء التحضيرات مكتبة إلومينا والتسلسل. كما نعرب عن امتناننا للتعليقات التي أبداها محررو المجلة وأربعة مراجعين مجهولين من شأنها تعزيز مخطوطةنا. كما نشكر منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي على زمالة ل سك لدمج هذه البروتوكولات للمشاريع التعاونية مع الزملاء في اليابان.


دافوس ودبي ووثيقة الخمسين\nعلى الرغم من أن منتدى دافوس قد خصص لمناقشة القضايا الاقتصادية الكبرى التي تشغل العالم وكان محطاً لرحال كبار الساسة والاقتصاديين، إلا أن المراهقة السويدية غريتا ثونبرغ المدافعة عن البيئة والتي تسعى عبر جهودها البسيطة لإنقاذ الأرض، قد خطفت الأضواء من الزعماء والقادة ووضعت الرئيس الأمريكي في حرج عندما تم سؤاله عنها.\nلقد كان لصرختها البيئية المدوية أثر كبير في نزول الملايين من الطلبة إلى الشوارع في العديد من مدن العالم من أجل التصدي لظاهرة تغير المناخ. لقد أسماها الرئيس الأمريكي وهي وأتباعها من المناصرين للبيئة «هؤلاء المتشائمين» الذين يريدون تغيير العالم.\nلقد كان أنصار البيئة يتظاهرون في دافوس مطالبين كبار الساسة بالأخذ في الاعتبار المتغيرات المناخية حين الحديث عن المشاريع الكبرى. فالتغيرات البيئية الضخمة التي حدثت وحرائق استراليا الضخمة الملتهبة وقبلها حرائق السويد وكاليفورنيا وبقاع أخرى من العالم، جعلت من التغيرات المناخية سؤال الساعة حيث تم توجيهه في دافوس إلى رؤساء الدول وصناع القرار.\nفلم يخل مؤتمر صحافي عن سؤال موجّه لصناع القرار عن المتغيرات البيئية وما يمكن أن تفعله الدول لحماية البيئة والحد من الهدر في الموارد الطبيعية وكيف يمكن حماية البيئة والتخفيف من الأضرار الحاصلة.\nوعلى الرغم من أن للدول الكبرى الصناعية دوراً كبيراً في تلك الكوارث البيئية إلا أن الدول الصغيرة أيضاً تستطيع أن تقوم بدور في حماية البيئة والحد من الهدر من الموارد البيئية.\nدبي واقتصادها المتطور ومشاريعها المبتكرة كانت حاضرة في دافوس، حيث تم الإعلان عن الجواز اللوجستي العالمي وهو الجواز الذي سيسمح بمرور التجارة دون عوائق، وسيمنح نوعاً من الولاء للشركات التجارية التي سوف تستفيد من موانئ دبي ومطاراتها ومناطقها الحرة.\nوتصدرت دبي المشهد في دافوس بعقد جلسة حوارية تناولت موضوع طريق دبي للحرير وهو الطريق الذي أعلن عنه صاحب السمو الشيخ محمد بن راشد آل مكتوم في وثيقة الخمسين. ويهدف هذا الطريق إلى إعادة رسم خارطة التجارة العالمية وتوزيعها التوزيع العادل الأمر الذي يضمن للجميع حصصاً متكافئة.\nاستعرضت الجلسة كذلك أهمية موقع الدولة الذي يربط بين العديد من الأسواق العالمية والناشئة وتستحوذ على حوالي 60% من الناتج العالمي. وعلى الرغم من أن الدول الصناعية الكبرى تتحمل العبء الأكبر عما لحق بالبيئة من تلوث وهدر في الموارد الطبيعية إلا أن الدول الصغرى تحاول محاولة جادة للحد من البصمة الكربونية.\nدبي الصغيرة بحجمها والكبيرة باقتصادها قامت بمحاولة جادة لحماية الموارد الطبيعية من خلال المبادرات المبتكرة والصديقة للبيئة. فقد وضعت اشتراطات جديدة في بناء المنازل وفي حماية البيئة الفطرية والمحميات الطبيعية.\nكما أعلن صاحب السمو الشيخ محمد بن راشد في وثيقة الخمسين أن هدف الإمارة القريب هو الحد من الانبعاثات الكربونية والعمل نحو توجيه 10% من منازل المواطنين لكي تنتج الطاقة والغذاء. فمما لا شك فيه أن حماية البيئة أصبحت هدفاً رئيساً للكثير من المدافعين عن الأرض والذين يتوقون إلى تقليل الانبعاثات الكربونية وإلى خلق مناخ صحي للأجيال القادمة.\nوعلى الرغم من أن هذا الهدف قد يراه البعض صعب التحقيق إلا أن العمل جار نحو خلق مناخ يستطيع فيه المنزل الإماراتي الاكتفاء بالطاقة عن طريق الألواح الشمسية. لقد استطاعت الإمارات تقديم أنموذج جميل للتنمية الإنسانية المتوازنة وخلق أنموذج يمكن للعالم تقليده.\nإن دولة الإمارات تضرب للعالم أجمع أنموذجاً جميلاً قائماً ليس فقط على القيم الحيوية والأخلاقية كالتسامح والعطاء والتعايش السلمي التي تسهم في بناء مجتمعات إنسانية فاضلة متعاونة، بل إلى تبني أفضل الممارسات الإدارية والبيئية التي تقود إلى حماية العالم ككل من كل ما يؤثر على موارده الطبيعية وعلى العيش المشترك.\nإن دبي خصوصاً ودولة الإمارات عموماً تشعر بأن اقتصادها جزء لا يتجزأ من الاقتصاد العالمي وحركته المرنة حول العالم، وبالتالي تعمل على التعاون مع غيرها من الدول لضمان التوزيع العادل للحصص الاقتصادية. ولضمان المسؤولية الاقتصادية فإن هناك مسؤولية أخلاقية تتمثل في حماية هذا العالم لضمان مستقبل الأجيال القادمة.\nوبالتالي فإن مسؤولية الدول مشتركة في النمو الاقتصادي كما هي مسؤولية مشتركة في حماية البيئة من أجل المستقبل. ولهذا فإن الإمارات لا تدخر جهداً في سبيل حماية البيئة وفي حماية القيم الإنسانية والأخلاقية التي هي أساس بقاء المجتمعات الإنسانية وحمايتها من الانهيار.\nآخر تحديث للصفحة تم بتاريخ: 3 فبراير 2020 03:00


الانكسارات العربية .. حاضر بائس ومستقبل غامض\nما بين يناير 2011 ويناير 2017 جرت مياه كثيرة تحت الجسر في المنطقة العربية، ما بين ابتهاج وترحيب بما حملته رياح التغيير في البداية وإحباط ورفض لما آلت إليه النتائج وسط مرحلة من الغموض المفعم بالقلق حول الحاضر وبالتوقعات السلبية للمستقبل.\nأحدث التقارير البحثية الغربية عن حالة العالم العربي طرحها مركز كارينجي للشرق الأوسط، تحت عنوان «انكسارات عربية: المواطنون، والدول، وعقود اجتماعية». ويلخص التقرير الأسباب في مجموعات تضم تجارب المواطنين العرب المتغيرة في سياق الضغوط الديموجرافية والهجرة البشرية والاستقطاب السياسي والحراك الاجتماعي، وأزمة الحوكمة في أرجاء المنطقة، والضغوط على الأنظمة الريعية، وتأثير القطاع الأمني ووسائل الإعلام على السياسات العربية، والنظام الإقليمي الآيل للانهيار في سياق حافل بالعديد من الصراعات الداخلية النزاعات بين الدول وشح الموارد.\nولا يتفاءل التقرير لا من الحاضر ولا من المستقبل، بل يقدم رؤية صادمة عن كل منهما.. «ستطلب الدول من المواطنين التضحية بمزايا المعونات الاجتماعية التي اعتادوا عليها منذ عهد بعيد بدعوى التقشف المالي، وسيقبل المواطنون بذلك، ولكنهم من جهة أخرى سيتوقف قبولهم بالأنظمة القديمة وسيطالبون بالمساواة والعدل وبدور أكبر في القرارات المتعلقة بالقضايا الوطنية.\nوأما السلطات التي ستخشى الإصلاح،فإنها ستواصل التشبث بالوضع الراهن المتهافت حتى لو أسفر ذلك عن نتائج كارثية».\nوحتى لا تقع هذه النتائج الكارثية يؤكد التقرير أنه لن يكون بمقدور الدول العربية تنمية مجتمعات مزدهرة إلا إذا اقتدت بنماذج سياسية واقتصادية جديدة. هنا لا يقدم التقرير شرحا لما يدعو إليه من نماذج جديدة. ولكنه في مواضع رئيسية منه لا يرى حلا إلا في ترسيخ المواطنة والتنوع أو التعددية السياسية، وكذلك التخلص مما أسماه الركود السياسي والنزعة التسلطية والفساد.\nمن يتأمل محتويات التقرير لا يملك إلا التعبير عن التقدير لجهد أصحابه وأهميته لصانع القرار العربي. ورغم ذلك يمكن طرح ثلاث ملاحظات بشأن محتواه والفائدة المرجوة منه.\nالملاحظة الأولى تتعلق بما يمكن تسميته إعادة إنتاج القديم ولكن بلغة ومعلومات معاصرة. فالمتابع للشأن العربي قبل أحداث 2011 لا يجد جديدا في كل ما جاء به تقرير كهذا لا من حيث التوجه ولا حتى من حيث المفردات. ولو شحذ البعض ذاكرته بعض الشىء لأكتشف أن كثيرا من تقارير الأنظمة العربية الرسمية في ذلك الزمان وصلت إلى نفس التشخيص وطرحت نفس المفردات!. فقط ظلت المشكلة قائمة لأن الأنظمة لم تطبق ما كانت تصل إليه من توصيات أو قرارات، أو لأنها تباطأت كثيرا في التطبيق فسبق السيف العزل.\nوأما الملاحظة الثانية فتتعلق بتغافل التداخل ما بين الداخل والخارج في مسار التطورات العربية.فقد اهتم التقرير بالتركيز على العوامل المحلية التي أدت إلى تدهور الأوضاع. ولا أحد يقلل من أهمية ذلك، ولكن الكثير مما ورد في التقرير سواء ما يتعلق بالاستقطاب السياسي والحراك الاجتماعي والخلافات المذهبية، والأخطر مشهد الهجرة البشرية وغيرها من المآسى الإنسانية، إنما وقع بفعل التدخلات الخارجية الغربية سياسية كانت أم عسكرية.\nوتتعلق الملاحظة الثالثة برؤية العالم، وهي مسألة فكرية وثقافية بالدرجة الأولى وتنصرف إلى تحديد ما يريده العرب لأنفسهم في هذا العالم المضطرب وما يريدونه من غيرهم. وإلى الآن وبعد كل هذه السنوات الطويلة في معارك العرب مع الخارج لا تريد مراكز الأبحاث الغربية أن تقبل أو حتى تتفهم أن جدول القيم ومضمونها مختلف إلى حد كبير مع ما عرفه الغرب. العدالة تأتى في مقدمة أولويات القيم لا الحرية ولا المساواة رغم الإيمان بهما. والعقيدة محور أساس في تحديد المواقف من الآخر ومن الأحداث ذاتها. التقارير الغربية لا تهتم بهذا وذاك في تناولها للشأن العربي، بينما تضع كل تركيزها على الحرية، ولذلك تظل التقارير الغربية بعيدة عن حقيقة الواقع العربي.


مبابي محتفلاً بهدفه وسط حسرة جوردي ألبا مدافع برشلونة في مباراة باريس التي خسرها الأخير 4-1\nنشر في: 24 فبراير ,2021: 07:17 م GST آخر تحديث: 24 فبراير ,2021: 07:39 م GST\nدقت أجراس الإنذار العام الماضي، وعقب ثلاث هزائم داخل الديار في ذهاب دور الستة عشر لدوري أبطال أوروبا لكرة القدم هذا الموسم، أصبح من الصعب تجاهل تراجع الكرة الإسبانية على الصعيد الأوروبي.\nوتضررت سمعة البلاد بالفعل بخسارة برشلونة 4-1 أمام باريس سان جيرمان في كامب نو وإشبيلية 3-2 على أرضه أمام بروسيا دورتموند، لكن هزيمة أتلتيكو مدريد 1-صفر أمام تشيلسي يوم الثلاثاء ربما كانت الأصعب.\nوكان أتلتيكو أفضل فريق في إسبانيا طوال الموسم الحالي، لكن أمام تشيلسي الذي لا يزال يتحسس طريقه مع مدربه الجديد توماس توخيل كان الفريق الإسباني بدون أنياب تماما وفشل في إطلاق تسديدة واحدة على مرمى الضيوف.\nوقال ريو فرديناند الفائز بلقب دوري الأبطال 2008 لشبكة "بي.تي سبورت" : هذا يمثل انعكاسا كبيرا عن مدى تواضع الدوري الإسباني حاليا. وأضاف جو كول لاعب تشيلسي السابق: إذا كان هذا أفضل ما يقدمه الدوري الإسباني، إذن فإن لديهم مشاكل. هذا تحول كبير بالتأكيد.\nوفازت أندية إسبانيا بستة ألقاب بين آخر عشرة لدوري الأبطال، لكن العام الماضي لم يبلغ أي فريق إسباني الدور قبل النهائي لأول مرة منذ 2007.\nوبدت علامات التراجع واضحة بالخسارة المذلة لبرشلونة 8-2 على يد بايرن ميونخ، وخسارة ريال مدريد أمام مانشستر سيتي في دور الستة عشر وخسارة أتليتيكو مدريد أمام لايبزيغ العام الماضي.\nوالآن يوجد تهديد خطير بعدم وجود أي فريق إسباني في دور الثمانية لأول مرة منذ موسم 2004-2005، وتتعلق آمال البلاد على ريال مدريد الذي سيزور أتالانتا في وقت لاحق يوم الأربعاء.\nوقال رونالد كومان مدرب برشلونة إنه من السابق لأوانه الحديث عن تراجع إسبانيا أوروبيا، لكن فريقه مثال على هذا التراجع.\nوفشل النادي الكاتالوني في تطوير أسلوب لعبه وتشكيلته، بينما أهدر الملايين على تعاقدات لم يثبت نجاحها مثل فيليب كوتينيو وأنطوان غريزمان وعثمان ديمبلي.\nكما تعاقد ريال مدريد مع صفقات فشلت في إثبات وجودها، إذ ضم النادي إيدن هازارد في صفقة قياسية، لكنه أبتلي بسلسلة من الإصابات، وكذلك فشل التعاقد مع البرازيليين الشابين فينسيوس جونيور ورودريجغو في صفقات باهظة الثمن نظرا لعدم إثبات وجودهما.\nوتعرضت سياسة الأندية الإسبانية في التعاقدات للسخرية من الرئيس التنفيذي لرابطة الدوري الألماني عندما قال الأسبوع الماضي عنها "ماكينات حرق الأموال والإدارة السيئة".


السربل يطلق مبادرة( نبض المونديال قطر ٢٠٢٢ )\nبواسطة عاطف عساف آخر تحديث يناير 24, 2021\nستادكم نيوز-اطلق الإعلامي الكويتي الزميل زيد السربل مبادرة إعلامية رياضية جديدة باسم ( نبض المونديال قطر ٢٠٢٢ ) تبدأ نشاطها بصورة رسميه . وتعد هذه المبادرة منبر اعلامي ومنصه رديفه وصوت جديد لدعم الاعلام الرياضي القطري والعربي وتعزيز دورة في تسليط الاضواء على المونديال الذي سيقام في قطر العام المقبل. وتهدف المبادرة التي تضم كوكبه من الاعلاميين الرياضيين وصل عددهم قبل ان تبدأ الى اكثر من ١٢٠ اعلامي من جميع الاقطار العربية لمتابعة كل مايتعلق بالمونديال الذي يقام لاول مره في التاريخ على ارض عربيه والانشطة المصاحبة له. وستتضمن المنصة كافة الاخبار والمعلومات الخاصة بالمونديال منذ ان بدأ بالاضافة الى تقارير ولقاءات خاصه وتعليقات واراء وصور وفيديوهات وتغريدات متنوعه تتعلق بشؤون المونديال . وعبر الزميل السربل عن شكره وتقديره لكل من ساهم في دعم هذه المبادره الخاصة بالمونديال القطري من مسوؤلين واعلاميين وجمهور من كل مكان وموقع وتقدم بجزيل الامتنان والتقدير لهم دون استثناء . وقال ان التشجيع والمؤازره لهذه المبادره هما الدافع الحقيقي وراء الاستمرار لتنفيذها واعتبرها اقل الواجبات التي يقدمها لمونديال كل العرب بكل فخر واعتزاز. ودعا الجميع الى دعم المبادرة ومتابعتها عبر وسائل التواصل الاجتماعي ( تويتر والانستجرام وفيس بوك وتلغرام ) على العناوين التالية\nويعد الزميل زيد السربل احد الكفاءات الاعلامية الكويتية وشغل منصب نائب رئيس التحرير للشوؤن المحلية بوكالة الكويتية ( كونا ) لسنوات طويله وله تاريخ حافل بالاعلام الرياضي لاكثر من ٣٥ عاما وترأس الكثير من اللجان والوفود الاعلامية لبطولات رياضيه دوليه وقارية ومحلية بصفته الاعلامية والرياضية وقام بتغطية اكبر البطولات من بينها اربع دورات اولمبيه هي اولمبياد برشلونه ٩٢ واتلانتا ٩٦ وبكين ٢٠٠٦ وبطولات كأس العالم لكرة القدم عام ١٩٩٤ م وفرنسا ٩٨ والمانيا ٢٠٠٦ م كما تراس وفود لعدة بطولات للعالم في لعبتيي المبارزه والجمباز بصفته عضو مجلس الاداره لاتحاديين لعدة فترات اولمبية الى جانب العديد من المناسبات الرياضية الكبرى من من بينها دورة الالعاب الآسيوية بغوانزو ( الصين ٢٠١٠ ) وانشون ( كوريا الجنوبية ) ودورات الالعاب العربية في سوريا ٩٢ ولبنان ومصر والجزائر ٢٠٠٤ وجميع دورات الخليج العربي ابتداءا من الدورة الخامسة بالعراق وكأس العرب لكرة القدم . وللزميل الكاتب زيد السربل عدة اصدارات من بينها الاعلام الرياضي في دولة الكويت واكاليل الرماية في دولة الكويت وجهراوي والمسيرة التاريخية لالعاب القوى الكويتية .\nإحصائية رقمية…السلط يثبت اقدامه بين كبار المحترفين\nالتعمري يعلن رسميا انتقاله للعب في الدوري البلجيكي\nعراقة الكرة الأوروبية


يمكنك إجراء مكالمات Skype من خلال السماعات بعد قيامك بإعداد السماعات باستخدام تطبيق Cortana. تعد المكالمات من حساب Skype إلى حساب Skype آخر مجانية، ونوفر كذلك عرضًا ترويجيًا لمدة محدودة للمكالمات المجانية إلى الهواتف المحمولة أو الخطوط الأرضية في الولايات المتحدة والمكسيك وكندا من خلال اشتراك Skype.\nكيف يمكنني إعداد Skype على السماعات الخاصة بي؟\nيمكنك إعداد السماعات الخاصة بك لمستخدمين اثنين على نفس السماعات. فبعد إكمال هذه الخطوات، ما عليك إلا تسجيل الخروج من حسابك وتكرارها باستخدام معلومات حساب المستخدم الثاني.\nأولاً، يجب عليك خوض عملية إعداد تطبيق Cortana على الكمبيوتر الشخصي أو الهاتف المحمول لديك. يجب عليك الاطّلاع على دليل تعليمات الجهاز لديك لمعرفة كيفية القيام بذلك. تأكد من استخدام نفس الحساب الذي تستخدمه لتسجيل الدخول إلى Skype. وبمجرد اكتمال ذلك، ستكون مستعدًا لإعداد Skype.\nملاحظة: إذا لم تقم بتحديث حسابك على Skype بحساب Microsoft، فستخوض العملية من أجل تمكين Cortana. معرفة المزيد.\nسيعمل الحساب الذي تستخدمه لتسجيل الدخول إلى Cortana على السماعات على تسجيل دخولك إلى حسابك على Skype تلقائيًا.\nوخلال إعداد Skype، ستتم مطالبتك بإذن لمزامنة جهات اتصالك على Skype بـ Cortana من أجل تمكين الاتصال باستخدام Skype.\nوسيتم بعد ذلك إرشادك من خلال البرامج التعليمية الخاصة بكيفية استخدام السماعات، بما في ذلك كيفية إجراء مكالمات Skype.\nكيف يمكنني استخدام السماعات الخاصة بي لإجراء مكالمات Skype؟\nللقيام بذلك... قُل ما يلي...\nإجراء مكالمة صادرة مرحبًا Cortana،\nاتصلي بأمي [على Skype]\nاتصلي بهاتف أمي المحمول [على Skype]\nاتصلي برقم 555-5555 [على Skype]\nاتصلي برقم 800JETBLUE [على Skype]\nاتصلي بـ El Gaucho [على Skype]\nما أفضل بيتزا في الجوار؟ …\nمرحبًا Cortana، اتصلي به [على Skype].\nالرد على مكالمة واردة مرحبًا Cortana،\nردي / أجبي على الهاتف\nالتحكم في مكالمة مرحبًا Cortana،\nارفعي مستوى الصوت / اخفضي مستوى الصوت\nاكتمي مستوى الصوت\nعند الاتصال بـ Cortana مرحبًا Cortana،\nقولي لي نكتة\nمن الذي يمكنني الاتصال به من خلال السماعات؟\nجهات اتصالك على Skype: هؤلاء هم الأشخاص الذين تواصلت معهم على Skype أو أرقام الهواتف التي حفظتها كجهة اتصال في Skype.\nجهات اتصال الهاتف لديك: هؤلاء هم الأشخاص والأرقام المحفوظة في دفتر عناوين هاتفك. يجب عليك منح Cortana الإذن لمزامنة جهات الاتصال من هاتفك من أجل الاتصال بجهات الاتصال هذه. وبصورة عامة يلزم توفر اشتراك أو رصيد Skype لإجراء هذا النوع من المكالمات ولكننا نوفر عرضًا ترويجيًا لفترة محدودة يسمح بإجراء مكالمات مجانية إلى وجهات معيّنة. معرفة المزيد.\nأرقام الهاتف: يمكنك مطالبة Cortana بالاتصال بأي رقم هاتف تقوله. وبصورة عامة يلزم توفر اشتراك أو رصيد Skype لإجراء هذا النوع من المكالمات ولكننا نوفر عرضًا ترويجيًا لفترة محدودة يسمح بإجراء مكالمات مجانية إلى وجهات معيّنة. معرفة المزيد.\nالأماكن المحلية: اطلب من Cortana الاتصال بأي مكان محلي. يمكنك الطلب حسب اسم المكان أو من خلال البحث عنه، ثم مطالبة Cortana بالاتصال. وبصورة عامة يلزم توفر اشتراك أو رصيد Skype لإجراء هذا النوع من المكالمات ولكننا نوفر عرضًا ترويجيًا لفترة محدودة يسمح بإجراء مكالمات مجانية إلى وجهة معيّنة. معرفة المزيد.\nهل يمكنني استخدام السماعات لقبول المكالمات الواردة من الهواتف المحمولة والخطوط الأرضية؟\nنعم يمكنك ذلك! معرفة المزيد حول كيفية إعداد رقم Skype.\nكيف يمكنني الاتصال بالأرقام الدولية؟\nإذا قمت بحفظ رقم دولي كجهة اتصال، فيمكنك الاتصال بجهة الاتصال هذه من خلال الاسم كما كنت ستفعل مع أي جهة اتصال محلية. إذا كنت ترغب في الاتصال برقم دولي لم تقم بحفظه، فيمكنك الاتصال بالرقم بأي من الطريقتين التاليتين:\nابدأ رقم الهاتف بـ "+" ("علامة زائد) - أي بالطريقة التالية، "مرحبًا Cortana، اتصلي برقم +44 ..."\nابدأ رقم الهاتف بـ "011" - أي بالطريقة التالية، "مرحبًا Cortana، اتصلي برقم 011 44 ..."\nيرجى ملاحظة أنك ستحتاج إلى أرصدة إضافية أو اشتراك دولي لتنفيذ هذا السيناريو، نظرًا لأن العرض الترويجي الأولي خلال إعداد الجهاز يغطي الاتصال بالولايات المتحدة فقط. معرفة المزيد حول الاتصال دوليًا.\nكيف يمكنني إضافة المزيد من جهات الاتصال؟\nإذا كنت تريد إضافة جهات اتصال، فقم بإضافتها على هاتفك، ثم افتح تطبيق Cortana على هاتفك لمزامنة جهات الاتصال هذه بالسحابة. بعد ذلك، يمكنك الاتصال بجهات الاتصال هذه على السماعات. معرفة المزيد.\nتوجد سماعاتي في غرفة عائلية. ما الحساب الذي يجب علي استخدامه لإعداد السماعات وSkype؟\nعندما تقوم بإعداد السماعات، فإنه يمكن لأي شخص في الغرفة سؤال Cortana وبدء مكالمة Skype. سيكون بإمكان السماعات الوصول إلى جهات الاتصال التي قمت بتمكينها (راجع من الذي يمكنني الاتصال به من خلال السماعات؟) إضافة إلى الإعلان عن أي مُعرف متصل وارد. يعني هذا أن أمامك خيارين عند تسجيل الدخول إلى السماعات:\nتسجيل الدخول إلى السماعات باستخدام حسابك الشخصي: ويعني هذا أن أي شخص في الغرفة سيكون بإمكانه الوصول إلى المعلومات والوظائف الموجودة لديك مع Cortana، بما في ذلك أي مكالمات Skype (الصادرة أو الواردة). وهذه هي التجربة الأكثر تخصيصًا لـ Cortana وSkype.\nإنشاء حساب جديد لعائلتك لتسجيل الدخول إلى السماعات: عندما تقوم بتسجيل الدخول إلى السماعات، فيمكنك إنشاء حساب جديد يمكنك استخدامه لعائلتك على السماعات، ولكن هذا يعني أن Cortana وSkype سيكون بإمكانهما الوصول إلى المعلومات وجهات الاتصال التي قمت بإعدادها على هذا الحساب فقط. ستحتاج إلى إضافة جهات الاتصال إلى هذا الحساب مجددًا لأي شخص ترغب في الاتصال به من السماعات (راجع كيف يمكنني إضافة المزيد من جهات الاتصال؟). وتعد هذه التجربة أقل فيما يتعلق بالتخصيص ولكنها أكثر في المشاركة.\nكيف يمكنني تكوين مُعرف المتصل الصادر لدي عندما أتصل بالأشخاص من الهواتف المحمولة والخطوط الأرضية من Skype؟\nيدعم Skype طرقًا متنوعة لتخصيص مُعرف المتصل الصادر لديك للمكالمات إلى الهواتف المحمولة والخطوط الأرضية. معرفة المزيد.\nهل يمكنني الاتصال بمجموعات Skype على السماعات الخاصة بي؟\nلا ندعم حاليًا إجراء مكالمات صادرة إلى مجموعات من السماعات. ومع ذلك، إذا كنت جزءًا من مجموعة تتصل بك، فإن السماعات لديك سترن ويمكنك الرد على هذه المكالمة.\nما الذي يحدث عندما أسأل Cortana خلال مكالمة؟\nعندما تسأل Cortana خلال مكالمة، فإن المستخدم البعيد سيسمع ما الذي تسأل Cortana عنه، ولكنه لن يسمع رد Cortana. ونفعل ذلك لاحترام خصوصيتك، حيث يمكنك أنت وحدك اختيار ما الذي تريد إخباره للمستخدم البعيد.\nهل تستمع Cortana إلى مكالماتي؟\nلا يتم تنشيط Cortana إلا باستخدام الكلمات "مرحبًا Cortana". ولا يتم تسجيل أي شيء من مكالمتك الهاتفية أو يتم إرساله إلى Cortana حتى تنطق هذه الكلمات. علاوة على ذلك، فإن المستخدم البعيد لن يتمكّن من تنشيط Cortana على سماعاتك أثناء المكالمة بينكما.\nهل يمكنني التفاعل مع جهات الاتصال التي تستخدم الاستجابة الصوتية التفاعلية (IVR) (على سبيل المثال، "اضغط 1 للمتابعة")؟\nحاليًا، التفاعل مع أنظمة IVR من خلال اتخاذ إجراءات مثل الضغط على حروف أو أرقام خلال المكالمة غير مدعوم. ولكن فريق Skype يدرس دعم هذه الميزة في المستقبل.\nكيف يمكنني إجراء مكالمات مجانية إلى هواتفي المحمولة وخطوطي الأرضية من سماعات Harman Kardon لدي؟\nنقدم عرضًا ترويجيًا لفترة محدودة لأي شخص يشتري سماعات Harman Kardon جديدة، يتيح له إجراء مكالمات مجانية غير محدودة من الولايات المتحدة إلى الهواتف المحمولة والخطوط الأرضية بالولايات المتحدة والمكسيك وكندا. وبمجرد قيامك بتسجيل الدخول إلى جهاز Harman Kardon، فإنك ستتلقى رسالة بريد إلكتروني تؤكد اشتراكك. يمكنك التحقق من حالة اشتراكك عن طريق تسجيل الدخول إلى ملف تعريف حسابك وعرض اشتراكاتك. معرفة المزيد حول العرض الترويجي للاتصال عبر Harman Kardon.\nملاحظة: ليس عليك القيام بأي شيء إضافة إلى إعداد سماعاتك لتنشيط العرض الترويجي للمكالمات المجانية، ولكن قد يستغرق الأمر حتى 90 دقيقة ليتم تنشيط اشتراكك. وكذلك فإن تاريخ انتهاء صلاحية اشتراكك قد لا يظهر بصورة صحيحة، ولكن لا تقلق فإنك ستحصل على العرض الترويجي المجاني على النحو الموضح في شروط الاشتراك.


طباعة الخبر: باسم يوسف لـ«سي إن إن»: العرب يعانون أيضا من الفاشية العسكرية ومنعت في مصر بعد محمد مرسي\nمن هنا وهناك / باسم يوسف لـ«سي إن إن»: العرب يعانون أيضا من الفاشية العسكرية ومنعت في مصر بعد محمد مرسي\nباسم يوسف لـ«سي إن إن»: العرب يعانون أيضا من الفاشية العسكرية ومنعت في مصر بعد محمد مرسي\nالسبت, 12 ديسمبر - الساعة: 2015 08:10:00 صباحاً\nقال الإعلامي المصري الساخر، باسم يوسف، إن الملياردير الأمريكي، دونالد ترامب، المرشح للانتخابات الرئاسية الأمريكية 2016، يكره المسلمين إلا من كانت جيوبهم مليئة، وذلك في تعليق على دعوة المرشح الأمريكي لمنع المسلمين من دخول أمريكا.\nجاء ذلك في مقابلة ليوسف على قناة «سي إن إن» الأمريكية حيث قال: «لدى ترامب العديد من الاستثمارات في الشرق الأوسط ولا يرى أنها مهددة… وأعتقد أن ما هو أهم من ذلك هو أنه ماض في بث الكراهية والعنصرية في الناس».\nوأردف يوسف قائلا: «الخوف هو سلاح كبير جدا، وعندما تضع أي مجموعة من الناس تحت حالة من الخوف المستمر فإنهم سيقومون بأمور لم يكن يعتقد أن باستطاعتهم فعلها، وأظن أن هناك العديد من مؤيدي ترامب لم يخطر في بالهم أن يحظروا مجموعة معينة من الناس قبل سنوات قليلة».\nوأضاف: «كانت لدي مشاكل مع حكومات إسلامية ولكن كانت لي أيضا مشاكل مع النظام الذي أسقط النظام الإسلامي. وفي الحقيقة فقد منعت بعد (إسقاط الرئيس المصري محمد) مرسي وليس خلال فترته… لدينا مشكلة في الشرق الأوسط فــيما يتعلق بالديمقراطية بشكل عام، هي ليست مشكلة إسلامية بل هي أيضا مشكلة العسكر، الأمر ليس فقط كإسلام فاشي بل هناك فاشية عسكرية».\nوتابع قائلا:»يقال إن هناك سمعة (سيئة) للإسلام في الغرب، ولكن في الحقيقة لا يمكن تعميم الفكرة والحكم على مجموعة كبيرة من الناس على خلفية ما تقوم به مجموعة صغيرة من الأشخاص الذين يرهبون أصلا الجميع».\nطبع الخبر في: الإثنين, 23 سبتمبر - الساعة: 2019 05:56:26 صباحاً\nرابط الخبر: https://yemen-press.com/news63281.html


السؤال المسكوت عنه\nسؤال الدولة، فضلًا عن هويتها، مسكوت عنه في أدبيات التنظيمات الإسلامية وأتباعها (فيسبوك)\nتكمن دوامة التنظيمات الإسلامية هنا وبالذات، أن سؤال الدولة وهويتها لا يندرج في سجل المُفَكَر فيه، وإنما يندرج بالضبط في خانة الّلا مُفَكَر فيه، بل المستحيل التفكير فيه. لم تتصالح هذه التنظيمات مع هذه الفكرة، لأنها لا تجد الأجوبة الكافية والمقنعة لسؤال الدولة. لذلك ظل هذا السؤال مربكًا لدرجة أن هذه التنظيمات يمكنها التحالف مع المحتل على أن تجيب إجابة شافية عن سؤال الدولة الغامض والمجهول في أدبياتها. من هنا يكمن بلاء العراقيين وسقمهم؛ فإذا كان الاستبداد السابق لا يجد حرجًا في أن يموضع نفسه في سجل الدولة العَلمانية، غير أنه يختزل كل مؤسساتها لحساب تاريخه الشخصي. أما الإسلامي لا يموضع نفسه لا إلى هؤلاء ولا إلى هؤلاء. إن سؤال الدولة هو بمنزلة الصاعقة تنزل بشكل مفاجئ على رؤوس الإسلاميين، وحتى هذا اللحظة يندرج هذا السؤال في خانة الغيبيات.\nيقع المرء في العراق في حيرة من أمره؛ هل يتعامل مع تنظيمات سياسية دنيوية أم مجموعة من الأنبياء والرسل؟\nمن جملة المصائب التي توالت على العراقيين هو ربط السياسة بالعقيدة ربطًا محكمًا، حتى أن المرء يقع في حيرة من أمره؛ هل يتعامل مع تنظيمات سياسية دنيوية أم مجموعة من الأنبياء والرسل. ولا أدعي أن لهذا الربط صيغة مُصَرّحٌ بها على نحو مباشر، لكن لسان الحال الجماهير والصيغ التعبوية السياسية التي تحركها، يتلمس فيها المرء بعدًا عقائديًا شبه واضح. والنتيجة كالتالي، وبدافع ردة الفعل بالطبع: سيعمد معارضو هذه التنظيمات إلى النظر إليها بوصفها خطوطًا عقائدية صرفة؛ وبالتالي بروز شرائح اجتماعية واسعة تندد بالخطاب الديني من حيث كونه خطابًا سياسيًا، ذلك أن الخطابات التجريدية والمحملة بحزمة مثالية عالية، والتي تحاول تبرير أفعالها السياسية، تصطدم بالوقائع، وهذه الأخيرة لا تفرق، بحسب التجارب المرّة، بين الدين كعامل روحي، وبين السياسة كحقل دنيوي صرف، نظرًا لما تراه من سلوكيات التنظيمات الإسلامية وأتباعها. والأمر ببساطة شديدة لأن التنظيمات الدينية لم تحسم أمرها بخصوص فصل الديني عن الدنيوي. بل لا زالت مصرّة، بشكل وبآخر، على دمجهما سويًا، ما يجعل الناس، هي الأخرى، لا تفرق بين الاثنين حينما تقيّم سلوك هذه التنظيمات.\nوالنتيحة: الدين والسياسة هوية واحدة. لماذا؟ لأن التنظيمات الدينية لم تحسم أمرها بعد حول الفصل المرتجى بين الديني والدنيوي. فلأجل هذا وغيره من الضروري أن يحتج المتدينون من أجل الحقوق، ويعتبروا الحدث الاحتجاجي ويدرجونه من ضمن الطقوس المقدسة، ويجددون عهد الولاء والرفض للذل والإهانة كما يجددونه في طقوسهم المليونية. وبالطبع إذا اختلطت عليهم الأولويات بين حب الإمام الحسين، على سبيل المثال، وحب الوطن، فليختاروا حب الحسين باعتباره رمزًا للإصلاح، وبهذا سوف لا يخسرون شيئًا وإنما يربحون أشياءً؛ قدسية حب الإمام الحسين وقدسية الحقوق وقدسية أن نكون بشرًا نصلح للعيش. بل ثمّة فائدة جليلة سيسديها أتباع التنظيمات الإسلامية للدين من خلال تخليصه من الفزاعات السياسية، وتقليل حِدّة النفور من الدين. لكن لا أظن أن هذه الملاحظات وغيرها تشكّل هاجسًا مقلقًا وأولوية قصوى للتنظيمات الإسلامية واتباعها.\nعلى اي حال، معظمنا يبحث عن النظام الأكثر مشروعية في إدارة عناصر السلطة. وبالتأكيد ستكون الدولة الدنيوية هي صمام الأمان لهذا الأمر، ذلك أنها تفصل الديني عن الدنيوي؛ سلطة زمنية بمعزل عن الدينية، سلطة الأرض وليس سلطة السماء. فنحن نعيش وسط دولة شبه مفكّكة تتصارع عليها سلطات متداخلة؛ فبينما تكون الدولة هي الإطار المهيمن على السلطة وهي الكيان الوحيد الذي له حق احتكار العنف، نجد العكس هو الصحيح. وكأنما قدر العراقي، وبالخصوص ما يتعلق بالتنظيمات الإسلامية، أن يبقى كارهًا لمفهوم الدولة. لذا، أن التفكير في بناء الدولة ومؤسساتها هو الهم الأقصى في العراق، وسيتزامن بالضرورة مفهوم العَلمانية مع ظهور الدولة؛ ذلك أن الهياكل القانونية والإدارية هي دنيوية بجوهرها، بل دنيوية من حيث القوّة والفعل، أي من حيث إمكانها الماهوي، ومن حيث نشوئها وظهورها الخارجي. الدولة من حيث كونها في الأذهان أو بادية في العيان ستكون آلياتها وأطارها دنيويَين صرف.\nلكن كل هذا وغيره لا يقنع الأتباع المتدينين! ذلك أن سؤال الدولة، فضلًا عن هويتها، مسكوت عنه في أدبيات التنظيمات الإسلامية وأتباعها، وهي تفضل البقاء على ما هو عليه مفضلةً إيّاه على هذا الصداع المزمن الذي يتعرّض له الإسلامي حين تتناهى إلى سمعه فكرة الدولة وهويتها وتثقيف أتباعه على هذه الفكرة، التي هي بالأساس لا تلغي إيمان المؤمن، إلا أنها قد تقضي على الولاءات الشخصية، وهذا ما لا تريده التتظيمات الإسلامية. فإذا عُرف السبب بطُل العجب.\nالعراقيون بين الجوهر والمظهر


حوافز دولية جديدة لإيران لوقف أنشطتها النووية\nمفاعل بوشهر النووي جنوب طهران (الفرنسية-أرشيف)\nاتفقت الدول الخمس دائمة العضوية في مجلس الأمن الدولي إضافة إلى ألمانيا على عرض حوافز جديدة على إيران لوقف أنشطتها النووية الحساسة، وفق ما أعلن وزير الخارجية البريطاني ديفد ميليباند في ختام اجتماع لوزراء خارجية الدول الست الكبرى في لندن الجمعة.\nولم يوضح الوزير البريطاني تفاصيل العرض الجديد الذي سيقدم للحكومة الإيرانية، مكتفيا بالإشارة إلى أنه صيغة "محدثة" للحوافز التي تم اقتراحها على إيران عام 2006 للتخلي عن برنامجها النووي.\nوناقش وزراء الدول الست (الولايات المتحدة وروسيا والصين وبريطانيا وفرنسا وألمانيا) الجهود لإقناع إيران بتعليق تخصيب اليورانيوم، وهي عملية تشكك واشنطن وبعض حلفائها في أن طهران تستغلها ستارا لتطوير قنابل ذرية.\nولكن إيران تنفي دائما تلك الاتهامات، وتؤكد أن برنامجها النووي مخصص للأغراض المدنية، ويهدف إلى توليد الطاقة الكهربائية.\nوكانت وزيرة الخارجية الأميركية استبقت اجتماع لندن بالتشكيك في جدوى "تحسين الحوافز" المعروضة على إيران لوقف أنشطتها النووية، ودعت إلى تشديد تنفيذ العقوبات التي قررتها الأمم المتحدة على طهران وتطبيقها تطبيقا كاملا.\nكما قالت إن الولايات المتحدة عازمة على عدم التزحزح عن تلك الحوافز.\nرايس استبقت اجتماع لندن بالتشكيك في جدوى تحسين الحوافز (الفرنسية-أرشيف)\nوقالت رايس للصحفيين لدى وصولها لندن للمشاركة في اجتماع الدول الست الكبرى بشأن البرنامج النووي الإيراني إن "الدبلوماسية لها أشكال كثيرة وليست دائما تقديم عرض محسن".\nووصفت العروض المقدمة لإيران بأنها "سخية للغاية", معتبرة أن المشكلة لا تكمن في تلك العروض ولكن في الإرادة الإيرانية, على حد قولها.\nورفضت طهران حتى الآن عرض حوافز قدمته الدول الست في يونيو/ حزيران 2006، كما رفضت ثلاثة قرارات لمجلس الأمن فرضت عليها عقوبات لعدم وقفها أنشطتها لتخصيب اليورانيوم وإعادة معالجته.\nوتشمل الحوافز التي عرضت على إيران إذا علقت تخصيب اليورانيوم ودخلت في مفاوضات مع الدول الكبرى تعاونا في المجال النووي المدني، ومزيدا من التجارة في الطائرات المدنية ومجالات الطاقة والتكنولوجيا المتقدمة والزراعة.


(بطانة مضخة الطين)إجمالي المنتجات ل 14 )\nمضخة كهربائية غاطسة Esph\nمضخة كهربائية غاطسة Esph المقدمة ESPB Packer عبارة عن جهاز تعبئة هيدروليكي ثنائي الاتجاه قابل للانزلاق وأداء عالي. تم تصميمه ليكون قصيرًا واقتصاديًا لنشر المضخات الغاطسة الكهربائية. آلة التعبئة مجهزة بشياق إنتاج تجويف كبير وجهاز غاطس كهربائي تقليدي. لا تحدث حركات نسبية بين الخيوط والمضخات الغاطسة الكهربائية أثناء...\nمضخة صناعية ضخ النفط كم سيراميك 1.مضخة الحفر الخزفية مناسبة لخزان النفط العميق والطبقة الصلبة والتربة الشديدة واستغلال النفط والغاز الطبيعي. 2.Oilfield Drilling Pump الحد الأدنى من عمر العمل هو 2000 ساعة ، يمكن أن تصل إلى 4000 ساعة بشكل طبيعي. 5-8 مرات أطول من البطانة ثنائية...\nكم لمضخات الطين مزورة مزايا 1. مناسبة لخزان النفط العميق ، والطبقة الصلبة والتربة الشديدة ، والنفط البحري واستغلال الغاز الطبيعي. 2. الحد الأدنى من العمل هو 2000 ساعة ، ويمكن أن تصل إلى 4000 ساعة بشكل طبيعي. 5-8 مرات أطول من البطانة ثنائية المعدن. 3. مقاومة التآكل ، مقاومة التآكل ، مقاومة الضغط العالي ، مقاومة درجة...


سرطان الدماغ وتشمل أورام المخ كل أنواع الأورام التي تظهر داخل القحف أو في قناة العمود الفقري المركزية. وهي تنجم عن انقسام غير طبيعي للخلايا ولا يمكن السيطرة عليه، غالبًا ما يكون ذلك في المخ نفسه، لكنه يحدث أيضاً في النسيج الليمفاوي، وفي الأوعية الدموية، وفي الأعصاب القحفية أو في أغلفة المخ (السحايا)، أوالجمجمة، أو الغدة النخامية، أو في الغدة الصنوبرية. داخل المخ نفسه، يمكن أن تكون الخلايا التي يحدث بها الانقسام عبارة عن خلايا عصبية[محل شك – ناقش] أو خلايا دبقية، والتي تشتمل على الخلايا النجمية والخلايا الدبقية قليلة التغصن وخلايا البطانة العصبية). كما يمكن أن تتسبب السرطانات الموجودة في الأعضاء الأخرى (الأورام الخبيثة) في انتشار أورام في المخ.\n•التهيج: تعب غير طبيعي، الشرود والهزات العصبية، وأيضا نوبات الصرع. قد لا تظهر أعراض لبعض أورام الدماغ الحميدة لعدة سنوات. اما البعض الآخر فقد يظهر أعراض غامضة ومتقطعة مثل الصداع والقيء والإرهاق و قد يخطأ في التشخيص بينه وبين اضطرابات الجهاز الهضمي. في هذه الحالات تحتاج الأعراض الثانوية إلى إعادة النظر فيها.\nمجلوبة من "https://ar.wikipedia.org/w/index.php?title=ورم_الدماغ&oldid=50933829"\nآخر تعديل بتاريخ 12 أكتوبر 2020، في 22:09\nآخر تعديل لهذه الصفحة كان يوم 12 أكتوبر 2020، الساعة 22:09.


في هذه الرياضة المرهقة عليك فقط أن تأكل.. - CNNArabic.com\nفي هذه الرياضة المرهقة عليك فقط أن تأكل..\nآخر تحديث الأحد, 24 يوليو/تموز 2016; 11:29 (GMT +0400).\nكرايزي ليغز كونتي، منافس في الأكل، المرتبة 20 في العالم\nليست مسابقات الأكل أمراً مسلياً، وإنما هي نشاط رياضي. إنها تشبه الركض في ماراتون، وسباق مئة ياردة في الوقت نفسه، بفارق أن قدميك تبقيان مكانهما، ولكن معدتك تتحرك بسرعة 100 ميل في الساعة.\nاسمي كرايزي ليغز كونتي، وأنا أشارك في مسابقات الطعام منذ 15 عاماً.\nلا أستطيع أن أذكر نوعاً واحداً من الطعام لم ينزل إلى معدتي ضمن المنافسات.\nبدون أي شك فإن منافسة الأكل هي رياضة حقيقية، إنها ذاكرة عضلية تملكها معدتك، ذهنك وجسدك إذا حضرت نفسك بالشكل الكافي.\nتابع بالفيديو: ما هي القوانين التي تمنعك أو تسمح لك بمقاضاة “بوكيمون غو” في حال الضرر؟\nما يمكن ألا يسير على ما يرام ليس الأصوات في معدتك، وإنما الأصوات في رأسك:\n"أنت تقارب على الامتلاء، ستستمر المسابقة إلى الأبد، متى سينتهي ذلك؟"\nتابع أيضا.. تعرّف إلى شخصيتك من خلال طريقتك في توضيب حقائب السفر\nيجب أن تكون استراتيجيتك دقيقة بما يختص بتقنياتك، ولكنك في الواقع لا تتذوق الطعام.\nفي الخامسة عشرة تقريباً، أبدأ أشعر بالانقباضات في جهازي. في منافسات الطعام نسميه الجدار، حيث يطلب منك جسمك أن تتوقف. تتعرق ، ينتفخ خداك وتشعر بالإرهاق، في آخر دقيقتين تتحول الأحلام إلى حقيقة أو تتحطم وهو الجزء الأصعب في أي مسابقة.\nشاهد أيضا.. هل ممارسة الرياضة في المدن الملوثة آمنة؟\nلا يوجد أي شيء سحري في ما يلي مسابقات الطعام، فنحن نهضم كل ما نأكله. أحتاج أن أشرب السوائل باستمرار لأشكل مكاناً قادراً على استيعاب الطعام في جهازي.\nالحد الأدني لأي مسابقة في الأكل هي 24 ساعة قبل أن أشعر أنني بشري، وأقصد ببشري تناول العشاء الطبيعي ثانية.\nللمزيد شاهد.. زجاجات كوكا كولا سرية للجنرالات الروس\nأجد أن نشاط الأكل التنافسي مرهق وصعب ويقتصر على أشخاص معينين، ولكنه مجز، فأنا سأستمر بالأكل طوال حياتي، وقد أقوم بذلك بشكل تنافسي.


طريقة عمل وصلة كهرباء Electrical Cable Extension - الكترونيات للجميع\nHome أساسيات Basics طريقة عمل وصلة كهرباء Electrical Cable Extension\nطريقة عمل وصلة كهرباء Electrical Cable Extension\nالعلم للجميع أكتوبر 26, 2019 ,أساسيات Basics\nشرح طريقة عمل وصلة كهربائية\nما هي الوصلة الكهربائية؟\nهي عبارة عن مجموعة من الأسلاك تكون على الأقل سلكين، لوصلهما مع الخط الحار (الفاز) والخط البارد (النيوترال أو المتعادل).\nتصنع الوصلة الكهربائية لنقل التيار الكهربائي من المكان الأصلي لمصدر الكهرباء إلى مكان آخر بعيد كما تماماً لتسهيل الوصول إلى ذلك المصدر كما في الشكل التالي:\nأنواع الوصلات الكهربائية\nهنالك عدة أنواع من الوصلات الكهربائية والتي تصنع بحسب الطلب والوظيفة التي ستقوم بها، ومن أهمها:\n1- وصلة كهربائية بخطين: ويطلق عليها أيضا الاسم وصلة كهربائية بسلكين، إذ أنها تشمل في تركيبها أو تصنع من سلكين نحاسيين. ولا تشمل تلك النوع من الوصلات الكهربائية على خط التأريض أو الإرث الكهربائي.\n2- وصلة كهربائية بثلاثة خطوط: ويطلق عليها أيضا الاسم وصلة كهربائية ذات الثلاث أسلاك. وما يميز مثل هذا النوع من الوصلات الكهربائية أنها تشمل على خط التأريض (التسريب الكهربائي)، لذلك تعد هذه الوصلة أكثر أماناً من الوصلة الكهربائية السابقة ذات الخطين.\n3- وصلة كهربائية بأربعة خطوط: يعد هذا النوع من الوصلات الأكثر ملائمة للتطبيقات التي لا تستهلك قدراً كبيرا من الطاقة الكهربائية. فهي بمثابة وصلتين كهربائيتين كل منها بخطين منفصلين جنباً إلى جنب. ولا يشمل على سلك التأريض الكهربائية كما في الشكل التالي:\n4- وصلة كهربائية بخمسة خطوط: هنالك نوعان من الوصلات الكهربائية التي تتكون وتتركب من خمسة أسلاك نحاسية بداخلها. الأولى؛ وهي عبارة عن وصلة كهربائية بأربعة خطوط، مضاف اليه خط التأريض أو الإرث الكهربائي.\nأما النوع الثاني من الوصلات الخماسية فتسمى بوصلة كهربائية ذات الثلاثة فاز، حيث أن كل سلك في هذا النوع من الوصلات الكهربائية له تسمية معينة. فالأسلاك الحارة الثلاث تسمى بـ L1 و L2 و L3 للون الأحمر، واللون الأصفر واللون الأزرق على التتالي. أما السلك ذا اللون الأسود فهو الخط المتعادل N. والسلك الأخير الذي يشمل على اللون الأخضر فهو سلك التسريب الكهربائي أو الإرث Earth.\nإن ما يميز الوصلة الكهربائية ذات الخمسة أسلاك هو الزيادة في نصف قطر الأسلاك النحاسية المكون منها عن الوصلات الأخرى؛ وذلك لأن هذا النوع من الوصلات في العادة يستخدم لنقل خطوط الطاقة الكهربائية العالية الجهد من مكان إلى آخر والتي تشمل عل سريان كميات كبيرة من التيار الكهربائي.\nطريقة صنع وصلة كهرباء\nلعمل وصلة كهربائية، يجب توفر المكونات التالية بحسب الجدول الذي في الأسفل:\nاسم المكون الكهربائي\nشكل المكون الكهربائي المطلوب\nفيش كهربائي ذكر\nفيش كهربائي أنثى\nسلك كهربائي بندل 3 خطوط مغلف بعازل إضافي خارجي\nخطوات عمل وصلة الكهرباء\n1- قم بتقشير طرفي أسلاك البندل من الجهتين وإزالة الطرف البلاستيكي العازل، لإظهار شعرات النحاس الموصلة كما في الشكل التالي:\n2- قم بفتح كل من الفيش الكهربائي الأنثى والذكر عن طريق إرخاء شد البراغي الموجودة عليها.\n3- بعد فتح ابريز الفيش الأنثى، قم بتوصيل السلك النحاسي الفاز أو الحار ذات اللون البني على الطرف اليسار الحار المكتوب عليه الحرف L باللغة الإنجليزية. ثم السلك النحاسي المتعادل ذات اللون الأزرق على الطرف اليمين المكتوب عليه الحرف N. وأخيرا الخط الأرضي الذي في الوسط، فيم توصيل السك الأصفر اليه.\n4- بعد فتح ابريز الفيش الذكر، قم بتوصيل السلك النحاسي على الطرف اليمين والمكتوب عليه الحرف L باللغة الإنجليزية. ثم السلك النحاسي النيوترال المتعادل ذات اللون الأزرق على الطرف اليسار والمكتوب عليه الحرف N. وأخيرا الخط الأرضي الذي في الوسط، فيم توصيل السك الأصفر اليه.\nتحذير هام بشأن الوصلات الكهربائية عند الصنع والتجربة\nيجب مراعاة توصيل الألوان عند عمل وصلة كهربائية، إذ أن التوصيل الخاطئ من شأنه أن يؤدي إلى تلف الأجهزة الكهربائية التي ستعمل على تلك الوصلة إضافة إلى الخطر المحدق التي تسببه الصدمة الكهربائية بفعل سوء التوصيل والتركيب الكهربائي لتلك الوصلة.\nأنواع الوصلات الكهربائية الدارجة في الأسواق بحسب نصف القطر\nهنالك نوعين دارجين في الأسواق من الوصلات ذات اللون الأبيض؛ الأولى تسمى بالوصلة ذات 1.5 مليميتر والثانية تسمى بوصلة 2.5 مليميتر. وطبعا، كلما زاد نصف قطر السلك النحاسي الكهربائي الموصل ازدادت قدرته على حمل تيار كهربائي أعلى.\nBy العلم للجميع at أكتوبر 26, 2019\nعالم الثقافة المعرفة 18 سبتمبر 2020 8:19 ص\nموضوع قيم ومهم ومفيد شكرا لك على هذه المعلومات وبارك الله فيك


الدولار ليس عملة لبنانية! – محمد قواص -سكاي نيوز – Beirut Observer\nالدولار ليس عملة لبنانية! – محمد قواص -سكاي نيوز\nليست صحيحة تلك السردية التي تتحدث عن أن الوضع في لبنان لن يتغير حتى لو سقطت حكومة حسان دياب وأتت حكومة دون حزب الله. وليس موضوعياً الزعم بأن شبكة الفساد في البلد فاعلة حتى دون حماية من الحزب وسلاحه. وليس بريئا وضع القوى السياسية في لبنان على قدم المساواة في الأداء والمسؤولية على نحو يراد منه، بسذاجة أو خبث، تبرئة إيران وحزبها من الانهيار الاقتصادي التاريخي غير المسبوق للبلد.\nلا تستقيم نظرية “كلن يعني كلن” كشرط لإجراء التغيير في لبنان. فالطبقة السياسية في البلد نتاج عملية سياسية تعبر عن مزاج اللبنانيين وتشبههم. وعليه فإن على اللبنانيين (بطوائفهم ومذاهبهم) أن يتغيروا لتأتي الطبقة السياسية التي تشبههم عاكسة لهذا التغيير.\nلا يمكن القبول برواية طهرانية لا ترى الحل إلا في عملية “تعقيم” تستأصل الورم من داخل هيكل الإدارة في لبنان. فإضافة إلى طوباوية الرواية في واقع الاقتصاد في العالم، فإنها تفترض من جهة أن الأمر قابل للحصول في ظل طبقة سياسية تحكمه، تنقلب على نفسها وعلى تقاليد الحكم والسياسة المعمول بها (سواء في التوزيع الطائفي لدستور الاستقلال أو في ذلك المعدل في الشكل والمتمسك في المضمون في دستور الطائف)، وتفترض من جهة أخرى أن عملية التعقيم تلك، وفق يوتوبيا حراك الشارع، هي الشرط الوحيد لإنقاذ لبنان وانتشاله من ورطته.\nوإذا ما صح ذلك في روايات الأدب الرومانسي أو في متون الأيديولوجيات الثورية القصوى (اليمينية واليسارية)، فإن ذلك لا يتسق مع علم الواقع وقواعد العمل السياسي في إدارة الممكن وإهمال المستحيل. وتشبه الحذاقة تلك (في استحالة سقوفها) ذلك الذي ما فتئ يردده حزب الله منذ سنوات من أنه مستعد للامتثال للدولة والتسليم بها في السياسة والدفاع حين يصل البلد إلى إنتاج “الدولة العادلة”. أما عدالة تلك الدولة فيحددها الحزب وفق معاييره لا وفق معايير الدنيا وواقعها الراهن.\nلم يكن لبنان مزدهراً في عقود الازدهار لأنه بلد طاهر في ممارسة سياسييه وفنون الإدارة. ولم يكن لبنان ليسجل معدلات نمو، لا سيما غداة الحرب الأهلية وظهور رفيق الحريري وحريريته السياسية، بسبب نقاوة أخلاقية في أداء هيكله الاقتصادي والمالي. فالبلد تجنب الكارثة التي يعيشها اليوم بسبب اعترافه البدائي بالعوامل التي تسمح بتدفق الموارد واتساقه مع قوانين المنطق في السياسة والعلاقات الدولية.\nيكتشف اللبنانيون فجأة أن العملة الصعبة التي تحدد مستوى اقتصادهم لها منابع خارجية ولا تنبت في المشاتل البيتية اللبنانية. يكتشف البعض منهم، لا سيما المبشرون بقهر “الامبريالية الأميركية” أن الدولار “الطاهر” الذي يستخدمونه من أجل ذلك ليس عملة “وطنية” لبنانية، وهو بالنهاية ملك خالص تديره وزارة الخزينة في الولايات المتحدة. يكتشفون أيضا أن مصادر دخل البلد في جلها مصدره خارجي، يتوفر إما من خلال السياحة والاستثمار وتحويلات المغتربين وإما من خلال المعونات المباشرة، وأن توقف التدفق الخارجي يقود حكما إلى هذا الاختناق الخطير. يكتشفون باندهاش أن للخارج حسابات ومصالح تحدد سيرورة التدفقات إلى الداخل ومصيرها.\nيصادر حزب الله بالسلاح والقوة قرار لبنان على النحو الذي يحوله مكاناً طارداً وليس جاذبا لاستثمارات اللبنانيين قبل الأجانب. يخطف الحزب البلد ويدرجه بنداً داخل أجندة الولي الفقيه في إيران، بما يجعله قاعدة معادية للبيئة العربية المالية التي لطالما ضخت في السابق وفورات مالية دون حساب ودون شروط ودون أجندات. وحين يعلن أمين عام الحزب من لبنان عن قرار تيار الممانعة في المنطقة لطرد النفوذ الأميركي من الشرق الأوسط، فإن في ذلك ما يتيح لواشنطن أن تقرر، ما لم تقرره حين كان الحزب يخطف رهائن أميركيين في بيروت، أن تؤمن بما يؤمن به حزب الله من أن لبنان بات حزب الله.\nلن يتغير مزاج هذا الخارج إذا ما سقطت حكومة حزب الله برئاسة دياب لتستبدل بحكومة جديدة لحزب الله برئاسة شخصية أخرى. لم يتغير حزب الله، لكن المشكلة أن العالم تغير، وتغير جدا، ولن يعيد الخارج ضخ الحياة في شرايين بلد يحتضر دون أن تقوده حكومة جرى بالفعل تعقيمها. تلك حقيقة لم تتغير، تعبر عنها باريس بعد واشنطن، ويعرفها سعد الحريري إلى درجة رفضه العودة لترؤس حكومة لا تستجيب لشروط هذا الخارج.\nوللخارج شروط بديهية، سواء في واشنطن أو لندن أو حتى بكين، ما زالت بداهتها لم تفهم في طهران ولدى حزبها في لبنان.\nمحمد قواص 2020-07-07\nPrevious: من أين يبدأ الحل في لبنان؟ – نديم قطيش – الشرق الأوسط\nNext: رشيد درباس: بهاء الحريري دخل في «الزواريب».. وفرنجية مرشح طبيعي للرئاسة


أدرج يـوم : الثلاثاء, 10 تشرين1/أكتوير 2017 09:29 الفئـة : اقتصــاد قراءة : 21 مرات\nصورة و أج- أرشيف\nعين الدفلى - أكد وزير السكن و العمران و المدينة، عبد الوحيد تمار، يوم الاثنين بعين الدفلى على ضرورة تبني رؤية استشرافية حول العمران مع إبراز الأهمية التي يكتسيها هذا الجانب في تصميم المدن المستقبلية.\nوأوضح السيد تمار على اثر التقرير الذي قدم له حول قطاعه في اطار زيارة لعمل التي قادته الى هذه الولاية انه "من الضروري تبني رؤية استشرافية حول العمران حتى يكون البناء المستقبلي لمدننا مطابقا للمقاييس الدولية المعمول بها".\nكما أشار في هذا السياق الى ان انجاز المدن ينبغي ان يستجيب للمعايير العصرية المحددة بدقة، مؤكدا على أهمية التنسيق بين المهندسين و المهندسين المعماريين و مهندسي التخطيط.\nوتابع قوله الوزير ان ازمة السكن لا يجب بأي حال من الأحوال ان تضع المدينة في المرتبة الثانية ككياني مضيفا ان المنشات على غرار المدرسة او الهياكل الصحية يجب أن تحافظ على أهميتها الخاصة.\nوفي معرض تطرقه لمختلف صيغ السكن بالولاية اعطى الوزير تعليمات للمسؤولين المحليين من اجل تحديد الأسباب التي تقف وراء البرامج التي لم يتم إطلاقها، مشيرا إلى أهمية معالجة المشاكل في وقتها من اجل اقتصاد المال و الطاقة.\nأما بخصوص ديون مؤسسات انجاز المشاريع التابعة لديوان الترقية و التسيير العقاري فقد أكد الوزير على أهمية تطهير هذا الجانب مشيرا إلى أن هذا المسعى سيعزز المؤسسات في هذا المجال كما يسمح لهيات الدولة بربح المصداقية.\nو فيما يتعلق بالسكن الريفي فقد أوضح السيد تمار ان تشجيع هذا النوع من السكن سيدفع السكان إلى البقاء في أراض أجدادهم مؤكدا على ضرورة ان يتم انجاز هذا النوع من السكن حسب المعايير السارية في تلك المناطق.\nوكمثال على الجهود التي يبدلها القطاع على المستوى المحلي، أوضحت مديرة السكن بالولاية فتيحة عرقاب، أن حظيرة السكن المحلية التي تفوق بقليل 107000 وحدة سكنية قد انتقلت إلى أكثر من 195000 وحدة في نهاية 2016 مشيرة الى نسبة شغل السكن تقدر على التوالي ب7.73 % و 4.92 % بالنسبة للفترات المعنية.\nكما أشارت الى ان استكمال مختلف الصيغ الجارية سيسمح لهذه النسبة ببلوغ 4.03 % تقريبا.\nولدى تفقده لمشروع انجاز 500 سكن بصيغة البيع بالايجار بجندل اوضح الوزير ان البرنامج الخاص بانجاز هذا النوع من السكن يسجل تأخرا كبيرا على مستوى الولاية مضيفا أن هذا التأخير غير مقبول بما ان هذا البرنامج قد سجل في سنة 2013.\nوتابع يقول السيد تمار انه في الوقت الذي تسجل فيه عديد الولايات تقدما معتبرا في هذا المجال لازالت عين الدفلى تعاني من صعوبات تعيق اي تقدم لهذا المشروع.\nوأضاف الوزير ان الهدف الرئيسي من زيارتي الى عين الدفلى يتعلق ببرنامج عدل الذي يجب النهوض به على مستوى الولاية. معربا عن التزامه بمتابعة شخصية لتطور الأمور على ارض الميدان من خلال تقارير دورية يقدمها له معاونوه.\nأما بخميس مليانة فقد قام السيد تمار بزيارة مشروع انجاز 1250 مسكن بذات الصيغة حيث أبدى استياءه من اختيار الارضية متأسفا لعدم الاخذ في الحسبان العناصر الأساسية في مجال الهندسة المعمارية.\nوبسيدي لخضر اطلع الوزير على نسبة تقدم مشروع انجاز 300 مسكن الواقعة بالمخرج الغربي للمدينة مبرزا الجانب الجمالي لا سيما استحداث المساحات الخضراء.\nواستطرد قائلا " أتمنى في يوم تدشين المشروع أن يعكس واقع الميدان هذا التصميم الجميل" يداعيا مؤسسة الانجاز الى احترام معايير الجودة و آجال التسليم.\nأما بالعطاف فقد تفقد الوزير مشروع انجاز 2000 وحدة سكنية بصيغة عدلي داعيا المسؤولين المكلفين بانجاز هذا المشروع على تقليص أجال التسليم الى أقصى حد لكن دون أن ينعكس ذلك سلبا على جودة الأشغال.\nوفي عاصمة الولاية تفقد الوزير مشروع 200 وحدة سكنية بصيغة عدل للقطب الحضري الجديد الواقع بالمخرج الشرقي للمدينة مشيرا الى أن الغياب المشاكل الموضوعية من شأنه تشجيع المرقي العقاري على الإسراع في وتيرة الانجاز.\nآخر تعديل على الثلاثاء, 10 تشرين1/أكتوير 2017 10:15\nأدرج يـوم : الثلاثاء, 10 تشرين1/أكتوير 2017 09:29 الفئـة : اقتصــاد قراءة : 21 مرة شارك


أهم أسرار وأخبار شيخ السياسيين بسينا | المحايد الإخباري\nالرئيسية/آراء ومقالات/أهم أسرار وأخبار شيخ السياسيين بسينا\nأهم أسرار وأخبار شيخ السياسيين بسينا\nإنه الدكتور منير الشوربجي صديق الجميع وأخ للكل ومستشار السياسه والعمل العام والصيدله في شمال سيناء .\nالدكتور منير الشوربجي سياسي من نوع خاص فهو عالم بالقانون وفقيه في الدستور وعالي الثقافه وكريم جدا في تعليم الآخرين فهو لابخل علي أحد بمعلومه ولايرد أحد عن إستشاره .\nالدكتور منير الشوربجي رجل إجتماعي جدا فعندما تتوجه إلي منزله فسوف يقابلك بابتسامه كبيره وأدب جم وكرم لامحدود .\nتولي الدكتور منير الشوربجي الكثير من المناصب العامه ولكنه أذهل الجميع بتواضعه الجم وحسن التعامل مع الجميع وهو داعم للدوله محب لقياداتها عاشق لتراب الوطن .\nالدكتور منير الشوربجي من أرقي عائلات العريش ومن أشهر حكمائها وهو بحق وطني من طراز فريد فلم يترك العريش أثناء الحرب علي الإرهاب وظل مرابطا بها وهو دائما يثق في قدرات الجيش والشرطه المصريه علي دحر أي عدوان مهما كانت قوته فهو الداعم القوي لمؤسسات الدوله تحت أي ظروف .\nالدكتور منير الشوربجي صاحب آراء وطنيه وحس سياسي مرهف وهو ضد مايسمي بصفقه القرن لأنه مع وحده الوطن أرضا وشعبا ومؤسسات .\nالدكتور منير الشوربجي عرض عليه الكثير من المواقع القياديه في عدد من الأحزاب ومنظمات المجتمع المدني ولكنه رفض وقال رأيه بكل صراحه أنا مستشار للجميع ولدي القدره علي العطاء بعيدا عن أي مناصب وسأترك الفرصه للشباب لكي يستكملوا المسيره ويتحملون المسئوليه .\nالدكتور منير الشوربجي لم يتورط في فساد أبدا ولايقول إلا كلمه الحق وعندما تقابله فتأكد إنه سوف يلبي مطلبك طالما كان قادرا علي ذلك وعندما يتدخل لحل مشكله فتأكد إنها سوف تحل وعندما يكون حكما لحل نزاع فتأكد من قدرته علي الحل لأن الكل يحبوبه وكذلك يحترمونه .\nأطلق عليه الكثيرون من أبناء سيناء لقب شيخ السياسيين لانه يتمتع بالدبلوماسيه وحسن التعامل مع المواقف وله خبره طويله في مجال السياسه والعمل العام الخدمي التطوعي .\nالدكتور منير الشوربجي رجل معطاء يتمتع بكل صفات الشخصيه العامه التي تتميز بالكاريزما والأدب والأخلاق العاليه لانه من عائله مصريه أصيله لها وضعها ومكانتها بين عائلات سيناء بل وعائلات مصر كلها .\nالدكتور منير الشوربجي دائما لديه جديد فهو قاريئ جيد للأحداث له القدره علي الإستنتاج والتحليل والوصول إلي النتائج حتي قبل حدوثها . الدكتور منير الشوربجي من خير ماأنجبت سيناء ومصر كلها علما وأخلاقا وهو الخبير والخلوق والمحب للجميع ولايتورع عن قول الحق لأنه لايخشي إلا الله .\nرغم مشواره الوطني الطويل وخدماته المتواصله للمواطنين إلا إنه لم يطلب يوما أي مقابل كما لم يكرمه أحد ولم يعترف بفضله إلا من يعرفه جيدا ولكنه حاز علي مالم يستطيع الكثيرون علي الفوز به وهو شعبيه وحب جارف من الجميع وهذا يكفيه علي حد قوله .\nقام بتصعيد الكثيرين إلي المناصب القياديه في شتي المجالات السياسيه والحزبيه والحكوميه ويحب الخير للجميع لذلك فقد فاز بحق بلقب شيخ مشايخ السياسيين بسيناء الذي يحبه ويعشقه الجميع .\nحكاية الدكتورة مايا صبحي مع أخطر تنظيم دولي وأين اختفت ؟!\nآية محمود تكتب “الزواج والكورونا”\nسيناء بين التحرير ، التعمير .. ودعوات الإنفصال بإسم التنمية والإستثمار


ارتفاع مبيعات السيارات في المملكة المتحدة لأول مرة في عام 2020\nارتفعت تسجيلات مبيعات السيارات الجديدة البريطانية بنسبة 11 في المائة في يوليو - أول زيادة شهرية في السوق حتى الآن هذا العام - حيث افتتحت صالات العرض في جميع أنحاء المملكة المتحدة لأول شهر كامل لها منذ تخفيف إجراءات الإغلاق.\nوجاء هذا الارتفاع في أعقاب علامات أخرى على الانتعاش التدريجي للاقتصاد البريطاني بعد الانكماش التاريخي بنسبة 25 في المائة في مارس وأبريل.\nويأتي ذلك وسط ارتفاع أسعار سلاسل الإمداد والتصنيع، على الرغم من تصاعد تخفيضات الوظائف في قطاع التجزئة.\nوأعاد الوكلاء فتح أبوابهم للعملاء في 1 يونيو في إنجلترا، و 8 يونيو في أيرلندا الشمالية، و 22 يونيو في ويلز، و 29 يونيو في اسكتلندا بعد إغلاقه منذ منتصف مارس.\nكما حذرت جمعية صناع السيارات ومجموعة التجار من أن الطلب المكبوت قد عزز مبيعات 174887 المسجلة في يوليو.\nوقال مايك هاوز الرئيس التنفيذي لجمعية صناع السيارات في بيان:\nبحلول نهاية سبتمبر، يجب أن تكون لدينا صورة أوضح عما إذا كان هذا اتجاهًا طويل الأجل\nوكان فريق الإدارة العليا للطب الرياضي يضغط من أجل الحصول على دعم إضافي للقطاع، بما في ذلك مخطط إلغاء محتمل.\nكانت الزيادة في المبيعات في يوليو هي الأولى منذ ديسمبر 2019، لكن الطلب حتى تاريخه انخفض بأكثر من 42 في المائة وتتوقع أحدث توقعات جمعية صناع السيارات انخفاضًا في العام بأكمله بنسبة 30 في المائة.\nوارتفعت مبيعات شركة فورد الرائدة في السوق في المملكة المتحدة بنسبة 10 في المائة الشهر الماضي، وزادت مبيعات فولكس فاجن، التي احتلت المرتبة الثانية، بنسبة 2.9 في المائة. وارتفع للمركز الثالث أودي بنسبة 16 بالمئة، وبي أم دبليو، في المرتبة الرابعة، بنسبة 24 في المئة. واختتمت شركة مرسيدس-بنز المراكز الخمسة الأولى، التي سجلت انخفاضًا بنسبة 15 بالمائة في يوليو.\nومن بين العلامات التجارية الأخرى، انخفضت مبيعات فوكسهول بنسبة 6 في المائة؛ وانخفضت تسجيلات هيونداي بنسبة 4 بالمائة، بينما زادت مبيعات العلامة التجارية الشقيقة كيا بنسبة 28 بالمائة. وحققت جاكوار مكاسب بنسبة 9.2 في المائة، وزادت لاند روفر حجمها بنسبة 38 في المائة وزادت مبيعات ميني بنسبة 49 في المائة.