Glykoproteiner på overfladen af celler spiller en kritisk rolle i cellefunktion, herunder signalering, vedhæftning og transport. På leukocytter, flere af disse glykoproteiner besidder immunglobulin (Ig) folder og er centrale for immun anerkendelse og regulering. Vi præsenterer her, en platform for design, udtryk og Biofysisk karakterisering af den ekstracellulære domæne af humane B-celle receptoren CD22. Vi foreslår, at disse metoder er stort set gælder for karakterisering af pattedyr glycoprotein ectodomains indeholdende Ig domæner. To suspension menneskelige embryonale nyre (HEK) cellelinjer, HEK293F og HEK293S, der bruges til at udtrykke glykoproteiner huser komplekse og high-mannose glycans, henholdsvis. Disse rekombinante glykoproteiner med forskellige glycoforms giver mulighed for at undersøge effekten af glycan størrelse og sammensætning på ligand bindende. Vi diskutere protokoller for at studere kinetik og termodynamik af glycoprotein binding til biologisk relevante ligander og terapeutiske antistof kandidater. Rekombinant glykoproteiner produceret i HEK293S celler er indstillet til at krystallisering glycan homogenitet, nedsat fleksibilitet og modtagelighed for endoglycosidase H behandling. Vi præsentere metoder til iblødsætning glycoprotein krystaller med tunge atomer og små molekyler til fase bestemmelse og analyse af ligand bindende, henholdsvis. De eksperimentelle protokoller diskuteret hold her løfte til karakterisering af pattedyr glykoproteiner at give indsigt i deres funktion og undersøge om therapeutics virkningsmekanisme.\nOverflade proteiner spiller en kritisk rolle i cellulære funktion. Gennem deres ekstracellulære domæner, kan disse Membranproteiner modulere celle-celle interaktioner, vedhæftning, transport og signalering1,2. Den ekstracellulære lokalisering af disse proteiner gør dem attraktive mål for udvikling af lægemidler til behandling af en lang række sygdomme, herunder kræft og autoimmune sygdomme3,4,5 , 6 , 7. en af de mest almindelige folder af menneskelige membran protein ectodomains er immunglobulin-lignende (Ig) fold, som er dannet ved syv eller flere β-tråde arrangeret i to β-sheets8,9. Ig-holdige glykoproteiner er typisk multi-domæne strukturer med Ig domæner sekventielt arrangeret på den ekstracellulære del af membran protein10. Posttranslationelle modifikationer af disse celle-overflade proteiner, især N - og O-linked glykosylering, har vist sig at spille vigtige roller i deres forordning, foldning, sekretion og funktion11. For at forbedre vores forståelse af deres funktion og bedre design therapeutics, der kan målrette dem, teknikker er påkrævet at gøre det muligt for deres detaljerede Molekylær karakterisering. Vi præsenterer her, en kombination af teknikker, der giver mulighed for den biofysiske (biolayer interferometri (BLI) og isotermisk titrering kalorimetri (ITC)) og strukturfondene (røntgenkrystallografi) karakterisering af ekstracellulære domæne Ig-holdige membran glykoproteiner, alene og i kompleks med deres biologisk relevante ligander og terapeutiske molekyler (figur 1).\nN-linked glykosylering er en af de mest almindelige post oversættelse ændringer på pattedyr proteiner, og der opstår under protein modning i det endoplasmatiske reticulum og Golgi12,13. Cellelinjer, såsom menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler, er blevet udviklet for rekombinante udtryk for store mængder af glykosyleret pattedyr proteiner14,15. Denne cellelinje er blevet udviklet i en suspension format, som giver mulighed for at lette optrapning protein produktion til større mængder i forhold til vedhængende cellelinjer. Her, vi udnytte to HEK293 cellelinjer: HEK293F og HEK293 Gnt jeg- / - (HEK293S), som adskiller sig ved fravær af N-acetylglucosaminyl-transferase (Gnt jeg) i sidstnævnte. Til gengæld produktion af komplekse glycans (som ses i HEK293F) er ikke mulig og i stedet høj mannose-type glycans (overvejende mand5GlcNAc2) bor på N-linked glycan websteder18,19,20 . Ved hjælp af disse to cellelinjer parallelt giver mulighed for at studere effekten af glycan størrelse og kompleksitet på biologiske funktion og terapeutiske målretning. Faktisk vil glykoproteiner produceret i HEK293F celler have større, mere komplekse glycans i forhold til den samme glycoprotein produceret i HEK293S celler. Glycoproteiner produceret i HEK293S celler er mere åbne over for krystallisering, på grund af den reducerede kemiske og konformationelle heterogenitet af deres N-knyttet glycans. Yderligere at forbedre crystallizability, glykoproteiner produceret i HEK293S (men ikke HEK293F) celler kan blive behandlet med enzym endoglycosidase Hansen (Endo Hansen), hvilket resulterer i kløvningen af høj mannose glycans sådan at kun en enkelt N-acetylglukosamin (GlcNAc) gruppe forbliver på hvert N-linked glykosylering site21,22. Andre metoder kan også bruges til at begrænse N-glycan behandling inden for cellerne, såsom tilføjelsen af glycosyltransferase hæmmere under glycoprotein udtryk, herunder kifunensine23. Alternative tilgange involverer udtryk for indfødte glycoproteiner (i HEK293F celler) efterfulgt af enzymatisk deglycosylation ved hjælp af peptid N-glycosidase F (PNGaseF). Dog har deglycosylation med PNGaseF vist sig at være mindre effektiv under indfødte betingelser og øger sammenlægning i nogle proteiner; i tilfælde når proteinet forbliver vandopløseligt efter behandling, får det negative afgifter på dens overflade på grund af Deamidering af asparagin rest til aspartinsyre24, som kan være skadelige for dets krystallisation. Forudsagte N-glykosylering websteder kan også være muteret, oftest for alanin eller glutamin rester, at forhindre N-linked glykosylering på disse websteder og generere glycoprotein prøver af høj ensartethed. Alternativt, glykoproteiner kan fremstilles i andre eukaryote cellekulturer, herunder gær, insekt, og plante systemer eller andre pattedyr cellelinjer som kinesisk hamster ovarie (CHO) celler16,17.\nMange pattedyr udtryk vektorer, herunder pHLsec, tillader sekretion af rekombinant glycoprotein ectodomains i celle medium25. Sekretion af glykoproteiner fra HEK293 celler giver mulighed for hurtig og nem rensning uden behov for celle lysering. Tilsætning af rensning tags (f.eks. hans-tag, Strep-tag, Flag-tag, Myc-tag, HA-tag) til målet N eller C endestation glycoprotein tillader rensning af en trinvis affinitet kromatografi. Efterfølgende kan størrelse udstødelse kromatografi bruges til at give en monodisperse prøve for biofysiske og strukturel karakterisering.\nEn meget ren og homogen glycoprotein prøve under passende betingelser kan resultere i godt diffracting krystaller. Når en fuld røntgen diffraktion datasæt er opnået fra sådanne krystaller, skal indledende faser være fast besluttet på at beregne elektron tætheden af glycoprotein. Takket være et stadigt stigende antal strukturer i Protein Data Bank (FBF) blevet den mest anvendte metode til gradvis langt molekylære udskiftning (MR), som bruger en relaterede protein struktur til at opnå indledende faser26. Men når hr. ikke løse fase, som det undertiden har været tilfældet for multi-Ig-domæne glykoproteiner27,28,29, alternative metoder er nødvendige. I denne artikel detalje vi en metode til at suge krystaller med tunge atomer (HA) for udfasning, der var nødvendige for at løse strukturen af CD22 ectodomain28. At identificere ret HA for udfasning er en iterativ proces, der afhænger af HA reaktivitet, tilgængelige atomer i glycoprotein i en given krystalgitter og krystallisering løsning30,31. Alternativt, naturlig svovl atomer i cystein og methionin rester kan bruges til udfasning hvis stede ved en høj nok forholdet til andre atomer i glykoprotein, og røntgen diffraktion data kan indsamles med høj nok redundans32, 33.\nDen biologiske funktion af membran glykoproteiner er ofte medieret af protein-protein interaktioner eller protein-ligand interaktioner, såsom med kulhydrater. Når liganden er lille nok til at diffuse fra løsningen til glycoprotein bindingssted i krystalgitter, kan iblødsætning forsøg lykkes at få et glykoprotein-ligand Co krystalstruktur for bedre at forstå ligand anerkendelse.\nDe protokoller, der præsenteres her, er også relevant for at forstå samspillet mellem overflade glykoproteiner med syntetisk terapeutiske ligander34,35 og antistof therapeutics36,37. Når det kombineres med strukturelle oplysninger, kan bindende kinetik og termodynamik være stærk til at forstå og forbedre deres virkningsmekanismer. En teknik, der giver mulighed for kinetic analyse af terapeutiske antistoffer binder til et glykoprotein er BLI38,39. BLI bruger biosensorer med et immobiliseret ligand til at måle association og dissociation kinetik med en bindende partner, i sidste ende bestemme en ligevægt dissociationskonstant (KD). BLI er en attraktiv tilgang, fordi små mængder af glykoproteiner er påkrævet (< 100 µg), eksperiment tiden er hurtigt (~ 10-15 min. pr. run), og det kan automatiseres. ITC er også nyttigt for at studere tilhørsforhold mellem glykoproteiner og bindende partnere40,41,42,43. Mens ITC er mere tid og reagens intensiv, kan værdifulde oplysninger indhentes vedrørende termodynamik i interaktionen (ΔG, ΔH, ΔS og støkiometrisk). ITC er også meget nyttigt for at studere svage interaktioner, der er ofte forbundet med forbigående bindingen af overflade glykoproteiner til ligander. Desuden, disse teknikker kan bruges sammen til at evaluere bindingen af forskellige konstruktioner og vurdere effekten af forskellige N-knyttet glycoforms fremstillet af udtrykker glycoprotein i forskellige cellelinier. Udfører BLI og ITC med glycoproteiner produceret i HEK293F, HEK293S og behandlet med Endo H kan give en grundig opfattelse af glycans rolle i biologiske aktivitet og terapeutiske engagement.\nVi anvendt med succes disse protokoller for at karakterisere den ekstracellulære domæne (ECD) af menneskelige CD2228, et glykoprotein medlem af familien sialic syre-bindende Ig-lignende lektiner (Siglecs) der er afgørende for at opretholde B-celle homøostase44 . Vi udført dybtgående konstruktion design at lette krystallisering og gradvis X-ray datasæt af HA iblødsætning med Hg. Vi også gennemblødt CD22 krystaller med dets ligand sialic syre (en2-6 sialyllactose) at opnå en struktur af immun receptor-ligand kompleks og således fastsatte struktur-styrede udformningen af glycan mimetics45,46blueprints. Derudover vi genereret fragment antigen bindende (Fab) af anti-CD22 terapeutiske antistof epratuzumab - en terapeutisk kandidat i øjeblikket i fase III kliniske forsøg for non-Hodgkins lymfom47- for at bestemme dets bindende affinitet af BLI og ITC til varierende glykosyleret CD22 ECD konstruktioner. Disse undersøgelser afslørede en afgørende rolle for N-linked glykosylering i epratuzumab engagement, med potentielle konsekvenser for CD22 anerkendelse på dysfunktionelle B-celler.\n1. konstruktion Design for Glycoprotein ECD\nEvaluere aminosyresekvens af menneskelige CD22 (Uniprot) ved hjælp af InterPro og Phyre2-servere til at identificere forudsagte domæne elementer og grænser ligger inden for protein48,49.\nKlone sekvensen af menneskelige CD22, mangler signal peptid, transmembrane og cytosole domæner (rester 20-687, herefter CD22 ekstracellulære domæne, CD22 ECD) i pHLsec pattedyr udtryk vektor25 ved hjælp af restriktionsenzymer AgeI og KpnI ( Figur 2 A) 50.\nBemærk: PHLsec vektor er optimeret til overekspression af opløselige, udskilles proteiner i pattedyrceller25. Denne vektor indeholder en sekretion signal at give mulighed for den ekstracellulære sekretion af opløselige glykoproteiner. pHLsec indeholder et C-terminal (hans)6 x tag for at lette affinitet rensning fra celle analysere immobiliseret metal affinitet kromatografi metoder.\nKlon afkortet konstruktioner af CD22 ECD med sekventiel sletninger af C-terminale Ig domæner: domæner 1-6 (rester 20-687), domæner 1-5 (rester 20-592), 1-4 (restprodukter fra 20-504) domæner og domæner 1-3 (restprodukter fra 20-330) (tal 2B og 2 C)50 .\nEvaluere den primære sekvens af CD22 ECD ved hjælp af NetNGlyc serveren til at identificere forudsagte N-linked glykosylering websteder i konstruere51.\nBruger site-directed mutagenese, standardprotokoller52 eller overlappende PCR53, mutere hvert forudsagte N-linked glykosylering websted (Asn til Localisation og/eller Asn til Ala) for at oprette konstruktioner af CD22 ECD, der indeholder enten en enkelt eller flere N-linked glykosylering mutationer.\nEfter sekvens kontrol af klonede konstruktioner, omdanne kompetente E. coli DH5α celler54 og maxi-prep DNA (ifølge fabrikantens anvisninger) for at forberede Transfektion.\n2. HEK293F og HEK293S cellecenter\nBemærk: Alle manipulation af HEK293F eller HEK293S celler med nødvendige reagenser og udstyr skal udføres i en biosikkerhed niveau 2 facilitet i en egnet biosikkerhed kabinet. Den ydre overflade af alle elementer skal være steriliseret med 70% ethanol opløsning eller tilsvarende reagens.\nFå HEK293F og HEK293S suspension celler (Se Tabel af materialer) og opbevares ved-80 ° C indtil klar til brug.\nVarm media (Se Tabel af materialer) i 1 time i et 37 ° C vandbad. Overføre 24 mL varmede medier til en 125 mL forbløffet celle kultur kolbe med en ventileret cap.\nFå 1 mL celle alikvot fra-80 ° C og overførsel til is.\nInkuber celler i et 37 ° C vandbad til ca. 1 min., for at delvist tø cellerne. Overføres 1 mL af celler fra hætteglasset til 125 mL forbløffet celle kultur kolbe indeholdende medierne.\nLuk celle kultur kolbe med ventileret hætte og sted kolbe i en shaker sat til 37 ° C, 130 rpm, 70% fugtighed og 8% CO2.\n3. HEK293 Celle vedligeholdelse\nBemærk: Celle tæthed og levedygtighed af celler skal være tjekket ca 24 timer efter optøning. Dette trin sikrer, at celler er at inddrive efter podning; indledende levedygtighed skal være > 80%.\nForsigtigt fjerne 10 µL af celler fra 125 mL kolbe indeholdende frisk suspension celler og overføre det til en sterile 1,5 mL microtube. Kolben lukkes og returnere det til rugemaskine.\nAfpipetteres 10 µL af Trypan blå løsning i 1,5 mL microtube som indeholder cellerne, blandes grundigt og overføre 10 µL til kammer af diasset optælling.\nSætte det tælle dias i en automatisk celle counter og få værdier for celle tæthed (i enheder af celler mL-1) og cellernes levedygtighed (i procent).\nBeregne omfanget af celler, der skal podes en frisk 200 mL kultur på en endelige tæthed af ~0.8 x 106 celler mL-1 ved hjælp af følgende ligninger:\nBemærk: Det kan tage ~ 5 d at opnå en passende celle tæthed til podning til en 200 mL kultur.\nNår cellen tæthed er tilstrækkelig til podning af en 200 mL kultur, warm-up medier for 1 h i et 37 ° C vand bad og overføre den varmede medier til biosikkerhed kabinet.\nDen krævede mængde af medier (som beregnet i ligning 2) bruger en serologisk pipette, omhyggeligt overføres til en 500 mL forbløffet celle kultur målekolbe med en ventileret cap.\nVed hjælp af en serologisk pipette, overføres den krævede mængde af suspension celler (beregnet i ligning 1) til 500 mL forbløffet celle kultur målekolbe indeholdende medierne.\nCap de nye 200 mL vedligeholdelse stock og returnere det til rugemaskine. Vokse celler til en massefylde på ca 3 x 106 celler mL-1. Passage celler med en tæthed på 0,8 x 106 celler mL-1 hver 2-3 d til at opretholde en stabil kultur af celler (som beskrevet i afsnit 3.4-3.7). Tillad ikke cellerne til at overskride en tæthed af ~ 4 x 106 celler mL-1.\n4. Transfektion af HEK293 celler for Glycoprotein udtryk\nBeregne omfanget af celler og media, der kræves til en 200 mL kultur for Transfektion på 0,8 x 106 celler mL-1 (ved hjælp af ligninger 1 og 2 fra afsnit 3.4).\nBemærk: Antallet af 200 mL transfections, der kan udføres afhænger celle tætheden af vedligeholdelse lager.\nOverføre den krævede volumen af medier og celler for Transfektion ind i en ny 500 mL celle kultur kolben med en ventileret cap og returnere celle stock til rugemaskine.\nInkuber celler til 1 time før Transfektion tillade celler til at akklimatisere følgende opdeling.\nOverføre 50 µg af DNA i en steril 50 mL konisk slange og fortynd med 5 mL af medier. Vakuum filtrere den fortyndede DNA ved hjælp af et 0,22 µm filtreringssystem til et andet sterile rør.\nBlandingen fortyndes, filtreret DNA i forholdet 1:1 masse: volumen med Transfektion reagens. Forsigtigt swirl DNA: Transfektion reagens løsning for at blandes og inkuberes løsning ved stuetemperatur i 10 min.\nTilføje DNA: Transfektion reagens løsning direkte til cellerne. Inkubér transfekteret celler ved 37 ° C, 130 rpm, 70% fugtighed og 8% CO2 i en shaker til 5-7 d.\n5. optimering af celle Transfektion betingelser\nBemærk: For at optimere celle Transfektion betingelser for maksimal glycoprotein udbytte, transfect celler på en række indledende celle tætheder og vurdere protein afkast over tid (fig. 3A). Transfect celler som beskrevet i afsnit 4, ved første celle tætheder spænder fra 0,5 x 106 2 x 106 celler mL-1 55. Retssag transfections kan skaleres til 25 mL samlede volumen (i 125 mL forbløffet celle kultur kolbe) med 6 µg DNA til at spare plads og reagenser. Mængden af DNA kan også være optimeret55.\nHver dag efter Transfektion (dage 1-7), overføre en 500 µL alikvot fra cellekultur i sterile 1,5 mL microtube (i biosikkerhed kabinet).\nSpin aliquoted celler på 12.000 x g i 5 min i en microcentrifuge umiddelbart efter opsamlingen. Overføre supernatanten til en ny 1,5 mL microtube og opbevares ved 4 ° C, indtil alle prøver er opnået.\nKvantificere udskilles glycoprotein af densitometri\nNår alle prøver er opnået, alikvot 20 µL af hver prøve ind i en ny 1,5 mL microtube og bland med 6 µL af ikke-reducerende 4 x Laemmli prøvebuffer.\nKog prøver for 5 min. ved 95 ° C i en thermo-blok. Spin prøver for 1 min på 12.000 x g i en microcentrifuge.\nIndlæse 20 µL af hver prøve pr. brønd i en 10-well 4-15% gradient SDS-PAGE gel. Omfatte én vognbane for protein størrelse markører. Kør gelen på 250 V i 20 min. i en buffer, glycin-Tris-SDS.\nEfter køre afslutningen, overføre gel til Coomassie pletten (Se Tabel af materialer) i 20 min. de plette gel i ddH2O i 20 min. billede gel.\nUdføre densitometri med ImageJ, efter standardprotokoller57,58.\nKompilere og afbilde data med 'dage efter Transfektion' på x-aksen og densitometri værdier på y-aksen (fig. 3A).\nBemærk: Alternativt hvis protein udtryk er utilstrækkelig til visualisering af SDS-PAGE, teknikker såsom Western blotting kan være brugt56.\nKvantificere udskilles glycoprotein af BLI\nBrug af Ni-NTA biosensorer, kvantificere mængden af udskilles glycoprotein ved hjælp af BLI59.\nKompilere og afbilde data med 'dage efter Transfektion' på x-aksen og "protein koncentrationen (µg/mL)' på y-aksen (fig. 3A).\n6. rensning af vandopløseligt Glycoprotein fra HEK293 supernatanten\nHøste celler ved centrifugering ved 6,371 x g i 20 min. ved 4 ° C. Bevare supernatanten indeholdende udskilles CD22 ECD og filtrere ved hjælp af et 0,22 µm filter.\nIndlæse supernatanten på 4 mL min-1 på en pre afbalancerede (20 mM Tris pH 9,0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazol) Ni-NTA kolonne (5 mL volumen) ved hjælp af en benchtop kromatografi system.\nBemærk: Andre affinitet-baserede rensning teknikker kan bruges, baseret på affinitet tags inkluderet i konstruktion design i afsnit 1.\nEfter supernatanten lastning, vaske kolonnen affinitet med 3-4 kolonne diskenheder (CV) af vaskebuffer (20 mM Tris pH 9,0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazol).\nElueres renset glycoprotein fra kolonnen ved hjælp af en 4-100% gradient (4 CVs) eluering buffer (20 mM Tris pH 9,0, 150 mM NaCl, 500 mM imidazol) mens indsamling fraktioner (fig. 3B).\nPool fraktioner der indeholder de eluted peak i en centrifugal filtrering enhed med en 10 kDa nominelle Molekylær vægt limit (NMWL) og koncentrat ved centrifugering på 4.000 x g ved 4 ° C i 15 min, eller indtil prøven når et volumen på 500 µL.\nTilføre en 500 µL prøve loop og belastning på 0,5 mL min-1 på en pre afbalancerede (20 mM Tris, pH 9,0, 150 mM NaCl) koncentreret glycoprotein højtydende størrelse udstødelse kolonne (ca 24 mL volumen) på en hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system ved 4 ° C mens indsamling fraktioner (figur 3C).\nKøre SDS-PAGE gel af elueret fraktioner til at identificere fraktioner der indeholder glykoprotein, og pool tilsvarende fraktioner. SDS-PAGE gel kan køres som beskrevet i afsnit 560.\n7. Deglycosylation af renset Glycoprotein\nMåler koncentrationen af oprenset protein efter størrelse udstødelse kromatografi ved hjælp af absorbans på 280 nm divideret med udslettelse koefficient (fx 1.418 M-1 cm-1 for CD22 ECD).\nBemærk: Den teoretiske extinction koefficient af proteiner af interesse kan beregnes ved hjælp af servere såsom ExPASy ProtParam61.\nInkuber oprenset protein med Endo H i 1 timer ved 37 ° C, ved en ratio på 1 mg renset protein til 10 µL af kommercielle enzym i 1 X Endo H buffer (ifølge fabrikantens anvisninger).\nBemærk: Endo H kløver høj mannose glycans produceret i HEK293S forlader en enkelt GlcNAc gruppe på hver glykosylering site21. Endo H ikke kløver glycans på proteiner fremstillet i HEK293F celler22, men andre enzymer kan bruges til dette formål (f.eks.PNGaseF24).\nKoncentrere deglycosylated ECD til 500 µL og køre gel filtrering kromatografi på en højtydende størrelse udstødelse kolonne (ca 24 mL volumen) på 0,5 mL min-1 på en FPLC til at fjerne Endo H og adskille nogen resulterende aggregater.\nGemme deglycosylated protein ved 4 ° C indtil brug i downstream eksperimenter.\n8. krystallisering af glykoproteiner\nBemærk: Udføre krystallisering forsøg ved hjælp af kommercielt tilgængelige skærme og konfigurere sidder drop eksperimenter ved hjælp af en krystallisering robot.\nKoncentrat ren, deglycosylated ECD til 10 mg mL-1 bruger en centrifugal filtrering enhed med 10 kDa NMWL på 4.000 x g (4 ° C), indtil den ønskede koncentration opnås.\nBestemme proteinkoncentration ved hjælp af absorbans på 280 nm og dividere med koefficienten, extinction.\nCentrifuge prøve på 12.000 x g i 5 min. ved 4 ° C forud for krystallisering forsøg at fjerne uønsket støv eller andre forurenende stoffer fra prøven.\nFylde beholderen wells af 96-godt møde drop krystallisering plader med 80 µL af krystallisering løsning fra en kommerciel krystallisering skærm.\nBemærk: Vi bruger sparse-matrix kommercielle skærme, der er blevet designet baseret på de mest succesfulde krystallisering betingelser med hensyn til strukturer deponeret i det foreløbige budgetforslag.\nVed hjælp af en krystallisering robot, dispensere dråber i brønden af krystallisering plade med en total drop volumen af 200 nL i oprenset protein: krystallisering løsning 1:1 forholdet.\nNår hele pladen har været udleveret, forsegle pladen med tape og sted i en plade imager for inspektion af synlige og ultraviolette lys.\nInspicere krystallisering plader umiddelbart efter installationen, og i de følgende uger, ved hjælp af både synlige og ultraviolette lys til at identificere vilkår, der giver første glycoprotein krystal hits.\nYderligere optimere krystaller opnået fra indledende krystallisering hits ved hjælp af fine skærme baseret på betingelse af krystal hit eller tilfældige matrix mikro-seeding metoder62,63,64,65.\nCryo-beskytte enhver krystaller mangler tilstrækkelig cryo-protectant inden for betingelsen krystallisering af iblødsætning krystal i mor liquor løsning suppleres med 20% (v/v) glycerol løsning (eller tilsvarende cryo-protectant, såsom ethylenglycol eller polyethylenglycol 400).\nMount krystaller i cryoloops og flash fryse dem i flydende nitrogen forud for indsamling af data på en hjem kilde diffractometer eller ved hjælp af synkrotron stråling.\n9. udfasning, ved hjælp af tunge Atom forædling\nBemærk: Før enhver manipulation af HA forbindelser, sikkerhedsmæssige aspekter skal tages i betragtning. HA forbindelser, der anvendes i Proteinkrystallografi er valgt for deres stærke affinitet til biologiske molekyler og udgøre en risiko for menneskers sundhed fra langvarig udsættelse. Træffe passende sikkerheds foranstaltninger for HA forbindelser som nævnt i deres sikkerhedsdatablade.\nFor at teste forskellige HA stoffer, reproducere koncentrationer og inkuberingstider, godt diffracting krystaller opnået i afsnit 8 i en 24-godt krystallisering plade ved hjælp af hængende-drop damptryk diffusion metode66.\nBestemme hvilket HA vil blive anvendt til crystal forædling. Servere (f.eks. Heavy-atom databasesystemet67) kan hjælpe med at HA sammensatte udvalg, at sikre, at de er egnede til protein og krystallisering betingelsen.\nBemærk: HA skærme er også kommercielt tilgængelige for nem screening af mest effektive HA forbindelser for udfasningen. Et sæt af "magic seven" HA forbindelser har tidligere beskrevet for at have høj sandsynlighed for succes for HA forædling68.\nOprette arbejdsstation til HA iblødsætning (figur 4A). Ved hjælp af en cryoloop, hurtigt overføre krystaller til en 0,2 µL slip på en 22 mm dække slip indeholdende HA løsning fortyndet i krystallisering tilstand, således at den endelige koncentration af HA spænder fra 1-20 mM. Forsegle drop og Inkuber i forskellige længder af tid (fig. 4B). Et godt udgangspunkt er 5, 10, 60 og 90 min. og overnatning.\nInspicér visuelt krystaller med en let mikroskop til at identificere eventuelle revner eller ændringer i farve, hvilket kan indikere bivirkninger til glycoprotein krystal eller krystal forædling.\nMontere krystaller i cryoloops og tilbage-sættetid krystaller til 30 s i tre på hinanden følgende 0.2 µL dråber indeholdende mor liquor løsning suppleres med 20% (v/v) glycerol (eller alternativ cryo-protectant)69. Back-iblødsætning krystallerne fjerner HA sammensat, var ikke-specifikt bundet og reducerer delvis belægning forårsaget af svage HA bindende. Flash fryse krystaller i flydende kvælstof (fig. 4B).\nFor dataindsamling bruge forarbejdning, struktur løsning og raffinement, tidligere beskrevet protokoller26,70,71,72.\n10. iblødsætning Glycoprotein krystaller med dets Ligand\nReproducere godt diffracting krystaller opnået i afsnit 8 i en 24-godt krystallisering plade ved hjælp af metoden hængende-drop vapor diffusion.\nForberede en stamopløsning i 50 mM ligand i 20 mM Tris, pH 9,0, 150 mM NaCl.\nBemærk: Liganden koncentration skal være tilberedt efter affinitet til sin glycoprotein. Hvis affinitet er ukendt, kan det være forpligtet til at bruge en metode som ITC (afsnit 12.2) til at bestemme samfølelse før begyndelsen iblødsætning eksperimenter. Sikre at liganden er opløseligt i den ønskede koncentration i den krævede buffer.\nTilføje varierende koncentrationer af liganden til drop indeholdende ECD krystaller og forsegle drop for inkubation ved tid længder mellem 5 min til 5 d.\nVisuelt spore krystaller med en let mikroskop til at identificere mulige ændringer i morfologi.\nMontere krystaller i cryoloops og cryo-beskytte dem i mor liquor løsning suppleres med 20% (v/v) glycerol (eller andre cryo-protectant ethylenglycol eller lav Molekylær vægt polyethylenglycol 400)69.\nFor indsamling, forarbejdning, struktur løsning og raffinement, bruge tidligere beskrevet protokoller73,74,75.\n11. produktion af Fragment Antigen bindende (Fab)\nSubclone gener, der svarer til Fab tunge kæde (HC) og lys kæde (LC) sekvenser af anti-ECD antistoffer, fxepratuzumab.\nBemærk: Alternativt IgG kan kløves af enzymet papain at generere Fab fragmenter76.\nTransfect celler, som beskrevet i afsnit 4, med følgende ændringer:\nBruge en samlet masse af DNA til Transfektion af Fab fragmenter af 90 µg pr. 200 mL af kultur.\nTransfect HC og LC plasmider i forholdet 2:1 at reducere mængden af LC dimer dannelse.\nEfter 7 d inkubation, høste celler, bevare supernatanten og filtrere med en 0,22 µm vakuum-drevet filtrering enhed.\nReagensglasset anti-LC (kappa eller lambda) affinitet kolonner i PBS buffer ved hjælp af en benchtop kromatografi system.\nBemærk: Hvis LC dimer dannelse er et problem under rensningen, Protein G affinitet kromatografi kan bruges som et alternativ til kappa/lambda LC affinitet rensning.\nIndlæse supernatanten på affinitet kolonne på 4 mL min-1. Efter prøven lastning, vaske kolonnen med 3-4 CVs af PBS.\nElueres protein fra kolonne ved hjælp af en isocratic eluering med 100 mM glycin, pH 2.2, straks neutralisere de eluted brøker med 10% (v/v) 1 M Tris, pH 9,0 i hver fraktion.\nBemærk: Eluted Fab kan blive yderligere renset ved ionbytning kromatografi og/eller størrelse udstødelse kromatografi ved hjælp af en FPLC ved 4 ° C.\n12. karakterisering af Fab og lille molekyle Binding til Glycoprotein\nForberede 50 mL af 1 x kinetik buffer (1 x PBS, 0,002% (v/v) Tween-20, 0,01% (w/v) BSA).\nHydrat seks Ni-NTA biosensorer i 200 µL 1 x kinetik buffer for 10 min i en tørstofmængden plade.\nFortynd hans markeret ECD i 1 mL af 1 x kinetik buffer i en endelig koncentration på 25 ng µL-1. Afpipetteres serielle fortyndinger af renset Fab i 200 µL 1 x kinetik buffer, med en høj koncentration af 500 nM, og efterfølgende serielle fortyndinger af 250 nM, 125 nM og 62,5 nM.\nAlikvot reagenser i sort flad bund polypropylen 96-brønd mikrotiterplade som vist i figur 5A, hvor hver godt indeholder 200 µL af den angivne løsning.\nIndsamle data ved hjælp af kinetik Assays i datafangst software, som tidligere beskrevet38,39,77 (figur 5A).\nKort, overføre biosensorer i brønd indeholder 1 x kinetik buffer til baseline for 60 s før pålæsning 25 ng µL-1 for glycoprotein for 240 s (eller indtil en tærskel på 1,0 nm nås) ved 1000 rpm.\nEfter en anden baseline 60 s i 1 x kinetik buffer, overføre biosensorer til brønde indeholdende seriel fortynding af Fab. 180 Sørensen association fase er senere efterfulgt af en 180 s dissociation skridt i 1 x kinetik buffer.\nBemærk: Biosensorer kan genbruges hvis den ovennævnte protokol er efterfulgt af en regenerering skridt, som består af tre cyklusser af vask biosensorer i stripping buffer (PBS med 500 mM imidazol) til 5 s efterfulgt af 5 s i 1 x kinetik buffer for neutralisering. Biosensorer kan genbruges op til ~ 10-20 gange i løbet af samme dag, eller indtil fattige data kvalitet er observeret.\nAnalysere data ved hjælp af analysesoftwaren (figur 5A):\nUnder fanen 1, import og vælge data.\nUnder fanen 2, trin 1: Markerede Data, Vælg Sensor udvælgelse og Fremhæv reference brønde (rækker E og F, figur 5A), lige falde i hak og indstillet til at henvise til godt. Under trin 2: Subtraktion, Vælg Reference brønde. Under trin 3: Tilpasse y-aksen, skal du vælge 'Baseline' fra klokkeslætsområdet for 0,1 til 59.8 s. Under trin 4: Inter trin korrektion, Vælg 'Juster til dissociation.' Under trin 5: Processen, Vælg Savitzky-Golay filtrering og presse procesdata.\nUnder fanen 3, Vælg 'Association og Dissociation' under trin på analyser med en 1:1 model. Vælg 'Globale montering' og 'Gruppe af farve'. Højreklik på kurver, Vælg 'Change farve', sæt alle kurver til farven på dine valg. Vælg 'Fit kurver'. Hvis data er godt udstyret, kan blive eksporteret en rapport ved at vælge 'Gem rapport'.\nGentag forsøget med glycoprotein produceret i HEK293F og HEK293S celler (afsnit 5) og efter Endo H behandling (afsnit 7) til at vurdere, hvilken virkning, hvis nogen, af forskellige glycoforms på Fab anerkendelse. Derudover Gentag eksperimentet med ECD udeladelser at give indsigt i domæne(r) bundet af Fab.\nIsotermisk titrering kalorimetri Fab-glycoprotein interaktion\nBemærk: ITC eksperimenter beskrevet her udføres ved hjælp af en automatiseret ITC instrument. Eksperimenter er udført i en 1 mL rund bund 96-brønd blok.\nDialyze ECD og Fab i en enkelt 4 L bægerglas på 20 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl ved 4 ° C natten over med en røre bar.\nKoncentrere dialysebehandling ECD og Fab 5 µM og 50 µM, henholdsvis, ved hjælp af en centrifugal filter med 10 kDa NMWL, at sikre at vaske koncentrator membraner tre gange med 5 mL af dialyse buffer på 4.000 x g for 5 min. ved 4 ° C før brug.\nBemærk: Enhver uoverensstemmelse i buffer mellem prøver i celle og sprøjte kan forårsage uønsket varme til at blive frigivet i løbet af ITC eksperiment og resultere i data af dårlig kvalitet.\nFor eksperiment 1: tilføje 400 µL af ECD til A1 skal indlæses i cellen, og 120 µL af Fab til godt A2 indlæses i sprøjten. Godt A3 er efterladt tomme tilbage blandet prøve følgende eksperiment afslutning. Hver efterfølgende eksperiment kan føjes til pladen i samme rækkefølge (dvs. eksperiment 2: celle - A4, sprøjte - A5, Tom godt - A6; Figur 5 B).\nBemærk: Omfatter buffer i bufferen kontrolelementer (for at bekræfte instrumentet opfører sig godt) i begyndelsen og slutningen af hver run samt ligand (i sprøjten) i buffer (i celle) kontrolelementer til at beregne heat af fortynding til prøven i sprøjten. Dette beregnede varme af fortynding skal derefter trækkes fra rå eksperimentelle data under dataanalyse (figur 5B).\nLøbe i alt 16 injektioner med et volumen på 2,5 μL for hver injektion. Injektion varighed er 5 s, med 180 s afstanden mellem injektioner. Indstil celle temperaturen til 25 ° C, med en omrøring hastighed på 750 rpm og et filter periode af 5 s.\nBemærk: Baseret på affinitet og termodynamik af ECD:Fab interaktion, kan det være nødvendigt at ændre den prøve koncentration, antal injektioner eller prøverummets temperatur.\nAnalysere data med den analyse software, som tidligere beskrevet40,41,43 (figur 5B).\nGentage forsøget i det mindste i dubletter, beregning af gennemsnitlig KD værdier og standardfejl. Gentag forsøget med ECD af forskellige glycoforms (afsnit 5 og 6) til at vurdere, hvilken virkning, hvis nogen, af glycoforms på termodynamik af Fab: glycoprotein interaktion.\nIsotermisk titrering kalorimetri ligand-glycoprotein interaktioner, at angive ITC eksperiment som beskrevet i afsnit 12.2, med følgende ændringer:\nDialyze ECD i 4 L i dialyse buffer natten over. Opløse ligand ved hjælp af dialyse buffer efter afslutningen af dialyse.\nUdføre ITC eksperimenter ved betydeligt højere koncentrationer at opdage lav-affinitet interaktioner. For ECD og ligand interaktionen, udføre ITC eksperimenter i koncentrationer på 100 µM af ECD i celle og 1 mM af ligand i sprøjten.\nFlere konstruktioner af CD22 ECD blev klonet i pHLsec udtryk vektor og overexpressed i pattedyr HEK293F og HEK293S cellelinjer (figur 2 og 3A). Alle konstruktioner blev renset til størrelse homogenitet af størrelse udstødelse kromatografi og givet en meget ren prøve for krystallisering undersøgelser (figur 3B og 3 C). Den CD22 konstruktion, der førte til godt diffracting krystaller var d1-d3 trunkering (rester 20-330), med fem af seks forudsagte N-linked glykosylering websteder muteret fra Asn til Ala (N67A, N112A, N135A, N164A og N231A), produceret i HEK293S celler, sådan at kun webstedet glykosylering på position N101 blev bevaret (denne konstruktion er opkaldt CD2220-330, 5A). Krystaller blev fremstillet i flere betingelser på skærmbilledet MCSG-1 sparse-matrix, men de bedste krystaller var fra en betingelse, der indeholder 30% (w/v) polyethylenglycol 4000, 0,2 M lithium chlorid og 0,1 M Tris, pH 8,5. Disse indfødte krystaller diffrakteres 2.1 Å resolution; ved hjælp af kendte strukturer af Ig domæner af relaterede Siglec proteiner ikke give nogen løsninger i hr. søgninger.\nFor at erhverve phasing oplysninger, gennemblødt vi indfødte krystaller med et panel af HA forbindelser, der omfattede Hg, Pt, Os, Ta og Br i koncentrationer fra 1-20 mM ha stof til en inkubationstiden fra 5 min-1 d (figur 4). Vi overvågede krystaller til ændringer i morfologi, og fandt at krystaller gennemblødt med HA sammensatte på 20 mM resulteret i den hurtige krakning og opløsning af krystal. Vi frøs ialt 63 krystaller, der beholdt deres form efter sæt inkuberingstider, der var gennemblødt med tantal bromid klynge, platin chlorid, mercurisulfat acetat og kviksølvklorid. Krystaller gennemblødt med 7 mM af kviksølvklorid i 30 min. viste unormal signal på et fluorescens scanning på canadiske Light Source (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canada) og tilladt for multi bølgelængde anormal dispersion X-ray dataindsamling på en enkelt krystal. Disse datasæt tillod os at løse kviksølv underkonstruktion af CD2220-330, 5A, som afslørede en enkelt kviksølv atom bundet til en gratis cysteine på position C308 og i sidste ende tillod os at bygge strukturen i CD2220-330, 5A i den trinvise Electron density kort ved hjælp af AutoBuild78.\nNår unliganded strukturen blev løst, var vi interesseret i at løse strukturen af CD22 bundet til dets ligand, en2-6 siallylactose. Vi først beregnet CD22 affinitet mod en2-6 sialyllactose ved hjælp af ITC for at karakterisere bindende termodynamik i samspillet. Vi observerede en affinitet for ~ 280 µM og bruges disse oplysninger til at identificere en begyndelseskoncentration (~ 100 x KD) af ligand bruge til iblødsætning af vores indfødte CD2220-330, 5A krystaller. Vi gennemblødt CD2220-330, 5A krystaller med 25 mM siallylactose for 5 min, 2 h, 14 h, 40 h og 5 d og overvåges for ændringer i crystal morfologi. ~ 75 krystaller alt var frosset fra forskellige tidspunkter og sendt til CLS synkrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Canada) for remote dataindsamling. I alt seks X-ray datasæt blev indsamlet fra godt diffracting krystaller. Struktur fra hver X-ray datasæt blev løst af hr. ved hjælp af unliganded CD2220-330, 5A struktur som en indledende søgning model. Den resulterende electron density for alle datasæt blev derefter inspiceret for positive tæthed i Fo-Fc kortet, der ville svare til bundne en2-6 sialyllactose inden for bindingssted for CD22. Bemærkelsesværdigt, alle datasæt indsamlet, selv dem fra krystaller gennemblødt efter kun 5 min af inkubationstiden, indeholdt positive tæthed svarende til ligand i bindingssted. Overordnede strukturer af unliganded og liganded CD22 var meget ens med minimal konformationelle ændringer, som kan forklare succesen af iblødsætning eksperimenter med en2-6 sialyllactose.\nVi kendetegnet næste antigene overfladen af CD22 anerkendt af terapeutiske antistof epratuzumab i BLI og ITC eksperimenter (figur 5). Kinetik og termodynamik profiler af epratuzumab Fab binding til CD22 konstruktioner med forskellige glycoforms afslørede et stigende affinitet til CD22 med reduceret N-linked glycan størrelse, med op til en 14-fold forbedring i affinitet for mindre glycans (327 nM vs 24 nM i BLI; 188 nM vs 58 nM i ITC). CD22 N-linked glycan begrænser adgangen af antistof mod sin epitop blev identificeret af BLI ved hjælp af single-point mutanter af CD22 og ved at løse epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 Co krystal struktur28.\nFigur 1 . Oversigt over glycoprotein karakterisering fra konstruktion design til biofysiske og strukturel karakterisering. (1) primære Sekvensanalyse af repræsentative glycoprotein. I grå, den ekstracellulære domæne (ECD); i green, den transmembrane (TM) segment; og i blå, glycoprotein cytosole domæne. Forudsagte N-knyttet glycans er mærket. (2) kloning af ECD konstruktioner. (3) udtryk for ECD constructs i pattedyrsceller. (4) glykoprotein oprensning. Mens proteiner udtrykt i HEK293F vil indeholde komplekse glycans, vil proteiner udtrykt i HEK293S have høje mannose glycans. Enzymatisk behandling af glykoproteiner produceret i HEK293S celler med Endo H resultater i glykoproteiner med kun GlcNAc gruppe på N-linked glykosylering websteder. (5a) glykoproteiner er testet for deres binding til antistoffer af biolayer interferometri (BLI) og isotermisk titrering kalorimetri (ITC). Affinitet til små ligander kan også måles ved ITC. (5b) krystallisering forsøg af glykoproteiner med homogene N-knyttet glycans, som udtrykt i HEK293S og deglycosylated med Endo H. (6) i nogle tilfælde mutation af N-linked glykosylering websteder er nødvendig for at opnå krystaller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 2 . Design af CD22 ectodomain DNA konstruktioner til udtryk i pattedyrsceller. A) repræsentation af det pHLsec plasmid brugt til forbigående Transfektion af CD22 ECD konstruktioner. AgeI og KpnI steder, der anvendes til kloning angives med røde bokse. B) The CD22 ECD indeholder syv Ig domæner (d1-d7) og 12 forudsagte N-linked glykosylering websteder (i blåt). Fire konstruktioner var designet fra CD22 ECD. C) 1% agarosegel viser PCR-amplikoner af CD22 ECD konstruktioner for kloning til pHLsec pattedyr udtryk vektor. Første lane indeholder 1 kb DNA markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 3 . Proteinekspression og -oprensning af glykoproteiner. A) effekt af celle tæthed på udtryk udbytter. Glycoprotein udtryk i små 25 mL kultur af HEK293F suspension celler transfekteret ved hjælp af tre forskellige start tætheder af celler (0,5 x 106 celler mL-1, 1,0 x 106 celler mL-1og 1.5 x 106 celler mL -1). Kvantificering foretages ved densitometri fra SDS-PAGE i venstre panel og kvantitative BLI i højre panel. Værdier er repræsentative for et glykoprotein forberedelse. B) kromatogram af det første rensning skridt for konstruere CD2220-330, 5A fra 600 mL af supernatanten ved hjælp af en Ni-NTA affinitet kolonne. Glycoprotein blev elueret med en gradient af imidazol (grå linie), hvor 100% svarer til eluering buffer, som indeholder 500 mM imidazol. Poolede fraktioner er afbildet med lodrette streger. C) størrelse-udelukkelse kromatogram til konstruere CD2220-330, 5A ved hjælp af en high-performance gel filtrering kolonne. Poolede fraktioner fra eluering peak er afbildet med lodrette streger. Indsatser: Coomassie farvede SDS-PAGE gel viser renheden af glycoprotein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 4 . Krystal iblødsætning med tunge atomer. A) prøve arbejdsstation til iblødsætning indfødte krystaller med HA forbindelser. Alle nødvendige værktøjer er mærket. B) fremgangsmåde følges for at suge krystaller af konstruere CD2220-330, 5A med HA forbindelser. Trin 1, åbne godt indeholdende krystaller og overførsel krystaller ved hjælp af en løkke til en 0.2 µL dråbe på et cover slip indeholdende HA løsning fortyndet i krystallisering tilstand, således at den endelige koncentration af HA spænder fra 1-10 mM. Trin 2, forsegle drop i krystallisering plade og inkuberes krystaller med HA sammensatte i forskellige perioder. Trin 3, montere gennemblødt krystal i loop og back-blød til 30 s i tre på hinanden følgende 0.2 µl dråber indeholdende mor liquor løsning suppleres med 20% (v/v) glycerol udleveres på en cover slip. Trin 4, flash fryse krystal monteret på en løkke med flydende kvælstof og placere det i en puck til forsendelse til synkrotron beamline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 5 . Biolayer interferometri og isotermiske titrering kalorimetri målinger. A) repræsentant BLI eksperiment. Øverste panel: eksempel på plade setup for en kinetik eksperiment, hvor følgende er mærket: 1 x kinetik buffer (B), hans6 x-mærket glycoprotein indlæsning (L), repræsentative Fab koncentrationer (500, 250, 125, 62,5 nM), PBS + 500 mM regenerering buffer (R), og 1 x kinetik neutralisering buffer (B). Hver indeholder godt 200 µL af løsning. Trin nummer for kinetik eksperiment er angivet øverst på pladen. Midten panel: Repræsentative rådata BLI eksperiment udføres ved hjælp af Ni-NTA biosensorer og pladen beskrevet i toppanelet. Trin tal svarer til baseline (1), hans6 x glycoprotein indlæsning (2), baseline (3), association i seriel fortynding af Fab (4) og dissociation (5). Regenerering trin er ikke repræsenteret (skridt 6-7). Nederste panel: Repræsentative analyserede data viser rå association og dissociation (blå linje) med den tilsvarende 1:1 passer (rød linje). B) øverste panel: repræsentative plade setup for en enkelt ITC køre på en automatiseret ITC instrument med syv eksperimenter i en 96-brønd runde nederste blok. Hvert eksperiment består af tre brønde. Den første brønd (rød) svarer til prøven for cellen (400 µL), den anden godt (grøn) svarer til prøven for sprøjten (120 µL). Tredje godt er efterladt tomme, og de blandet prøver vil blive returneret til denne godt efter eksperimentet gennemført. Forsøg 1, 2 og 7 er buffer i bufferen kontrolelementer. Forsøg 3-5 repræsenterer tredobbelt eksperimenter med glykoprotein (P) i celle og Fab eller ligand (L) i sprøjten. Eksperiment 6 repræsenterer en ligand varme af fortyndingsluftens og bør trækkes fra forsøg 3-5 i dataanalyse. Nederste panel: Repræsentative rå (øverst) og forarbejdede (nederst) ITC data viser Fab (epratuzumab) binding til CD22 ECD produceret i HEK293F celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nMembran-forankrede glykoproteiner er vigtige for cellefunktion og attraktive terapeutiske mål. Her præsenterer vi en protokol for de strukturelle og Biofysisk karakterisering af ECD af membran glykoproteiner, både alene og i kompleks med lille molekyle ligander og Fab fragmenter. Vi har med succes brugt denne protokol til at bestemme krystalstruktur af de tre N-terminal-de fleste Ig domæner i den ekstracellulære del af menneskelige CD2228, et kritisk samarbejde receptor på B-celler involveret i at holde humorale immunitet i check79. Vi har også kendetegnet bindingssted af CD22 med dens naturlige ligand en2-6 sialyllactose og defineret tilstand af anerkendelse af et terapeutisk antistof mod human CD22. Disse resultater giver indsigt i struktur-funktion relationer af et centralt medlem af familien Siglecs, der har begrænset udtryk på B-celler og en molekylær køreplan for udviklingen af nye CD22 målrettet små molekyle og antistof-baseret Therapeutics. Mens denne protokol blev brugt med succes til en Ig-holdige B-celle receptoren, foreslår vi, at vores tilgang kan anvendes for de strukturelle og Biofysisk karakterisering af enhver membran glycoprotein med et særskilt domæne organisation. I sådanne tilfælde, konstruere design og kombinatorisk N-linked glycan mutationer (enten til Localisation eller Ala) kan evalueres for at finde en konstruktion velegnet til crystal vækst og høj opløsning diffraktion.\nAt opnå en homogen og ren glycoprotein prøve er af kritisk betydning for crystal vækst og røntgen diffraktion samt for downstream biofysiske karakterisering. N-knyttet glycans til stede på glykoproteiner er i sagens natur heterogen, og kan forårsage konformationelle og kemiske forskelle inden for den glykoprotein, der kan afskrække krystal formation. For at reducere denne mikro-heterogenitet, kan strategier, der indfører punktmutationer for at fjerne Asn rester forudsagt for at havnen N-knyttet glycans, eller ved hjælp af mutant cellelinjer (f.eks HEK293S) efterfulgt af behandling med endoglycosidases (såsom EndoH) betydeligt forbedre krystallisering succes15,21,22. I denne protokol diskutere vi rensning af opløselige glykoproteiner og funktionelle luftrumsblokke, der er udskilt i cellen supernatanten. Glycoprotein sekretion giver en relativt simpel rute mod renhed, uden behov for celle lysis eller tilsætning af barske kemikalier eller rengøringsmidler. Den celle supernatanten, indhenter følgende celle høst er derefter køre direkte over en kolonne, der har affinitet for protein af interesse (f.eks. Ni-NTA for hans markeret glykoproteiner eller LC affinitet for Fab fragmenter). Dog afhængig af kolonnen i brug og betingelserne i cellen supernatanten (fx pH), kan den bindende evne til protein af interesse for kolonnen blive påvirket. Hvis dette er tilfældet, kan det være nødvendigt at koncentrere sig og buffer exchange cellen supernatanten for at forbedre binding til kolonnen. Derudover anbefales det, at kvalitetskontrollen trin under rensningen være ansat til at hjælpe med at vurdere protein renhed. Kører en SDS-PAGE gel eller vestlige skamplet af alle prøver (før, under og efter rensning trin) kan give indsigt i hvorvidt den foreslåede rensning ordning er velegnet til protein af interesse. Hvis kontaminerende bands er synlige på SDS-PAGE, eller hvis flere arter er opnået under rensning (f.eks. flere toppe på størrelse udelukkelse), yderligere rensning foranstaltninger bør overvejes, fx ionbytning kromatografi, at få i renhed og øge chancerne for downstream krystallisering80.\nFor makromolekylære krystallisering er det ofte afgørende for at opnå høje udbytter af protein af interesse at tillade screening af et stort antal potentielle krystallisering betingelser ved høje protein koncentrationer at finde egnet krystal hits. Generelt, de HEK293 cellelinjer drøftet her (HEK293F og HEK293S) er robust udtryk systemer, og let kan skaleres til at producere mere prøve efter behov. Det er imidlertid muligt, at protein af interesse ikke kan udtrykke tilstrækkeligt inden for disse cellelinjer. I disse tilfælde, andre cellelinjer, såsom Expi293 celler81,82, er blevet fundet for at vise overlegne niveau af protein udtryk og bør betragtes som et alternativ.\nHvis velordnet, diffracting krystaller ikke er fremstillet efter afprøvning af flere konstruktioner af protein om interesse trods høj renhed, kan det være nødvendigt at udvide krystallisering teknikker for at fremme krystal formation. Det har vist sig at Fab fragmenter af antistoffer og nanobodies kan være fremragende krystallisering smagsforstærkere, og fremme velordnet krystal pakning83,84,85. Disse fragmenter kan udtrykt og renset til homogenitet og anvendes i et kompleks med protein af interesse for at fremme krystallisering. Vigtigere, kan Fab fragmenter produceret som beskrevet i afsnit 10 have en tendens til at danne ikke-funktionelle LC dimerer86. Disse dimerer er forurenende stoffer og bør fjernes under rensningen. Vores erfaring, LC dimerer ofte har en anden opbevaring volumen på størrelse udstødelse, eller elueres som en særskilt peak på ionbytning kromatografi, og dermed kan blive fjernet fra Fab rensning - men det ikke er altid tilfældet. Hvis disse teknikker er utilstrækkelige til at fjerne LC dimerer fra Fab rensning, kan yderligere rensning metoder, såsom Protein G affinitet rensning, anvendes til at forbedre renhed.\nAlternativ til co-kompleks med Fab fragmenter, veldokumenterede teknikker såsom random matrix microseeding kan forbedre chancerne for at få ordnet krystaller63,70. Denne metode omfatter tilføjelse af små mængder af knust, suboptimal krystaller i den krystallisering tilstand, giver en krystal nucleate at fremme crystal vækst. Dette kan udføres ved hjælp af krystaller af protein af interesse, eller dem med lignende domæne arkitektur og tertiære struktur. Derudover kan random matrix microseeding udføres i forsøg på at krystallisere protein alene eller i kompleks med en Fab fragmentet eller lille molekyle af interesse. De seneste fremskridt i kryo-elektronmikroskopi også gøre denne teknik et attraktivt alternativ til røntgenkrystallografi for at opnå høj opløsning strukturelle oplysninger for molekyler med passende funktioner87,88, 89,90,91.\nNår udfasning af røntgen diffraktion datasæt mislykkes ved hr., kan HA iblødsætning være nødvendigt at løse fase af unormale spredning eller isomorphous udskiftning. Inspektion af aminosyresekvens af protein kan give et fingerpeg om strategien for HA forædling, herunder optimale pH for bindende. Uparret cysteines inden for proteinet kan navnlig specifikt binde HA forbindelser, der indeholder kviksølv. Iblødsætning indfødte krystaller med HA forbindelser er en iterativ proces til at bestemme identiteten af den optimale HA sammensatte, sin koncentration og den krævede inkubationstiden. Hvis første iblødsætning forsøg ikke give godt diffracting krystaller indeholdende en HA egnet til udfasning, kan det være nødvendigt at indføre aminosyre udskiftninger for at forbedre sandsynligheden for HA bindende og forbedre unormal signal. Eksempler kan nævnes mutationer for at medtage en gratis cystein rest effektivt binder Hg, Au, Pt eller Pb. angivelse af proteiner for anomale indfasningen seleno-methionin suppleret medier i E. coli er flittigt brugt til anormale afvikling, men en tilsvarende system, der pålideligt inkorporerer seleno-methionin er ikke let tilgængelige for mammale celler i suspension92,93, og er et område af fremtidige udvikling.\nNår unliganded strukturen af glycoprotein af interesse er opnået, kan iblødsætning krystaller med lille molekyle ligander udføres for at opnå en struktur af immun receptor-ligand kompleks. Disse data giver en blueprint for den rationelt design af mere specifikke og høj-affinitet ligander, der kan bruges som små-molekyle therapeutics samt giver høj opløsning indsigt i den biologiske funktion af glycoprotein. Når du forsøger at suge glycoprotein krystaller med lille molekyle ligander af interesse, kan inspektion af unliganded krystalstruktur indikere om iblødsætning skal være muligt. Hvis tæt krystal-pakning kontakter er fundet omkring den liganden bindingssted eller omkring regioner forventes at gennemgå konformationelle ændringer på ligand bindende, iblødsætning vil sandsynligvis være problematisk. I dette tilfælde skal andre metoder såsom Co krystallisering af protein-ligand komplekset udføres.\nRøntgen diffraktion eksperimenter beskrevet i denne hvidbog blev udført ved hjælp af beamlines, 08-ID og 08-BM på den canadiske lyskilde, som støttes af Canada Foundation for Innovation, naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada, den Universitetet i Saskatchewan, regeringen i Saskatchewan, vestlige økonomiske diversificering Canada, Canadas National Research Rådets og de canadiske institutter for sundhedsforskning. Vi vil gerne anerkende den strukturelle & biofysiske Core facilitet, Hospital for syge børn, for adgang til instrumenterne, ITC og BLI. J.E.O. blev støttet af Banting postdoc stipendium BPF-144483 fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. T.S. er en modtager af en Canada Graduate stipendium Master's Award og en Vanier Canada Graduate stipendium fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. Dette arbejde blev støttet af opererer grant PJT-148811 (J.-P.J.) fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. Denne forskning blev gennemført, til dels takket være støtte fra Canada forskning stole program (J.-P.J.).


Minier (8-10 år) Juniorer (10-12 år) Trop (12-16 år) Seniorer (16+ år)\nVi er en gruppe på omkring 100 spejdere i alderen 8 år og opad — og en masse engagerede ledere, som alle elsker spejderlivet med alt hvad dertil hører af gang i bålet og udeliv i al slags vejr. Vi lægger vægt på et stærkt fællesskab og på at man lærer at blive en del af en gruppe, der kan samarbejde.\nVi mødes i vores hytter på Morescosvej 5-7 i Ordrup. Her er vi flere forskellige spejdergrupper, der har til huse. MorescoSpejderne holder til i de nye sorte hytter.\nVi har tre aldersopdelte grene, der alle mødes på følgende tidspunkter:\nMinierne (8-10 år) mødes mandage 18:00 - 19.30\nJuniorerne (10-12 år) mødes onsdage 18:00 - 20:00\nTrop (12-16 år) mødes onsdage 18:00 - 20:00\nNogle gange mødes vi andre steder i nærområdet – fx på Charlottenlund Fort. Ud over at holde spejdermøder tager vi også på ture – både endagsture, weekendture på Sjælland og lidt længere lejrture. Vi plejer bl.a. at have en weekendtur inden jul, en i foråret og en sommerlejr på en uge for hele gruppen (altså alle aldersgrene).\nVores halvårsprogram står i vores medlemsblad, Tam-Tam, som også kan læses på hjemmesiden. Du kan også følge os på Facebook: Facebook.com/MorescoSpejderneDDS.\nTid 08:00 - 15:00\nSe alle arrangementer fra MorescoSpejderne


Lash Lift/Permanent vippebuk uden farvning af vipper (Elev)\nAftagning af Shellak (Elev)\nFarvning af vipper (Elev)\nHudanalyse (Gratis ved køb af produkter) Elev\nKosmetisk pedicure inkl. Shellak (Elev)\nMini manicure inkl.Shellak (Elev)\nVelvære quick behandling med Beauty Angel lys (Elev)\nVoks af næsebor og ører (Elev)\nVoks overlæbe eller hage (Elev)\nKan behandlingen gå galt/Falder mine vipper af?\nBehandlingen kan ikke gå galt – dog kan dine vipper blive overbehandlet. Sker dette vil de ‘krølle’ mere end det buk man går efter i et Lash Lift. Dette kan skyldes flere ting.\nDet kan være vipperne er tørre, og ved næste Lash Lift bør behandles kortere tid.\nDet kan også skyldes der er mange små babyhår, dvs. vipper der er kortere og finere. De små hår kan ikke altid klare lige så lang behandlingstid som de lange vipper. Dette kan gøre de kommer til at ‘krølle’ lidt. Opstår uønsket ‘krøl’, kan dette rettes ud igen ved at lave et omvendt Lash Lift.\nDine vipper falder ikke af! Det er naturligt at du taber mellem 1-5 vipper dagligt – om du har fået lavet Lash Lift eller ej. Der er altid en naturlig udskiftning af dine vipper, ligesom med håret på dit hoved\nHUSK: Når du kommer til behandlingen er det VIGTIGT at du kommer uden øjenmake-up, da fjernelse af især vandfast mascara med olie, kan lægge en film omkring vipperne, som mindsker bukket.\nLørdag 09.00 - 14:00


Ordspillet Deluxe app for iPhone: reviews, screenshots, forum, users community\nFra 0-3 år. Spil det sammen med dit barn\nThe information may be outdated (2011-03-28 21:45:06). For actual information go to iTunes\nRelated to «Ordspillet Deluxe» applications\nVi taler dansk 5 ud af 6 stjerner i Berlingske. 36 billeder i 3 kategorier. Lr safari-dyr, musik-instrumenter og legetj. Tryk p et dyr og hr dets navn p dansk, samt lyden fra dyret - Hr lven brle Fra 0-3 r. Spil det sammen med dit barn. more\nView all related to: Ordspillet Deluxe applications


Danske Lejere - Valeur\nDanske Lejere oplevede, at det var svært for medlemmer og ikke-medlemmer at komme i kontakt med deres medarbejdere. Ubesvarede opkald kan i værste tilfælde resultere i kundetab. Samtidig var mange af de indgående opkald som Danske Lejere modtog af forskellige art, hvilket gjorde det svært for deres medarbejdere at viderestille opkald så effektivt som muligt.\nVores erfarne konsulenter varetager Danske Lejeres indgående opkald og sikrer, at alle der ringer ind får den samme gode kundeservice. Derudover hjælper Valeur Customer Service også med mersalg af medlemskaber. Hos os går god kundeservice og vækst hånd i hånd.\nBruger du Valeur Customer Service som supportløsning, skaber du samtidig sikkerhed, service, vækst og kvalitet i jeres kundebetjening.


Kørte 200 km/t på Kongevejen: Vanvidsbilist sendt i fængsel - sn.dk - Allerød\nDen dengang 24-årige mand blev anholdt efter syv minutter vanvidskørsel, hvor politiet jagtede ham gennem Allerød og Birkerød.\nArtiklen: Kørte 200 km/t på Kongevejen: Vanvidsbilist sendt i fængsel\nKørte 200 km/t på Kongevejen: Vanvidsbilist sendt i fængsel\nEn 25-årig mand er blevet kendt skyldig i hasarderet kørsel, hvor han forsøgte at flygte fra politiet med 200 km/t og undervejs kørte mod færdselsretningen.\nAllerød - 15. juli 2021 kl. 06:21\nEn dramatisk biljagt udspillede sig sidste år i Allerød, og nu er den i dag 25-årige mand fra Hundested, der sad bag rattet, blevet kendt skyldig i en lang række lovovertrædelser.\nDen 19. april klokken 19.38 ville politiet standse den unge mand i en bil på Kongevejen i krydset ved Nymøllevej. Han var dog bestemt ikke interesseret i at tale med politiet, og han flygtede fra stedet med 200 km/t, hvor man må køre 60 km/t.\nDe næste syv minutter ræsede manden mod Birkerød med politiet i hælene.\nUndervejs kørte han flere gange over i den modsatte vejbane, ligesom han flere gange var ved at køre over for rødt lys.\nBrems og slinger\nUd for Kongevejen nummer 11 måtte han lave en katastrofeopbremsning for at undgå at køre ind i en anden bil. Opbremsningen førte til, at den tiltalte mistede kontrollen over bilen, der kom i slinger, hvorefter han påkørte en påbudstavle, »hvilket udsatte passageren i bilen, føreren af den anden bil og andre trafikanter for fare«, som der står i dombogen.\nDa han var ved Shell tankstationen på Birkerød Kongevej, måtte han igen foretage en katastrofeopbremsning, og bilen kom igen i slinger.\nLængere fremme af Birkerød Kongevej kørte han igen over i den anden vejbane og måtte foretage et kraftigt vrid i rattet til højre for at undgå at påkøre den modkørende trafik. Også denne gang mistede han herredømmet over bilen. Han kørte hen over fortov og cykelsti og ud i græsrabatten, hvor han påkørte en træpæl. Han fortsatte med at køre, indtil det lykkedes politiet at bringe manden til standsning på Kongevejen ud for nummer 7.\nVed retten i Hillerød var han derfor tiltalt for at have tilsidesat væsentlige hensyn til færdselssikkerheden og på en særlig hensynsløs måde, idet tiltalte ved grov kådhed eller på lignende hensynsløs måde, forvoldte nærliggende fare for nogens liv eller førlighed i forbindelse med Nordsjællands Politis eftersættelse af ham.\nHan var tiltalt for at have indtaget de bevidsthedspåvirkende stoffer Diazepam og Amfetamin inden kørslen. Desuden var han tiltalt for at have kørt under påvirkning af samme stoffer i Brøndby, og for at have ført bil uden førerret i Kregme og for at overhale over cykelstien i Kregme i februar sidste år.\nDen 25-årige mand erkendte flere af de andre sager, men han nægtede sig delvist skyldig i sagen fra Allerød.\nIfølge dombogen havde den 25-årige ikke kørekort, og blodprøven, der var blevet taget efter anholdelsen, viste en påvirkning over mindstegrænsen. Han er tidligere straffet for overtrædelse af færdselsloven og for vold.\nIfølge dombogen lagde retten i sagen fra Allerød afgørende vægt på en betjents vidneforklaring.\n»Vidnet har forklaret, at han under kørselsforløbet løbende foretog rapportering til vagtcentralen, og at han og hans kollega straks efter at være kommet tilbage til stationen skrev rapport. Vidnet har i øvrigt i det væsentlige forklaret i overensstemmelse med anklageskriftet, og det kan lægges til grund, at forløbet er som beskrevet i anklageskriftet«, fremgår det af dombogen.\nKonkret fare for andre\nRetten bemærkede, at tiltaltes hensynsløse kørsel ikke blot generelt set var farlig, men at den efter vidnets forklaring medførte konkret fare for både medtrafikanters og passageres liv og førlighed.\nDen 25-årige blev derfor kendt skyldig. Han blev straffet med fængsel i fire måneder og en bøde på 10.400 kroner. Han frakendes desuden ubetinget retten til at føre bil i syv år fra den 8. juli 2019. En personbil er blevet konfiskeret, og tiltalte skal betale sagens omkostninger.


⇒ Køb Egetræ i Skagen – Klik her\nEr du på udkig efter egetræ i Skagen? Vi anbefaler følgende webshops…\nEn lang række online forhandlere frembyder i øjeblikket en række forskellige fragtløsninger. Den mest anvendte er lige nu at få afleveret pakken hos en pakkeshop, fordi du på den måde nemt kan hente pakken når der er mulighed for det. Fragtmuligheden er altså i høj grad simpel, og oftest endvidere den mest betalelige fragtløsning.\nDu burde tillige overveje at bestille varerne til levering til din bolig eller til når du er på job. Leveringsformen er almindeligvis et hak mere bekostelig, men derudover meget bekvem. Den mest letkøbte leveringsmanér af egetræ i Skagen kan ikke benægtes at være at du selv henter produkterne, men det står og falder med at du bor tæt på egetræ i Skagen e-forretningens bopæl.\nFragtperioden kan i nogle tilfælde være meget relevant ifald man skal bruge dine nye varer med det samme, så i det øjemed er det øjensynligt aktuelt at du efterser tidshorisonten for levering for det vedkommende produkt.\nTemmelig mange egetræ i Skagen netbutikker yder levering på næste hverdag på flere varer, men vær vagtsom da det forudsætter at transaktionen realiseres inden et fastsat tidspunkt, med hensynstagen til at de har udsigt til at kunne nå at få egetræ i Skagen ud af døren forud for at pakkemedarbejderne holder fyraften.\nFlere online firmaer byder på fragt uden betaling, men i de fleste tilfælde kræver det at man indkøber for et præcist beløb. Ellers skulle du vælge den billigste leveringsudgave, der i de fleste tilfælde – uden hensyn til om man opholder sig ved Taastrup, Rønne eller Sorø – er at få fragtfirmaet til at bringe dine produkter til et afhentningssted.\nDet er efterhånden usædvanlig simpelt for alle og enhver at finde frem til de bedste priser på egetræ i Skagen i blandt diverse e-firmaer, og til gengæld har massevis af internet foretagender ikke kunne slippe for at stampe salgsværdien på mange af deres produkter – til børn, og samtidig til damer og herrer – drastisk, og endda nogle gange tilbyde levering uden gebyr.\nDog kan det immervæk blive gavnligt at efterprøve et par firmaer på nettet efter egetræ i Skagen tilbud forud for at du placerer ordren, således at du er tryg ved at indhente den mindst kostelige pris.\nMan bør dog være årvågen med, at når en e-shop tilbyder egetræ i Skagen for en pris som kan ses som besynderligt fremragende, kan det mange gange være en indikation på en uoprigtig internet webshop. Bestillinger med betalingskort er på den anden side omfattet af en orden, der passer på dig som køber imod snydagtige netshops.\nGenerelt foreslår vi bestillinger med kort eller mobilbetaling. Som et alternativ kunne du anvende et afdragstilbud som fx ViaBill, når du vil afbetale regningen i flere bidder.\nInden folk handler egetræ i Skagen på en e-handler burde de for at være sikker se på forhandlerens regler, dog er det ofte ikke videre interessant.\nEn anden mulighed kan være at efterse hvorvidt online virksomheden er verificeret af e-mærket, fordi det almindeligvis er et fingerpeg om at e-forhandleren efterkommer de officielle regler, foruden at online forhandleren rutinemæssigt kontrolleres af fagmænd som forstår vedtægterne på området. Desuden tilbydes du chance for at få bistand, ifald du bliver udsat for besvær som følge af din bestilling.\nTilmed går vi ind for at kunden er på vagt for de væsentligste betingelser der er gældende for transaktionen, som eksempelvis hvilken returneringsret på egetræ i Skagen internet shoppen har. Her er det også vigtigt, at man stadig sikrer ens e-mail kvittering, så man altid vil kunne bekræfte handlen, uanset om du shopper til en mand eller kvinde.\nTrustpilot fører til fuldt ud gavnlige chancer for at bese en længere række forhenværende brugeres bedømmelser og derved går vi ind for, at du besigtiger internet virksomhedens egetræ i Skagen kritik forud for at du shopper.\nFacebook medfører endvidere i højeste grad sikre chancer for at få indblik i e-butikkens troværdighed. Foruden det er der mange internet firmaer hvor det er muligt at skrive en bedømmelse af købsoplevelsen, som desuden kan drages fordel af til at få et indtryk af tilfredsheden hos kunderne.\nDenne side er finansieret af indtægter fra reklamer. Vi hjælper utallige webshops eftersom vi promoverer firmaernes tilbud, og modtager betaling når en bruger fra vores side gennemfører en ordre.\nOrientering angående egetræ i Skagen og internet varehuse i Danmark vedligeholdes løbende, men vi kan desværre ikke garantere imod modifikationer der er blevet implementeret efter seneste opdatering af de anvendte oplysninger.\nEgetræ i Skagen – Køb egetræ i Skagen


Med et par års corona-forsinkelse fik Camilla, Ulla og Vivi deres bevis på at være certificerede PODD instruktører, da Gayle Porter var i Danmark for at holde et 5-dages advanced kursus – hendes første i mere end to år!\nEfterårets kurser i PODD til elektroniske enheder samt PODD med alternativ betjening er nu programsat.\nFind dem i kalenderen til venstre.\nBoardMaker – fra 6 til 7\nDer er som tidligere nævnt problemer med import af gamle PODD sider til BoardMaker 7. Seneste melding fra Tobii Dynavox er:\nCurrently we are not advising PODD be used in bm7 due to incompatibility and errors/issues that come after the import. We would recommend to continue to use PODD with your v.6 software until we have resolved the issues with update.\nHar man brug for konvertering nu, har Edda arbejdet en del med konverteringen og fundet frem til den metode, hun synes giver færrest fejl i konverteringen fra BoardMaker 6 til 7.\nHent en konverteringsvejledning her.\n5-dages avanceret PODD-kursus i Danmark.\nSom vi har skrevet her, er PODD sidesæt til tablet, pc, iPad m.v. ved at blive oversat til dansk til brug i andre programmer end Compass, og de første er godkendt og udgivet.\n15 + til skole / børnehave\ntil brug i programmet Mind Express, der forhandles af ASK.\n15 skole / 15 førskole\n60 Udvidede nøgleord (ny juni 2021)\ntil brug i programmet Grid 3, der forhandles af Aabentoft.\nASK-projekt i København\nAugust-nummeret af CP Indblik – medlemsblad for CP Danmark – har bl.a. artikel om et ASK-projekt i Københavns Kommune, hvor PODD indgår som et bærende element.\nBrugen af kommunikationsbøger udfordrer os i en Corona-tid. Hvordan kan vi undgå smittespredning via bøgerne? Hvordan kan vi balancere det realistiske med det sikre? Emmy Kjelmann mfl. har samlet nogle anbefalinger omkring dette.\nHent Emmys anbefalinger.\nDer er lavet kommunikationstavler til brug i forbindelse med Corona virus situationen.\nPODD er en strategi til udvikling af sprog og kommunikation, der:\nunderstøtter sproglig udvikling fra tidligt niveau til avanceret niveau.\nstøtter op om indlæring af sætningsstrukturer og læse/skrive færdigheder.\nfungerer med forskellige betjeningssystemer; såvel teknologiske som ikke-teknologiske.\nindeholder strategier til indlæring, undervisning af samtalepartnere, målsætning og implementering.\nPODD er en forkortelse for Pragmatisk Organiserede Dynamiske Displays (sider/tavler)\n..så man ledes til sandsynligt ordforråd, der kan bruges til kommunikation i den aktuelle situation.\nStander/holder til PODD kommunikationsbog\nVi har samlet eksempler og fremstillingsvejledning til forskellige former for holdere og bæreseler til PODD bøger.\nLæs mere her, bl.a. beskrivelse af en bog, der ved hjælp af kanalplast og Velcrobånd forsynes med stiv for- og bagside, så den kan stå selv.\nPODD alternativ betjening – nye skabeloner\nSkabeloner, der ikke er med på USB kortet ved levering, kan downloades og f.eks. gemmes på afsnittet ‘Ekstra’ på USB-kortet. Vi er nu klar med fire nye:\n48 PAVS nøgleord\n48 Nøgleord – farvekodet\n64 PAVS – udvidede nøgleord\n64 Farvekodet – udvidede nøgleord\nInstitutioner, der har anskaffet PODD Alternativ betjening kan hente skabelonerne ved at logge ind med det 7-cifrede licensnummer, der står bag i teoribogen.\nSeksualitet og kommunikation\nISAAC Danmark, Landsforeningen LEV og CP Danmark (Spastikerforeningen) afholdt januar 2019 temadag omkring seksualitet og personer med funktionsnedsættelser, kommunikationshandicap m.v.\nI den forbindelse har vi samlet specialsider omkring seksualitet. Opbygningen af siderne har taget udgangspunkt i PODD principperne.\nLæs mere på www.kommunikationsbog.dk, hvorfra de også kan downloades.\nBøger, tilpasset elever på STU\nI samarbejde UUC Maglemosen og Uddannelsescenter UIU er fire skabeloner er blevet tilpasset til brug af klasser/elever på STU.\nEfter aftale med Maglemosen og UIU kan de frit downloades. Skabelonerne er ‘generaliseret’, så symboler og sider, rettet mod det specifikke STU er fjernet.\nDe kan findes under Dansk materiale, når man er logget ind med sit PODD licensnummer.


Curly Purly blebukser | Saga i farver\nOrginalopskrift af Marnie Ann Joyce. Oversat, og detaljegraden øget, af mig 🙂\nTak til brugerne af slyngebarn.dk’s Stofbleforum for at hjælpe med at gøre opskriften så udførlig og umisforståelig som muligt.\n3 markører, en til midt bag/omgangens start og en til hofteangivelse i hver side\n3 sæt strømpepinde eller rundpinde i følgende størrelser (det er nemmest at bruge strømpepinde i de små størrelser):\n– et sæt i den størrelse, du brugte til at opnå strikkefastheden.\n– et sæt ét nummer under den størrelse, du brugte til at opnå strikkefastheden.\n– et sæt 1½ numre under den størrelse, du brugte til at opnå strikkefastheden.\nF.eks.: Ved Lima skal der bruges p. 5 til at opnå strikkefastheden. De andre skal så være p. 4 og 3½.\n50 [50; 50-100; 100; 100] g uldgarn.\nLima/Peru Uld fra Hjertegarn passer rigtig godt. Hvis du vælger et andet garn, skal det have en strikkefasthed som angivet ovenover.\n– Garnet skal bestå min. 75-80 % uld, for at være velegnet til blebukser.\n– Undgå Superwash-behandlet uld (kan ikke lanoliseres lige så godt som alm. uld).\n– Husk at garnet skal være elastisk (dvs. ret fast i tvindingen og holder formen). Undgå derfor 100 % merinogarn. Garn med mohair bør også undgås. Hvis du alligevel bruger sådanne garner, anbefaler jeg at du syr et stykke elastisk gennem ribben på indersiden, så taljebåndet holder formen.\nDen rette tykkelse garnNB! Hvis det ønskede garn er tyndere eller tykkere, end at der skal bruges en pindestørrelse mellem 4 og 6 til at opnå strikkefastheden, vil det færdige resultat blive enten for løst eller for stift.\nDu kan bruge to tråde sammen af det tynde garn for at opnå strikkefastheden, men ellers bør du finde et andet, mere velegnet garn.\nAt opnå den rette strikkefasthedHvis dit garn har en lidt anden strikkefasthed end angivet herunder, kan du gå en pind op eller ned for at opnå strikkefastheden. Det vigtigste er at strikkefastheden passer, selvom man så skal bruge andre pindestørrelser end de angivne.\nHvis du bruger rundpinde, skal du alligevel bruge et sæt strømpepinde 1½ numre under den størrelse, du brugte til at opnå strikkefastheden. De skal bruges til benstumperne.\nStørrelserDette mønster er designet til at have en tæt pasform.\nDit barns mål skal være ca. fra midt i til overgrænsen af en størrelse (f.eks. hvis hofter er 40-45, vælges S, ikke M).\n(NB) Newborn; Hofter: Ca. 30,5 – 40,5 cm. Blemål: 35,5 cm\n(S) Small; Hofter: Ca. 35,5 – 45,5 cm. Blemål: 40,5 cm\n(M) Medium; Hofter: Ca. 40,5 cm – 56 cm. Blemål: 45,5 cm\n(L) Large; Hofter: Ca. 43 – 61 cm. Blemål: 51 cm\n(XL) X-large; Hofter: Ca. 48 cm – 63,5 cm. Blemål: 56 cm\nHofter = Bredeste omkreds med ble på (som regel øverst på hofterne, der hvor vingerne på bleen begynder)\nBlemål = Med ble på, fra ca. navlen fortil (der hvor bukserne skal nå op til), ned mellem benene, og op bagpå til der, hvor bukserne skal gå til (er som regel ca. 5 cm mere end samme mål målt på bleen).\nForkortelserm = maske\n2 r sm = to ret sammen\n2 dr r sm = 2 masker drejet ret sammen, dvs. stik pinden ind i maskerne fra højre side og bag til, i stedet for, som normalt, fra venstre side og fortil.\nVendepindeHvis du laver vendepindene i mønsteret, er det tætsiddende med god plads til blenumse. De når lidt højere op bagpå, hvilket giver en god pasform, da mere en ble jo fylder mest bagpå.\nHvis du undlader dem, vil blebukserne sidde strammere, og der er ikke plads til lige så stor en blenumse.\nDesigneren kan godt lide dem uden venderækker og med høj talje under bukser, fordi de så når op over buksernes lining og forhindrer dem i at flytte på sig under leg.\nTips til at lave vendepindeSådan snor du garnet om næste maske på den omgang, hvor du vender:\nNår du har strikket de m du skal, og skal til at vende, gør du således:\n– Tag næste maske over på højre p uden at strikke den,\n– før garnet rundt om masken,\n– sæt masken tilbage på venstre p.\nDerefter vendes strikketøjet. Så undgår du at få et hul, hvor du har lavet vendingen.\nPå næste omgang:\nNår du kommer til den maske fra omgangen før, som garnet blev snoet om, tager du det lille stykke omsnoede garn op på venstre pind. Derefter strikker du det samtidig med masken på pinden, som om de var én maske. Så undgår du at man kan se vandrette stumper garn henover maskerne, hvor vendingen blev lavet.\nAndet– Du kan tilpasse mønsterets størrelse selv, husk at slå et antal masker op, der kan ganges med 8.\n– Brug en strækbar opslagning, f.eks. strikkeopslagning.\nSlå 64 [72, 80, 88, 96] m på på pinde, der er 1½ p mindre end dem du brugte til at opnå strikkefastheden.\nSaml omgangen og marker omgangens start med en markør. Denne markør markerer midt bag/omgangens start (det er en rigtig god idé at benytte denne markør, det kan ellers være svært at se, hvad der er for og bag).\n1. omgang: Strik rib, 1 r, 1 vr, strik hele omgangen sådan. Imens du strikker denne omgang, placerer du de to hoftemarkører således:\nNB: 17 m, placer markør, 31 m, placer markør, 16 m.\nS: 19 m, placer markør, 35 m, placer markør, 18 m.\nM: 21 m, placer markør, 39 m, placer markør, 20 m.\nL: 23 m, placer markør, 43 m, placer markør, 22 m.\nXL: 25 m, placer markør, 47 m, placer markør, 24 m.\nFortsæt i 1 r, 1 vr over 14 p (=5 cm), ignorer alle markører.\nHvis du ønsker at skifte farve, kan du gøre det her.\nNu beslutter du om du vil strikke vendepinde (giver bedre plads til blenumse).\n– Hvis du strikker vendepinde, strikker du både det i sort og det i grøn.– Hvis du ikke strikker vendepinde, springer du det i grønt over.\nHvis du ønsker at tilføje en vendepind, gøres det her; efter farveskiftet, og før du skifter pindestørrelse.\nVendepinden laves sådan (det er ret enkelt, spring ud i det . De mange punkter er bare for at gøre det meget tydeligt, hvordan det foregår):\nDer strikkes som maskerne viser (ret over retmasker og vrang over vrangmasker)\n– strik fra omgangens start og hen til hoftemarkøren,\n– sno garnet om næste maske (dvs. den første m på den anden side af hoftemarkøren),\n– vend strikketøjet\n– strik hen til omgangens start og videre hen til den anden hoftemarkør\n– sno garnet om næste maske (ligesom ovenfor)\n– vend strikketøjet igen, og strik tilbage til omgangens start\nVendepinden er nu slut, fortsæt således:\nSkift nu til en pindestørrelse 1 pind under den, du bruge til at opnå strikkefastheden. Så strikker du således:\n* 3 r, 1 vr, 1 r, 1 vr, 1 r, 1 vr*. Gentag mellem * og * hele omgangen.\nStrik således over i alt 7 omgange (=2,5 cm).\nHvis du ønsker at tilføje vendepinde, tilføjes den anden her. Der strikkes som maskerne viser (ret over retmasker og vrang over vrangmasker).\nLav en enkelt vendepind ved at strikke fra hoftemarkør til hoftemarkør og tilbage igen (se tips under Vendepinde). Vendepinden er nu slut.\nSå fortsætter du således:5 r *1 vr, 7 r*. Gentag imellem * og * indtil der er 3 m tilbage, og strik så 1 vr, 2 r.\nStrik således over alt 7 omgange (=2,5 cm).\nHvis du ønsker at tilføje vendepinde, tilføjes den tredje her. Der strikkes som maskerne viser (ret over retmasker og vrang over vrangmasker).\nSkift til den pindestørrelse, du brugte til at opnå strikkefastheden.\nFortsæt med at strikke i ret, indtil blebukserne måler 12,7 [14: 15,2: 16,5: 16,5] cm fra opslagskanten.\n(hvis du har tilføjet vendepinde, skal dette mål tages på blebuksernes FORSTYKKE, ikke bagstykket hvor vendepindene er).\nNu lukkes der af i hver side ved hoftemarkørerne:\n– Strik fra starten af omgangen (midt bag) og hen til første hoftemarkør (højre hofte). Luk 5 m af efter markøren.\n– Strik til 5 m før den anden hoftemarkør (venstre hofte), luk 5 m af.\n– Strik resten af omgangen.Lad m til forstykket hvile (det er dem, hvor der IKKE er den maskemarkør, der markerer omgangens start), evt. på en maskeholder/stor sikkerhedsnål.\nStrik fra starten af omgangen og hen til de aflukkede m (højre hofte), men strik de sidste 2 m: 2 r sm.\nVend (uden af sno om), så du nu har vrangsiden mod dig.\n1. p: Strik vr\n2.p: 2 dr r sm, strik til slutningen af pinden, 2 r sm.\nGentag disse to pinde til der er 18 [18, 20, 20, 20] m tilbage. Lad disse m hvile på én pind (evt. på en maskeholder/stor sikkerhedsnål).\nFortsæt med forstykket, det er maskerne på sikkerhedsnålen.\nSæt garnet til og strik til der er to m tilbage, 2 r sm. Vend så du har vrangsiden mod dig.\n1.p: Strik vrang\nGentag disse to pinde, til der er 18 [18, 20, 20, 20] m tilbage.\nMål benåbningen hele vejen rundt langs kanten og fortsæt i glat uden indtagninger til benåbningen måler 23 [25,5: 28: 30,5: 33] cm.\nSæt maskerne på én pind.\nAflukning over 3 pinde\n(det lyder kompliceret, men er faktisk ret enkelt, når man er kommet i gang med det):\nAlle masker strikkes ret!– Vend blebukserne på vrangen.\n– Hold de to pinde med maskerne fra forstykker og bagstykket i venstre hånd (altså som om det var én pind).\n– Tag nu den første m på den ene pind og den første m på den anden p, og strik begge m samtidig, som om det var én m.\n– Strik den næste m (på begge pinde) på samme måde.\n– Du har nu to m på højre p. Luk af i alm. aflukning ved at trække den første m over den anden.\nFortsæt således, altså: Strik næste m på begge p, som om det var én m, og luk derefter én m af på højre p. Fortsæt således indtil alle m er lukket af.\nSaml et lige antal m op omkring benåbningen til manchetter med strømpepinde. Der er ikke noget fast antal, du skal samle op. Du samler bare op, så der er lige så langt mellem hver maske, som på resten af strikketøjet.\n(Men hvis du vil have en tommelfinger-guide, plejer jeg at samle følgende antal m op:\nNB: 24 m\nS: 28 m\nM: 32 m\n(L og XL følger når jeg har fået strikket i de størrelser)).\nJeg foretrækker en ribkant på 2,5 cm i 1 r, 1 vr rib med mindre størrelse pinde (f.eks. den samme størrelse som blev brugt til taljebåndets rib). Det giver en tæt og sikker pasform.\nMen du kan gøre hvad du vil, f.eks. flæser (saml et passende antal m op, strik et par omg. rib. Slå derefter 2 m op i hver m på en omgang, og strik et par omgange uden udtagninger, inden du lukker af), eller strikke helt i ret, som giver en rullekant.\nDamp dine blebukser, hvis du vil. Det udjævner maskerne, så det strikkede bliver mere jævnt at se på.\nDet gør man således: Tag et viskestykke, læg det over det strikkede og stryg ovenpå viskestykket det med et dampstrygejern (jeg strikker f.eks. vrangpindene lidt løsere, og det resulterer ofte i “riller”, dampningen fjerner dem helt ).\nSå er de klar til brug.\nÆndringer i forhold til originalopskriften\n– Jeg har skrevet forklaringer og beskrivelse på forkortelser, pinde, garntype, hvordan man måler/beregner hvilken størrelse man skal bruge og hvordan man laver vendepinde.\n– Ved indtagningerne mellem benene: I stedet for at strikke to masker sammen på alle pinde (hvor man bruger “ssp” på vrangpindene), har jeg valgt at strikke 2 r sm i den ene side og 2 dr r sm i den anden side på retpindene, og strikke ren vrang på alle vrangpinde. Det er fordi jeg synes, at ssp ikke er særlig god i Kontinental Strikning (som danskere bruger). Den bliver noget omstændelig og giver et hul. Den egner til bedre til Engelsk Strikning (som amerikanere bruger).\n– Jeg bruger strikket aflukning i stedet for syet, da jeg synes at det bliver pænere (og mindre klumpet).\nSå det er altså Curly Purly opskriften med mine ændringer/forbedringer og uddybende kommentarer.\nHvis du ønsker at strikke den oprindelige opskrift strikkes der ved indtagningerne på for- og bagstykke 2 r sm de sidste to m på retsiden og “ssp” (se på nettet) de sidste to m på vrangsiden. Desuden lukkes for- og bagstykket almindeligt af og sys sammen bagefter.\nPubliceret med tilladelse fra designeren\nCurly Purly blebukser samt variationerGratis strikkeopskrifter\nRuths Undertrøje med tilføjne angivelser for størrelse 1-3 år\nTak for opskriften… Den må jeg prøve!!


Atlantsammenslutningen har udarbejdet en række videopodcasts for at øge forståelsen for de helt store grene af international politik. Derudover skal disse videopodcasts give mulighed for fordybelse inden for emnet.\nDisse videopodcasts er bl.a. velegnede til gymnasielæreren, der ønsker et input i undervisningen af fagligt højt niveau; til den universitetsstuderende på bacheloruddannelsen; og til den, der er interesseret i international politik.


Revisor Mikael Hansen er rettet og specialiseret mod selskaber (ApS, A/S og IVS) og enkeltmandsvirksomheder og har til formål at give en personlig oplevelse og en tæt dialog om dit regnskab og din økonomi. ...\nLæs mere om Revisor Mikael Hansen ApS\nThorvald Bindesbølls Plads 8\nAlba Økonomi v/Martin Pedersen\nAlba Økonomi (tidl.:Bagsværd Erhvervsservice ApS) er en lille servicevirksomhed, der gennem mere end 20 år har løst alle opgaver indenfor virksomhedsadministration I Københavnsområdet og på Sjælland....\nLæs mere om Alba Økonomi v/Martin Pedersen\nØstre Teglkaj 8 (Husbåd)\nJeg kan varetage hele regnskabsfunktionen fra den daglige bogføring, herunder kreditor-/debitorstyring, afstemning, lønadministration, månedlige rapporteringer, momsregnskab, klargøring af årsregnskab til revisor samt kontakt til alle relevante samarbejdspartnere eksternt og internt\nLæs mere om Hasforth Consulting\nGl. Kongevej 5C\nRegnskabsmusen er den flittige mus der fikser regnskaberne, og ´musen´ der inspirer og vejleder indenfor regnskab i en holistisk kontekst Kig in forbi: www.regnskabsmusen.dk\nLæs mere om REGNSKABSMUSEN\nHF Engvang 29\nBogføring og afstemninger til revisor og årsregnskab. Momsregnskab og -indberetning, EU-salg, Intrastat Debitor- og Kreditorbogholderi Løn og gager\nLæs mere om regnskabsservice.net\nVi tilbyder at: ...\nLæs mere om Talselskabet ApS\ninger boye aps\nVi beskæftiger os primært med rådgivning og bogføring for iværksættere samt mindre virksomheder. Vi tilbyder også undervisning i finansbogføring i e-conomic samt i regnskabsforståelse og regnskabsanalyse.\nLæs mere om inger boye aps\nSvanevænget 1, st.th.\nL J Regnskab er en enkeltmandsvirksomhed, der tilbyder bogføringsassistance til små virksomheder. Jeg forsøger at tilbyde en så fleksibel løsning som muligt, så din hverdag lettes så meget som mulig. Jeg tilbyder at stå for virksomhedens bogføring. Du kan som kunde stort set selv bestemme hvor og...\nLæs mere om LJ Regnskab\nVermlandsgade 51, 2.sal\nQualiTal v/Maria Seung Mogensen\nLæs mere om QualiTal v/Maria Seung Mogensen\nc/o Maria Seung Mogensen\nVi hjælper kunde i hele Danmark med daglig bogføring til meget små penge...\nLæs mere om Regnskabshuzet v. Karina Nielsen\nBogføringsopgaver -hel eller delvis. Enten fra eget kontor eller ude hos kunden. Hjælp til opstart af - eller oprydning i -dit bogholderi Debet eller kredit ..... hvorfor ? Hvad skal jeg bruge det til ?\nLæs mere om Skjoldemose Regnskab\nBorups Allé 16. 2. Th\nLæs mere om AKKURA\nJens Otto Krags Gade 20 st.tv.\nJeg hjælper med alt det praktiske ved start af virksomhed, stiftelse af selskab, moms- og skatteregistrering, oprettelse af regnskabssystem. Efter behov varetager jeg bogføring, lønafregning eller assisterer med gennemgang hvis du selv ønsker at at medvirke ved bogføring. Jeg udarbejder færdigt...\nLæs mere om Peter Villumsen ApS\nDin Freelance Bogholder v/Marianne P. Madsen\nFakturering Kreditor Debitor Daglig bogføring Bankafstemning Løn\nLæs mere om Din Freelance Bogholder v/Marianne P. Madsen\nJeg har igennem 10 år arbejdet med e-conomic.dk, som i mine øjne er det mest brugervenlig regnskabsprogram der findes....\nLæs mere om LH Administration\nLemberggade 22, 2. Th\nMit speciale er mindre virksomheder der ønsker en personlig og nærværende bogholder....\nLæs mere om BC Accounting\nMX-Regnskab i København er revisor og bogholder for virksomheder, der primært er i København og Storkøbenhavn. Udover kontoret i København har vi også et kontor i Århus. Vores kontorer arbejder tæt sammen og derfor mener vi, at vi kan tilbyde dig en god løsning. Vi beskæftiger os med bogføring,...\nLæs mere om MX-REGNSKAB S.M.B.A.\nHvis du har brug for hjælp til bogføring i e-conomic eller andre administrative opgaver i dit firma, er du kommet til det rette sted. ...\nLæs mere om PC & Økonomi v/Stig Andersen\nFrimestervej 61, 2 th\nVirksomheder ønsker overblik og kontrol over de forretningsmæssige, administrative og tekniske opgaver. Desuden ønsker man en sparringspartner, hvor man kan drøfte virksomhedens udfordringer og muligheder. Via faglig rådgivning, sparring, grundighed og overblik assisterer vi virksomheder til at...\nLæs mere om plusADMIN\nNjalsgade 76, 4sal - Univate


Hvordan at vide, hvilken producent lavet bruseren ventilen / Shareoflancaster.com\nSådan får du den franske grå hvidtekalk Provincial kig på møbler\nHvornår bruger du koblinger vs fagforeninger i en svejset & gevind rør?\nKøling Tower Tutorial\nEnkel slange Roller instruktioner\nSådan lå parket gulvfliser\nTE fejlkode på en LG vaskemaskine\nHvordan Sloan Flush ventiler arbejde\nVVS problemer få ofte dyre hurtigt hvis de ikke er repareret i tid. Erstatte et brusebad ventil er nogle gange mere udfordrende, hvis du ikke ved, hvem gjorde det oprindelige niveau. Ventiler er lille nok, at de normalt ikke har fuld firmanavne eller logoer på dem. Som et resultat, kræver vide, hvilken producent lavet din bruser ventil nogle undersøgelser.\n•Undersøg ventilen for enhver at identificere farver eller mærker. Noget særprægede hjælper til at identificere producenten af det.\n•Tag ventil til en hardware- eller VVS butik og bede arbejderne der om de genkender den og kan fortælle dig, hvem gjorde det. De matcher det med andre ventiler, de har på lager og se om de finder en dublet med virksomhedens navn på pakken.\n•Opkald din udlejer, hvis du bor i en lejlighed. Udlejeren kan vide hvem gjorde ventiler eller hvilket selskab du kontakter for at finde ud af sikker.\nDyrknings når dit hjem eller lejlighed blev bygget. Mens dit brusebad ikke kan have den oprindelige ventil fra byggeri stadig i det, hjælpemidler vel vidende den almindelige periode du lokalisere mulige producenter.\n•Spørg en blikkenslager, der er lokale til dig. Blikkenslageren kunne vide, hvilke mærker bruges typisk i området og det hjælper med at indsnævre din søgning.\nHvordan at vide, hvis vand ventilen til ismaskinen er slukket?


Ungkom Nord Bureaucrawl | Djøf\nUngkom Nord Bureaucrawl\nDen 3. oktober afholder Ungkom Nord et bureaucrawl med kommunikationsvirksomhederne Det Nye Sort og Konxion, der begge tilbyder kreative og moderne kommunikationsløsninger. Virksomheder vil holde oplæg med fokus på arbejdsopgaver, medarbejderkompetencer og hverdagen i en kommunikationsvirksomhed.\nOnsdag den 3. oktober afholder Ungkom Nord et bureaucrawl, hvor studerende vil få muligheden for at få et indblik i to kommunikationsvirksomheder; Det Nye Sort og Konxion. Begge virksomheder er særligt udvalgte til vores arrangement, fordi de tilbyder kreative og moderne kommunikationsløsninger. Virksomhederne vil hver især holde et oplæg, hvori de vil fortælle om dem selv, deres medarbejdere, hverdagen som kommunikationsbureau og give eksempler på konkrete cases, som de har arbejdet med. Arrangementet er tiltænkt kommunikationsstuderende eller studerende med interesse for kommunikation, da arrangementet vil give et indblik i det kommunikative erhvervsliv og karrieremuligheder både under og efter studiet, som resultat af en nyetableret kontakt mellem deltagerne og virksomhederne.\nKl. 15.30 Registrering af deltagere og velkomst ved Ungkom Nord\nKl. 16.00 Oplæg ved Det Nye Sort\nKl. 17.00 Afslutning ved Det Nye Sort\nKl. 17.05 Fælles gang fra Det Nye Sort til Konxion\nKl. 17.30 Oplæg ved Konxion\nNår du tilmelder dig et [arrangement/netværk] hos Djøf, har vi brug for nogle oplysninger om dig. Vi behandler dine oplysninger i overensstemmelse med lovgivningen. Læs mere i Djøfs Privatlivspolitik her.


Radisson Collection Hotel, Royal Copenhagen - Konference.dk\nVelkommen til Radisson Collection Royal Hotel – et femstjernet hotel og vartegn for dansk arkitektur og design. Hele hotellet er designet af den berømte danske arkitekt, Arne Jacobsen – helt fra den yderste facade til lobbyen med de graciøse stole; Svanen og Ægget. Arne Jacobsen var en af Danmarks største arkitekter i det 20. århundrede. Med sit alsidige talent vandt han både national og international anerkendelse. Arne Jacobsen mestrede alle elementer i den arkitektoniske proces, fra de store linjer til de små detaljer.\nKonstruktionen af Radisson Blu Royal Hotel begyndte i 1956. Fire år senere, den 1. Juli 1960 var ”Royal Hotel” klar til at modtage sine første gæster. Med sine 20 etager blev ”Royal Hotel” kaldt ”Landmark of The Jet Age”. Den arkitektoniske opmærksomhed for detaljer i forhold til funktionalitet og valg af materialer i det overordnede design såsom i mindre individuelle objekter, var meget beundringsværdigt.\nHvert værelse på hotellet var bevis på de omhyggelige detaljer i Arne Jacobsens design.\n“Royal Hotel” blev bygget til Københavns internationale gæster. Det sendte signaler af elegance og afdæmpet luksus i en atmosfære, der karakteriserede den skandinaviske stil. Hotellet repræsenterede enkelthedens sejr – samtidig med, at det var det mest moderne og sofistikerede hotel i verden. Hotellet er igang med en omfattende renovering af hele hotellet. Møde – og konferenceafdelingen, lobbyen og legendariske restaurant Café Royal samt halvdelen af værelserne er helt nyrenoveret i 2017.\nBe the first to review “Radisson Collection Hotel, Royal Copenhagen” Annuller svar


Debat: Symbolpolitik at love rent vand ved at forbyde landmænd | Maskinbladet\nAf Fagchef Bente Andersen Bæredygtig Grundvandsbeskyttelse - 12. apr. 2021 kl. 13:40\nBæredygtig Grundvandsbeskyttelse: Så flyt dog boringerne, sådan som folketingets partier har opfordret til.\nBoringsnære beskyttelsesområder - i daglig tale BNBO - blev vedtaget for år tilbage med henblik på at beskytte grundvandet mod forurening dér, hvor drikkevandsboringer finder sted.\nI "Aftale om Pesticidstrategi" kan man læse hvorledes den daværende regerings og næsten samtlige resterende partiers målsætning og beslutninger for at opretholde pesticidfrit drikkevand skal føres ud i livet.\nKommunerne skal i praksis udføre kontrollen i henhold til følgende passage i strategien:\n" I fase 1 pålægges kommunerne frem til og med 2022 at gennemgå alle BNBO på landbrugsjord og BNBO på øvrige arealer, hvor der anvendes pesticider til erhvervsmæssige formål, mhp. at vurdere behovet for yderligere indsatser som fx at flytte boringen eller at indgå aftaler om pesticidfri drift, stop for dyrkning af jorden eller egentligt opkøb af jorden."\nDe seneste 10 år har det været lovpligtigt, at udlægge en 25 meters sprøjtefri beskyttelseszone rundt om alle drikkevandsboringer.\nUtvivlsomt alt sammen beslutninger ud fra en nobel kongstanke om at sikre alle danskere og kommende generationer rent drikkevand.\nFaktum er imidlertid, at godkendte pesticider anvendt på dyrkningsfladen ikke udgør en trussel imod drikkevandet. Ikke én eneste boring er de sidste 20 år sløjfet på grund af pesticidanvendelse på dyrkningsfladen. Det er imidlertid bl.a. det offentliges anvendelse af totalherbicider, der har ført til sløjfninger. Hvorfor fortæller myndighederne ikke den reelle årsags sammenhæng til danskerne?\nDanskerne skal have rent drikkevand - også vore efterkommere. Det kræver imidlertid en helt anden grundighed end den holdningsmæssige fremgangsmetode, man benytter sig af ved at sætte kikkerten for det blinde øje for alle de andre stoffer, vi udleder i vores samfund. Der er utallige andre forureningskilder.\nDet er helt skørt at private og det offentlige må anvende pesticider uden for dyrkningsfladen, samtidig med at landmænd ikke må anvende dem på dyrkningsfladen.\nI Danmark har vi det skrappeste afprøvningssystem og godkendelsessystem for pesticider, der anvendes på dyrkningsfladen. Landmænd har gennemgået et stort pensum og bestået eksamen i anvendelse af pesticider.\nHvert fjerde år skal landmanden gennemføre obligatorisk efteruddannelse for fortsat at måtte indkøbe og anvende pesticider. Landmanden skal på markniveau føre sprøjtejournal, dvs. han skal dokumentere dato og mængde for hver eneste middel han bruger.\nBiocider bliver til pesticider\nVidste du for eksempel, at når pesticider bliver blandet i maling og træbeskyttelse, så hedder de biocider. Så er det samtidig helt andre regler der gælder.\nI 2014 udgjorde biocider 70.780 tons, mens plantebeskyttelsesmidler udgjorde 49.685 tons. Når rester af biocider findes i grundvandet bliver de betegnet som pesticider.\nTabel: Arbejdstilsynet: Farlige kemikalier i Danmark.\nDet er et falsum og symbolpolitik at bilde danskerne ind, at de får rent drikkevand, ved at forbyde landmænd at sprøjte med pesticider. Pesticiderne udgør under 3 promille af de kemiske stoffer, der bliver anvendt i det danske samfund.\nDét man skal gøre, hvis man reelt vil sikre drikkevandet, er at etablere drikkevandsreservater, hvor den menneskelige aktivitet bliver reduceret til et minimum. Mulige områder til formålet skal fuldstændig kortlægges, og gamle punktkilder såsom lossepladser, vaskepladser og industrigrunde bør alle fjernes og renses op.\nI vores daglige kontakt med landmænd, der bliver mødt af krav om BNBO og indsatsplaner er det hovedrystende at se, hvordan de skal undlade at anvende pesticider, alt imens der ingen krav er til private på naboparceller. Stærkt trafikerede veje går igennem områderne med nedsivning af vejsalt og partikler fra bildæk i grundvandet til følge. Der findes punktkilder i indvindingsoplandet osv. Det er himmelråbende, at en sådan tilgang kan finde sted i et såkaldt oplyst samfund som det danske. De stoffer i Danmark, hvis miljømæssige og biologiske påvirkning er allerbedst undersøgt, vil man forbyde,\nBrug dog beføjelsen\nHar kommunerne simpelthen ikke læst hvad, der står i strategiplanen?\nSom det fremgår af uddraget fra "Aftale om Pesticidstrategi" er det i allerhøjeste grad også pålagt kommunerne, at undersøge muligheden for at "flytte boringen".\nKommunerne har således misforstået den egentlige tanke bag BNBO. Der skal ikke drages konklusioner på forhånd. Hvert BNBO skal gennemgås for sig.\nDer er dog også enkelte eksempler på at en kommune spiller efter reglerne.\nIndenfor Holbæk kommune ligger Knabstrup Gods. Kommunen har udført risikovurdering mht. regelret anvendelse af godkendte pesticider på godsejerens jord og konstateret, at "der ikke er behov for yderligere beskyttelse af grundvandet inden for matriklen..." og at han "...fortsat må anvende pesticider på sin jord indenfor BNBO".\nMed andre ord - denne kommune har fattet budskabet og er et godt eksempel til efterfølgelse for andre kommuner.\nDet kan altså lade sig gøre at læse grundigt på tingene, foretage en risikovurdering og hvis ellers at 25 meters zonen er overholdt afstå fra at genere landets lodsejere yderligere.\n12. apr. 2021 kl. 13:40