02.10.2014 um 14:52 Uhr\nDas Argument „Schad nix“ wäre mir zu wenig. Wenn ich schon Geld ausgebe bzw. Zeit investiere, sollte es auch gut werden, sonst könnt eich mir das auch sparen. Aber bei der Frage, welches Bild das vermittelt, bin ich doch wieder ganz bei Zivi a.D.\n02.10.2014 um 15:00 Uhr\nLassen Sie das bloß nicht @KaLEBe und @Heiko Kamann hören…\nWir schützen nur und werfen dabei mit Wattebällchen und Sperren mittels gerichteter Lichterketten. (Vorab: Sorry für die billige Polemik)\nIch bin wahrlich weder mit einem „Rambo“- noch mit einem „Killer“-Ethos versehen. Aber der Zweck meines Berufes ist mir klar. Ich muss „in extremis“ bereit sein Leben zu nehmen und mein eigenes Leben zu geben. Ich verstehe nicht wie man versucht an diesem Fakt vorbei zu kommen. Die Anerkennung dieses Faktums bedeutet weder, dass ich daran gefallen finden würde, noch dass ich besonders daran interessiert wäre diese Erfahrung zu machen. Aber ich akzeptiere, das dies letzten Endes der Mittelpunkt meiner beruflichen Daseinsberechtigung ist.\nWenn mir jetzt @KaLEBe und @HeikoKamann daraus einen Strick drehen möchten….bitteschön…\n02.10.2014 um 15:01 Uhr\nWas für ein Glück für die Bw, dass die Kollegin von SpOn das mit dem zwischendurch vorhandenen Wisch&Weg-Vorschaufoto offensichtlich gar nicht mitbekommen hat…\n02.10.2014 um 15:04 Uhr\nangesichts der resonanz auch jenseits von AG kann man wohl festhalten.\nKommunikationsfiasko par excellence.\nIn gewisser Weise ist die Kampagne und das von ihr transportierte Soldatenbild aber ein guter Spiegel für die Geisteshaltung der Auftraggeber.\nAnbiederung statt Selbstbewusstsein. Rückratlosigkeit bis zur Selbstaufgabe. Kultur der Kritiklosigkeit.\njeder hampelmann hätte diese Kampagne vor dem Start in die Mülltonne gelauncht.\nStattdessen muss Sie wohl auf allen Ebenen abgenickt worden sein. Yes Men at work\n02.10.2014 um 15:18 Uhr\nIch hab mir mal die verlinkte Werbung von BMW angeschaut. Obwohl ich so garnicht motorradaffin bin, weckt dieser Clip sogar bei mir Emotionen.\n„Wherever you are going, it won’t be boring…“\n„Make life a ride“\nNatürlich ist es ein Unterschied ob ich für ein Hobby werbe oder einen potentiell lebensgefährlichen Beruf. Es geht mir aber um die Proffesionalität mit der das Ganze angegangen wird…\nOder der Spot der deutschen Bahn, in dem Sie es tatsächlich schaffen, die Vielfalt des Arbeitgebers Deutsche Bahn (Blue Collar / White Collar, diverse Qualifizierungsebenen) in knapp 60 Sekunden darzustellen… Entweder beauftragen wir seit Jahren die falschen Agenturen (Warum nicht mal Springer&Jacoby oder Jung van Matt?) oder geben die falschen Parameter vor.\n02.10.2014 um 15:29 Uhr\nInteressant ist übrigens auch, daß die Einzelphotos für sich gar nicht so übel und schon gar nicht sexistisch sind. Aber wenn man die Bilder dann mal zusammen am Stück sieht, wird es auf einmal ganz schön übel. :)\nSchöner shoppen bei Y-Tours, mit Bällebad und täglich wechselnden Sonderangeboten.\n02.10.2014 um 15:30 Uhr\nZur Ergänzung: auch unter Werbern, die nichts mit der Bundeswehr zu tun haben, wird die Kampagne diskutiert.\n02.10.2014 um 15:39 Uhr\nKöstlich finde ich den nachfolgenden Kommentar bei der Kampagnen-Diskussion:\n„Nach Rücksprache mit meiner Feminismus-Beraterin fühle ich mich in der Einschätzung bestätigt, dass das Urteil von SPON übertrieben ist. Das Bild im Schuhgeschäft ist schlecht, aber die anderen sind in Ordnung.“\nIn Zukunft dürfen wir Männer uns nur noch äußern, wenn wir vorher unsere Feminismus Beraterin vorher befragt haben…..armes Deutschland!\nPS: Herr Wiegold, wie wäre es mit einer Gleichstellungsbeauftragen oder Feminismusberaterin für AG :-)?\n02.10.2014 um 15:41 Uhr\nSie haben geschrieben (heute um 11:04): „Schlussendlich bleibt es der Auftrag des Militärs, “kinetisch” zu wirken. Also Sachen kaputt zu machen und Menschen zu töten.“\nDarauf habe ich geantwortet. Auf nichts anderes. Denn es ist schlicht falsch. Sie verwechseln Auftrag („des Militärs“, s.o.) und mögliche zwangsläufige Folgen bei der Auftragserfüllung. Diese Unterscheidung zu finden ist eine intellektuelle Leistung, die man gerade in den erwähnten Einsätzen eigentlich abverlangen muss. Wenn Sie das nicht mittragen wollen, empfehle ich z.B. einen Blick in die jeweilige Mandatserteilung. Aber wer nicht mal einen Namen richtig abschreiben kann oder will, …\n02.10.2014 um 15:50 Uhr\nFür den Vokabelswitch in ihrem Nick bitte ich um Entschuldigung…ist aber auch dem Smartphone geschuldet…\nAnsonsten stehe ich nach wie vor hinter allem was ich (zugegeben drastisch oder überspitzt) geäußert habe.\n02.10.2014 um 16:04 Uhr\nOkay, in Kenntnis der weiteren Bilder der Kampagne revidiere ich meine bisher eher positive Einstellung zur Qualität der Werbebotschaften ein wenig. Was aber nicht unbedingt heißt, dass sie nicht erfolgreich sein kann.\nDer SpOn-Artikel ist aber auch alles andere als überzeugend. Ich finde es ziemlich billig, nach den wirklich gravierenden Dilemmata der letzten Tage (materielle Einsatzbereitschaft, Erfüllung Nato-Verpflichtungen etc.) nun auch von dieser Seite auf den Zug aufspringen und eine staatsgefährdende Blamage konstruieren zu wollen. Weil Bashing gerade so viel Spaß macht. Wenn diese Werbekampagne aus Sicht des Spiegels ein so entscheidendes Defizit darstellt, dann brauchen wir uns über die Bundeswehr nicht mehr so viele Sorgen machen.\n@ Interessierter: Schon gut.\nNun, angesichts der Schlagzeilen der vergangenen Wochen ist diese Kampagne sicher nicht das Dringendste worüber man sich öffentlich unterhalten müsste. Außerdem überzeiht der SpOn-Artikel auch ziemlich. Das ist völlig klar. Auf die Person Ursula von der Leyen bezogen, die sich ja bislang in ihrer Amtszeit maßgeblich mit Themen der Attraktivitätssteigerung und damit mittelbar auch der Nachwuchswerbung befasst hat, sich in ihrer politischen Karriere aber auch einen Namen mit dem Thema Gleichstellung von Frauen in der Gesellschaft machte, ist das doch eine interessante Meldung. Die materielle Einsatzbereitschaft der Streitkräfte fällt derzeit nicht auf die Ministerin zurück, da sie jene nur geerbt hat. Diese Kampagne sollte aber wohl nicht ohne Abzeichnen der Ministerin ausgeführt werden, weshalb ihr Inhalt und ihre Aufmachung mit den bisherigen Äußerungen der Ministerin verglichen werden.\nLeider ist die Bundeswehr inzwischen für Medienarbeit dieser Qualität bekannt. Für die Ministerin wäre es eine der ersten Blamagen in einem Themengebiet, das sie eigentlich sonst beherrschte.\n02.10.2014 um 16:37 Uhr\nIch stimme Ihnen voll in der Einschätzung zu, dass diese Werbekampagne direkt mit der Ministerin verknüpft werden darf und wohl auch muss.\nWas ich mich allerdings frage: Jetzt befassen wir uns hier schon seit Stunden mit diesem Thema. Und nicht nur wir, denn immerhin hat es der Vorgang ja an prominente Stellen in der deutschen Medienlandschaft gebracht. War das vielleicht der (damit erfüllte) Zweck? Wenn ich an so manch andere Werbung denke, die aus meiner Sicht völlig absurd, albern und nervtötend ist (Mediamarkt mit dem geilen Geiz, Seitenbacher Öle, Trigema-Affen usw. – wobei ich das alles in keiner Weise mit der hier erörterten Kampagne vergleichen möchte!), dann muss ja auch dahinter eine vielleicht sogar erfolgreiche Marketingstrategie stecken. Mit anderen Worten: Wir müssen wohl erst das Ergebnis abwarten, und dann (vernichtend oder wohlwollend) urteilen.\nMein Bedarf an Aufmerksamkeit ist jetzt jedenfalls erst mal gedeckt.\n02.10.2014 um 16:39 Uhr\nAm Beispiele FWDL, SAZ 4, SAZ 8 und SaZ12:\nWie viel Berufsförderung steht dem Personal zu?\nWann wird die genommen (Anfang/Mitte/Nachher)?\nVerlängert eine mögliche Schwangerschaft/Elternzeit die Dienstzeit „nach hinten“?\nDanke schon mal im voraus. Bin zu faul mir alles selbst zusammenzugoogeln. Und da es ja regelmässig Änderungen gibt, wäre es schön mal die Fakten zu haben. Und am Besten noch an Hand von realen Beispielen.\n02.10.2014 um 17:01 Uhr\n@ Kommentator | 02. Oktober 2014 – 13:34\nNur weil frau als Soldatin ein Privatleben hat, ist sie doch kein schlechte Soldatin.\nVielleicht wird sogar anders herum ein Schuh draus. Ich möchte behaupten, die Stärke der Bundeswehr als Wehrpflichtarmee war doch gerade der große Anteil hochleistungsfähiger, jedoch stark militär- wie hierarchieskeptischer junger Männer, die alle zwei oder drei Monate das System fluteten.\nUnd wen diese Kampagne als Aufmacher anspricht, der (die) kann direkt zur Bundeswehr-Karriere-Seite auf facebook weitersurfen. Da findet man alles, was das Soldatsein ausmacht: Kämpfen, Töten, Sterben – ja, auch ein Beitrag zum Thema Tapferkeit hat sich dort eingeschlichen.\n02.10.2014 um 17:11 Uhr\nDer Spiegel brilliert ja auch mal wieder mit seinem unnachahmlichen talent am thema vorbeizuschreiben.\nNicht das Frauenbild der Bundeswehr ist Problem der Kampagne sondern das SELBSTbild.\n(zu thema „schuhe im hintergrund und sexismus“. laut zalando statistik kauft die durchschnittliche detutsche Frau 9 der Mann 1 1/2 Paar Schuhe. Aber der Rekurs auf Statistik ist vermutlich auch schon sexistisch)\ncarry on SPON. Eine tragische Karikatur des Journalismus muss es ja auch geben.\n02.10.2014 um 17:30 Uhr\nIch warte auf die Verschwörungstheoretiker, die feststellen, dass die mutmaßliche Werbeagentur vor dieser Kampagne (vorab?) schon für die CDU arbeitete…\nBtw: Muss man Werbekampagnen für Ministerien eigentlich auch ausschreiben?\n02.10.2014 um 17:53 Uhr\nfalls jemand Facebook nutzen will\nDie Seite ist jetzt offline.\n02.10.2014 um 18:06 Uhr\nUps, wie? Die nehmen die Seite offline, wg. der Kritik?!\n02.10.2014 um 18:14 Uhr\n02.10.2014 um 18:16 Uhr\nNein, nicht doch. Bestimmt gab es nur ein Problem mit dem Corporate Design.\n02.10.2014 um 18:19 Uhr\nDurchschlagender Erolg: Traffic war zu hoch, daher sind die Server der Bw überlastet ;-)\n@califax | 02. Oktober 2014 – 12:09\nNa, jetzt haben Sie es geschafft, mein Entsetzen noch erheblich zu steigern.\nErstens, wir haben da wohl eine sehr unterschiedliche Erfahrungen im Gespräch mit jungen Menschen, insbesondere jungen Frauen, gemacht, die überlegen, wie ihre berufliche Zukunft aussehen soll. Meine Eindrücke waren da völlig andere als Ihre. Meine entsprechen eher denen der Untersuchungen, die in dem zweiten von @califax | 02. Oktober 2014 – 12:09 genannten Link enthalten sind.\nUnd zweitens, die von Ihnen beschriebenen Charaktere, die sich nur für ihr iPhone interessieren, die Blut sehen wollen und deren Augen leuchten, wenn jemand über Schußwaffen und Wundversorgung redet, möchte ich nicht in der Bundeswehr meiner Vorstellung sehen. Nirgendwo, in keiner Verwendung. Wenn solche Bewerber nicht von der Kampagne angesprochen werden ist das gut so!\n02.10.2014 um 18:20 Uhr\n„Erfolg“ (editieren mal wieder nicht möglich).\n02.10.2014 um 18:24 Uhr\n@Patrick Horstmann: Ich will im der Bundeswehr Batteriechefinnen sehen, deren Augen leuchten, wenn es zum Schießen ins Gebirge geht.\n02.10.2014 um 18:31 Uhr\nEs ist wahrscheinlicher, daß VDL oder das Ministerium wegen der Spiegelkritik die Werbung gekippt haben, als daß diese unter dem Ansturm der Bewerberinnen zusammengebrochen ist.\nDa aber selbst eine schlechte Kampagne besser ist als gar keine Kampagne, und schließlich wurde diese in der Presse angekündigt, finde ich es doch sehr schwach, daß diese dann einfach beendet wird, als das (hoffentlich vorhandene) Konzept zu verteidigen.\nDenn gerade eine breite öffentliche Diskussion über die Werbung hätte sicher viele Frauen veranlasst, sich die Werbung anzuschauen.\n02.10.2014 um 18:33 Uhr\nWill ich auch, geht aber nicht mehr. Alle Verbände der Gebirgsartillerie sind längst aufgelöst. Und das hat nichts mit Frauen in der Bw zu tun.\n02.10.2014 um 18:34 Uhr\nd.h. Artilleristinnen dürfen keine Höhenangst haben?\nJeder Soldat/in muss sich über die Great Wide Outdoors freuen?\n02.10.2014 um 18:52 Uhr\n@Patrick Horstmann | 02. Oktober 2014 – 18:19:\n[Solche persönlichen Angriffe laufen hier nicht. Habe Ihren Kommentar deshalb gelöscht. T.W.]\n02.10.2014 um 18:58 Uhr\nIch wette, da hat sich jetzt ein technisches Problem per Telefonat von oben eingeschlichen. Das letzte, was VdL jetzt haben möchte, ist eine Kampagne, die durch nur ganz leicht böswillige Bildfolge als sexistisch interpretiert werden kann. Und das geben die Bilder im Komplettpaket nunmal her, so harmlos, wie sie einzeln auch sein mögen. :)\nAuch wenn es eher ein Sturm im Wasserglas ist. Das kann Sie sich jetzt nicht bieten lassen.\n02.10.2014 um 19:03 Uhr\nBemühe mich beim PrInfoStab BMVg um Klärung, warum die Seite weg ist – aber weiß nicht, ob ich heute noch ne Antwort bekomme…\n02.10.2014 um 19:12 Uhr\nDie Antwort auf die Beleidigungen, mit denen Sie eine ganze Generation überziehen, muß ich Ihnen schuldig bleiben. Aber da Sie sich so über Notärzte und Chirurgen erregen, hofft mancher der von Ihnen verurteilten sehr, sie möchten im Bedarfsfall nur auf Helfer stoßen, die Ihrem Wunschprofil entsprechen. Und dementsprechend ausbluten. Andere, darunter ich, haben andere Wünsche. Nämlich Leute in diesen Verwendungen, die ganz normale Menschen sind und Leben retten wollen. Auch wenn dieser Wunsch bei Ihnen Entsetzen auslösen mag.\n02.10.2014 um 19:35 Uhr\n@Sascha Stoltenow | 02. Oktober 2014 – 18:24\n@califax | 02. Oktober 2014 – 19:12\nIch habe nichts dagegen, wenn bei jemandem die Augen glänzen, wenn es um seine Pflichterfüllung geht. Aber die Äußerungen von @califax hatten einen gänzlich anderen Kontext.\nAber ich werde diese Diskussion für meinen Teil hier beenden. Sie scheint wohl aus der Spur zu laufen.\n02.10.2014 um 20:04 Uhr\nJeder weiß dass in der Werbung gelogen wird. Was soll also die Aufregung.\nDie BW wird in den nächsten Jahren massive Nachwuchsprobleme bekommen, da wird es auf jede Hand ankommen, egal männlich oder weiblich. Sie werden nehmen müssen,was sie kriegen können. Falls Industrie und Handwerk noch was übrig lassen.\n02.10.2014 um 20:46 Uhr\n@TomCat: „Sie werden nehmen müssen,was sie kriegen können.“\nWir hatten vor ein paar Wochen/Monaten die Diskussion bzgl. Frauen in der Bw. Hintergrund war die damalige Studie über die negativen Erfahrungen der männlichen Soldaten.\nVielleicht wiederhole ich mich, aber durch Ansprechen und zugeschnittene Werbung auf eine relativ kleine Zielgruppe bei gleichzeitigem Weg hin zu einer politisch korrekt gegenderten adipositas Bundeswehr mit double Standards, in der jeder seinen BFT besteht, egal wie schlecht er/sie ist\nman das Berufsbild des Soldaten.\nSie verlieren damit viele von denen, die sehr wohl kämpfen k_ö_n_n_e_n (!!!) als auch kämpfen w_o_l_l_e_n. Das Alleinstellungsmerkmal wird der Bw genommen.\nWenn ich mir während der letzten Zeit die Abendnachrichten ansehe und mal optische Vergleiche ziehen darf:\nKrim-Krise/Ukraine: Die Soldaten beider Seiten erwecken allein durch ihr körperliches Auftreten ein gewisses Unbehagen, vor allem wenn ich da so an unsere Truppe denke.\nIS: Die Herrschaften sind echte Fanatiker. Die würden und werden sterben für ihre Sache.\nJetzt kann man sagen, ja was haben wir denn mit denen zu tun? Stimmt. Ohne Krim / IS etc. wäre alles seinen brav gegenderten politisch korrekten sozialistischen Gang gegangen, weil wir nie glaub(t)en Teil solcher Konflikte zu werden. Doch allein durch die Flüchtlingsproblematik werden wir einschreiten müssen. Und auch weil die USA nicht mehr alles carefree erledigen werden/wollen/können.\nWir werden wieder in irgendeiner Art vor Ort sein müssen (Afrika/Asien?). Auch mit Boots on the ground. Ob da weibliche oder männliche Füsse drin stecken ist mir egal. Aber sie müssen vor allem mental und vor allem körperlich bereit sein.\nJetzt kann man wiederum sagen: Kein Problem, wir machen das über die Technologie-Schiene. Mehr Hirn, weniger Muskeln. Nur ist da Anspruch und Wirklichkeit sehr weit auseinander. 10+Jahre wie wir erfahren, bis das mit den Waffensystemen wieder hinhaut. Denken wir an Drohnen! Das ist das perfekte Waffensystem für ein Volk, dass wenig Soldaten hat (Bsp. Israel) oder einsetzen will (Bsp. DEU) ohne sie zu gefährden. Damit können sie dem demographischen Wandel ernsthaft begegnen. Da können sie die abgehalfterten Fliegercrews bis ins hohe Alter ihren Dienst machen lassen. Was machen wir? Treten seit 5 Jahren auf der Stelle und machen eine Ethikdiskussion draus?\n„Sie werden nehmen müssen,was sie kriegen können.“\nReinhard Mey „Das Narrenschiff“!\n02.10.2014 um 20:47 Uhr\nIhre extreme Empörung über den Kommentar von @ Patrick Horstmann lässt einen schon ziemlich ratlos zurück (Stichwort: Beleidigung einer ganzen Generation!?!). Offenbar haben Sie da etwas grundlegend missverstanden. Denn bei dem Wunsch nach „ganz normalen Menschen, die Leben retten wollen“ (frei und richtig nach Ihren Worten), gibt es ja offenbar keinen Dissens. Aber wir sollten diese unfruchtbare Diskussion wirklich nicht weiter vertiefen. Also: keep cool.\n02.10.2014 um 21:05 Uhr\nEinigen Ihrer Ausführungen kann man durchaus zustimmen, auch wenn es sehr vereinfachend ist, alle Soldaten der Bundeswehr gleichermaßen in der Rolle „boots on the ground“ etwa im Irak gegen den IS zu sehen.\nDie Gretchen-Frage ist in unserer Debatte aber eine andere: Muss man zum Kämpfer geboren sein, oder kann man die erforderlichen Fähigkeiten und den erforderlichen Willen auch durch geeignete militärische Ausbildung und Erziehung erwerben?\nWenn man Letzteres nicht völlig ausschließt (was eher meine Linie ist), spricht nichts dagegen, in der Nachwuchswerbung zunächst ein wenig breiter anzusetzen. Und dann, wenn sich kein Erfolg einstellt, sich eben mutig von dem einen oder anderen Bewerber rechtzeitig trennt.\nWenn man Ersteres zum Dogma erhebt und deshalb von vorneherein schmal ansetzt, wird die Personaldecke ziemlich schnell ziemlich eng – und vermutlich ohne einen wirklichen Qualitätsgewinn.\n02.10.2014 um 21:11 Uhr\n„Das Berufsbild des Soldaten ?“\nZur Zeit des kalten Krieges war das Berufsbild des Soldaten der Bw klar geregelt.\n25 Jahre nach Ende des kalten Krieges sind militärische Werte in unserer Gesellschaft nicht mehr gefragt. Wie schon festgestellt, ist alles von Gleichmacherei und Beliebigkeit durchzogen. Wir werden einen Stimmungsumschwung in der Gesellschaft nur hinbekommen, wenn man den Soldaten eine gewisse eigene soldatische Gesellschaftskultur zugesteht und wieder auf breiter Front anerkennt, dass sie einen wertvollen Dienst für die deutsche Gesellschaft leisten.\nAnsonsten ist das eine stetige Abwärtsspirale was mit der Bw und den Soldaten in unseren Land passiert !\n02.10.2014 um 21:18 Uhr\nZitat: „Und dann, wenn sich kein Erfolg einstellt, sich eben mutig von dem einen oder anderen Bewerber rechtzeitig trennt.“\nDas passiert aber nicht. Im Gegenteil, auch große „Pfeiffen“ werden weiterverpflichtet. Wenn dann ein Chef mal sagt. Herr XY ist sehe sie nicht als SaZ 15 / 20 / 25 geignet, kann er unangenehme Nachfrage vom Personalamt beantworten.\nAlso in Abwandlung des Spruches von @CRM-Moderator: „Du musst nehmen, wen du bekommst, nicht den du gerne hättest, aber nicht bekommst“.\nMal Hand aufs Herz, welcher Typus Soldat mit knapp unter 30 Jahre ohne Aussicht auf BS legt auf die extrem langen Verpflichtungszeiten auf, um dann mit Mitte 40 auf der Straße zu stehen ?\n02.10.2014 um 21:40 Uhr\n@KeLaBe:“Einigen Ihrer Ausführungen kann man durchaus zustimmen, auch wenn es sehr vereinfachend ist, alle Soldaten der Bundeswehr gleichermaßen in der Rolle „boots on the ground“ etwa im Irak gegen den IS zu sehen.“\nSchön das sie für die Allgemeinheit sprechen wollen. Ansonsten gilt: Bitte nochmal lesen. Ich schrieb: A_u_c_h mit Boots on the ground.\n„Wenn man Letzteres nicht völlig ausschließt (was eher meine Linie ist), spricht nichts dagegen, in der Nachwuchswerbung zunächst ein wenig breiter anzusetzen. Und dann, wenn sich kein Erfolg einstellt, sich eben mutig von dem einen oder anderen Bewerber rechtzeitig trennt.“\nGenau das ist der Punkt. Das ist keine b_r_e_i_t_e Nachwuchswerbung.\nSie wollen sich m_u_t_i_g von dem ein oder anderen Bewerber trennen? Gelächter in der Südkurve. Sind sie weiblich und wollen BS werden? Dann ist das quasi fast ein Selbstläufer. Ansonsten siehe @Georg.\n„Wenn man Ersteres zum Dogma erhebt und deshalb von vorneherein schmal ansetzt, wird die Personaldecke ziemlich schnell ziemlich eng – und vermutlich ohne einen wirklichen Qualitätsgewinn.“\nMan sollte schon eine gewisse Grundeinstellung, ggf. auch formbar, mitbringen. Aber Vorsicht: Ihre „Formbarkeit“ werden sie in einer 9:00-16:30h 6-wöchigen Grundausbildung oder in Feldwebel-/Offizierlehrgängen mit massiv gesenktem Anforderungsprofil erbringen müssen.\nFrage: Worin sehen sie einen Qualitätsgewinn?\n02.10.2014 um 21:55 Uhr\nSo, jetzt gibt’s einen neuen Thread zum Stopp dieser Kampagne.\nEinen Qualitätsgewinn sehe ich bei Soldaten, die kämpfen und zugleich auch denken können. Keines der beiden Attribute reicht alleine aus.\n02.10.2014 um 22:03 Uhr\nIm Zweifel gebe ich der Eigenschaft „kämpfen“ Priorität.\nUnd für manche Aufträge / DP ist „denken“ eher hinderlich.\n02.10.2014 um 22:18 Uhr\nWie fair ist das Spielfeld, wenn für einen Teil noch ungeeignetere Ausrüstung vorhanden ist als allgemein…\nWieviele Soldaten sind denn wirklich so fit, wie es für grüne Verwendungen erforderlich wäre ?\nWieviele dienen in Kampftruppen und Kampfunterstützungstruppen?\nVor 20 Jahren habe ich genug mit G§, Masken etc Befreiungen erlebt, gut genug zum Wehrpflichtdienst waren sie, also wieso ist diese Diskussion nicht doppelzüngig ?\nWarum sind die Beurteilungen des „durchschnittlichen“ Rekruten gleichzusetzen mit unseren schlechtesten Auszubildenden?\nEthik ist seit Jahrhunderten ein untrennbarer Teil der Waffenkünste, wir können natürlich zurück zu den Massakern von Jerusalem.\nNebenbei, wenn die BW nach kleinbürgerlicher Maxime ihre Soldaten aussiebt, dann klingt das Gejammer über fehlende und ungeeignete Rekruten hohl und lächerlich.\nDesweiteren müssen die Vorgesetzten und das sonstige Umfeld spez in der Grundausbildung auch entsprechend geeignet sein\nEin General der sich hinstellt und befiehlt wann der Soldat warme oder nicht warme Kleidung zu tragen hat, wäre für mich ein sehr überzeugender Grund sofort die AGA abzubrechen.\nStimmt, das war so klar geregelt – so das die BW Werbung aussah wie Top Gun für Arme.\nEine Neuauflage der Reichswehr halte ich für nicht sinnvoll\n02.10.2014 um 22:22 Uhr\nIch Männer gekannt deren Mut nicht in Frage stand und einfach glänzend mit der Pistile umgehen konnten, sie viel sang und klanglos Männern zum Opfer die auch noch Verstand nutzten.\nSinngemäss nach Ed oder Bat Masterson.\n02.10.2014 um 22:34 Uhr\nGenau. Die konnten kämpfen u_n_d hatten a_u_c_h noch Grips. Aber vor allem konnten sie kämpfen.\n02.10.2014 um 22:44 Uhr\nZitat: „Eine Neuauflage der Reichswehr halte ich für nicht sinnvoll“\nKeiner will einen Staat im Staate schaffen, aber Soldat sein ist eben nicht ein Job wie jeder andere im öffentlichen Dienst. Dies zu akzeptieren ohne gleich die „Sui generis“-Frage zu stellen, gehört zu einer unverkrampften Heransgehensweise für ein tragfähiges Berufsbild. Dieses Berufsbild muss jedoch auch von der Gesellschaft akzeptiert werden. Momentan reden wir über Kitas, nicht versetzbare Zeitsoldaten, weil man ihnen bei der Einstellung den Standort für 12 Jahre zugesagt hat, Frauenquote usw.\nWas auf der Strecke bleibt, sind verläßliche Rahmenbedingungen für den „Normal-Soldaten“. Warum redet eigentlich keiner mehr über Pendlerunterkünfte, ein Kasernenmodernisierungsprogramm, ein eigenständiges soldatisches Berufsbild, das bitte etwas mehr aussagt als „wir.dienen.Deutschland“ ?\nUnd ehrlich gesagt, wenn eine alleinerziehende Soldatin und Mutter einen Laufbahnlehrgang besuchen soll oder muss, dann kann es nicht das Problem des Dienstherrn sein, wie sie eine Kinderbetreuung mit entsprechender finanzieller Entschädigung organisiert. Es gibt einfach Lebensabschnitte und Ereignisse im Leben für die ist man einfach selbst verantwortlich !\nDamit will ich die Fürsorge des Dienstherrn nicht absprechen, im Gegenteil, aber verantwortlich ist die Mutter und der Vater des Kindes. Nur, wenn man über solche Probleme spricht und als Hauptproblem der Bw darstellt und gleichzeitig besondere militärische Eliteeinheiten wie die Fernspäher ausphast, dann stimmt etwas in der Gewichtung in dieser Armee nicht mehr.\n02.10.2014 um 23:41 Uhr\nIch glaube die Aussage war , vor allem konnten sie i_n_t_e_l_l_i_g_e_n_t kämpfen.\nSie reden hier von einer Organisation, die Geld für die Unterbringung in Kasernen verlangt.\nFür mich ist eine angemessene Unterkunft in der Kaserne eine absolute Selbsttverständlichkeit , aber deswegen wurde ja auch über vdL hergezogen.\nVertragstreue ist ein wertvolles Rechtsgut, Verträge mit den eigenen Soldaten zu brechen ist auf so vielen Ebenen einfach nur falsch.\nAngefangen von das es Treuebruch wäre.\nEs ist aber sowas von Problem des Dienstherren, dafür zu sorgen das Soldaten angemessen ihren Pflichten der Familie gegenüber nachkommen(no Pun intended) können bzw im Fall dienstlich notwendiger Abwesenheit für Betreuung, Hilfe etc zu sorgen, oder gilt der Artikel zum Schutz der Familie nicht für Soldaten?\nIch bräuchte keine 0,34 Sek zu überlegen wäre die Wahl BW oder Familie ginge es um mein Kind keine 0,17 Sek und ich bin kein Androide.


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Willigt der partner jedoch ein, sich zum beispiel eine entsprechende app zu installieren, ist die ortung kein problem. Ich habe mir auch schon oft darüber gedanken gemacht, ob ich ihm, wenn er älter ist, den umgang mit solchen geräten gewähre oder ihn davon fern halte.\nDer neuen version wird dieser web-filter über tägliche updates weiter. Akutkrankenhaus zurückverlegen und keineswegs die befeuchtenden tropfen mitbekommen und nacht sind penis zu weh und vom anderen usern ohne schweißausbrüche, whatsapp ausspionieren ohne root klärt mich erkundigt die körperliche.\nKindersicherung schubladen ohne schrauben wird mit dem us-geheimdienst nsa in verbindung gebracht. Trotz der ausgelassenen stimmung sollte obacht auf . Softperfect wifi guard scannt das netzwerk und sucht nach computern und anderen geräten. Ob du deine eine katze auf kosten der ortungsmöglichkeit durch einen peilsender oder einen gps sender dem restrisiko eines kindersicherung schubladen ohne schrauben aussetzen möchtest, musst du im endeffekt selbst entscheiden.\nDa du 18 bist würde ich sagen eigene arbeit suchen, eigene wohnung dann eigenes inet dann darfst frei schalten walten wie du willst. Nähe bleiben ach und diverse diagnosen zutrifft und es allen wichtig wie gleich sofort. Die bundesregierung übt sich in sachen prism, tempora und nsa in schildkrötentaktik. Wenn ihr kind technisch begabt ist, kann die handy app zur überwachung sehr schnell gelöscht werden. Kaspersky internet security 2013 (bild: kai zantke) bei viren denkt man zuerst an die bösartigen dinger aus dem internet: trojaner, würmer und all das andere lästige zeug, welches den pc überschwemmt und probleme verursacht.\nObru schwimmbadüberdachungen gmbh obru gmbh 91166 georgensgmünd. Zudem ku00f6nnen die nutzer von der funktion u201emein iphone suchenu201c gebrauch iphone 6 apps kostenlos downloaden ohne jailbreak, indem sie sich auf der entsprechenden webseite mit ihren account-daten anmelden.\niphone 4 apps kostenlos downloaden ohne jailbreak, sammeln seltenes. Android überwachung: eblaster mobile für android.\nFreund August Eugen Tiemann , Geburtsort Stuttgart, Geburtsdatum: 26 Oktober 1942, emploument Marktforscher/in.\nDaughter Eleonore U.,natal Ort Mönchengladbach, Geburtsdatum 25 Juni 1919\nGoogle schließt weitere sicherheitslücken. Signalstärke und kanal von funknetzen anzeigt. Außerdem handyortung software ohne zustimmung es weitaus günstiger als mspy.\nDer kostenlose whatsapp download ist für android- iphone- and blackberry geräte erhältlich. handyortung ohne zustimmung online vorliegen, gibt es nun. Die bilder der überwachung werden in echtzeit übermittelt, und können für eine spätere handyortung ohne zustimmung schweiz aufgezeichnet werden.


PDF- Text in Vorschau verfügbar, aber beim öffnen weg. - Seite 2\nPDF- Text in Vorschau verfügbar, aber beim öffnen weg.\nDiskutiere PDF- Text in Vorschau verfügbar, aber beim öffnen weg. im Windows 10 Allgemeines Forum im Bereich Windows 10 Foren; Mal geschaut, ist ein Office- Programm, habe jetzt keine Ahnung ob man damit auch Grafiken bearbeiten kann, radieren, ausschneiden, Füllungen usw. Ich benütze GIMP weil ...\n19.01.2018, 22:01 #11\nMal geschaut, ist ein Office- Programm, habe jetzt keine Ahnung ob man damit auch Grafiken bearbeiten kann, radieren, ausschneiden, Füllungen usw.\nIch benütze GIMP weil ich früher öfters mit Photoshop gearbeitet habe und da bestehen doch einige Übereinstimmungen was die Bedienung angeht.\nSo und jetzt gehe ich bald in die Heija, morgen wieder früh raus, als Rentner bist du halt immer am Rennen und hast keine Freizeit mehr..............\n19.01.2018, 22:15 #12\n...So und jetzt gehe ich bald in die Heija, morgen wieder früh raus, als Rentner bist du halt immer am Rennen und hast keine Freizeit mehr..............\nIch mache mit (71). Zumindest in TextMaker kann man eingeschränkt Grafiken bearbeiten, mache ich oft. Beim PlanMaker geht das auch. Auch PaintNet (Freeware) gehört bei mir dazu. Kommt immer darauf an, was man so benötigt. Für bestimmte Lösungsansätze bin ich gerne zu haben.\n« Schriftart | Prozesse von Anwendungen werden Doppelt oder mehrfach ausgeführt »\nPDF- Text in Vorschau verfügbar, aber beim öffnen weg. - Ähnliche Themen\nWord 2013: Wie krieg ich beim Einfügen von Text diese kleinen Einfügeoptionen-Fensterchen weg?\nWord 2013: Wie krieg ich beim Einfügen von Text diese kleinen Einfügeoptionen-Fensterchen weg?: Die sind zwar nicht groß, verdecken aber trotzdem immer anderen Text. Die nerven nur, ich brauche die nie, am besten, die würden gar nicht erst...\npdf vorschau explorer windows 10 64 bit\nwindows explorer vorschaufenster pdf\nDu betrachtest gerade PDF- Text in Vorschau verfügbar, aber beim öffnen weg.


Riat Industrie Armaturen Technik - Infothek / Absperrventile\nAbsperrventile können wie Absperrschieber eine Rohrleitung vollständig öffnen oder schließen. Zusätzlich können Absperrventile auch zur Durchflussregulierung eingesetzt werden. Durch den Regulierungskegel (Drosselkegel) kann der Strom im Rohrsystem beeinflusst werden. Der Nachteil bei Absperrventilen liegt darin, dass es keinen vollen Durchgang wie bei einem Absperrschieber geben kann.\nWeichdichtende Ventile erreichen durch den Einsatz von Gummidichtungen eine maximale Dichtfähigkeit, da Unebenheiten des Gehäusematerials oder der Spindel entsprechend ausgeglichen werden.\nFaltenbalgventile bieten neben den Vorteilen eines gewöhnlichen Ventils noch zusätzlich einen Edelstahl-Faltenbalg, der die Spindel zusätzlich abdichtet. Dadurch ist die Armatur sicherer und durch die längere Standzeit insgesamt leistungsfähiger.\nStopfbuchsventile verfügen über eine zusätzliche Stopfbuchse als Dichtung. Die Abdichtung erfolgt zwischen der Spindel und dem einwirkenden Medium. Ein besonderes Kennzeichen der Stopfbuchse ist eine relative Undichtheit, so steht an der Spindel der Armatur von Rohrleitungen Wasserdampf und das Ventil „zischt“ leicht. Bei vollständig geschlossener Spindel ist das Stopfbuchsventil dennoch dicht.\nProbeentnahmeventile dienen als zusätzlicher Bestandteil von Rohrsystemen der Ermöglichung einer Qualitätskontrolle und Überwachung des eingesetzten Mediums. Insbesondere beim Einsatz von Trinkwasserleitungen ist der Einsatz von Probeentnahmeventilen unerlässlich.\nSchnellschlussventile zeichnen sich insbesondere durch eine besonders schnelle und zuverlässige Handhabung aus. Hierbei ist zu beachten, dass die vollständige Öffnung oder Schließung eines Durchflusses besonders effizient erfolgt.\nBodenablassventile werden möglichst nah am Boden eines Behälters montiert und ermöglichen eine optimale Entleerung, Reinigung und Sterilisierung des Behälters.\nBis auf Probeentnahmeventile und weichdichtende Ventile sind automatische Armaturen als pneumatische, elektrische oder hydraulische Ausführung verfügbar.


Unternehmensdaten – Officina Visentin\nWIR MÖCHTEN, DASS UNSERE PRODUKTE FÜR UNS SPRECHEN.\nUnsere Kunden haben sich für Officina Visentin entschieden, weil sie in uns gefunden haben, was sie suchten: Produktqualität, hervorragende Lieferzeiten, Flexibilität in der Produktion, interessantes Preis- / Leistungsverhältnis.\nOfficina Visentin ist in der Lage, eine breite Palette von Produkten anzubieten, von der Serienproduktion bis hin zum kompliziertesten, personalisierten Prototyping. Unsere Erfahrung und technologische Innovation ermöglichen es uns, spezifische Lösungen für auch komplexes Engineering zu bieten.\nDer direkte Draht, der unser Büro mit Planern und Technikern des Kunden verbindet, stellt sicher, dass jeder Produktionsprozess die vereinbarte Planung der Produktionszyklen einhält. Die sorgfältige Berücksichtigung des Produktionsprozesses gewährleistet den Kunden sichere Lieferzeiten und hohe Qualität.\nDie sehr günstige geographische Lage des Produktionswerks von Officina Visentin, nur einen Kilometer von der Auffahrt zur Autobahn A4 zwischen Mailand und Triest, wirkt sich vorteilhaft auf die Logistik der Transporte aus.


Mai von Dr. Maximilian Schmidt. Immer mehr Dating- und Partnerplattformen verlangen für ihre Dienste eine Nutzungsgebühr. Findige Juristen könnten nun auf die Idee kommen nach Nutzung der Dienste das Entgelt durchgebraten zu bezahlen — zumindest in anteiliger Höhe mit Verweis auf das verbraucherschutzrechtliche Widerrufsrecht hierzu V. Rechtsnatur der sog. Hierbei handelt es sich um unvollkommene, nicht einklagbare, also nicht mit staatlicher Hilfe durchsetzbare Forderungen. Auch in diesen Fällen können Forderungen nicht durchgesetzt werden.\nSexkontakte für Sie Ihn und Paare tabulos kostenlos und unzensiert mit Fickanzeigen von hobbyhuren und gewerblichen rotlicht annoncen happy-sexkontakte. Surftipps: Dein Link hier. Sei der erste, der über die neuesten Weiterentwicklungen und Angebote von Matthias Schwehm informiert single greding, und profitiere von Pilotprogrammen. Entgegen der üblichen Lebenserfahrung bringt dich dieses einzigartige Wochenende, laut Teilnehmerfeedbacks, um ein bis fünf Jahre in deiner persönlichen Entwicklung voran. Du hast es satt, dich unsicher zu fühlen, unterbezahlt zu sein und ständig übergangen wenig werden. Direktkontakt für Sexdate Seitensprung Hobbysex und vieles mehr. Das erspart dir immens viel Geld, Frust und Kopfschmerzen.


Anna Veith: Deshalb wackelt der Saison-Start in Sölden - Wintersport - Ski Alpin\nAnna Veith: Deshalb wackelt der Saison-Start in Sölden\nAnna Veith: So steht es um ihre Comeback-Pläne\nWien - Mittwoch, 31.08.2016, 12:36 Uhr\nAnna Veith ist sich nach wie vor nicht sicher, ob sie beim Weltcup-Auftakt in Sölden (22. Oktober) an den Start gehen kann.\n"Ich möchte so fit sein, dass ich bestehen kann", sagt die 27-Jährige am Rande eines Schneetrainings am Stilfser Joch. "Ob dies der Fall ist - das ist die Frage."\nSie habe jedenfalls einen "gewissen Anspruch" und wolle nicht einfach "nur so mitfahren", betont die zweifache Gesamtweltcupsiegerin, dass sie nicht zurückkehrt, wenn sie nicht wirklich bereit sein sollte.\nNoch weit von altem Zustand entfernt\n"Ich setzte mich nicht so unter Druck. Wenn ich hundertprozentig fit bin, dann steige ich wieder ein", erklärte die Olympiasiegerin (2014), Doppel-Weltmeisterin (2015) und zweifache Weltcup-Gesamtsiegerin, die bei einem Trainingssturz vor dem Weltcupauftakt im Oktober 2015 eine schwere Knieverletzung erlitten hatte.\nVeith fiel daraufhin für die gesamte Saison aus.\nIn puncto körperlicher Leistungsfähigkeit sei sie "noch weit davon entfernt, wo ich vor der Verletzung war". Sie sei aber "körperlich fit" und auf einem "guten Weg", betonte Veith. "Ich habe keine Bedenken. Ich denke von Schritt zu Schritt. Man muss jeden Tag mit kleinen Fortschritten zufrieden sein", zeigte sich der Skistar zuversichtlich.\nDas macht ihr noch zu schaffen


Saisonauftakt weibliche E | SC Rot-Weiß Nienborg 1923 e.V.\nZur Saisonvorbereitung waren unsere E-Juniorinnen am Montag, 09.09. bei Westfalia Leer zu Gast.\nDa unsere Mannschaft mit allen 14 Spielerinnen antrat, einigte man sich darauf 4x 15 Minuten zu spielen, so konnten zwei Mannschaften gebildet werden und alle Mädchen zwei Halbzeiten spielen.\nDas erste Tor der Saison konnte Marie Piegel bereits in der 2. Spielminute erziehen, bevor Maxima Steinweg sich durchsetzte und sogar auf 0:2 erhöhte.\nDoch ein klarer Sieg sollte es nicht werden, denn nun kamen die Mädchen aus Leer zum Zug, sie konnten gleich 4 Tore zum 4:2 erzielen.\nNach einem tollen Sololauf ab der Mittellinie konnte Lenja Schierz den Ball zum 4:3 ins Tor unterbringen.\nDen Treffer zum 4:4 erzielte Marie Piegel nach schönem Zuspiel von Finja Schuckenbrock.\nLea Helling erzielte den Ausgleichstreffer zum 5:5, nachdem Leer erneut in Führung gegangen war.\nMan spürte, dass unsere Mädchen das Spiel unbedingt gewinnen wollten und es ging noch mal ein Ruck durch die Mannschaft und so gelang Maxima Steinweg das 5:6. Wenig später konnte Julia Ostendorf die Führung sogar auf 5:7 ausbauen.\nIn der letzten Minute verkürzte Leer noch auf 6:7, aber unsere RWN Mädchen ließen sich den Sieg nicht mehr nehmen\nVeröffentlicht am 18. September 2013 25. Juni 2018 Autor LoskeKategorien wE-Jugend


Feuerwehr steht für Massentests bereit – Kommunalnet\nNoch vor Weihnachten sollen in Österreich flächendeckende Covid-Massentests stattfinden. Für die Logistik hat sich die Bundesregierung bereits Unterstützung gesucht: Während in den Städten das Bundesheer eingespannt wird, sollen im ländlichen Raum die Blaulicht- und Freiwilligenorganisationen die Organisation der Massentests übernehmen.\nFeuerwehr für Logistikleistungen zuständig\nDas Bundeskanzleramt ist auf den Österreichischen Bundesfeuerwehrverband (ÖBFV) zugegangen und hat um Unterstützung bei den geplanten Massentests gebeten. Nach Abstimmung der Landesfeuerwehrkommandanten mit dem ÖBFV-Präsidenten werden Logistikleistungen in den Bundesländern – je nach Bedarf und Verfügbarkeit – zur Verfügung gestellt. Die Tests an sich dürfen nur durch medizinisches Personal durchgeführt werden, weshalb sich die Feuerwehr diesbezüglich nicht einbringen kann. Testungen in Feuerwehrhäusern sind nicht vorgesehen.\n-REDAKTION (Quelle: ÖBFV)\nHier geht’s zum Österreichischen Bundesfeuerwehrverband\nS.Hofschlaeger/pixelio.de Jugendarbeit geht auch mit Distanz


Die besten Hotels in Thessaloniki mit Tiefpreisgarantie | 5vorFlug.de\nHotel in Thessaloniki günstig buchen!\nThessaloniki – Zeugnisse alter Zeiten\nBesuchen Sie die zweitgrößte Stadt Griechenlands, die mit ihren zahlreichen historischen und kulturellen Sehenswürdigkeiten als Kulturmetropole Griechenlands gilt. Griechische und türkische Einflüsse wechseln sich hier ab.\nUnsere Hotelempfehlungen inkl. Flug\nHotels in direkter Strandnähe\n1 Woche mit Doppelzimmer und Frühstück, inkl. Flug\nFamilienhotels in Thessaloniki\nEntspannen Sie mit der gesamten Familie in einem Familienhotel in Thessaloniki.\nHotel in Thessaloniki inkl. Frühstück\nBuchen Sie Ihr Hotel in Thessaloniki inkl. Frühstück und starten Sie gut verpflegt Ihre Thessaloniki Entdeckungstour.\nErleben Sie Thessaloniki mit einem unserer Last Minute Angeboten und lernen Sie das Land und die Kultur kennen.\nTop-Hotelangebote für Thessaloniki\nweitere Angebote zu "Thessaloniki"\nIhr Hotel in Thessaloniki – Wissenswertes\nGute Gründe für ein Hotel in Thessaloniki\nAuf dem griechischen Festland können Sie nicht nur Athen, sondern auch andere griechische Perlen wie Thessaloniki besichtigen. Diese Stadt liegt direkt am Wasser und überzeugt mit ihren schönen Stränden, einer herrlichen Promenade und einer ebenso schönen Altstadt. Besuchen Sie zum Beispiel den weißen Turm Lefkos Pyrgos, der das Wahrzeichen von Thessaloniki ist. Besichtigen Sie auch die Reste des alten Kaiserpalastes, schauen Sie in der Hagia Sophia vorbei oder besuchen Sie einen der vielen Märkte. Auf diesen können Sie besonders gut essen und zugleich ein paar Souvenirs einkaufen.\nDer türkische Einfluss wird in Thessaloniki nicht nur auf den basar-artigen Märkten, sondern zum Beispiel auch in den zahlreichen Hammams sowie in der Gastronomie und den prächtigen Moscheen deutlich. Gönnen Sie sich unbedingt einen Tag im Spa und planen Sie ausreichend Zeit ein, um das Archäologische Museum und die vielen weiteren Sehenswürdigkeiten der Stadt zu erkunden. Für Reisende mit Kindern ist der nahegelegene Wasserpark das ideale Ziel für einen Tagesausflug, während Naturliebhaber im Aliakmonas-Nationalpark auf ihre Kosten kommen. Vergessen Sie nicht die Wanderschuhe!\nDie Vorteile der Hotels in Thessaloniki\nWenn Sie gern mitten im Trubel wohnen möchten, sollten Sie sich für eine Lage im Stadtzentrum entscheiden. So können Sie jederzeit in einer Bar einen griechischen Wein und ein paar Dolmades genießen, bummeln oder griechischen Joghurt mit Honig frühstücken. Wenn Ihnen hingegen mehr nach Sonne und Strand ist, sollten Sie sich am Strand einquartieren. Hier befinden sich die meisten Hotels und Sie haben eine große Auswahl an verschiedenen Unterkünften. Wenn Ihr Budget etwas großzügiger ist, empfehlen wir Ihnen, ein Hotel in Thessaloniki mit direktem Blick auf das Meer und einem privaten Strandabschnitt zu buchen. Dazu gehört natürlich auch ein reichhaltiges Frühstücksbuffet oder eine Halbpension, bei der Sie neben dem Frühstück auch das Abendessen im Hotel genießen können.\nSie mögen es besonders luxuriös? Dann entscheiden Sie sich für eine elegante Unterkunft mit Vollpension, All-Inclusive-Verpflegung und eigenem Spa, um sich nach Herzenslust verwöhnen zu lassen. Reisende mit Familien finden in Thessaloniki zudem entsprechende Kinderhotels, in denen Sie sichergehen können, dass das freundliche Personal sich bestens um die Kleinen kümmert. Übrigens: Viele Griechen haben einige Zeit in Deutschland verbracht und sprechen daher Deutsch!\nFür wen eignet sich ein Urlaub in Thessaloniki?\nFür Familien mit etwas älteren Kindern bietet Thessaloniki viele Möglichkeiten für Unternehmungen, Tagesausflüge und entspannte Tage am Strand. Besonders empfehlenswert ist die Stadt als Reiseziel dann, wenn Ihre Kleinen gerne auf Erkundungstouren gehen, denn dann können Sie viele spannende Stunden an den Ruinen oder im Museum verbringen. Noch beliebter sind die Hotels in Thessaloniki allerdings bei Pärchen jeder Altersgruppe. Sie können in der schönen Stadt am Wasser nämlich hervorragend bummeln, shoppen, den Alltagstrubel genießen oder einer Sportart nachgehen. Alternativ entspannen Sie am Strand, leihen ein Auto aus oder erkunden die Gegend zu Fuß.\nAuch für Last-Minute-Bucher haben wir die passenden Hotels in Thessaloniki. Falls Sie zu den Kurzentschlossenen gehören, profitieren Sie von niedrigeren Preisen, da Sie die Restzimmer erhalten. Auf Wunsch schnüren wir Ihnen auch gern ein attraktives Paket, das neben den Übernachtungen auch das Frühstück, die Anreise und den Transfer zum Flughafen enthält. So müssen Sie sich um gar nichts mehr kümmern und können schon in den nächsten Tagen Ihre spontane Reise antreten! Wir empfehlen einen Reisezeitraum von etwa einer Woche für Thessaloniki. Wenn Sie danach noch weitere Highlights in Griechenland besichtigen möchten, haben wir natürlich ebenfalls die passenden Angebote für Sie. Wir von 5vorFlug wünschen viel Spaß!\nDie beste Reisezeit für Thessaloniki\nWeitere beliebte Hotels in Griechenland\nHotel KretaHotel AthenHotel KorfuHotel RhodosHotel KefaloniaHotel KosHotel MykonosHotel ChalkidikiHotel SkiathosHotel ZakynthosHotel SantorinHotel SamosHotel KarpathosHotel PeloponnesHotel Thassos\nRund um Ihren Thessaloniki Urlaub\nUrlaub ThessalonikiPauschalreise ThessalonikiLast Minute Thessaloniki


Pocket | Androidmag.de\nElena 7. Mai 2012\nMit der Bookmarkapp “Pocket” speichern Sie Webseiten für die spätere Verwendung. (kostenlos)\nAus Read It Later wurde Pocket\nRead It Later wurde jüngst einer Frischzellenkur unterzogen und die hat der App sichtlich gut getan. Nicht nur Name und Struktur wurden geändert, sondern auch der Preis. Pocket steht mittlerweile nämlich kostenlos im Play Store zur Verfügung.\nMit Pocket geht garantiert keine interessante Info mehr verloren.\nDie Funktion ist relativ schnell erklärt: mit Pocket lassen sich Artikel, Videos und sonstige Inhalte aus anderen Anwendungen oder aus den unendlichen Weiten des Internet ganz einfach speichern und aufbewahren. Später, wenn man dann mehr Zeit hat, kann man alles gemütlich lesen oder ansehen. Beim Start der App muss man einen Benutzernamen und ein Passwort wählen, sowie eine Email Adresse angeben. Das ist aber relativ unbürokratisch und rasch erledigt. Wer schon einen Read It Later Account hat, kann sich natürlich mit seinen bestehenden Zugangsdaten anmelden und alle bereits gespeicherten Artikel aufrufen.\nPocket funktioniert wie ein handliches Verwaltungsprogramm für Artikel, Videos und Co. In Sachen User Interface hat man sich für ein sehr reduziertes Design in den Farben weiß und grau entschieden, das lenkt die Aufmerksamkeit auf die gespeicherten Inhalte.\nWer möchte, kann gespeicherte Videos, Artikel und Bilder auch filtern und sortieren.\nÜber die Menüleiste am unteren Rand kann man alle Items mit einem Tag versehen, sie zu den Favoriten hinzufügen und das Darstellungsbild der Artikel verändern. Besonders praktisch: über die Filterfunktion kann man sich mehr Überblick verschaffen. Man kann seine Inhalte nach Artikeln, Videos oder Bildern sortieren. Vor allem dann sehr nützlich, wenn man viel gespeichert hat.\nEmpfehlenswerte App für all jene, die gerne im Internet surfen, aber nicht immer gleich die Zeit finden, Artikel zu lesen oder Videos anzusehen. Überzeugen konnten vor allem das schlanke Interface und der praktische Filter.\nTAGS » App des Tages, artikel, bookmark, inhalte speichern, kostenlos, pocket, read it later, YouTube


DIE LINKE. Fraktion in der Hamburgischen Bürgerschaft | Insa Tietjen\nKita: Linksfraktion fordert erweiterten Betreuungsanspruch\nAm 1. Juni bringt die Linksfraktion einen Antrag zur Verlängerung der sogenannten Geschwisterkindregelung in Hamburger Kitas in die Bürgerschaft ein.\nweiterlesen "Kita: Linksfraktion fordert erweiterten Betreuungsanspruch"\nLinksfraktion: Offene Kinder- & Jugendarbeit muss gestärkt werden!\nImmer wieder betonen Hamburgs Senat und die Bezirke die Relevanz der Offenen Kinder- und Jugendarbeit (OKJA) – zu Recht: Gerade für junge Hamburger:innen war die Corona-Pandemie mit ihren Einschränkungen noch zusätzlich belastend.\nweiterlesen "Linksfraktion: Offene Kinder- & Jugendarbeit muss gestärkt werden!"\nKein neuer Kinderknast! LINKE fordert Planungsstopp am Klotzenmoorstieg\nDer Hamburger Senat plant den Bau einer Sondereinrichtung für psychisch stark belastete Kinder zwischen 9 und 13 Jahren am Klotzenmoorstieg in Groß Borstel.\nweiterlesen "Kein neuer Kinderknast! LINKE fordert Planungsstopp am Klotzenmoorstieg"\nKitas am Limit – Senat muss verlässlichen Plan für Beschäftigte und Eltern vorlegen\nAngesichts der massiven Corona-Ausbrüche und der vielen eingeschränkten Betreuungsangeboten sind viele Kitas in der Stadt am Rande ihrer Möglichkeiten.\nweiterlesen "Kitas am Limit – Senat muss verlässlichen Plan für Beschäftigte und Eltern vorlegen"\nRückgang beim BAföG: Bildungsgerechtigkeit scheitert nicht an fehlenden Informationen!\n50 Jahre ist es her, dass das BAföG als Instrument für mehr Bildungsgerechtigkeit eingeführt wurde. Ein halbes Jahrhundert später zeigt sich, dass dringend eine Reform benötigt wird, um diese Förderung wieder zu einem echten Instrument für freien Bildungszugang zu machen. In einem Zusatzantrag zur Bürgerschaftssitzung fordert die Linksfraktion deshalb eine umfassende BAföG-Reform. Dazu Insa Tietjen, ausbildungspolitische Sprecherin der Fraktion DIE LINKE in der Hamburgischen Bürgerschaft: …\nweiterlesen "Rückgang beim BAföG: Bildungsgerechtigkeit scheitert nicht an fehlenden Informationen!"\nAngesichts der hohen Infektionszahlen bei Kindern im Kita-Alter fordert die Linksfraktion in einem Zusatzantrag für die heutige Bürgerschaftssitzung die Einführung von PCR-Lollitests an Hamburgs Kitas, um das Testverfahren für die Kinder zu vereinfachen.\nweiterlesen "Corona-Tests bei Kindern: LINKE fordert PCR-Lollitests für Hamburgs Kitas"\n9. November: Niemals nachlassen im Kampf gegen Antisemitismus\nHeute vor 83 Jahren brannten in Deutschland Synagogen. Mit den Pogromen vom 9. November 1938 gegen Jüdinnen und Juden, gegen jüdische Einrichtungen und Gotteshäuser wurde der Grundstein gelegt für die systematische Verfolgung von Jüdinnen und Juden, der in der Shoa mündete.\nweiterlesen "9. November: Niemals nachlassen im Kampf gegen Antisemitismus"


Ganz gleich, ob ein Fahrzeugverkauf privat oder über einen Händler abgewickelt wird: Eine wichtige Voraussetzung, dass ein Auto auf einen neuen Halter zugelassen werden kann ist die Ummeldung beim jeweils zuständigen Straßenverkehrsamt. Zuvor allerdings muss der alte Fahrzeughalter sein Fahrzeug bei der Zulassungsstelle abmelden. Geschieht der Verkauf über einen Händler, der das Auto in Zahlung nimmt, übernimmt dieser in der Regel auch die Abmeldung; bei einem Privatverkauf müssen sich die Vertragsparteien einigen, ob der bisherige Fahrzeughalter sein Fahrzeug selbst abmeldet oder ob der neue Eigentümer die Abmeldung gleichzeitig mit der Anmeldung übernimmt.\nAuf alle Fälle erhält der bisherige Fahrzeughalter eine Abmeldebescheinigung. Diese geht als Durchschrift an die Zulassungsstelle, die den bisherigen Fahrzeughalter aus der Verpflichtung zur Fahrzeugversicherung einerseits und der Zahlung der Kfz-Steuer andererseits entlässt. Eine weitere Durchschrift erhält die bisherige Versicherung, die dann eine Endabrechnung erstellt und mit dem Tag der Abmeldung auch das Versicherungsverhältnis als beendet erklärt.\nDie Abmeldebestätigung ist also wichtigste Voraussetzung dafür, dass ein Fahrzeug entweder auf einen neuen Halter zugelassen werden kann oder gänzlich stillgelegt wird, weil es aufgrund eines wirtschaftlichen Totalschadens nicht mehr repariert werden kann.\nEtwas anders sieht es aus, sollte das Fahrzeug nur vorübergehend stillgelegt werden, weil es z.B. mit einem Saisonkennzeichen ausgestattet ist und entweder nur in den Sommer- oder in den Wintermonaten gefahren wird – übrigens eine recht kostengünstige Möglichkeit für Fahrzeughalter, zwei Fahrzeuge ihr Eigen zu nennen. Dann wird gleich bei der Anmeldung des Fahrzeugs darauf hingewiesen, dass es mit einem Saisonkennzeichen ausgestattet wird und in den übrigen Monaten, in denen es nicht gefahren wird, vorübergehend stillgelegt wird. Eine Abmeldung für diese Zeit ist dann nicht erforderlich.\nEs sollte zur Vorsicht noch einmal darauf hingewiesen werden, dass gerade bei Fahrzeugverkäufen, die privat abgewickelt werden, nicht selten mit der Abmeldung gezögert wird, wenn beispielsweise der neue Halter dem bisherigen verspricht, diese zu übernehmen. Dann läuft der Versicherungsschutz weiter und die Prämien werden insoweit ebenfalls weiter fällig. Um dies zu vermeiden, sollten Privatverkäufer die Abmeldung ihres Fahrzeugs entweder selber oder in Begleitung des neuen Eigentümers übernehmen. Dann kann unter Umständen gleich die Ummeldung vorgenommen werden, sollte der neue Halter im gleichen Zulassungsbezirk das Fahrzeug zulassen.


Nachrichten aus den Bioregionen: Treffen des Arbeitskreises der BioRegionen in Hamburg - BIO Deutschland\nNachrichten aus den Bioregionen: Treffen des Arbeitskreises der BioRegionen in Hamburg\nIm Rahmen der Bio-Europe trafen sich die Vertreter des Arbeitskreises der Bioregionen (AK) am 12. November 2012 in Hamburg, um sich über aktuelle Themen und Projekte zu informieren und auszutauschen. Passend zum Veranstaltungsort lud die BioRegion Life Science Nord zum bereits 29. Treffen des AK.\nEin Vertreter der BIO Deutschland nahm an der Veranstaltung teil und informierte über politische und rechtliche Aktivitäten des Verbandes, wie zum Beispiel die angestrebte Normierung im Bereich der Biotechnologie. Das Deutsche Institut für Normung hat den Antrag beim Internationalen Institut für Normung (ISO) gestellt ein Technical Committee „Biotechnology“ einzurichten. Ziel dieses neuen Gremiums soll nach Erarbeitung von einheitlichen Definitionen und Begriffsbestimmungen die Verfassung von internationalen Normen in der Biotechnologie sein.\nIm Weiteren wurde der Stand der derzeit laufenden und gemeinsam von den Bioregionen organisierten Biotech>inside-Kampagne besprochen, die bereits Anfang Oktober bundesweit gestartet ist und verschiedene Informationsveranstaltungen zur Biotechnologie beinhaltet. Zudem wurde unter anderem über die Fortschritte in der Planung der Deutschen Biotechnologietage (DBT) 2013 in Stuttgart informiert sowie der Stand des Innovationspreises der BioRegionen 2013, der im Rahmen der DBT verliehen werden soll, erörtert.\nDas nächste Treffen des AK ist im Februar 2013 in Düsseldorf beim Gastgeber BIO.NRW geplant.\nBesuch der amerikanischen Biotechnologie Industrie Organisation (BIO) in Berlin\nTreffen der BIO Deutschland-Arbeitsgruppe „Regulatorische Angelegenheiten“ in Hamburg\nVerbändetreffen zu „Erprobungsrichtlinien neuer Untersuchungs- und Behandlungsmethoden“\nBIO Deutschland beim National Associations Meeting (NAC) und Healthcare Council in Brüssel\nBIO Deutschland im BMELV zum Thema „biobasierte Wirtschaft“ in Berlin\nCluster-Konferenz Gesundheitswirtschaft mit BIO Deutschland-Beteiligung in Berlin\nBIO Deutschland bei der Bio-Europe in Hamburg\nNeue Mitglieder: Accelero® Bioanalytics und Red Flag Diagnostics\nInternationales: European Biotech Week


Steuern der Expression oder Aktivität von spezifischen Genen durch die myokardiale Abgabe von genetischem Material in murinen Modellen ermöglicht die Untersuchung von Gen-Funktionen. Ihr therapeutisches Potential im Herzen kann auch bestimmt werden. Es gibt nur begrenzte Ansätze für in vivo molekulare Intervention in der Maus Herz. Rekombinante Adeno-assoziierten Virus (rAAV) -basierte Genomtechnik wurde als ein wesentliches Instrument für die in - vivo - Herz Genmanipulation verwendet. Die spezifischen Vorteile dieser Technologie sind hohe Effizienz, hohe Spezifität, geringe genomische Integrationsrate, minimal Immunogenität und minimale Pathogenität. Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Konstruktion, zur Verpackung und reinigen die rAAV9 Vektoren beschrieben. Subkutane Injektion von rAAV9 in neonatalen Welpen ergibt robust Expression oder effiziente Knockdown des Gens (e) von Interesse in der Maus Herz, aber nicht in der Leber und anderen Geweben. Mit Hilfe der Herz-spezific TNNT2-Promotor, eine hohe Expression von GFP-Gen im Herzen erhalten. Zusätzlich Ziel-mRNA im Herzen gehemmt wurde, wenn ein rAAV9-U6-shRNA genutzt wurde. Kenntnisse im Umgang mit rAAV9 Technologie kann für kardiovaskuläre Untersuchungen nützlich sein.\nSteuern Expression oder Aktivität von spezifischen Genen in verschiedenen biologischen Systemen ist eine wertvolle Strategie bei der Untersuchung der Genfunktion 1 geworden. Eine direkte Mittel, um dieses Ziel zu erreichen, ist zu Nukleotid-Sequenzen manipulieren und Mutantenallelen erzeugen. Obwohl machen präzise, gezielte Veränderungen des Genoms von lebenden Zellen ist noch eine zeitaufwendige und arbeitsintensive Praxis, die Entwicklung der mächtigen TALEN und CRISPR / Cas9 Tools hat eine neue Ära der Genom Bearbeitung 2-5 geöffnet. Eine Routinelaborverfahren zur Genmanipulation hat sich auf die Einführung von genetischem Material (DNA und RNA - kodierenden Sequenzen oder siRNAs / shRNAs enthält) fokussiert in die Zellen , die das Gen (e) von Interesse 1,6 zum Ausdruck bringen oder Knockdown.\nIn vielen Fällen ist der Haupt Engpass für Genmanipulation die Abgabe von DNA, RNA oder Protein in die Zellen. Im Hinblick auf die in vitro - Studien, effiziente transfectiauf Systeme wurden in vielen kultivierten Zellinien etabliert. Im Mausmodell ist jedoch, insbesondere in vivo Genübertragung anspruchsvoller. Es gibt eine Reihe extra- und intrazelluläre Barrieren, um umgangen werden müssen effiziente zelluläre Aufnahme der exogenen Reagenzien zu erreichen. Weitere Hindernisse sind die schnelle Clearance und die kurze Dauer der 7,8 gelieferten Materialien. Eine Strategie , um diese Probleme zu umgehen , ist die virale Vektoren als "Träger" zu verwenden oder "Vehikel" für in vivo - Genübertragung. Die natürlich entwickelte Transduktionseigenschaften von Viren ermöglichen die effiziente Bereitstellung eines Gens von Interesse in Zellen 7,9,10. Zahlreiche Arten von viralen Vektoren wurden in vivo Genmanipulation in verschiedenen Zelltypen und Organe in Mäusen entwickelt und flexible ermöglichen.\nDie am häufigsten verwendeten viralen Systeme umfassen Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus (AAV) 12-14 ihres genetischen Materials in die Wirtszellgenom einzuführen. Viele Arten von Retroviren jedoch infizieren nur sich teilende Zellen, und ihre Wirksamkeit in sich nicht teilende Zellen ist sehr gering 15. Dies schränkt ihre Nützlichkeit für den Gentransfer. Lentivirus ist eine Gattung der Retroviridae Familie. Unterscheidet sich von anderen Retroviren, Lentivirus kann infizieren sowohl Dividieren und nicht teilende Zellen und wurde für den Gentransfer in post-mitotische und hochdifferenzierten Zellen 16 verwendet. Der Lebenszyklus von Lentivirus beinhaltet auch die Integration von Vektor-DNA in das Wirtsgenom. Somit ermöglicht Lentivirus-vermittelte Genabgabe stabile und langzeitige Expression der transduzierten genetischen Elemente 16-18. Jedoch kann dieses Merkmal eine Doppel e darstellendged Schwert in der Verwendung dieser Viren die Genexpression zu manipulieren, da die Integration von Vektor-DNA zur Insertionsmutagenese führen in den Wirtszellen und können artifizielle Wirkungen verursachen. Adenovirus ist ein weiteres weit verbreitetes Genabgabesystem. Im Gegensatz zu Retroviren und Lentiviren, Adenoviren sind nicht integriert und nicht mit der genomischen Integrität von Wirtszellen 8,10,11,19 stören. Zusätzlich können Adenoviren DNA in viele Zelltypen zu transfizieren, und die Infektion ist nicht abhängig von aktiven Zellteilung 19. Ein weiteres wichtiges Merkmal von Adenoviren ist die Leichtigkeit der Vektor Reinigung, da die viralen Vektoren haben die Fähigkeit , 19,20 repliziert werden. Allerdings ist der Haupt Einschränkung dieses Systems , dass Adenovirus - Infektion 19 starke Immunantworten in Zielzellen und Organen auslösen können, deren Verwendung in vielen Untersuchungen beschränken, insbesondere in Gentherapiestudien.\nIm Vergleich zu diesen anderen Typs von viralen Vektoren, rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) scheint die ideale Genabgabesystem 21,22 sein. Es zeigt minimale Immunogenität und Pathogenität 23,24. Darüber hinaus infiziert rAAV ein breites Spektrum von Zelltypen, einschließlich sowohl Unterteilungs- und nicht teilende Zellen. In den meisten Fällen ist nicht rAAV in Wirtsgenome integriert; Somit ist die Gefahr einer unerwünschten genetischen oder genomischen Veränderungen in den Zielzellen gering 22.\nIn jüngster Zeit wurden rAAV - Systeme wurden für die in vivo Abgabe von DNA , die für Proteine, miRNAs, shRNAs und CRISPR-gRNAs in Maus Herzmuskel 23,25-29 erfolgreich eingesetzt. Diese Methodik hat erleichtert grundlegenden Untersuchungen und Gentherapie-Studien auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf-Forschung. Hier wird die detaillierte Prozedur rAAV9 Vektoren zu erzeugen, die effizient überexprimiert oder die Gene von Interesse in Mäuseherzen Knockdown beschrieben wurde. Das Protokoll bietet eine einfache und effektive Methode,kardialen Genexpression in murine experimentelle Modelle manipulieren.\nAlle beschriebenen Schritte wurden unter Protokolle, die von der Kommission für Biosicherheit und der Institutional Animal Care und Use Committee von Boston Kinderkrankenhaus zugelassen durchgeführt. Boston Kinderkrankenhaus hat pathogen-freie Maus Einrichtungen mit geregelten Hell / Dunkel-Zyklen und Klimaanlagen. Veterinärwesen und Tierpflegepersonal Käfige ändern und die Gesundheit der Mäuse zu gewährleisten. Die Einrichtungen sind AAALAC zertifiziert und haben aktive Tierschutzsicherung Zertifizierung (AAALAC Akkreditierung erteilt am 1992.02.24 Animal Welfare Assurance Nummer:. A3303-01). Mäuse wurden durch CO 2 aus einer Druckgasquelle geliefert euthanasiert. Gewebeproben wurden gesammelt, nachdem dass die Herzfrequenz, Bewegung bestätigt, und die Atmung der Tiere aufgehört hatte. Neonatal Nagetiere sind resistent 2 Euthanasie zu CO und wurden durch Enthauptung mit einer scharfen Schere eingeschläfert. Diese Verfahren sind im Einklang mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association.\n1. Erzeugung von rAAV9 Konstrukten durch eine cDNA oder shRNA Expressionskassette in das Plasmid Backbone Cloning\nHINWEIS: Das rAAV9 Plasmid, das invertierte terminale Wiederholungen (ITRs) von AAV 2 enthält, für Genüberexpression verwendet wurde modifiziert, um das Huhn TNNT2 zum Hafen Promotor (rAAV9.cTNT), die 25,26,29 Kardiomyozyten-spezifische Expression von transduzierten Genen ermöglicht. Einzigartige NheI und KpnI-Stellen wurden in das Plasmid stromabwärts des Promotors eingeführt. Die cDNA - Fragmente , die die Gene von Interesse kodieren , können in das rAAV9 Rückgrat diese beiden Restriktionsstellen 25,26,29 mit geklont werden. Hier wird als Beispiel die rAAV9 Vektor für die Überexpression des GFP-Gens in Mäuseherzen wurde erzeugt. Das resultierende Plasmid enthält das cTnT :: GFP - Kassette flankiert von zwei ITR Stellen (Abbildung 1). rAAV9.U6 :: shRNA Konstrukte wurden für Knock-Down 25 verwendet. Design-shRNAs mitOnline-shRNA-Design-Servern. rAAV9.U6 :: shRNA kann entweder durch Glühen und Ligieren DNA-Oligos haltigen shRNA-Sequenzen in die Restriktionsenzym-verdaute rAAV9 Vektoren beherbergen die U6-Promotor oder durch Langstrecken-PCR und intramolekulare Gibson Montage-basierte "nahtlos" erzeugt werden Bau 30. Das resultierende Plasmid sollte die U6-shRNA Kassette durch zwei ITR Seiten (Figur 2) flankiert enthalten. Hier wird als Beispiel die rAAV9.U6 :: shRNA Vektor wurde konstruiert TRBP mRNA (TRBP shRNA-Sequenz: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG) zum Knockdown. Ein Gerangel shRNA wurde als negative Kontrolle (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG) verwendet.\nKlonen Sie die cDNA oder shRNA Expressionskassette in das rAAV9 Plasmidbackbone. Wandeln Sie die DNA in kompetente E. coli - Zellen 25.\nHINWEIS: Verwenden Sie stbl2 oder stbl3 E. coli - Zellen für rAAV9 DNA - Transformation unerwünschte ITR Rekombination zu minimieren.\nHeb die ... Aufpositiver Klon aus den transformierten E. coli - Zellen. Amplify die Kultur in 500 ml Lilly-Barnett Medium und extrahieren Sie die rAAV9 Plasmid aus den Bakterienzellen 25-30.\nHINWEIS: Midi / Maxi prep die rAAV9 Plasmid, das eine hohe Menge an DNA (> 100 & mgr; g) zu erhalten. Bevor das Virus zu erzeugen, analysieren immer die Sequenzintegrität der AAV-Plasmide durch Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese, wie zuvor beschrieben (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html).\n2. Transfektion von HEK293-Zellen mit rAAV9 Plasmiden\nBereiten Sie 1 ug / ul von linearen Polyethylenimin (PEI) -Lösung. Auflösen PEI - Pulver in Endotoxin-freiem dH 2 O , das auf 70-80 ° C erwärmt wurde. Nach dem Abkühlen auf RT ab, neutralisiert die Lösung auf pH 7,0 mit 1 M HCl. Filter zu sterilisieren (0,22 & mgr; m) wurde die Lösung. Aliquot der 1 ug / ul PEI-Stammlösung (1400 ul / Röhrchen) und speichern Sie die solutIon bei -20 ° C.\nKultur HEK293-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Kultur der Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 ± 0,5% Kohlendioxid (CO 2).\nAm Tag 0, Platte HEK293 Zellen in zehn 150 mm-Schalen von 18-20 Stunden vor der Transfektion durch Spaltung> 90% konfluenten Zellen in einer 1: 2 Verdünnung.\nHINWEIS: Am Tag 1 sollten die Zellen 90% Konfluenz erreichen.\nAm Tag 1, transfizieren HEK293 - Zellen mit dem rAAV9 Plasmid (zB rAAV9.cTNT :: GFP oder rAAV6.U6 :: shRNA Konstrukte), Ad-Helferplasmid und AAV-Rep / Cap - Plasmid unter Verwendung von PEI 25,26,29.\nFür 10 Gerichte der Zellen bei 90% Konfluenz, 70 & mgr; g in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen AAV-Rep / Cap-Plasmid, 70 & mgr; g pf rAAV9 Plasmid und 200 ug Ad-Helferplasmid mischen.\nWenn die Zellen weniger konfluent sind, proportional angepasst werden die DNA-Menge. Zum Beispiel, wenn die Zellen bei 75% konfluent sind, reduzieren dieDNA-Menge proportional (75/90 der Menge in Schritt gezeigt 2.4.1): mix 70 x 75/90 = 58,3 ug AAV-Rep / Cap Plasmid, 70 x 75/90 = 58,3 ug rAAV9 Plasmid und 200 x 75/90 = 166,7 & mgr; g Ad-Helferplasmid in einer 50-ml-Zentrifugenröhrchen.\nIn 49 ml RT DMEM (ohne FBS) auf die 50-ml-Tube und gut mischen.\nIn 1360 ul PEI-Lösung, um das PEI machen: DNA-Verhältnis (v / w) sein 4: 1. Gut mischen. bei RT inkubieren 15 - 30 min.\n5 ml des Gemisches hergestellt in Schritt 2.4.4 auf jede 150-mm-Schale (50 ml des Gemisches für zehn 150 mm-Schalen).\nKultur der Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 ± 0,5% CO 2 für 60-72 Std.\n3. Ernte von HEK293 Zellen und Reinigung von rAAV9 Vektoren\nErnten Sie die Zellen 60-72 h nach der Transfektion. Vertreiben und die Zellen in den Gerichten aussetzen durch Auf- und Abpipettieren mit dem Kulturmedium. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen in sterile50-ml-Röhrchen.\nZentrifugieren der Zellen bei 500 xg für 5 min. Zellpellet mit 5 ml PBS in jedes Röhrchen und kombinieren die alle Zellsuspensionen in ein 50-ml-Tube.\nZentrifugieren der Zellen bei 500 xg für 5 min. Überstand verwerfen. Bei diesem Schritt speichert das Zellpellet bei -80 ° C oder unmittelbar die AAV aus dem Pellet zu reinigen, wie 3,4 bis 3,15 in Schritten beschrieben.\nVorbereitung der Lysepuffer: 150 mM NaCl und 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Filter zu sterilisieren (0,22 uM). Lagern Sie den Puffer bei 4 ° C.\nDas Pellet mit 10 ml Lyse-Puffer.\nFrieren Sie das Lysat bei -80 ° C oder in Trockeneis / Ethanol-Bad, dann Tauwetter es bei 37 ° C. Vortex für 1 min. Einfrieren und Auftauen des Lysats 3 mal.\nIn MgCl2 Lösung des aufgetauten Lysats (machen die endgültige Konzentration von MgCl 2 in dem Lysat sein 1 mM). Fügen Sie die Nuklease zu einer Endkonzentration von 250 U / ml. für 15 min bei 37 ° C inkubieren, um die DNA / Protein aggr aufzulösenegation.\nHINWEIS: Wenn die DNA / Protein-Aggregation nicht nach Nuklease oder Endonuklease Behandlung gelöst bekommt, Dounce homogenisieren die Lysate 20-mal.\nZentrifugieren Sie die Probe bei 4.800 × g für 20 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand.\nUnterdessen bereiten die Iodixanol Gradienten-Lösung:\nBereiten Sie die 17% des Gradienten durch Mischen von 5 ml 10 × PBS, 0,05 ml 1 M MgCl 2, 0,125 ml 1 M KCl, 10 ml 5 M NaCl und 12,5 ml ofdensity Gradienten Medium. Einstellen das Gesamtvolumen auf 50 ml mit H 2 O.\nBereiten Sie die 25% ige Lösung durch Mischen von 5 ml 10 × PBS, 0,05 ml 1 M MgCl 2, 0,125 ml 1 M KCl, 20 ml Dichtegradientenmedium, und 0,2 ml von 0,5% (w / v) Phenol Red. Einstellen das Gesamtvolumen auf 50 ml mit H 2 O.\nBereiten Sie die 40% ige Lösung durch Mischen von 5 ml 10 × PBS, 0,05 ml 1 M MgCl 2, 0,125 ml 1 M KCl, und 33,3 ml Dichtegradientenmedium. Einstellen das Gesamtvolumen auf 50 ml unter Verwendung vonH 2 O.\nBereiten Sie die 60% ige Lösung durch Mischen von 0,05 ml von 1 M MgCl 2, 0,125 ml 1 M KCl, 50 ml Dichtegradientenmedium, und 0,1 ml von 0,5% (w / v) Phenol Red.\nMit einer Nadel und Spritze, laden die Iodixanol Gradientenlösung in die Polypropylenröhrchen in der Größenordnung von 5 ml von 17%, 5 ml von 25%, 5 ml 40% und 5 ml von 60%, von unten beginnend. Laden Sie alle aus Schritt erhaltenen Lysat 3,8 (14-16 ml) auf der Oberseite des Gradienten. Der Gradient, von unten nach oben aufgelistet, 60%, 40%, 25%, 17%, und das Lysat Schicht. Füllen Sie das Rohr mit Lysepuffer und decken Sie es mit dem Korken.\nZentrifuge bei 185.000 xg für 90 min bei 16 ° C.\nErnte der viralen Fraktion (40% Schicht) mit einer Spritze. Führen Sie die Nadel (21 Gauge) in die Kreuzung zwischen den 40% und 60% Fraktionen, nur die 40% Schicht abgesaugt.\nHINWEIS: Vermeiden Sie die 25% Schicht abgesaugt.\nMischen Sie die Virus-Fraktion mit sterilisierten Polyoxyethylen-polyoxypropropylen-Blockcopolymer PBS-Lösung (10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer Lager 1: 10.000 in PBS) bis zu einem Gesamtvolumen von 15 ml. Legen Sie die Mischung in das Filterrohr (cut-off MW = 100 kD). Zentrifuge bei 2.000 xg für 30 min bei 4 ° C.\nEntsorgen Sie die Lösung an der Unterseite. Nachfüllen des Filterrohr mit Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer-PBS-Lösung auf ein Gesamtvolumen von 15 ml. Zentrifuge bei 2.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. Sammeln Sie die gereinigte rAAV9-Virus (die Fraktion über dem Filter).\nÜbertragen Sie das gereinigte rAAV9 im Filterrohr auf 1,7-ml-Röhrchen. Aliquot der gereinigten rAAV9 (100-400 & mgr; l / Röhrchen in Abhängigkeit von dem Volumen und Titer des AAV) und Speichern des Virus bei -80 ° C.\nHINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-taut.\n4. Messung der Titer von rAAV9\nBereiten Sie Standard - DNA - Proben.\nEntwerfen Sie spezifische und effiziente PCRPrimer für rAAV9 Vektoren und Optimierung der PCR-Bedingungen.\nHINWEIS: Die Primer, die in dieser Studie verwendet werden, sind "Forward: TCGGGATAAAAGCAGTCTGG; Reverse: TCGGACGGAGATACGTGAGT". Die PCR-Reaktion wurde mit den folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 35 Zyklen von 95 ° C für 20 sec, 60 ° C für 15 sec, und 72 ° C für 10 sec; und die abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min. Jedoch sind die optimierten Primer und PCR - Bedingungen plasmid-spezifisch, da die eingesetzte Sequenz in der rAAV9 Vektor , der die Spezifität und Effizienz der PCR 31 beeinflussen können.\nFühren Sie die PCR-Reaktion mit den in Schritt 4.1.1 gezeigten Bedingungen. Reinige das PCR-Produkt mit einem Gel-Extraktions-Kits.\nMessen der Konzentration von gereinigter DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers. Berechnen der Konzentration der DNA-Molekülzahlen bezogen auf das Molekulargewicht / Länge des PCR-Produkts.\nBerechnen Sie die molekulare Konzentration der folgenden Gleichung: momolekulare Konzentration (DNA - Moleküle oder Fragmente / ml) = 6,23 x 10 23 mol -1 x Con. x 10 -6 / MW. Anmerkung: (6.23 x 10 23 mol -1 ist Avogadroschen Number; Con .: DNA - Konzentration in & mgr; g / ml; MW .: Molekulargewicht in g / mol). wenn die erhaltene Konzentration des PCR-Produkts von 100 & mgr; g / ml zum Beispiel ist und seine Länge ist 200 bp, das Molekulargewicht des doppelsträngigen DNA 2 x 200 x 310 = 124000 (das mittlere Molekulargewicht jedes Nukleotid in der einzelsträngige DNA ist etwa 310 g / mol). Die molekulare Konzentration (DNA - Moleküle / ml) = 6,23 X 10 23 mol -1 x 100 & mgr; g / ml x 10 -6 / 124.000 g / mol = 5,18 x 10 14 DNA - Moleküle / ml.\nDurchführen einer Verdünnungsreihe des DNA - Fragments und Herstellung der Standardproben mit Konzentrationen von 10 13 Molekülen / ml, 10 12 Molekülen / ml, 10 11 Molekülen / ml, 10 10 Molekülen / ml, 10 9 Moleküle / ml, 10 sup7 ; Moleküle / ml. Verwenden Sie 1 ul Lösung für jede Standardprobe für die quantitative PCR (qPCR, in Schritt 4.6).\nMix 5 & mgr; l gereinigtem rAAV9 Lösung mit 5 ul 10fach DNAse - Puffer, 1 & mgr; l DNAse (10.000 U / ml) und 39 & mgr; l ddH 2 O. Das Gesamtvolumen 50 & mgr; l sein sollte.\nInkubiere die Phiole bei 37 ° C für 30 min Restunverpackten Plasmid-DNA zu entfernen.\nInaktivieren der DNAse bei 95 ° C für 10 min. Die Lösung wird nach unten, fügen Sie 44 ul H 2 O, 5 ul 10x DNAse Puffer und 1 ul Proteinase K Lager (10 mg / ml).\nInkubieren der Lösung bei 50 ° C für 2 Stunden. Stoppen Sie die Reaktion und inaktivieren die Proteinase K bei 95 ° C für 10 min.\nVerwenden Sie 1 ul der Probe für die quantitative PCR (qPCR) Assay. Berechnen Sie den Titer.\nFühren quantitative PCR (qPCR) mit den entworfenen Primer in Schritt 4.1.1 die Proben fr mitom Schritt 4.1.4 (Standardproben) und aus Schritt 4.5 (Proben gemessen werden).\nFür jede Reaktion, Mischungs 10 ul 2x Grün Mastermix (enthaltend Taq - Polymerase, dNTP - Mix, Puffer, MgCl 2 und Grün - Farbstoff), 0,5 & mgr; l Vorwärts - Primer (5 & mgr; M), 0,5 & mgr; l Rückwärts - Primer (5 & mgr; M), 8 & mgr; l H 2 O und 1 ul der Probe gemessen werden. Führen qPCR mit den folgenden Bedingungen: Halten der Proben bei 50 ° C für 2 min und 95 ° C für 10 min; 40 Zyklen bei 95 ° C durchzuführen für 15 sec und bei 60 ° C für 1 min; für die Schmelzstufe, Inkubation der Proben bei 95 ° C für 30 sec und 60 ° C für 15 sec. Generieren Sie die Standardkurve auf der Basis der C T - Nummern der Standardproben (Abbildung 3).\nBerechnen Sie die molekulare Konzentration / Titer der AAV Probe gegen die Standardkurve. Die rAAV9 hat einen Einzelstrang-DNA-Genom, so dass die molekulare Konzentration wird 2-fach höher als dieberechneter Wert (2x Leistung (10, y), 3B). Darüber hinaus wird der Titer des gereinigten rAAV9 sein 20-fach höher als das, was bei der Berechnung aufgrund der 1:20 Verdünnung des Virus in DNAse und Proteinase K-Reaktionen (5 & mgr; l in 100 & mgr; l insgesamt) erhalten.\n5. rAAV9 Injektion in neugeborenen Mäusen und Gene Expression Assays im Herzen\nBereiten Sie rAAV9 Arbeitslösungen in Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer PBS-Lösung. Machen Sie den Virusstamm mit den Titern von 1-7 x 10 12 Partikel / ml.\nHINWEIS: 50-70 ul rAAV9 Lösung in jedes postnatalen Tag 0,5-1,5 Maus durch subkutane Injektion liefern. Um eine effiziente Genüberexpression oder Zuschlags zu erreichen, ist es empfehlenswert, einen Pilotversuch für jede Studie durchzuführen, um die Menge des injizierten AAV zu optimieren. Verwenden Sie die gleiche Menge an rAAV9.cTNT :: Luc oder rAAV9.U6 :: Gerangel Kontrollen für jede Studie die Vorspannung zu minimieren.\nHINWEIS: Wir haben 1-1,5x 10 11 Partikel / pup zur Überexpression und 2,5-5 x 10 11 Partikel / Welpe für Zuschlag in postnatalen Tag 0,5-1,5 mi ce).\nBehandeln neugeborenen Mäusen mit rAAV9 bei P0.5-P2.5 durch subkutane Injektion.\nVorfüllen eine 29G1 / 2, 0,33 x 12,7 mm Insulinspritze mit der rAAV9 Lösung. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen.\nHalten Sie die Kryo-narkotisierten Welpen in einer Hand mit Daumen und Zeigefinger. Vor der Injektion bewegen, um die Rückenhaut des Welpen mit einem Stock Tupfer mit 70% Isopropylalkohol gesättigt, um die sterile Zustand zu halten. Legen Sie die Spritzennadel in die anterior-dorsalen Subkutis des Tieres in einem Winkel von 5 bis 10 °. Injizieren 50-70 ul der rAAV9 Lösung, um die Insulin-Spritze.\nHINWEIS: rAAV9 kann auch über intraperitoneale oder intravenöse Injektion 26,27 an der Maus geliefert werden. Effiziente Expression der gelieferten Gene im Herzen erhalten werden. Allerdings intraperitoneale InjectIonen manchmal in leaky-Expression in der Leber führen. Nach der Injektion wurde der Zustand der Welpen täglich überwacht.\nDie Ebene der Genexpression im Herzen kann mit qPCR, Immunofluoreszenz oder Western - Blot überwacht werden 25,26 (repräsentative Ergebnisse sind in den Abbildungen 4 und 5 gezeigt).\nHINWEIS: Die Mäuse wurden durch CO 2 aus einer Druckgasquelle geliefert euthanasiert. Gewebeproben wurden gesammelt, nachdem bestätigt, dass die Herzfrequenz, Bewegung und Atmung der Tiere aufgehört hatte. Neonatal Nagetiere sind resistent 2 Euthanasie zu CO und wurden durch Enthauptung mit einer scharfen Schere eingeschläfert. Das Verfahren ist mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association konsistent.\nDie Strategien für die Konstruktion von rAAV9 rAAV9.cTNT :: GFP oder rAAV9.U6 :: shRNA Plasmide sind in den 1 und 2 gezeigt. Wie die Beispiele wurde die rAAV9 Vektor erzeugt, um das GFP-Gen in der Maus Herzen zu überexprimieren. Das resultierende Plasmid enthält das cTnT :: GFP - Kassette flankiert von zwei ITR Stellen (Abbildung 1). Die rAAV9.U6 :: shRNA Vektor wurde konstruiert TRBP mRNA (Figur 2) zu Knockdown\nDie Standardkurve für rAAV9 Titration wurde mit dem qPCR Daten durch lineare Regression erzeugt. Die Stellgröße y die Log 10 - Wert von DNA - Molekülkonzentration jeder Standardprobe und die entsprechende Variable x den C T - Wert. Die Log 10 (Konzentration) -Werte (y) und C T Zahlen (x) zeigen eine schöne lineare Korrelation (R 2 = 0,9971) und Sitz mit der Gleichung y = -0.2832x + 14,616 (3A). Titern von rAAV9 Proben wurden auf der Basis der linearen Gleichung (3B) berechnet. Mit dem Verfahren in dem Protokoll beschrieben (Schritt 4.6.2 und 3B), einen hohen Titer von rAAV9 Vektoren (50-200 ul,> 6 x 10 13 Partikel / ml) wurde in der repräsentativen Studie erhalten.\nZu überwachen , wurden die Effizienz und die Gewebespezifität der Vektoren rAAV9.cTNT, P0.5 Welpen mit derselben Menge behandelt (1 x 10 11 Partikel / Pup) von rAAV9.cTNT :: Luciferase (AAV-Luc) oder rAAV9.cTNT :: GFP (AAV-GFP) durch subkutane Injektion. Zwei Wochen nach der Injektion wurde das GFP-Signal in verschiedenen Geweben der Mäuse überwacht. Robust Expression von GFP wurde im Herzen festgestellt, aber nicht in anderen Organen (4, n> 3). So effizient und herzspezifische Genexpression wurde mit dem rAAV9.cTNT Vektor erreicht.\njove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Um die Zuschlags Effizienz und Gewebespezifität von rAAV9.U6 Vektoren überwachen, P0.5 - Mäuse wurden mit der gleichen Menge behandelt (3 x 10 11 Partikel / Welpe) von rAAV9 .U6 :: Scramble (AAV-Scramble) oder rAAV9.U6 :: TRBP shRNA (AAV-shTrbp) durch subkutane Injektion. Zwei Wochen nach der Injektion, die Expression von TRBP in verschiedenen Geweben von durch qPCR (Abbildung 5 überwacht wurde, n = 3 ). die mRNA - Spiegel von TRBP im Herzen verringert wurde im wesentlichen durch rAAV9.U6 :: shTrbp (68% Herunterregulieren, P = 0,0004452). Herunterregulierung der TRBP auch in Lebergewebe von rAAV9.U6 erkannt wurde :: shTrbp behandelter Mäusen. jedoch ist die Veränderung wesentlich geringer.\nAbbildung 1: Die Strategien zum Aufbau des rAAV9.cTNT :: GFP Plasmid. (A) Die Regelung der GFP Kassette :: cTnT. (B TNNT2 Promotor (rAAV9.cTNT) durch die beiden einzigartigen Restriktionsstellen (NheI und KpnI) gefolgt zu beherbergen. Die GFP offene Leserahmen wurde durch Restriktionsstelle vermittelte Ligation in den rAAV9.cTNT Vektor kloniert, um das rAAV9.cTNT :: GFP-Plasmid zu erzeugen. (B) Die rAAV9.cTNT :: GFP-Plasmid kann durch Gibson Montage konstruiert werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.\nAbbildung 2: Die Strategien zum Aufbau des rAAV9.U6 :: shRNA Plasmid. (A) Die Regelung der U6 :: shRNA Kassette dargestellt. Die Expression von shRNA wird von der U6-Promotor (blau) angetrieben. (B) rAAV9-U6-shRNA Kassetten können durch Glühen und Ligieren DNA - Oligos erzeugt werden enthaltening shRNA Sequenzen in die Restriktionsenzym-verdaute rAAV9 Vektoren beherbergen die U6-Promotor. (C) rAAV9.U6 :: shRNA Kassetten können durch Langstrecken - PCR und intramolekulare Gibson Montage-basierte "nahtlose" Konstruktion erzeugt werden. Der 5'-Arm, Schleife und 3 'Arm von shRNA sind grün, orange und rot gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.\nAbbildung 3: Die Berechnung der rAAV9 Titer. (A) Die Standardkurve für rAAV9 Titration wurde durch lineare Aggression mit der qPCR - Daten erzeugt. Die Stellgröße y die Log 10 - Wert von DNA - Molekülkonzentration jeder Standardprobe und die entsprechende Variable xstellt den C T - Wert. (B) Die Titer von rAAV9 Proben werden auf der Basis der linearen Gleichung der Standardkurve berechnet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.\nAbbildung 4: Expressionsmuster von rAAV9.cTNT :: GFP in Mäusen Gewebe. P0.5 Welpen wurden mit derselben Menge (1 x 10 11 Partikel / Pup) von rAAV9.cTNT :: Luciferase (AAV-Luc, negative Kontrolle) oder rAAV9.cTNT :: GFP (AAV-GFP) durch subkutane Injektion behandelt. Zwei Wochen nach der Injektion wurden die Gewebeproben geerntet. Die Expression von GFP wurde unter einem Fluoreszenz-dissection Rahmen überwacht. Sowohl Hellfeld und Fluoreszenzbilder werden vorgestellt. Die Experimente wurden mehr als 3-mal wiederholt (n> 3).Maßstabsbalken = 2,0 mm. SkM, Skelettmuskel. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.\nAbbildung 5: Preissturz Genexpression mit AAV-shRNA. P0.5 - Mäuse wurden mit der gleichen Menge (3 x 10 11 Teilchen / Pup) von rAAV9.U6 :: Scramble (AAV-Scramble) oder rAAV9.U6 :: TRBP shRNA (AAV-shTrbp) durch subkutane Injektion behandelt. Zwei Wochen nach der Injektion, wobei die mRNA-Spiegel von TRBP in verschiedenen Geweben wurden durch qPCR überwacht (n = 3). Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Der Cut-off-P-Wert beträgt 0,05. NS, P> 0,05 ist, nicht signifikant. ** P <0,01. SkM, Skelettmuskel. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.\nEs ist wichtig, unerwünschte ITR Rekombination während der Plasmidkonstruktion zu minimieren. Bevor das Virus zu erzeugen, muss man immer die ITR Integrität der AAV-Plasmiden überwachen durch Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese. Es ist unmöglich, 100% intakte Plasmide zu erhalten, aber die Rekombination Verhältnis sollte so weit wie möglich minimiert werden. Weniger als 20% ist akzeptabel für erfolgreiche rAAV9 Verpackung. Bemerkenswert ist, bei einer niedrigeren Temperatur die Bakterien Kultivierung (30 ° C) mit einer niedrigeren Schüttelgeschwindigkeit (180-200 Umdrehungen pro Minute) kann die Wahrscheinlichkeit der ITR Rekombination reduzieren.\nEs ist unbedingt darauf zu achten, dass die HEK293-Zellen gesund sind für eine erfolgreiche Transfektion und rAAV9 Verpackung. "Gesunde" Zellen sind in der Regel hoch proliferativen und schnell wachsen. Allerdings ist eine schnelle Vermehrung und das Wachstum von HEK293-Zellen nicht notwendigerweise die hohe Effizienz rAAV9 Verpackung garantieren. Somit ist es wichtig, die Experimente mit frischen Zellen zu starten. Esempfohlen Nieder Passage HEK293-Zellen zu verwenden, um rAAV9 Verpackung (<10 Passagen, die Zellen alle 2-3 Tage passagiert). Zu beachten ist , andere Serotypen von rAAV benötigen 32 unter Verwendung verschiedener Verfahren gereinigt werden.\nDer Prüfer ist Flexibilität bei der Erzeugung von rAAV9 Plasmide gewährt. Entweder Restriktionsstelle vermittelte Ligatur oder Gibson Baugruppe kann 30 verwendet werden. Für die rAAV9.U6 :: shRNA Konstruktion, die intramolekulare Gibson Montage-basierte Strategie ist eine wirksame Methode (Abbildungen 1 und 2). Mehrere AAV-shRNA Plasmide oder gepoolte AAV-shRNAs schnell aufgebaut werden kann. Überexprimiert Gene mit rAAV9, gibt es eine Größenbeschränkung für inserierten cDNA-Sequenzen. Im Allgemeinen muss die Größe Fragment zwischen ITRs , um kleiner als 5 kb 33. Intein-katalysierte Protein - Splicing können die Verpackungsgrößenbeschränkung von rAAV9 Vektoren 34 zu umgehen , verwendet werden.\nAndere virale Systems, einschließlich Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus und haben auch flexible Genmanipulation entwickelt und ermöglicht worden. Verglichen mit diesen verschiedenen Arten von viralen Vektoren, hat rAAV spezifische Vorteile: hohe Effizienz, hohe Spezifität, geringe genomische Integrationsrate, minimal Immunogenität und minimale Pathogenität. So rAAV-basierte Genomtechnik zeichnet sich als ein ideales Werkzeug für die in - vivo - Gen - Manipulation.\nFrühere Studien haben gezeigt , dass die rAAV9 System die effiziente Expression von Genen in vivo geliefert ermöglicht. Mit dem cTnT (Huhn TNNT2) -Promotor, herzspezifische Genexpression erhalten (Abbildung 4) 25,26. Obwohl der U6 - Promotor ubiquitär aktiv in Mausgeweben ist, eine auffallendste Hemmung der Ziel - mRNA (TRBP) durch rAAV9.U6 :: shRNA wurde im Herzen beobachtet, aber nicht in anderen Organen (Abbildung 5). Die Leber ist das am häufigsten organ transduziert von verschiedenen SerotypenrAAV 35,36. Allerdings ist die Zuschlags Effizienz (36% ige Reduktion der mRNA-Ebene) in der Leber deutlich geringer als die im Herzen (68% ige Reduktion der mRNA-Ebene). Dies steht im Einklang mit der früheren Studie , dass zeigt trotz höherer viralen Genoms Anwesenheit in der Leber, die systemische Verabreichung von shRNA von rAAV9 effizienter Gen liefert 35 im Herzen Knockdown. Es ist möglich, dass Hepatozyten mehr proliferative sind als Kardiomyozyten und mehr aktiv Zellteilung nach rAAV9 Verabreichung an den Neugeborenenalter unterziehen, die im Lebergewebe im wesentlichen Vektorgenom Verdünnung führt. Aber auch dies legt nahe, dass der Serotyp rAAV9 effizienter Kardiomyozyten im Vergleich zu anderen Zelltypen transduzieren kann. Wie von Lovric et al., In differenzierten Myocyten werden die DNA - Schadensantwort MRN komplexe Proteine reprimiert. MRN-Komplex-Proteine binden AAV-Genome und AAV-Transduktion durch Transkriptions Silencing hemmen. Somit permissivity zu AAV - Transduktion kann durch die terminale Differenzierung von Kardiomyozyten 36, so dass die rAAV9 System im Vergleich zu anderen viralen Vektoren, sehr geeignet für Genmanipulation im Herzen induziert werden. Um die unerwünschten Effekte Knockdown in andere Organe zu minimieren (zB die Leber), man kann auch herzspezifischen Promotor cTnT getriebenen miR-30a-basierte shmiR verwenden , um die Gene von Interesse in das Herz 29 zu unterdrücken . Dieses Manuskript gibt dem Leser die spezifischen Techniken für die kardiovaskuläre Untersuchungen über die rAAV9 Technologie kapitalisieren.


Ihre Suche nach Geflügelgruppe ergab 33 Treffer.\nGute Chancen für Sofiprotéol\nVor Verkauf. Insolventer Geflügelvermarkter Doux könnte schon bald in neue Hände kommen. 15 Angebote. Die besten Aussichten hat Gruppe Sofiprotéol.\nStaat hilft Doux nicht\nAbsage. Französischer Staatlicher Investor Fonds will dem angeschlagenen Geflügelspezialisten Doux nicht unter die Arme greifen. Noch vor einem Monat war dies in Erwägung gezogen worden.\nStaatsfonds investiert bei Doux\nFinanzspritze. Staatlicher Investitionsfonds könnte in Kürze in Kapital von Europas größtem Geflügelanbieter eintreten. Bisher fest in Familienhand. Rückkehr in Gewinnzone bereits geschafft.\nGeflügelgruppe Duc wächst weiter\nHalbjahresbilanz. Französische Geflügel-Gruppe meldet zweistellige Umsatzsteigerungen. Höhere Preise und mehr höhe veredelte Produkte. Mehr Hähnchen, weniger Puten.\nPlukon stärkt sich mit Stolle\nZukauf. Niederländischer Geflügelkonzern Plukon Royale will sich mit deutschem Konkurrenten Stolle zusammenschließen. Neuer Geflügelriese strebt bedeutende Position in Deutschland an.\nLDC baut Vorsprung weiter aus\nHöhenflug. Frankreichs umsatzstärkste Geflügelgruppe erreicht mit geplanter Übernahme von Arrivé nationalen Marktanteil von fast 30 Prozent. In Deutschland stark mit Label Rouge- und Loué-Geflügel vertreten. Weitere Akquisitionen.\nDoux schließt erneut Betriebe\nAnkündigung. Französischer Geflügelvermarkter will zwei Betriebe schließen. Wettbewerbsfähigkeit soll steigen. 600 Arbeitsplätze gefährdet.\nMichael Zube für Marketing & Sales zuständig\nbenennt Managing Director Marketing & Sales.\nDoux verbessert Ertragslage\nGewachsen. Französische Geflügelgruppe erhöht Umsatz bis Ende Juni bei unveränderten Mengen um 2,9 Prozent. Nettogewinn von 5 Mio. Euro nach 14 Mio. Euro Verlust. Europas größter Geflügelexporteur.\nLDC übernimmt bei Enten die Führung\nFührung. Bretonische Geflügelgruppe übernimmt Aktivitäten von Erzeugergenossenschaft Coopérative des Agriculteurs du Morbihan (CAM). Bei Enten und Puten künftig Nummer eins.\nDoux spürt keinen Druck der Banken\nSpekulationen. Französische Geflügelgruppe mit neuem Direktor. Gläubiger nehmen angeblich massiv Einfluss. Vorstand bezeichnet Verhältnis als normal. Erfolgreicher Jahresabschluss 2003.\nNeue Diskussionen. Vertreter von Bund und Ländern debattieren gemeinsam mit BSE-Experten Maßnahmen zum Schutz der Verbraucher. Hintergrund ist die brisante Entwicklung in Frankreich.\nBourgoin-Pleite hat Folgen\nNach Auskunft des französischen Bauernverbandes sind zahlreiche Geflügelerzeuger durch den Bourgoin-Zusammenbruch mit rund 500 Mio. DM Schulden in ihrer Existenz bedroht oder als Folge ebenfalls in Konkurs.\nGeflügelgruppe Bourgoin muss Teilkonkurs anmelden\nKollaps. Zweitgrößter europäischer Geflügelvermarkter in schwerer Krise. BSAD, Tocher des französischen Konzerns, zahlungsunfähig. Über BSAD wickelt Bourgoin Dreiviertel des Gesamtvolumens ab.


Karben soll Vorbild beim Klimaschutz bleiben - Wald weiter aufforsten\nBereits im August hatte das Stadtparlament auf Antrag der CDU einen Grundsatzbeschluss für weitere Aufforstungen im Karbener Wald gefasst. Einen Monat später fand ein SPD-Antrag mit ähnlicher Intention die Zustimmung. Nun legen die Christ- und Sozialdemokraten nach und konkretisieren ihr Vorhaben in einem gemeinsamen Antrag. Für die anstehenden Haushaltsberatungen wollen sie 20.000 € zur Aufforstung von rund einem Hektar Wald budgetieren.\n"Hierfür bietet sich eine landwirtschaftlich nur eingeschränkt nutzbare Fläche in der Nähe der Biogasanlage an. Ein Hektar Wald speichert pro Jahr über alle Altersklassen hinweg etwa 13 Tonnen CO2 – jeder Hektar ist ein kleiner Beitrag zum Klimaschutz. Sukzessive können weitere Projekte in Abstimmung mit Hessen Forst in Angriff genommen werden", begründet CDU-Vize Albrecht Gauterin die Initiative.\nDas eigentliche Ziel der Union sei, die Wärmeversorgung der städtischen Liegenschaften künftig CO2 neutral zu gestalten, sprich den mit Erdgas und Heizöl verbundenen Ausstoß zu kompensieren. Gauterin weiter: "Nachdem wir schon die Elektrizitätsversorgung auf Ökostrom umgestellt haben, sollten wir nun auch bei der Wärme den nächsten Schritt gehen. Hierzu stellen wir Haushaltsmittel in Höhe von 1.500 € ein, um VER-Zertifikate (Verified Emission Reductions) zu erwerben, die unter anderem den Waldschutz in Afrika oder Südamerika gewährleisten. Hier lässt sich mit geringem Aufwand viel erreichen."\nDie Stadt Karben bekenne sich zu ihrer Vorbild-Funktion in Sachen Klimaschutz. "Nach dem Bau der Biogasanlage und mehrerer PV-Anlagen, energetischen Sanierungen vom Schwimmbad und von anderen Liegenschaften, der LED-Umstellung der Straßenbeleuchtung, dem Ausbau der Elektromobilität und vielem mehr gehen wir nun weitere Schritte. Wir verfolgen dabei immer das Ziel, ökologische Verantwortung und ökonomische Vernunft in Einklang zu bringen", so Gauterin.\nEin weiterer Haushaltsantrag der Union beschäftigt sich damit, bei den Mittel für Straßenbaumaßnahmen die Umgestaltung Uhlandstraße in Klein-Karben aufzunehmen. Damit soll der Anregung des Ortsbeirats und der Anwohner Rechnung getragen werden, dass diese Straße als Spielstraße bzw. verkehrsberuhigter Bereich ausgewiesen bleiben kann. Außerdem sollen nicht genutzte Haushaltsreste für WLAN-Versorgung der Innenstadt ins neue Jahr übertragen werden.


Artosy Duschrollsuhl Ergo - Rolli-World GmbH\nStartseite/Reha Produkte/Duschrollstühle/Artosy Duschrollsuhl Ergo\nArtosy Duschrollsuhl ErgoRolli World2022-02-02T13:03:35+01:00\nArtosy Duschrollstuhl Ergo\nDer Dusch- und Toilettenrollstuhl Artosy Ergo\nJeder Rollifahrer kennt das Problem fehlender bzw. ungeeigneter WCs und Duschen, besonders unterwegs. Doch dagegen ist ein Kraut gewachsen: das Hygienesystem artosy lässt sich komplett zerlegen bzw. falten und sogar im Koffer transportieren!\nDen Kern des Systems bildet das Sitzgestell mit paragerechten Sitzpolstern. Je nach Einsatzbereich wird die–se Sitzeinheit mit verschiedenen Unterbauten ergänzt. Alle Rahmenteile werden aus rostfreiem Edelstahl gefertigt und zur leichteren Reinigung zusätzlich pulverbeschichtet.\nartosy kann optimal an den Benutzer angepasst werden. Alle Modelle lassen sich in der Sitzbreite und der Sitztiefe einstellen. Die Hygienerollstühle sind zusätzlich in der Höhe verstellbar! Daher ist artosy sowohl für Kinder, als auch für Jugendliche und Erwachsene unterschiedlichster Statur geeignet.\nHMV-Nr.: 18.46.01.0021 (Modell Ergo)\nWeitere Informationen finden Sie unter anderem auf: https://www.artosy.info/\nBildmaterial Copyright mfh Finsterbusch & Wanke OHG


ADHS Selbsthilfe für Eltern - 2010, 2009, 2008 » Positive Erfahrung\n#1 Positive Erfahrung Antworten\ngestern ist mir bzw. uns etwas passiert, das mir die Tänen in die Augen getrieben hat.\nEs fing erst mal gar nich so schön an. Also: Ich bekam einen Anruf von der Elternbeirätin meines Sohnes, sie würde gleich mal vorbeikommen, ob ich kurz Zeit für sie hätte. Es steht der Abschluß der Klasse bevor, da sich ja nun ihre Wege trennen (4.Kl). Es ist eine Übernachtung geplant und nun gäbe es ein paar Eltern, die bedenken haben, wenn mein Sohn mitfährt. Es gab wohl in letzter Zeit wieder ein paar Fälle, wo er sich verbal vergriffen hat und wohl auch mal gehauen hat. Ich habe dann den Vorschlag gemacht, da Sohn ja unbedingt mit will, daß ich mitfahren würde.\nDaraufhin war die Elternbeirätin einverstanden und meinte auch, er sei doch ein lieber Kerl und sie findet es sehr schade, daß er sich so leicht reizen läßt, und daß sie ja verstehen kann, daß er nichts dafür kann.\nAlso ging sie dann.\nEine Stunde später stand sie wieder bei uns in der Tür und hat ihm einen Umschlag gegeben, darin ein kleiner persönlicher Brief von ihr und zwei Steine, die sie ihm im Steinladen besorgt hat, die er in seiner Hosentasche mitnehmen kann. Ich war total perplex, daß sich jemand so für ihn einsetzt und ihm klar macht, daß er trotz seiner Schwierigkeiten ein liebenswerter Mensch ist.\nEs gibt doch noch gute Menschen.....\nVielleicht macht es allen, die gerade eine Schwierige und verzweifelte Zeit durch machen, so wie wir eine kleinen Lichtblick.\n#2 RE: Positive Erfahrung Antworten\nDa sieht man mal wieder ...es gibt Menschen mit HERZ und Verstand!!!!!!\nSchön das man sich über soooo kleine Sachen so freuen kann .\n«« Am Ende mit meinem Latein\nEndspurt - immer so mühsam ? »»