Medizinwelt | Medizinstudenten Charite | Biochemie und Molekularbiologie des Menschen | Zielsteuerung und intrazellulärer Transport von Proteinen\nMedizinweltMedizinstudenten ChariteBiochemie und Molekularbiologie des MenschenBuchkapitelZielsteuerung und intrazellulärer Transport von Proteinen\nDissoziation und Neubildung der Kernmembran während des Zellzyklus. Durch geeignete Transportprozesse müssen nach der Auflösung des Zellkerns die löslichen Kernproteine, die sich zunächst im Zytosol verteilt hatten, erneut in den entstehenden Zellkern importiert werden.\nSchnitt durch eine Kernpore. Die Kernpore wird von Nucleoporinen gebildet, die in achtzähliger Rotationssymmetrie angeordnet sind. Die Struktur und die Funktion der als Transporter bezeichneten Struktur sind noch nicht endgültig geklärt.\nImport eines Proteins aus dem Zytosol in den Zellkern. Das zu importierende Protein (die Fracht) trägt eine Kernlokalisationssequenz (NLS). Ran GTP-bindendes Protein, GEF Guaninnucleotidaustauschfaktor.\nPräsequenz der Ornithin-Transcarbamylase (OTC). Die Präsequenz wird nach Import in die Mitochondrien zwischen den Aminosäuren in Position 32 und 33 abgespalten.\nDie Proteinimportmaschinerie der Mitochondrien. Der TOM-Komplex vermittelt den Proteintransport über die mitochondriale Außenmembran (AM). Gezeigt sind nur die drei wichtigsten Tom-Proteine. Der Proteinimport über den Intermembranraum (IMR) wird z.T. von mehreren kleinen Tim-Proteinen von 8–13 kDa vermittelt. Die Innenmembran (IM) enthält zwei unterschiedliche TIM-Komplexe, die beide zu ihrer Funktion das Membranpotenzial benötigen. Nur der Tim23-Komplex kooperiert mit mtHsp70. Die MPP (matrix processing peptidase) spaltet N-terminale Präsequenzen von Vorstufenproteinen ab.\nTransport mitochondrialer Vorstufenproteine über die Innenmembran\na) in einem ersten Schritt durch einen elektrophoretischen Effekt des Membranpotenzials auf die Präsequenz,\nb) in den folgenden Schritten durch mtHsp70.\nChaperonproteine begleiten mitochondriale Vorstufenproteine sowohl im Zytosol als auch in der mitochondrialen Matrix. In beiden Kompartimenten zählen die Mitglieder der Hsp70-Familie zu den wichtigsten Chaperonproteinen. mtHsp70 ist das Hsp70 der mitochondrialen Matrix. Die Wechselwirkungen mit Hsp70 im Zytosol und in der Matrix sind der entscheidende Grund der ATP-Abhängigkeit des mitochondrialen Proteinimports.\nFunktion des Peroxins Pex5. Die Zielerkennungssequenz vom Typ PTS1 dient zunächst der Bindung an das Protein Pex5 im Zytosol. Die Ablösung von Pex5 und der Import in die Peroxisomen werden von mehreren anderen Peroxinen vermittelt.\nSchema des SRP-Zyklus. SRP (signal recognition particle) bindet gleichzeitig an das Ribosom und an die hydrophobe Signalsequenz. Die Translation des Proteins wird dadurch aufgehalten und erst am Translocon wieder aufgenommen. Die tatsächlichen Größenverhältnisse der ribosomalen Untereinheiten und des Sec61-Komplexes zeigt Abb. 17.10.\nSchnitt durch das Ribosom und den assoziierten Sec61-TRAM-Komplex. Der Kanal durch die große Untereinheit des Ribosoms hat eine Länge von ca. 9 nm und eine Weite von ca. 2 nm.\nFaltungshelfer des ER-Lumens.\na) Domänen des Chaperons BiP. Bei Austausch des gebundenen ADP gegen ATP kommt es zu Konformationsänderungen, und die peptidbindende Domäne öffnet sich. Substratpeptide können dann leicht abgegeben oder aufgenommen werden. Nach Hydrolyse des ATP zu ADP wird das gebundene Substratpeptid hingegen festgehalten. Die ATP-Hydrolyse wird durch Bindung an das Partnerprotein Sec63 stimuliert. Alle anderen Mitglieder der Hsp70-Familie zeigen grundsätzlich den gleichen Aufbau.\nb) Die Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) bildet mit ihren Substratproteinen kovalente Bindungen aus. Reduzierte PDI wird durch Glutathiondimere (GSSG) oxidiert (regeneriert), die im Lumen des ER in hoher Konzentration enthalten sind.\nVerankerung von Proteinen in Membranen durch Fettsäuren. Palmitinsäure und Myristinsäure verankern Proteine, die zum Zytosol exponiert sind; GPI-verankerte Proteine befinden sich an der Außenseite der Plasmamembran.\nStruktur von Dolicholphosphat (a) und Bildung N-gebundener Kohlenhydratseitenketten (b).\nQualitätskontrolle der Proteinfaltung im ER. Die Struktur der Kohlenhydratseitenketten ist in Abb. 17.13 dargestellt.\nRöntgen-Aufnahme des Thorax bei Mukoviszidose. Das Fehlen des CFTR in den Plasmamembranen beeinträchtigt in der Lunge die Immunabwehr und äußert sich deshalb in häufigen bakteriellen Infektionen. Die Aufnahme zeigt die dadurch ausgelöste chronische Entzündung sowie entzündungsbedingte sackartige Ausweitungen der Bronchien (Bronchiektasen).\nSekretion und vesikulärer Transport. ER endoplasmatisches Retikulum, COP Coat protein, VTC vesikotubuläre Cluster, TGN trans-Golgi-Netzwerk, AP Adapterprotein.\nEinleitung der Membranfusion. Das SNARE-Protein des Vesikels und das SNARE-Protein der Zielmembran bilden zusammen mit SNAP-25 einen Komplex, in dem sich vier SNARE-Motive (-helikale Sequenzabschnitte von ca. 60 Aminosäuren) zusammenlagern. Die SNARE-Motive liegen parallel, sodass alle C-Termini zur jeweiligen Membran zeigen. Es bildet sich eine Coiled-coil-Struktur, in der sich die vier -Helices gegenseitig umwinden.\nDer NSF-Komplex kann SNARE-Komplexe in einer ATP-abhängigen Reaktion auflösen. NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor) zählt zur Gruppe der AAA-ATPasen. -SNAP (Soluble NSF attachment protein) dient dem NSF als Adapter.\nFusion sekretorischer Vesikel mit der präsynaptischen Membran. Synaptotagmin-1 vermittelt die Calciumabhängigkeit der Fusion.\nBildung clathrinummantelter Vesikel bei rezeptorvermittelter Endozytose.\na) Adapterproteine (AP) bilden Komplexe mit Clathrin und einem Rezeptorprotein, z.B. dem Mannose-6-phosphat-Rezeptor.\nb) Struktur des Clathrin-Triskelions.\nc) Bildung des Vesikels. Der Clathrinmantel hat eine korbartige Struktur. Jede Verstrebung besteht aus vier schweren Ketten und kommt durch eine Überlagerung mehrerer Clathrinmoleküle zustande, wobei sich zwei Unterschenkel und zwei Oberschenkel antiparallel zusammenlagern. An der Abschnürung des Vesikels von der Membran ist das GTP-bindende Protein Dynamin beteiligt.\nd) Außenansicht eines Vesikels.\nAufnahme und retrograder Transport des Choleratoxins. Das Choleratoxin gehört zur Gruppe der bakteriellen Toxine vom AB5-Typ. Eine toxische A-Untereinheit ist dabei mit fünf B-Untereinheiten verbunden, die der Bindung des Toxins an die Zielzelle dienen.\nPrinzipien des intrazellulären Proteintransports 492\nTransportproteine der Importin--Familie494\nImport in den Zellkern494\nExport aus dem Zellkern495\nMitochondrialer Proteintransport 496\nZielerkennungssequenzen mitochondrialer Proteine496\nDer TOM-Komplex der Außenmembran496\nDie beiden TIM-Komplexe der Innenmembran497\nMechanismen des mitochondrialen Proteintransports498\nDie Biogenese der Peroxisomen 500\nPEX-Gene und Peroxine500\nProteintransport in das endoplasmatische Retikulum 501\nDas Ribonucleoprotein SRP501\nDie Importpore des ER502\nProteinfaltung und Proteinmodifikationen im ER503\nKontrolle der Proteinfaltung im ER505\nTransport durch COP-I- und COP-II-Vesikel507\nProteinreifung im Golgi-Apparat508\nTransport zu Endosomen, Lysosomen und zur Plasmamembran509\nSekretion von Neurotransmittern511\nEndozytose über Lipid rafts und Caveolae513\nDie letzte große Choleraepidemie Europas brach im August 1892 in Hamburg aus. Die Erreger verbreiteten sich bei hochsommerlichen Temperaturen über verschmutztes Trinkwasser. Betroffen waren v.a. die Armutsviertel der Innenstadt. Robert Koch, der als Experte aus Berlin gerufen wurde, zeigte sich über die hygienischen Verhältnisse in der Stadt entsetzt. Innerhalb von zehn Wochen erkrankten 16.956 Einwohner, von diesen starben 8605. Der Erreger der klassischen Cholera, Vibrio cholerae, war von Robert Koch erst wenige Jahre zuvor (1883) bei Untersuchungen in Ägypten entdeckt worden. Cholera beginnt schlagartig mit heftigem Erbrechen und wässrigen Durchfällen. Es kommt zu enormen Flüssigkeitsverlusten von bis zu 20 L/Tag. Das entscheidende Toxin von Vibrio cholerae ist das Choleratoxin. Es handelt sich um einen Proteinkomplex, der von den Bakterien an die Umgebung abgegeben wird. Für die Toxizität ist letztlich das Fragment A1 des Toxins entscheidend, eine ADP-Ribosyl-Transferase, die im Zytosol der Enterozyten in die Regulation der cAMP-Synthese eingreift. Über einen außerordentlichen Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration wird ein massiver Ausstrom von Chloridionen ausgelöst, der dann die Ursache der Diarrhö ist. Die Ursachen der Cholerasymptome scheinen damit geklärt. – Aber wie gelangt das Fragment A1 in das Zytosol der Enterozyten?\nWie gelangt ein bakterielles Toxin in das Zytosol einer Zelle des Wirtsorganismus? Wie gelangen unter physiologischen Bedingungen die vielen ständig in einer Zelle synthetisierten Proteine an ihre jeweiligen Bestimmungsorte? Außer den 13 mitochondrial kodierten Proteinen sind alle etwa 30 000 bis 40 000 Proteine des Menschen im Kern kodiert und werden von Ribosomen im Zytosol synthetisiert. Diese Proteine entstehen somit alle im gleichen Kompartiment, obwohl sie letztlich in ganz unterschiedlichen Kompartimenten oder sogar außerhalb der Zelle benötigt werden. Ohne eine geordnete Verteilung der synthetisierten Proteine im Raum würde es selbst bei noch so perfekter Genregulation niemals zur Entwicklung eines Organismus oder auch nur einer Zelle kommen, sondern allenfalls zur Anhäufung einer strukturlosen Masse.\nEindrucksvolles Beispiel ist der Kerntransport mit der Auflösung und Neuordnung des Zellkerns im Laufe eines Zellzyklus.\nGanz andere Mechanismen als beim Zellkern laufen beim mitochondrialen Proteintransport ab und entscheidende Rollen spielen auch die Peroxisomen und das endoplasmatische Retikulum (ER) mit seinen zwei Anteilen, dem rauen ER, in dem die Proteine der Plasmamembran synthetisiert werden, und dem glatten ER, das vor allem für den Lipidstoffwechsel, die Entgiftung und Gluconeogenese eine wichtige Rolle einnimmt.\nFür den Transport vom ER zum Bestimmungsort der Proteine spielt die Sekretion eine große Rolle. Der sekretorische Weg beginnt mit der Synthese der sekretorischen Proteine am ER und endet mit der Exozytose an der Plasmamembran.\nMüssen Proteine oder andere Stoffe von außen in die Zelle aufgenommen werden, so geschieht das durch Endozytose oder Phagozytose.\nPrinzipien des intrazellulären Proteintransports\nViele Proteine enthalten in ihrer Aminosäuresequenz Abschnitte, die über die Verteilung des jeweiligen Proteins in der Zelle entscheiden, und die Zelle enthält offensichtlich eine Maschinerie, die diese Zielerkennungssignale identifiziert und den entsprechenden spezifischen Transport der Proteine in die korrekten Kompartimente vermittelt. Nur die Proteine ohne besondere Signalsequenzen verbleiben nach ihrer Synthese dauerhaft im Zytosol.\nDie ganze Tragweite dieses Prinzips wurde 1975 von Günter Blobel erkannt. Seine frühen Arbeiten zu diesem Thema wirkten außerordentlich anregend auf eine ganze Generation von Biochemikern, die daraufhin die Wege der Proteine in sämtliche Reaktionsräume der Zelle untersucht haben. Für seine bahnbrechenden Beiträge zum intrazellulären Proteintransport erhielt er 1999 den Nobelpreis für Medizin.\nDie Bewegungen der Proteine in den Zellen haben sehr unterschiedliche Gründe. Zunächst ist jede Proteinkette schon aus quantenmechanischen Gründen ständig in Bewegung. Die verschiedenen irregulären Kräfte, die unablässig auf die Proteinmoleküle einwirken, sind die Ursache der Brown'schen Molekularbewegung. So wird eine Gruppe von Molekülen nicht auf Dauer an einem Ort versammelt bleiben, sondern sich durch Diffusion im zur Verfügung stehenden Raum gleichmäßig verteilen, wenn dieser Prozess nicht durch besondere Kräfte oder Strukturen verhindert wird. Damit sich Strukturen ausbilden können, müssen die verschiedenen Proteine in kontrollierter und gerichteter Weise verteilt werden.\nEin gezielter Transport von Proteinen und Membranvesikeln erfolgt z.B. an den Mikrotubuli der Nervenzellfortsätze.\nEin Proteintransport mit Membranvesikeln ist eine der Voraussetzungen bei der Freisetzung von Antikörpern aus den B-Zellen des Immunsystems und der Sezernierung von Insulin in das Blut.\nBei der Translokation von Proteinen über biologische Membranen dagegen gelangen die Proteine in ein neues Kompartiment, z.B. aus dem Zytosol in den Zellkern, in die Mitochondrien oder in das endoplasmatische Retikulum. Der Proteintransport erfolgt dabei oft durch sehr enge Poren, weshalb sich die Proteine während der Translokation vollständig entfalten müssen.\nDie fundamentale Bedeutung des intrazellulären Proteintransports zeigt sich eindrucksvoll in der regelmäßigen Auflösung und Neubildung der Zellkerne im Zellzyklus. Die Struktur der Zellkerne ist in den Zellen wesentlich durch die Kernhülle bestimmt. Die Hüllmembran der Zellkerne ist ein Derivat des endoplasmatischen Retikulums (ER). Sie besteht aus einer äußeren und einer inneren Membran, die durch einen schmalen Hohlraum, die perinucleäre Zisterne, voneinander getrennt sind (Kap. 16.2.2). Sowohl die Membranen als auch dieser Hohlraum stehen in Verbindung mit dem ER. An die Innenseite der Kernmembran ist ein Netzwerk angelagert, das von bestimmten Proteinen gebildet wird und die kugelförmige Struktur des Zellkerns stabilisiert. Dieses Netzwerk wird als Kernlamina bezeichnet (Kap. 16.2.3). Die Kernlamina ist normalerweise sehr stabil. Bei jeder Mitose zerfällt sie aber in Einzelteile, und die Kernmembran löst sich in Membranvesikel auf. Wenn nach der Trennung der Chromosomen die beiden Tochterzellen entstehen, bildet sich der Zellkern in jeder Tochterzelle gänzlich neu, und die löslichen Proteine des Kernplasmas werden anschließend aktiv aus dem Zytosol importiert (Abb. 17.1). Hierzu gehören z.B. sämtliche Transkriptionsfaktoren, die Histone und das pentamere Protein Nucleoplasmin, das im Kernplasma in größeren Konzentrationen vorhanden ist. Es vermittelt als molekulares Chaperon die Wechselwirkungen der DNA mit den Histonen und ist damit für die Bildung der Nucleosomen und der Chromatinstruktur von Bedeutung.\nSobald die Kernmembran aufgebaut ist, erfolgt jeder weitere Transport von Makromolekülen in den Kern hinein und aus ihm heraus durch große Kernporen. Jede Kernpore wird von einem großen ringförmigen Proteinkomplex gebildet, der beide Membranen der Kernhülle durchspannt und als Kernporenkomplex (nuclear pore complex, NPC) bezeichnet wird (Abb. 17.2). Ein einzelner Zellkern enthält ca. 3000–5000 derartige Kernporenkomplexe. Zumindest zeitweise wird jede Kernpore von mehreren Proteinmolekülen pro Sekunde passiert.\nAlle Kernporenkomplexe haben die gleiche Struktur (Abb. 16.6 und 17.2). Sie besitzen einen äußeren Durchmesser von 145 nm und eine achtzählige Rotationssymmetrie: Acht gleichartige Bauelemente sind in einem Kreis angeordnet; jedes der Bauelemente besteht wiederum aus einer Vielzahl unterschiedlicher Proteine. Die Proteine, aus denen die Kernporen aufgebaut sind, werden als Nucleoporine bezeichnet. Jedes der Nucleoporine liegt achtmal oder in Vielfachen von 8 vor. Die Molekülmasse einer einzelnen Kernpore liegt bei 125.000 kDa (zum Vergleich: Cytochrom c hat eine Molekülmasse von 12,4 kDa).\nDer zentrale Teil des Kernporenkomplexes wird vom sog. Spoke complex gebildet, der entfernt an ein Rad mit Speichen erinnert. Die große Radnabe in der Mitte wird als Transporter\nbezeichnet und bildet vermutlich die eigentliche Pore. Diese kann Partikel bis zu einem Durchmesser von 26 nm hindurchlassen. Normalerweise scheint der Innendurchmesser der Kernporen allerdings bei nur 9 nm zu liegen.\nAuf der zytoplasmatischen Seite liegt dieser Struktur ein großer Ring auf, in dem acht Filamente verankert sind, die in das Zytosol hineinragen. Auf der Seite des Kernplasmas befindet sich ebenfalls ein Ring. In diesem ist der nucleäre Korb (nuclear basket) verankert, der wiederum aus acht Filamenten gebildet wird, an deren Enden zudem ein weiterer Ring befestigt ist.\nAlle diese Strukturelemente werden von insgesamt mindestens 50 unterschiedlichen Nucleoporinen gebildet.\nKernporenkomplexe zeigen eine achtzählige Rotationssymmetrie. Ihre Komponenten werden als Nucleoporine bezeichnet.\nTransportproteine der Importin--Familie\nDa der Innendurchmesser der Kernporen bei 9 nm liegt, können verschiedene Proteine frei durch diese Poren hindurchdiffundieren, sofern sie dazu klein genug sind (< ca. 40 kDa). Tatsächlich ist der Anteil der frei diffundierenden Proteine aber gering. Für den Kerntransport ist vielmehr charakteristisch, dass er nicht durch einfache freie Diffusion, sondern durch Bindung an ein Transportprotein erfolgt.\nDer Kerntransport wird fast immer von bestimmten Transportproteinen (transport receptors) vermittelt, die alle miteinander verwandt sind und als Importin--Proteine (oder Karyopherine) bezeichnet werden (Abb. 17.3). Die Importin-\n-Proteine sind vergleichsweise groß, ihre Molekülmasse liegt bei 100 kDa. Säugerzellen scheinen mindestens 22 Mitglieder dieser Familie zu enthalten. Sie unterscheiden sich durch die Spezifitäten für ihre jeweiligen Substratproteine. Zudem unterscheidet man die Importine im engeren Sinne des Wortes, die den Import von Proteinen in den Kern vermitteln, von den Exportinen, die zwar zur gleichen Proteinfamilie gehören, deren Funktion aber darin besteht, den Export von Proteinen aus dem Kern zu ermöglichen.\nDie Substratproteine binden an ihr jeweiliges Importin z.T. direkt, z.T. unter Vermittlung eines Adapterproteins. Mehrere derartiger Adapterproteine bilden wiederum eine Proteinfamilie, die als Importin--Proteine bezeichnet werden. Sechs Mitglieder dieser Familie sind bereits bekannt. Mit Importin sind die Importin--Proteine aber strukturell nicht verwandt. Das Nucleoplasmin des Kernplasmas wird z.B. zunächst im Zytosol synthetisiert. Dort bindet es an Importin , und dieses wiederum bindet an Importin . Der trimere Komplex gelangt dann durch die Kernporen hindurch in das Innere des Zellkerns, wo er zerfällt und damit das Nucleoplasmin freisetzt.\nEinige Proteine, z.B. das ribosomale Protein L5 und das Rev-Protein des AIDS-Virus (HIV-Rev), binden ohne Beteiligung von Importin direkt an ein Importin und werden von diesem ohne Beteiligung eines Adapterproteins in den Kern transportiert.\nDie meisten Proteine, die in den Kern importiert werden, sind während der Translokation an Transportproteine gebunden, die als Importin--Proteine (oder Karyopherine) bezeichnet werden. Alle Importin--Proteine sind sich strukturell sehr ähnlich.\nImport in den Zellkern\nKernproteine unterscheiden sich von den zytosolischen Proteinen dadurch, dass sie ein Kernlokalisationssignal (nuclear localization signal, NLS) enthalten.\nDieses besteht im Fall des Nucleoplasmins aus der Aminosäuresequenz\nSowohl Lysin als auch Arginin sind positiv geladene Aminosäuren. Unter Vermittlung dieser Kernlokalisationssequenz bindet das Nucleoplasmin an Importin , mit dem es in den Zellkern gelangt.\nDas berühmteste (weil als Erstes eingehend charakterisierte) Kernlokalisationssignal eines Proteins ist ein Sequenzmotiv aus dem großen T-Antigen des SV40-Virus. Es handelt sich um die Sequenz\nAuch hier liegt eine Häufung positiv geladener Aminosäuren vor, insbesondere eine Ansammlung von Lysinresten. Im Detail unterscheidet sich diese Sequenz aber durchaus von der Kernlokalisationssequenz des Nucleoplasmins.\nAllgemein handelt es sich bei den Importin-- bzw. Importin--spezifischen Kernlokalisationssequenzen oft um kurze, im Detail aber variable, lysinreiche Sequenzabschnitte.\nManche Mitglieder der Importin--Familie erkennen allerdings Kernlokalisationssignale, die eine gänzlich andere Struktur zeigen. Es gibt also kein einheitliches Kernlokalisationssignal, sondern mehrere unterschiedliche Erkennungssequenzen. Die NLS-Sequenzen vieler Proteine sind noch gar nicht bestimmt worden.\nKernlokalisationssignale können sich in unterschiedlichen Positionen der Aminosäuresequenz des jeweiligen Proteins befinden. Entscheidend ist, dass sie nach dem Transport in den Kern nicht entfernt werden. Dieses ist für Kernproteine – im Unterschied z.B. zu mitochondrialen Proteinen – deshalb essenziell, weil sich während jeder Mitose der Kern auflöst und sich dann sämtliche Kernproteine im Zytosol verteilen. Wenn nach der Mitose der Kern neu aufgebaut wird, können die Kernproteine nur anhand ihrer Kernlokalisationssequenzen erkannt und wieder eingesammelt werden.\nDas kleine GTP-bindende Protein Ran\nEs hat sich gezeigt, dass GTP beim Kerntransport eine wichtige Rolle spielt. Das Protein, das im Kern mit dem GTP reagiert, ist das kleine GTP-bindende Protein Ran (Abb. 17.3). RanGTP bindet im Kernplasma an die neu importierten Importin--Komplexe und löst deren Dissoziation aus. Damit bewirkt RanGTP im Zellkern die Freisetzung der Substratproteine.\nDer Komplex aus RanGTP und Importin bleibt aber zunächst stabil und wird durch die Kernporen in das Zytoplasma exportiert. Erst dort hydrolysiert das gebundene GTP zu GDP + Pi und der Komplex zerfällt in RanGDP und freies Importin . Anschließend muss das RanGDP wieder zurück in den Kern gebracht werden. Dazu bindet RanGDP an das Protein NTF2 (Nuclear transport factor 2), mit dem es in den Kern wandert. Dort wird das gebundene GDP gegen neues GTP ausgetauscht.\nNTF2 gehört interessanterweise nicht zur Importin--Familie. Ran ist damit ein Beispiel für ein Protein, das Importin--unabhängig in den Kern importiert wird. Darüber hinaus zeigt dieses Beispiel, dass auch kleine Proteine oft mithilfe eines Transportproteins in den Zellkern gelangen und nicht durch einfache Diffusion. Ran hat nämlich eine Molekülmasse von nur 24 kDa.\nDer RanGDP/RanGTP-Gradient als Triebkraft des Kerntransports\nDie Eigenschaften, die Ran gegenüber Importin zeigt, hängen wesentlich davon ab, ob Ran GTP oder GDP gebunden hat:\nIm Zellkern liegt Ran überwiegend in Form von RanGTP vor und vermittelt die Freisetzung der Substratproteine vom Importin .\nIm Zytosol liegt Ran weitgehend in Form von inaktivem RanGDP vor, sodass sich die Substratproteine ungestört an das Importin anlagern können.\nDie unterschiedlichen Arbeitsbedingungen für das Importin werden dadurch aufrechterhalten, dass es im Kern und im Zytosol unterschiedliche Partnerproteine gibt:\nIm Zellkern befindet sich ein Guaninnucleotidaustauschfaktor (RanGEF, Ran guanine nucleotide exchange factor), der die Abgabe des GDP von Ran katalysiert und damit die Beladung von Ran mit neuem GTP ermöglicht.\nIm Zytosol befindet sich ein Ran-spezifisches GTPase-aktivierendes Protein (RanGAP), das Ran veranlasst, das gebundene GTP zu GDP zu hydrolysieren.\nDer RanGDP/RanGTP-Gradient zwischen Zytosol und Kernplasma ist vermutlich die wichtigste Triebkraft für den gesamten Kerntransport. Ein ATP- oder GTP-abhängiger Transportmotor ist in den Kernporen nicht identifiziert worden. Die Kernporen vermitteln sowohl den Import wie den Export des Importins , ohne dass dabei Energie aufgewendet würde. Ob und in welche Richtung dabei weitere Proteine mitgenommen werden, wird letztlich nur vom Konzentrationsverhältnis von RanGDP und RanGTP in Zytosol und Kern bestimmt.\nDer Transport der Importin--Komplexe zu den Kernporen wird dadurch erleichtert, dass viele Nucleoporine (also die Proteine, aus denen die Kernporen aufgebaut sind, oben) wiederholt das Sequenzmotiv Phenylalanin(F)–Glycin(G) enthalten. Die Importin--Komplexe zeigen eine auffällige Affinität zu diesem FG-Motiv.\nKernproteine enthalten in ihrer Aminosäuresequenz definierte Abschnitte, die als Kernlokalisationssignale dienen. Nachdem ein Protein zusammen mit Importin in den Zellkern gelangt ist, wird seine Freisetzung hier durch das GTP-bindende Protein Ran ausgelöst. Triebkraft des Kerntransports ist der RanGDP/RanGTP-Gradient zwischen Zytosol und Kernplasma.\nExport aus dem Zellkern\nDer Export von Proteinen aus dem Kern in das Zytosol wird von Mitgliedern der Importin--Familie vermittelt, die als Exportine bezeichnet werden. Die Exportine binden dabei nicht nur die zu exportierenden Substratproteine, sondern auch RanGTP. Die trimeren Komplexe werden durch die Kernporen in das Zytosol entlassen, wo das GTP hydrolysiert und der Komplex zerfällt. Diesem Prinzip folgt z.B. der Reexport von Importin . Der Export von Proteinen aus dem Kern wird durch Kernexportsignale (nuclear export signal, NES) vermittelt, die oft von längeren Sequenzabschnitten aus über 100 Aminosäuren gebildet werden. Charakteristisch sind hier leucinreiche Sequenzabschnitte.\nInteressanterweise wird auch der Export der tRNA durch ein RanGTP-bindendes Mitglied der Importin--Familie vermittelt. Dieses Protein hat den Namen Exportin-t erhalten.\nDie beiden Untereinheiten der Ribosomen werden im Nucleolus aus den rRNA und ca. 80 verschiedenen ribosomalen Proteinen zusammengesetzt. Alle ribosomalen Proteine werden aus dem Zytosol importiert und stellen einen großen Anteil der ständig in den Zellkern zu importierenden Proteine. Die großen und die kleinen Untereinheiten der Ribosomen werden nach ihrer Fertigstellung unabhängig voneinander durch die Kernporen hindurch in das Zytosol exportiert, wiederum unter direkter Beteiligung RanGTP-bindender Exportine.\nAuch alle mRNA werden ausschließlich in Form bestimmter RNA-Protein-Komplexe exportiert. Diese scheinen aber keine Mitglieder der Importin--Familie zu enthalten.\nAm Kerntransport sind sowohl Importine als auch Exportine beteiligt. Importine und Exportine gehören zur gleichen Familie der Importin--Proteine.\nZielerkennungssequenzen mitochondrialer Proteine\nDie Translokation von Proteinen in die Mitochondrien folgt ganz anderen Prinzipien als der Import von Proteinen in den Zellkern. Eine Ähnlichkeit besteht lediglich insofern, als auch mitochondriale Proteine bestimmte Zielerkennungssequenzen enthalten, durch die sie das ihnen zugeordnete Organell in der Zelle finden können. Von den mehr als 1000 verschiedenen mitochondrialen Proteinen sind nur 13 im mitochondrialen Genom kodiert, alle übrigen sind kernkodiert. Nach ihrer Synthese im Zytosol unterscheiden sie sich von den anderen Proteinen zunächst nur durch ihre Zielerkennungssequenzen. Wie für die nucleären Proteine gilt auch für die mitochondrialen Proteine, dass sie nicht alle die gleichen Zielerkennungssequenzen tragen, sondern in diesen Sequenzen große Unterschiede zeigen.\nDie meisten mitochondrialen Proteine befinden sich in der Matrix. Alle bislang untersuchten Proteine der Matrix werden im Zytosol zunächst mit einer charakteristischen N-terminalen Präsequenz synthetisiert (Abb. 17.4). Diese Präsequenzen haben meist eine Länge von 20–40 Aminosäuren und neigen zur Bildung von -Helices. Diese weisen in jedem Fall mehrere positiv geladene Aminosäuren auf, also Lysin- oder Argininreste, während negativ geladene Aminosäuren vollständig fehlen.\nViele Proteine der anderen mitochondrialen Kompartimente, insbesondere die Proteine der Außenmembran, werden ohne eine derartige Präsequenz synthetisiert. Ihre Zielerkennungssignale befinden sich in der Regel nicht am N-Terminus, sondern in einem Bereich im Inneren der Sequenz, mitunter sogar am C-Terminus.\nMitochondriale Matrixproteine werden im Zytosol mit einer N-terminalen Präsequenz synthetisiert. Die klassischen Präsequenzen mitochondrialer Proteine umfassen etwa 20–40 Aminosäuren, neigen zur Bildung von -Helices und exponieren mehrere positive Ladungen. Proteine der anderen mitochondrialen Kompartimente enthalten meist vollkommen anders strukturierte Zielerkennungssignale.\nDer TOM-Komplex der Außenmembran\nSowohl der Zellkern als auch die Mitochondrien sind Zellorganellen, die von zwei Membranen umhüllt sind. Während aber die Kernporen beide Kernmembranen überspannen, enthalten die beiden mitochondrialen Membranen zwei voneinander unabhängige Proteintransportsysteme, die jeweils nur für den Proteintransport über eine der beiden Membranen verantwortlich sind.\nDie Importmaschinerie der mitochondrialen Außenmembran wird von Tom-Proteinen gebildet (translocase of the mitochondrial outer membrane; Abb. 17.5 oben). Die verschiedenen Tom-Proteine werden durch die Angabe ihrer Molekülmasse näher spezifiziert.\nTom20 (Molekülmasse 20 kDa) spielt an der Oberfläche der Mitochondrien eine wesentliche Rolle bei der Erkennung N-terminaler Präsequenzen. Man bezeichnet Tom20 deshalb auch als Importrezeptor.\nProteine, die unabhängig von Tom20 importiert werden, benötigen in der Regel Tom70 als Importrezeptor. Tom70 ist insbesondere der Importrezeptor für den ADP-ATP-Translokator und verwandte Proteine.\nDie Importrezeptoren Tom70 und Tom20 sind mit dem Kanalprotein Tom40 verbunden, das in der mitochondrialen Außenmembran eine Pore von ca. 2 nm Innendurchmesser bildet. Der Tom40-Kanal ist die zentrale Eintrittspforte für den Proteinimport in die Mitochondrien.\nTom40, Tom20 und Tom70 sind zudem mit mehreren weiteren Tom-Proteinen verbunden, die einen gemeinsamen TOM-Komplex bilden.\nDie beiden TIM-Komplexe der Innenmembran\nDie Importmaschinerie der Innenmembran wird von Tim-Proteinen gebildet (translocase of the mitochondrial inner membrane; Abb. 17.5 unten). Die Innenmembran muss den Protonengradienten pH und das Membranpotenzial aufrechterhalten. Sie darf deshalb im Gegensatz zur Außenmembran keine ständig geöffneten Poren enthalten. Dies mag einer der Gründe sein, weshalb die Tim-Proteine keinerlei\nÄhnlichkeit mit den Tom-Proteinen haben. Um die eintreffenden Proteine aufnehmen zu können, enthält die Innenmembran zwei unterschiedliche TIM-Komplexe.\nDer ADP-ATP-Translokator (das häufigste Protein der Innenmembran) und die ihm verwandten homologen Proteine werden überwiegend ohne eine Präsequenz synthetisiert. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie werden von einem Komplex aufgenommen, der Tim22 als porenbildende Komponente enthält. Der Tim22-Komplex vermittelt dann auch die korrekte Insertion dieser Proteine in die Innenmembran. Da es sich bei den Substraten dieses TIM-Komplexes um sehr hydrophobe Proteine handelt, benötigen sie auf ihrem Weg vom Tom40-Kanal zur Tim22-Pore die Hilfe bestimmter kleiner Tim-Proteine von ca. 10 kDa, von denen sie im Intermembranraum in Lösung gehalten werden.\nEin erblicher Defekt in einem dieser kleinen Tim-Proteine des Intermembranraums (dem Deafness/dystonia peptide, DDP) ist die Ursache des Mohr-Tranebjaerg-Syndroms. Die Krankheit ist extrem selten, hat für die Betroffenen allerdings erhebliche Folgen. Erste Symptome in der Kindheit sind zunehmende Taubheit und Muskelschwäche. In späteren Stadien kommen weitere neurologische Ausfälle hinzu. Die Krankheit ähnelt darin anderen Mitochondriopathien. Offenbar reagieren die Zellen des Nervensystems auf Defekte der Mitochondrien besonders empfindlich.\nProteine mit N-terminalen Präsequenzen werden von einem Komplex aufgenommen, der Tim23 als porenbildende Komponente enthält. Die typischen mitochondrialen Präsequenzen dienen also nicht nur der Bindung an den TOM-Komplex der Außenmembran und damit der Zielerkennung, sondern sie sind anschließend auch bei der gezielten Insertion in die Tim23-Pore von entscheidender Bedeutung. Interessanterweise sind Tim23 und Tim22 homologe Proteine, haben also ähnliche Aminosäuresequenzen. Unter Vermittlung mehrerer Adapterproteine bindet mtHsp70 (ein ATP-abhängiges mitochondriales Hitzeschockprotein von 70 kDa) an die Tim23-Pore, nimmt das translozierende Protein auf und zieht es in die Matrix. Im Anschluss an die Translokation werden die N-terminalen Präsequenzen nicht mehr benötigt und deshalb normalerweise von einer Prozessierungspeptidase (matrix processing peptidase, MPP) abgeschnitten. Nach Ankunft in der Matrix sind die reifen Proteine dadurch gegenüber den ursprünglichen Vorstufenproteinen um ca. 20–40 Aminosäuren verkürzt.\nDa die heutigen Mitochondrien in evolutionsbiologischer Hinsicht als modifizierte Nachkommen von Bakterien aufzufassen sind (Kap. 6.1.3), stellt sich die Frage, ob sich in den Mitochondrien noch Reste der ursprünglichen bakteriellen Proteintransportsysteme erhalten haben.\nBemerkenswert ist, dass weder der TOM-Komplex noch die beiden TIM-Komplexe nennenswerte Ähnlichkeiten zu bakteriellen Proteinen erkennen lassen. Lediglich das mtHsp70, das mit dem Tim23-Komplex kooperiert, ist ein offensichtlicher Verwandter der bakteriellen Hitzeschockproteine von 70 kDa.\nDie mitochondriale Innenmembran enthält allerdings unabhängig von den TIM-Komplexen noch das Protein Oxa1, das ebenfalls unmittelbar an der Biogenese mitochondrialer Proteine beteiligt ist. Oxa1 ist ein Verwandter des bakteriellen YidC, das in der bakteriellen Plasmamembran mit Proteinexportporen assoziiert ist. Sowohl Oxa1 als auch YidC haben die Aufgabe, die Insertion bestimmter neu synthetisierter Proteine in die jeweilige Membran zu vermitteln.\nErst kürzlich wurde mit dem SAM- bzw. TOB-Komplex ein Proteinkomplex mit Ähnlichkeit zu bakteriellen Proteintransportsystemen in der mitochondrialen Außenmembran identifiziert. Der von manchen Arbeitsgruppen als SAM (sorting and assembly of mitochondria), von anderen als TOB (topogenesis of mitochondrial outer-membrane beta-barrel proteins) bezeichnete Komplex enthält u.a. das Protein Sam50 ( Tob55), das eine ausgeprägte Ähnlichkeit zum Omp85 der Außenmembranen gramnegativer Bakterien zeigt. Interessanterweise dienen beide Proteine ausschließlich dazu, die Insertion von -Fass-Proteinen (beta-barrel proteins) in die jeweilige Zielmembran zu ermöglichen.\nMechanismen des mitochondrialen Proteintransports\nund ATP als Energiequellen\nDie ersten Schritte des mitochondrialen Proteinimports sind noch reversibel. Solange ein Vorstufenprotein lediglich an den TOM-Komplex bindet oder in die Tom-Pore eintaucht, kann es auch wieder in das Zytosol entlassen werden. Irreversibel sind erst die folgenden Schritte: Sobald die Präsequenz eines Vorstufenproteins in eine Tim23-Pore der Innenmembran eintaucht, wird sie sofort durch einen elektrophoretischen Effekt in die Matrix gezogen, da die Präsequenzen ausnahmslos positiv geladen sind, während die Matrix negativ aufgeladen ist ( ca. 140 mV). Die Energiequelle für den ersten Schritt des Proteintransports über die Innenmembran ist somit das mitochondriale Membranpotenzial (Abb. 17.6a).\nDa die Präsequenz nach Ankunft in der Matrix abgeschnitten wird, steht sie für weitere Schritte des Proteinimports nicht mehr zur Verfügung. Der Import des reifen Teils des Proteins wird nun von mtHsp70 angetrieben (Abb. 17.6b). mtHsp70 bindet mit seiner peptidbindenden Domäne direkt an das translozierende Protein und zieht es in die Matrix. Dabei wird von der N-terminalen Domäne des mtHsp70 ATP hydrolysiert. Aus diesem Grund ist der mitochondriale Proteinimport ATP-abhängig. Sobald das Vorstufenprotein vollständig in die Matrix importiert worden ist, löst sich mtHsp70 ab.\nmtHsp70 gehört zu der großen Gruppe der Chaperonproteine. Allgemein sind Chaperone allein durch ihre Funktion definiert: Alle Chaperone binden vorübergehend an ihre Substratproteine, halten sie dabei in einem bestimmten Faltungszustand und setzen sie schließlich wieder frei.\nProteintransport und Proteinfaltung\nDa der Innendurchmesser der Tom-Pore bei 2 nm liegt, ist es denkbar, dass Polypeptide diese Pore in -helikaler Konformation passieren können. Der Durchmesser einer -Helix beträgt nur 1,2 nm. Andererseits ist es offensichtlich, dass selbst die kleinsten Proteine während des Transports durch diese Pore zumindest ihre Tertiärstruktur aufgeben müssen. Für den mitochondrialen Proteintransport müssen die Vorstufenproteine also entfaltet werden. Stabil gefaltete Proteine können nicht importiert werden. Hierin liegt ein wichtiger Unterschied zum Import von Proteinen in den Kern: Die Kernpore hat einen Innendurchmesser von 9 nm, sodass ein großer Teil der Proteine im nativen Faltungszustand in den Kern importiert werden kann.\nSowohl die Tim22-Pore als auch die Tim23-Pore sind normalerweise geschlossen, da sonst das Membranpotenzial der Innenmembran zusammenbrechen würde. Aufgrund indirekter Hinweise nimmt man an, dass die Tim23-Pore sich zum Proteinimport nur gerade so weit öffnet, dass ein Vorstufenprotein in gestreckter Konformation aufgenommen werden kann. Spätestens an der Innenmembran kommt es daher zu einer vollständigen Entfaltung der Vorstufenproteine.\nDie Importkompetenz der Vorstufenproteine\nAn die Außenseite der Mitochondrien sind stets einige Ribosomen angelagert, sodass manche Vorstufenproteine vermutlich direkt in die Mitochondrien injiziert werden können. Man spricht in diesem Fall von cotranslationalem Import. Die weitaus meisten Proteine werden aber zunächst an freien Ribosomen synthetisiert und erst nachträglich, d.h. posttranslational, importiert.\nDie Mehrzahl der mitochondrialen Vorstufenproteine wird am Ausgang der Ribosomen von einer Gruppe von Chaperonen in Empfang genommen (Abb. 17.7). Zu diesen gehören\nu.a. die zytosolischen Mitglieder der Hsp70-Familie. Die Proteinkomplexe, die unter Beteiligung des Hsp70 gebildet werden, haben eine variable Zusammensetzung. Ihre Funktion besteht darin, die Vorstufenproteine sicher zu den Mitochondrien zu bringen.\nDurch dieses System wird insbesondere verhindert, dass sich Vorstufenproteine mit ihren hydrophoben Anteilen unspezifisch zusammenlagern und Aggregate bilden. Derartige Aggregate wären für den mitochondrialen Proteinimport unbrauchbar. Ein weiterer Effekt der Chaperone besteht möglicherweise darin, dass im Zytosol die Faltung mancher Vorstufenproteine verhindert wird, die in stabil gefaltetem Zustand nicht durch die engen Importporen der Mitochondrien transportiert werden könnten. Man nimmt an, dass beides, die Verhinderung der Faltung und die Verhinderung der Aggregation, zur Importkompetenz der Vorstufenproteine beiträgt.\nSobald die translozierenden Vorstufenproteine in der Matrix erscheinen, begegnen sie dort erneut einem System von Chaperonen. Die Schlüsselfunktion kommt hier mtHsp70 zu. mtHsp70 (mitochondriales Hsp70) ist homolog zu den Mitgliedern der Hsp70-Familie im Zytosol. Eine noch größere Ähnlichkeit findet man zu den Hsp70-Proteinen der Bakterien, womit die Endosymbiontenhypothese erneut bestätigt wird.\nGrundsätzlich muss ein Substratprotein hinreichend entfaltet sein, damit ein Mitglied der Hsp70-Familie daran binden kann. Da die Vorstufenproteine in der Matrix in vollkommen entfalteter Form erscheinen, sind sie an der Importpore ideale Substrate für das dort wartende mtHsp70. Dieses hat in der Matrix zwei unterschiedliche Funktionen:\nProteinfaltung: Zum einen unterbindet mtHsp70 die Aggregation der neu importierten Proteine. mtHsp70 kooperiert dabei mit mehreren anderen Chaperonen und Faltungshelferproteinen, die zusammen ein flexibles Netzwerk alternativer Faltungswege bereitstellen, auf denen die verschiedenen neu importierten Proteine sicher zu ihren endgültigen Bestimmungsorten und Faltungszuständen gelangen können.\nProteintranslokation: In einer zweiten Funktion repräsentiert mtHsp70 den entscheidenden Motor des mitochondrialen Proteintransports. Wenn dem mtHsp70 das ATP als Energiequelle entzogen wird, kommt der Import sämtlicher Proteine in die Matrix zum Erliegen.\nDie Frage, in welchem Sinne mtHsp70 als Motor des Proteintransports angesprochen werden kann, ist bislang nicht befriedigend geklärt. Unter den Stichworten Trapping und Pulling werden zwei Konzepte diskutiert:\nTrapping: Verschiedene Experimente haben gezeigt, dass sich die Funktion des mtHsp70 beim Proteinimport zu einem erheblichen Teil auf eine im Grunde genommen rein passive Funktion beschränkt. Sobald die Vorstufenproteine vom Membranpotenzial in die Importpore gezogen worden sind, werden die in der Matrix exponierten Abschnitte der Polypeptidkette durch eine schnelle Anbindung von mtHsp70 festgehalten (Trapping). Die zunächst zufällige und ungerichtete Bewegung wird so in eine einwärtsgerichtete Bewegung überführt. mtHsp70 fungiert hier lediglich als Sperrklinke (molecular ratchet) und ist in dieser Hinsicht nur in einem eingeschränkten Sinn als Motor zu bezeichnen.\nPulling: Möglicherweise übt mtHsp70 zusätzlich auch eine Funktion als Motor im engeren Sinne des Wortes aus. mtHsp70 ist zunächst über das Adapterprotein Tim44 an die Tim23-Importpore gebunden. Von Tim44 wird es ATP-abhängig auf die translozierende Polypeptidkette übertragen. Es scheint nun so zu sein, dass mtHsp70 im Moment der Ablösung vom Adapterprotein eine erhebliche Konformationsänderung durchmacht. Sollte mtHsp70 im gleichen Moment bereits an die translozierende Polypeptidkette gebunden sein, wäre es denkbar, dass dabei tatsächlich eine Kraft auf die Polypeptidkette übertragen wird (Pulling). Die Relevanz, die den ATP-abhängigen Konformationsänderungen des mtHsp70 zukommt, ist derzeit noch umstritten. Offenbar stößt die Biochemie hier an die Grenzen dessen, was sich in Bezug auf molekulare Mechanismen in der Zelle mit den derzeit zur Verfügung stehenden Methoden sicher nachweisen lässt.\nDie Biogenese der Peroxisomen\nPEX-Gene und Peroxine\nPeroxisomen sind kleine kugelige Zellorganellen von ca. 0,2 bis 1 m Durchmesser, die nur eine einzige Hüllmembran aufweisen (Kap. 16.9). Die Peroxisomen enthalten verschiedene Oxidasen, durch die sie u.a. am Abbau von Ethanol beteiligt sind. Zudem findet die -Oxidation von Fettsäuren nicht nur in den Mitochondrien, sondern auch in den Peroxisomen statt. Die peroxisomalen Proteine sind ausnahmslos kernkodiert. Ihre Biogenese ist intensiv studiert worden, nachdem sich herausgestellt hat, dass es eine Gruppe von Erbkrankheiten gibt, die auf eine gestörte Biogenese der Peroxisomen zurückgeführt werden können. Ohne funktionsfähige Peroxisomen kommen die Neugeborenen mit einer ausgeprägten Muskelschwäche zur Welt. Sie sterben meist noch im Säuglingsalter. Das Syndrom ist als Zellweger-Krankheit bekannt (Kap. 16.9). Die Gene, deren Mutationen für die Zellweger-Krankheit verantwortlich sind, werden als PEX-Gene (peroxisome assembly) bezeichnet. Die von ihnen kodierten Proteine sind die Peroxine. Inzwischen sind 23 Peroxine identifiziert worden. Einige von ihnen sind im Zytosol lokalisiert, bei anderen handelt es sich um Proteine der peroxisomalen Membran.\nFunktionell können die Peroxine zwei Gruppen zugeordnet werden, die sich daraus ergeben, dass die peroxisomalen Matrixproteine im Zytosol mit zwei unterschiedlichen Zielerkennungssequenzen (peroxisomal targeting signal, PTS) synthetisiert werden. Die Proteine der peroxisomalen Matrix werden jeweils mit einem dieser beiden Signale synthetisiert und binden dann im Zytosol an lösliche Rezeptorproteine:\nPTS1 befindet sich immer am C-Terminus des jeweiligen Proteins und besteht im typischen Fall aus der Sequenz Ser–Lys–Leu (SKL). Die meisten peroxisomalen Proteine besitzen diese SKL-Sequenz. PTS1-Sequenzen binden im Zytosol an das Rezeptorprotein Pex5 (Abb. 17.8).\nPTS2 befindet sich immer am N-Terminus und besteht aus 20–30 Aminosäuren. Die Konsensussequenz der PTS2-Signale zeigt eine gewisse Variabilität: (Arg/Lys)–(Leu/Ile)–X5–(His/Gln)–(Leu). In vielen Fällen wird das PTS2 nach Import in die Peroxisomen abgeschnitten. PTS2-Sequenzen binden an das Rezeptorprotein Pex7.\nDie Rezeptorproteine binden dann an Peroxine der peroxisomalen Membranen. Mehrere Peroxine kooperieren dort beim Import jeweils einer der beiden PTS-Klassen. Der primäre Rezeptor für Pex5 an der Oberfläche der Peroxisomen ist Pex14. An den folgenden Schritten des Proteinimports sind in der peroxisomalen Membran u.a. Pex2, Pex10 und Pex12 beteiligt. Der Rückweg des Pex5 in das Zytosol erfordert eine Beteiligung der ATPasen Pex1 und Pex6.\nIn Kap. 16.9 wurden bereits zwei Modellvorstellungen zur Biogenese von Peroxisomen vorgestellt:\nEntstehung durch Teilung bereits vorhandener Peroxisomen\nEntstehung durch Abknospung von Vesikeln vom endoplasmatischen Retikulum.\nTatsächlich entstehen auch Peroxisomen – ähnlich den Mitochondrien – im Prinzip durch Teilung der zuvor bereits in der Zelle vorhandenen Peroxisomen. Eine Analogie zu den Mitochondrien ist allerdings nicht in jeder Hinsicht gegeben. So werden peroxisomale Proteine auch in gefaltetem Zustand und sogar in Form von Proteinkomplexen importiert. In dieser Hinsicht besteht also ein grundsätzlicher Unterschied zum mitochondrialen Proteinimport und eher eine Ähnlichkeit zum Kernimport. Tatsächlich kann nicht ausgeschlossen werden, dass die peroxisomalen Rezeptorproteine Pex5 und Pex7 mitsamt den an sie gebundenen Proteinen durch die Membran hindurch in die peroxisomale Matrix gelangen und die Rezeptoren dann wieder in das Zytosol zurückkehren. Obwohl die Komponenten der peroxisomalen Proteinimportmaschinerie größtenteils identifiziert werden konnten, sind die Mechanismen der Translokation von Proteinen über die peroxisomale Membran noch weitgehend ungeklärt.\nDie Zielerkennungssignale peroxisomaler Membranproteine werden allgemein als mPTS bezeichnet. Sie können weder dem PTS1- noch einem PTS2-Typ zugeordnet werden. Die meisten peroxisomalen Membranproteine scheinen sich im Anschluss an ihre Synthese unmittelbar in die Membranen der Peroxisomen einzulagern. In jüngster Zeit hat sich allerdings gezeigt, dass es eine kleine Gruppe von Membranproteinen gibt, die zunächst in die Membranen des ER inserieren, um dann nachträg\nlich auf eigentümlichen Wegen zu den Peroxisomen zu gelangen (ein Protein, das diesen Weg nimmt, ist z.B. Pex3).\nDie an der Biogenese der Peroxisomen beteiligten Proteine sind die Peroxine, die von PEX-Genen kodiert werden. Defekte der Biogenese der Peroxisomen sind die Ursache der Zellweger-Krankheit.\nProteintransport in das endoplasmatische Retikulum\nDas Ribonucleoprotein SRP\nFast alle Proteine werden von den Ribosomen unmittelbar in die ER-Membran injiziert (cotranslationaler Import). Auch die Proteine des glatten ER sind ursprünglich einmal auf diese Weise in ihr Organell gelangt. Lediglich bestimmte kleine Proteine können auch posttranslational in das ER importiert werden. Zum Beispiel wird Synaptobrevin, das bei der Fusion von Vesikeln mit der präsynaptischen Membran eine wichtige Rolle spielt, posttranslational in das ER transportiert.\nÄhnlich wie die mitochondrialen Matrixproteine tragen auch die ER-Proteine zunächst eine charakteristische N-terminale Signalsequenz, die auch Präpeptid genannt und im Anschluss an die Translokation über die Membran proteolytisch entfernt wird. Die Signalsequenzen beginnen mit einer kleinen N-terminalen Gruppe von Aminosäuren, von denen mindestens eine positiv geladen ist. Hieran schließt sich ein Abschnitt von sechs bis zwölf hydrophoben Aminosäuren an, auf den dann wieder ein hydrophiler Abschnitt folgt. Die genaue Aminosäuresequenz ist denkbar variabel.\nAls Beispiel ist hier die Signalsequenz des Präproalbumins angegeben, der Vorstufe des Albumins, die in den Hepatozyten synthetisiert wird. Die hydrophoben Aminosäuren der Signalsequenz sind durch Fettdruck hervorgehoben, die positive Ladung wird vom Lysin (Lys) beigesteuert:\nDie Signalsequenzen dienen nicht der unmittelbaren Insertion in die ER-Membran, sondern werden zunächst nur für die Bindung an einen bestimmten Proteinkomplex benötigt, der als SRP (signal recognition particle) bezeichnet wird. Das SRP ist ein Ribonucleoprotein, das aus sechs Proteinen und einer RNA von 300 Basen besteht. Der wichtigste Bestandteil des SRP ist das Protein SRP54, das sowohl die Signalsequenz als auch das Nucleotid GTP bindet. SRP hat die Aufgabe, unter den vielen Ribosomen der Zelle diejenigen zu identifizieren, die eine mRNA translatieren, welche für ein ER-Protein kodiert. SRP bindet sowohl an das Ribosom als auch an die Signalsequenz (Abb. 17.9).\nDurch die Bindung des SRP an die N-terminale Signalsequenz wird die weitere Translation zunächst aufgehalten, und der gesamte Komplex bindet an ein freies Translocon der ER-Membran. Als Translocon wird der Proteinkomplex bezeichnet, der in der ER-Membran den Proteinimport vermittelt (Kap. 17.5.2). Mit diesem Proteinkomplex ist der SRP-Rezeptor assoziiert (früher auch als Docking-Protein bezeichnet). Er besteht aus zwei Untereinheiten, die beide GTP binden können. Das SRP, das seinerseits mit den Signalsequenzen der zu translozierenden Proteine assoziiert ist, bindet an der -Untereinheit des SRP-Rezeptors.\nAn der Zielerkennung sekretorischer Proteine sind somit insgesamt drei GTP-bindende Proteine beteiligt, nämlich SRP54 und die beiden Untereinheiten des SRP-Rezeptors.\nDie Ankunft des Ribosoms am Translocon löst dann eine weitere Reaktionskette aus. SRP löst sich von der Signalsequenz ab, und das Ribosom mitsamt der Signalsequenz bindet an das Translocon. Die beteiligten GTP-Moleküle werden dabei zu GDP hydrolysiert.\nDer Proteinimport in das ER findet im Verlauf der Proteinbiosynthese (cotranslational) statt. Das Translocon ist der Proteinkomplex, der in der ER-Membran den Proteinimport vermittelt. Mit dem Translocon ist der SRP-Rezeptor assoziiert. Dieser bindet das Signal recognition particle (SRP), das durch Bindung an die Signalsequenzen die Erkennung der zu translozierenden Proteine vermittelt.\nDie Importpore des ER\nZusammen mit der naszierenden (wachsenden) Polypeptidkette bindet das Ribosom mit seiner großen Untereinheit sehr fest an das Translocon, das die Proteinimportpore des ER bildet. Die Pore ist in Abwesenheit wie in Anwesenheit des Ribosoms an der Innenseite der ER-Membran dicht verschlossen. Das Ribosom sitzt also auf einem engen, wassergefüllten Hohlraum, in den nun die Polypeptidkette hineinwächst. Die Polypeptidkette erreicht diesen Hohlraum durch einen Tunnel des Ribosoms, der von der Stelle, an der die Peptidbindungen geknüpft werden, durch die große Untereinheit des Ribosoms hindurch zum Ausgang über der Proteinimportpore führt (Abb. 17.10). Die wachsende Polypeptidkette erreicht den Ausgang dieses Tunnels erst, wenn sie ca. 40 Aminosäuren umfasst.\nDer Proteinkomplex Sec61, von dem die Proteinimportpore des ER gebildet wird, besteht aus vier verschiedenen Proteinen: den drei Untereinheiten des heterotrimeren Komplexes und dem TRAM-Protein.\nDie Untereinheiten des Sec61-Komplexes werden als Sec61, - und - bezeichnet. Es wurden mehrere weitere Membranproteine identifiziert, die ebenfalls mit dem Sec61-Komplex assoziiert sein können und auch dem Translocon zugerechnet werden, die aber nur bei der Translokation bestimmter Proteine benötigt werden.\nDas Protein TRAM (translocation-associated membrane protein) ist in der ER-Membran vermutlich mit acht membranspannenden Domänen verankert und ebenfalls unmittelbar an der Porenbildung beteiligt. Im Translocon ist TRAM an der Ausbildung einer Stelle beteiligt, an der hydrophobe Abschnitte einer wachsenden Polypeptidkette in die Membran eingebettet werden können. TRAM hat damit eine wichtige Funktion in der Biogenese vieler Membranproteine.\nMembranspannende Abschnitte von Proteinen (Transmembrane segments, TM) bestehen normalerweise aus einer Sequenz von ca. 20 ausnahmslos hydrophoben Aminosäuren. 20 Aminosäuren werden nämlich benötigt, damit ein Polypeptid in -helikaler Struktur genau die richtige Länge hat, um den hydrophoben Teil einer biologischen Membran überspannen zu können.\nVermutlich stellt der Sec61-TRAM-Kanal einen Seitenausgang zur Verfügung, durch den sich hydrophobe Segmente einer Polypeptidkette direkt in die Lipidmembran einlagern können. Die hydrophilen Anteile der wachsenden Polypeptidkette hingegen bewegen sich an dem Seitenausgang vorbei und gelangen in das Lumen des ER.\nDie Importpore des ER ist zunächst an der Innenseite zum Lumen hin abgeschottet. Die Pore öffnet sich, sobald die naszierende Kette mehr als 70 Aminosäuren umfasst. Die Struktur der Pore wie auch der Mechanismus des Öffnens und Schließens sind noch nicht befriedigend geklärt.\nIn den frühen Stadien der Translokation biegt sich der N-Terminus der naszierenden Kette mit der Signalsequenz U-förmig zurück, sodass sich die wachsende Polypeptidkette zunächst in Form einer Schlaufe in die Pore einlagert. Im weiteren Verlauf der Translokation wird die Signalsequenz von der transloconassoziierten Signalpeptidase abgespalten, und der N-Terminus der weiterwachsenden Polypeptidkette erreicht das Lumen des ER. Durch die Abspaltung der Signalsequenz entstehen z.B. aus dem Präproalbumin das Proalbumin und aus dem Präproinsulin das Proinsulin.\nAußerdem erhält nun die Oligosaccharyltransferase (OST) Zugang zur translozierenden Polypeptidkette und katalysiert eine Glykosylierung, sobald eine geeignete Glykosylierungsstelle vorgefunden wird. Dabei wird in einem Schritt eine vollständige bäumchenartige Struktur übertragen, die aus 14 Zuckereinheiten aufgebaut ist. Das Oligosaccharid wird kovalent mit einem Asparaginrest der naszierenden Kette verbunden (N-Glykosylierung).\nDie Proteinimportporen des ER werden von Komplexen mehrerer Membranproteine gebildet. Die wichtigsten Komponenten sind dabei die Proteine Sec61 sowie das Protein TRAM. Die Polypeptidkette wächst über einen Tunnel im Ribosom bei der Translation durch die Proteinimportpore. Hydrophobe Segmente der Polypeptidkette werden direkt in die Membran eingelagert, hydrophile gelangen in das ER-Lumen.\nProteinfaltung und Proteinmodifikationen im ER\nNach Ablösung von dem am Translocon gebundenen Ribosom ist die Reifung der neu synthetisierten Proteine noch nicht beendet:\nAlle Proteine müssen jetzt erst noch ihre korrekte dreidimensionale Struktur einnehmen, d.h., sie müssen sich korrekt falten. Solange sie sich noch nicht in ihrer endgültigen nativen Konformation befinden, besteht die Gefahr, dass sie sich mit ihren hydrophoben Sequenzabschnitten zusammenlagern und unlösliche Aggregate bilden. Um dies zu verhindern, enthält auch das ER-Lumen eine Vielzahl an Chaperonen und Faltungshelferenzymen.\nFast alle Proteine werden im Lumen des ER kovalent modifiziert, zunächst durch Abspaltung der Signalsequenz, dann aber z.B. auch durch die Übertragung von Kohlenhydratseitenketten.\nBeide Prozesse sind außerordentlich wichtige Aufgaben des ER und sollen deshalb näher erläutert werden.\nIm ER hat das BiP, ein Mitglied der Hsp70-Familie, eine zentrale Funktion bei der Verhinderung der Bildung unlöslicher Aggregate (Abb. 17.11a). Es befindet sich als lösliches Protein im ER-Lumen. In der Nähe der Proteinimportporen wird BiP teilweise von dem Protein Sec63 festgehalten, das als Membrananker dient. Sec63 ist an der Porenbildung nicht beteiligt, man zählt es deshalb zu den transloconassoziierten Proteinen. BiP wurde ursprünglich als Bindungsprotein für die schweren Ketten der Immunglobuline entdeckt (und entsprechend als Heavy chain-binding protein, BiP, bezeichnet). Es hat sich dann aber bald herausgestellt, dass BiP ein Bindungsprotein für viele nichtnative Proteine ist. Solange Proteine ihre endgültige Struktur noch nicht eingenommen haben, exponieren sie meist Abschnitte hydrophober Aminosäuren, die später, im nativ gefalteten Protein, im Inneren der Proteinstruktur verborgen sein werden. BiP bindet an diese hydrophoben, von außen zugänglichen Bereiche und schirmt sie vor den hydrophoben Bereichen anderer Proteine ab. Eine ähnliche Funktion hat auch das Hsp90 des ER. BiP und Hsp90 gehören beide zur Gruppe der Chaperone.\nDie Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) ist ein Enzym, das zwei SH-Gruppen enthält (Abb. 17.11b). Diese können mit den SH-Gruppen nichtnativer Proteine reagieren und vorübergehend Disulfidbrücken ausbilden. Sie greifen damit in die Bildung der intramolekularen Disulfidbrücken ein, die sich im ER ausbilden. Im Zytosol herrschen immer reduzierende Bedingungen, die u.a. von Glutathion aufrechterhalten werden. Im Lumen des ER hingegen herrschen oxidierende Bedingungen, weshalb hier SH-Gruppen zu Disulfidbrücken reagieren. Fast alle Disulfidbrücken, die in Proteinen gefunden werden, sind im Lumen des ER gebildet worden. Dabei geschieht es zunächst leicht, dass die falschen SH-Gruppen miteinander reagieren. Zusammen mit dem System der Chaperone löst die PDI derartige Bindungen wieder auf und ermöglicht anschlie ßend die Ausbildung der korrekten Disulfidbrücken und eine korrekte Faltung.\nDie Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) sind eine Gruppe von Enzymen, die im Gegensatz zur PDI nicht nur im ER, sondern in fast allen Kompartimenten der Zelle gefunden werden, u.a. auch in den Mitochondrien. Sie katalysieren in Proteinen die Isomerisierung der Peptidbindung zwischen einer Aminosäure und einem nachfolgenden Prolinrest. Durch ihren partiellen Doppelbindungscharakter können Peptidbindungen entweder in cis- oder in trans-Konformation vorliegen. Die meisten Peptidbindungen nehmen von allein die trans-Konformation ein. Bei X–Pro-Bindungen zeigt aber auch die cis-Konformation eine beträchtliche Stabilität. Die falsche Konformation einer Prolinbindung kann den letzten Schritt einer Proteinfaltung erheblich verzögern. Deshalb wird die entsprechende Konformationsänderung enzymatisch von PPIasen katalysiert.\nDie Synthese der Lipoproteine (VLDL in der Leber, Chylomikronen im Dünndarmepithel) erfordert eine cotranslationale Beladung von Apolipoproteinen (ApoB-100 bzw. ApoB-48) mit Lipiden (Kap. 18.2.1). Auch diese Reaktion wird im Lumen des ER enzymatisch katalysiert.\nEine größere Zahl von Proteinen erhält im ER eine stabile Verankerung in der Membran durch Übertragung auf Glykosylphosphatidylinositol (GPI). Viele Proteine, die an den Oberflächen der Zellen exponiert werden, sind über derartige GPI-Anker mit der Plasmamembran verbunden (Kap. 8.4.2). Die genaue Struktur der GPI-Anker ist variabel. Die Verankerung in der Membran wird letztlich durch zwei Fettsäuren vermittelt (Abb. 17.12 rechts). Diese sind über Glycerin, Phosphat, Inositol, mehrere Zuckergruppen und Ethanolamin mit dem C-Terminus des jeweiligen Proteins verbunden. Ein Enzym des ER (GPI-Transamidase) schneidet die hierfür vorgesehenen Proteine von ihrem zuvor bestehenden Transmembransegment ab und überträgt sie im Lumen des ER auf den GPI-Anker.\nEine Verankerung von Proteinen in Membranen ist unabhängig von GPI auch unmittelbar durch verschiedene Fettsäuren möglich, etwa durch Palmitinsäure oder durch Myristinsäure (Abb. 17.12 links). In diesen Fällen erfolgt die Verankerung jedoch an der zytosolischen Seite der jeweiligen Membranen. Entsprechend handelt es sich bei den für die Übertragung der Fettsäuren verantwortlichen Enzymen um zytosolische Enzyme, die zum Lumen des ER keinen Zugang haben.\nBiogenese N-gebundener Kohlenhydratseitenketten\nDie Biogenese der N-gebundenen Zucker beginnt an einem Lipidmolekül der ER-Membran. Dort werden kleine verzweigte Oligosaccharide synthetisiert, die an das Lipid Dolicholphosphat gebunden sind (Abb. 17.13a). Das wachsende Oligosaccharid entsteht zunächst an der zytosolischen Seite der ER-Membran, wendet sich dann aber enzymatisch katalysiert auf die andere Seite und befindet sich somit an der Innenseite der ER-Membran. Nach ihrer Fertigstellung haben die an Dolicholphosphat gebundenen Oligosaccharide alle die gleiche Struktur: Sie bestehen aus insgesamt 14 Zuckermonomeren, die ein Bäumchen mit drei Ästen bilden. Der Stamm des Bäumchens wird von zwei N-Acetylglucosaminen gebildet, die drei Äste bestehen aus neun Mannosegruppen, der längste Ast trägt an seinem Ende zudem drei Glucoseeinheiten. Das Oligosaccharid hat damit die Zusammensetzung Glc3Man9(GlcNAc)2 (Abb. 17.13b)\nKatalysiert durch die Oligosaccharyltransferase (OST), wird dieses Oligosaccharid dann am Translocon als Ganzes auf den Amidstickstoff eines Asparaginrests einer wachsenden Polypeptidkette übertragen (N-Glykosylierung). Dieses Asparagin wird nur dann glykosyliert, wenn es sich um die zweite Aminosäure vor einem Serin oder vor einem Threonin handelt; die Erkennungsstelle für die Oligosaccharyltransferase des ER hat die Struktur Asn–X–Ser/Thr, die Aminosäure X ist beliebig.\nDie drei Glucoseeinheiten des längsten der drei Äste werden dann in enzymatisch katalysierten Reaktionen sehr schnell entfernt. Parallel wird in der Regel von jedem der beiden kürzeren Äste je ein Molekül Mannose abgespalten. Das ursprüngliche Glc3Man9(GlcNAc)2 wird so zu Man7(GlcNAc)2 umgewandelt.\nDas BiP im Lumen des ER verhindert als wichtiges Chaperonprotein die Bildung unlöslicher Aggregate der neu synthetisierten Proteine. Auf dem Weg durch das ER werden viele Proteine kovalent modifiziert, z.B. durch N-Glykosylierung oder durch Kopplung an einen GIP-Anker.\nKontrolle der Proteinfaltung im ER\nSobald die Proteine im ER ihre richtige Struktur eingenommen haben, werden sie i.d.R. in Membranvesikel eingeschlossen und zum Golgi-Apparat transportiert. Proteine, die ihre endgültige Struktur noch nicht eingenommen haben, werden im ER zurückgehalten. Hieran sind Mechanismen beteiligt, die unter dem Stichwort Qualitätskontrolle zusammengefasst werden (Kap. 16.3.1). Im einfachsten Fall handelt es sich um Substrate der PDI oder des BiP. Allein durch die Bindung an diese Faltungsmediatoren werden die Substratproteine daran gehindert, das ER zu verlassen.\nIn einem weiteren System spielen die N-gebundenen Kohlenhydratseitenketten der neu synthetisierten Proteine eine entscheidende Rolle (Abb. 17.14). Nach Abspaltung der drei Glucose- und der beiden Mannoseeinheiten sind die Glykoproteine Substrate für ein lösliches Enzym des ER-Lumens, das einzelne Glucosemoleküle mit den Oligosacchariden verknüpfen kann. Das Enzym bezieht die Glucose von UDP-Glucose und heißt deshalb UDP-Glucose-Glykoprotein-Glucosyltransferase.\nEntscheidend ist, dass die Glucosyltransferase einzelne Glucosemoleküle nur auf unvollständig gefaltete Glykoproteine überträgt. Proteine, die ihre endgültige Struktur bereits korrekt eingenommen haben, werden hingegen unverändert freigesetzt und können sofort ihren Weg zum Golgi-Apparat einschlagen. Die Glykoproteine aber, die im ER nur eine Glucosegruppe an ihrem Oligosaccharid aufweisen, binden an das Membranprotein Calnexin und an das homologe lösliche Protein Calreticulin. Kohlenhydratbindende Proteine wie Calnexin und Calreticulin werden allgemein als Lektine bezeichnet. Durch die Bindung an Calnexin und Calreticulin werden falsch gefaltete Glykoproteine daran gehindert, das ER zu verlassen, sodass sie weiter mit den verschiedenen Chaperonen und Faltungshelferenzymen des ER in Wechselwirkung treten können (Calnexin/Calreticulin-Zyklus, Kap. 16.3.1). Die Glucosyltransferase hat in diesem System der Proteinfaltung und Proteinreifung offensichtlich eine zentrale Kontrollfunktion.\nERAD: Abbau falsch gefalteter ER-Proteine\nWas aber passiert mit Proteinen, die trotz aller Aktivitäten der ER-Faltungsmaschinerie ihre native Konformation nicht einnehmen können? Wenn derartige Proteine in der Zelle akkumulierten, hätte dies auf die Dauer fatale Folgen. Nichtnative ER-Proteine werden deshalb durch eine Protease abgebaut, die sich eigentümlicherweise nicht im ER, sondern im Zytosol befindet. Es handelt sich um einen großen zylinderförmigen Proteinkomplex, das Proteasom. Der Transport der falsch gefalteten Proteine aus dem ER in das Zytosol wird als retrograder Transport bezeichnet, der dadurch eingeleitete Abbau als ERAD (ER-assoziierte Degradation, Kap. 16.3.1).\nDer Mechanismus des retrograden Transports ist trotz intensiver Bemühungen bislang nicht befriedigend geklärt. Einige Beobachtungen weisen darauf hin, dass der Export aus dem ER durch die gleiche Sec61-Pore erfolgt wie der Import in das ER. An der Bildung der Exportporen scheinen allerdings zusätzlich die Membranproteine Derlin-1, -2 und -3 beteiligt zu sein. Möglicherweise hängt es vom Typ des zu translozierenden ER-Proteins ab, welches der Derlin-Proteine zur Porenbildung herangezogen wird. Möglicherweise gibt es auch reine Derlin-Poren, die kein Sec61 enthalten.\nAlle Substrate des Proteasoms müssen zunächst an internen Lysinresten mit Ubiquitin beladen und auf diese Weise als abzubauende Substrate gekennzeichnet werden. Dies geschieht noch während des Exports durch Ubiquitin-Ligasen. Die Beladung mit Ubiquitin ist zudem für die Extraktion des Substratproteins aus der ER-Exportpore von Bedeutung. An der Außenseite der Pore lagert sich das zytosolische Protein p97 an, das als ATP-abhängiger Motor des retrograden ER-Transports dient.\np97 erkennt seine Substrate anhand der Ubiquitingruppen. Während des retrograden Transports bilden Derlin-Proteine und Ubiquitin-Ligasen mit p97 einen gemeinsamen Proteinkomplex. p97 verdankt seinen Namen seiner molekularen Masse von ca. 97 kDa. Es bildet im Zytosol stabile Hexamere, die sich in elektronenmikroskopischen Aufnahmen als ringförmige Strukturen nachweisen lassen.\nDas berühmteste Beispiel für ein Protein, das auf diesem Weg abgebaut wird, ist das defekte CFTR-Protein bei Mukoviszidose (Kap. 15.2.1 und Abb. 17.15). Es gelangt zwar zunächst in das ER, erreicht dann aber nie die Zelloberfläche, da es zuvor retrograd exportiert und dann von den Proteasomen des Zytosols abgebaut wird. Bedingungen, die im ER zu einer vermehrten Bildung falsch gefalteter Proteine führen, werden als zellulärer Stress bezeichnet (Kap. 16.3.1). Die Zellen enthalten ein System der Genregulation, das auf Stress antwortet. Wenn z.B. bei ungewöhnlich hohen Temperaturen vermehrt falsch gefaltete Proteine akkumulieren, wird die Expression einer Vielzahl von Genen aktiviert, die Komponenten der Proteinfaltungsmaschinerie des ER kodieren. Das Phänomen wird als UPR (unfolded protein response) bezeichnet.\nEin kompliziertes System von Chaperonen und Faltungshelferproteinen vermittelt im Lumen des ER die Reifung der Proteine. Sofern Proteine im ER ihre native Struktur nicht erreichen, werden sie retrograd in das Zytosol exportiert und dort von Proteasomen abgebaut.\nTransport durch COP-I- und COP-II-Vesikel\nDer sekretorische Weg\nDie meisten am ER synthetisierten Proteine werden nach Passieren der Qualitätskontrolle in Vesikel verpackt, die sich vom ER abschnüren. Die Vesikel entstehen bevorzugt an Membranen, die mit dem rauen ER zwar in unmittelbarer Verbindung stehen, selbst aber keine Ribosomen tragen (vesikotubuläre Cluster, VTC, Kap. 16.4). Die Vesikel erreichen zunächst den cis-Golgi-Apparat, gelangen dann in die Zisternen des medialen Golgi-Apparats und schließlich in den trans-Golgi-Apparat, an den sich das trans-Golgi-Netzwerk anschließt (Kap. 16.5). Von hier aus werden Vesikel in verschiedene Richtungen abgegeben. Einige Vesikel wandern zur Plasmamembran, wo sie durch Exozytose ihren Inhalt abgeben. Andere Vesikel fusionieren mit Endosomen, die durch Endozytose bzw. Pinozytose entstanden sind, oder mit Lysosomen, in denen aufgenommene Makromoleküle bei niedrigem pH-Wert abgebaut werden. Abb. 17.16 zeigt die Transportvorgänge während des sekretorischen Wegs im schematischen Überblick (Details Abb. 16.13).\nAuf dem sekretorischen Weg werden Vesikel allerdings nicht nur vom ER zur Peripherie der Zelle transportiert, vielmehr wandern Vesikel in erheblichem Umfang auch in der Gegenrichtung, retrograd, von der Peripherie zum ER. Die Transportrichtung der Vesikel wird jeweils von bestimmten Proteinen bestimmt, die mit den Vesikeln assoziiert sind.\nCOP-I-Vesikel: Rücktransport zum ER\nBeim vesikulären Transport spielen kleine GTP-bindende Proteine eine wichtige Rolle, die sich an der Außenseite der Vesikel nachweisen lassen. Die verschiedenen Vesikel einer Zelle können oft nur über die Bestimmung ihrer jeweiligen spezifischen GTP-bindenden Proteine unterschieden und definiert werden. Zu diesen Proteinen gehört auch ARF (ADP-ribosylation factor), der in den Membranen des VTC und des cis-Golgi-Apparats über eine Fettsäure (Myristinsäure) verankert ist. ARF dient nun anderen Proteinen des Zytosols als Bindungsprotein und initiiert damit die Bildung neuer Vesikel. Die zytosolischen Proteine, die letztlich einen Mantel um die neu gebildeten Vesikel ausbilden, werden als Coat proteins Typ I, kurz COP-I, bezeichnet.\nSobald sich ein neuer Vesikel gebildet und von der Golgi-Membran abgelöst hat, hydrolysiert das ARF-gebundene GTP zu GDP, und der COP-Mantel löst sich auf. Der nunmehr entkleidete Vesikel wird zur ER-Membran transportiert, mit der er fusioniert. Die COP-I-Vesikel dienen somit dem retrograden Transport von Proteinen vom VTC und cis-Golgi-Apparat zum ER. Auf die gleiche Weise werden auch Proteine innerhalb des Golgi-Apparats retrograd vom trans- zum cis-Golgi-Apparat transportiert.\nUm mit den COP-I-Vesikeln retrograd transportiert zu werden, müssen lösliche luminale Proteine an ihrem C-Terminus eine KDEL-Sequenz exponieren. Im Einbuchstabencode steht KDEL für die Aminosäuresequenz Lys–Asp–Glu–Leu. Die KDEL-Sequenz bindet an ein bestimmtes Membranprotein der COP-I-Vesikel, den KDEL-Rezeptor. Dieser stellt sicher, dass nicht wahllos sämtliche Proteine des cis-Golgi-Apparats zum ER transportiert werden, sondern nur die dafür vorgesehenen. Wenn in den vorangegangenen Abschnitten davon die Rede war, dass bestimmte lösliche Proteine im ER zurückgehalten werden, so lag besagtem Phänomen genau dieser Mechanismus zugrunde, also ein KDEL-abhängiger Rücktransport zum ER durch COP-I-Vesikel. Membranproteine weisen zu dem gleichen Zweck keine KDEL-Sequenz, sondern eine C-terminale Lys–Lys–X–X-Sequenz auf, wobei die beiden letzten Positionen von beliebigen Aminosäuren eingenommen werden können.\nCOP-II-Vesikel: Transport vom ER zum Golgi-Apparat\nCOP-II-Vesikel bilden sich am ER und am VTC (dem vesikotubulären Cluster) zwischen ER und Golgi-Apparat) und transportieren ihre Ladung zum Golgi-Apparat. Auf den ersten Blick ähneln sie den COP-I-Vesikeln, allerdings kommen in ihrer Umhüllung andere Proteine vor. Zwar enthalten sie ebenfalls ein kleines GTP-bindendes Protein, bei diesem handelt es sich aber nicht um das Protein ARF wie in den COP-I-Vesikeln, sondern um Sar1. Auch die COP-II-Vesikel verlieren ihren Mantel bald nach der Ablösung von der Membran.\nViele Proteine des ER gelangen in die COP-II-Vesikel, ohne dass hierzu spezifizierende Signale oder Mechanismen nötig wären. Sie folgen wahllos einem allgemeinen Fluss von Material aus dem ER zum Golgi-Apparat. Dieses Prinzip wird als Bulk flow bezeichnet.\nWährend des Transports zum VTC und zum Golgi-Apparat bewegen sich die COP-II-Vesikel weitgehend an Mikrotubuli entlang. Dieser Mechanismus erleichtert in der Zelle die Überwindung größerer Strecken. Da auch der Golgi-Apparat in das Netzwerk der Mikrotubuli eingespannt ist, hilft dieser Transportmechanismus auch beim Auffinden der Zielmembran.\nEine Vielzahl von Beobachtungen lässt vermuten, dass es sich beim Golgi-Apparat im Grunde genommen um ein Derivat des ER handelt. Oft sieht es nämlich so aus, als ob die vom VTC abgelösten Vesikel vor dem cis-Golgi-Apparat selbstständig zu einem neuen cis-Golgi-Apparat fusionieren. Der Golgi-Apparat scheint somit, ausgehend von COP-II-Vesikeln, ständig neu gebildet zu werden. Schließlich ist auch daran zu erinnern, dass der Golgi-Apparat während jeder Mitose vollständig in Vesikel aufgelöst wird und anschließend, ähnlich wie der Zellkern, neu aufgebaut werden muss.\nAm retrograden COP-I-vermittelten vesikulären Transport vom Golgi-Apparat zurück zum ER nehmen insbesondere alle diejenigen löslichen luminalen Proteine teil, die über eine C-terminale KDEL-Sequenz verfügen. Der anterograde Transport vom ER zum Golgi-Apparat erfolgt durch COP-II-Vesikel.\nProteinreifung im Golgi-Apparat\nDer Golgi-Apparat ist nicht nur Durchgangsstation für die aufgenommenen Proteine, sondern auch der Ort verschiedener kovalenter Modifikationen.\nSulfatierungen finden teils im Zytosol, teils im Golgi-Apparat statt. Im Golgi-Apparat werden die Kohlenhydratseitenketten mancher Glykoproteine mit Sulfatgruppen versehen. Zu diesen Glykoproteinen gehören insbesondere Bestandteile der extrazellulären Matrix. Manche Proteine werden auch unmittelbar an Tyrosinresten sulfatiert. Die Sulfatgruppen stammen bei allen Sulfatierungen von Phosphoadenosinphosphosulfat.\nAn den zytosolischen Seiten der Membranen des Golgi-Apparats – aber auch an anderen Membranen – werden verschiedene Proteine mit Lipidankern verknüpft (Abb. 17.12). Bei diesen Lipiden handelt es sich entweder um Isoprene (Farnesylgruppen [C15] oder Geranylgeranylgruppen [C20]) oder um gesättigte Fettsäuren (Myristinsäure [C14]; Palmitinsäure [C16]).\nManche Proteine, z.B. Albumin und Insulin, gelangen in Form von Proproteinen in den Golgi-Apparat. Derartige Proteine werden in den Vesikeln prozessiert, die sich vom trans-Golgi-Apparat ablösen. Ein klassisches Beispiel ist das Herausschneiden des C-Peptids aus dem Proinsulin (Kap. 24.9.1).\nIn den Zisternen des Golgi-Apparats erhalten auch die Kohlenhydratseitenketten der Glykoproteine ihre endgültige Struktur. Im cis-Golgi-Apparat werden zunächst drei weitere Mannoseeinheiten von den N-gebundenen Man7(GlcNAc)2-Oligosacchariden entfernt. Im medialen und im trans-Golgi-Apparat werden dann wieder neue Zucker angeheftet, nämlich N-Acetylglucosamin, Galaktose, Fucose und N-Acetylneuraminsäure. Die genaue Zusammensetzung der Endprodukte ist unterschiedlich. Vermutlich sind nicht alle Kohlenhydratseitenketten für alle Enzyme in gleichem Maße zugänglich.\nBereits im cis-Golgi werden einzelne N-gebundene Oligosaccharide in Position 6 einer Mannoseeinheit phosphoryliert. Alle Glykoproteine, die eine derartige Mannose-6-phosphat-Gruppe erhalten, werden nach Verlassen des Golgi-Apparats zu den Lysosomen transportiert. Im trans-Golgi-Apparat binden sie an einen membranständigen Mannose-6-phosphat-Rezeptor, der diesen Transportweg sicherstellt.\nDie Synthese O-gebundener Kohlenhydratseitenketten erfolgt im Golgi-Apparat durch Übertragung einzelner Zucker auf hydroxylierte Aminosäuren, also auf Serin oder Threonin. Im Gegensatz zu N-gebundenen Zuckern wird keine fertige große Struktur übertragen, sondern das Oligosaccharid wächst Schritt für Schritt an der Polypeptidkette. Als Donor für Zuckermonomere dienen überwiegend UDP-gebundene Zucker.\nAuch die Enzyme für die Synthese der Blutgruppenantigene des AB0-Systems (Kap. 8.2.3 und 25.3.8Kap. 8.2.3Kap. 25.3.8) befinden sich im Golgi-Apparat. Die Unterschiede der Blutgruppen kommen dadurch zustande, dass das Gen, das eine bestimmte Zuckertransferase kodiert, in der Bevölkerung in verschiedenen Allelen vorkommt. Deshalb wird an manche Glykolipide und Glykoproteine entweder N-Acetylgalaktosamin (Bildung des A-Antigens) oder Galaktose (Bildung des B-Antigens) angehängt.\nTransport zu Endosomen, Lysosomen und zur Plasmamembran\nDer Weg vom trans-Golgi-Netzwerk zu Endosomen und Lysosomen\nProteinen, die vom Golgi-Apparat zum trans-Golgi-Netzwerk (TGN) gelangt sind, stehen zwei Wege offen:\nProteine mit einer N-gebundenen, Mannose-6-phosphat-haltigen Kohlenhydratseitenkette gelangen zusammen mit dem Mannose-6-phosphat-Rezeptor in Vesikel, die von Clathrin ummantelt sind. Der Clathrinmantel löst sich bald wieder auf, und die nackten Vesikel fusionieren mit späten Endosomen, Membranstrukturen, die in ihrem Inneren bereits einen niedrigen pH-Wert aufweisen und darin den Lysosomen ähnlich sind (Abb. 17.16). Ein Effekt des niedrigen pH-Werts ist die Freisetzung der Mannose-6-phosphat-haltigen Proteine von ihrem Rezeptor. Die späten Endosomen geben nun zwei Typen von Vesikeln ab: Der erste Typ bringt die nun entleerten Mannose-6-phosphat-Rezeptoren zurück zum trans-Golgi-Netzwerk, ein zweiter Typ von Vesikeln transportiert die freigesetzten Mannose-6-phosphat-markierten Proteine zu den Lysosomen. Viele Proteine, die auf diesem Wege zu den Lysosomen transportiert werden, sind Proenzyme. Sie werden in den Transportvesikeln proteolytisch gespalten und damit aktiviert. In den Lysosomen sind sie dann an den vielfältigen organellspezifischen Abbaureaktionen beteiligt. In jüngster Zeit findet zunehmend Beachtung, dass viele Partikel mithilfe von Autophagosomen zu den Lysosomen gelangen. Auf diese Weise können Partikel aus dem Zytosol in die Lysosomen gelangen (Kap. 16.7). Autophagosomen sind u.a. im Hinblick auf die Entstehung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen von Interesse, bei denen im Zytosol ungewöhnliche Proteinaggregate akkumulieren.\nProteine ohne Mannose-6-phosphat-Gruppe werden vom trans-Golgi-Netzwerk in große, oft unregelmäßig geformte Vesikel verpackt, die direkt zur Plasmamembran wandern und dort ihren Inhalt durch Exozytose an den Extrazellularraum abgeben. Die Membranproteine der Vesikel gelangen durch die Exozytose in die Plasmamembran. Längere Strecken innerhalb der Zelle werden von den Vesikeln an Mikrotubuli überwunden.\nMembranfusion durch SNARE-Proteine\nNach welchem Mechanismus fusionieren Vesikel mit ihrer jeweiligen Zielmembran? Trotz der Vielzahl unterschiedlicher Vesikeltypen scheint es in der Zelle nur sehr wenige Mechanismen zu geben, durch die eine Fusion von Membranen zustande kommt. In fast allen Fällen sind im entscheidenden Schritt bestimmte SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors, Kap. 16.4) an der Fusion beteiligt. Alle SNARE-Proteine sind sich in ihrer Struktur sehr ähnlich. Fast immer sind sie über eine C-terminale Transmembrandomäne in einer der beiden zu fusionierenden Membranen verankert. Es hat sich eingebürgert, v-SNAREs von t-SNAREs zu unterscheiden. Das v bezeichnet die SNARE-Proteine des jeweiligen Vesikels, das t bezeichnet die Zielmembran (engl. target membrane; Kap. 16.4).\nIn ihrer zytosolischen Domäne enthalten alle SNARE-Proteine einen Abschnitt von ca. 60 Aminosäuren, der als SNARE-Motiv bezeichnet wird. Diese 60 Aminosäuren bilden lange -Helices aus, die für die Funktion der Proteine von entscheidender Bedeutung sind (Abb. 17.17). Das Protein SNAP-25 enthält sogar zwei SNARE-Motive in seiner Sequenz. In der Membran ist es nicht durch eine Transmembrandomäne verankert, sondern durch eine Palmitinsäure, die kovalent an einen Cysteinrest in der Mitte der Sequenz gebunden ist. SNAP-25 hat dadurch eine stimmgabelförmige Struktur.\nZu Beginn der Membranfusion lagern sich die N-terminalen Enden von vier SNARE-Motiven zusammen, wobei jede der beiden Membranen mindestens ein SNARE-Protein beisteuert (Abb. 17.17). Die Komplexbildung, die am N-Terminus beginnt, setzt sich dann bis zu den C-terminalen Enden fort, sodass die Transmembrandomänen der SNARE-Proteine – und damit auch die beteiligten Membranen – in unmittelbare Nähe zueinander gebracht werden. Daraufhin fusionieren die Lipidschichten beider Membranen, und das Vesikel fusioniert mit der Zielmembran.\nDissoziation der SNARE-Komplexe durch NSF und -SNAP\nIm Zuge der Fusion bilden die drei beteiligten SNARE-Proteine einen extrem stabilen Komplex vier parallel liegender -helikaler SNARE-Motive (Abb. 17.17). Dieser synaptische Kernkomplex (core complex) hat eine Länge von 12 nm. Die außerordentliche Stabilität dieses Komplexes beruht auf ausgeprägten hydrophoben Wechselwirkungen der beteiligten Proteine. Die Energie für die Fusion stammt nicht aus einer Hydrolyse energiereicher Verbindungen, sondern aus der Energie, die in den Konformationen der beteiligten Proteine gespeichert war. Für die Auflösung des SNARE-Komplexes ist allerdings eine spezielle Maschinerie erforderlich, die ihre Energie unmittelbar aus der Hydrolyse von ATP bezieht.\nDas ATP-abhängige Protein dieser Maschinerie ist das NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor, Abb. 17.18). NSF ist ein zylinderförmiger Proteinkomplex aus sechs identischen Untereinheiten, der an das N-terminale Ende des SNARE-Komplexes andockt. An den SNARE-Komplex lagern sich seitlich zudem mehrere -SNAP-Einheiten (soluble NSF attachment protein) an. -SNAP dient dem NSF als Adapter. Im NSF kommt es unter Beteiligung von ATP zu Konformationsänderungen, die vom -SNAP auf den SNARE-Komplex übertragen werden. Dadurch gelingt es, den außerordentlich stabilen SNARE-Komplex aufzulösen und die Untereinheiten weiteren Reaktionszyklen zur Verfügung zu stellen.\nNSF gehört zu einer Gruppe ATP-abhängiger Proteine, die als AAA-ATPasen bezeichnet werden (ATPases associated with various cellular activities). Zu den AAA-ATPasen zählt auch das hexamere Protein p97, das den Motorkomplex des retrograden Transports aus dem ER repräsentiert. In ihrer Primärstruktur zeigen NSF und p97 deutliche Ähnlichkeiten. Eine weitere AAA-ATPase ist die 19S-Komponente, mit deren Hilfe Proteasomen ihre Substrate aufnehmen. Generell nutzen AAA-ATPasen die Energie des ATP, um eine Entfaltung von Proteinen, eine Dissoziation von Proteinkomplexen oder einen Transport von Polypeptiden zu katalysieren.\nDie Fusion der verschiedenen Vesikel mit den jeweiligen Zielmembranen wird in der Zelle durch SNARE-Proteine vermittelt. Die Auflösung der SNARE-Komplexe erfolgt durch NSF, eine AAA-ATPase, die mit dem Adapter -SNAP kooperiert.\nDie Fusion neurosekretorischer Vesikel mit der präsynaptischen Membran (Kap. 29.4) ist in den vergangenen Jahren außerordentlich intensiv untersucht worden, sodass inzwischen viele Details geklärt werden konnten. Grundsätzlich sind zwei unterschiedliche Typen derartiger Vesikel zu unterscheiden:\nSekretorische Granula haben einen Durchmesser von ca. 100 nm und enthalten Neuropeptide.\nSynaptische Vesikel sind wesentlich kleiner. Sie haben einen Durchmesser von ca. 50 nm und enthalten Neurotransmitter wie Acetylcholin, Glutamat oder Catecholamine, aber keine Neuropeptide.\nAlle neurosekretorischen Vesikel scheinen ihren Inhalt mithilfe der gleichen Fusionsmaschinerie an den synaptischen Spalt abzugeben. Das v-SNARE der Vesikel ist das Synaptobrevin (syb; Abb. 17.19). Die präsynaptische Membran enthält die beiden t-SNARE-Proteine Syntaxin und SNAP-25. Wie bereits erwähnt, enthält SNAP-25 nicht nur ein, sondern gleich zwei SNARE-Motive in seiner Sequenz. (-SNAP und SNAP-25 sind nicht verwandt, es hat sich nur zufällig ein ähnlicher Name ergeben.)\nDie Anlagerung (Docking) und nachfolgende Fusion der Vesikel erfolgen in einem Bereich der präsynaptischen Membran, der als aktive Zone bezeichnet wird. Das Syntaxin wird an der präsynaptischen Membran zunächst von dem regulatorischen Protein Munc18 blockiert. Das Munc18 wird anschließend durch Munc13 vom Syntaxin abgelöst und die Fusionsmaschinerie dadurch in einen Bereitschaftszustand versetzt (Priming). Die Fusion wird jetzt nur noch von dem Vesikelprotein Synaptotagmin-1 blockiert, das zwar an die SNARE-Proteine bindet, deren weitere Reaktion aber zunächst verhindert. Die Blockade kann nur aufgehoben werden, indem Calciumionen an das Synaptotagmin-1 binden.\nIn der aktiven Zone befinden sich spannungsabhängige Calciumkanäle, die bei Eintreffen eines Aktionspotenzials kurzzeitig geöffnet werden. Die einströmenden Calciumionen binden an die beiden zytosolischen Domänen C2A und C2B des Synaptotagmins. Insgesamt wurden fünf Calciumbindungsstellen in diesen Domänen nachgewiesen. Die Calciumbindung löst dann eine entscheidende Umlagerung im Komplex der SNARE-Proteine und die Fusion der Membranen aus. Die Zeitspanne vom Eintritt der Calciumionen bis zur Freisetzung der Neurotransmitter beträgt nur 0,1–0,5 ms.\nDie bakteriellen Toxine von Clostridium tetani (dem Erreger des Wundstarrkrampfs) und Clostridium botulinum (Ursache schwerer Lebensmittelvergiftungen durch kontaminierte Wurstwaren) sind spezifische Proteasen, die SNARE-Proteine im C-terminalen Bereich des SNARE-Motivs spalten und die Proteine damit irreversibel inaktivieren. Die Freisetzung der Neurotransmitter wird dadurch vollständig verhindert. Da die SNARE-Proteine der verschiedenen Synapsen signifikante Sequenzunterschiede zeigen, sind die bakteriellen Toxine spezifisch für bestimmte Neurone. Entsprechend unterschiedlich sind die Symptome.\nWie das Choleratoxin gehört auch das Tetanustoxin zu den bakteriellen Toxinen vom AB5-Typ. Die A-Untereinheit des Tetanustoxins ist eine zinkhaltige Endopeptidase mit einer Spezifität für das SNARE-Protein Synaptobrevin in den inhibitorischen Interneuronen des Rückenmarks. Die Hemmung der Ausschüttung der Neurotransmitter in den Synapsen der Interneurone verursacht eine permanente Aktivierung der -Motoneurone und damit eine spastische Lähmung.\nZellen haben im Wesentlichen zwei Möglichkeiten, Material und Flüssigkeitströpfchen aus ihrer Umgebung aufzunehmen, nämlich Phagozytose und Endozytose.\nDurch Phagozytose können auch größere Teilchen aufgenommen werden, z.B. Bakterien durch Makrophagen. Bei der Phagozytose spielt in jedem Fall das Zytoskelett eine entscheidende Rolle, insbesondere das Actin, das die Bewegungen der Zelle vermittelt, durch die die aufzunehmenden Partikel umschlossen werden.\nBei der Endozytose werden unter direkter Beteiligung von Clathrinen Vesikel von 50–100 nm Durchmesser gebildet. Solange dabei nur unspezifisch Flüssigkeitströpfchen aufgenommen werden, spricht man von Pinozytose. Sobald der Inhalt der Vesikel von Rezeptorproteinen der Membran bestimmt wird, handelt es sich um eine rezeptorvermittelte Endozytose.\nDie Endozytose wird durch die Anlagerung von Adapterproteinen (AP) an membranspannende Rezeptoren eingeleitet (Abb. 17.20a). Sie ermöglichen dann in einem weiteren Schritt die Anlagerung der Clathrine, die letztlich die korbartige Umhüllung des Vesikels ausbilden.\nEin adapterproteinbindender Rezeptor ist bereits vorgestellt worden, nämlich der Mannose-6-phosphat-Rezeptor. Er bindet im Lumen des trans-Golgi-Netzwerks (TGN) die an Mannose phosphorylierten Glykoproteine und an der Außenseite den Adapterproteinkomplex AP1. Der AP1-Komplex ist ein spezifischer Adapter für Clathrin am TGN. Die entstehenden Vesikel wandern anschließend zu den Endosomen.\nDer Adapter AP2 hat eine entsprechende Funktion an der Plasmamembran. Dort bindet er z.B. an den LDL-Rezeptor und spielt eine Rolle bei der Endozytose der LDL. In den Synapsen vermittelt AP2 die Bildung sekretorischer Vesikel.\nDas Clathrin, das an AP1 bzw. an AP2 bindet, ist in allen diesen Fällen das gleiche Protein. Die Grundeinheit des Clathrinmantels ist das Triskelion, eine Struktur, die von den drei schweren Ketten gebildet wird (Abb. 17.20b). Der Name wurde in Analogie zu dem griechischen Ornament aus drei angewinkelten Beinen gewählt. Die N-Termini der schweren Ketten bilden globuläre Strukturen, die an die genannten Adapterproteine binden können. In den inneren Bereichen des Triskelions ist an jede schwere Kette eine leichte Kette angelagert. Das Triskelion ist kein ebenes System, sondern in sich leicht gebogen. Bei der Assoziation zum Clathrinkorb bildet sich deshalb von allein eine kugelige Struktur. An Membranen kommt es bei der Anlagerung von Clathrinmolekülen anfangs zur Ausbildung einer clathrinummantelten Grube (Coated pit), aus der dann der ummantelte Vesikel (Coated vesicle) hervorgeht (Abb. 17.20c, d).\nDie Adapterproteine binden auch mehrere akzessorische Proteine, die für die Bildung der clathrinummantelten Vesikel notwendig sind. Hierzu gehört das GTP-bindende Protein Dynamin, das GTP-abhängig kleine Ringe bildet. Es umkleidet den Hals, durch den die Vesikel anfangs noch mit der Membran verbunden sind, und spielt eine wesentliche Rolle bei der Abschnürung der Vesikel von der jeweiligen Membran.\nWeiterer Transport am Beispiel LDL\nDie Prozesse, die sich an die Endozytose anschließen können, sollen am Beispiel der LDL (Low-density-Lipoproteine, Kap. 18.2) genauer beschrieben werden.\nDie Aufnahme der LDL erfolgt in clathrinummantelten Gruben. Hier binden die LDL (Durchmesser 20–25 nm) an den LDL-Rezeptor, der über AP2-Adapter mit Clathrinmolekülen in Verbindung tritt. Nach Ablösung der Vesikel von der Plasmamembran löst sich der Clathrinmantel wieder auf. Dieser Prozess ist ATP-abhängig. Bei der ATPase (uncoating ATPase) handelt es sich um ein zytosolisches Mitglied der Hsp70-Familie. Die nackten Vesikel, die dabei übrig bleiben, sind die frühen Endosomen.\nDurch Fusion mit Vesikeln, die sich vom TGN abgelöst haben, entstehen aus den frühen Endosomen die späten Endosomen. Diese enthalten nun auch V-Typ-ATPasen. Die V-Typ-ATPasen haben weitgehend die gleiche Struktur wie die ATP-Synthasen der Mitochondrien (Kap. 6.4). Im Vergleich zu den mitochondrialen ATP-Synthasen (F-Typ-ATPasen) arbeiten die V-Typ-ATPasen aber rückwärts: Die ATP-Bindungsstellen liegen auf der zytosolischen Seite, und unter Hydrolyse von ATP werden Protonen in die frühen Endosomen hineingepumpt. Parallel werden auch Chloridionen aufgenommen, sodass zwar ein pH-Gradient aufgebaut wird, aber kein entsprechendes Membranpotenzial entsteht. Der pH-Wert sinkt auf 4,5–5. Relativ zum Zytosol entsteht damit ein mehr als 100facher Konzentrationsunterschied der Protonen, ein zehnfach höherer Konzentrationsunterschied als über der mitochondrialen Membran. Durch den Abfall des pH-Werts kommt es im Inneren der Endosomen zur Dissoziation von Ligand und Rezeptor, z.B. der LDL-Partikel vom LDL-Rezeptor.\nDie späten Endosomen geben zum einen Vesikel ab, die die LDL-Rezeptoren wieder zur Plasmamembran transportieren, zum anderen geben sie Vesikel ab, die die LDL-Partikel zu den Lysosomen transportieren. Auch die Lysosomen halten mithilfe von V-Typ-ATPasen einen pH-Wert von 4,5–5 aufrecht. Der LDL-Rezeptor benötigt für eine Rundreise in die Zelle hinein und zurück zur Plasmamembran nur 10–20 min. Erst nach mehreren 100 Runden wird er abgebaut und durch einen neuen ersetzt.\nDie M-Zellen der Peyer-Plaques nehmen im Ileum ständig Bakterien aus dem Lumen auf und geben sie dann an der basolateralen Seite an benachbarte Makrophagen ab. Ein derartiger Prozess, bei dem auf eine Endozytose unmittelbar eine Exozytose folgt, wird als Transzytose bezeichnet. Je nach Bedarf werden dann in der Darmschleimhaut IgA-Antikörper gebildet, die die Darmflora unter Kontrolle halten. Tatsächlich befinden sich die meisten Immunzellen des Menschen in Schleimhäuten, und die meisten Antikörper, die im Menschen produziert werden, gehören zum Typ IgA. Im Ileum gelangen die IgA durch die Enterozyten hindurch in das Lumen des Darms. Die Enterozyten nehmen die IgA durch rezeptorvermittelte Endozytose an der basolateralen Seite auf und geben sie an der apikalen Seite wieder ab. Auch hierbei handelt es sich um eine Transzytose. Durch Transzytose gelangen auch IgG aus dem Blut der Mutter in das Blut der Plazenta und aus dem Blut in die Muttermilch.\nEndozytose über Lipid rafts und Caveolae\nLipid rafts sind kleine Areale einer Plasmamembran, in denen sich ungewöhnlich viel Cholesterin und Sphingomyelin sammelt (Kap. 8.4.1, Abb. 8.32Kap. 8.4.1Abb. 8.32). Aufgrund der ungewöhnlichen Lipidzusammensetzung akkumulieren in den Lipid rafts auch bestimmte Membranproteine, z.B. Hormon- und Wachstumsfaktorrezeptoren. Auffällig viele Proteine der Lipid rafts sind über GPI-Anker mit der Membran verbunden. Ausgehend von Lipid rafts bilden sich oft kleine flaschenförmige Invaginationen von ca. 50 nm Durchmesser, die Caveolae (Kap. 16.7, Abb. 16.17bKap. 16.7Abb. 16.17b).\nEin charakteristisches Protein der Caveolae ist das Caveolin, das in die Membranen dieses Zellorganells eingelagert ist. In jüngster Zeit mehren sich Hinweise auf Endozytosevorgänge, die von Clathrinen und clathrinummantelten Vesikeln unabhängig sind und stattdessen von derartigen Caveolae ihren Ausgang nehmen. Interessanterweise ist auch in diesen Fällen das GTP-bindende Protein Dynamin am Mechanismus der Endozytose beteiligt. Die dabei gebildeten Vesikel fusionieren anschließend in vielen Fällen mit Endosomen, sodass sich die clathrinabhängigen und clathrinunabhängigen Importwege auf der Stufe der Endosomen wieder treffen. Ein physiologisches Substrat dieses Wegs scheint in den Endothelzellen das Albumin zu sein. Derzeit wird vermutet, dass Caveolae vielfach die Entrittspforte für Viren, Toxine oder auch ganze Bakterien sind. Ein besonders intensiv untersuchtes Beispiel ist der Weg des Choleratoxins in die Zielzellen der Darmschleimhaut\nEndozytose und intrazellulärer Transport des Choleratoxins\nErst jetzt, mehr als 100 Jahre nach der letzten großen Choleraepidemie in Europa, kann auch der Weg des zu Beginn dieses Kapitels erwähnten Choleratoxins in das Zytosol der Zielzellen präzise bestimmt werden (Abb. 17.21). Das Choleratoxin (CT) zählt zu den klassischen bakteriellen Toxinen vom AB5-Typ. Es besteht aus einer toxisch aktiven A-Untereinheit sowie aus fünf B-Untereinheiten, die für die Bindung an den Rezeptor in der Plasmamembran der Enterozyten des Jejunums verantwortlich sind. Als Rezeptor dient dem CT das Glykolipid GM1 (Kap. 8.2.3). Anschließend kommt es zu einer Endozytose des Toxins, die überwiegend von Caveolae ausgeht.\nAnschließend lässt sich das Toxin in typischen Endosomen nachweisen. Von hier aus gelangt es durch vesikulären Transport zum ER. Die A-Komponente des CT exponiert ein KDEL-Signal, das dafür sorgt, dass das Toxin bei einem Transport vom ER zum Golgi-Apparat sofort wieder zurück zum ER transportiert wird. Das CT ist dabei ein Substrat des retrograden, COP-I-vermittelten Transportwegs.\nIm ER gerät das CT in Kontakt mit den dort vorhandenen Chaperonproteinen und der Protein-Disulfid-Isomerase. Das CT wird entfaltet, und die Untereinheiten lösen sich voneinander ab. Dabei löst sich von der A-Untereinheit das entscheidende toxische Fragment A1 ab. Es wird retrograd durch Sec61-Poren des ER in das Zytosol exportiert. Als ATP-abhängiges Motorprotein des Exports dienen dabei Hexamere des p97. Erst jetzt kann das A1-Fragment im Zytosol seine toxische Aktivität entfalten und in die Regulation der cAMP-Konzentration eingreifen. Es katalysiert in den Enterozyten die ADP-Ribosylierung des heterotrimeren stimulatorischen G-Proteins Gs und löst damit eine permanente Aktivierung der Adenylatcyclase aus (Kap. 22.2).\nEs zeigt sich an diesem Beispiel, wie die aktuellen Fortschritte im molekularen Verständnis der zellulären Strukturen auch zu einem wesentlich besseren Verständnis pathologischer Prozesse beitragen können.\nUm von der Kernimportmaschinerie erkannt zu werden, müssen Proteine eine Kernlokalisationssequenz aufweisen. Dabei handelt es sich um einen charakteristischen, im Detail aber variablen Sequenzabschnitt. Der Austausch von Proteinen zwischen Zytosol und Zellkern wird generell durch Kernporen vermittelt. Diese haben einen äußeren Durchmesser von 145 nm und eine achtzählige Rotationssymmetrie. Die Proteine, aus denen die Kernporen aufgebaut sind, werden als Nucleoporine bezeichnet. Kleine Proteine können teilweise frei durch die Kernporen diffundieren, die meisten Proteine gelangen aber nur im Komplex mit einem Transportprotein aus der Familie der Importin--Proteine in den Kern. Dort lagert sich das GTP-bindende Protein Ran an das Importin an, und das neu importierte Kernprotein wird daraufhin vom Importin freigesetzt. Der Export von Proteinen aus dem Kern wird von Exportinen vermittelt, die mit den Importin--Proteinen strukturell verwandt sind.\nMitochondrien enthalten über 1000 verschiedene Proteine, von denen aber nur 13 von der mitochondrialen DNA kodiert sind und innerhalb der Mitochondrien synthetisiert werden. Alle anderen Proteine werden im Zytosol synthetisiert und posttranslational in die Mitochondrien importiert. Als Zielerkennungssignal dient dabei in den meisten Fällen eine positiv geladene N-terminale Präsequenz von etwa 20–40 Aminosäuren. Die Proteine binden zunächst an den TOM-Komplex der Außenmembran, der auch die generelle Importpore der Mitochondrien enthält. Die Insertion in die Innenmembran sowie der Transport durch die Innenmembran hindurch in die Matrix werden von TIM-Proteinen vermittelt. Die entscheidenden Energiequellen der Translokation sind das mitochondriale Membranpotenzial sowie ATP, das vom mitochondrialen Hitzeschockprotein mtHsp70 benötigt wird. Dieses bindet an die translozierenden Polypeptide und zieht sie in die Mitochondrien hinein.\nAuch peroxisomale Proteine werden an zytosolischen Ribosomen synthetisiert. Durch spezifische Zielerkennungssequenzen sind sie für den Transport in die Peroxisomen prädestiniert. Die Translokation wird von Peroxinen vermittelt. Angeborene Defekte der Peroxine sind die Ursache der Zellweger-Krankheit.\nProteintransport in das ER\nDer Proteintransport in das ER erfolgt weitgehend cotranslational, d.h., die Proteine des ER werden von Ribosomen synthetisiert, die sich unmittelbar an das ER anlagern ( raues ER). Die Proteinimportporen des ER, die Translocons, werden von den Proteinen Sec61, Sec61 und Sec61 zusammen mit dem Protein TRAM gebildet. Viele Proteine binden während der Translokation an ein Hitzeschockprotein aus der Hsp70-Familie, das Protein BiP. Dieses gehört zu den Chaperonproteinen und Faltungshelfern, die im Lumen des ER die Aggregation der neu importierten Proteine verhindern. Proteine, die ihre native Struktur gleichwohl nicht erreichen, werden durch die Proteinimportporen retrograd zurück in das Zytosol transportiert, wo sie von Proteasomen abgebaut werden. Im Lumen des ER werden viele Proteine kovalent mit Kohlenhydratseitenketten versehen, also glykosyliert. Die Glykosylierung erfolgt im ER generell an der Amid- gruppe bestimmter Asparaginreste. Die Substratproteine werden somit N-glykosyliert. Die Redoxbedingungen erlauben im ER zudem die Ausbildung von Disulfidbrücken (–S–S–). Die Bildung der korrekten Disulfidbrücken wird durch Protein-Disulfid-Isomerasen (PDI) erleichtert.\nAuf dem sekretorischen Weg gelangen bestimmte Proteine, die von den Ribosomen des rauen ER synthetisiert wurden, an die Zelloberfläche oder sogar aus der Zelle heraus. Der Transport erfolgt mit Vesikeln, die sich von den Membranen des ER abschnüren und dann zunächst zum Golgi-Apparat gelangen, um dort mit den Membranen zu fusionieren. Hier bilden sich dann erneut Vesikel, die den weiteren Transport vermitteln. Die an diesen Schritten beteiligten Vesikel sind die COP-II-Vesikel. Ein retrograder Transport von der Peripherie zum ER wird von COP-I-Vesikeln vermittelt. Lösliche Proteine müssen eine C-terminale KDEL-Sequenz (Lys–Asp–Glu–Leu) aufweisen, um am retrograden COP-I-Transport teilnehmen zu können. Eine KDEL-Sequenz zeigt auch die toxische A-Untereinheit des Choleratoxins, die durch retrograden Transport von der Zelloberfläche zum ER gelangt. Die Fusion der verschiedenen Vesikel mit der jeweiligen Zielmembran wird durch SNARE-Proteine vermittelt. Die Membranfusion wird dabei durch lange -Helices eingeleitet, die sich aneinanderlagern und die Membranen in unmittelbaren Kontakt bringen. Die SNARE-Komplexe werden nach der Fusion unter Beteiligung der Proteine NSF und -SNAP wieder aufgelöst. Dieser Prozess ist ATP-abhängig. SNARE-Proteine sind auch an der Sekretion der Neurotransmitter in den Synapsen beteiligt.\nEine Endozytose kann unabhängig voneinander entweder von clathrinummantelten Gruben oder von Caveolae ausgehen. Caveolae bilden sich an der Plasmamembran, ausgehend von Lipid rafts. Diese enthalten in hoher Konzentration u.a. Cholesterin und Sphingomyelin. In den entstehenden Endosomen kommt es nach Einbau von V-Typ-ATPasen zu einer Ansäuerung. In der Regel fusionieren die Endosomen schließlich mit Lysosomen, in denen der Inhalt der Endosomen weitgehend abgebaut wird.\nProteine, die in den Zellkern, in die Mitochondrien oder in das ER importiert werden sollen, exponieren jeweils charakteristische Zielerkennungssignale. Warum bleiben die Zielerkennungssignale der Kernproteine dauerhaft erhalten, während diejenigen der mitochondrialen und der ER-Proteine nach der Translokation sofort entfernt werden?\nErläutern Sie, warum das Protein Bax, das durch Insertion in die mitochondriale Außenmembran Apoptose auslösen kann, keine typische N-terminale Präsequenz aufweist. Denken Sie bei der Beantwortung an die konkrete Funktion der klassischen Präsequenzen beim mitochondrialen Proteinimport.\nErläutern Sie, warum Proteine der Zelloberfläche oft glykosyliert sind, warum es aber sehr unwahrscheinlich ist, dass auch ein Protein der mitochondrialen Außenmembran glykosyliert sein könnte.\nDie Glykoproteine der Schleimhäute, die Mucine, enthalten sowohl N- als auch O-glykosylierte Kohlenhydratseitenketten. Erläutern Sie, in welchem Zellorganell die jeweilige Glykosylierung stattgefunden hat.\nNennen Sie Proteine in der Membran des ER, die am retrograden Transport des defekten CFTR-Proteins bei Mukoviszidose beteiligt sein könnten.\nErläutern Sie, wie die toxische A-Untereinheit des Choleratoxins nach Bindung an die Zelloberfläche in das Zytosol der Zielzelle gelangt.\nErläutern Sie die Toxizität des Tetanustoxins.\nWelcher Schritt in der Funktion der SNARE-Proteine ist ATP-abhängig? Denken Sie bei der Beantwortung an den vollständigen Reaktionszyklus der SNARE-Proteine.