10/20pcs Plast Seng Udskiftning 2 Størrelser Sovesofa Lamel Sort Center Endekapper Indehavere Indre Gummi Muffe Møbler Tilbehør / Top ~ www.mythos-graesktaverna.dk\n10/20Pcs Plast Seng Udskiftning 2 Størrelser Sovesofa Lamel Sort Center endekapper Indehavere Indre Gummi Muffe Møbler Tilbehør\nTags: parure de oplyste 200, cykel dahon, kaktus led usb, latte cup, smart both, sofa tilbehør butik, håndtere møbler område!, lamel træ, plast lamel indehaver, anti-tangle gummi.\nEt Enkelt Hoved: 210120010276\nDobbelt Hovedet: 210120020276\nModel-Nummer: Udskiftning Bed Lamel\n100% Nye og Autentiske Pålidelig Kvalitet\nModel: Center Cap / End Cap\nSingle - End Cap størrelse: 55*30*27mm (Længde * Bredde * Højde)\nDobbelt - Center Cap størrelse: 55*55*17mm (Længde * Bredde * Højde)\n1. Høj kvalitet plast, tykt materiale, holdbart.\n2. Bruges til at lave/rette træ-planker på sengested.\n3. Egnet til metal, seng, læder seng, træ-seng, sovesofa, køjeseng osv. ...\n1.På grund af lys-og tv forskel, de elementer, farve maby være lidt forskellige fra de billeder.\n2.Lad 0.2-0.8 cm forskelle på grund af manuel måling.\n10/20pcs * Udskiftning Bed Lamel plasthætter\nTegnefilm Mønster Baby Tæppe Milepæl Fotografering Af Nyfødte Baby Tæppe Spille Måtter Månedlige Antal Foto Prop Baggrund Klud\nTegnefilm Mønster Spædbarn Baby Tæppe Milepæl Fotografering af Nyfødte Baby Tæppe Spille Måtter Månedlige Antal Foto Prop Baggrund Klud Funktion: Type:Nyfødt baby milepæl tæppe Materiale: Polyester bomuld Størrelse: 100*100cm Farve: Som Vist Antal: 1pc Egnet scener: baby portrætter, hundrede dage, jubilæum, fødselsdag, jubilæum Brug:\nNYE 7" For Google Hjem Reden Hub Carbon / Google Reden Hub CON Grigio Assistent LCD-Display og Touch-Skærm, Digitizer Assembly\nF405-WING STM32F405 Flight Controller Kontrol Med INAVOSD MPU6000 BMP280 /Support Fly Fløj fastvinget\nProdukt Beskrivelse FC Specifikationer: MCU: 168MHz STM32F405 IMU: MPU6000 accelerometer/gyro (SPI) Baro: BMP280 (I2C) OSD: INAV OSD w/ AT7456E chip Blackbox: MicroSD card slot (SD/SDHC -) VCP & 6x UARTs 2x Motorer, 7x Servoer udgange 2x I2C 3x Lysdioder for FC STATUS\nMonteret Badekar Hane Chrome med håndbruser Badeværelse Karbad Håndvask blandingsbatteri fritstående svingtud Brus Tryk på XT377\nProdukt beskrivelse: Materiale: Messing. Farve: Krom . Komplet med slanger og tilbehør. Et hul installation. Betaling Vi accepterer SPÆRREDE / Kreditkort Og VISA .Bank til Bank Wire transfer Western Union Fragt : · Vær mere opmærksom på at din ordre-adresser, som SKAL passe til din leveringsadresse.\nkr2 898.80 kr1 594.34\nHOT Skelet Hoved Harpiks Askebæger Kraniet Ghost Skønhed Statue Håndværk Askebæger, Tobak Aske Max Skulptur Statue Cigaret Aske Container\nHOT Skelet Hoved Harpiks Askebæger Kraniet Ghost Skønhed Statue Håndværk Askebæger, Tobak Aske Max Skulptur Statue Cigaret Aske Container Beskrivelse: Produkt navn: rund skalle askebæger Produkt model: MH20030 Produkt materiale: harpiks Produkt størrelse: diameter 11.5*3cm Produkt vægt: 248g, brutto vægt 350g Produkt emballage:\n20 sæt af høj kvalitet Z-type Aluminium Solar Panel Tag Monteringsbeslag for carvan tag\nVær opmærksom bemærk 1.En masse = 20 sæt. 2.Leveret af Fedex eller DHL. 3.pakken indeholder 1 sæt 4stk Aluminium Campingvogn parentes 4stk Bolt M6x16 4stk Møtrik M6 8stk træ skruer 4stk låseskive 4stk Skive Installere Manuel: Trin 1: Sæt solpanel på det horisontale plan med forsiden ned,tage ud en\nEaget Fingeraftryk USB 3,0 Flash-Drev 128 GB Pendrive 64GB Personlige oplysninger Krypteret Pen Drive 32GB Top Sikkerhed USB-Drev\nFunktioner : 1. Hjælp AES265 kryptering algoritme,giver den dybeste beskyttelse af dine oplysninger sikkerhed. 2. Din personlige hemmelighed senior husholderske.Unik baggrund centrale management system, hommization indstillinger og kontrollere, at forvaltningsmyndigheden. 3. Ngeraftryk,hurtig respons, følsomme,forenkle\nApexway Batteri til Acer Aspire 3100 3690 5100 5610 5630 5650 5680 9110 9120 9800 Serie BATBL50L6 BATCL50L6 BATBL50L4 BATCL50L\nBemærk: Postnummer 97 og 98 i Frankrig ikke kan sende. Postnummer 35-, 07-, 38 -, og Balearen, de Kanariske Øer, Las Palmas Santa Cruz de Tenerife i Spanien ikke kan sende. Laptop Batteri kan erstatte følgende varenumre BATBL50L4 BATBL50L6 BATCL50L6 Laptop Batteri også kompatibel med følgende\nSOGANRE Smart Touch Bassin Hane Rustfrit Stål-Touch Sensor Følsomme Badeværelse Vandhaner Touch-Kontrol-Tryk let på Med Sæbe Dispenser\nSOGANRE Smart Touch Bassin Hane Rustfrit Stål-Touch Sensor Følsomme Badeværelse Vandhaner Touch-Kontrol-Tryk Let På Med Sæbe Dispenser Produkt Beskrivelse SOGNARE Touch Kontrol Badeværelse Håndvask Hane Elegant Design Og En Finish Produktet Er Fremstillet I Kina Type Installation: Dæk Monteret Installeringshuller:\n8LED nattesyn Bil førerspejlets Kamera Auto Parkering Overvåge CCD Vandtæt universal bil kamera Universal Backup Parkering Kamera\nVelkommen til SoulNavi Bil AutoRadio Butik, Har En Dejlig Dag! 8 LED Night Vision Bil førerspejlets Kamera Universal Backup Parkering Kamera Auto Parkering Overvåge CCD Vandtæt universal bil kamera Funktion: 1.produkt navn: 8LED bil førerspejlets kamera 2.Anti tåge glas. 3.CCD-imaging sensor. 4.Understøtter\nPrint Boardshorts Mænd Board-Badeshorts mænds badetøj kuffert Herre Beach Shorts Surf Vand Sport Fitness Bære Korte Ingen Liner/foer\n1stk For 3D-printer blæser 5CM BUB0524HHB turbine blæser ventilator 5015 24V 0.18 Aserver inverter\nModel: BUB0524HHB Størrelse: diameter 50 mm, tykkelse 15mm Pitch: 57mm Spænding: 24V Nuværende: 0.18 En Leje: double ball Ledning: 3 linjer\nSabre hånd protector, Sabre standard vagt, hegn, tilbehør og udstyr\nAlle produkter er fra min fabrik, med god kvalitet og til en konkurrencedygtig pris! Beskrivelser: Fægtning er den kampkunst, kæmper med knive.Den almindelige version af hegn i dag, generelt kendt som Ol-Fægtning, er opdelt i 3 hovedkategorier: Folie, Sabre og Epee. Vi er en fabrik, der producerer hegn masker, hegn, tasker,\nHUACAN Billede Af Tal Mad Håndmalet DIY Gave Hjem kagepynt Tegning På Lærred Maleri Blomst Væg Kunst\nNavn: Maleri Af Numre Blomst Om rammen: Vi sælger diy olie maleri af tal uden Ramme Værktøj: 1 x Lærred/3 x Paintbrush (1big,1middle,1small)/1 indstil maling/2 x Ikke-trace krog/ 2 x skrue Opmærksomhed: Dette er ikke et færdigt maleri,du har brug for at afslutte det selv. Vær Opmærksom på: Hvis der er en\nFashion Kvinder Langærmet Bluse Med Blomster Print Ladies Casual Bluse, T-Shirt, Toppe\nHej!Velkommen til vores butik! Kvalitet er den første med den bedste service.kunder alle er vores venner. Fashion design,100% Helt Ny,høj kvalitet! Materiale: Polyester Farve:vist som billede Størrelse: S, M, L Ærme Type: Langt ærme Pakke Indhold: 1 x Toppe Bemærkninger: Bemærk,\nDesktop Bowling Spil Mini Træ Bold Brætspil, Legetøj Forældre-Barn-Interaktiv Tabel For Børn, Voksne, Familie, Sjove Puzzle Udvikle\nBeskrivelse: Hvad med bowling i hjemmet? Hej, prøv dette legetøj! Funktioner: -Nyt design miniature desktop bowling, giver dig en form for anderledes og spændende oplevelse. -Lavet af sikre og ikke-giftige træ-materiale, bare bruge med tryghed. -Med glat overflade, ikke såre dine hænder let. -Hjælper\nFordele'Kit SD-081A Elektroniske Precision Skruetrækker Sæt 7pcs med Kærv og Phillips skruetrækker for elektronik telefon reparation\n100% Oprindelige Pro'sKit SD-081A 7pcs Precision Skruetrækker Sæt Elektronik Reparation Telefon Fremstillet af AISI 8660 Krom-Molybdæn-Vanadium Stål med satin-finish.Glat roterende cap for let skrue/skrue hurtigt uden at løfte bits Ergonomisk non-slip dual farve TPR og Nylon håndtag for brugeren Indhold 7 Stk AISI 8660\nVoksen/barn Vaskbar Genanvendelige Støvtæt Stof Maske, Unicorn Hest Dyre Ansigt Maske med Filter Chip Mascarillas\n2pack HOT NYE BR-2/3AGCT4A 6v batteri PLC BR-2/3AGCT4A lithium-ion-batterier Sort bælte krog plug\nFunktioner Model Nummer: BR-2/3AGCT4A Mærke:Original Spænding:6V Kapacitet:5000mAh Vægt:55g Diamter:34.5 mm Højde:33.5 mm Fremstillet i Japan Pakken indeholder: 2pack BR-2/3AGCT4A 6v batteri PLC Service Efter Salg: ● Kære købere, alle de varer, af lithium batterier i vores butik leveres med detaljerede registreret tracking nummer ● Vi\n20Pieces 10 ML Parfume Flaske Matteret sand Med emballage max Spray Flasker Prøve Tomme Beholdere Forstøver\n------ 20Pieces 10 ML Parfume Flaske Matteret sand Med emballage max Spray Flasker Prøve Tomme Beholdere Forstøver Kapacitet: 10 ml Vægt: 13g 13g Materiale: Glas flaske Type: Tom Flaske Proces: Matteret sand, Spray-farver, UV-belægning, Udskrivning


Long time no see | Londoners Long time no see – Londoners\nFørste skridt er selvfølgelig at tage beslutningen om at ville afsted. At turde sige farvel til alt\nDer har været alt for stille herinde et stykke tid. At man ofte siger at London er en travl by er uden tvivl sandt og når man oveni det også gerne vil opleve en masse, er der ikke meget tid at hente til at sidde stille et par timer med computeren.\nJeg har har de to sidste uger b.la. spist fødselsdagsbrunch med Katarina på en café TRADE i Shoreditch, et super fedt område der har masser af små hyggelige cafeer og masser af natteliv. Dertil har jeg også været til Chanel Mademoiselle Privé exhibition, hvilket faktisk var lidt skuffende..\nI sidste weekend havde jeg besøg af min dejlige veninde, Helene fra Danmark. Den stod på shopping, hygge, god mad og ikke mindst en tur i Londons natteliv. Vi fik de lækreste pizzaer på Pizza Union ved Kings Cross, det er et helt vildt hyggeligt og billigt sted.\nPå trods af det godt kan lyde som 2 uger med tid til en masse skal de 40-45 timers arbejde også lige regnes med og når det er gjort er der ikke meget tid at hente. Jeg nyder mine fridage i fulde drag, men kunne dog stadig godt tænke mig at have mere tid til at se mere af England. Men på trods af lange dage på job er det, det hele værd når det som i dag lige har været payday og en god løn er trillet ind på kontoen. Jeg nyder den engelske skat mere og mere (du kan tjene op til 10600kr free herovre, lidt et andet frikort end i Danmark).\nDet er endelig blevet weekend og min familie kommer på besøg, så jeg glæder mig til at vise dem London og alt det jeg har oplevet de sidste 3 måneder.\nFørste skridt er selvfølgelig at tage beslutningen om at ville afsted. At turde sige farvel til alt derhjemme og hoppe på flyveren mod en helt …


Jesus’ efterlignelsesværdige egenskaber | Jesus’ liv\nFordi Jesus var fuldkommen, havde han ikke mange af de bekymringer og problemer som andre havde. Men han viste at han havde dybe følelser for mennesker. Han var villig til at gøre alt hvad han kunne, for at hjælpe dem – han gjorde mere end hvad der var nødvendigt. Ja, medfølelse fik ham til at hjælpe andre. Meditér over eksemplerne på det i kapitlerne 32, 37, 57, 99.\nBåde børn og voksne følte at de kunne komme til Jesus, for han var hverken reserveret eller arrogant. Folk følte sig godt tilpas i hans selskab fordi de kunne fornemme at han interesserede sig for dem. Det kan du læse om i kapitlerne 25, 27, 95.\nOPTAGET AF BØN\nJesus henvendte sig ofte til sin Far i bøn, både når han var alene og sammen med andre. Han bad ved mange forskellige lejligheder, ikke kun ved måltiderne. Han bad til sin Far for at takke ham, lovprise ham og få vejledning når han skulle træffe vigtige beslutninger. Læg mærke til eksemplerne på det i kapitlerne 24, 34, 91, 122, 123.\nNår Jesus til tider trængte til at hvile sig og slappe af, satte han alligevel andres behov før sine egne. Han havde ikke en mig-først-indstilling, så også på det her område er han et rigtig godt eksempel som vi kan efterligne. Læs om hans eksemplariske uselviskhed i kapitlerne 19, 41, 52.\nJesus nøjedes ikke med at undervise i at man skal være tilgivende – han var selv tilgivende over for sine disciple og andre. Grund over eksempler på det i kapitlerne 26, 40, 64, 85, 131.\nIHÆRDIG OG IVRIG\nDet var forudsagt at de fleste jøder ikke ville anerkende Messias, og at hans fjender ville dræbe ham. Så Jesus kunne have valgt at gøre mindst muligt for folk. Men det gjorde han ikke – han fremmede ihærdigt den sande tilbedelse. Han var et eksempel i iver for alle sine disciple der kommer ud for ligegyldighed eller endda modstand. Se kapitlerne 16, 72, 103.\nJesus var ufuldkomne mennesker langt overlegen på utallige områder, for eksempel med hensyn til kundskab og visdom. Det at han var fuldkommen, betød uden tvivl at hans fysiske og mentale evner overgik alle andres omkring ham. Alligevel tjente han ydmygt andre. Det kan du læse om i kapitlerne 10, 62, 66, 94, 116.\nJesus var altid tålmodig med sine apostle og andre når det ikke lykkedes dem at efterligne hans eksempel eller at anvende det han lærte dem. Han gentog tålmodigt hvad de skulle gøre for at komme nær til Jehova. Reflektér over eksempler på Jesus’ tålmodighed i kapitlerne 74, 98, 118, 135.


Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass | Protocol (Translated to Danish)\nKvantitative lokalisering af Golgi Protein af Imaging dens centrum af fluorescens masse\nHigh Precision FRET på enkeltmolekyliveau forbiomolekylstrukturbestemmelse…\nDen præcise lokalisering af Golgi beboere er afgørende for forståelsen af Golgi cellulære funktioner. Men konventionelle Optisk mikroskopi er afskåret fra løse sub-Golgi strukturen. Her beskriver vi protokol for en konventionel mikroskopi baseret super-resolution metode til at bestemme kvantitativt sub-Golgi lokalisering af et protein.\nGolgi kompleks består af seriefremstillede stablet membran cisternae, som kan yderligere inddeles i sub-Golgi regioner, herunder SNG-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi og trans-Golgi netværk. Cellulære funktioner af Golgi bestemmes af den karakteristiske distribution af sin bopæl proteiner. Konventionelle lysmikroskopi rumlige opløsning er for lav til at løse sub-Golgi struktur eller cisternae. Immuno-guld elektronmikroskopi er således en metode til at lokalisere et protein på sub-Golgi plan. Teknik og instrument er dog ud over evne af de fleste celle biologi labs. Her beskriver vi vores nyligt udviklede super-resolution metode kaldet Golgi protein lokalisering af imaging Centre of mass (lys) til systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein. LYS er baseret på standard fluorescens mærkning protokoller og konventionelle wide-felt eller Konfokal mikroskoper. Det drejer sig om kalibrering af kromatisk-Skift aberration af mikroskopiske systemet, image erhvervelse og efter købet analyse. Sub-Golgi lokaliseringen af en test protein udtrykkes kvantitativt lokalisering kvotienten. Der er fire vigtigste fordele ved lys; Det er hurtig, baseret på konventionelle metoder og værktøjer, lokalisering resultatet er kvantitative, og det frembyder ~ 30 nm praktiske opløsningen langs Golgi-aksen. Her beskriver vi de detaljerede protokollen af lys til at lokalisere en test Golgi protein.\nGolgi kompleks spiller væsentlige roller i sekretoriske/endocytic handel med proteiner og lipider (herefter laster) i pattedyrceller1,2,3. I Golgi, er laster ikke kun sorteret til forskellige subcellulære rum men også ændret ved forskellige typer af glykosylering. Den pattedyr Golgi kompleks omfatter talrige sideværts tilsluttede Golgi stakke, som typisk består af 4-11 stramt tilstødende og flad membran sække kaldet cisternae. De seriefremstillede stablet Golgi cisternae yderligere kategoriseres, fra den ene ende til den anden, som cis, mediale og trans-cisternae. På trans-side af en Golgi stak, trans-de fleste membran sac udvikler sig til en rørformet og reticulum membran netværk kaldet trans-Golgi netværk (TGN)4. I den sekretoriske pathway, laster stammer fra det endoplasmatiske reticulum (ER) Angiv en Golgi stak på sin cis-side og derefter sekventielt passere gennem mediale og trans-cisternae. Laster til sidst afslutte Golgi på trans-Golgi eller TGN destining plasma membran, endosomes eller sekretorisk granulat.\nDe molekylære og cellulære mekanismer af hvordan laster transit en Golgi stak og hvordan Golgi fastholder sin cisternal organisation forblive mystiske og er i øjeblikket stadig under en ophedet debat1. En af vanskelighederne på dette område er at Golgi cisternae kun kan løses under elektronmikroskopi (EM) siden opløsningen af et optisk mikroskop (~ 200 nm) er utilstrækkelige til at løse individuelle Golgi cisternae (< 100 nm i begge cisternal tykkelse og afstand). Sub-Golgi lokaliseringen af hjemmehørende proteiner og transit laster bestemmes derfor konventionelt immuno-guld EM. Men immuno-guld EM meget teknisk krævende og det er ud over evne af de fleste celle biologi labs. Selv om løsningen af EM kan være sub nanometer, opløsningen af den immuno-guld EM er stærkt hæmmet af antistof kompleks størrelse (primære plus den sekundær antistof) og guld partiklen, og det kan være værre end 20 nm. Derudover fås EM billeder fra 2D tynd-sektioner i stedet for en 3D globale visning af Golgi, hvilket kan føre til fejlagtige konklusioner alt efter den relative placering og orientering af 2D sektion5. For eksempel kan at studere en EM single-sektion ikke pålideligt differentiere en vesikel ud fra de retvinklede en tubulus, da begge kan vise identiske runde membran profiler. De nylige fremkomsten af super-resolution mikroskopi-teknikker, såsom 3D-strukturerede belysning mikroskopi (3D-SIM), stimuleret emission udtynding (STED), photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi ( STORM), gør det muligt at løse sub-Golgi strukturer under lys mikroskoper6. Men der er mindst fire ulemper, der kan i betydelig grad begrænse deres anvendelser i celle biologisk undersøgelse af Golgi. 1) aktuelle super-resolution teknikker kræver dyre og særlige hardwarekonfiguration, som er ud over de fleste celle biologi labs. 2) særlig fluorescens mærkning protokoller er behov for nogle super-opløsning teknikker. 3) selv om den bedste betingelse, hævder disse teknikker 20-110 nm i rumlige opløsning, kan den praktiske opløsning fremstillet i ægte prøver være meget værre. 4) i forhold til konventionelle mikroskopi, disse super-resolution teknikker stadig har vanskeligheder med at gennemføre multicolor, 3D eller live celle imaging, enten enkeltvis eller i kombination. Nok vigtigst, giver både immuno-guld EM og super-resolution mikroskopi-teknikker kvalitative i stedet for kvantitative lokalisering data.\nForsøger at delvist løse ovennævnte problemer, har vi for nylig udviklet en konventionel lysmikroskopi baseret metode, som er opkaldt Golgi protein lokalisering af imaging Centre of mass (lys), til systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein med en opløsning svarende til immuno-guld EM7. I denne metode, er Golgi i kulturperler pattedyrceller spredt som Golgi mini-stakke af behandling af nocodazole, en mikrotubulus depolymerizing stof. Omfattende undersøgelser har vist, at nocodazole-induceret Golgi mini-stakke (herefter Golgi mini-stakke) ligner indfødte Golgi stakke i både organisation og cellulære funktioner8,9,10, 11. Lokalisering kvotienten (LQ) af en test protein kan erhverves gennem lys og det betegner den kvantitative sub-Golgi lokalisering. Numeriske værdier for LQs kan sammenlignes og en LQ database med mere end 25 Golgi markører har været til rådighed.\nGolgi mini-stakke er i lys, triple-mærket af endogene eller eksogent udtrykt GM130, GalT-mCherry og test protein (x). GM130 og GalT-mCherry, cis- og trans-Golgi markører henholdsvis12,13, levere referencepunkter. Den tredobbelte fluorescens, rød (R), grøn (G) og far-red (B), kunstigt vises som røde, grønne og blå, henholdsvis. Midten af fluorescens masse (herefter center) er vedtaget for at opnå sub-pixel opløsning. Golgi akse defineres som vektor fra center GM130 som GalT-mCherry. Golgi mini stack er modelleret som en cylindrisk struktur med uendelig rotational symmetri omkring Golgi akse. Derfor kan en Golgi mini stack yderligere modelleret som en endimensional struktur langs Golgi akse. LQ test protein x defineres som dxd1, hvor dx er afstanden fra midten af x som GM130, mens d1 er afstanden fra centrum af GalT-mCherry end GM130. Hvis midten af x er off-axis, bruges sin fremskrivning aksial afstand til beregning. Variabler, herunder Golgi akse, aksial vinkel, dx, d1, vinklen α og β, vinkel, for lys er skematisk illustreret i figur 1. LQ er uafhængig af Golgi aksial vinkel, selvom Golgi mini-stakke orientere tilfældigt i en celle.\nGolgi mini-stakke vises inhomogene i billeder. Vi udviklet tre kriterier for at vælge analyzable Golgi mini-stakke for lys. 1) den signal-støj-forholdet kriterium, hvor forholdet mellem den samlede intensiteten af en Golgi mini stack til standardafvigelse (SD) i baggrunden er ≥ 30 i hver kanal. Dette kriterium er at sikre den positionering nøjagtighed af center of mass, som afhænger af signal-støj-forhold af Golgi mini-stakke. 2) den aksiale vinkel eller afstand kriterium, som kræver d1≥ 70 nm. d1 aftager med forhøjelsen af Golgi aksial vinkel. Når den aksiale vinkel nærmer sig 90° eller lodret, mini stakken bliver ikke-opløselige d1 nærmer sig 0. d1≥ 70 nm kan effektivt udelukke nær lodret Golgi mini-stakke. 3) co-linearitet kriteriet, hvor enten | tan α | eller | tan β | er ≤ 0,3. Dette kriterium sikrer, at de tre centre for en mini stack er tilstrækkeligt co-lineær for vores endimensional model af Golgi mini stack. Alle lys mikroskoper lider af kromatisk aberration, der kan alvorligt fordreje de relative position af rød, grøn og far-red fluorescens Centre. Kromatisk aberration af mikroskop systemer er eksperimentelt kalibreret af imaging 110 nm perler, som triple-mærket af rød, grøn og far-red fluorescens. For hver perle billede, midten af rød er defineret som den sande holdning af perle og kromatisk-skift af grønne og far-red Centre er monteret af første-ordens polynomiel funktioner. Centre af Golgi mini-stakke er udsat for de polynomiel funktioner til at korrigere de kromatiske forskydninger i grønne og far-red kanaler.\nGennem lys kan vi opnå en opløsning af ~ 30 nm langs Golgi akse under standardbetingelser. Vigtigere, giver det en systematisk metode til kvantitativt kort enhver Golgi protein. LYS kan udføres af konventionelle mikroskoper, såsom wide-felt eller Konfokal mikroskoper, ved hjælp af fælles fluorescens mærkning protokoller. Billedbehandling og databehandling kan tage så kort som en time. Gennem lys, har vi direkte demonstreret den progressive overgang af sekretoriske lasten fra cis- til trans-side af Golgi7.\nBemærk: Nedenfor er en trin for trin protokol af lys til bestemmelse af LQ af EGFP-mærket tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), en Golgi bosiddende enzym, i HeLa celler.\n1. forberedelse af fluorescens-mærket Golgi Mini-stakke\nForbered glas coverslips\nAlikvot 0,3 mL sterilt Dulbecco ændret Eagle's Medium (DMEM) til et godt af en 24-godt plade i vævskultur hætte.\nTørre et stykke af Φ 12 mm No.1.5 glas coverslip ved hjælp af bløde silkepapir dabbed med 70% ethanol til at fjerne snavs på overfladen af glas coverslip. Bruge et par skarpe pincet til kort lægges i blød i coverslip i 70% ethanol, overføre det ind i den 24-godt plade og synker det til bunden af den godt indeholdende sterile DMEM.\nBemærk: Glas coverslips er konventionelt steriliseret ved flambering. Dog knække coverslips under sådan behandling nemt under efterfølgende håndtering. 70% ethanol iblødsætning er effektiv til sterilisation glas coverslips uden at beskadige dem.\nMed låg er omfattet, forlade den 24-godt plade i 37 ° C CO2 inkubator indtil brug.\nKultur HeLa celler (herefter celler) i en T-25 kolben i DMEM suppleret med 10% føtal bovin Serum (FBS) (herefter komplet medium) i et 37 ° C CO2 inkubator leveres med 5% CO2. Antibiotika er ikke nødvendige her.\nNår cellerne kommer ~ 80% confluency, Aspirér næringssubstratet. Der tilsættes 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA i kolben og der inkuberes celler i et 37 ° C CO2 inkubator for 2 min. Tilføj 1 mL komplet medium i kolben og forsigtigt flush celler ud af kolben væggen når der afpipetteres.\nOverføre fritliggende celler til en steril centrifugering rør og spin på 500 x g i 2 min. at sammenpresse cellerne. Opsug supernatanten og suspendere celle pellet i 1 mL komplet medium.\nOpsug medium i godt af 24-godt plade der indeholder steriliseret glas coverslip og frø ~ 1 x 105 celler i brønden. Top op af brønden med komplet medium til 0,5 mL. Inkuber i et 37 ° C CO2 inkubator leveres med 5% CO2. Kultur celler til ~ 80% confluency.\nBemærk: Well-spread celler er fordelagtige for imaging spredte Golgi mini-stakke.\nTransfect ~ 80% sammenflydende celler med 80 ng GalT-mCherry7 og 320 ng TPST1-EGFP (Se Tabel af materialer) DNA plasmider ved hjælp af en Transfektion reagens ifølge protokollen fra producenten. Inkuber i et 37 ° C CO2 inkubator. Ændre medium efter 4-6 h inkubation. Cellerne er klar ~ 12 timer senere.\nNocodazole behandling til at generere Golgi mini-stakke\nForberede en nocodazole stamopløsning (33 mM) ved at opløse 10 mg nocodazole pulver i 1 mL dimethylsulfoxid. Alikvot stamopløsningen og opbevares ved-20 ° C til langtidsopbevaring.\nFortyndes 1 µL af nocodazole stamopløsning (33 mM) i 1 mL 37 ° C komplet medium (slutkoncentration 33 µM). Der centrifugeres ved topfart at fjerne partikler.\nAspirér medium i brønden, og der tilsættes 0,5 mL af 33 µM nocodazole indeholdende komplet medium. Inkuber celler i et 37 ° C CO2 inkubator for 3 h. Fortsæt til immunofluorescens mærkning (afsnit 1.5).\nBemærk: Hold celler i mørke til at undgå photobleaching GalT-mCherry og TPST1-EGFP.\nForberede reagenser til immunofluorescens mærkning\nFor at forberede 4% PARAFORMALDEHYD opløsning, opløse 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD pulver i hot 1 X fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og opløsningen filtreres gennem 0,45 µm filter. Opløsningen kan opbevares ved-20 ° C.\nForsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige og kræftfremkaldende, og det kan forårsage hudirritation. Bære en passende personlige værnemidler (PPE).\nFor at forberede fluorescens fortynding buffer (FDB), mix 5% (v/v) FBS, og 2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS. Opløsningen filtreres gennem 0,45 µm filter og gemme løsningen på-20 ° C.\nOpløse 5,35 g NH4Cl pulver i 1 L vand til at forberede 100 mM NH4Cl og gemme løsning ved stuetemperatur.\nOpløse 10% (w/v) saponin pulver i vand for at forberede 10% saponin, alikvot og gemme løsningen på-20 ° C.\nSkyl den godt en gang med 0,5 mL 1 x PBS løsning og tilsæt 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD løsning. Ruger i 20 min. ved stuetemperatur. Skyl godt to gange med 0,5 mL 1 x PBS og to gange med 0,5 mL 100 mM NH4Cl. Skyl godt to gange med 0,5 mL 1 x PBS. Celler kan holdes i 1 x PBS ved 4 ° C natten over i mørke.\nFortyndes 1 µL musen anti-GM130 primære antistof i 500 µL FDB indeholdende 0,1% saponin. Vende låget af 24-godt plade og Anvend 10 µL primære antistof blandingen på låget.\nBrug et par skarpe pincet til at udpakke og overføre glas coverslip på dråbe antistof blanding sikring, celle side er i kontakt med blandingen. Inkuber celler med primær antistof blandingen i 1 time ved stuetemperatur.\nBemærk: Låg med coverslip kan placeres i en fugtig plasticpose i mørke.\nBrug et par skarpe pincet til at udpakke og overføre coverslip at nå med den celle side op og skyl det i 0,5 mL 1 x PBS for tre gange i ≥ 30 min. ryster er unødvendige.\nFortyndes 1 µL far-red fluorophore konjugeret gede anti-mus IgG (sekundær antistof) i 500 µL FDB indeholdende 0,1% saponin.\nVask og rengør omvendt overfladen af låg af 24-godt plade. Anvend 10 µL far-red sekundær antistof blandingen på låget. Gentag trin 1.5.3.2 - 1.5.3.3.\nForberede montering medium ved at blande 1 g glycerol, 2,2 g poly(vinylalkohol) (MW ~ 31.000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) og 8.8 mL H2O. opløses blandingen i en 60 ° C vandbad med lejlighedsvis vortexing. Gemme løsningen på-20 ° C.\nTø montering medium og overføre 10 µL til et glas dias. Overlejre coverslip (celle side ned) på dråbe af montering medium. Inkuber glas dias ved 37 ° C i 30 min eller stuetemperatur i 1 time til at hærde montering medium. Forsegl coverslip med farveløs-neglelak og gemme glas dias ved-20 ° C.\n2. forberedelse af fluorescerende perler for kromatisk-Skift korrektion\nOmhyggeligt placere et stykke af 25 mm No.1.5 glas coverslip på en plastik rack.\nOverførsel rack med coverslip til et 400 mL bægerglas fyldt med 300 mL 1 M NaOH og Læg instrumenterne i ultralydsbad i et badekar sonikator (35 watt) i 15 min. kort skyl rack i et 400 mL bægerglas fyldt med 300 mL deioniseret vand. Overføre rack til et 400 mL bægerglas fyldt med 300 mL 99% ethanol og Læg instrumenterne i ultralydsbad i Bad sonikator i 15 min. kort skyl rack i et 400 mL bægerglas fyldt med 300 mL deioniseret vand.\nGentag trin 2.1.2 to gange mere.\nSkyl rack med coverslip i 300 mL deioniseret vand i et 400 mL bægerglas for 10 min. Gentag trinnet to gange mere. Overføre rack til en 60 ° C-ovn og tørre coverslip for 1 h. butik den tørrede coverslip i et støvfrit petriskål.\nImmobilisering af fluorescerende perler på glas coverslip\nFortyndet 110 nm flerfarvet fluorescerende perler 80-fold i 1 x PBS indeholdende 0,1 µg/µL BSA. Kort vortex tube at sprede perle aggregater. Sprede 60 µL fortyndet perler på renset Φ 25 mm No.1.5 glas coverslip (Se afsnit 2.1) ved hjælp af en pipette tip. Tørre coverslip i en ekssikkator tilsluttet en vakuumpumpe i mørke og montere coverslip til et glas dias i 50 µL montering medium (Se trin 1.5.4.2).\n3. billede erhvervelse\nBemærk: Lys kræver billeder af højt signal / støj-forhold (SNR) for høj præcision center of mass beregning. Billedet kan erhverves af konventionelle mikroskoper såsom laser scanning Konfokal, spinning disk wide-feltet eller Konfokal mikroskop. En wide-felt mikroskop udstyret med plan-apokromatiske mål objektiver og en lav støj billedsensor, såsom en afgift - sammen enhed (CCD) og videnskabelige komplementær metal-oxide semiconductor (sCMOS) kan bruges. Parametre for billedsensoren er justeret for at sikre en lav læse-støj og højt dynamikområde. Mikroskopet skal være udstyret med den optimale konfiguration af fluorescens filtre til grøn, mCherry og far-red fluorophore, og det skal have ubetydelig fluorescens cross-talk. Ideelt, den billedbehandlingssystem opnår en Nyquist samplingfrekvens i x, y og z-aksen, som typisk kræver x, y og z størrelse af en voxel til at være mindre end 100, 100 og 200 nm, henholdsvis. X og y størrelsen af voxel er altid lig og betegnes som pixel_size. Pixel_size kan beregnes ved at dividere kamera sensor størrelsen af systemet forstørrelse.\nBillede multi-farver perler\nBillede multi-farver perler i grøn, rød og far-red kanaler i begyndelsen og slutningen af hver tænkelig session.\nBemærk: Her, billeder blev erhvervet gennem en konventionel wide-felt epi-fluorescens mikroskop (inverteret) udstyret med 100 X NA 1.4 plan-apokromatiske mål, motoriserede stadium, 200 Watt metal-Halogenid lyskilde og 16-bit sCMOS kamera. Bølgelængder for excitation filter (band pass), dichroic spejl (lang pass) og emission filter (band pass) af den grønne kanal filter kube er 465-495, 505 og 515-555 nm; for den røde kanal filter kube er 528-553, 565 og 578-633 nm; og for far-red kanal filter kuben er 590-650, 660 og 663-738 nm. I løbet af erhvervelse, størrelsen af en voxel langs x, er y og z akse 64, 64 og 200 nm, henholdsvis.\nFind en synsfelt med god perle tæthed.\nErhverve 3D billedstakke i grøn, rød og far-red kanaler (kanalG, kanalRasmussen, channelB, henholdsvis). Tage 3 sektioner over og under de bedste brændplanet (7 dele pr. stak). Gemme de tre stakke som tre TIFF-filer.\nBemærk: Eksponeringstid for hver kanal bestemmes empirisk at maksimere den dynamikområde, undgå pixel mætning og minimere photobleaching. Andre parametre, såsom filtre og x, y og z størrelse af voxel, er valgt som beskrevet ovenfor.\nBilledstakke Golgi mini-\nBrug TPST1-EGFP og GalT-mCherry transfekteret og fluorescently mærket (punkt 1.5) dias at finde celler, der udtrykkelig TPST1-EGFP og et lavt eller mellemstort GalT-mCherry. Erhverve 3D billedstakke, som beskrevet i trin 3.1.3.\nErhverve Centre af fluorescerende perler\nImageJ, Åbn et sæt perle billeder bestående af tre TIFF-filer (File > Billede > Åbn).\nGennemsnitlig 3 på hinanden følgende sektioner omkring den bedste fokuseret sektion i kanalRasmussen af billede > stakke > Z projekt. Input sektionsnummer "Start skive" og "Stop skive", og blandt indstillingerne af "projektion type", Vælg "Gennemsnitlige intensitet".\nTegne regioner af interesse (ROIs), der indeholder ingen perler i den billed benytter "Polygon valg". I "Analyze > sæt målinger", tjek kun "Grå middelværdien" og "Standardafvigelse". Derefter køre "Analyze > foranstaltning" at få middelværdi og SD af ROI.\nBeregne baggrund intensiteten som "mean + 6 × SD". Subtraher billedet med de tilsvarende baggrund intensitetsværdierne af "processen > Matematik > Subtraher", inddata den baggrund intensitet værdi svarende til denne kanal.\nGentag trin 4.1.2 og 4.1.4 for kanalG og kanalB billedstakke ved hjælp af den samme start og stop skive og den samme baggrund ROI. Bemærk, at Investeringsafkastet bruges i trin 4.1.3 kan kopieres til kanalG og kanalB billeder.\nFlette de tre baggrund-trukket billeder (billede > farve > Sammenflet kanaler) ved at vælge kanalRasmussen som rød, kanalG som grøn og kanalB som blå. En enkelt sammensat billede bestående af tre kanaler vil være opnået.\nLancere ROI manager (analyser > værktøjer > ROI Manager). Tegne et kvadrat ROI omkring enkelt perler sikrer, at der er kun én perle inden for hver ROI. Tilføje ROI Investeringsafkast Manager ved at trykke på "t" på tastaturet. Gentag denne proces, og Tilføj så mange ROIs som muligt.\nI "Analyze > sæt målinger", tjek kun "Center of mass".\nVælg kanalRasmussen, i ROI Manager, skal du klikke på "Måle" for at få Centre; to kolonner, svarende til x- og y-koordinaten af centre for ROIs vises i vinduet "Resultat". Kopier og indsæt de to kolonner i et regneark.\nGentag trin 4.1.9 for kanalG ogB-kanal.\nArrangere koordinater af centre i et enkelt regneark i følgende rækkefølge: xR, yR, xG, yG, xB, og yB. Gemme regnearket i ".csv" format som "beads.csv". Efterlad ingen mellemrum i filnavnet.\nVælg og måle Golgi mini-stakke\nInstallere to makroer (vedlagt i Supplerende materialer) i ImageJ, "Makro-Golgi ROI inspektion" og "Makro-Output 3 kanaler data" af Plugins > installeret ". Klart ROI manager og resultatet vindue.\nÅbne et sæt af Golgi mini stak billeder bestående af tre TIFF-filer (fil > Billede > Åbn).\nGentag trin 4.1.2 - 4.1.5 og gemme de tre baggrund-trukket billeder til senere brug. Post baggrund SDs for kanalRasmussen, kanalG og kanalB som SDR, SDG og SDB, henholdsvis til senere brug.\nKopiere de tre baggrund-trukket billeder genereret fra trin 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).\nI "processen > billede regnemaskine", først tilføje baggrund-trækkes kanalG at kanaliseref billeder. Tilføje det resulterende billede til baggrunden-trækkes kanalB -billede. At det resulterende billede, i "Image > Adjust > tærskel", skal du vælge "Indstil" indtaste "1" som "Laveste grænse". Efter tryk på "Anvend", er en sort og hvid binært billede ført.\nI "Analyze > analysere partikler", input størrelsesområde for "størrelse (pixel ^ 2)". Input "50-infinity". Check "Omfatter ikke på kanterne" og "Tilføj til Manager". ROIs indeholdende Golgi mini-stakke er nu tilføjet til ROI manager.\nBemærk: Størrelsesområde skal bestemmes empirisk at udelukke lyde, som generelt er små.\nFlette de tre baggrund-trukket billeder (billede > farve > Sammenflet kanaler) fra trin 4.2.3 ved at vælge kanalRasmussen som rød, kanalG som grøn og kanalB som blå. En enkelt sammensat billede bestående af tre kanaler er genereret.\nKør makroen "Makro-Golgi ROI inspektion" ved at vælge "Plugins > makro-Golgi ROI inspektion". I dialogboksen interaktiv Inspicér visuelt hver ROI for at holde eller afvise den. Vælg ROIs, der indeholder et enkelt objekt i alle tre kanaler.\nBemærk: Når du har kørt dette værktøj, afviste ROIs fjernes fra ROI manager.\nKontroller kun "Område", "Grå middelværdien" og "Center of mass" "Analyze > sæt målinger". Erhverve data ved at lancere makro værktøj "Makro-Output 3 kanaler data" (Plugins > makro-Output 3 kanaler data).\nBemærk: Områder, betyde Støtteintensiteter og Centre (x og y) af ROIs i kanalRasmussen, kanalG og kanalB vises i vinduet "Resultat".\nKopi x og y koordinater centre i et regneark og arrangere dem i følgende rækkefølge: xR, yR, xG, yG, xB, og yB. Gemme regnearket som en ".csv" (ministacks.csv). Efterlad ingen mellemrum i filnavnet. Fortsæt til kromatisk-Skift korrektion af Centre (afsnit 4.3) og LQ beregning (afsnit 4.4).\nKromatisk-Skift korrektion af Centre\nInstallere Matlab Compiler Runtime (MCR).\nInstallere fÃ¸lgende filer i en dedikeret arbejdsmappe: my_train.exe og my_test.exe. Kopier og Indsæt "beads.csv" og"ministacks.csv" filer i samme mappe.\nLancere "Command Prompt" af Windows og gå til i orden omslag ved at taste den næste befale " cd path_of_working_folder".\nGenerere en fil, kromatisk-Skift kalibrering ved hjælp af centre for perler. Skrive den næste befale "my_train.exe perler.csv kalibrering.mat 1". En fil med navnet"kalibrering.mat" er skabt i i orden omslag. Ignorere andre filer, der er genereret.\nRette den kromatiske-skift af centre for Golgi mini-stakke ved at skrive følgende kommando "my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv kalibrering.mat 1".\nBemærk: En fil med navnet"corrected_ministacks.csv" er skabt i i orden omslag. Det indeholder kromatisk-Skift korrigeret koordinaterne for centre, som er arrangeret i rækkefølgen af xG, yG, xB og yB. Ignorere andre filer, der er oprettet. Notere, at den røde kanal er defineret som fri for kromatisk aberration og derfor xR og yR er de samme som rå data.\nBeregning af LQs\nLancere data analyse software og kopiere og indsætte, i den nedenstående rækkefølge, mener grå værdier, områder, baggrund SDs fremstillet af trin 4.2.3 (placere dem på række 1) og kromatisk-Skift korrigeret x og y koordinater af Golgi mini-stakke i kanalRasmussen i en regneark som kolonnerne A til E. Ligeledes overføre tilsvarende data for kanalG og kanalB til kolonnerne F til J og K til O, henholdsvis.\nTilføje otte nye kolonner P til W, opkaldt "integreret intensiteten af kanal Rasmussen", "integreret intensiteten af kanal G", "integreret intensiteten af kanal B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) og LQ.\nHøjreklik på toppen af den respektive kolonne og vælg "Sæt kolonneværdier" til at beregne værdier for hver kolonne. For kolonne P, input "Col(A)Col(B)"; for kolonne Q, input "Col(F)Col(G)"; for kolonne F, input "Col(K)Col(L)"; kolonne S, input "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" hvor "pixel_size" er størrelsen af pixel i nm; kolonne T, input "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; kolonne U, input "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; kolonne V, input "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; kolonne W, input "Col (T) / Col (S)".\nFiltrer Golgi mini-stakke af de tre kriterier, der er beskrevet i Introduktion.\nI data analyse software, gå til "regneark > regneark forespørgsel" og vælg kolonne variabler for "If"-testen. Tildel følgende aliaser I1, I2, I3, d1, A og B for kolonner "integreret intensiteten af kanal Rasmussen", "integreret intensiteten af kanal G", "integreret intensiteten af kanal B", d1, ABS(tan a) og ABS (tan b), henholdsvis. I den "hvis betingelsen" boks, indtaste "I1 > =30*cell(1,3) og I2 > =30*cell(1,8) og I3 > =30*cell(1,13) og d1 > = 70 og (A < = 0,3 eller B < = 0,3)".\nVælg "Udpak til nyt regneark", klik på "Anvend". Kolonner A-W af analyzable Golgi mini-stakke er udtrukket til et nyt regneark.\nI det nye regneark, Højreklik på toppen af kolonne W, Vælg "statistikker på kolonne > åben Dialog". Check "N alt", "Mener", "SE betyder", "Histogrammer". Den statistiske analyse af LQs vises derefter.\nDen moderne forskning grade lysmikroskop udstyret med en plan apokromatiske linse, som den, der anvendes i vores laboratorium, viser minimal kromatisk aberration (fig. 2A). Men en omhyggelig undersøgelse af multi-farve fluorescerende perle billede kan afsløre skift af anden farvebilleder af den samme perle (figur 2B). Vi definerer at den røde kanal er fri for kromatisk aberration og derfor Centre af røde Fluorescens er de sande positioner af perler. De relative kromatisk forskydninger af grønne og far-red fluorescens kan være repræsenteret af grønne og blå vektorer med oprindelse fra midten af røde fluorescens (figur 2C). Den kromatiske Skift inden for billedbehandling-flyet er empirisk illustreret ved den grønne og blå vektor for hver perle (figur 2D). For vores mikroskop, kromatisk-Skift er ikke ensartet som både størrelser og retninger af forskydninger ændring ifølge x og y positioner. Den kromatiske-Skift kan betydeligt påvirke nøjagtigheden af lys, som skift af far-red Centre kan være så meget som 50 nm. Derfor skal kromatisk-Skift korrigeres. Når centre for perler er erhvervet, ansætter vi første-ordens polynomium montering til at kalibrere og efterfølgende rette kromatisk forskydninger af Centre. Kromatisk-Skift aberration er væsentligt forbedret med denne tilgang (figur 2 D-G).\nI pattedyrceller er Golgi kompleks samlet på det perinuclear område, som normalt ikke er opløselige i en konventionel optisk mikroskop (fig. 3A). Efter nocodazole behandling for 3 timer, perinuclear Golgi kompleks forsvinder og snesevis af Golgi mini-stakke samle på endoplasmatiske reticulum exit steder over hele cytoplasma (fig. 3B). Store bidder af Golgi membran og aggregerede Golgi mini-stakke er til stede, og de er ikke udvalgt til analyse. Et eksempel billede illustrerer udvælgelse af Golgi mini-stakke er vist i figur 3C. Ved hjælp af værktøjet "Makro-Golgi ROI inspektion", 40 udvalgte Golgi mini-stakke er angivet i figur 3D. Efter anvendelse af de tre kriterier, 21 Golgi mini-stakke var analyzable og valgt for beregningen af LQs af TPST1-EGFP (figur 3D; mærket som "L"), med deres statistikker, vist i figur 3E. I alt 111 analyzable Golgi mini-stakke blev udvalgt fra 12 celler og LQ TPST1-EGFP blev målt til at være 0,76 0,04 (gennemsnit ± SEM; n = 111) (figur 3F). LQ TPST1-EGFP placerer det mellem giantin (LQ = 0,59) og EGFP-Rab6 (LQ = 1,04)7. Det er i nærheden af GS15 (LQ = 0,83) og ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Vi har defineret sub-Golgi regionerne på grundlag af LQs ved at overveje kvalitative lokalisering data fra litteraturen: ERES/ERGIC, <-0.25; cis, 0,00 ± 0,25; mediale, 0,50 ± 0,25; Trans-Golgi, 1,00 ± 0,25 og TGN, 1,25-2,00. LQ TPST1-EGFP tyder derfor sin trans-Golgi lokalisering, som er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse14.\nFigur 1 . Skematiske illustrationer viser variabler, som bruges i beregningen af lys. (A) xz visning af en Golgi mini stak, som har co-axial centers GM130, GalT-mCherry og protein x fluorescens viser Golgi akse, aksial vinkel, dx og d1. Billedet af Golgi mini stack er dens projektion på billedet flyet. (B) xy-visning af en Golgi mini stack med off-axis center af protein x viser vinklen α, vinklen β og projektion aksial afstand dx. A og B er tilpasset fra figur 1E og figur 1F i vores tidligere publikation7, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 2 . Korrektion af den kromatiske-shift. (A) den trefarvet flettede billede af 110 nm multi-farver perler erhvervet af en wide-felt mikroskop. Hver perle udsender grønne, røde, og far-red (kunstigt farvet blåt) fluorescens. Skala bar, 10 µm. (B) forstørret visning af en flettede single-perle billede med en mærkbar kromatisk-shift. Skalere bar, 200 nm. (C) en skematisk diagram viser, at forskydninger af grønne og far-red perle billeder kan være repræsenteret af vektorer fra midten af det røde perle billede (0,0) til Centre green (grøn vektor) og far-red (blå) perle vektorbilleder, henholdsvis. (D, E) Effekten af den kromatiske-Skift korrektion. Inden for det samme billede, grøn og blå vektorer afbildes før og efter skift korrektion. For at visualisere den lille Skift, er omfanget af hver vektor-forstærkede 200-fold. (F, G) Scatter observationsområder viser Centre green (grønne prikker) og far-red (blå prikker) perler før og efter skift korrektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 3 . Et typisk eksempel på lys, her erhverve LQ af TPST1-EGFP. En HeLa celler udtrykker TPST1-EGFP (grøn) og GalT-mCherry (rød) blev farvet for endogene GM130 (blå). (A) A typiske celle. (B, C, D, E) En celle, der er behandlet med nocodazole var afbildet (B). Fra billedet, blev analyzable Golgi mini-stakke valgt som vist i C. Valgte Golgi mini-stakke er mærket af identifikationsnumre. Billeder af disse maskerede Golgi mini-stakke vises nedenfor i D med deres identifikationsnumre. "L" angiver, at Golgi mini stack er gyldig for beregningen af LQ (analyzable Golgi mini stakke). Histogram af LQs af 21 mini-stakke fra cellen er vist i E. (F) Histogram af LQs af 111 mini-stakke fra 12 celler. Værdien vises i histogrammet er gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nSupplerende materialer: Makro-Golgi ROI inspection.ijm, makro-Output 3 kanaler data.ijm, Matlab koder, My_train.exe, My_test.exe og regneark template.opj.\nTidligere, lokalisering af Golgi protein under den lysmikroskopi var hovedsagelig kvantificeres ved graden af korrelation eller overlapning af billedet af proteinet med billedet af en Golgi markør af kendte lokalisering15,16, 17. Den resulterende korrelation eller overlappende koefficient afspejler hvor tæt test proteinet til Golgi markør rumligt. Der er mindst tre forbehold for denne tilgang. Først korrelation eller overlappende koefficient er ikke-lineært, og det betyder ikke direkte fysisk afstand. Andet, graden af korrelation er kritisk afhængige af mikroskopiske-Systems opløsning. Derfor er koefficient mellem to Golgi proteiner ikke en system-uafhængig konstant. Tredje, to Golgi proteiner med samme aksiale lokalisering, men forskellige laterale distribution langs cisternae kan have særskilte koefficienter. Dermed angiver korrelation eller overlappende koefficienten ikke den aksiale lokalisering af en Golgi protein. I en alternativ metode foreslået af Dejgaard mfl., cis, trans-Golgi markører og protein af interesse er triple-mærket i nocodazole behandlet Golgi mini-stakke, svarende til lys. Inden for hver Golgi mini stack, holdninger i de tre maksimale intensitet pixel er erhvervet og den relative placering af test protein beregnes som en afstand forhold18. Deres metode er dog ude af stand til at opnå sub-pixel opløsning, som stærkt begrænser dets anvendelse. I forhold til tidligere kvantitative metoder, lys, der blev selvstændigt udviklet men bærer et lignende koncept som Dejgaard mfl., er i stand til at kvantificere den aksiale lokalisering af en Golgi protein med hidtil uset nøjagtighed og konsistens.\nVi præsenterede protokollen af lys til at erhverve LQ eksogent udtrykt normal god landbrugspraksis-mærkede protein - TPST1-EGFP. LQ endogene protein kan bestemmes, hvis dens antistof er tilgængelige. Afhængigt af arten af det primære antistof, mus eller kanin, så en kanin eller musen anti-GM130 antistof, henholdsvis, kan bruges i triple-mærkning-protokollen. Både kanin og musen anti-GM130 antistoffer for immunofluorescens mærkning er kommercielt tilgængelige. Vi har tidligere vist, at kanin og musen anti-GM130 antistoffer give de samme resultater i lys7. Hvis testen protein er uløseligt rød i fluorescens emission, såsom mCherry fusion, en normal god landbrugspraksis-tagged Golgi markør protein med kendte LQ i kombination med GM130 antistof mærkning kan bruges til triple-label celler og indirekte udlede LQ test protein. Antager markør protein LQ er LQm og afstanden fra centrum af markør protein til, af GM130 dm, LQ test protein x kan beregnes som (dxdm) × LQm. En af de største fordele ved lys i forhold til Super-resolution mikroskopi er, at det let kan anvendes til den levende celle imaging i konventionelle mikroskopiske opsætninger. Vi har prøvet en kombination af tre fluorescens proteiner, normal god landbrugspraksis-Golgin84, mCherry-GM130 og GalT-iRFP670, til dynamisk overvågning LQ af normal god landbrugspraksis-Golgin84 i enkelt Golgi mini-stakke7.\nI lys er den mest tidskrævende trin efter købet analyse, især om udvælgelse af analyzable Golgi mini-stakke. Som Golgi mini-stakke er heterogene i størrelse og molekylære sammensætning19, det er uklart, om fordelingen af LQs (figur 3F) repræsenterer den heterogene arkitektur af Golgi mini-stakke eller usikkerhed for vores beregning af den LQ. Uanset årsagerne fandt vi, at det er vigtigt at have et stort antal analyzable Golgi mini-stakke (n) til at sikre nøjagtigheden af LQ, der er kompromitteret når n er små. Typisk giver data med n ≥ 100 fra flere celler pålidelige LQs. LYS giver derfor, ensemble-gennemsnit lokalisering data, tilsløre individualitet af Golgi mini-stakke. En anden begrænsning af lys er, at det forudsætter, at alle Golgi proteiner har en smal distribution omkring et enkelt center. Nogle Golgi proteiner, såsom COPI underenheder, ARF1 og opløselige N-ethylmaleimide-følsomme faktor vedhæftet fil protein receptor (snarer)20,21, er blevet rapporteret til at distribuere bredt fra cis til trans- Golgi og TGN. Det er formentlig upassende at studere deres Golgi lokalisering af LQ. Som lys i øjeblikket indebærer manuel udvælgelse af Golgi mini-stakke, der er både besværlig og subjektive, vil den fremtidige udvikling af lys være at gennemføre et software-værktøj for at vælge automatisk Golgi mini-stakke med minimal menneskelig indblanding.\nHvad er den rumlige opløsning af lys? Da LQ er et forhold, som er unitless, betyder det ikke en rumlig afstand. Her, forsøger vi at give et meget groft skøn. Den rumlige opløsning af lys kan defineres som den mindste aksial afstand mellem to opløselige Golgi proteiner. Undersøge LQs af forskellige Golgi proteiner7, fandt vi, at SEMs af datasæt med n ≥ 100 vifte omkring 0,03. Forudsat to Golgi proteiner har den samme n = 100 og SEM = 0,03, de to Golgi proteiner har signifikant forskellige lokalisering af t-test (p < 0,05), dvs, opløselige, hvis forskellen mellem deres LQs er ≥ 3 × SEM = 0,09. Fra EM-data, kan vi anslår, at den aksial længde af Golgi mini stack, som også er afstanden fra GM130 til GalT-mCherry i lys, er ~ 300 nm8. Dermed opløsning af lys er anslået til 0,09 × 300 = 30 nm langs Golgi akse. I lys giver en større n generelt mindre SEM, hvilket igen resulterer i højere opløsning.\nDet er formentlig upassende at direkte sammenligne opløsning af lys til at af den immuno-guld EM, da de sidstnævnte teknik ikke direkte giver kvantitative lokalisering data. Svarende til lys, opløsningen af den immuno-guld EM langs Golgi-aksen kan defineres som den mindste afstand mellem to opløselige Golgi markører. For at måle dens opløsning kræver undersøgelse af dual-immuno-guld mærkning af to Golgi proteiner, der er tæt støder op til hinanden langs Golgi akse. Sådan systemisk undersøgelse er sandsynligvis ikke tilgængelig efter vores overbevisning. Som omtalt i indledningen er en af de begrænsende faktorer i den rumlige opløsning af den immuno-guld EM er den store størrelse af antistof kompleks, hvilket gør beslutningen om at være værre end ~ 20 nm. En anden vigtig begrænsende faktor af billedopløsningen er mærkning massefylden af antigen molekyler. Ifølge Nyquist prøveudtagning teori, skal der være mindst to guld partikler pr. opløsning enhed. I de fleste immuno-guld EM undersøgelser, afstande mellem nabo guld partikler ikke < 15 nm på grund af den meget lave mærkning effektivitet; Dette gør det vanskeligt for denne teknik til at opnå en opløsning er mindre end 30 nm. Fra dette synspunkt anslår vi, at løsningen af lys er mindst sammenligneligt med immuno-guld EM.\nLYS er en robust metode, der giver særdeles ensartede resultater. Det er uafhængige af typen af mikroskop bruges. Vi har testet de hele-felt og spinning disk Konfokal mikroskoper gav de samme resultater. LQs af de samme Golgi proteiner erhvervet på forskellige batches af eksperimenter blev også i god aftale med hinanden. En LQ database består af en varieret vifte af Golgi bosiddende proteiner der er genereret for sammenligning og fortolkning. Vi forventer, at mere brug af lys i Fællesskabets forskning vil udvide databasen. Derfor, en mere komplet database kvantitativt beskriver lokaliseringen af et stort antal af Golgi proteiner høj grad vil hjælpe med at forstå organisation og funktion af Golgi kompleks.\nVi vil gerne takke D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Storbritannien) for TPST1-EGFP DNA plasmid, samt Lakshmi Gitte Steen for at hjælpe med softwareoptimering. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Medical Research Council (NMRC-CBRG-007/2012), Undervisningsministeriet (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 og 15/RG132 og AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) til ll


Escort mercedes ældre nøgne kvinder / Tænker ballerup\nEscort mercedes ældre nøgne kvinder\n21.02.2018 Kvist Kristen\nmere end det, siger Morten. Selvom at Morten har været escort i otte år, er der ikke ret mange, der kender til hans sidegeschæft. Og med mit bælte eller slips binder jeg hende, forklarer Morten, der bruger navnet Morten Jerk, når han er escort. Oftest skriver de en e-mail, hvor de kort forklarer, hvem de er, og hvad de efterspørger, siger Morten. Her er der ellers flest nøgne kvinder og kønsorganer, men man kan altså finde Morten Jerk.\nHan har hverken børn eller kæreste, og det har han aldrig haft. Den yngste, der har købt hans ydelser, var omkring 20 år, og den ældste var omkring. Han har svært ved at forklare det, men måske er det selve optakten til samlejet og spændingen imellem ham og kvinden. Han tager styringen ved at pirre dem. Morten vil gerne se pæn ud, når han skal møde de kvinder, der har betalt for at have sex med ham.\nUdover at han gerne tantra massage fredericia escort ikast vil beholde nogle få faste kunder, escort mercedes ældre nøgne kvinder så ved han ikke, hvad han skal bruge sin genvundne tid til. Jeg tænder ikke på det og kan ikke se, hvorfor jeg skulle gøre det. Morten arbejder som escort og besøger hver uge unge, ældre og handicappede kvinder. Han går allerede til hip hop, standarddans og jitterbug. Kvinderne, der kontakter mig, mangler spænding og vil gerne have noget andet, end det de kan støve op i byen. I foråret var jeg sammen med et venindepar i 20erne. En fotograf tog på et tidspunkt nogle billeder af mig, som skulle bruges i en bog. Snostrup tantra massage fredericia escort ikast Billeder Af Penis Handicap Sex Store Modne Kvinder Asian Pussy. Kvinder Har Sex Med Dyr Film Tranebierg Hjertedating Seoghoer Pigen, Unge Nudister Sinnerup Hpv Smitte Se Fisse Lesbisk Chat. Han er ikke typen, der tager en lædermaske på og bruger pisk. Amatør Piger Escort Annoncer østtarp Big Girls Porn Abort Under. Swingerklub Aalborg Klinting Copenhagen Sauna De Bedste Dating Sider Free Live Cams (115) 100, sex oplevelser tasteful porn massage sider ugehoroskop, dansk live sex gratis film sex youporno escort kastrup porno med handling dota hentai netdate sex i hillerød nøgen danske piger free sex videoer. Morten har besluttet, at han ikke tilbyder oralsex, fordi han er sammen med så mange kvinder. Dansk Cam Chat Sex Date Dk Camchatten Tyvse Intim Massage Fyn. I dag har han taget det sorte på sammen med en hvid skjorte, slips, seler og en sort hat i 1950er-stil. Skjelby Escort Diskret I Arhus Auktion Dating Homo Noveller escort mercedes ældre nøgne kvinder tantra massage fredericia escort ikast Sexdating.\nSom stripper tilbød publikum mig en gang imellem penge, hvis jeg havde sex med dem. Morten får nogle gange forespørgsler fra mænd, der vil have sex med ham, men det siger han altid nej til. Det kunne jeg godt finde på at begynde at gøre igen, siger Morten. Jeg kan godt lide den spænding, og at det er mig, der skal bløde hende op, siger Morten og fortsætter: Der er selvfølgelig også gange, hvor det mest er pengene, der trækker. Han har gennem sit arbejde været sammen med singlekvinder, gifte kvinder, handicappede kvinder og venindepar.\nEscort mercedes ældre nøgne kvinder 451\nTantra massage fredericia luxus escort københavn Escort service kopenhagen massage flensburg\nEscort mercedes ældre nøgne kvinder Koncerter i tivoli københavn sexet massage