A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem | Protocol (Translated to Danish)\nHer beskriver vi en protokol, der er en fleksibel, hele vært, high-indhold screeningsværktøj, der kan udnyttes til at studere vært-patogen interaktioner og bruges for drug discovery.\nAntallet af nye stoffer identificeret af traditionelle, in vitro- skærme er aftaget, reducere succes af denne tilgang i søgen efter nye våben til at bekæmpe flere medicinresistens. Dette har ført til den konklusion, at forskere ikke kun behovet for at finde nye lægemidler, men også nødt til at udvikle nye måder at finde dem. Blandt de mest lovende kandidat metoder er hele-organisme, i vivo -undersøgelser, at bruge høj overførselshastighed, fænotypisk readouts og vært der spænder fra Caenorhabditis elegans til Danio rerio. Disse værter har flere stærke fordele, herunder dramatiske nedskæringer i falske positive hits, som forbindelser, der er giftige for værten og/eller biounavailable er typisk faldt i begyndelsesskærmen før dyre følge op.\nHer viser vi, hvordan vores assay er blevet brugt til at afhøre vært variation i de veldokumenterede C. elegans—Pseudomonas aeruginosa flydende drab pathosystem. Vi viser også flere udvidelser af denne gennemarbejdet ud teknik. For eksempel, er vi i stand til at udføre høj overførselshastighed genetiske skærme ved hjælp af RNAi i 24 - eller 96-brønd plade formater til forespørgsel vært faktorer i denne vært-patogen interaktion. Ved hjælp af denne analyse, kan samlede genom skærme være afsluttet i kun et par måneder, der drastisk kan forenkle opgaven med at identificere stoffet mål, potentielt uden brug af besværlige biokemiske rensning tilgange.\nVi rapporterer også her en variation af vores metode, der erstatter de gram-positive bakterie Enterococcus faecalis for gram-negative patogenet P. aeruginosa. Meget som det er tilfældet for P. aeruginosa, er drab af E. faecalis tidsafhængig. I modsætning til tidligere C. elegans—E. faecalis assays, vores assay for E. faecalis ikke kræver preinfection, forbedre dens sikkerhedsprofil og reducere chancerne for kontaminerende væske-håndtering udstyr. Analysen er meget robust, viser ~ 95% dødelighed 96 timer efter infektion.\nIdentifikation og udvikling af effektiv, bredspektret antibiotika, nu næsten et århundrede siden, førte til en skelsættende øjeblik i offentlige sundhed hvor der var en udbredt tro det smitsomme sygdom ville være en svøbe af fortiden. Inden for et par korte årtier begyndte denne optimisme at aftage, som patogen efter patogen udviklet resistensmekanismer, der begrænsede disse engang mirakuløse behandlinger. For nogen tid syntes våbenkapløb mellem drug discovery indsats og patogener afbalanceret. Dog har misbrug af antimikrobielle stoffer for nylig kulminerede i fremkomsten af pan-resistente stammer af Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensog P. aeruginosa1, 2,3,4.\nP. aeruginosa er en opportunistisk, gram negative, multi vært patogen, der er en alvorlig trussel mod patienter med alvorlige forbrændinger, dem, der er immunkompromitterede eller har cystisk fibrose. Det er også i stigende grad identificeret som en udløsende agens i svær nosokomielle infektioner, især på grund af dens igangværende erhvervelse af antimikrobiel resistens. Til at begynde at imødegå denne trussel, har vi brugt de veldokumenterede C. elegans-P. aeruginosa infektion system5. Vores lab har leveraged dette system til at udvikle en væskebaseret, høj overførselshastighed, high-indhold screening platform for at identificere nye forbindelser, der begrænser patogenet evne til at dræbe vært6. Intriguingly, synes disse forbindelser at tilhøre mindst tre generelle kategorier, herunder antimikrobielle stoffer7 og virulens hæmmere8. Andre high-indhold drug discovery assays i C. elegans er blevet rapporteret til Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, og Enterococcus faecalis, blandt andre9,10,11,12,13,14,15,16. Disse typer af assays har flere velkendt fordele, såsom begrænsning af falske positive hits, der kan være giftige for både vært og patogen, øget sandsynlighed for biotilgængelighed i forhold til en kemisk skærm, og evnen til at identificere hits ud over blot begrænse mikrobiel vækst, såsom anti-virulents, immun stimulerende molekyler eller forbindelser, der ellers vipbar balancen i vært-patogen interaktionen til fordel for førstnævnte. Derudover er forbindelser opdaget i disse skærme ofte effektiv i pattedyr værter.\nDet er værd at bemærke, at mindst to andre assays17,18 rådighed til at udføre høj overførselshastighed skærme i C. elegans i væske. Hver af disse assays er imidlertid en ændring, der tillader den prototypiske tarm-kolonisering assay, kendt som sen-drab, der skal udføres i flydende, øge gennemløb og giver forbindelser til at være mere let screenet. Omhyggelig karakterisering har endegyldigt viste, at mekanismerne for bakteriel virulens er forskellige mellem disse assays og vores væske-baseret skærm7. Da begge typer af virulens er observeret i pattedyr systemer, er det vigtigt at overveje, hvilke virulens determinant er mest relevante for eksperimentatorens interesser forud for analysen udvalg.\nHer viser vi en optimeret version af de væskebaseret C. elegans-P. aeruginosa assay. Vi rapporterer også tilpasning af vores væske-baseret analyse metode til at rumme de gram-positive bakteriel patogen Enterococcus faecalis. Ligesom P. aeruginosaidentificeres E. faecalis stadig som en alvorlig nosokomielle trussel med en voksende bevæbning af antimikrobiel resistens veje1. Selv om en tidligere metode for high throughput screening af E. faecalis findes14, kræver det preinfection med det patogen, der komplicerer proceduren og øger sandsynligheden for kontaminerende udstyr som COPAS FlowSort. Vores protokol eliminerer behovet for før inficeringen, forbedre sikkerhedsprofilen. Endelig, vi rapportere et middel, hvormed enten af disse assays kan kombineres med fodring RNAi, tillade bruger hen til ransage for værten faktorer, der spiller en rolle i oprettelsen af, eller resistens over for infektion.\nForsigtig: P. aeruginosa og E. faecalis er biosikkerhedsniveau 2 patogener, og korrekte sikkerhedsforanstaltninger skal træffes til at forhindre utilsigtet infektion og at minimere forurening af overflader. Alle medier og materialer, der kommer i kontakt med patogener skal være steriliseret og/eller kasseres. Yderligere retningslinjer er tilgængelige fra CDC publikation biosikkerhed i mikrobiologiske og biomedicinske laboratorier (BMBL), 5th edition.\n1. forberedelse og vedligeholdelse af P. aeruginosa\nStreak P. aeruginosa fra en frossen bestand på en LB (Lysogeny bouillon) agar plade. Inkuber 16 til 24 timer ved 37 ° C\nBemærk: Udføre P. aeruginosa eksperimenter i en BSL-2 biologiske sikkerhed kabinet at sikre sterilitet. Brug passende sikkerhedsforanstaltninger til at minimere risikoen for patogene smitte eller kontaminering.\nOverføre denne plade til 4 ° C. Denne plade kan opbevares ved 4 ° C og anvendes til podes kulturer i op til en uge. Efter en uge, dekontaminering og kassér pladen og foretage en ny LB streak plade.\nBemærk: P. aeruginosa virulens falder efter længere tids opbevaring.\nTo dage før opsætning af assay plader, podes 3-5 mL sterilt LB bouillon med en enkelt koloni af P. aeruginosa fra pladen lavet i 1.1. Der inkuberes ved 37 ° C i 12 til 16 timer.\nBemærk: Ikke udruge længere end 16 h. I rige flydende kulturer begynder P. aeruginosa PA14 at lyse.\nForberede sterile 10 cm plader med langsom dræbe media (3 g NaCl, 3.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL af fosfat buffer (beløb pr. liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) og 868 mL KH2PO4 (1 M)) og 18 g agar/L).\nBemærk: Forberede plader før tid. De kan opbevares i op til 3 uger i en lufttæt beholder ved 4 ° C.\nFrø hver 10 cm langsom dræbe plade (SK plade) med 350 μl af P. aeruginosa fra Frisk overnight LB kultur. Ved hjælp af en steril bakteriel spreader, sprede bakterier jævnt over hele overfladen af medier og lad tørre i en BSL-2 biologiske sikkerhed kabinet.\nInkuber plader ved 37 ° C i 24 timer.\n2. forberedelse af RNAi bakterier\nStreak ud eller pin-overførsel ønskede stammer af RNAi-holdige bakterier på LB agar plader der indeholder passende antibiotika (carbenicillin på 100 µg/mL) og tetracyklin på 15 µg/mL for Ahringer og Vidal biblioteker fra en frossen bestand.\nBemærk: Når du arbejder med nonpathogenic bakterier, bruge Andersen BSL-2 / B biologiske sikkerhed kabinet eller en BSL-1 laminar flow hætte til at sikre, at steriliteten af kulturer og at minimere risikoen for krydskontaminering af biblioteket.\nInkuber plader i 24 timer ved 37 ° C.\nGemme plader ved 4 ° C i op til to uger.\nEfter to uger, kassere pladerne og erstatte dem med frisklavet plader.\nTeste flere RNAi stammer parallelt ved at individuelt vaccinere en enkelt koloni fra hver klon til 4 mL af carbenicillin-suppleret LB i en enkelt godt af en 24-godt dybt-godt plade eller i en steril reagensglas.\nBemærk: Tetracyklin er blevet rapporteret til at reducere effektiviteten af RNAi. Brug det ikke i dette medie.\nPlacer 24-godt dyb brønd plader i en rystende inkubator optimeret til flerhulsplader og inkuberes ved 37 ° C i 16 h mens ryste på 950 rpm.\nBemærk: Det er svært at opnå ensartet bakterievækst i flerhulsplader ved hjælp af en konventionel ryster inkubator. De ryster inkubator skal være i stand til at ryste som et minimum på 750 rpm for at kulturer til at vokse ordentligt. I mangel af en specialiseret shaker er det muligt at dyrke hver kultur i en individuel tube. Kulturer kan blive overført til den 24-godt plade til centrifugering bagefter, hvis det ønskes.\nIndsamle bakterier ved centrifugering i 5 minutter ved 2.000 x g.\nDekanteres af invertere pladen og ryste voldsomt. Resuspend RNAi bakterier i 100 µL af S Basal (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 opløst i 1 L ultrarent vand og steriliseres ved autoklavering).\nDer afpipetteres resuspenderet bakterier i et passende antal brønde i en multiwell NGM plade (Nematode vækst medier, 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL af fosfat buffer (beløb pr. liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) og 868 mL KH2PO4 (1 M)), og 18 g agar pr. liter vand) suppleret med IPTG (1 mM slutkoncentration) og carbenicillin (100 μg/mL endelige koncentration).\nBruge 3,5 mL af NGM media pr. brønd 6-godt plade, 1 mL pr. brønd af en 24-godt plade eller 150 µL pr. brønd af 96-brønd plade.\nBruge 100 μL/brønd af bakterier til 6-godt plade; 50 μL/brønd for 24-godt; eller 20 μL/brønd til 96-brønd plade. Lad det tørre.\nBemærk: Tørring er normalt udføres i en steril flow hætte til at fremme hurtig og ensartet tørring. Ensartet tørring er meget vigtigt. Undgå over tørring, som revner i agaren fremme gravende af orme. Dette fører til orm tab og potentielle tilstopning af væske-håndtering systemer.\nBruge rede pladerne straks eller gemme dem på 4 ° C i op til to uger til senere brug.\nBemærk: For at forhindre plader fra udtørring, de kan forseglet med plastik paraffin film eller anbringes i en tæt lukket beholder med fugtige papirservietter.\n3. vedligeholdelse og forberedelse af C. elegans\nBemærk: Før du indleder eksperimenter, generere en synkroniseret befolkningen i fælderne, voksen tvekønnede orme som følger.\nVask fælderne voksne (dvs. med flere embryoner synlige inden for gonade) fra 4-6 10-cm NGM plader i en 15 mL konisk slange ved at tilføje 4 mL S Basal plade, hvirvlende forsigtigt, og derefter hælde i en 15 mL konisk slange.\nPellet orme via centrifugering ved 1.000 x g i 30 sekunder.\nAspirat supernatanten, pas på ikke for at forstyrre orm pelleten.\nTilsættes 3,5 mL orm blegemiddel (slutkoncentration 0,5 M NaOH, 1% natriumhypochlorit, i sterilt vand) til orm pellet og mix af invertere i 1 minut.\nKort vortex og centrifugeres ved 1.000 x g i 30 sekunder.\nOpsug eller dekanteres, pas på ikke for at forstyrre orm pelleten.\nTilsættes 3,5 mL frisk orm blegemiddel til orm pellet.\nEnergisk Bland orme i blegemiddelopløsning. Jævnligt (omkring hvert tiende sekund) Inspicér visuelt orme under et dissekere mikroskop. Hold øje med orm neglebånd at bryde, frigive æg. Når de fleste af de voksne orme har været opløst (~ 95%), fortyndes blegemiddel til 15 mL med Basal S at stoppe fordøjelsen.\nBemærk: Æggeskaller er mere modstandsdygtige over for blegemiddel end voksne væv, men de kan opløses under langvarig eksponering. For at undgå æg opløsning, Udsæt ikke æg for at ormen blegemiddelopløsning til længere end 7 minutter. Hvis æggeskaller er alt for beskadiget, vil embryoner dø.\nPellet embryoner på 1.000 x g for 30 sekunder og Opsug eller dekanteres uden at fjerne pellet af embryoner.\nResuspend orme i S basal til en endelige mængden af 15 mL til at fortynde resterende blegemiddelopløsning.\nGentag trinene vask, (3.9-3.10) tre gange mere for i alt 4 træk vasker.\nEfter den fjerde vask, Aspirér supernatanten og tilføje til 5 eller 6 mL sterilt S Basal ind i 15 mL konisk rør. Målet er at resuspend embryoner til en koncentration af ~ 50 orme pr. µL.\nBemærk: Mængden af S Basal afhænger af størrelsen af æg pellet; jo større pellet, mere S Basal er nødvendige.\nInkuber den koniske rør natten på en tabel-top rotator ved stuetemperatur eller 48 h på 15 ° C. Larverne vil udklækkes, men larve udvikling vil anholde på stadiet L1 (L1 diapause) på grund af næringsstof afsavn.\nUndersøge embryoner under en dissekere mikroskop for at kontrollere, at de fleste af dem har udklækket og anholdt på L1-udviklingstrin.\nBestemme optællingen ormen ved at tage 20 µL af ormen prep og fortynde det med 80 µL af S Basal. Tilsæt 10 µL fortyndede orm opløsning direkte på en tom NGM tallerken. Gentag 2 gange mere.\nTælle larver i hver plet og bestemme det gennemsnitlige antal. Opdele dette gennemsnit af 2 at få en omtrentlig optælling af orme pr. µL i orm prep. Ormen preps kan derefter bruges til formering plader eller eksperimenter.\nBemærk: Efter 4-5 dage, udsultet larver vil begynde at dø; Kassér prep på dette punkt.\nFormeringsmateriale fra stammen, pipette et passende antal L1 orme (5.000-6.000) på 3-4 10-cm NGM plader spottet med koncentreret OP50 E. coli- "superfood" (E. coli OP50 spottet på 25 X koncentration (dvs. 1 L af natten OP50 kultur dyrket i LB udbytter 40 mL 25 X OP50 superfood); 2 mL af denne koncentrerede bakteriel suspension er spottet på hver 10 cm NGM tallerken).\nBenyt en af følgende (i "grundlæggende" Brug 3.17.1 protokolopsætningen for "RNAi skærmen oprettet" Brug trin 3.17.2 - 3.17.4 som passende) for at forberede plader til eksperimenter:\nPipette ~ 5.000 orme/10 cm plade seedede med RNAi eller OP50 superfood.\nPipette ~ 500 orme/godt i en 6-godt plade seedede med RNAi.\nPipette ~ 300 orme/godt i en 24-godt plade seedede med RNAi.\nPipette ~ 100 orme/godt i en 96-brønd plade seedede med RNAi.\nBemærk: For instruktioner om, hvordan RNAi var seedet henvises til trinene 2,7-2.9 i forberedelse af RNAi bakterier.\nHvis der bruges en frugtbar stamme af orme Inkuber orme ved 25 ° C til ~ 44-48 h. Brug disse orme så hurtigt som muligt efter at befolkningen har nået en passende alder. Dette minimerer virkningen af æg udrugning inden for ormene under analysen.\nHvis stammen, der bliver brugt er temperatur-steril (f.eks. fer-15(b26); fem-1(hc17) eller glp-4(bn2)), inkuberes orme ved 15 ° C for ~ 16 h og derefter overføre til 25 ° C til 44 h at fuldføre udvikling og forebygge embryogenese.\n4. flydende dræbe Assay opsætning (grundlæggende protokol)\nBemærk: Dette er en protokol til en bakteriel stamme og en kilde til orme.\nBruger en celle skraber, fjerne P. aeruginosa fra en SK plade og resuspend i ~ 5 mL S Basal. Skalere hvis det er nødvendigt. Måling af Ekstinktionen af bakteriel suspensionen ved hjælp af et spektrofotometer (OD600)\nForberede 24 mL fortyndet bestand af P. aeruginosa i S Basal på OD600 ≈ 0,09 (3 X endelige koncentration). Se 4.6.2 for endelige indhold pr. brønd og skalere volumen af bakteriel fortynding i overensstemmelse hermed.\nTilføje 21 mL flydende langsom dræbe media (3 g NaCl, 3.5 g pepton/l suppleret med CaCl2 og MgSO4 til en endelig koncentration på 1 mM). Ved hjælp af en multikanalpipette, overføre 45 µL af bakterier og medier til hver brønd af et 384-godt plade.\nVaske orme fra kilden (dvs.trin 3.17.1) i en 50 mL konisk slange og tillade orme at bilægge under gravitationel kraft. Aspirat supernatanten til 5 mL. Resuspend i alt 50 mL S basal.\nGentag trin 4.4 to gange.\nBruger en worm sorteringsanlæg, sortere ca 22 orme i hver brønd af 384-godt plade.\nBemærk: Opsætning dråber hver orm i ~1.1 µL af væske. 22 orme vil beløbe sig til 25 µL, overbringe samlede assay volumen til 70 µL/brønd.\nDen endelige sammensætning af hver brønd består af 70 µL. 45 µL af denne diskenhed er tilføjet som bakteriel medium (0,03 OD600 bakterier i 24 µL S Basal, og 21 µL SK suppleret med CaCl2 og MgSO4). De andre 25 µL er tilføjet med en af 22.\nHvis sorteringsanlæg bruges her (Se Tabel af materialer) er ikke tilgængelig, orme kan fortyndes til en endelig koncentration på 1 orm/µL i S Basal og pipetted 25 µL/brønd ved hjælp af en multikanalpipette. Dog, resultaterne kan udvise øget variation. Alternativt er det muligt at bruge en peristaltiske flydende dispenser, som beskrevet af Leung og kolleger19.\nEfter orme er blevet sorteret i 384-godt pladen, forsegle pladen med en gas-gennemtrængelige film og inkuberes plader ved 25 ° C i 24-48 timer.\nPå det ønskede tidspunkt, bruge en mikrotiterplade skive for at vaske 384-godt plade med S Basal ialt 5 gange.\nEfter den anden vask, Aspirér de fleste medier, forlader ~ 20 µL. kraftigt ryste plader ved hjælp af en mikrotiterplade vortexer i mindst 30 sekunder til at løsne snavs fra bunden af brøndene).\nEfter den sidste vask, aspirat supernatanten ned til 20 µL. tilsættes 50 µL af 0,98 µM nukleinsyre pletten (Se Tabel af materialer) / godt af 384-godt plade, til en slutkoncentration på 0,7 µM.\nInkuber ved stuetemperatur i 12-16 timer. Dette farvestof vil kun pletter døde orme. Efter den ønskede inkubationstid pletten vask plader ved hjælp af mikrotiterplade vaskemaskinen til at fjerne overskydende (minimum 3 vasker).\nFor dataopsamling, brug et spektrofotometer eller en automatiseret mikroskop til billede både lys og fluorescens (531 nm excitations- og 593).\nBrug en lav forstørrelse mål for at give et billede af hele brønden at blive fanget.\nAlternativt kan du bruge flow vermimetry. Denne teknik bruger et stort objekt flow Flowcytometret som en orm fluorimeter, måling af størrelse og fluorescens af hele organisme (dvs., C. elegans) i en mode, der stærkt ligner flowcytometri.\nBruge automatiserede billede analyse software (såsom CellProfiler, en gratis billede analyse studie baseret på MatLab http://cellprofiler.org/) til at beregne de fluorescerende og samlede orm områder pr. brønd på en saglig måde.\nBemærk: Kvotienten for disse tal repræsenterer brøkdel død til hver brønd. Hvis en godt havde farves 7 orme ud af 20 samlede, så brøkdel død består af 0,35 eller 35%.\nFør første brug, skal automatiseret billedbehandling rørledningen valideres af manuelle scoring. Dette gøres ved at sammenligne resultaterne fra de automatiserede pipeline til score opnået ved visuelt inspicere billeder og optagelse brøkdele af døde orme for hver af dem. Valideringsprocessen sikrer, at parametre for automatiseret billedbehandling forarbejdning er nøjagtige og repræsentere dataene korrekt.\n5. tilpasning til Screening flere C. elegans stammer eller Knockdowns (RNAi skærmen Setup)\nBemærk: Dette er et RNAi skærmen beskrevet for en 24-godt plade setup.\nDer tilsættes 1 mL af S Basal pr. brønd af en 24-godt plade (Se trin 3.17.3). Forsigtigt agitere orme ved at ryste pladen, derefter overføre orme til en tom, sterile 24 deep-godt plade. Tillad orme at bilægge gravitationelt (~ 5 minutter).\nAspirat supernatanten, forlader omkring 1 mL. 7 mL S Basal tilsættes til hvert hul.\nGentag trin 5.1-5.2 et minimum af 2 flere gange. Efter sidste vask, Aspirér supernatanten, forlader ca 400 µL.\nBruger funktionen Resampler af ormen sorteringsanlæg, sortere 22 orme fra 24-godt plade orm suspension i hver brønd af et 384-godt plade (hver brønd af en 24-godt plade udbytter 8-12 brønde i en 384-godt plade).\nFor at undgå sult, afpipetteres bakterier i 384-godt plader (enten en stamme, der tjener udelukkende som mad, såsom OP50, eller en patogene stamme) forud for sortering.\nBemærk: Patogener kan tilføjes følgende trin 2,3-2,5 eller 6,4-6,5 og fødekilde bakterier kan fortyndes og tilføjet ved at følge den samme ordning for P. aeruginosa.\nEfter orme er blevet sorteret i 384-godt pladen, tilføje små molekyler eller andre eksperiment-specifikke materialer.\n6. tilpasning til E. faecalis\nBemærk: Kun forskelle fra P. aeruginosa assay er beskrevet.\nForberede en frisk kilde til E. faecalis af striber bakterier fra en frossen bestand på en BHI (hjernen hjerte Infusion) agar plade og inkubere i 16-24 timer ved 37 ° C.\nBemærk: Udføre E. faecalis eksperimenter i en BSL-2 biologiske sikkerhed kabinet at sikre sterilitet. Brug passende sikkerhedsforanstaltninger til at minimere risikoen for patogene smitte eller kontaminering.\nPladerne kan opbevares ved 4 ° C i op til en uge. Efter denne periode, erstatte med en ny plade.\nAftenen før sortering orme, podes 3-5 mL sterilt BHI med en enkelt koloni af E. faecalis. Inkuber 12-16 timer ved 37 ° C med agitation.\nTilføje bakterier til brønde som for P. aeruginosa (3 x bakterier i S Basal, OD600≈0.09).\nBemærk: For E. faecalis, den endelige godt sammensætning er: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, med den resterende mængde består af S basal. Husk, at 25 µL af S basal vil blive leveret med orme.\nBemærk: E. faecalis producerer tykke biofilm, der absorberer de fluorescerende plet, der forårsager uskarpe billeder. Omfattende vask kan være utilstrækkelige til at fjerne denne biofilm. Orme kan i dette tilfælde overføres til en tom plade ved hjælp af en multikanalpipette. For at lette overførslen, kan Tween 20 føjes til S Basal til en endelig koncentration på 0,1% (v/v) Tween 20 i S Basal. Dette aids i at fjerne orme fra biofilm.\nVigtige parametre for analysen ydeevne\nEn korrekt forståelse af den biologi, der ligger til grund for denne analyse er nødvendig for fejlfinding og optimering af analysen. I forbindelse henviser vi først til flere vigtige papirer belyse mekanismerne i patogenesen af P. aeruginosa-medieret drab i flydende7,20. Forudsat at trinene ovenfor følges (Se figur 1 for en skematisk af assay protokol) observeret en tidsafhængig drab af C. elegans kun ved tilstedeværelse af patogen (figur 2A). I modsætning hertil, i mangel af centrale kosttilskud (f.eks., hvis pepton er udeladt af medierne, og kun S Basal tilføjes), vil lidt at ingen drab observeres (figur 2B). Interessant, er to-trins inkubation af P. aeruginosa (i 24 timer ved 37 ° C, derefter 24 timer ved 25 ° C), som er afgørende for konventionelle langsom-drab assays, og var oprindelig gennemført i flydende drab21, undværes i dette assay ( Figur 2 c). Mens det er muligt at tilføje P. aeruginosa lige fra overnatning LB kultur, gør det væsentligt ændrer dødelighed kinetik og anbefales ikke.\nForståelse assay biologi giver også forenkling af analysen, hvis passende og ønskeligt. For eksempel, den vigtigste drivkraft for vært drab i dette assay er siderophore pyoverdine, og værten toksicitet forårsaget af pyoverdine er betinget af dens evne til at binde jern7. Som sådan, kan analysen forenkles ved at erstatte pyoverdine-rige filtratet, renset pyoverdine eller endda nogle syntetiske jern-chelaterende kemikalier (fx 1,10-phenanthroline) for levende bakterier, som det transkriptionel svar af C. elegans til disse behandlinger er meget lignende (figur 3)22.\nFlere forskellige linjer af beviser tale til robustheden af opsætningen af eksperimenterende. Først, setup tåler en bred vifte af indledende bakteriel koncentrationer. Koncentrationer OD600 = 0.0025 (ca 10-fold lavere end anbefalet) stadig udstille afhængig af tid og koncentration drab, selv om timingen Skift (figur 4A). Andet reproducerbarhed af analysen er det sådan, at så få som 4 brønde er ofte tilstrækkelig til at opnå statistisk signifikante data (figur 4B).\nDer er flere ændringer, som vi ikke anbefale. For eksempel ved hjælp af indledende bakterier inocula med koncentrationer meget højere end dem, der er anført i protokollen; gøre resultatet så tyk, biofilm-lignende materiale, der er vanskeligt eller umuligt at effektivt vaske væk, hvilket komplicerer scoring dødelighed. Desuden kan høj koncentration bakterielle inocula også konkurrere for ilt og udløse uspecifikke vært drab7.\nEn anden betydelig kommentar er at begrænse perioden mellem stoppe analysen og imaging de døde orme. Bemærk, at denne tidsramme skal omfatte farvning, så det er afgørende at være effektiv. Efter død begynder det biologiske materiale inden for orme til ekstrudering og/eller indtages af bakterier. I løbet af 24-32 h forbliver kun hårstrået. Hårstrået pletter meget dårligt og er meget lys, hvilket gør det let at miste under vasker. Det er vigtigt at bemærke, stammer eller stamme/RNAi betingelser med meget forskellige kinetik af drab kan være kompliceret af dette fænomen (dvs. nogle orme kan stadig være i live, mens andre har allerede mistet deres indhold og er umulige at billede). Figur 4A viser dette fænomen, som orme på venstre side af pladen, podes med meget lave indledende bakteriel koncentrationer, er stadig i vid udstrækning i live mens orme på højre side af pladen, der blev udsat for meget højere koncentrationer af bakterier, er blevet vasket væk.\nEn meget vigtig determinant for analysen succes er den metode til at indsamle og analysere data. I vores laboratorium, vi har brugt mindst tre metoder til indsamling af data fra disse assays: spektrofotometri, automatiseret mikroskopi og flow vermimetry (dvs. tilpasning af flow flowcytometri teknikker til C. elegans, bogstaveligt talt, måling af orme i en flydende løsning). Først af disse metoder bruger en spectophotometer til at læse fluorescens dye eller reporter for de pågældende orm. Denne metode har fordelen ved hjælp af en forholdsvis allestedsnærværende stykke udstyr (Spektrofotometer standard med en mikrotiterplade læser) og er den hurtigste metode til at erhverve data. Men det mangler det informative indhold tilgængeligt fra automatiseret mikroskopi og den statistiske effekt af flow vermimetry.\nAutomatiseret mikroskopi er en anden holdbar løsning. En række mikrotiterplade Billeddannende systemer er i øjeblikket på markedet, der spænder i priser, der er overkommelige for en enkelt investigator (f.eks. en Bio-Tek Cytation5) til større og dyrere og bedre maskiner, der er mere almindeligt forekommende i core faciliteter (f.eks. en molekylære enheder ImageXpress mikroskop). I praksis er de fleste af disse løsninger modtagelig for scoring de fleste skærme og assays. Mest automatiseret billedbehandling platforme kan også kobles til downstream-software til billedbehandling (f.eks. MetaMorph, ImageJ, Gene5 eller cellen Profiler) for yderligere at udbyttet af oplysninger. Eksempler på nytten af behandling er vist i figur 5 og figur 6. Når signal-støj-forholdet er højt (som i figur 5), analyse er enkel og diskriminere mellem positive og negative betingelser er trivielt. I disse tilfælde, kan selv svagt hits nemt identificeres. Mange assays, men har en svagere signal / støj-forhold. For eksempel, øger behandling af PINK-1::GFP22 orme (med konstitutiv mCherry udtryk i deres pharynges) med 1,10-phenathroline niveauet af PINK-1::GFP. Til dataanalyse, er inducerbar normal god landbrugspraksis reporter normaliseret til det konstituerende mCherry signal (figur 6). I dette tilfælde reporter har svagere udtryk og/eller er ikke aktiveret i størstedelen af ormene. Derfor kan gennemføre yderligere billedbehandling værktøjer, som cellen Profiler, der kan reducere baggrund og forstærke signalet være fordelagtige.\nEndelig, hvis en COPAS FlowPilot er tilgængelige, det kan bruges til at hente data via flow vermimetry. Meget ligesom de mere velkendte begrebet flowcytometri, kan dette instrument bruges til at måle fluorescens af C. elegans i mindst to eller tre kanaler ad gangen. Denne metode er meget modtagelig for erhvervelse af data med høj Statistisk signifikans, men gennemløb er meget formindsket i forhold til automatiseret mikroskopi. Den mest markante fordel ved flow vermimetry er i evnen til at analysere hele orm befolkninger som en enkelt gruppe for en replikeres i stedet opdele dem i flere brønde og analysere gennemsnittet af brøndene. Analysere store grupper i denne mode dramatisk forbedrer den statistiske effekt og giver mulighed for påvisning af selv små effekter.\nÆndringer af flydende drab analysen\nDen seneste udvikling af analysen har udvidet sin nytte ved herunder boltpistoler aktivering af fluorescerende journalister (figur 6), ved hjælp af medium til høj overførselshastighed RNAi teknikker (figur 3), og selv substitution af oprindelige patogenet.\nDen mest indlysende grund til at bruge RNAi oprettet er at teste for værten forsvar veje mod P. aeruginosa (eller andre patogener). Eksempler på RNAi knockdown af gener, der er relevante for overlevelse i analysen er vist i figur 3. I overensstemmelse med tidligere bemærkninger20,23,24,25, daf-2(RNAi) forbedret C. elegans overlevelse under eksponering til P. aeruginosa, mens daf-16 ( RNAi), zip-2(RNAi) og cebp-1(RNAi) forkortes det. Som bemærket, er RNAi mest blot inkluderet i analysen voksende orme på flerhulsplader hvor hver godt indeholder en anden RNAi klon. Høj viskositet agar og små mængder involveret er det vanskeligt at opnå ensartet, boble-gratis påfyldning af 96-brønd plader uden specialudstyr. Desuden kan tørring bakteriestammer transporterer RNAi også være et problem, som ydre brøndene tørre hurtigere end indre wells, fører til ikke-ensartethed og betydelige potentiale for agar revner. Som nævnt ovenfor, tilskynder den orme til graver, reduktion af antallet af dyr, der er tilgængelige for screening og risici tilstopning væske-håndtering maskiner. For begge disse grunde er 24-godt plader lettere at arbejde med end 96-brønd plader. Selvom dette reducerer assay overførselshastighed, det forbedrer pålidelighed, og foreslås, især for første skærme.\nEndelig, er analysen blevet ændret assay for at erstatte P. aeruginosa med E. faecalis. (I princippet substitution med andre bakteriearter bør ikke give unødig vanskeligheder, forudsat at passende dyrkning og eksponeringsforhold identificeres.) Den vigtigste faktor til at overveje er kravene medier af patogenet, både for vækst og udvikling og til induktion af virulens. For eksempel, kræver Gram positive, opportunistisk patogen E. faecalis næringsrige medier (som BHI) og inkubation ved højere temperaturer i forhold til P. aeruginosa14,26. Ved at tage disse faktorer i betragtning, tilpasning af den assay bruge E. faecalis var ligetil. Som nævnt P. aeruginosa, så vi tidsafhængig drab (figur 7). Interessant, var timingen af død svarende til tidligere offentliggjorte assays, der anvendes før inficeringen agar plader26, trods manglen på dette trin, som kan tyde på, at de mekanismer, der er involveret i patogenesen varierer.\nFigur 1: ordningen for væskebaseret C. elegans – P. aeruginosa infektion assay. Skridt involverer ødelægge formering og forberedelse er på venstre side, bakteriel forberedelse til højre. Skridt involverer begge er centreret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 2: Aflivning af C. elegans af P. aeruginosa er specifikke og kræver ordentlig bakteriel ernæring. (A) C. elegans død E. coli og P. aeruginosa. (B) C. elegans død i overværelse af P. aeruginosa med (højre) og uden (venstre) langsomt dræbe medier tilføjet til mix (dvs., S basal kun). S Basal er en minimal medier og indeholder ikke de næringsstoffer, der kræves for bakteriel vækst og er til hinder for produktion af pyoverdine. (C) C. elegans død i overværelse af forskelligt rede P. aeruginosa. p < 0,01, baseret på Student's t-test. Fejllinjer udgør S.E.M. 10 brønde blev brugt pr. biologiske replikat pr. betingelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 3: C. elegans modstand mod P. aeruginosa afhænger vært immun veje. Et panel af valgte RNAi knockdowns blev behandlet med enten P. aeruginosa (A) eller 1,10-phenanthroline (en kemiske chelator, der efterligner eksponering for P. aeruginosa i væske) (B). p < 0,01, #p < 0,05, baseret på Student's t-test. Fejllinjer udgør S.E.M. 10 brønde blev brugt pr. biologiske replikat pr. betingelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 4: C. elegans drab af P. aeruginosa er robust og afhænger af bakteriel koncentration. (A-B) repræsentative billeder (A) og kvantificering (B) C. elegans død efter eksponering for varierende koncentrationer af P. aeruginosa for 72 h. p-værdier blev beregnet på grundlag af studerendes t -test. Skalalinjen i (A) er 1 mm. 16 wells blev brugt pr. biologiske replikat pr. betingelse. BF: Lyse felt, FL: fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 5: databehandling erhvervelse og billedet af en assay med et stærkt signal. (A) repræsentative billeder af live (negativ kontrol) og døde (positiv kontrol) C. elegans. (B) statistiske analyse af negative og positive kontrol baseret på data erhvervelse metode, tilstand for behandling og antallet af brønde analyseret. (C) Fluorescens blev analyseret for orme fra fire individuelle brønde på en 96-brønd plade (to positive og to negative kontrolhullerne). Hver indeholdt godt ~ 100 orme. Hver prik på grafen repræsenterer en enkelt orm, viser den time of flight, (som korrelerer med, men på grund af coiling af levende orme ufuldkomment repræsenterer størrelse) og den målte fluorescens for orme, der farves med Sytox Orange. Positiv kontrol orme blev præ dræbt af varme eksponering. Ændringer i spænding og form af døde orme (som kan ses i(), den døde orme vises mere stang-lignende og har få kroppen bøjninger) sammenlignet med deres levende modstykker, døde orme har en længere TOF. p-værdier blev beregnet på grundlag af Student's t-test. Skalalinjen i()er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 6: databehandling erhvervelse og billedet af en assay med en moderat signal. (A) repræsentative billeder af C. elegans transporterer en inducerbar PINK-1::GFP reporter og en mCherry konstituerende markør (for at normalisere udtryk af gener fra extrachromosomal array). C. elegans udsat for DMSO (negativ kontrol) eller 1,10-phenanthroline (positiv kontrol). (B) statistiske analyse af negative og positive kontrol baseret på data erhvervelse metode, tilstand for behandling og antallet af brønde analyseret. (C) fire individuelle brønde på en 96-brønd plade (to positive og to negative kontrolhullerne) blev analyseret ved hjælp af flow vermimetry. p-værdier blev beregnet på grundlag af Student's t-test. Skalalinjen i()er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 7: C. elegans drab af E. faecalis er robust og tid afhængige. (A-B) repræsentative billeder (A) og kvantificering (B) C. elegans død efter udsættelse for E. faecalis. p < 0,01, baseret på Student's t-test. 10 brønde blev brugt pr. biologiske replikat pr. betingelse. Fejllinjer udgør S.E.M. skalalinjen i (A) er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nDenne analyse (eller lignende assays hvor andre patogener er stedet for P. aeruginosa eller E. faecalis) er nyttig for en række formål, herunder drug discovery. Det er også nyttigt for grundlæggende biologiske spørgsmål, såsom identificering af virulens faktorer, klarlæggelsen af vært forsvar, og fastlægge den lovgivningsmæssige maskiner involveret i vært-patogen interaktion.\nP. aeruginosa flydende drab assay er robust, er der flere punkter hvor omhyggelig opmærksomhed skal betales til at minimere risikoen for svigt. Først, som bemærket, skal bakteriel kilde plade for P. aeruginosa vaccinationer forblive frisk, lest bakterier mister virulens, trods overnight vækst i LB. For det andet, det er nøglen til at sikre, at calcium og magnesium er føjet til P. aeruginosa dræbe assays. Uden det, vil virulens blive betydeligt kompromitteret. Endelig er det værd at bemærke, at orme opdrættes på HT115 (for RNAi-baserede assays) vil dø væsentligt senere end orme opdrættes på OP50 (N. Kirienko, personlig meddelelse). Af denne grund, hvis skifte til RNAi-baserede undersøgelser, er det vigtigt at empirisk bestemme det bedste tidspunkt for analysen.\nFor at dræbe assays med enten P. aeruginosa eller E. faecalis, er det afgørende at sikre, at der er tilstrækkelig føde for udviklingen af orme fra L1 fase, indtil de er klar til at blive brugt i analysen. Sult, selv på kort sigt, er kendt for at aktivere en række vært forsvar veje, såsom DAF-2/DAF-16 insulin/IGF signalering netværk27. Vores data tyder på, at DAF-16/FOXO aktiveres allerede lidt ved at blive kulturperler i flydende20, og yderligere aktivering er stærkt ønskeligt, da DAF-16/FOXO fremmer bredspektret patogen modstand23.\nEndelig er det afgørende at bruge helt sterile orme i enhver assay, der bygger på dødelighed som en udlæsning. Hvis orme er frugtbar, forårsager der i flydende vanskeligheder i æglægning. Som et resultat, udklækkes nogle af embryonerne inden i den overordnede, i sidste ende forårsager dens død. Derfor bruger vi generelt en genetiske læsion, som glp-4(bn2)28, , viser en helt penetrant sterile fænotype for disse assays. Brugen af kemikalier, der forhindre embryonale udvikling, men stadig tillader æglægning, som 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), bør undgås, da de også kan påvirke med bakteriel vækst og udvikling.\nGenerelt har vi fundet det ganske nyttigt at planlægge flere tidspunkter for analyse. Selvom analysen er robust og timingen er generelt konsekvente, kan stokastiske og umærkelig ændringer flytte timingen af død i analysen inden for 2-4 timer. Når fejlfinding er nødvendig, er det ofte nyttigt at overveje først den enkleste svar; dvs., forberede friske medier, kassere de seneste bakterielle kulturer og re streak bakterielle stammer fra frosne bestande, osv. , kun meget sjældent disse foranstaltninger ikke gendanne analysen til funktionalitet.\nPå grund af den relative enkelhed af metoden, kan der nemt udføres en lang række ændringer. Orme fra en ensartet glp-4(bn2) baggrund for høj overførselshastighed RNAi skærme som dem vi beskrive heri, er nyttigt at ændre til identifikation af host reaktion veje for en bred vifte af fremmedstoffer og giftige kemikalier. For eksempel, tilføjer den samme kemiske eller toksin i hver brønd af RNAi plader (f.eks. Cry5B toksin, phenanthroline, etc.), kan veje, der ændrer følsomheden over for disse toksiner nemt identificeres. Disse typer af skærme kan også bruges til at identificere forsvar netværk mod nogen af vifte af patogener, der inficerer C. elegans.\nForfatterne erklærer, at de har nogen interessekonflikter at videregive.\nDenne undersøgelse blev støttet af kræftforebyggelse og Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation forskning tilskud C-1930, og af de nationale institutter for sundhed K22 AI110552 tildeles NVK. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.


Ting object | Stoner | eReolen\nHusmandssønnen William Stoner fra Missouri, USA, bliver i 1910 sendt på landbrugsskole men vælger litteraturens verden, bliver universitetslærer, og vender ikke senere tilbage til forældrenes gård\nfar-datter forholdet identitet karriere konflikter litteratur mænd universiteter ægteskab\nJesper BøllehuusJens Christian Grøndahl\n10 t., 36 min.\nForlagets beskrivelse af: Stoner af John Williams\n"Stoner" er et fascinerende, velskrevet og rørende portræt af en helt almindelig mand, hvis liv man ikke kan undgå at blive berørt af. Det er en roman om identitet, om livet, om de valg, vi træffer.\nLæserne har endnu en gang delt deres yndlingsbøger med os. Du kan gøre det samme og anbefale din yndlingsbog til efteråret. Eller læse denne uges læseranbefalinger lige her!\nAnmeldelse af: En ganske almindelig mand.\nForstået baglæns, består livet så af andet end en lang række blanke dage, der ikke har efterladt noget varigt aftryk i bevidstheden? Dage, uger, måneder og år der så pludselig bliver afbrudt af en begivenhed, der senere erindres med stor intensensitet.\nAnmeldelse af: Stoner af John Williams\nEt almindeligt liv, men en ualmindelig god bog. Denne velfortalte historie om en mand i Missouri i første halvdel af 1900-tallet er amerikansk litteratur, når det er allerbedst!. Da Stoner første gang så dagens lys i 1965, fik den efter sigende ikke megen opmærksomhed.


TEKST: SUZETTE FROVIN\nFOTO: MIRIAM DALSGAARD, POLFOTO\n”Det er ikke nok at sætte strøm til bøgerne”\nDigitale læremidler er ikke nødvendigvis bedre end traditionelle. Især ikke, hvis de blot øger omfanget af færdighedstræning.\nGode digitale læremidler giver muligheder for at løse opgaver på nye måder, som inddrager og engagerer eleverne i, og dermed styrker, læringen. Sådan ser den digitale virkelighed i folkeskolen langt fra ud endnu.\n”Der er brug for tidssvarende læremidler og undervisningsforløb, som i højere grad ligner den virkelighed, børnene færdes i. Hvis digitale værktøjer skal understøtte bedre læring, er det ikke nok bare at sætte strøm til bøgerne,” siger Jakob Harder, vicedirektør for Digitalisering og Videndeling i Styrelsen for It og Læring.\nDen mest udbredte type digitale læremidler er træningsprogrammer med selvrettende opgaver og formidlende læremidler, der typisk kombinerer tekst, billeder og links. Stort set alle forlagenes digitale fagportaler er ifølge Thomas Illum Hansen formidlingsorienterende, og en del af dem har desuden færdighedstrænende elementer. Der er ikke væsentlige argumenter for, at denne type læremidler fungerer bedre digitalt end på papir.\n”De digitale træningsprogrammer og formidlende læremidler kan let bidrage til at fastholde den tilgang til undervisning og læring, som har været anvendt i skolen de sidste 200 år. Vi træner og tester elevernes færdigheder, men det er tvivlsomt, hvor meget læring der finder sted,” siger Thomas Illum Hansen.\nDet er Katrine Andersen enig i. Hun har som lærer arbejdet med digital læring i mange år og har undervist en række lærere i at integrere digitale løsninger i undervisningen. For tiden er hun ved at færdiggøre en kandidatuddannelse i it-didaktisk design ved Aarhus Universitet.\n”Mange digitale læremidler er utrolig uambitiøse og udnytter slet ikke de muligheder, det webbaserede univers giver. Det er afgørende for elevernes læring, at de er medskabere af deres egen læringsproces. Træningsprogrammerne lægger på ingen måde op til et produktivt, involverende forløb. Tværtimod sidder eleverne bare og klikker på skærmen, indtil de rammer det rigtige svar. Det er der ingen læring i overhovedet,” siger Katrine Andersen.\nLæring skal skabes af eleverne\nAt digitaliseringen af folkeskolen indtil videre i store træk er identisk med træningsprogrammer og formidlende læremidler skyldes ifølge Thomas Illum Hansen, at de understøtter den traditionelle skole, hvor dagen er brudt op i lektioner, og undervisningen foregår i klasser.\n”Desværre er den type undervisning ikke så hensigtsmæssig, hvis vi ser på, hvilke kompetencer eleverne får brug for i fremtiden,” siger han.\nDe stilladserende læremidler fylder langt mindre, selv om netop de bidrager til at give elever nødvendige kompetencer i samarbejde, innovation, digital dannelse og kritisk tænkning. Her inddrages eleven direkte i sin egen læring og arbejder alene eller sammen med andre om at løse komplekse udfordringer. iLitt.dk er et eksempel på stilladserende læremiddel, der giver eleverne på mellemtrinet mulighed for at arbejde med litteratur gennem interaktive opgaver og værktøjer, som støtter og udfordrer elevernes læring undervejs.\nEn anden type stilladserende læremidler er de professionssimulerende forløb, hvor klassen for eksempel omdannes til en avisredaktion, og eleverne fordeler redaktionens roller imellem sig og derefter i fællesskab producerer en avis.\n”De stilladserende læremidler og professionssimulerende forløb er ofte eksemplariske, fordi de udfordrer eleverne, tager udgangspunkt i omverdenen og giver eleverne mulighed for at prøve sig selv af i forskellige roller som en del af læringen,” siger Thomas Illum Hansen.\nEn anden af knasterne i de digitale læremidler er den automatisk generede feedback. Selv om systemerne hurtigt og effektivt kan vise resultatet af for eksempel en diktat, og der er bedre mulighed for at tilpasse og differentiere læringsforløbene, bidrager den digitale feedback ikke til elevernes læring. Forskningen peger på, at det er den uddybende, reflekterende feedback, der for alvor rykker, og den kan eleven kun få, hvis læreren sætter resultaterne i perspektiv og sammen med eleven sætter nye mål for egen læring.\n”Det er et langt sejt træk at udvikle nye typer af materialer, der understøtter en undervisning, som peger ind i det 21. århundrede, men der er heldigvis tegn i den rigtige retning, ” siger Thomas Illum Hansen.\nDigitaliseringen har åbnet for en større og mere fleksibel og mangfoldig samling af tekst, lyd og billeder. Samtidig forsøger stadigt flere producenter at integrere digitale procesværktøjer og intelligente løsninger, der aflaster lærerne og understøtter eleverne. På den måde kan de bedre håndtere den kompleksitet, der kendetegner samarbejde og problemløsning i et fagligt fællesskab, og som giver nye muligheder for brugbar feedback til den enkelte elev.\nBedre til at skrive på bare seks uger\nSkriv og læs er et eksempel på et læremiddel, som kombinerer en særlig pædagogisk, didaktisk tilgang med teknologi. Strategien bag appen er, at eleverne så tidligt som muligt skal i gang med at skrive, og at de skal arbejde med tekster, de selv finder på.\nLæremiddel.dk offentliggjorde i foråret 2016 en effektmåling af Skriv og Læs, som bekræftede svenske resultater. Effektmålingen viste, at de elever i 1. klasse, der brugte Skriv og læs-appen, på bare seks uger blev mere end dobbelt så dygtige til at skrive end de elever, der ikke brugte appen.\n”Metoden gør eleverne til forfattere og motiverer dem til at skrive mere og bedre. Man kan sige, at de lærer at skrive på samme måde, som de lærte at tale. Som voksne giver vi dem positiv og målrettet feedback, så de bliver motiveret til at skrive og lære mere,” forklarede forskningsleder på undersøgelsen Thomas Roed Heiden fra University College Lillebælt i en pressemeddelelse, da undersøgelsen blev offentliggjort.\n• Forhold jer nuanceret til integration af it i skolen. Det er typisk kommunerne, der køber adgang til it-systemerne, så jeres opgave er især at have fokus på, hvordan de digitale tilbud integreres i undervisningen.\n• Skolebestyrelsen godkender undervisningsmidler, så brug skolens værdigrundlag og den undervisningspraksis, der er allerede er, som afsæt for en diskussion om, hvad formålet med den digitale undervisning er.\n• Inddrag skolens fagteamkoordinatorer i vurderingen af de digitale læremidler.\n• Brug lærernes viden fra undervisningen til at forholde jer til, hvad der virker. Hvis lærerne oplever problemer med de digitale læremidler, så støt dem ved at undersøge udfordringerne.\n• Fokuser på uddannelse af og videndeling blandt lærerne, så alle lærere udvikler kompetencer inden for digital læring. Mange skoler har succes med at uddanne front runners, som de andre lærere kan bruge som sparringspartnere i udviklingen af digitale undervisningsforløb.\nKilder: Katrine Andersen, lærer og underviser i digital læring, Jeppe Bundsgaard, professor i it og fagdidaktik ved DPU, Århus Universitet\nEleverne om skærm i undervisningen\nUndersøgelse: Mange børn skal selv have it-udstyr med\nHjælp eleverne til digital dannelse – 7 gode råd til skoler


Lorenzo vandt igen - Ny Moto2 verdensmester - Moto GP\nLorenzo vandt igen\nNy Moto2 verdensmester\n27/10-2013 kl. 21:30\nMotoGP, Japan: Afgørelsen på MotoGP VM må vente til næste og sidste runde, da Lorenzo tog sin 7. sejr i år – en mere end Marquez.\nWeekenden startede lidt kaotisk, da de første træninger blev annulleret pga. dårligt vejr. Det skyldtes ikke kørernes manglende evner til at køre i regnvejr, men en helikopter, der ikke kunne flyve i det vejr, hvorfor de ikke kunne garantere for kørernes sikkerhed, pga. problemer med at bringe dem hurtigt nok til nærmeste hospital, hvis det skulle blive nødvendigt.\nDerfor blev alle træninger slået sammen til én om lørdagen, der varede en halv gang længere, end vanligt. Lorenzo tog pole og var igen også hurtigst i løbet.\nMarquez var tæt på, i midten af løbet, men kørefejl gav Lorenzo luft en gang imellem, og Marquez fik aldrig lukket hullet.\nPedrosa har vundet de seneste 2 år i træk på Motegi, men måtte nøjes med 3. pladsen i år. Rossi var foran Repsol-Honda'erne på et tidspunkt, men seriøse kørefejl sendte ham ned på 11, pladsen. Det lykkedes dog at blive nr. 6 efter Bautista og Bradl.\nSå var der mere fest over Moto2, hvor en ny verdensmester blev kåret denne weekend, nemlig Pol Espargaro. Hans to nærmeste konkurrenter røg ud af løbet efter et massesammenstød på første omgang, så den lå lige til højrebenet for Espargaro, der dog for en sikkerheds skyld lige vandt løbet alligevel, foran Mika Kallio og Tom Luhti.\nI Moto3 var der også drama. På første omgang var Alex Rins lige ved at komme i alvorlige problemer pga. noget karamboulage med et par andre, men meget værre gik det for VM-førende Salom, der blev rykket i sandkassen af Isac Vinales, der slog en saltomortale hen over hovedet på Salom.\nSalom kom op igen, men måtte kapitulere og køre i pit.\nVinales, Rins og Marquez kæmpede derefter i front, indtil Rins lavede en kørefejl, der resulterede i et styrt. Han endte helt nede på 24.pladsen.\nMarquez fik sin første Moto3-sejr ved at slå Vinales med 0.027 sekund.\nStillingen er nu mere tæt, end nogensinde, med de tre førende indenfor 5 points.\n2 Marquez SPA Honda +3.188\n3 Pedrosa SPA Honda +4.592\n4 Bautista SPA Honda +19.755\n5 Bradl GER Honda +22.810\n6 Rossi ITA Yamaha +24.637\n7 Crutchlow GBR Yamaha +27.496\n8 Smith GBR Yamaha +30.969\n9 Hayden USA Ducati +37.010\n10 Dovizioso ITA Ducati +42.944\n2 Kallio FIN +1.344\n3 Luthi SWI +3.379\n4 Simeon BEL +8.420\n5 Simon SPA +10.315\n6 Terol SPA +11.364\n7 De Angelis RSM +12.718\n8 Aegerter SWI +15.609\n9 Nakagami JPN +18.414\n10 Pasini ITA 20.679\n1 Marquez SPA KTM\n2 Vinales SPA KTM +0.027\n3 Folger GER KTM +7.750\n4 Oliveira POR Mahindra +15.889\n5 Fenati ITA Honda +18.323\n6 Miller AUS Honda +18.432\n7 McPhee GBR Honda 18.439\n8 Ajo FIN KTM +25.608\n9 Antonelli ITA Honda 25.950\n10 Binder RSA Honda +32.933\n1 Marquez SPA Honda 318\n2 Lorenzo SPA Yamaha 305\n3 Pedrosa SPA Honda 280\n4 Rossi ITA Yamaha 224\n5 Crutchlow GBR Yamaha 188\n6 Bautista SPA Honda 160\n7 Bradl GER Honda 146\n8 Dovizioso ITA Ducati 133\n9 Hayden USA Ducati 118\n10 Smith GBR Yamaha 107\n1 Espargaro SPA 265\n2 Redding GBR 224\n3 Rabat SPA 204\n4 Kallio FIN 185\n6 Luthi SWI 146\n7 Nakagami JPN 145\n8 Terol SPA 125\n9 Zarco FRA 123\n10 Torres SPA 106\n1 Salom SPA KTM 300\n2 Vinales SPA KTM 298\n3 Rins SPA KTM 295\n4 Marquez SPA KTM 200\n5 Folger GER KTM 163\n6 Oliveira POR Mahindra 144\n7 Miller AUS Honda 110\n8 Masbou FRA Honda 84\n9 Vasquez SPA Mahindra 71\n10 Kornfeil CZE KTM 68


Køb Mom God Save The Gin hos Drinks&Co\nMom God Save The Gin (131,20kr), en gin London Gin fra destilerier González Byass destilleret i England og mængden af alkohol er 39,5 °. Drinks&Co samfund validerer Mom God Save The Gin med 4,2 5 poeng.\nTeknisk fil · Mom God Save The Gin\nHvis du kunne lide Mom God Save The Gin , kan du også nyde ...\nMom, God Save The Gin er en meget cool, nice, blød og aromatisk Premium gin.\nDens spændende personlighed er resultatet af infusionarla med røde bær efter fire destillationer.\nHans unikke blødhed, pulserende smag af bær og blødt finish opnået efter en omhyggelig proces.\nProduktionsdetaljer: Premium Gin, destilleret med forskellige udvalgte botaniske. Lavet med røde frugter og eksotiske botaniske at få sin blide natur.\nKøbe Destillater González Byass:\nFremhævet anmeldelse om Mom God Save The Gin\nMom God Save The Gin er en præmie gin lavet med røde frugter og eksotiske botaniske for sin glatte karakter. Dens spændende personlighed er resultatet af infusionarla med røde bær efter fire destillationer. Dens unikke blødhed, pulserende røde frugter smag og glat finish, der opnås efter en...\nFlere anmeldelser af Mom God Save The Gin\n- MOM, Dronningen af Gins, blev oprettet med det formål at bryde stereotyper. Glat men karakteristisk, aristokratisk og plebejer, elegant og oprørsk. Dens design, sort og magenta, har til formål...\nUdgivet 03/06/16 til07.58\nPakning meget godt produkt er fremragende\nUdgivet 15/11/15 til03.19\nSmukke gin. Perfekt afbalanceret. Smager fantastisk med frosne strawberrys\n- smagsnoter: I munden omfatter citrus toner. I lugten er mere komplekse og blomster toner og røde frugter som jordbær og bær er værdsat.\n- DETALJER OM FORBEREDELSE: Geneve Premium lavet med røde...\nUdgivet 03/01/17 til05.15\nEn præmie gin lavet med eksotiske botaniske og bær til et strejf af blødhed infusionadatras fire destillationer at opnå en renhed og utrolig klasse. Produceret og aftappet i Storbritannien for at...\nUdgivet 17/12/15 til05.02\nGlem titler. Royalty er en holdning.\nGin med en blød, fløjlsagtig karakter og levende smag.\nEksotiske botaniske infunderes med røde frugter efter fire destillationer.\nSåledes er født MOM, dronning...\nUdgivet 06/11/15 til04.41\nBlød og sofistikeret gin. Eksotiske aroma med blomster og røde frugter smag.\nUdgivet 22/10/15 til04.41\nMor er en Premium gin fremstillet alkohol 39.5º Inglaterra.Mom er en Premium gin lavet med bær og eksotiske botaniske der materialisere i en yderst skånsom karakter. Hans spændende personlighed er...\nLæs flere anmeldelser af Mom God Save The Gin »\nDu kan også købe Mom God Save The Gin ...\nSøgninger relateret til Mom God Save The Gin\nHvis du ønsker at købe Mom God Save The Gin, om Drinks&Co finde de bedste priser på Gin González Byass.\tTage den med til den bedste pris på Drinks&Co på den nemmeste måde og med alle garantier. Derudover, har vi en katalog med mere end 59.000 produkter til salg, det dom gør os til de førende selgere af vin, destillater og øl i Europa det er mere end 38.000 personer som har handlet hos os


Kokholm 37 – et besøg i Harboøre | Marianne Hesselholts Blog\n5 thoughts on “Kokholm 37 – et besøg i Harboøre”\nChristian, januar 18, 2021 kl. 1:59 pm skriver:\nJeg gik fornylig igang med lidt slægtsforskning efter en pause på små 10 år. Jeg er pt i gang med min mors side. Hun selv kommer fra Hjørring/Brønderslev, men er på sin mors side (min mormor) ud af fiskerslægt fra Harboøre egnen. Mine forfædre (på min mormors mors side) bærer navne som Rønn, Lilleøre, Knak, Kokholm, Stausholm, Hasseris, Hau/Haf, Klit og Gade. Jeg hedder selv Rønn til mellemnavn. Navnet har jeg fra min mor, der har det fra sin mor. Min tipoldefar er Mads Knak Pedersen Rønn (1862-1937), som du har på dit foto mellem de to andre herrer på denne side. Det findes også her //arkiv.dk/vis/2545069.\nTil gengæld tror jeg ikke, at det er Mads Kokholm med kone på det andet foto. Derimod ligner fruen ganske meget min tipoldemor, Else Kristine (Stine) Nielsen (1869- starten af 1940’erne), som jeg har close up foto af og som kan findes på andre fotos på bl.a. //arkiv.dk/vis/2544212. Og det betyder så, at herren ved siden af ingen ringere end (en yngre udgave af) min tipoldefar Mads Knak Pedersen Rønn, som jeg også har close up fotos af. Der er flere fotos af familien på arkiv.dk\nStines far hed Christen Kokholm Nielsen (ca. 1842 – x) og moren Ane Marie Christensen (Christensdatter) Stausholm (ca 1836 – x). Det passer jo meget godt med, at den Christen Kokholm, du har på fotoet er enten Stines 4 år yngre bror eller en nevø. Den anden kunne meget vel være en Kresten Knak, som dermed er en fætter e.l. til Mads Knak Pedersen Rønn på mødrene side. Se link her //arkiv.dk/vis/2545099). Omvendt synes jeg faktisk, at aldersforskellen er ret stor på Mads KPR og de to andre. Mon herren til højre er Mads KPRs søn, Kristen Kokholm Pedersen Røn(n), født ca 1892? Det passer vist meget godt med tøjstilen (1920’erne..). Anyway, det er i hvert fald min tipoldefar i midten 🙂\nMads Knak Pedersen Rønn’s forældre er Peder Pedersen Rønn (1828-1885) og Marie Kathrine Madsen (Madsdatter) Knak. På dette foto //arkiv.dk/vis/2544402 er det også Mads og Stine med med deres børn og min oldemor som nr 2 fh bagerst. Jeg kan huske min oldemor fra min barndom som en sød og humorfyldt “Besse”, mens min mor husker sin oldemor (Stine), som en noget stiv – og meget religiøs – dame. Hun smiler heller ikke meget på de fotos, der er af hende…\nOg det bringer mig til mit sidste input. Jeg tror, at den Christen Kokholm Nielsen, som du har et foto som soldat af er Stines far, ikke hendes broder/fætter. Det passer også med tidsbilledet. Den yngre Christen vil ikke have båret en sådan uniform, da den passer bedre til 1860-1870’erne. Dér var han alt for ung, født ca 1873. Ergo tror jeg, at du har fundet et foto af min tiptipoldefar Christen Kokholm Nielsen som ung soldat 🙂\nJeg håber, at du kan bruge mit input til noget. Skulle du falde over flere Knakker, Kokholmer etc så sig endelig til.\nChristian, januar 20, 2021 kl. 8:36 am skriver:\nIgnorer venligst dette indlæg. Jeg blev klogere siden. Det nyeste er rigtigt 🙂\nmarianne, marts 6, 2021 kl. 10:06 pm skriver:\nTusind tak for dit lange og meget indholdrige svar på mine blogindlæg, som rigtignok ikke er særlig “sikre” – nu kom i al fald en hel del på plads. Det er jeg glad for. Selv om jeg jo så har en “forkert” Christen Kokholm med i min bog – det gør så ikke voldsomt meget, da bogen er og bliver en roman, og jeg har aldrig (sådan som du) været en habil og grundig slægtsforsker. Jeg synes, det er et interessant forskningsfelt, men det har jeg slet ikke tålmodighed til. Du må undskylde, at jeg først svarer dig nu, men jeg er så hjemme i bloggens finesser og havde faktisk ikke set din kommentar før nu. Som tak vil jeg gerne sende dig romanen, som udkommer til maj. Vil du ikke sende mig din adresse til min mail?\nChristian, januar 20, 2021 kl. 8:34 am skriver:\nJeg gik fornylig igang med lidt slægtsforskning efter en pause på små 10 år. Jeg er pt i gang med min mors side. Hun selv kommer fra Hjørring/Brønderslev, men er på sin mors side (min mormor) ud af fiskerslægt fra Harboøre egnen. Mine forfædre (på min mormors mors side) bærer navne som Rønn, Lilleøre, Knak, Kokholm, Stausholm, Hasseris, Hau/Haf, Klit og Gade. Jeg hedder selv Rønn til mellemnavn. Navnet har jeg fra min mor, der har det fra sin mor. Min tipoldefar er Mads Knak Pedersen Rønn (1862-1937), som du har på dit foto mellem de to andre herrer på denne side. Jeg selv har også en kopi af fotoet. Det findes også her //arkiv.dk/vis/2545069. Jeg har et par korrektioner og information til dine fotos og historie, som du måske kan bruge.\nDe to herrer til henh venstre og højre for Mads Knak Pedersen Røn, er hans sønner. Til venstre er det ganske rigtigt Kristen Kokholm, men hans fulde navn er Kristen Kokholm Pedersen Røn, f. 16/11 1895. Den anden er Kristen Pedersen Røn, f. 19/12 1901 (ja de to brødre hedder begge Kristen, eller Christen/Kresten alt efter temperament). Alle er altså Røn’er (her med kun et n). Den ældste bærer mellemnavnet Kokholm fra sin mors side (se nedenfor). Der var en tredie bror, Peder Pedersen Røn, f.5/5 1897, som er opkaldt efter sin farfar. Der var også tre piger i ægteskabet mellem Mads KPR og Else Kristine f. Kokholm Nielsen, hvoraf en af dem er min oldemor, Ane Marie Pedersen Røn(n), f. 7/3 1893. Min mor husker alle børnene, også de to herrer, der flankerer Mads Knak Pedersen Røn(n). Faktisk lever hans datter endnu. Hun er min mormors kusine, som dog er på alder med min mor (midt 80’erne).\nDu har ganske ret i, at Knak’erne (eller Røn’erne nok mere præcist) var gode handelsfolk. Min tipoldefar, Mads KPR voksede derimod op meget fattig (familien var under familieforsøgelse, da Mads var dreng, men det lykkedes ham at arbejde sig op til at være en ganske holden mand. Sammen med sønnen Kristen Kokholm PR er de nr 3 og 4 på listen over de højest betalende skatteydere i Harboøre sogn (FT 1916)\nVedrørende det nederste foto tror jeg ikke, at det er (en) Mads Kokholm med kone. Faktisk ligner fruen ganske meget min tipoldemor, Else Kristine (Stine) Kokholm Nielsen (4/10 1868 -> starten af 1940’erne), som jeg har close up foto af og som kan findes på andre fotos på bl.a. //arkiv.dk/vis/2544212. Og det betyder så, at herren ved siden af må være ingen ringere end (en yngre udgave af) min tipoldefar Mads Knak Pedersen Røn, som jeg også har close up fotos af. Jeg ligger inde med flere fotos af Mads og Stine, – med og uden børn/børnebørn. På dette foto //arkiv.dk/vis/2544402 er det også Mads og Stine med med deres børn og min oldemor som nr 2 fh bagerst.\nJeg kan huske min oldemor fra min barndom som en sød og humorfyldt “Besse”, mens min mor husker sin oldemor (Stine), som en noget stiv – og meget religiøs – dame. Hun smiler heller ikke meget på de fotos, der er af hende… Men det var jo nok heller ikke et let liv.\nStines far hed Christen Kokholm Nielsen (6/1. 1842 – d. efter 1921) og moren Ane Marie Christensen Stausholm (ca 1836 – efter 1890/før 1906). Christen (kaldet Kræn) var murerarbejdsmand. Jeg har et par slidte fotos af hver af dem. Mangler stadig at få dem scannet ind. Og det bringer mig så til mit sidste input. Jeg tror, at den Christen Kokholm Nielsen, som du har et foto som soldat af er Stines far, ikke hendes broder/fætter. Det passer også med tidsbilledet. Ergo tror jeg, at du har fundet et foto af min tiptipoldefar Christen Kokholm Nielsen som ung soldat :-). Om det var 2. slesvigske krig er ikke godt at vide, men han var jo 22 år i 1864.\nJeg har faktisk også et meget godt foto af Elisabeth Kokholm (gift Kokholm), som sammen med en Christen Kokholm startede Kokholm hotel ved Skagen. Jeg tror, at den Christen er en fætter til min tipoldemor. Hvorfor skulle min familie ellers ligge inde med et foto af Elisabeth Kokholm. Det må lidt mere gravearbejde kunne afdække….\nJeg håber, at du kan bruge mit input til noget. Skulle du falde over flere Rønn’er, Knakker, Kokholmer etc så sig endelig til.\nChristian, maj 27, 2021 kl. 2:33 pm skriver:\nNu er det mig, der hænger i bremsen, beklager. Jeg havde slet ikke set, at du havde svaret mig. Beklager at ovenstående indlæg kom ad to omgange, men jeg blev lidt klogere efter det første – og det er jeg så også blevet siden da 🙂\nJeg har i mellemtiden læst en anmeldelse af din roman, og jeg vil da meget gerne modtage et eksemplar. Min adresse er; Drejerbakken 7, Langtved, 4070 Kirke Hyllinge.\nJeg læser helst faglitteratur og når det er skønlitteratur, må det meget gerne tage afsæt i virkelige personer/begivenheder. Så din romans emne falder fint i min smag 🙂\nJeg kan så oplyse, at jeg i mellemtiden er blevet noget klogere på min slægt fra Harboøre ved at tale med min mormors kusine, som er samme alder som min mor (85 år). Her har jeg fået bekræftet, at fotoet med de tre herrer er; Kresten Kokholm Pedersen Rønn (ældste søn), Mads Knak Pedersen Rønn (far – kaldet “Mads Knak”) og Christian Pedersen Rønn (yngste søn), – som jeg godt kan huske fra jeg var lille dreng.\nJeg var også en tur i Harbøre (Vrist og Vejlby) for et par måneder siden for at se, om jeg kunne finde Mads KPR og Stines hjem. Det er nu omgivet af sommerhuse, og jeg fandt det ikke, men det skulle dog ligge der jf min mor og min mormors kusine. Huset blev bygget omkring århundredeskiftet af svigerfar, murermester Kresten “Kræn” Kokholm Nielsen. Dele af huset blev lejet ud og blev brugt som en slags kunstnerkoloni. Min mormors kusine har et par malerier malet af et københavnsk kunsterpar. Måske derfra ideen til hotellet i Kandestederne kom fra – eller omvendt?\nMin tipoldeforældre brød med den indremissionske kirke efter den forfærdelige drukneulykke i 1897, hvor en bror druknede – og de ikke helt så religiøse (!) blev lagt nederst i massegraven. Det var “sorte” pastor Moe, der herskede i Harboøre på det tidspunkt. Jeg har flere forfædre, der led druknedøden “ude på havet”. Det er da godt, at de nåede at få børn først… 😉\nJeg slægtsforsker alene, fordi jeg gerne vil have tingene på plads. Der dukker spændende ting og sager op i forbindelse med en sådan slægtsforskning – og tanken om selv at skrive en fiktiv roman er mig slet ikke fremmede… Jeg er sikker på, at der er mange – fiktive / delvis-fiktive – historier at fortælle om samfundet i Harboøre. Men det bliver når jeg får mere tid.\nNå, nu blev jeg grebet af historien igen. Beklager igen sen respons. Ser frem til at læse din bog.


Forside Nyheder Lucas Bjerregaard har sat modstanderne\nDet er jo helt vildt! Lucas bjerregaard lavede copy/paste af åbningsdagens score, og kom således også ind i -6 på anden-dagen, af BMW MASTERS, der spilles i Shanghai.\nLucas Bjerregaard fører an i Kina\nSergio Garcia der sad på tronen inden dagens tee-off blev henvist til en andenplads. Sergio har nu hele 3 slag op til Danmarks Lucas Bjerregaard, der nu ligger solidt i front, og næppe smider det helt store væk med den form han viser for tiden.\nSergio Garcia deler andenpladsen i -9 med Jaidee fra Thailand, og der er desværre lidt ned til nærmeste danske spiller. Men helt galt er det heldigvis ikke. For Søren Kjeldsen er på den delt 12. plads i -5, efter at have gået anden runde i 5 under, og gå 36 pladser fremad.\nThorbjørn Olesen gik også frem, og er nu i +2 på en delt 61. plads, uden de store håb. Men Lucas og Søren kan altså begge nå at få en interessant bid af kagen, der lyder på hele $ 7.000.000 i samlet præmiesum.\nDU KAN SE NÆRMERE PÅ LUCAS BJERREGAARD´s SVING HER\n30 oktober 2015 20:35\nLucas Bjerregaard har 7 trin til toppen\nI Europas og nok også et af verdens bedste golf-paradis, spilles der denne uge Turkish Airlines Ope


Rob Bells nye bog Love Wins, giver ikke nogen svar.\nSå skete det, efter at have været ved at glide ud i glemsonheden vælger Rob Bell at komme med en bog som bare endnu mere klart end før viser at han er en vranglærer. Og det i sådan en grad at selv de sekulære medier i USA, kan se at det er tilfældet. Bogen Love Wins er nemlig blevet vurderet som universalisme. Alligevel ligger den højt på Amazons hitliste, ja folk vælger jo deres egne vranglærere, og nogen vil bare hellere have løgnen end de vil have sandheden. Rob Bell har efter bogen udkom, givet interview til flere medier. Men dette interwiew med den velkendte journalist Martin Bashir, blev han godt nok taget på sengen (ja underligt udtryk, jeg ved det godt). Rob Bell havde åbenbart forventet at få lov til at lovprise hans nyeste bog, men Bashir stiller ham de spørgsmål som Rob Bell igennem flere år har forsøgt at undlade at svare på. Han bryder sig vist ikke om at give et klart svar, for så finde man jo ud af hvad han står for. Men se selv videoen igennem og se hvorledes en dygtig journalist viser at Rob Bell ikke har noget som helst fornuftigt at give. Kun spørgsmål, som ikke giver nogen svar. Underligt at en mand der siger han prædiker Guds ord, ikke har fundet klare svar i bibelen, når de nu står så klart deri.\nHvis du ønsker at høre et interview med journalisten Martin Bashir om hans møde med Rob Bell, kan den høres her: http://www.godandculture.com/blog/msnbcs-martin-bashir-on-the-paul-edwards-program\nI det interview går han ned i Rob Bells bog og viser hvorledes Bell manipulerer med sandheden og fordrejer folks udsagt til at passe til sit eget verdenssyn. Du kan også høre hvorfor Bashir mener at der overhovedet er et marked for bøger uden klare svar er blevet så populære i vore dage, selv i kirken. Et interview som virkelig er værd at bruge en halv time på.\n7 Responses to “Rob Bells nye bog Love Wins, giver ikke nogen svar.”\nIntet menneske kan gøre sig ekslusiv og moralsk på Guds vegne, når det gælder GUDS kærlighed. Kærlighed som vi syndere kender den er ikke guddommelig agape kærlighed – kun stykkevis i sin opfattelse.\nIngen præst kan tage en synder ind til sig og trøstende love ham, at han sagtens kan komme ind i Guds rige uden at iføre sig rene hvide klæder.\nI lignelsen om kongesønnens bryllup blev én udelukket fra bryllupsfesten, fordi han stillede i egne snavsede klæder.\nVi er mange på denne jord, som kan kalde os ofre på det ene eller det andet grundlag – men KUN som en synder, angrende og med et oprigtigt ønske om at fatte et andet sind, kan vi gå ind ad den dør som hedder Jesus kristus.\nRob Bell siger: Vi genfinder kristendommen som en Østens religion\nDet er et citat fra bogen af Anders Ova, Den sidste profeti.\nNår Rob Bell sige således så synes jeg det fortæller alt\nRet lavt journalistik, Rob får jo ikke lov at sige noget som helst…\nRob Bell har altid givet mig hovedpine, men er godt tilfreds med den måde, som journalisten griber sagen an på. Man fornemmer jo næsten, at journalisten er en Kristen broder, for man kan tydeligt fornemme hans harme over Bell’s vranglære og blasfemi af det eneste sande evangelium.\nMan ser virkeligt her at Bell er en ulv, som har smidt sine fåreklæder, og at han er universalist… Og som jeg altid har sagt, alt der begynder med “uni” skal man holde sig fra… Guds freds.\nSikke noget vrøvl Morten. Rob Bell får da masser af mulighed for at sige noget. Men han viser jo bare at han ikke vil, eller ikke kan svare tilfredsstillende på ellers ret enkle spørgsmål. Du burde tage og høre interviewet med Bashir som jeg linkede til.\nDesuden siger Rob Bell det han plejer at sige, hvilket er en omgang liberalteologisk postmodernistisk semifilosofi som ikke hænger sammen alligevel..\nHvis Rob Bell føler sig misforstået, kan han jo korrigere.\nPå en måde forstår jeg Rob Bell, for når man ikke ser helheden er det ikke rart at tænke på at alle ikke kommer i himmelen.


Smart Opel Corsa-e ikke billig elbil. Læs testen her | FDM\nL:406 cm B:174 cm H:143 cm\nMålt rækkevidde 180 km\nTyske Opel er blevet en del af franske PSA (Peugeot og Citroën), og det kan nu ses i Opels modelprogram, der i stigende grad er baseret på den franske bilkoncerns modeller og teknik. Det gælder ikke mindst for Opel Corsa, der nu er bygget over Peugeot 208, og som helt og holdent anvender fransk teknik.\nDet er ikke noget dårligt udgangspunkt, for netop 208 opnåede sidste år at blive kåret til årets bil i Europa 2020. Ligesom 208 bygges Corsa i udgaver med benzin-, diesel- eller elmotor.\nVi har her testet elversionen, og den er rigtig interessant i en tid, hvor flere bilkøbere tænker i den retning. Men det er ikke et valg, der økonomisk set er lige til højrebenet. For selvom der ikke er registreringsafgift på elbiler i denne prisklasse, er elbilen fortsat ret dyr.\nNår man sidder bag rattet, føler man, at man sidder i en Opel, selvom bilen er bygget over en Peugeot 208. Der er et stort rat, et digitalt instrumenthus samt en flot integreret skærm til navigationsanlægget.\nEr Opel Corsa-e dyr eller billig?\nSammenligner man denne testede udgave med den dyreste benzinversion med automatgear og et tilsvarende højt udstyrsniveau, er elbilen stadig 65.000 kr. dyrere i anskaffelse. Og ser man blot på billigste benzinversion og sammenligner med billigste elbil, er prisforskellen hele 95.000 kr.\nDer skal derfor en del flere penge op af lommen, hvis man vil køre i en elbil fra Opel. Heldigvis kan den elektriske udgave lokke med lavere løbende udgifter, men for denne testede udgave af Opel Corsa-e er prisforskellen stadig så stor, at man ikke kan hente merprisen ind i sparede omkostninger undervejs.\nMan kommer dog tæt på, hvis man ser på den samlede økonomi over fem år. Over en så lang periode er fordelen ved benzinbilen skrumpet til blot ca. 1.000 kr. om året, og så er elbilen ikke en helt umulig investering.\nSkærmen er trykfølsom og viser bl.a. navigation, radio, Apple CarPlay og telefon. Klimaanlægget styres fra knapper længst nede, og det fungerer godt.\nHvor lang er rækkevidden på Opel Corsa-e?\nOpel Corsa-e har et batteri på 50 kWh, der er placeret under dels bagsædet, dels en del af vognbunden. Dermed skaber vægten et lavt tyngdepunkt, og placeringen sikrer, at pladsforholdene ikke generes nævneværdigt.\nBatteriet leverer strøm til en elmotor, der trækker på forhjulene, og motoren kan levere op til 136 hk. Ikke meget, men nok til, at den ikke føles svag. Der er tre indstillinger for effekten, og som udgangspunkt starter bilen op i midterste indstilling, hvor der kun er ca. 100 hk til rådighed.\nHerfra kan man skifte til enten en Eco-indstilling, hvor der kun er ca. 80 hk, eller Sport med de annoncerede 136 hk. Valget af indstilling kan ses direkte på rækkevidden og gør det muligt at kunne køre lidt længere på en opladning, hvis det kniber med at nå frem til en lader.\nLæs også: Motors test af Opel Corsa-e's søsterbil Peugeot e-208\nFabrikken stiller 330 km i udsigt, og det lyder tilstrækkeligt. Men vores test viser, at man ikke umiddelbart skal regne med at komme så langt. Vi prøvede flere gange at måle rækkevidden, og vores standardtest med konstant 110 km/t. på motorvej viste, at man i så fald kun kan nå 180 km.\nEn mere varieret kørsel resulterede først i 190 km og senere i blot 170 km. Det var alle test, der fandt sted i vintervejr med ca. plus fem grader og med køreprogrammet i Sport. Om sommeren kan man givetvis nå op mod 250 km på motorvej og omkring 300 km, hvis man kører mere varieret.\nMan kan øge rækkevidden ved at forvarme bilen, mens den står i laderen, via en app på mobilen.\nDe to dyreste udgaver af Opel Corsa-e er forsynet med en trefaset 11 kW-lader. Den kan lade hele batteriet op på under fem timer. På farten kan bilen lynlades med op til 100 kW.\nHvor hurtigt oplades Opel Corsa-e?\nDenne topudgave er (modsat de billigste versioner) udstyret med en trefaset 11 kW-lader til brug ved en ladeboks derhjemme. Det gør det muligt at lade bilen op på omkring fem timer.\nPå farten kan man lade med op til 100 kW, omend det kun er kortvarigt, at ladeeffekten er så høj. Ret hurtigt bevæger hastigheden sig ned mod de 50 kW, og man skal derfor påregne mellem en halv og en hel time, før man kan køre videre med markant mere strøm på batteriet. Fabrikken angiver, at man kan lade bilen op til 80 procent på en halv time – det lykkedes os ikke.\nDer følger også en nødlader med bilen. Den kan lade med 1,4 kW, hvis man har et godkendt strømudtag. I så fald tager det halvandet døgn at lade bilen op. Køber man en Corsa-e, er den rette løsning derfor at få sat en ladeboks op derhjemme, hvis man har den mulighed. Gennem Opel kan man f.eks. vælge en aftale med Clever, hvor de sætter deres egen ladeboks op for 7.500 kr., hvorefter man betaler 749 kr. pr. måned for et abonnement, der dækker strømforbruget både hjemme og ved ladning fra en af Clevers ladere langs de offentlige veje.\nDer er rimelig plads i bagagerummet, som rummer 309 liter. Vi savner et separat opbevaringsrum til kablerne.\nHvordan er indretningen i Opel Corsa-e?\nSelvom udgangspunktet er en Peugeot 208, har Opel formået at sætte sit eget præg på indretningen. Ved førerpladsen møder man således et traditionelt Opel-rat og altså ikke det lille rat som i 208, hvor man ser instrumenthuset over rattet. Instrumenthuset er digitalt og viser mange oplysninger undervejs, men er også en smule rodet at se på. Alle menuer er på dansk.\nMidt på instrumentbordet er der en 10"-trykskærm, og den fungerer egentlig fint. Der er mulighed for at koble sin telefon op via kabel og på den måde benytte Apple CarPlay eller Android Auto. Selve klimaanlægget styres fint via separate knapper, og der er varme i både sæder og rat.\nDer er gode fralægningspladser og mulighed for at oplade sin telefon trådløst. Et stort glastag giver fint lys i kabinen.\nI denne topudgave af Corsa-e er glastag standard. Det kan ikke åbnes, men man kan lukke af for lyset med et elbetjent gardin.\nHvordan kører Opel Corsa-e?\nPå vejen opleves Corsa-e tilstrækkelig hurtig, og det er en fornøjelse at mærke den glidende acceleration uden gearskift undervejs som i en traditionel bil. Motoren kan høres tydeligt ved motorvejskørsel, hvor støjniveauet ikke opleves markant forskelligt fra en traditionel bil.\nAffjedringen er til den bløde side, og man har en lidt vuggende fornemmelse, når man møder bløde vejbump, mens små huller giver en øjeblikkelig fornemmelse af, at det stadig er en tung bil.\nEt irriterende element, som desværre er arvet fra både Peugeot og Citroën, er den lange tid, man skal trykke på startknappen, hver gang man skal begynde eller afslutte en tur. Men ellers er den samlede køreoplevelse positiv, og kan man leve med bilens trods alt begrænsede kabine- og bagageplads, er Corsa-e et udmærket bud på en elbil anno 2021.\nMen man kan ikke lade være med at tænke på, at for få kroner mere kan man få f.eks. en VW ID.3, en Peugeot e-2008 eller måske endnu bedre en Opel Mokka-e, når den dukker op om få måneder.\nOvervejer du at købe en elbil? Læs FDMs tema om hverdagen med elbil\nDen lille Corsa ser rap ud og har fået sit eget tydelige designsprog, selvom bilen deler teknik med Peugeot 208.\nOpel Corsa fås med valg mellem benzin-, diesel- eller elmotor. Her er det elbilen, vi har set nærmere på. Den kører godt, men ikke særlig langt på en opladning.\nBagsædepladsen er kneben, og der er ikke friskluftdyser. Der er isofix-beslag til autostole ved de to yderpladser.\nDen elektroniske gearstang mellem forsæderne er let at betjene, og man kan vælge mellem D og B, hvor sidstnævnte giver en ekstra kraftig motorbremsning.\nInstrumenthuset består af en stor digital skærm, der viser mange oplysninger undervejs. Skærmen sidder fint i synsfeltet, men de mange informationer kan virke en smule uoverskuelige.