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ヒトCD3は、多分子T細胞複合体の一部としてT細胞上で発現される抗原を指し、これは異なる三つの鎖からなる：CD3-ε、CD3-δ、およびCD3-γ。例えば固定された抗CD3抗体によってT細胞上でCD3が集合すると、T細胞受容体が関与する場合と類似のT細胞活性化が起こるが、これはそのクローンに典型的な特異性とは無関係である；国際公開公報第99/54440号（特許文献1）またはHoffman(1985), J. Immunol. 135:5〜8（非特許文献1）を参照されたい。\nCD3抗原を特異的に認識する抗体は、先行技術において、例えばTraunecker, EMBO J. 10(1991), 3655〜9（非特許文献2）およびKipriyanov, Int. J. Cancer 77(1998), 763〜772（非特許文献3）において記述されている。最近、CD3に対する抗体が、多様な疾患の治療に提唱されている。これらの抗体または抗体構築物は、欧州特許第1 025 854号（特許文献2）に開示されるように、T細胞枯渇物質またはマイトゲン物質のいずれかとして作用する。ヒトCD3抗原複合体に対して特異的に結合するヒト／齧歯類ハイブリッド抗体は、国際公開公報第00/05268号（特許文献3）に開示され、例えば腎臓、敗血症、および心臓の同種異系移植片の移植後の拒絶事例の治療のための免疫抑制剤として提唱されている。国際公開公報第03/04648号（特許文献4）は、CD3および卵巣癌抗原に対する二重特異性抗体を開示している。さらに、Kufer(1997), Cancer Immunol. Immunother. 45:193〜7（非特許文献4）は、最小の残留癌の治療のためのCD3およびEpCAMに対して特異的な二重特異性抗体に関する。\nCRS症状は、しばしば報告される軽度の「インフルエンザ様」症候群から、報告される回数がより少ない重度の「ショック様」反応（これには、心血管および中枢神経系の症状が含まれることがある）に及ぶ。症状には、とりわけ頭痛、振せん、悪心／嘔吐、下痢、腹痛、倦怠、および筋／関節痛ならびに疼痛、全身の虚弱、心肺事象と共に神経精神学的事象が含まれる。体液過剰負荷の患者および体液過剰負荷ではないように思われる患者において重度の肺浮腫が起こる。特にマウスモノクローナル抗体の治療的治療の障害となるもう一つの重篤な問題は、そのような抗体に対する液性免疫応答の開始であり、それによってヒト抗マウス抗体（「HAMAs」）の産生が起こる（Schroff(1985), Cancer Res. 45:879〜885（非特許文献5）, Shawler(1985), J. Immunol. 135:1530〜1535（非特許文献6））。HAMAsは典型的にマウス抗体による治療の2週目のあいだに産生され、マウス抗体を中和し、それによってその意図する標的に対するその結合能を阻害する。HAMA反応は、マウス抗体定常領域（「Fc」）および／またはマウス可変領域（「V」）の性質に依存しうる。\n【特許文献２】欧州特許第1 025 854号\n【非特許文献１】Hoffman(1985), J. Immunol. 135:5〜8\n【非特許文献２】Traunecker, EMBO J. 10(1991), 3655〜9\n【非特許文献３】Kipriyanov, Int. J. Cancer 77(1998), 763〜772\n【非特許文献４】Kufer(1997), Cancer Immunol. Immunother. 45:193〜7\n【非特許文献５】Schroff(1985), Cancer Res. 45:879〜885\n【非特許文献６】Shawler(1985), J. Immunol. 135:1530〜1535\n【図８】HCICカラムからの抗CD19×抗CD3タンパク質分画の脱免疫変種の280 nmでの代表的な溶出パターン。700 mlで大きい段差を示す下の線は、20 mM酢酸塩、pH 3.5を含む溶出緩衝液の理論的勾配を示す。280 nmでの高い吸収は、カラムフロースルーにおける非結合タンパク質が原因であった。810.98 mlでの矢印は、溶出した抗CD3分画を示す。\n【図９】Ni-キレートHis Trap（登録商標）カラムからの抗CD19×抗CD3タンパク質分画の脱免疫変種の280 nmでの代表的な溶出パターン。85 mlで第一の段差および90 mlで大きい第二の段差を示す下の線は、溶出緩衝液（破線）の理論的勾配を示す。93.16 mlでの矢印は抗CD19×抗CD3構築物を含むタンパク質分画を示す。\n【図１０】セファデックスS200ゲル濾過カラムからの代表的なタンパク質溶出パターン。分画を0〜130 mlの保持時間から回収した。80.44 mlでのタンパク質ピークは、MW約52 kDに対応し、脱免疫された抗CD19×抗CD3構築物を含む。\n【図１４】非脱免疫CD3抗体の可変重鎖領域、VH5（配列番号：74）、VH7（配列番号：76）、VH2（配列番号：70）、およびVH3（配列番号：72）の配列アラインメント。フレームワーク領域（FR1）、相補性決定領域1（CDR1）、フレームワーク領域1（FR1）、相補性決定領域3（CDR3）、およびフレームワーク領域4（FR4）を示す。FR1における配列LARおよびVKK、フレームワーク1とCDR1領域との移行部分での配列ASGYTFおよびASGYTA、FR3での配列LTTDK、ITTDK、およびMTTDT、ならびにFR3での配列MQLS、MELS、およびLQMNを四角で囲んだ。アラインメントは、ベクターNTI AdvanceのAlingn Xプログラム（Informax, Inc., USA）を用いて行った。\n【図１５Ａ】CD3陽性JurkatおよびEpCAM陽性Kato III細胞における異なる脱免疫抗CD3部分：抗CD3（VH5/VL2）×5-10（配列番号：37）（A）を有する二重特異性抗EpCAM構築物のFACSに基づくアッセイにおける結合分析。右へのシフトは結合を示す。Jurkat細胞において、点線はネガティブコントロールのシフトを示す（二次抗体のみ）、破線は抗EpCAM-抗CD3対照抗体の結合を示し、太い線は対象二重特異性構築物を示す。EpCAM陽性Kato III細胞を用いる結合アッセイにおいて、CD3に対するモノクローナル抗体の代わりにEpCAMに対するモノクローナル抗体を陽性対照として用いた。\n【図１５Ｂ】CD3陽性JurkatおよびEpCAM陽性Kato III細胞における異なる脱免疫抗CD3部分：脱免疫抗CD3（VH5/VL2）×4-7（配列番号：33）（B）を有する二重特異性抗EpCAM構築物のFACSに基づくアッセイにおける結合分析。右へのシフトは結合を示す。Jurkat細胞において、点線はネガティブコントロールのシフトを示す（二次抗体のみ）、破線は抗EpCAM-抗CD3対照抗体の結合を示し、太い線は対象二重特異性構築物を示す。EpCAM陽性Kato III細胞を用いる結合アッセイにおいて、CD3に対するモノクローナル抗体の代わりにEpCAMに対するモノクローナル抗体を陽性対照として用いた。\n【図１５Ｃ】CD3陽性JurkatおよびEpCAM陽性Kato III細胞における異なる脱免疫抗CD3部分：脱免疫抗CD3（VH5/VL2）×3-1（配列番号：31）（C）を有する二重特異性抗EpCAM構築物のFACSに基づくアッセイにおける結合分析。右へのシフトは結合を示す。Jurkat細胞において、点線はネガティブコントロールのシフトを示す（二次抗体のみ）、破線は抗EpCAM-抗CD3対照抗体の結合を示し、太い線は対象二重特異性構築物を示す。EpCAM陽性Kato III細胞を用いる結合アッセイにおいて、CD3に対するモノクローナル抗体の代わりにEpCAMに対するモノクローナル抗体を陽性対照として用いた。\n【図１５Ｄ】CD3陽性JurkatおよびEpCAM陽性Kato III細胞における異なる脱免疫抗CD3部分：脱免疫抗CD3（VH5/VL2）×4-7（VL-VH）（配列番号：35）（D）を有する二重特異性抗EpCAM構築物のFACSに基づくアッセイにおける結合分析。右へのシフトは結合を示す。Jurkat細胞において、点線はネガティブコントロールのシフトを示す（二次抗体のみ）、破線は抗EpCAM-抗CD3対照抗体の結合を示し、太い線は対象二重特異性構築物を示す。EpCAM陽性Kato III細胞を用いる結合アッセイにおいて、CD3に対するモノクローナル抗体の代わりにEpCAMに対するモノクローナル抗体を陽性対照として用いた。\n【図１５Ｅ】CD3陽性JurkatおよびEpCAM陽性Kato III細胞における異なる脱免疫抗CD3部分：脱免疫抗CD3（VH5/VL2）×5-10（VL-VH）（配列番号：39）（E）を有する二重特異性抗EpCAM構築物のFACSに基づくアッセイにおける結合分析。右へのシフトは結合を示す。Jurkat細胞において、点線はネガティブコントロールのシフトを示す（二次抗体のみ）、破線は抗EpCAM-抗CD3対照抗体の結合を示し、太い線は対象二重特異性構築物を示す。EpCAM陽性Kato III細胞を用いる結合アッセイにおいて、CD3に対するモノクローナル抗体の代わりにEpCAMに対するモノクローナル抗体を陽性対照として用いた。\n研究の際の構築物のパネルの交差反応性は、例えば、従来的な条件下で(例えば、Harlow および Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 およびUsing Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999を参照されたい)、関心対象の(ポリ)ペプチドに対して、ならびに多数のより多くまたはより少なく(構造的におよび/または機能的に)密接に関連する(ポリ)ペプチドに対して、二重特異性単鎖抗体構築物のこのパネルの結合を評価することによって試験され得る。関心対象の(ポリ)ペプチド/タンパク質に結合するが、例えば心臓組織の細胞といった関心対象の（ポロ）ペプチドと同様の組織によって好ましくは発現する他の(ポリ)ペプチドのいずれかに結合しないか、または本質的に結合しない構築物（つまり、抗体（二重特異性）scFvsなど）のみが、関心対象の(ポリ)ペプチド/タンパク質に特異的であると見なされ、本発明において提供される方法におけるさらなる研究のために選択され、実施例において図示されている。これらの方法は、特に、構造的におよび／または機能的に密接に関連した分子を有する結合研究、ブロッキングおよび競合作用研究を含むことができる。これらの結合研究は、また、FACS解析、表面プラスモン共鳴（SPR（例えばBlAcore（登録商標）により））分析超遠心、等温の滴定熱量測定法、蛍光異方性、蛍光分光法、または、放射性同位元素を使ってラベルされたリガンド結合実験を含む。さらにまた、細胞毒性アッセイ（実施例にて図示したように）および上述したアッセイのような生理学的なアッセイ法が行われても良い。したがって、特異的抗原との抗原相互作用部位の特異的相互作用の例には、そのレセプターについてのリガンドの特異性が含まれてもよい。この定義は、その特異的レセプターを結合する際にシグナルを誘導するリガンドの相互作用を特に含む。対応するリガンドの例には、その特異的サイトカイン-レセプターと相互作用し/結合するサイトカインが含まれる。セレクチンファミリー、インテグリン、およびEGFのような増殖因子のファミリーの抗原のような抗原に対する抗原相互作用部位の結合もまた、この定義に特に含まれる。この定義にまた特に含まれるこの相互作用についての他の例は、抗体の抗原性結合部位との抗原決定基(エピトープ)の相互作用である。\n「結合する/相互作用する」という用語はまた、直線状エピトープに関連するばかりでなく、ヒト標的分子またはその一部の2つの領域からなる、コンホメーションエピトープ、構造エピトープ、または不連続エピトープに関連し得る。本発明の文脈において、コンホメーションエピトープは、ポリペプチドがネイティブタンパク質にフォールディングするときに分子の表面上で一緒になる、一次配列中で分離した2つ以上の個別のアミノ酸配列によって定義される(Sela, (1969) Science 166, 1365およびLaver, (1990) Cell 61, 553-6)。\n「Ig-由来第二の結合ドメイン」という用語は、「免疫グロブリン由来ドメイン」、特に、抗体またはその断片、一本鎖抗体、合成抗体、Fab、F(ab2)'、Fv、もしくはscFv断片等のような抗体断片、またはこれらの任意の化学改変された誘導体を指す。これらの抗体分子は、異なる種に由来してもよく、またはキメラ起源であってもよい。最も好ましくは（本明細書において下記に示すように）、本発明のCD3特異的結合構築物に含まれる該Ig由来第二のドメインは、scFvである。本発明に従って用いられる抗体、抗体構築物、抗体断片、抗体誘導体（全て、Ig-由来）、またはその免疫グロブリン鎖は、当技術分野で公知の通常の技術、例えばアミノ酸枯渇、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当技術分野で公知の他の任意の改変を単独または組み合わせて用いることによって、さらに改変することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるDNA配列にそのような改変を導入する方法は当業者に周知である；例えばSambrook(1989)上記引用文、を参照されたい。「Ig-由来ドメイン」という用語は特に、少なくとも一つのCDRを含む（ポリ）ペプチド構築物に関する。引用されたIg-由来ドメインの断片または誘導体は、上記の抗体分子の一部であるおよび／または化学／生化学または分子生物学的方法によって改変された（ポリ）ペプチドを定義する。対応する方法は当技術分野で公知であり、とりわけ実験マニュアルに記述されている（Sambrookら「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第二版1989および第三版2001；Gerhardtら「Methods for General and Molecular Bacteriology」、ASM Press, 1994；Lefkovits「Immunology Methods Manual : The Comprehensive Sourcebook of Techniques」、Academic Press, 1997；Golemis「Protein-Protein Interactions : A Molecular Cloning Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002を参照されたい）。\nより好ましい態様において、T細胞エピトープの生成傾向が低下した該CD3特異的ドメインの該CDR-H1およびCDR-H2領域は、国際公開公報第99/54440号に記述されるように抗体構築物に由来する。さらにより好ましい（および添付の実施例に説明するように）該CDR-H1およびCDR-H2領域と共にCDR-H3領域は、Traunecker(1991), EMBO J. 10, 3655〜3659に記述されるCD3分子に関して特異性を有する抗体／抗体誘導体に由来する。本発明に従って、該CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3領域は、例えばヒトCD3-ε鎖に関してトランスジェニックであるマウスにおいて、他のTCRサブユニットの状況においてヒトCD3-ε鎖を特異的に認識することができる抗体／抗体誘導体等に由来する。これらのトランスジェニックマウス細胞は、天然またはほぼ天然のコンフォメーションでヒトCD3-εを発現する。\n本発明に従って、フレーム領域は、抗原に接触する高度可変相補性決定領域（CDRs）のタンパク質骨格構造を提供する免疫グロブリンおよびT細胞受容体のVドメイン（VHまたはVLドメイン）における領域に関する。各Vドメインにおいて、FR1、FR2、FR3、およびFR4と呼ばれる四つのフレームワーク領域が存在する。フレームワーク1は、VドメインのN-末端からCDR1の開始部までの領域を含み、フレームワーク2は、CDR1とCDR2のあいだの領域に関し、フレームワーク3は、CDR2とCDR3のあいだの領域を含み、およびフレームワーク4はCDR3の末端からVドメインのC-末端までの領域を意味する；とりわけJaneway, 「Immunobiology」, Garland Publishing, 2001, 第5版を参照されたい。このように、フレームワーク領域は、VHまたはVLドメインにおけるCDR領域外の全ての領域を含む。さらに、「フレームワークとCDR領域のあいだの移行配列」は、フレームワークとCDR領域とのあいだの直接接合部に関する。特に、「フレームワークとCDR領域のあいだの移行配列」という用語は、CDR領域のN-およびC-末端に直接存在する配列またはCDR領域周囲のアミノ酸を意味する。したがって、フレームワークはまた、異なるCDR領域のあいだの配列を含んでもよい。当業者は、所定の配列からフレームワーク領域、CDRsと共に対応する移行配列を容易に推測することができる；Kabat(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest.」、5th edit., NIH Publication no. 91-3242保健社会福祉省、Chothia(1987), J. Mol. Biol. 196, 901〜917およびChothia(1989)Nature 342, 877〜883を参照されたい。\n「二重特異性一本鎖抗体構築物」という用語は、二つの抗体由来結合ドメイン、好ましくはscFvを含む構築物に関する。該結合ドメインの一つは、ヒトCD3抗原（標的分子1）と特異的に結合／相互作用することができる抗体（またはその一部）、抗体断片、またはその誘導体の可変領域からなる。第二の結合ドメインは、下記のようにもう一つの（ヒト）抗原（標的分子2）と特異的に結合／相互作用することができる抗体、抗体断片、またはその誘導体の可変領域（またはその一部）からなる。したがって、該第二の結合ドメインは、本発明に従って、細胞表面分子および／または腫瘍特異的マーカーに対して特異性を有する抗原-相互作用部位を含む、先に引用したIg由来第二のドメインである。二重特異性構築物、好ましくは該二重特異性一本鎖抗体構築物における該二つのドメイン／領域は、好ましくは一本鎖として互いに共有結合される。この結合は、直接（ドメイン1[T細胞エピトープの生成傾向の低下を含み、およびCDR領域もしくはCDR領域と上記のフレームワーク領域とを含むヒトCD3抗原に対して特異的]−ドメイン2[細胞表面分子および／または腫瘍特異的マーカーに対して特異的]、もしくはドメイン1[細胞表面分子および／または腫瘍特異的マーカーに対して特異的]−ドメイン2[T細胞エピトープの生成傾向の低下を含み、およびCDR領域またはCDR領域と上記のフレームワーク領域とを含む、ヒトCD3抗原に対して特異的]、またはさらなるポリペプチドリンカー配列（ドメイン1−リンカー配列−ドメイン2）のいずれかによって行うことができる。リンカーを用いる事象において、このリンカーは好ましくは、第一および第二のドメインのそれぞれが、互いに独立してその異なる結合特異性を確実に保持することができるために十分な長さおよび配列を有する。先に述べたように、および添付の実施例において示されるように、好ましくは本明細書に定義される少なくとも二つのドメインを含むCD3特異的結合構築物は、「二重特異性一本鎖抗体構築物」であり、最も好ましくは二重特異性一本鎖抗体Fv（scFv）である。該構築物は薬学的組成物の状況において用いられると特に想像される。二重特異性一本鎖分子は当技術分野で公知であり、国際公開公報第99/54440号、Mack, J. Immunol.(1997), 158, 3965〜3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021〜7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother. (1997), 45, 193〜197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098〜2103, Bruhl, J. Immunol. (2001), 166, 2420〜2426に記述される。本発明の特に好ましい分子フォーマットは、本発明の構築物のCD3特異的結合ドメインが、先に定義された少なくとも一つのVHおよび一つのVL領域を含む、ポリペプチド構築物を提供する。本明細書に記述され、T細胞エピトープの生成傾向が低下したVH領域の他に、該特異的結合構築物は、T細胞エピトープの生成傾向が低下したさらなる領域／ドメインを含んでもよいことに注意されたい。先に述べたように、VL領域および／または対応するフレームワークは、本発明に従って、T細胞エピトープ生成傾向の低下を有するように操作されているアミノ酸の鎖を含んでもよい。scFvフォーマットにおいてリンカードメインによって互いに連結しているVHドメインおよびVLドメインの分子内方向は、引用された二重特異性一本鎖構築物に関して決定的ではない。このように、可能性がある配置（VH-ドメイン−リンカードメイン−VLドメイン；VLドメイン−リンカードメイン−VHドメイン）をいずれも有するscFvは、引用された二重特異性一本鎖構築物の特定の態様である。CD3特異的ドメインは、二重特異性分子のN-末端またはC-末端に存在しうる。各ドメインのVHおよびVL領域は異なる順序で配置することができる（VH−VLまたはVL−VH）。\nさらに、「ヒト化アプローチ」は、当技術分野において周知であり、特に抗体分子、例えばIg由来分子に関して記述されている。「ヒト化」という用語は、非ヒト抗体に由来する配列のいくつかの部分を含む非ヒト（例えば、マウス）抗体またはその断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')、scFvs、または抗体の他の抗原結合部分配列）のヒト化型に関する。ヒト化抗体には、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（CDR）からの残基が、所望の結合特異性、親和性、および結合能を有するマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種のCDRからの残基に置換されているヒト免疫グロブリンが含まれる。一般的に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質液に全てが非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応して、およびFR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である、少なくとも一つ、および一般的に二つの可変ドメインの全てまたは実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は最適には、典型的にヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部を含むであろう；とりわけJonesら、Nature 321:522〜525(1986)、Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593〜596(1992)を参照されたい。非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野で周知である。一般的にヒト化抗体は、ヒト抗体により厳密に類似するように、非ヒトである起源からそれに導入された一つまたはそれ以上のアミノ酸を有するが、なおも抗体の当初の結合活性を保持している。抗体／抗体分子のヒト化法は、Jonesら、Nature 321:522〜525(1986)；Riechmannら、Nature 332:323〜327(1988)；およびVerhoeyenら、Science 239:1534〜1536(1988)にさらに詳述されている。ヒト化抗体の特定の例、例えばEpCAMに対する抗体は、当技術分野で公知であり、例えば（LoBuglio, 「Proceedings of the American Society of Clinical Oncology」（抄録）、1997, 1562およびKhor, 「Proceedings of the American Society of Clinical Oncology」（抄録）、1997, 847）を参照されたい。\n本発明のCD3特異的結合構築物のIg由来第二のドメインはまた、EpCAM、CCR5、CD19、HER-2、HER-2 neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1（ムチン）、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、ガングリオシドGD3、9-O-アセチル-GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、ポリSA、GD2、炭酸脱水酵素IX（MN/CA IX）、CD44v6、Sonic Hedgehog（Shh）、Wue-1、プラズマ細胞抗原（膜結合型）IgE、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、CCR8、TNF-α前駆体、STEAP、メソセリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、Ly-6、デスモグレイン4、E-カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、CD25、CA19-9マーカー、CA-125マーカー、およびミュラー管阻害物質（MIS）受容体II型、sTn（シアリル化Tn抗原）、FAP（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、EGFRvIII、L6、SAS、CD63、TAG72、TF-抗原、Cora抗原、CD7、CD22、Igα（CD79a）、Igβ（CD79b）、G250、gp100、MT-MMPs、F19-抗原、CO-29およびEphA2からなる群より選択される分子に対して特異性を有する抗原相互作用部位を含んでもよい。\n上皮細胞接着分子（17-1A抗原、KSA、EGP40、GA733-2、ks1-4またはesaとも呼ばれるEpCAM）は、特定の上皮および多くのヒト癌において特異的に発現されるアミノ酸314個の40 kDa膜貫通型糖タンパク質である（Balzer, J. Mol. Med. 1999, 77, 699〜712において論評）。EpCAMはマウスモノクローナル抗体17-1A/エドレコロマブ（Goettinger, Int. J. Cancer, 1986;38, 47〜53およびSimon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990;87, 2755〜2759）による認識を通して発見され、その後クローニングされた。EpCAMは、内皮細胞を一定方向に非常に秩序だって接着させるために役立つ（Litvinov, J. Cell Biol. 1997, 139, 1337〜1348）。上皮細胞が悪性形質転換すると、急速に増殖する腫瘍細胞により、上皮の高度細胞秩序が放棄される。その結果、EpCAMの表面分布はより制限が少なくなり、分子は腫瘍細胞上でより露出され、腫瘍細胞表面上の抗体、抗体断片、または抗体誘導体の結合にとって近づきやすくなる。その上皮細胞起源のために、ほとんどの癌腫による腫瘍細胞はなおもその表面上にEpCAMを発現する。\nインビボで、EpCAMの発現は、上皮の増殖の増加に関連し、細胞分化に負に相関する（論評に関してはBalzar, J. Mol. Med., 1999, 77, 699〜712を参照されたい）。EpCAMの発現は本質的に、全ての主要な癌腫について認められる（Balzar, 1999, J. Mol. Med. 77, 699〜712に論評、またはとりわけDe Bree, Nucl. Med. Commun. 1994, 15, 613〜27；Zhang, Clin. Cancer Res. 1998, 4, 295〜302に報告されている）。その広範な発現のために、EpCAMは「汎癌腫」抗原と呼ばれている。多くの場合、腫瘍細胞は、その親上皮または該癌のより攻撃性の低い型よりかなり高い程度にEpCAMを発現することが認められた。例えば、EpCAM発現の増加は、前立腺癌発達の初期事象を表す（Poczatek, J. Urol. 1999, 162, 1462〜1644）。さらに、子宮頚部の扁平上皮癌および腺癌の大多数において、強いEpCAMの発現は、増殖の増加および最終分化に関するマーカーの消失に相関する（Litvinov, Am. J. Pathol, 1996, 148, 865〜75）。乳癌において、腫瘍細胞上でのEpCAMの過剰発現は、生存の予測因子である（Gastl, Lancet, 2000, 356, 1981〜1982）。EpCAMは、頭部、頚部、および肺の扁平上皮癌を有する患者における播種された腫瘍細胞を検出するためのマーカーである（Chaubal, Anticancer Res. 1999, 19, 2237〜2242；Piyathilake, Hum. Pathol. 2000, 31, 482〜487）。表皮、口腔、咽頭蓋、咽頭、喉頭、および食道において認められる正常な扁平上皮は、有意にEpCAMを発現しなかった（Quak, Hybridoma, 1990, 9, 377〜387）。EpCAMは原発、転移、および播種性NSCLC（肺の非小細胞癌細胞（Passlick, Int. J. Cancer, 2000, 87, 548〜552））の大多数において、胃の腺癌および胃食道接合部腺癌（Martin, J. Clin. Pathol. 1999, 52, 701〜4）において、ならびに結腸直腸、膵臓癌および乳癌に由来する細胞株（Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 3542〜6；Packeisen, Hybridoma, 1999, 18, 37〜40）において発現されることが示されている。\nEpCAM 3-1、EpCAM 3-5、EpCAM 4-1、EpCAM 4-7およびEpCAM 5-10は、国際公開公報第99/25818号においてファージディスプレイによって単離されたEpCAMに対する特異的一本鎖抗体に関する。\nヒトCD3抗原に対して特異性を有する抗体の脱免疫されたVHドメインは、配列番号：74または76に記載した配列から選択することができる。ヒトCD3抗原に対して特異性を有する抗体の脱免疫されたVLドメインは、配列番号：78、80、または82に記載の配列から選択することができる。ヒトEpCAM 3-1、3-5、4-1、4-7、および5-10抗体のVHタンパク質ドメインはそれぞれ、配列番号：137、141、145、149、および133に記載されている。ヒトEpCAM 3-1、3-5、4-1、4-7、および5-10抗体のVLタンパク質ドメインはそれぞれ、配列番号：139、143、147、151、および135に記載されている。\nヒトCD3抗原に対して特異性を有する抗体の脱免疫VHドメインをコードする核酸分子は、配列番号：73または75に記載の配列から選択することができる。ヒトCD3抗原に対して特異性を有する抗原の脱免疫されたVLドメインをコードする核酸分子は、配列番号：77、79、または81記載の配列から選択することができる。ヒトEpCAM 3-1、3-5、4-1、4-7、および5-10抗体のVHタンパク質ドメインをコードする核酸分子はそれぞれ、配列番号：136、140、144、148、および132に記載されている。ヒトEpCAM 3-1、3-5、4-1、4-7、および5-10抗体のVLタンパク質ドメインをコードする核酸分子はそれぞれ、配列番号：138、142、146、150、および134に記載されている。\nいかにして核酸分子を用いてハイブリダイゼーション実験を実行するかは周知であり、すなわち、当業者は、本発明に従って彼らがどのハイブリダイゼーション条件を使用しなくてはならないかを知っている。このようなハイブリダイゼーション条件は、Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y.などの標準的な教科書において言及されている。本発明に従って好ましいものは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチドまたはその部分にハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドである。\n「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、50%ホルムアミド、5×SSC(750mM NaCl、75mM クエン酸ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム(pH 7.6)、5×デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中での42℃、一晩のインキュベーション、続いて0.1×SSCにおける約65℃でのフィルターの洗浄をいう。よりストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度(より低いホルムアミドのパーセンテージはより低いストリンジェンシーを生じる);塩濃度、または温度の操作を通して達成される。例えば、よりストリンジェンシーの低い条件は、6×SSPE(20×SSPE=3M NaCl;0.2M NaH2PO4;0.02M EDTA, pH 7.4)、0.5% SDS、30%ホルムアミド、100μg/mlサケ精子ブロッキングDNAを含む溶液中での37℃での一晩のインキュベーション;引き続く50℃での1×SSPE、0.1% SDSを用いる洗浄を含む。さらに、なおより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に実行される洗浄が、より高い塩濃度(例えば、5×SSC)で行われ得る。上記の条件におけるバリエーションが、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を含めることおよび/またはそれで置換することを通して達成され得ることに注目されたい。代表的なブロッキング試薬には、デンハルト試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ精子DNA、および市販の独自製品の処方物が含まれる。特異的ブロッキング試薬を含めることは、適合性に伴う問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の修飾を必要とする可能性がある。\nヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、細胞表面上の二つの重要な分子であるCD4および共受容体に最初に結合して初めてヒト細胞内に入ることができる。最初に認識される共受容体は、CCR5であり、ウイルスのライフサイクルの後期ではもう一つのケモカイン受容体であるCXCR4はHIV-1の共受容体となる（D'Souza, Nature Med. 2, 1293(1996)；Premack, Nature Med. 2, 1174；Fauci, Nature 384, 529(1996)）。性的接触によってウイルスのほとんどの伝幡を引き起こすHIV-1株は、M-指向性ウイルスと呼ばれる。これらのHIV-1株（非合胞体誘導（NSI）プライマリウイルスとしても知られる）は、初代培養CD4+ T細胞およびマクロファージにおいて複製することができ、ケモカイン受容体CCR5（および頻度は少ないがCCR3）をその共受容体として用いる。T-指向性ウイルス（時に、合胞体誘導（SI）プライマリウイルスと呼ばれる）はまた、初代培養CD4+ T細胞においても複製できるが、さらにインビトロで確立されたCD4+ T細胞株に感染することができ、それらはケモカイン受容体CXCR4（融合体）を通して行われる。これらのT-指向性株の多くは、CXCR4の他にCCR5を用いることができ、中には、少なくとも特定のインビトロ条件においてCCR5を通してマクロファージに入ることができるものもある（D'Souza, Nature Med. 2, 1293(1996)；Premack, Nature Med 2, 1174；Fauci, Nature 384, 529(1996)）。\n他の共受容体がHIV-1の発病に関与しているか否かは解明されていないが、インビトロ試験から、いくつかのT-指向性株に関して他の共受容体の存在が推測されうる。M-指向性HIV-1株は、HIVの性的伝幡の約90％に関係していることから、CCR5は、患者におけるウイルスの主要な共受容体である；CXCR4を用いる（T-指向性）株の伝幡（または全身性の確立）はまれである（D'Souza, Nature Med. 2, 1293(1996)；Premack, Nature Med. 2, 1174；Fauci, Nature 384, 529(1996)；Paxton, Nature Med. 2, 412(1996)；Liu, Cell 86, 367(1996)；Samson, Nature 382, 722(1996)；Dean, Science 273, 1856(1996)；Huang, Nature Med. 2, 1240(1996)）。しかし、SIウイルスがインビボで進化すると（またはそれらが伝幡されると）、それらは特にビルレントとなり、より急速な疾患の進行を引き起こす（D'Souza, Nature Med. 2, 1293(1996)；Premack, Nature Med 2, 1174；Fauci, Nature 384, 529(1996)；Schuitemaker, J. Virol. 66, 1354(1992)；Connor, J. Virol. 67, 1772(1993)；Richman, J. Infect. Dis. 169, 968(1994)；R.I. Connorら、J. Exp. Med. 185, 621(1997)；Trkola, Nature 384, 184(1996)）。\n標的細胞上の共受容体分子の数および同一性、ならびにHIV-1株が異なる共受容体を通して細胞に入る能力は、疾患の進行に関する重要な決定因子であるように思われる。これらの要因は、HIV-1感染症の宿主およびウイルス依存的局面の双方に対する主要な影響である。例えば、CCR5におけるホモ接合欠損体（デルタ32）は、インビボおよびインビトロでHIV-1感染症に対する抵抗性と強く相関する。欠損CCR5対立遺伝子に関してヘテロ接合である人は、感染症に対する保護はせいぜい弱く、疾患の進行にごくわずかな遅れを示すに過ぎない（Paxton, Nature Med. 2, 412(1996)；Liu, Cell 86, 367(1996)；Samson, Nature 382, 722(1996)；Dean, Science 273, 1856(1996)；Huang, et al., Nature Med. 2, 1240(1996)）。しかし、他の要因が活性化CD4+ T細胞上のCCR5発現レベルに影響を及ぼして、それによってインビトロでHIV-1感染症の効率に影響を及ぼしうる（Trkola, Nature 384, 184(1996)；Bleul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1925(1997)）。\nI型糖尿病は、T細胞媒介自己免疫疾患であると考えられる。膵臓におけるCCR5受容体の発現は、関連する動物モデルにおいてI型糖尿病の進行に関連した（Cameron(2000), J. Immunol. 165, 1102〜1110）。特に、CCR5発現は、インスリン症および自然発生型I型糖尿病の発症に関連した。\n（ヒト）CCR5に特異的に結合するいくつかの抗体が当技術分野で公知であり、MC-1（Mack(1998), J. Exp. Med. 187, 1215〜1224）またはMC-5（Blanpain(2002)Mol. Biol. Cell. 13:723〜37；Segerer(1999), Kidney Int. 56:52〜64；Kraft(2001)J. Biol. Chem. 14:276:34408〜18）を含む。CCR-5抗体、特にMC-1およびMC-5は、本発明のCD3特異的構築物のIg由来第二のドメイン源として役立つ可能性がある。従って、好ましい態様において、本発明は、第一のドメインがヒトCD3に対する特異性を提供して、T細胞エピトープの生成傾向の低下を有し、該Ig由来第二のドメインが（ヒト）CCR5に対して特異的な抗体に由来する、少なくとも二つのドメインを含む二重特異性構築物に関する。最も好ましくは、そのような構築物は本明細書において定義されるように一本鎖scFvである。\nMC-1は、ヒトCCR5の第二の細胞外ループの第一の部分に特異的に結合して、添付の実施例に示すようにアカゲザルに由来するCCR5と交叉反応しないことが示された。したがって、本発明のCD3特異的構築物は、例えばCCR5、好ましくはヒトCCR5に対して特異的な抗体のVLおよびVHドメイン（すなわち、Ig-由来第二のドメイン）、ならびにCD3抗原に対して特異的な抗体のVHおよびVLドメインを含むことが好ましい。ヒトCCR5に対して特異的な該抗体は、とりわけMack(1998), J. Exp. Med. 187, 1215〜1224および添付の実施例に記述されているマウス抗ヒトCCR5抗体MC-1である。なおも、MC-5と同様に他の抗CCR5抗体（添付の実施例に特徴が示されているように、およびBlanpain(2002)Mol. Biol. Cell. 13:723〜37；Segerer(1999)Kidney Int. 56:52〜64およびKraft(2001)J. Biol. Chem. 14:276:34408〜18において開示されるように）を、本発明の状況において用いてもよい。\n構築物 構築物部分の配列番号 脱免疫された抗CD3構築物／特異性\nCD19は、非常に有用な医学的標的であることが判明した。CD19は、プロB細胞から成熟B細胞へのB細胞系列全体において発現され、細胞表面から消失しない場合、全てのリンパ腫細胞において均一に発現され、幹細胞には存在しない（Haagen, Clin. Exp. Immunol. 90(1992), 368〜75；Uckun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988), 8603〜7）。CD19に対する抗体とさらなる免疫調節抗体の双方を用いる併用治療が、B細胞の悪性疾患（国際公開公報第02/04021号、US2002006404、US2002028178）および自己免疫疾患（国際公開公報第02/22212号、US2002058029）の治療のために開示されている。国際公開公報第00/67795号は、無痛性の劇症型B-細胞リンパ腫の治療のためと共に急性および慢性型リンパ球性白血病の治療のために、CD19に対する抗体を用いることを開示している。国際公開公報第02/80987号は、B細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、またはB細胞白血病（例えば、B細胞急性リンパ球性白血病（B-ALL）（例えば、ヘアリーセルリンパ腫）B細胞前駆体急性リンパ球性白血病（プレB-ALL）、B細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL））のような疾患の治療のために抗原CD19に対する抗体に基づいて免疫毒素を治療的に用いることを開示する。\nCD20は、B-リンパ球上に存在する細胞表面タンパク質の一つである。CD20抗原は、B-細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）の90％以上におけるリンパ球を含む、正常および悪性プレBおよび成熟Bリンパ球において認められる。抗原は造血幹細胞、活性化Bリンパ球（プラズマ細胞）、および正常組織には存在しない。ほとんどがマウス起源であるいくつかの抗体が記述されている：1F5（Pressら、1987, Blood 69/2, 584〜591）、2B8/C2B8、2H7、1H4（Liuら、1987, J. Immunol. 139, 3521〜3526；Andersonら、1998, 米国特許第5,736,137号；Haismaら、1998, Blood 92, 184〜190；Shanら、1999, J. Immunol. 162, 6589〜6595）。\nCD20は、担体タンパク質に結合したscFvをコードするDNAのワクチン接種を用いるプラズマ細胞悪性疾患の治療のための免疫治療戦略において（Treonら、2000, Semin Oncol 27(5), 598）記述されており、CD20抗体（IDEC-C2B8）を用いる免疫療法において、非ホジキンB-細胞リンパ腫の治療において有効であることが示されている。CD20抗体は、非ホジキンリンパ腫において有効性および認容性が証明されており、これまで無処置または再発／不応性の無痛性非ホジキンリンパ腫においてそれぞれ、反応率は73％および48％であった（Montserrat, 2003, Semin Oncol. 30(1suppl2), 34〜39）。さらに、CD20抗体は、再発または進行期のB-細胞新生物を治療するために広く用いられており、有効率は約50％である。\n本発明の核酸分子に、調節配列が加えられ得ることは当業者には明らかである。例えば、プロモーター、転写エンハンサー、および/または本発明のポリヌクレオチドの発現の誘導を可能にする配列が利用され得る。適切な誘導系は、例えば、例えばGossen および Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992, 5547-5551))およびGossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62)によって記載されるようなテトラサイクリン調節される遺伝子発現、または、例えばCrook (1989) EMBO J. 8, 513-519によって記載されるようなデキサメタゾン誘導性遺伝子発現系である。\n多くの適切なベクターが分子生物学における当業者に公知であり、その選択は所望される機能に依存し、これにはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子操作において慣用的に使用される他のベクターが含まれる。種々のプラスミドおよびベクターを構築するために、当業者に周知である方法(例えば、Sambrookら(前掲)およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)を参照されたい)が使用され得る。または、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構成され得る。以下でさらに詳細に議論されるように、クローニングベクターは、個別のDNAの配列を単離するために使用された。関連する配列は、特定のポリペプチドの発現が必要とされる発現ベクターに移動され得る。代表的なクローニングベクターには、pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322、およびpGBT9が含まれる。代表的な発現ベクターには、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CATが含まれる。\n転写の開始の原因であるエレメントに加えて、このような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流のSV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位などの転写終結シグナルを含み得る。さらに、使用される発現系に依存して、細胞区画にポリペプチドを方向付けるか、または培地にポリペプチドを分泌することが可能であるリーダー配列が、列挙される核酸配列のコード配列に加えられてもよく、これらは当技術分野で周知である;例えば、添付の実施例１も参照されたい。リーダー配列は、適切な段階で、翻訳配列、開始配列、および終結配列と、好ましくは、翻訳されたタンパク質またはその部分の分泌を方向付けることが可能であるリーダー配列と、細胞膜周辺腔または細胞外媒体でアセンブルされる。任意に、異種配列が、所望の性質(例えば、発現された組換え産物の安定化または精製の単純化;前記を参照されたい)を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。この文脈において、適切な発現ベクターは当技術分野で公知であり、例えば、岡山-バーグcDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pEF-DHFR、pEF-ADA、またはpEF-neo(Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150)、またはpSPORT1(GIBCO BRL)である。\n使用され得る代替的な発現系は昆虫系である。1つのこのような系において、Autographa californica核多核体病ウイルス(AcNPV)が、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeにおいて外来性の遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。列挙される核酸分子のコード配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの必須でない領域にクローニングされ得、ポリヘドリンプロモーターの制御下に配置され得る。このコード配列の首尾よい挿入はポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質の被覆を欠く組換えウイルスを産生する。次いで、組換えウイルスは、本発明のタンパク質が発現されるS. frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeに感染させるために使用される(Smith, j. Virol 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227)。\n形質転換された細胞、例えば、植物組織および植物細胞の選択のために有用である選択可能なマーカー遺伝子は当業者に周知であり、例えば、dhfr(これはメトレキサートに対する耐性を付与する(Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.)13 (1994), 143-149));npt(これはアミノグリコシドネオマイシン、カナマイシン、およびパロマイシンに対する耐性を付与する(Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995))およびhygro(これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する(Marsh, Gene 32 (1984), 481-485))についての選択の基礎として代謝拮抗物質耐性を含む。さらなる選択可能な遺伝子が記載されており、すなわち、以下が記載されている。trpB(これは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする);hisD(これは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする)(Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047);マンノース-6-リン酸イソメラーゼ(これは細胞がマンノースを利用することを可能にする)(WO 94/20627)およびODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)(これはオルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を付与する)(McConlogue, 1987, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)またはAspergillus terreusからのデアミナーゼ(これは、ブラスチシジンSに対する耐性を付与する(Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338))。\n有用なスコア付け可能なマーカーもまた当業者に公知であり、市販されている。有利には、このマーカーは、ルシフェラーゼ(Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121)グリーン蛍光タンパク質(Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47)、またはβ-グルクロニダーゼ(Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907)をコードする遺伝子である。この態様は、列挙されたベクターを含む細胞、組織、および生物体を単純かつ迅速にスクリーニングするために特に有用である。\n上記のように、列挙された核酸分子は、例えば、精製だけでなく遺伝子治療目的のために、コードされたCD3特異的構築物を細胞中で発現するために単独でまたはベクターの一部として使用され得る。上記の（二重特異性）CD3構築物のいずれか1つをコードするDNA配列を含む核酸分子またはベクターは細胞に導入され、次には関心対象のポリペプチドを産生する。遺伝子治療(これはエクスビボまたはインビボの技術によって細胞に治療遺伝子を導入することに基づく)は、遺伝子移入の最も重要な応用の1つである。インビトロまたはインビボの遺伝子治療のための適切なベクター、方法、または遺伝子送達系は文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、以下を参照されたい。列挙された核酸分子およびベクターは、直接的導入のために、またはリポソーム、もしくはウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)を介する細胞への導入のために設計され得る。好ましくは、この細胞は生殖系列細胞、胚性細胞、または卵細胞、またはそれらから由来する細胞であり、最も好ましくは、幹細胞である。胚性幹細胞の例は、とりわけ、Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428において記載されている幹細胞であり得る。\n上記に従って、本発明は、本明細書中に定義される二重特異性単鎖抗体構築物のポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む、遺伝子操作において慣用的に使用されるベクター(特に、プラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージ)を誘導するための方法に関する。好ましくは、このベクターは、発現ベクターおよび/または遺伝子移入もしくは標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、標的とされた細胞集団への列挙されたポリヌクレオチドまたはベクターの送達のために使用され得る。当業者に周知である方法が組換えベクターを構築するために使用され得る;例えば、Sambrook et al. (前掲)、Ausubel(1989、前掲)または他の標準的教科書において記載される技術を参照されたい。または、列挙される核酸分子およびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構成され得る。本発明の核酸分子を含むベクターは、周知の方法(これは細胞宿主の型に依存して変化する)によって宿主細胞に移動され得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核生物細胞のために利用されるのに対して、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが他の細胞宿主のために使用され得る;Sambrook、前記を参照されたい。\n列挙されるベクターは、特に、pEF-DHFR、pEF-ADA、またはpEF-neoであり得る。ベクターpEF-DHFR、pEF-ADAおよびpEF-neoは、当該分野において、例えば、Mack et al. (PNAS (1995) 92, 7021-7025)およびRaum et al. (Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150)ににおいて記載されている。\n「原核生物」という用語は、本発明のタンパク質の発現のためにDNA分子またはRNA分子で形質転換またはトランスフェクトされ得る全ての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主は、グラム陰性細菌ならびにグラム陽性細菌、例えば、大腸菌、S. typhimurium、Serratia marcescensおよびBacillus subtilisなどを含み得る。「真核生物」という用語は、酵母、高等植物、昆虫、および好ましくは哺乳動物の細胞を含むことを意味する。組換え産生手順において利用される宿主に依存して、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、グリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されなくてもよい。特に好ましいものは、本発明のポリペプチドのコード配列ならびにそれに遺伝子が融合したN末端FLAG-タグおよび/またはC末端His-タグを含むプラスミドまたはウイルスの使用である。好ましくは、このFLAG-タグの長さは約4〜8アミノ酸であり、最も好ましくは8アミノ酸である。上記のポリヌクレオチドは、当業者に一般的に公知である技術のいずれかを使用して宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。さらに、融合された、作動可能に連結された遺伝子を調製する方法、ならびに例えば、哺乳動物細胞および細菌中でそれらを発現させる方法は、当技術分野において周知である(Sambrook、前掲)。\n本発明に従って、「薬学的組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。好ましい態様において、薬学的組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内投与のための、または組織もしくは腫瘍への直接注射による組成物を含む。特に、該薬学的組成物は注入または注射によって患者に投与されると想像される。適した組成物の投与は異なる方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内投与によって行ってもよい。本発明の薬学的組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含んでもよい。適した薬学的担体の例は当技術分野において周知であり、これには、燐酸緩衝生理食塩液、水、油／水乳剤のような乳剤、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等が含まれる。そのような担体を含む組成物は、周知の通常の方法によって製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、適した用量で被験者に投与することができる。投与レジメは、主治医および臨床的要因によって決定されるであろう。医学の技術分野において周知であるように、任意の患者1人の用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与期間および経路、全身健康、ならびに同時投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。一般的に、薬学的組成物の規則的な投与としてのレジメは、1μg〜5 g単位/日の範囲でなければならない。しかし、連続的注入のためのより好ましい用量は、0.01μg〜2 mg、好ましくは0.01μg〜1 mg、より好ましくは0.01μg〜100 μg、さらにより好ましくは0.01μg〜50 μg、および最も好ましくは0.01μg〜10 μg単位/kg体重/時間の範囲であってもよい。特に好ましい用量は、本明細書において下記に引用される。進行は定期的な評価によってモニターすることができる。用量は変化するが、DNAの静脈内投与のための好ましい用量はDNA分子約106〜1012コピーである。本発明の組成物は、局所または全身投与してもよい。投与は一般的に非経口、例えば静脈内投与であろう；DNAはまた、例えば内部または外部標的部位へのバイオリスティック（biolistic）送達、または動脈内の部位にカテーテルによって標的部位に直接投与してもよい。非経口投与のための調製物には、滅菌水溶液、または非水溶液、懸濁液、および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩液および緩衝培地を含む、水、アルコール／水溶液、乳剤、または懸濁液が含まれる。非経口溶媒には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、液体および栄養補助剤、電解質補助剤（リンゲルデキストロースに基づくような）等が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等のような保存剤および他の添加剤も同様に、存在してもよい。さらに、本発明の薬学的組成物は、例えば好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンのような蛋白質様担体を含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、二重特異性一本鎖抗体構築物またはこれをコードする核酸分子もしくはベクター（本発明において記述されるように）の他に、薬学的組成物の意図する用途に応じて、さらに生物活性物質を含んでもよいと想像される。そのような物質は、消化管系に作用する薬剤、細胞増殖抑制物質として作用する薬剤、ハイパーウリケミア（hyperurikemia）を予防する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えば、コルチコステロイド）、循環系に影響を及ぼす薬剤および／または当技術分野で公知のT-細胞共刺激分子またはサイトカインのような物質であってもよい。\n脱免疫されている抗CD3一本鎖抗体をコードするDNAを、本明細書において抗CD3カセットと呼ぶ。この抗CD3カセットは、SGGGGSリンカー（配列番号：176）、抗CD3 VH領域（配列番号：110）、およびアミノ酸14個のGSリンカー（VEGGSGGSGGSGGSGGVDリンカー（配列番号：68））、および抗CD3 VL領域（配列番号：112）からなり、この後にヒスチジン残基6個が続く。上記のDNAをSrf1部位でベクターpPCR-Script-Amp SK(+)（Stratagene）にクローニングした。抗CD3カセットのDNAおよびアミノ酸配列を配列番号：1、配列番号：2および図1に示す。\n抗CD3カセットの脱免疫版をオーバーラップPCR組換え法によって構築した。pPCR-S-Amp SK+において、抗CD3カセット（配列番号：1、2）を必要な脱免疫配列への変異誘発のための鋳型として用いた。改変される領域を含む変異原性プライマー対の組を合成した。異なるVH領域4個および異なるVL領域3個を含む、産生された脱免疫配列をNot1からHind III断片としてベクターpPCR-S-Amp SK+にクローニングして、全DNA配列が正確であることを確認した。異なるVH領域4個および異なるVK領域3個を全ての組み合わせ（全体で12）において、PCRまたはVH領域の3'末端に導入した単一のBstEII部位のいずれかを用いて結合した。各組み合わせの全DNA配列が正確であることを確認した。抗CD3構築物の対応する当初の非脱免疫配列（VH：配列番号：110、VL：配列番号：112）を有する異なる脱免疫VH領域（配列番号：70、72、74、および76）およびVL領域（配列番号：78、80、および82）を表9に要約する。\n緩衝液A1（20 mMトリスpH 7.2）によって平衡にしたXK16/60カラム（Pharmacia）にローディングしたMEP Hypercel（登録商標）において、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーを行った。細胞培養上清500 mlをカラム（10 ml）に流速3 ml/分で適用した。未結合試料を緩衝液A1によって洗浄し、結合したタンパク質を100％緩衝液B1（20 mM酢酸塩、pH 3.5）によって溶出した。溶出したタンパク質分画をさらなる精製のためにプールした。\n製造元のプロトコールに従ってNiSO4をローディングしたHisTap（登録商標）カラム（Pharmacia）を用いて、IMACを行った。カラムを緩衝液A2（20 mM NaP、pH 7.5、0.4 M NaCl）によって平衡にして、試料を緩衝液A2によって2：1希釈して、pH 7を得た。試料を流速1 ml/分でカラム（2 ml）に適用して、カラムを緩衝液A2によって洗浄して、未結合試料を除去した。結合したタンパク質を、緩衝液B2（20 mM NaP、pH 7.5、0.4 M NaCl、0.5 Mイミダゾール）の2段階勾配を用いて溶出した。段階1：20％緩衝液B2の10カラム容積；段階2：100％緩衝液B2の10カラム容積。溶出したタンパク質分画をさらなる精製のためにプールした。\nPBS（Gibco）によって平衡にしたSephadex S200 HiPrep（登録商標）カラム（Pharmacia）においてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。溶出したタンパク質試料（流速1 ml/分）に、SDS-PAGEおよび検出のためにウェスタンブロットを行った（図11）。カラムを分子量決定のために予め較正した（分子量マーカーキット、Sigma MW GF-200）。\nさらに、抗CD19×抗CD3タンパク質の脱免疫変種をウェスタンブロットによって特異的に検出した。ウェスタンブロットは、Optitran BA-S83（登録商標）メンブレンおよびInvitrogen Blot Module（登録商標）によって製造元のプロトコールに従って行った。用いた抗体は、Penta His（Quiagen）およびアルカリホスファターゼ（AP）標識ヤギ抗マウスIg（Sigma）であり、染色溶液はBCIP/NBT液（Sigma）であった。主要なシグナルは、SDS-PAGEにおいて52 kDaで主要なバンドに対応することが示された（図11b）。\nEC50値を特定するために、用量反応を、0.4 pg/ml抗CD19×抗CD3から100 ng/ml抗CD19×抗CD3まで分析した。EC50値は、抗CD19×抗CD3の生物学的有効性を記述するが、絶対値は、エフェクター細胞源に応じて有意に変化するであろう。このように、相対的有効性は、以下の式に基づいて抗CD19×抗CD3参照材料と比較して計算される：\n抗CD19および脱免疫抗CD3を含む構築物の細胞障害活性を図13に示す。精製された非脱免疫抗CD19×抗CD3を対照として用いた。脱免疫構築物のEC50値は21.9〜81.6 pg/mlの範囲であったが、非脱免疫抗CD19×抗CD3構築物のEC50値は、22.7 pg/mlであった。このように、脱免疫構築物は全て、非脱免疫分子と同等のEC50値であることが判明した。\n（表１２）脱免疫および非脱免疫抗CD3 scAbから得たペプチドの免疫原性を調べるために用いた健康なドナー20人のHLA DRハプロタイプ\n非脱免疫CD3抗体の可変重鎖領域、VH5（配列番号：74）、VH7（配列番号：76）、VH2（配列番号：70）、およびVH3（配列番号：72）を、Vector NTI Advance（Informax, Inc., USA）のAlingnXプログラムを用いて整列させた。用いたClustal Wアルゴリズムは、Nucleic Acid Research, 22(22)：4673〜4860, 1994に記述されている。アラインメントを図14に示す。アラインメントから、意外にも良好な結合を示す可変領域VH5およびVH7が、フレームワーク1とCDR1との移行領域で配列ASGYTFを有することが認められうる。さらに、結合を示さないVH領域（VH2（配列番号：70）およびVH3（配列番号：72））が、フレームワーク1とCDR1との移行部で配列ASGYTAを含む。このように、T細胞エピトープの生成傾向およびCD3に対する結合が低下した構築物を得るために、構築物はフレームワーク1とCDR1との移行領域で配列ASGYTFを含まなければならない。意外にも、CD3に結合し、上記の配列ASGYTFを含むT細胞エピトープの生成傾向が低下した重鎖可変領域は良好な結合を示す。\nN-末端脱免疫抗CD3（VH5/VL2）を、脱免疫（CD19×抗CD3（VH5/VL2）（配列番号：192））を鋳型として、および以下のプライマー（DI CD3 5-2 VH BsrGI\n（配列番号：40）、DI CD3 5-2 VL BspEI\n脱免疫抗CD3を含む上記のPCR産物を、制限酵素BsrGIおよびBspEIによって切断した後、真核細胞分泌シグナル（リーダーペプチド）のアミノ酸配列を含むbluescript KSベクター（Stratagene, La Jolla, CA）にEcoRI/BsrGI断片としてクローニングした。この構築物をEcoRIおよびBspEIによって切断後、リーダーペプチドと共にそれぞれの抗CD3 scFvを含む得られたDNA断片を、pEF-DHFRベクターにおいてC-末端位で抗EpCAM scFv 3-1、4-7、または5-10を含むEcoRI/BspEI切断プラスミドにクローニングした。シークエンシング（Sequiserve, Vaterstetten）によって二重特異性一本鎖をコードする配列を確認後、プラスミドを真核細胞タンパク質発現のためにDHFR欠損CHO細胞にトランスフェクトした。DHFR欠損CHO細胞における真核細胞タンパク質発現は、Kaufmann, R.J.(1990)Methods Enzymol. 185, 537〜566に記述された通りに行った。\nVL-VH方向にアミノ酸15の標準的なリンカーを含む抗EpCAM 4-7（配列番号：168）をPCRによって得た。4-7 VH領域および4-7 VL領域を以下のプライマーによって個々に増幅した（4-7 VL：4-7 VL BspEI 順方向\n（配列番号：117）、4-7 VL GS15 逆方向\n（配列番号：118）、4-7 VH：4-7 VH GS15 順方向\n（配列番号：42）、4-7 VH SalI 逆方向\n（配列番号：43））。PCR産物に導入された重なり合う相補的配列を用いて、その後の融合PCRの際に、アミノ酸15個の(G4S1)3（一文字アミノ酸コード）リンカー（標準的なリンカー）（配列番号：168）のコード配列を形成した。この増幅段階は、プライマー対4-7 VL Bsp EI FORおよび4-7 VH SalI REV（配列番号：42および43）を用いて行った。\nアミノ酸15個の標準的な（(G4S1)3）リンカーを含むVL-VH方向の抗EpCAM 5-10を、PCRによって得た。5-10 VH領域および5-10 VL領域を、以下のプライマーによって個々に増幅した（5-10 VL：5-10 VL BspEI 順方向\n（配列番号：44）、5-10 VL GS15 逆方向\n（配列番号：45）、5-10 VH：5-10 VH GS15 順方向\n（配列番号：46）、5-10 VH SalI 逆方向\n（配列番号：47））。その後の融合PCRにおいて、PCR産物に導入された重なり合う相補的配列を用いて、アミノ酸15個の(G4S1)3（一文字アミノ酸コード）リンカー（標準的なリンカー）（配列番号：168）のコード配列を形成した。この増幅段階はプライマー対5-10 VL BspEI FORおよび5-10 VH SalI REVによって行った。\nPCR産物5-10 VL-VHおよび4-7 VL-VHを、抗CD3構築物（VH5/VL2）を含むpEF-DHFRベクターにクローニングした。シークエンシングによって二重特異性一本鎖をコードする配列を確認した後、真核細胞発現のために、プラスミドをDHFR欠損CHO細胞にトランスフェクトした。DHFR欠損CHO細胞における真核細胞タンパク質発現は、Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol. 185, 537〜566に記述された通りに行った。\nN-末端方向で抗CD3部分を有する二重特異性一本鎖抗体のEpCAMおよびCD3に対する結合をFACS分析によって確認した。その目的のために、EpCAM陽性ヒト胃癌細胞株Kato III（ATCC HTB-103）を用いた。抗CD3部分の結合は、Jurkat細胞（ATCC TIB 152）において示された。\n細胞を供給元の推奨に従って培養して、細胞200000個を10 μg/ml構築物と共に2％FCS（仔ウシ胎児血清）を含むPBS 50μlにおいてインキュベートした。構築物の結合は、2μg/ml抗His抗体（Qiagen, Hilden, FRGから得たPenta-His抗体）によって2％FCSを含むPBSにおいて検出した。第二段階として、ヤギ抗マウスIgGに由来するR-フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2を、2％FCS（Dianova, Hamburg, FRG）を含むPBS 50μlにおいて1：100倍希釈して用いた。試料をFACSscan（BD biosciences, Heidelberg, FRG）において測定した。\n非脱免疫3-1×抗CD3分子を構築するために、VH-VL方向のC-末端3-1をPCRによって得た。3-1 VH-VLを二つの部分において含む断片IおよびIIを、プライマー対me 91a（配列番号：53）/me 90（配列番号：52）およびme 83（配列番号：50）/me 84（配列番号：51）をそれぞれ用いてPCRによって増幅した。Expand High Fidelity System of Roche Diagnosticsを用いてホットスタートPCRを行った。20サイクル（94℃/30秒、60℃/1分、72℃/1分）を増幅のために行い、その後72℃で3分を1サイクル行った。\nPCR断片IおよびIIに1.5％アガロースゲル上での電気泳動を行った。断片を混合して（各1 ng）、完全な3-1を含む断片IIIの増幅のために、プライマー対me 91a（配列番号：53）およびme 84（配列番号：51）によって行う次のPCR反応の鋳型として用いた。PCRは上記の通りに行ったが、アニーリング温度は68℃であった。断片IIIをアガロースゲルにおいて精製して、BsrGIおよびBspEI（Biolabs）によって消化し、精製してその後pEF-DHFR抗EpCAM（M79）×抗CD3構築物の対応する部位にクローニングした。クローニングした領域を制限消化物およびDNAシークエンシングによって確認した。\n3-5を二つの部分で含む断片IおよびIIを、プライマー対me 81（配列番号：56）/me 90（配列番号：52）、およびme 83（配列番号：50）/me 84（配列番号：51）をそれぞれ用いて、3-1×抗CD3に関して記述した条件に従ってPCRによって増幅した。PCR断片IおよびIIを含むアガロースゲル断片を、完全な3-5を含む断片IIIを増幅するために、プライマー対me 81（配列番号：56）およびme 84（配列番号：51）によって再増幅した。PCRは先に記述した通りに実施した。断片IIIをアガロースゲルにおいて精製して、BssHIIおよびBspEI（Biolabs）によって消化して、精製し、その後pEF-DHFRベクターの対応する部位にクローニングした。クローニングした領域を制限消化物およびDNAシークエンシングによって確認した。\n4-1を二つの部分で含む断片IおよびIIを、プライマー対me 91a（配列番号：53）/me 90（配列番号：452）およびme 83（配列番号：50）/me 84（配列番号：51）をそれぞれ用いて上記の条件によってPCRによって増幅した。\n完全な4-1を含む断片IIIを増幅するために、PCR断片IおよびIIを含むアガロースゲル断片を、プライマー対me 92a（配列番号：59）およびme 84（配列番号：51）によって再増幅した。PCRは先に記述した通りに実施したが、アニーリングは68℃で行った。断片IIIをアガロースゲルにおいて精製して、BsrGIおよびBspEI（Biolabs）によって消化して、精製し、その後pEF-DHFR-抗EpCAM（M79）×抗CD3クローニングベクター構築物の対応する部位にクローニングした。クローニングした領域を制限消化物およびDNAシークエンシングによって確認した。\n4-7を二つの部分で含む断片IおよびIIを、プライマー対me 81（配列番号：56）/me 90（配列番号：52）、およびme 83（配列番号：50）/me 84（配列番号：51）をそれぞれ用いて、上記の条件に従ってPCRによって増幅した。PCR断片IおよびIIを含むアガロースゲル断片を、完全な4-7 VHおよびVL鎖を含む断片IIIを増幅するために、プライマー対me 81（配列番号：56）およびme 84（配列番号：51）によって再増幅した。PCRは先に記述した通りに実施した。断片IIIをアガロースゲルにおいて精製して、BssHIIおよびBspEI（Biolabs）によって消化して、精製した後pEF-DHFRベクターの対応する部位にクローニングした。クローニングした領域を制限消化物およびDNAシークエンシングによって確認した。\n5-10を二つの部分で含む断片IおよびIIを、プライマー対me 92a（配列番号：59）/me 90（配列番号：52）、およびme 83（配列番号：50）/me 84（配列番号：51）をそれぞれ用いて、上記の条件に従ってPCRによって増幅した。PCR断片IおよびIIを含むアガロースゲル断片を、完全な5-10を含む断片IIIを増幅するために、プライマー対me 92a（配列番号：59）およびme 84（配列番号：51）によって再増幅した。PCRは先に記述した通りに実施したが、アニーリングは68℃で行った。断片IIIをアガロースゲルにおいて精製して、BsrGIおよびBspEI（Biolabs）によって消化して、精製し、その後pEF-DHFR抗EpCAM（M79）×抗CD3クローニングベクターの対応する部位にクローニングした。クローニングした領域を制限消化物およびDNAシークエンシングによって確認した。\nDHFR遺伝子を欠損するCHO細胞を、10％仔ウシ胎児血清（Life Technologies、65℃で30分間熱不活化）およびHT（ヒポキサンチンおよびチミジン；Life Technologies）を添加したαMEM培地（Life Technologies, cat No. 32561）において維持した。Lipofectamine 2000キット（登録商標）（Invitrogen）を用いて製造元によって提供された説明書に従って、細胞にpEF-DHFR-3-1×抗CD3（VH5/VL2）（配列番号：48）およびpEF-DHFR-5-10×抗CD3（VH5/VL2）（配列番号：62）をトランスフェクトした。48時間後、選択培地（熱不活化10％透析仔ウシ胎児血清（Life Technologies）を含むαMEM培地）において選択を行った。3〜4週間後、細胞培養上清を回収して、4℃で300 gで10分間遠心して細胞および細胞の破片を除去した。二重特異性抗体を含む上清を、さらに分析するまで-20℃で保存した。\nJurkat細胞（CD3結合に関して）およびKato細胞（EpCAM結合に関して）250000個を、二重特異性構築物（それぞれ、pEF-DHFR-3-1×抗CD3（VH5/VL2）（Nr. 50、配列番号：48）およびpEF-DHFR-5-10×抗CD3（VH5/VL2）（Nr.54）（配列番号：62））を含む細胞培養上清（50 μl）と共に独立して4℃で45分間インキュベートした。その後、細胞をFACS緩衝液（1％仔ウシ胎児血清（FCS）および0.05％アジ化ナトリウムを含む燐酸緩衝生理食塩液）において2回洗浄して、マウス抗His抗体（Dianova、DIA 910）と共に4℃で60分間インキュベートした。洗浄段階は上記の通りに行った。\n細胞を最終的にヤギ抗マウスIg-FITC結合抗体（BD 550003）またはPEに結合させた抗マウスIgG（Sigma, P8547）のいずれかと共に最終的にインキュベートした。洗浄段階後、事象10000個をFACS Calibur（B&D）を用いて分析した。結合アッセイの結果を図16に示す。構築物3-1×抗CD3（VH5/VL2）（配列番号：49）および5-10×抗CD3（配列番号：63）は、Jurkat細胞上でCD3に対して、およびKato細胞上でCD19に対して強い結合を示した。\nさらに高分解能の陽イオン交換クロマトグラフィーを、20 mM MES緩衝液pH 5.5によって平衡にしたMiniSカラム（Amersham）において行った。試料を同じ緩衝液によって1：3に希釈してからカラムにローディングした。結合したタンパク質を0〜30％勾配の1 M NaClの平衡緩衝液溶液によって溶出した。溶出したタンパク質分画を生物活性アッセイにおいて試験した。表14は、精製脱免疫EpCAM構築物の収量を示す。構築物は全て、有効に産生することができた。意外にも構築物5-10×抗-CD3（VH5/VL2）（配列番号：63）は、2200 μg/lという極めて良好な収量を有した。\n細胞毒性試験のために、CHO-EpCAM(1.5×107)を、PBSで２回洗浄して血清を除き、製造業者の指示書に従ってPKH25色素(Sigma-Aldrich Co.)とともにインキュベートした。細胞染色後にRPMI/10% FCSで2回洗浄した。\n細胞を計数し、CB15エフェクター細胞と混合した。CD4ポジティブT細胞クローンCB15は、Fickenscher博士(University of Erlangen/Nuernberg, Germany)からご厚意で提供された。細胞を、供給業者によって推奨されるように培養した。得られる細胞懸濁物は、mlあたり400,000標的および2×106エフェクター細胞を含んだ。96ウェル丸底プレート中のウェルあたり、50μlの混合物を使用した。\n抗体をRPMI/10% FCS中で必要とされる濃度まで希釈し、この溶液の50μlを細胞懸濁物に加えた。標準的な反応は、37℃/5% CO2中で16時間インキュベートした。ヨウ化プロピジウムを1μg/mlの最終濃度で加えた。室温での10分間のインキュベーション後、細胞をFACSによって分析した。PKH26蛍光を、標的細胞のポジティブ同定のために使用した。細胞毒性を、全ての標的細胞にわたるPIポジティブの比として測定した。\nシグモイド型用量応答曲線は、代表的には、Prismソフトウェア(GraphPad Software Inc., San Diego, USA)によって決定されるように、>0.97のR2値を有した。細胞毒性アッセイの結果は、図１７および１８に示されている。\n脱免疫（CHO-DHFR-）および非脱免疫（CHO-DHFR-またはCHO-K1）を産生するCHO細胞株を、HyQ PF CHO LS培地＋4 mM L-グルタミンにおいて37℃および5％CO2のCO2インキュベータにおいて培養した。細胞数および生存率はトリパンブルーによって決定した。細胞密度を1〜2×105個mlに設定した。\n細胞をスピンナフラスコに移して、攪拌培養の条件に調節した。操作パラメータの設定は、CO2インキュベータにおいて通気しながら80 rpm、37℃、および5％CO2であった。培養容積は100〜500 mlの範囲であり、インキュベーション時の細胞密度は1〜2×105個/mlの範囲であった。Tフラスコでのサブ培養に関して、各継代毎に培養物を遠心して、新鮮な予め加温した培地に浮遊させた。細胞密度は1〜2×105個/mlに設定した。\n8.5.2 プロテインL ELISA\nマイクロタイタープレートをrプロテインLのPBS緩衝液溶液（2μg rプロテインL/ml PBS緩衝液）によって2〜8℃で一晩コーティングした。コーティングの後、残っている吸着部位をブロッキング緩衝液（2％BSAのPBS緩衝液溶液）によってブロックした。次に、プレートを凍結して≦18℃で保存した。使用前、プレートを融解して、洗浄緩衝液（0.05％Tween 20のPBS緩衝液）によって洗浄し、コーティング溶液とブロッキング緩衝液の混合物を除去した。\n洗浄後、ウサギ抗マウスIgG（希釈緩衝液において1：5,000倍希釈）を加えて、室温で60分間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギIgGを加えた（希釈緩衝液において1：1,000倍希釈、室温で60分）。pNPP基質溶液を加えて、3 M NaOHを加えることによって反応を停止させた。ELISAリーダーによって405 nm（参照フィルター492 nm）で吸光度を測定した。\nIg由来第二の結合ドメインが、EpCAM、CCR5、CD19、HER-2、HER-2 neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1（ムチン）、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、ガングリオシドGD3、9-O-アセチル-GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、ポリSA、GD2、炭酸脱水酵素IX（MN/CA IX）、CD44v6、Sonic Hedgehog（Shh）、Wue-1、プラズマ細胞抗原、（膜結合型）IgE、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、CCR8、TNF-α前駆体、STEAP、メソセリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、Ly-6、デスモグレイン4、E-カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、CD25、CA19-9マーカー、CA-125マーカー、およびミュラー管阻害物質（MIS）受容体II型、sTn（シアリル化Tn抗原、TAG72）、FAP（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、EGFRvIII、L6、SAS、CD63、TAG72、TF-抗原、Cora抗原、CD7、CD22、Igα、Igβ、G250、gp100、MT-MMPs、F19-抗原、CO-29およびEphA2からなる群より選択される分子に対して特異性を有する抗原相互作用部位を含む、請求項16または17に記載のCD3特異的結合構築物。\n【出願人】（５０５２９８８２５）マイクロメット　アクツィエン　ゲゼルシャフト (14)


6336エンジェルナンバー :: nashvl-rebel.com\n656, 6556のミラー数字がエンジェルナンバーの人は、周りに流されない生き方をした方が良さそうです。そうすることで自分の心に軸ができ、本当の幸せを見つけて豊かな生活が送れるでしょう。物に固執する人生では、本当の幸せを. 【エンジェルナンバー36】を調べてみて 1回目に見た時 物質的なことは、アセンデッド・マスター達にゆだねるのですね‥（ついつい余計な事を考えてしまうので‥）なかなか難しいですが、この【エンジェルナンバー36】の. エンジェルナンバー74の数字の意味 エンジェルナンバー74は、『天使達とあなたとの結びつきと、あなたの直感力のおかげで貴重な聖なる導きを受け取っています』というメッセージです。これはあなたの天使たちからの愛と希望. 6363 の繰り返し数字がエンジェルナンバーの人は、多くの誘惑が目の前に現れるかもしれません。しかし、アセンデッドマスターが正しい道を教えてくれるという暗示でもあります。天のメッセージを無視して誘惑に惑わされないよう.\n6868エンジェルナンバーの恋愛の意味とは？この数字は、執着心が様々な繁栄を遮ってしまっているから、その殻から抜け出してという警告です。今回は、エンジェルナンバー6868が教えてくれる恋愛にお. 《スポンサーリンク》 あなたには、ふと意識が向いた数字や繰り返し目に飛び込んでくる数字はありますか？ そのような数字があれば、エンジェルナンバーの可能性があります。 つまり、天使たちが数字を介してあなたにメッセージ. エンジェルナンバー「7777」の数字が示す意味は、「よく頑張りましたね。これまで本当に頑張りました！過去の努力の報酬を受け取る時です。そして報酬を受け取り更なるステップアップを目指しましょう。宇宙はあなたの進歩を喜ん. エンジェルナンバー「3838」には豊かさをもたらすという意味があります。この豊かさとはどのような変化なのか気になりますね。恋愛においても良い方向への変化が現れます。アセンデッド・マスターや天使からのメッセージに耳を. このナンバーと一緒前後に見るナンバーにも注意を払い、メッセージを受け取ったら、行動に移してください。 先のことはあまり考えずに、思い立ったらすぐ行動すること それが吉を呼ぶでしょう。 【6336】.\nドリーン・バーチュー氏の著書よりエンジェルナンバー6の数字を紹介しています。これは、所有物、この惑星に関すること、有形資産などの地球上の物質に関連している数字です。スピリチュアルな面に意識を集中し信じることで物質. 車のナンバー、時計など エンジェルナンバー555 を繰り返しみるのであれば、天使からのメッセージです。どんな意味が込められているかというと エンジェルナンバー555が秘める意味は？ 『重大な変化と意義深い変化が訪れています。. 1414恋愛【エンジェルナンバー】は、目の前の出来事や 現実に集中没頭するという意味。 恋愛が恍惚状態となり、恋心が火山のように噴火して 燃えさかり相手の虜になることです。 時には大きくぶつかり、時にはケンカしたりしながら.\nエンジェルナンバーな日々／555、9999 もっと見る 大天使ミカエルのメッセージすべてが完璧 起こることすべてに意味があります。 うまくいってもOK うまくいかなくてもOK うまくいかない時は うまくいく 天使の祝福 ANGEL 他の. 誰もが同じでなくていいのです。貴方の個.エンジェルナンバー1010本当の自分を復活させるパワー！ 8月15日に8号線を走行中。ふと、すれ違う対向車のナンバーが1010。おー！すばらしい ナンバーだと感動すると、続く車も1010、2台.\nこんばんは。おとといからの出来事です。おととい仕事へ行く途中で9999のカー・ナンバーを見ました。1、3や7の連続ナンバーは今までたくさん見たことがあるのですが、9の連続は初めてだったので驚き. 【空現れたエンジェル・ウィングⅣ】 サチャロカアゼツライトとワークし ブレスレットの写真を撮っていたら 雲が変わり始め エンジェルウィングにフォーメーションを変えていきました。 天使たちが空から挨拶に来てくれました。.\n夜中に空を見上げると月輪 大いなる存在に出会い 大きな を見上げながら、宇宙と対話してるような、そんな感覚でした。 ・ ・ 月 月夜 月光浴 月暈 ムーンボウ 天使の祝福 今日の空 igでつながる空 moon moongram moonhalo ig. 《6666》エンジェルナンバーが伝えたい本意 《9999》エンジェルナンバーのフォーナイン 《2222》ツインソウル22のエンジェルナンバー 《エンジェルナンバー》888が暗示することをご紹介 婚活パーティー検索 ALLリセット 婚活 恋活 街コン. 最近車を運転していてよく見かけるナンバーが 6868 さっそくドリーンのエンジェルナンバーで調べました。 68 ・・・ 「 あなたは豊かさを実現しました。 この流れを止めないよう、 あなたの信じるものに寄付をしてください。. 昨日那覇からの帰り道に、車のナンバーで気になったのが 「 3838 」 繰り返し 違う車のナンバーとして現れては、 私の車の前を走っていました 。 『 これは またしても お知らせだ ！ 』 とピンときて エンジェルナンバーの.\nエンジェルナンバー早見表（数字一覧） あなたが見たエンジェルナンバーの意味について、恋愛面など詳しく解説したサイト エンジェルナンバー占い.jp.\n330のエンジェルナンバーの意味と恋愛などのメッセージとは？ エンジェルナンバー330は、アセンデッドマスターを表す3の数字と神の存在を表す0の数字で構成されています。エンジェルナンバー330を感じたということは、あなたの周りに聖人. 携帯電話、PDA等からのアクセス方法について 郵便番号検索に使用されているデータについて 2019年度版郵便番号簿の変更案内（PDF） PDFファイルを閲覧するためには Adobe Readerが必要です。.\nライブドアニュースより一部転載しました。安倍晋三首相の父親・安倍晋太郎氏と暴力団の交際2014年11月27日6時0分「闇社会の守護神」と呼ばれていた人物が、ひっそりと息を引き取った――。大阪、東京両地検の元特捜部検事で、巨額. 2019/11/01- Pinterest で rainbowdolphin33 さんのボード「ANGEL」を見てみましょう。。「天使、エンジェル、大天使」のアイデアをもっと見てみましょう。. PALM ANGELS LOGO CHECK SHIRT 44 パームエンジェル ロゴ チェックシャツ 背ロゴ バックロゴ ピンク 長袖シャツ 191101 【あす楽対応_関東】【あす楽対応_甲信越】【あす楽対応_北陸】【あす楽対応 楽天市場 ジャンル一覧. [ ピンキーエンジェルプレミアム ]乳首やビキニラインの黒ずみにお悩みの方へ朗報！乳首の黒ずみ バストトップ用クリーム ビキニライン 黒ずみ デリケートゾーン 美白。【ネコポス送料無料】 ピンキーエンジェルプレミアム 乳首の.\nエンジェルナンバー6336 あなたの望むものを天使たちは もたらそうとしています。あなたがより輝くためのサポートを 天使たちは惜しむことなく行います エンジェルナンバー1414 天使は今、自分の考えにしっかりと 注意するようメッセージを贈って.\nエンジェルナンバー【396】の解説 [adrwd] エンジェルナンバー【396】意味一覧 エンジェルナンバーの意味を解説します。エンジェルナンバーに気づいたら意味を確認して自分なりの解釈をしてみましょう。恋愛のこと、仕事のこと、お.


【新着情報】今週の新商品 ＠カップ麺：週報（2018年4月第4週） - 週報：カップ麺発売予定\nどうも、taka :aです。お気付きの方もいらっしゃるかとは思いますが、FC2のプロフィール画像とTwitter（@honjitsunoippai）のアイコンを変更しました。あ、スマホからだと見られないのかな…えっと、「これ」なんですけど…めっちゃ可愛くないですか？w 製作者は前プロフィール画像と同じ、「もちもちもっちー(*´ω｀*)」と「30代1児の母の子育て遊び100選」の筆者で、ブログ仲間のウルちゃん（@uru85san3）…くっそ忙しい時間の合間を縫って描いてもらいました。ちなみに彼女とは実際に会ったことはないんですけれども（写真などで私の顔を知っているわけでもありません）、普段から親交の深いビー玉に新しいアイコンを見せたところ…「うん、よく似てるね(*´꒳`*)」ほほぉ…いや、うん。実際ちょっと似ているかもしれないw（雰囲気ですよ？雰囲気w） もちろん以前のプロフィール画像にも思い入れがあるんだけど、今回のアイコンをTwitterと共に統一して設定しました。関係者各位、新しい私をよろしくお願いします（ぺこり）ウルちゃん素敵すぎるアイコンありがとう！「アイコン販売を本格的に考えようと思う」\n「日清のどん兵衛 どリッチ 全部のせうどん」290円（税別）全国 New\n「日清焼そばU.F.O. 濃厚激辛ソース焼そば」180円（税別）全国 New\n「明星 バリカタ 極細麺と濃厚とんこつ」225円（税別）全国 New\n「マルちゃん やみつき旨辛 辛黒 富山ブラック風焼そば」180円（税別）全国 New\n「マルちゃん やみつき旨辛 辛赤 名古屋台湾まぜそば」180円（税別）全国 New\n「マルちゃん 飯田商店 醤油ラーメン」250円（税別）全国 New\n「タテロング THE 和 わさびを利かせたおろし風そば」205円（税別）全国 New\n「サッポロ一番 地獄の担担麺 護摩龍 阿修羅」250円（税別）全国 New\n「マルちゃん 大盛！京都系黒醤油ラーメン」93円（税別）IY New？\n「マルちゃん 大盛！横浜系醤油豚骨ラーメン」93円（税別）IY Renewal？\n✔ 日清食品は、一度はやってみたかった夢の全部のせ！「日清のどん兵衛 どリッチ 全部のせうどん」と、U.F.O.史上最高に辛くて旨い！ 「日清焼そばU.F.O.濃厚激辛ソース焼そば」の2品をリリース。いやぁ…これは両方ともインパクトが絶大ですね。「日清のどん兵衛 どリッチ 全部のせうどん」は、お馴染み「ふっくらおあげ」「サクサク天ぷら」「ジューシィ牛肉」をドド〜ンと盛った税 “別” 290円のハイエンドカップ麺。通常パッケージでは具材が入りきらないため、かぶせフタ付きの特別パッケージを起用したそうです。もう完全に具材で喰わせる気ですね…受けて立とうじゃないの。つゆは関西風かな？条件によっては無印どん兵衛が3個くらい買えちゃう値段になるので、費用対効果が総評の指標になりそうです。「日清焼そばU.F.O.濃厚激辛ソース焼そば」は、オリジナルの濃厚ソースをベースに唐辛子を添加した激辛ソースらしく、さらに「辛さ2倍パウダー」が別添されるそうで、唐辛子の刺激的な辛さが2倍にアップするとともに、野菜の旨みと燻製をイメージした食欲をそそる芳ばしい香りがアクセントに加わるそうです。矛の切っ先は、まるか食品の「ペヤング 激辛やきそば」でしょうか。単なる激辛カップ麺ではなさそうなので、こちらも気になるところ。\n✔ 明星食品は、「明星 バリカタ 極細麺と濃厚とんこつ」を新発売…なんですけれども、これ実は過去に何回もリリースされているテーマなんですよね。カップ麺と親しい人であれば、過去に一度は食べたことがあるのではないでしょうか。「バリカタ」食感の加水率が低い極細ノンフライ麺が売りのシリーズで、本格志向の製品なんですが、年々とんこつの勢いが落ちてしまっているんですよね…まぁ臭いが正義とは言い切りませんが、ノンフライ麺の出来映えが本物さながらの秀逸な仕上がりなので、とんこつ感にも期待してしまうじゃないですか…とか何とか言いながら、今回も間違いなく美味しいと思いますw\n✔ 東洋水産は、「やみつき旨辛」シリーズより、「辛黒 富山ブラック風焼そば」と「辛赤 名古屋台湾まぜそば」を新発売。そして、過去に2度（かな？）タテ型ビッグでリリースされた、「飯田飯店」の「醤油ラーメン」がノンフライ麺どんぶり型で新登場します。「やみつき旨辛」シリーズの「辛黒 富山ブラック風焼そば」は、昨年にも「辛白 ちゃんぽん焼そば」との抱き合わせでありましたね。他にも「麻辛（まーから）担担麺」や「酢辛（すーから）酢辣湯麺」（2012年）、「赤辛 ユッケジャン味」や「青辛 水キムチ味」（2012年）、「辛黒 しょうゆヌードル」や「辛白 ちゃんぽん」（2012年・2016年）、最近だと「辛黒 富山ブラックラーメン」や「辛赤 名古屋台湾ラーメン」などのリリースもあったんですが、当ブログではタイミングが合わず、1度も紹介できていないシリーズなんです…で、「飯田商店 醤油ラーメン」のタテ型ビッグ（2014年05月26日発売 この頃はタテ型ビッグでも税別190円が相場だったんですよねぇ…）は食べて記事にしましたが、油揚げ麺がネガティヴに作用してしまい、総評は伸び悩んで★3でした。2017年5月15日にもリリースされていいますが、こちらは食いっぱぐれまして…w まぁ今回はノンフライ麺どんぶり型なので、タテ型ビッグとは受ける印象は大きく異なるでしょう。\n✔ エースコックは、「タテロング THE 和 わさびを利かせたおろし風そば」を新発売。「通な大人たちに向けたこだわりの和風カップめんシリーズ『THE 和』誕生！」って…また新シリーズを増やす気ですかエースコックさんw （いや、とっても楽しいですけどね…いろいろ放置されちゃってて自然消滅が危ういブランドが心配だなぁ…と、老婆心ながらに思うだけで…w） そういえば汁ありカップ麺でワサビは少し珍しいですよね。鰹の風味が利いたスープに、「大根おろし風パウダー」と「本わさびパウダー」が入った粉末スープを加えて仕上げる、キリッとした爽やかな味わいが特徴だそうで、早くも夏向けの装いを感じる新商品です。昨年、「わかめラーメン ゆず胡椒と大根おろし風しお」というカップ麺があったんですけれども、その時の大根おろしパウダーが活かされているのでしょうか。\n✔ サンヨー食品は、「サッポロ一番 地獄の担担麺 護摩龍 阿修羅」を新発売。いやぁ…ほんと週に1回のペースで何かしらの担担がリリースされますね。しかも、目立って多いのが汁なし担担麺。これから夏に向けて、さらに新作の頻度が上がってくると予想されますが、もう完全にトレンドと言って差し支えないでしょう。こちらのカップ麺は、東京・大久保にある担担麺専門店「地獄の担担麺 護摩龍（ごまりゅう）」とコラボレーションした大判カップめんで、たっぷりの唐辛子＆ほんのり花椒が特徴だそうです。最近の汁なし担担麺は軒並み花椒がメインの製品が多かったので、唐辛子がメインの構成には新鮮味を感じますね。かなり攻撃的なパッケージなんですけれども、それ相応のインパクトが唐辛子から感じられるのでしょうか。希望小売価格は250円というハイエンド使用ですが、ノンフライ麺を採用しているようなので、本格さに期待したいと思います。\n球数としては塩っぱい雰囲気の今週ですが、まだニュースリリースが追い付いていない新商品や特定のコンビニ限定商品が出てくるかもしれませんし、いま分かっている上記の製品だけでも粒揃いのメンツですよね。とりあえず、日清食品の「日清のどん兵衛 どリッチ 全部のせうどん」と「日清焼そばU.F.O. 濃厚激辛ソース焼そば」、東洋水産の「マルちゃん 飯田商店 醤油ラーメン」、エースコックの「タテロング THE 和 わさびを利かせたおろし風そば」、サンヨー食品の「サッポロ一番 地獄の担担麺 護摩龍 阿修羅」あたりが候補でしょうか。あ、また「やみつき旨辛」シリーズが漏れるかも…w ここ最近、新商品のリリースが盛んだったペヤング氏が嫌に静かなのが気になるところなんですけれども、5月に5つもの新製品リリースを予定しているようなので、嵐の前の静けさでしょうか。もしかしたら記事の公開後に新商品の発表があるかもしれないので、確認が取れたら追記しますね。あ、それと先週のコンビニ先行発売だった「ペヤング すっぱからMAXやきそば」なんですが、セブンイレブン先行発売だったそうです。私の行動圏内にはセブンイレブンが無いので、一般販売開始（5月7日）以降に取り上げたいと思います。それでは、今週もよろしくお願いします（ぺこり）