Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons | Protocol (Translated to Portuguese)\nNós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células lisados nucleares. O ensaio produz taxas de actividade de reparação de ADN passíveis de análise cinética e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecido e lisados tumorais ou com proteínas purificadas.\nNós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células nucleares lisados utilizando base excisão de reparação (BER) balizas molecular. O substrato (farol) é composto de um deoxyoligonucleotide contendo uma lesão de uma única base com um 6-Carboxifluoresceína (6-FAM) porção conjugada com o extremo 5 'e uma porção DABCYL conjugada com a extremidade 3' do oligonucleótido. O RIC farol molecular é de 43 bases de comprimento ea sequência foi concebida para promover a formação de uma estrutura de haste loop-com 13 nucleótidos no loop e 15 pares de bases no 1,2-tronco. Quando dobrada nesta configuração da porção 6-FAM é extinta por DABCYL de uma maneira não fluorescente via Förster Transferência de Energia de Ressonância (FRET) 3,4. A lesão é posicionada de tal modo que a remoção da lesão seguinte base e cisão vertente o oligonucleótido de base restante 5 contendo a porção 6-FAM é libertado a partir da haste. Solte umadescolamento nd do (DABCYL) Quencher resulta em um aumento de fluorescência que é proporcional ao nível de reparo do DNA. Ao coletar várias leituras dos valores de fluorescência, em tempo real avaliação da atividade da RIC é possível. O uso de padrão quantitativo PCR em tempo real instrumentos permite a análise simultânea de várias amostras. O desenho destes balizas BER moleculares, com uma lesão de uma única base, é passível de análises cinéticos, quantificação BER e validação inibidor e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecidos e os lisados de células de tumor ou com proteínas purificadas. A análise da actividade BER em lisados de tumor ou tecido aspira usando estas balizas molecular pode ser aplicável a medições de biomarcadores funcionais. Além disso, a análise da actividade BER com proteínas purificadas usando este ensaio quantitativo fornece uma rápida, o método de alto rendimento para a descoberta e validação de inibidores de BER.\n1. Projeto Beacon Molecular\n1,1 Projetando e encomendar o seu farol molecular\nO design do seu farol molecular deve considerar o seguinte:\nTemos bons resultados com oligonucleotídeos 43 mer DNA. O conteúdo de GC deve ser> de 32%. Excluir uma base G na extremidade 5 '.\nPedido 6-FAM (6-Carboxifluoresceína) conjugação na extremidade 5 'e DABCYL como um 3' modificação.\nA posição da lesão deve estar na base # 6 a partir da extremidade 5 '.\nO comprimento da haste ou duplex hairpin deve ser um mínimo de 15 pb.\nO comprimento da laçada recomendada é de 13 bases.\nA estrutura geral da baliza é como mostrado na Figura 1.\nUma vez que a seqüência e lesão tipo é decidido, o oligonucleotídeo pode ser encomendado a partir de a maioria das empresas de oligonucleotídeos. Nós ordenamos nossos oligonucleotídeos de IDT e solicitar que os oligonucleotídeos são purificada por HPLC e provided como um pó ou em um formato seco.\n1,2 Recozimento seu farol molecular\nDissolve-se oligonucleótidos de DNA liofilizados em Oligo tampão de diluição (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 0,1 mM) para dar uma solução stock concentrada Molecular Beacon de 40 uM.\nPreparar uma solução de baliza 200nM Molecular trabalhando a partir do 40 mM de solução stock Molecular Beacon utilizando o tampão de reacção BER (ver abaixo). Adicione a 200 nM solução Beacon Molecular trabalhando para um tubo estéril mL preto 1.5.\nIncubar o tubo contendo a 200 nM solução farol molecular trabalhando num copo grande de água a ferver durante 3 minutos.\nApós 3 minutos, retirar o copo da fonte de calor e incubar as balizas molecular na água durante a noite para promover recozimento. Use isolador de calor materiais tanto sobre e sob o copo para retardar o processo de arrefecimento.\nBeacons alíquotas em estéreis, preto tubos de 1,5 ml, 100 ul de cada tubo.\nArmazenar a -30 ° C.\n1.3 Análise de Qualidade de seu farol molecular\nRealizar uma análise da curva de fusão para confirmar que as balizas BER moleculares não fluorescência até aquecida, para determinar a temperatura de fusão óptima e para confirmar que cada baliza irá fluorescência quando aquecido.\nPara cada baliza adicionar o volume da solução indicada Beacon 200 nM Molecular trabalho e tampão de reacção BER, tal como indicado na Tabela 1, a 6 poços de uma rápida placa de 96 poços óptico (Applied Biosystems, Cat # 4.346.906).\nUse um tempo real instrumento de PCR tais como o sistema StepOnePlus (Applied Biosystems) ou semelhante para monitorar FAM-corante de excitação durante a análise da curva de fusão.\nPrograma seu tempo real instrumento de PCR (sistema StepOnePlus) para monitorar FAM excitação do corante como uma função do aumento da temperatura em pequenos incrementos para análise da curva de fusão. O sistema de StepOnePlus é programado para medir FAM fluorescemnce e rampa entre 25 ° C a 95 ° C em 0,5 intervalos ° C. Uma curva de fusão típico é mostrado na Figura 2.\nFluorescência de fundo pouca ou nenhuma deve ser visível a temperaturas inferiores a 50 ° C. Verifique se há um aumento uniforme e íngreme na fluorescência, indicativos das balizas de pura qualidade e alta. Os valores de Tm de cerca de 60 ° C a 80 ° C são favoráveis e deve ser igual para todas as diluições.\nDeterminar T max, a temperatura a máximas de fluorescência [FL (max)] valores, a partir desta análise. A proporcionalidade dos valores de fluorescência em T m ou T max para a entrada de farol (a concentração) deve ser linear. O valor de fluorescência em T max, Fl (max), deve exceder os valores de fundo, a 37 ° C pelo menos 5 vezes.\n2. Preparação Lysate Nuclear\nBase de dados de 2,1 Excisão Repair reação buffer de 5 preparação\nAdicionar todos os componentes listadosna Tabela 2 e trazer o volume do tampão para 900 mL com DDQ 2 O.\nAjustar o pH a 7,8 usando hidróxido de potássio 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).\nTraga o volume do tampão para 1000 mL com DDQ 2 O.\nFiltrar o buffer usando 0,22 uM de filtro, Nalgene de 1 L de filtro (cat # 167-0020).\nAdicionar Ditiotreitol (DTT), imediatamente antes de utilizar o tampão de reacção BER.\n2,2 cultura de células e isolamento das células\nSugere-se a células de cultura confluente até 90-100%. Isolar as células a partir de 4-6 pratos (150 mm) para se obter lisado nuclear suficiente para um conjunto completo de análise (aproximadamente 5 x 10 7 células no total).\nRecomenda-se para preparar 3 culturas independentes para 3 peletes de células independentes para obter biológica repetições para cada análise.\nLisados nucleares são prontamente preparados utilizando o procedimento de isolamento NucBuster (EMD Cat # Calbiochem Bioscience 71.183-3) ALTHough qualquer protocolo de isolamento nuclear seria apropriado (ver abaixo, ponto 2.3.).\n2,3 preparação lisado Nuclear\nAntes da partida, um cocktail de Inibidor de Protease liofilizado (Calbiochem, Cat # 539131, Conjunto 1) é primeiro re-suspenso em 100 uL de água estéril para preparar um estoque de 100x. Utilizar imediatamente ou congelar em alíquotas a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Calcular 1 uL do estoque 100x para cada 10 7 células extraídas, conforme necessário.\nTodos os passos durante o procedimento de extracção deve ser realizada em gelo ou a 4 ° C para assegurar a estabilidade da proteína.\nEtiqueta 15 ml tubos de Falcon e colocar no gelo.\nRemover meios de crescimento a partir de células e lava-se duas vezes com 7,5 mL de PBS frio.\nAdicionar 5 mL de PBS frio a cada prato e as células de raspar a partir da placa utilizando uma levantador célula. Transferir as células para o 15 mL refrigeradas tubo Falcon.\nCentrifugar a baixa velocidade (500 xg, 4 ° C) durante 5 minutos. Remover o sobrenadantee estimar o volume globular, por comparação. (Até 250 uL de volume de células embalado pode ser processado num tubo mL único 1,5)\nCentrifugar durante mais um minuto a 1 500 xg e remover o PBS restante com uma pipeta. Ressuspender o sedimento de células em NucBuster Reagente de Extracção 1 de acordo com o tamanho do hematócrito: 150 ul de Reagente de Extração NucBuster 1 por volume da célula 50 uL embalado. (Alternativamente, o sedimento de células pode ser rapidamente congelados em gelo seco ou com azoto líquido e armazenadas a -80 ° C até estar pronto para prosseguir).\nDepois de re-suspensão, transferir para um tubo de lisado mL pré-refrigeradas 1,5.\n15 seg vórtice a alta velocidade, incubar em gelo durante 5 minutos, e novamente vórtice 15 seg a alta velocidade.\nCentrifugar a 13.000 xg durante 5 minutos a 4 ° C.\nSobrenadante contém fracção citoplasmática. Retire e guarde a -80 ° C ou descarte.\nRe-suspender o sedimento em uma mistura de 1 uL de re-suspenso Cocktail 100x inibidor de protease, 1 e mu; l de DTT 100 mM e 75 reagente de extração ul NucBuster 2 por volume de 50 ul de células embalado.\nCentrifugar a 13.000 xg durante 5 minutos a 4 ° C. Sobrenadante contém proteínas nucleares. Recolher o sobrenadante e prossiga para a próxima etapa.\n2,4 Diálise, a quantificação de proteínas e alíquotas\nTodas as etapas durante o procedimento de diálise devem ser realizados com pré-refrigerados soluções, materiais e equipamentos para garantir a qualidade extrato.\nPreparar tampão de diálise (1 L requerido por amostra), como detalhado na Tabela 3. Importante: Tampão deve ser frio (4 ° C). Sugerimos a preparar pelo menos um dia antes. Tampão de diálise filtrada pode ser armazenada a 4 ° C indefinidamente se DTT não tenha sido adicionado.\nPré-frio copos (2 copos de 1 L por exemplo), tampão de diálise, câmaras de diálise, micro-centrífugatubos, seringas e agulhas.\nLogo antes de usar - adicionar 1 mL 1 M DTT por litro de tampão de diálise.\nDialisar a lisado preparada no Passo 2,3 em 0,5 L de tampão de diálise pré-refrigerada durante 90 minutos a 4 ° C com agitação suave, utilizando um Slide-A-Lyzer PIERCE cassete de diálise (0,5-3 mL cassetes de diálise com 7.000 de corte MW).\nTransferir cassete de diálise para um segundo béquer contendo 0,5 L de tampão de diálise pré-refrigerados e dializar lisado durante 90 minutos a 4 ° C com agitação suave.\nRecolher a solução de proteína dialisada nuclear da cassete de diálise utilizando uma seringa (Fisher, cat # 309.659). Usar uma junta diferente do utilizado anteriormente para injectar a proteína na cassete de diálise. Note-se que o extracto pode ter cristalizado devido a concentrações de proteína elevadas. Tente incluir nublados cristais olhando ao remover a solução de proteína dialisado nuclear.\nAliquota da amostra a micro centrífuga-tubos, 20 uL cada uma. Congelamento rápido em gelo seco e store à temperatura de -80 ° C até à utilização.\nDeterminar a concentração da proteína dialisada usando protocolos padrão. Exemplos de esperados concentrações lisado nucleares são mostrados na Tabela 4.\nFinalmente, os lisados devem ser avaliados para controlo de qualidade. Avaliação dos lisados irá variar de acordo com a experiência. Como descrito anteriormente, rotineiramente analisar lisados para a expressão de proteínas BER vários via 1,2 immunoblot.\nO passo de diálise é usado para fazer uma solução de reacção uniforme através das linhas de células para facilitar a comparação. Omitindo o passo de diálise pode afectar as taxas de enzimáticas e análise cinética uma vez que as soluções salinas e condições de reacção já não são idênticas nas linhas celulares diferentes e preparações devido às várias diluições necessárias. No entanto, observou-se que utilizando lisados de maior do que 5 ug / uL e adicionando tampão de reacção suficiente não permite omissão da etapa de diálise (dados não mostrados). Para th estudos inibidorem não requerem comparação entre os lisados de células diferentes, a diálise pode não ser necessária. No entanto, é recomendável diálise, como indicado.\n3. Ensaio Beacon Molecular\n3.1 Requisitos para o equipamento\nUm quantitativa em tempo real instrumento de PCR, como StepOnePlus qRT-PCR ou comparável, ou um fluorómetro placa de 96 poços capaz de detectar e medir a fluorescência FAM em tempo real. Nota: Este procedimento é aplicável a qualquer máquina capaz de ler os valores de fluorescência das balizas e gravá-los em tempo real. A máquina deve, no entanto, permitem ao usuário acessar os valores brutos de fluorescência para análise de dados.\nCentrifugar compatível com ópticas qRT-PCR tubos ou placas sendo usados.\nMicrosoft Excel para analisar os dados coletados.\n3.2 Buffers e reagentes\nÓpticos qRT-PCR tubos ou placas com tampas correspondentes.\nBER tampão de reacção (ver umaBove e Tabela 2).\nProteína nuclear dialisada extrai como preparado no Passos 2,3 e 2,4 e diluiu-se a 2 ug / uL de proteína com BER tampão de reacção contendo DTT.\nBalizas molecular diluída para 200 mM com tampão de reacção BER para criar a solução balizas molecular de trabalho (ver acima).\n3,3 Ensaio de configuração (Tabela 5)\nA máquina de qRT-PCR não é normalmente usado como um fluorímetro de modo que o método de execução deve ser mudada.\nPrograma de uma primeira fase e definir a temperatura da reacção a 37 ° C com um tempo de ciclo (pontos de tempo para as medições) de 20 segundos com um mínimo de 180 ciclos (ou mais, dependendo do desenho do ensaio de reparação). Certifique-se de coletar dados durante os ciclos. Portanto, a máquina irá recolher dados a cada 20 segundos para um total de 1 hr.\nCriar uma segunda fase que as rampas a temperatura a Tmax, da baliza particular, a temperatura com fluorescência máxima, como determinado em Passo 1,3 (avaliação da qualidade do seu farol molecular). O tempo de ciclo deve ser novamente 20 segundos com um total de 15 ciclos. Isto irá recolher dados a cada 20 segundos durante 5 minutos à fluorescência máxima possível da baliza. Os valores de fluorescência medida durante os ciclos a Tmax é usado para normalizar os valores de fluorescência em cada poço (passo 4.2a). Se estiver usando várias balizas diferentes certifique-se de incluir as etapas que fornecem valores similares repetitivos para o Tmax dos faróis também.\nDefina o volume de reação de 25 ul.\nDefinir-se o design da placa na máquina qRT-PCR usando o software da Applied Biosystems do. Só estamos interessados nos valores brutos de fluorescência, é só selecionar a "Curva padrão" - tipo de experimento.\nPreencha o layout da placa. Um exemplo é mostrado na Tabela 5. Não acrescentar nada aos poços selecionados como a curva padrão.\n3,4 ensaio Run\nDiabinhoortant: material pré-refrigerados Uso e soluções. Mantenha-se fresco até execução e detecção.\nAdicionar quantidade apropriada de DTT para o tampão de reacção BER para ser usado.\nDiluir solução de proteína a uma concentração de 2 ug / uL usando tampão BER reacção (com DTT).\nPara as experiências iniciais, sugerem a utilização 10 ug de lisado nuclear dialisada por poço (5 uL / poço) e 1 pmole de substrato, a baliza molecular a uma concentração de 40 nM final (5 uL / poço). Nós temos consistentemente obtido de alta qualidade e os resultados reprodutíveis com 10 ug de lisado de células, embora seja possível que os lisados de células diferentes ou substratos da baliza podem ditar concentrações de proteína inferiores ou superiores.\nOs componentes de ensaio em cada poço são de 15 uL de tampão de reacção BER, 5 uL baliza e 5 uL de lisado nuclear. Executar cada combinação farol / lisado em triplicata.\nVários controles negativos são necessários para cada farol, inclusive amostras sem farol, como 25 emu; L de tampão de reacção BER apenas, e 20 uL de tampão de reacção BER com 5 uL lisado e 20 uL de tampão de reacção BER com 5 uL de baliza sem lisado.\nVárias amostras de controlo são necessários para cada lisado nuclear. Estes incluem um controle negativo [15 tampão de reação uL BER, 5 farol controle uL (sem lesão) e 5 lisado amostra uL]. Sugerimos também a incluir experimentais controles positivos, tais como a inclusão de THF contendo balizas que imitam sítio abásico contendo oligos e são facilmente incisão [15 tampão de reação uL BER, 5 uL farol THF e 5 lisado uL da amostra]. Naturalmente, o controlo preciso positiva irá depender da concepção global experimental.\nComo um exemplo, siga Tabela 5 abaixo para a disposição da placa.\nPipetar em tubos ópticos ou placas, enquanto em gelo ou suporte arrefecida para minimizar a iniciação da reacção antes da detecção do sinal.\nPipetar tampão de reação BER primeiro em todos os poços.\nO beacons pipeta n de acordo com o layout da placa em poços corretos e sempre pipeta lisados última em poços para minimizar a reação de iniciação antes da detecção do sinal.\nTubos de vedação ou a placa completamente, misturar e girar com uma centrífuga para reunir as soluções para a parte inferior dos tubos ou placas\nInsira placa em qRT-PCR máquina e começar a ensaio.\nApós a conclusão, exportar dados brutos, de preferência em formato Excel. Para o sistema de StepOnePlus apenas os dados multi-componentes são necessários. Este contém todos os valores de fluorescência no várias leituras classificadas por cor do corante e bem.\n4. Análise Ensaio Molecular Beacon\nUsamos o software Microsoft Excel para executar essas análises e cálculos. Recomendamos que estabelecem modelos e macros que permitem a análise rápida e fácil e exibe gráficos com base em dados provenientes de formatos padrão de 96 poços.\n4,1 remoção do fundo\nUtilizando os valores brutos de fluorescência a partir dos dados multi-componentes, em primeiro lugar organizar os dados por poço de amostra /. Para o sistema de StepOnePlus isto pode ser conseguido através da exportação os dados "em colunas", resultando em um arquivo Excel com as linhas visualizar múltipla indivíduo lê com os ciclos diferentes para os diferentes poços em colunas.\nPara cada baliza indivíduo molecular, subtrair os valores de fundo de fluorescência detectados nos controlos negativos (20 uL de tampão de reacção e BER 5 uL de baliza) a partir dos valores de fluorescência em cada ciclo em que todos os poços utilizando farol molecular. Isto remove as alterações do fundo de fluorescência não associados com o lisado de análise futura.\nFl 4,2 normalização (Tmax)\nPara abordar a variabilidade na pipetagem e detecção de fluorescência em poços diferentes, normalizar os dados para os valores máximos de fluorescência (que se correlacionam com a entrada baliza).\nCalcule os valores médios de fluorescência de ciclos em T max para o indivíduo bem: Fl (T max) (passo 3.3aii).\nCalcule o Fl rácios (ciclo x) / Fl (T max) e multiplicar por 100. Sob a suposição de provável que Fl (T max) corresponde ao valor máximo possível de fluorescência quando totalmente incisão, estes dados normalizados representam% livre FAM (= baliza BER% incisa).\nCombinar as amostras em triplicado calculando a média dos dados (% livre FAM) dos 3 poços para cada ciclo (até o ciclo 180) e calcular os erros em cada um.\nCalcular vezes multiplicando 20 seg a cada ciclo.\nUma vez que a variância bem-a-bem na detecção de fluorescência pode ser significativo, é recomendável adicionar um corante fluorescente, tais como ROX ao estoque farol molecular que serve como padrão para re-ajustar os valores de fluorescência dos poços individuais. Neste caso, o corante ROX seria utilizado como um padrão interno (referência passiva) em cada único poço. ROXOs espectros de excitação e emissão (excitação - 588 nm, emissão nm 608) é distinta da do corante 6-FAM utilizado no ensaio (excitação - 495 nm, emissão - 520 nm). O corante ROX permitiria um passo de normalização semelhante ao RT-PCR convencional procedimentos que permite que a normalização de bem-a-assim diferenças que podem ocorrer devido a artefactos. Estes podem resultar de pipetagem erros ou podem ser originários de bem-a-assim variação na eficiência de detecção de fluorescência.\nLote dados de fluorescência normalizados (% livre FAM) contra o tempo (em segundos) em um gráfico de dispersão com os erros correspondentes.\nSugerimos análise cinética de reparação em pelo menos três diferentes preparações de lisados nucleares que representam repetições biológica. Para avaliar a variação, inter-experimentais erros calculados a partir das médias de cada experiência individual deve ser exibido.\nUma análise representativa de dois lisados de células tumorais: LN428, um gliomalinha de células com níveis indetectáveis de metil purina DNA glicosilase (MPG) e LN428/MPG, a linha celular mesmo concebido para expressão elevada de MPG; ambas as linhas celulares têm níveis equivalentes de AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. Cada foram sondadas para APE1 actividade e actividade MPG usando o BER THF Molecular Beacon (Figura 3) e do BER Hx Molecular Beacon (Figura 4), onde THF = tetra-hidrofurano (um substrato para APE1) e Hx = hipoxantina (um substrato para MPG) . Nota: Na Figura 3 (substrato THF), os resultados dos lisados LN428/MPG mostram uma baixa fluorescência máxima absoluta, em comparação com os LN428 lisados. Este é o resultado de um valor mais baixo farol de entrada, tal como determinado usando valores Tmax (ver 3.3a). Quando este valor mais baixo foi usada para normalizar os resultados, que resulta em uma grande alteração na trama. Esta bem ilustra a importância de normalizar os dados. Plotando os valores absolutos de fluorescência por si só, sugerem a repaas taxas de infravermelho entre LN428 e as células LN428/MPG são diferentes. No entanto, quando os dados são normalizados para considerar a variabilidade bem-a-assim, o APE1 mediada diferença da taxa de reparação é mostrado para ser mínima.\nNós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células nucleares lisados utilizando base excisão de reparação (BER) balizas molecular (Figura 1). Uma vez recozido, sugerimos realizar uma análise da curva de fusão (Tabela 1) como uma avaliação da qualidade do seu farol molecular (Figura 2). Lisados nucleares podem então ser preparados, utilizando os componentes do tampão listados na Tabela 2. Dialisar a lisado em 0,5 L de tampão de diálise pré-refrigerada durante 90 minutos a 4 ° C com agitação suave, utilizando uma cassete de diálise PIERCE Slide-A-Lyzer contra o tampão de diálise listados na Tabela 3. Recolher osolução de proteína dialisada nuclear da cassete de diálise utilizando uma seringa. Usar uma junta diferente do utilizado anteriormente para injectar a proteína na cassete de diálise. Determinar a concentração da proteína dialisada usando protocolos padrão. Exemplos de esperados concentrações lisado nucleares são mostrados na Tabela 4. Executar a reacção, tal como indicado acima (passo 3.4), utilizando o esquema de placa, como mostrado na Tabela 5. Uma análise representativa de dois lisados de células tumorais: LN428, uma linha celular de glioma com níveis indetectáveis de metil purina DNA glicosilase (MPG) e LN428/MPG, a linha celular mesmo concebido para expressão elevada de MPG; ambas as linhas celulares têm níveis equivalentes de AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. Cada foram sondadas para APE1 actividade e actividade MPG usando o BER THF Molecular Beacon (Figura 3) e do BER Hx Molecular Beacon (Figura 4), onde THF = tetra-hidrofurano (um substrato para APE1) e Hx = hipoxantina(Um substrato para MPG). Finalmente, usando uma dU BER / A farol molecular que relatórios sobre a actividade glicosilase de uracilo, mostramos que a saída de sinal ou a força do sinal é máxima no 10μg de proteína e diminui para um nível indetectável em 0,62 mg de proteína (Figura 5).\nFigura 1. Estrutura global da baliza BER Molecular. É mostrada a sequência e concepção global das balizas BER Molecular aqui utilizadas como uma molécula de cadeia simples, depois do recozimento e novamente depois de fusão. O negrito, itálico porção da sequência é a haste (15 bases) ea porção sublinhada da sequência é a malha (13 bases). FAM = 5 'corante fluorescente 6-Carboxifluoresceína [na extremidade 5'; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, coeficiente de extinção (260 nm): 20.960; coeficiente de extinção (no absorvância max): 75.000] e DABCYL = o quenching 3 'agente Dab cil [no extremo 3 '; Abmax = 453 nm; Faixa Quenching = 425-520 nm] X = lesão (varia de acordo com a questão de pesquisa) e Y = base o oposto da lesão (varia de acordo com a questão de pesquisa). .\nFigura 2. Derreter Curva. Uma curva de fusão representativo é mostrado para o controle da baliza BER Molecular (A), e as balizas BER molecular contendo o tetra-hidrofurano porção (THF) (B) ou a porção Hipoxantina (Hx) (C). Concentrações de oligonucleotídeos variou de 0 nM (azul escuro), 8 nm (vermelho), 16 nm (verde), 32 nm (violeta), 64 nM azuis para 128 nM (laranja). Tal como descrito no Passo 1,3, os oligonucleótidos hibridados foram aquecidos de 25 ° C a 95 ° C em 0,5 ° C intervalos e do sistema de StepOnePlus é programado para medir FAM fluorescência em cada intervalo de 0,5 ° C.\nFigura 3. Os dados representativos utilizando o BER THF farol molecular. AP actividade de endonuclease específica para a hidrólise do sítio abásico analógico tetra-hidrofurano (THF) foi medido em lisados nucleares a partir da linha celular de controlo (LN428) ea MPG a sobre-expressão linha de células (LN428/MPG) . Cada lisado foi analisada usando o BER Controle Beacon Molecular (LN428, verde; LN428/MPG, púrpura) ou a BER THF Molecular Beacon (LN428, azul; LN428/MPG, vermelho). Os resultados são reportados como (a) a média unidades de resposta de fluorescência e (B) os mesmos dados normalizados para a entrada baliza como descrito na Secção 4 acima (THF = tetra-hidrofurano).\nFigura 4. Os dados representativos utilizando o BER Hx Molecular Beacon actividade glicosilase de ADN específico para a remoção do substrato MPG hypoxanthine (Hx) foi medido em lisados nucleares a partir da linha celular de controlo (LN428) ea MPG a sobre-expressão linha de células (LN428/MPG). Cada lisado foi analisada usando o BER Controle Beacon Molecular (LN428, verde; LN428/MPG, púrpura) ou a BER Hx Molecular Beacon (LN428, azul; LN428/MPG, vermelho). Os resultados são reportados como (a) a média unidades de resposta de fluorescência e (B) os mesmos dados normalizados como descrito na Secção 4 acima (Hx = hipoxantina).\nFigura 5. Os dados representativos utilizando o dU BER / A farol molecular em diferentes níveis de proteína. DNA glicosilase (UNG) actividade específica para a remoção de uracilo (dU / A) foi medido em lisados nucleares a partir de células T98G. O lisado T98G foi analisada utilizando o BER Controlo farol molecular ou o dU BER / A farol molecular, em níveis de proteína de 10, 5, 2,5, 1,25 ou 0,62 ug, tal como indicado na fIGURA. Os resultados são dados normalizados conforme descrito na Seção 4 acima.\nConcentração de baliza (nM) 0 8 16 32 64 128\nSolução Beacon Molecular de trabalho (200 nm) adicional (uL) 0 1 2 4 8 16\nBER tampão de reacção (w / o DTT) (uL) 25 24 23 21 17 9\nTabela 1. Esquema de um experimento de curva de fusão.\n1 Total L Volume da solução de reserva necessária Con. da solução de reserva Con Final.\nHEPES-KOH 25 mL 1M pH 7,8 25 mM </ Td>\nEDTA 1 mL PH 8,0 0,5 M 0,5 mM\nGlicerina 10 mL N / A 1%\nDTT (adicionar antes do uso) 0,5 mL 1 M 0,5 mM\nH 2 S 888,5 mL N / A N / A\nTabela 2. BER tampão de reacção.\nHEPES-KOH 50 mL 1M pH 7,5 50 mM\nGlicerina 200 mL N / A 20%\nDTT (adicionar antes do uso) 1 mL 1 M 1 mM\nH 2 S 698 mL N / A N / A\nTabela 3. Tampão de diálise.\nLinha de células Concentração de proteína (mg / mL)\nTabela 4. Determinação resultados de proteína.\nControlo Negativo 25μL BER Tampão (Controle de Fundo) 20 uL BER Tampão\nNO lisado (Teste em triplicado) <br /> 15μL BER Tampão\n5μL LN428 Lysate (Teste em triplicado)\nBER 15μL tampão\nNO lisado (Teste em triplicado) 15μL BER Tampão\n5μL LN428 Lysate (Teste em triplicado) 15μL BER Tampão\n20 uL BER Tampão\n5μL lisado (Controle de Fundo) 20 uL BER Tampão\nNO lisado (Teste em triplicado)\nLy LN428/MPG 5μLsaciar\nTabela 5. Ensaio Beacon Molecular set-up.\nExistem mais de 600 citações usando "farol molecular" o prazo para detectar e quantificar as inúmeras moléculas e as atividades enzimáticas, incluindo atividade de helicase 6, atividade DNA polimerase 7,8, a atividade DNA ligase 9, a atividade da telomerase 10, a atividade DNA fotoliase 11 e DNA / RNA híbridos 12, entre muitos outros. Além da utilização de balizas molecular para a medição das actividades de ADN de reparação listados acima, nós e outros demonstraram a utilidade destas sondas para a análise de BER actividade 1,2,13-15.\nO tempo real ensaio de actividade BER descrevemos aqui incorpora uma única base modificada e permite a avaliação quantitativa das taxas de BER para diferentes lesões ou alterações na base oposto da lesão. As aplicações podem variar de estudos moleculares mecanicistas às telas inibidores. Nós demonstramos especificidade BER comparando Lysates de MPG células que expressam com não-células que expressam e falta de atividade na beacons controle. O ensaio é altamente sensível, permitindo a detecção de defeitos na expressão de proteínas a MPG BER 2 ou XRCC1 1 e é suficiente para detectar pequenas alterações nos parâmetros de ADN de reparação cinéticos e da eficácia dos inibidores de reparação do ADN [manuscrito em preparação]. Várias leituras ao longo do apoio ativo o tempo de reparação calcularam as taxas cinéticas ea importância em quaisquer mudanças nessas taxas cinéticas. O RIC ensaio farol molecular é, portanto, adequada para alto rendimento estudos para a tela para os inibidores de enzimas de reparo do DNA (telas de inibidores) ou para estudos sobre o papel de cada um dos componentes nucleares. A análise dos lisados nucleares permite a avaliação de reparação do ADN no contexto completa do complexo de BER, consequentemente, também descreve as alterações indirectas ou influências sobre a maquinaria BER (por exemplo, modificações pós-tradução ou mutações).\nOprotocolo, como descrito, deve produzir resultados altamente reprodutíveis e quantitativa. No entanto, existem vários detalhes a considerar para garantir a análise apropriada: (1) Os valores de fundo de controlos negativos pode ser demasiado elevado: Isto pode ser devido a mau armazenamento ou o fabrico do oligonucleótido. Valores de fundo de alta nos lisados sem balizas indicam fluorescência auto confusão (ou seja, contaminação ou expressão celular de proteínas fluorescentes exógenos). Se a expressão de uma proteína fluorescente é inevitável, os espectros de excitação / emissão para o corante repórter e proteína fluorescente não podem sobrepor-se, (2) Fl (Tmax) é baixa: concentração de ADN é diferente do dado. Verifique a concentração de DNA por espectrofotometria (OD 260 nm), por exemplo, utilizando o Nanodrop. Alta concentração de DNA com baixo Fl (Tmax) indica um carregamento FAM insuficiente sobre as balizas. Purificação por HPLC impede a contaminação com ADN não modificado (ver acima), (3) actividade de reparação é pobre: Se o FL (Tmax) valores emúltimos ciclos indicam entrada baliza suficiente e detecção por fluorescência, isto pode sugerir que a preparação extracto nuclear falhou. Qualidade extrato nuclear é crucial. Baixas temperaturas deve ser assegurada durante todo o procedimento incluindo armazenamento a longo prazo a -80 ° C e (4) as curvas de actividade de reparação iniciar com valores elevados de exposição: Mesmo muito curto das amostras à temperatura ambiente antes da análise inicia reparação. Mantenha fresco em todos os momentos.\nEste ensaio BER altamente sensível e quantitativo é também aplicável para a análise de proteínas purificadas, permitindo estudos sobre a especificidade do substrato, alterando as balizas molecular em conformidade. Finalmente, o ensaio é aplicável a análise de tumor e os lisados de tecido, proporcionando uma oportunidade para medir parâmetros de reparação de ADN funcionais como biomarcadores de resposta ou a eficácia terapêutica, como já sugerido para avaliar tumores para PARP1 potenciação inibidor da temozolomida agente alquilante 2.\nRWS é consultor científico Trevigen, Inc. O resto dos autores declaram que não existem conflitos de interesse.\nEste trabalho foi financiado por doações da Fundação Pittsburgh e pelo National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] para RWS. Suporte para o Mecanismo de UPCI Lentivirus foi fornecido RWS pela Grant Suporte Cancer Center do National Institutes of Health [P30 CA047904]. O suporte também foi fornecida pelo Departamento da Universidade de Pittsburgh de Farmacologia e Biologia Química para DS. Foi também prestado apoio por ESTRO para CV.


Vestidos de Noiva com Decote em V | Noivas do Rio de Janeiro\nInício » Vestidos de Noiva com Decote em V\nPublicado em: 18/03/2019 por: Noivas do Rio de Janeiro\nSabemos que escolher o vestido de noiva ideal é uma tarefa tão esperada quanto difícil. Se às vezes já é difícil decidir o look do dia a dia, imagine para o momento mais importante da sua vida! Por isso, sempre tentamos trazer dicas para ajudar. Hoje, vamos indicar vestidos de noiva com decote V da Internovias e Noivas do RJ.\nO decote em V é uma ótima opção, porque valoriza o colo e alonga a silhueta, dando a sensação de que a pessoa é mais alta e esbelta. O efeito fica muito bonito tanto pessoalmente como nas fotos. Veja, a seguir, como esse decote pode aparecer!\nQue tal ousar e escolher uma peça que tenha decote em V tanto na frente quanto nas costas? Este é um bom exemplo, inclusive, é um modelo super sensual, pois o decote é profundo dos dois lados e ainda tem transparência, mas continua sofisticado!\nUma opção mais discreta nesse mesmo modelo é esta, perfeita para casamento durante o dia, em um local aberto.\nSe você não abre mão do tradicional vestido com saia ampla, também pode escolher um que tenha esse estilo de decote, para deixá-lo mais moderno. Veja este exemplo lindo.\nUma forma de usar o decote em V nos vestidos de noiva é com maior profundidade, aquele que chega perto do umbigo, mas que tem detalhes que equilibram o visual, como um tule ou até mesmo um design que o deixe mais estreito na medida em que desce. Neste modelo, é exatamente isso que acontece, o decote é bem profundo, mas ainda assim fica discreto e muito elegante.\nNesta peça, o tule deixa o decote bem mais discreto.\nO mesmo acontece com esta outra. Isso prova que as noivinhas podem investir em um decote bem profundo sem perder a delicadeza da peça e sem ousar demais, caso não seja o seu estilo.\nDecote em V x coração\nSe você quer aproveitar as vantagens do decote em V de uma forma ainda mais romântica, escolha versões que remetem ao decote coração, o mais romântico de todos. Este é um exemplo, observe como o desenho na região do busto lembra o arco do coração. Essa modelagem, com uma leve diferença entre o corpo e a saia, também é mais delicada.\nEsse estilo de decote também é o deste vestido. Aliás, aqui, o coração é ainda mais evidente! E o modelo semi-sereia com cintura marcada já se tornou um clássico que não sai mais de moda.\nDica extra: se optar por usar colar com esse tipo de vestido, aposte naqueles que acompanham o desenho do decote, ou seja, que também têm o formato em V. Ou substitua o colar por brincos mais longos, que também criam uma composição bem luxuosa.\nO decote em V para noivas é perfeito para valorizar o corpo e fazer você se sentir ainda mais linda! Confira outras opções de vestidos da Internovias e Noivas do RJ com essa característica e encante-se!


Diretoria | IPLA - Instituto da Psicanálise Lacaniana\nPresidente: Jorge Forbes\nPsicanalista e médico psiquiatra, em São Paulo. Doutor em Ciências pela Universidade de São Paulo - USP - Faculdade de Medicina (Neurologia). Doutor em Teoria Psicanalítica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ. Mestre em Psicanálise pela Universidade Paris VIII. A.M.E. - Analista Membro da Escola Brasileira de Psicanálise e da Escola Europeia de Psicanálise. Membro da Associação Mundial de Psicanálise - AMP. É um dos principais introdutores do ensino de Jacques Lacan no Brasil, de quem frequentou os seminários em Paris, de 1976 a 1981. Teve participação fundamental na criação da Escola Brasileira de Psicanálise, da qual foi o primeiro diretor-geral. Preside o Instituto da Psicanálise Lacaniana - IPLA e o Projeto Análise (www.projetoanalise.com.br). Dirige a Clínica de Psicanálise do Centro do Genoma Humano - USP. Tem artigos publicados no Brasil e no exterior; é autor, dentre outros livros, o mais recente: “Inconsciente e Responsabilidade – Psicanálise do Século XXI”, em que estuda as mudanças necessárias a uma psicanálise para os tempos pós-modernos, além do Édipo. Também escreveu Você quer o que Deseja? Da palavra ao gesto do analista e, em coautoria, A Invenção do Futuro, em que pensa soluções para viver na era de quebra dos ideais. Colabora com a grande imprensa, sendo curador e conferencista do Café Filosófico da CPFL – TV Cultura (vídeos: http://migre.me/diXB). Por seus trabalhos sobre as novas formas de viver na pós-modernidade, tem sido consultado por hospitais, escolas e empresas.\nDiretora-Superintendente: Teresa Genesini\nPsicanalista. Participa da Clínica de Psicanálise do IPLA e da Clínica de Psicanálise do Centro de Estudos do Genoma Humano - USP. É pesquisadora do Projeto Análise, coordenado por Jorge Forbes. Tem trabalhos apresentados em congressos nacionais e internacionais. Graduada em matemática e mestre em estatística pela UNICAMP, trabalhou com assessoria estatística para pesquisas acadêmicas e para instituições de ensino. Coordenou, desenvolveu e implantou sistemas de avaliação educacional no SENAI e no Departamento de Planejamento e Orientação da Secretaria Municipal de Educação de São Paulo. Lecionou matemática e estatística em cursos de administração, economia e psicologia.\nDiretora-Tesoureira: Liége Lise\nPsicóloga e psicanalista. Coordenadora da Clínica Escola do IPLA. Pesquisadora da Clinica de Psicanálise do Centro de Estudos do Genoma Humano – USP. Participante do Projeto Análise dirigido por Jorge Forbes.\nDiretora-Secretária: Daniela Magalhães\nFormada pela Faculdade de Direito Padre Anchieta, com especialização em Direito Processual Civil pela Pontifícia Universidade Católica de São Paulo - PUC-SP e LL.M. Master of Laws em Direito Societário pelo IBMEC São Paulo. Advogada com atuação na área do Direito de Civil, contencioso e consultoria, especialmente em Contratos, Direito Socitário e Direito de Família. Foi pesquisadora do Projeto Análise coordenado por Jorge Forbes e colaborou na realização de cursos e debates com o objetivo de proporcionar a conversa entre o Direito e Psicanálise.\nJorge Forbes - diferenças entre psiquiatria, psicoterapia e psicanálise


Dilma não dará entrevista; Governo escala ministro para visitar Paraíba :: Vale News PB\nINICIO > Dilma não dará entrevista; Governo escala ministro para visitar Paraíba\nDilma não dará entrevista; Governo escala ministro para visitar Paraíba\nA Assessoria de Imprensa da Presidência da República entrou em contato na tarde desta quinta-feira (11) com o Portal MaisPB para esclarecer a informação de entrevista da presidente Dilma Roussef uma emissora de rádio da Paraíba, neste sábado, ocasião em que a petista anunciaria liberação de empréstimo de R$ 700 milhões ao Governo do Estado.\nA Diretoria de Relações com a Imprensa Regional atribuiu a informação a um ruído de comunicação. Esclareceu que a Secretaria da Presidência chegou a sondar emissora de João Pessoa sobre a entrevista da presidente, mas esta seria focada no esforço nacional de combate ao vírus da Zyka.\n“Houve apenas uma sondagem e a pauta seria de combate ao Aedes, nosso grande foco no momento”, informou a Diretoria, acrescentando não ter informações e nem autonomia para falar de empréstimo. Manifestou, ainda, preocupação quanto à expectativa gerada na população.\nAo invés da entrevista de Dilma, o ministro do Turismo, Henrique Eduardo Alves (PMDB), foi escalado para estar em João Pessoa, reforçando a campanha de combate ao mosquito transmissor do vírus da Zyka.\nAntes, a Secretaria da Presidência enviou nota negando articulação da entrevista. “Qualquer informação diferente não foi divulgada pela assessoria de imprensa da Presidência da República”.\nMais cedo, o Portal MaisPB divulgou que o Governo ultimava os preparativos para anunciar a liberação do empréstimo de R$ 700 milhões ao Estado da Paraíba. O empréstimo junto ao Banco do Brasil foi aprovado pela Assembleia Legislativa em dezembro do ano passado e carecia de aval federal.\nNo começo da manhã, funcionários da Secretaria de Imprensa da Presidência iniciaram a articulação da entrevista. Com o vazamento da informação, via fontes de Brasília, o movimento foi abortado.


Apartamento de 03 dormitórios (01 suíte), próximo ao Shopping Cassol da Sertório, na Zona Norte. Condomínio com 3 torres e 8 andares cada. Cozinha americana, living amplo e gás central. Piso laminado em todas as peças. Condomínio com portaria 24 horas, piscina, fitness, salão de festas, salão de jogos, espaço zen, quiosques com varias churrasqueiras e quadras de esportes. Todos os espaços finamente decorados e mobiliados, padrão Goldzstein. Uma vaga de garagem. Vale a pena conferir!!!\nApartamento de 2 dormitórios com 37m², sem vaga. Todo reformado. Excelente condomínio com portaria 24hrs, próximo à Escola São Francisco, pontos de ônibus, supermercado e farmácia. Agende sua visita.\nApartamento de um dormitório bem amplo e bem arejado , living para dois ambientes bem definido e aconchegante, banheiro social azulejado, cozinha ampla com área de serviço integrada. Imóvel localizado no segundo andar , um lance de escada, todo gradeado. Próximo a todos os recursos que o bairro oferece, tais como ponto de ônibus, escolas, posto de saúde, comércios em geral. Agende sua visita.\nR$ 278.000 - Condomínio: R$ 200\nApartamento de 3 dormitórios sendo 1 suíte com vaga de garagem no bairro Boa Vista em Porto Alegre. Condomínio com baixo custo.Rua tranquila de fácil acesso. Entre Anita Garibaldi e próximo a Plínio Brasil Milano.Amplo living com sacada integrada e espera p churrasqueira, cozinha, área de serviço separada, banheiro social. Prédio com elevador, portaria 24 horas, salão de festas, gás central, cancha de esporte,play ground,fachada do prédio c/ pintura e textura,OBS.ficam todos os moveis fixos...VALE APENA CONFERIRObs\nR$ 439.000 - Condomínio: R$ 520\nApartamento de 2 dormitórios, reformado e 1 banheiro. Cozinha e área se serviço. Prédio não possui condomínio. Churrasqueira. Possui 1 vaga de garagem coberta...\nApartamento no Bairro Santana de 01 dormitório, living 02 ambientes, cozinha com moveis sob medida, área de serviço separada e banheiro social.\nApartamento de dois dormitórios na Cidade Baixa. Apartamento, semimobiliado, com 99,77m² de área privativa, todo em piso cerâmico, amplo dormitório de casal, hall, living para três ambientes com lareira e sacada fechada com churrasqueira, lavabo, banheiro social, copa-cozinha e área de serviço. Vaga de garagem coberta e escriturada. Imóvel em andar alto, fundos, silencioso, ótima ventilação e luminosidade. Edifício em localização privilegiada, no coração da Cidade Baixa, dois elevadores, portaria 24 horas e jardim frontal com gradil. Proximidades do Zaffari da Lima e Silva e todos recursos que o bairro oferece.\nApartamento diferenciado com 103m² l Pátio privativo l 2 dormitórios l 1 garagem NOVO, com ótima iluminação e ventilação 215.000 - aceita financiamento Infra completa: portaria 24 horas l piscinas adulto e infantil l 2 salões de festas l playground l Academia l sala de jogos l quiosques c/churrasqueiras l quadra poliesportiva l vagas para visitantes\nR$ 213.000 - Condomínio: R$ 340\nApartamento diferenciado com 103m² l Pátio privativo l 2 dormitórios l 1 garagem NOVO, com ótima iluminação e ventilação. Condomínio com infraestrutura completa de lazer. Portaria, salão de festas, piscina adulto e infantil, espaço kids, área verde, playground, quadra e muito mais. Baixa taxa condominial. Contate a Leffe Imóveis e faça o melhor negócio.\nR$ 426.000 - Condomínio: R$ 460\nApartamento com dois dormitórios na Cidade Baixa!! De frente, andar alto, muito arejado e vista para o bairro e redenção. Sala espaçosa, cozinha, área de serviço separada, banheiro com ventilação direta e deposito exclusivo. Prédio com lindo salão de festas, churrasqueira, fitness e portaria.\nApartamento de 03 dormitórios no bairro Navegantes, com 99,20 de área privativa, living dois ambientes com sacada fechada, 1 suite, banheiro social e auxiliar, dependencia de empregada, 1 vaga de garagem fechada e escriturada,predio com elevador proximo a Farrapos, aceita financiamento e fgts. Agende sua visita!!!!


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Home > Notícias > Notícias internacionais > Lentidão na tomada de decisões atrasa soluções para a crise na zona euro\nLentidão na tomada de decisões atrasa soluções para a crise na zona euro Notícias do dia\nEurogrupo diz que Grécia não vai sair da moeda única mas a decisão sobre o desembolso de uma nova fatia de ajuda ao país foi adiada até novembro.\nOs países da zona do euro conseguiram, pelo menos, um acordo na noite de ontem sobre as garantias pedidas pela Finlândia para conceder novos empréstimos a Atenas. Os ministros das Finanças têm estado a debater o reforço dos poderes do fundo de socorro e a opção de aumentar a sua capacidade de actuação via Banco Central Europeu aos países mais fragilizados.\nActualmente, o FEEF tem uma capacidade para empréstimos de 440 mil milhões de euros, um montante considerado insuficiente caso Bruxelas se veja obrigada a resgatar outras economias em dificuldade.\nEm Bruxelas a jornalista da Euronews, Margharira Sforza considera que segundo alguns analista o processo europeu para aprovar o pacote de reformas tornou-se muito lento e que resta saber se ainda vão ser tomadas a tempo acalmar as tensoes nos mercados e assim poder ser evitada uma tragédia grega.


Com quase certeza absoluta afirmo que você nunca ouviu falar do Silent Mangá Audition (SMA). Tal evento reúne artistas do mundo todo com o intuito de desenvolver histórias sem diálogos entre os personagens. O propósito é criar uma obra que qualquer um possa “ler” e entender a mensagem.\nApesar de ter competidores do mundo todo, e de existir a 8 anos, é impressionante que ninguém aqui da equipe da Cúpula nunca tenha ouvido falar do Silent Mangá Audition, eesse extraordinário evento online que acontece duas ou até três vezes por ano.\nEntão, chega de enrolação e vamos falar do evento que pode até mesmo garantir uma viagem com tudo pago pro Japão e, ainda, a oportunidade de trabalhar numa editora japonesa!\nO que é o Silent Mangá Audition, ou SMA?\n“Para ter sucesso em expressar uma história, é preciso imagens refinadas, capazes de comunicar com o leitor sem o uso de diálogo. Entusiasmar e entreter os leitores de todo o mundo, superando as barreiras linguísticas é o verdadeiro objetivo do SILENT MANGA AUDITION®!”\nAcredito que o trecho acima resuma bem este evento.\nO SMA foi criado por ninguém mais ninguém menos que Nobuhiko Horie; ex-editor-chefe da Weekly Shounen Jump e fundador da Coamix.\nEm outras palavras, uma das cabeças por trás da revista de mangás mais vendida do mundo. Esta, em seu auge, chegou na extraordinária marca de mais de 1 milhão de vendas por dia!\nA primeira edição do Silent Mangá Audition aconteceu em 2012, organizada pela equipe da Coamix que também são jurados das edições. E esses artistas estão entre os mais respeitados no Japão.\nQualquer pessoa do mundo pode participar do Silent Mangá Audition?\nSim, jovens! Qualquer pessoa!\nFaz sentido, visto que ideia principal do evento é que qualquer um, independente de sua nacionalidade, possa mostrar seu talento e compartilhar suas histórias com pessoas que estão do outro lado do mundo.\nDesde que não haja diálogos.\nEu, após ler todas as obras da competição, posso afirmar que em todas às edições tem bastante pessoas talentosas da Rússia, Tailândia, Itália e principalmente, do Brasil.\nResumo das regras do SMA\nComo dito anteriormente, o mangá não pode conter diálogos. Apesar de que mensagens em livros ou placas podem estar escritas no idioma que o autor preferir. Podem também haver onomatopeias e sinais como “!” ou “?”.\nEntretanto, os personagens não podem se comunicar com diálogo escrito.\nO número de páginas é limitado em cada edição, mas nunca superando 31 páginas.\nÀs páginas devem estar no modelo de mangás, sendo assim, da direita pra esquerda (durrr).\nApesar do tamanho e da quantidade de páginas serem reduzidos, é altamente recomendado utilizar duas páginas para formar um panorama.\nO participante deve trabalhar de acordo com o tema proposto naquela edição.\nOs jurados irão julgar a capacidade da obra em transmitir a mensagem sem haver nem um diálogo, e o impacto da mesma.\nPara mais detalhes das regras e informações de como participar, clique aqui para dar uma olhada em tudo. Porém, tudo em inglês. Get ready.\nUm pouco sobre os Jurados do SMA\nOs jurados são formados por quatro mangakás da “velha guarda” do ramo, artistas que revolucionaram estilos de mangás. Eles criaram novos estilos, novas formas de narrativa e deram inicio a toda uma nova geração em sua época.\nTsukasa Hojo foi um dos precursores do mangá com estilo realista. Ele foca em enredos que são mais voltados mais para a realidade. Suas principais obras são Cat’s Eye, City Hunter e Angel Heart. Ele também é um velho amigo de Tetsuo Hara (logo abaixo). Além disso, Hojo foi o mentor de Tekehiko Inoe, autor dos megahits Vagabond e Slam Dunk.\nTetsuo Hara é o ilustrador e co-criador por trás do lendário e muitíssimo famoso Hokuto no Ken. Este mangá, que foi publicado durante seis anos pela Shoune Jump, inspirou todo um estilo de obras “porradeiras” que perduram até hoje.\nRyuji Tsugihara autor de Yoroshiku Mecha-Doc, Restore Garage 251, ‘Shonen Readom, etc. Ele também é diretor na Coamix.\nJun Tomizawa autor de Commander Zero, Kigyō Senshi Yamazaki, Koroshiya Menkichi, etc. É consultor no SMA.\nÀs premiações do Silent Mangá Audition\nAntes de tudo, preciso ressaltar que toda edição do Silent Mangá Audition conta com premiações e selos diferentes.\nAcredito eu que a equipe da Coamix ainda está decidindo quais os melhores nomes e tipos de premiações. Porém, uma coisa não muda: todos os participantes conseguem pontos de “prestígio” de acordo com a premiação.\nLogo após a participação, os pontos ficam registrados no perfil do artista. Os jurados podem decidir entregar-lhes os dois prêmios mais cobiçados:\nViagem para o Japão com tudo pago;\nParticipação do MASTERCLASS, aulas de mangá diretamente com os mestres e a oportunidade de trabalhar na Coamix.\nDessa maneira, na 13ª edição do SMA, tivemos premiações que variam entre uma menção honrosa, um prêmio em dinheiro de 30.000 ¥ (cerca de 1.500,00 reais) até 500.000 ¥ (cerca de 25.000,00 reais).\nVale lembrar também que não existe número fixo de ganhadores.\nSendo assim, em cada edição podem haver dois ou mais participantes ganhadores do GP (prêmio máximo), tanto quanto pode não haver nenhum ganhador. Tudo depende dos jurados.\nAlém disso, cada nova edição do SMA pode haver uma premiação especial.\nNa ultima competição, ocorrida em janeiro de 2020, o evento deu um importante passo para o reconhecimento mundial. Uma das premiações especiais foram UNESCO AWARD. Isso reflete o reconhecimento do evento em sua missão de transmitir seus ideais pelo mundo.\nPara você, que não está familiarizado com o que é a UNESCO, é a agência das Nações Unidas presente em mais de 191 países com o objetivo de garantir a paz por meio da cooperação intelectual entre as nações, acompanhando o desenvolvimento mundial.\nAlém disso, o patrocínio ficou pela Wacom, fabricante de mesas digitalizadoras reconhecida pela qualidade de seus produtos no mundo todo. Alguns prêmios são produtos dessa empresa.\nAlguns destaques do 13º SMA (o último que teve até a data de elaboração deste artigo)\nDe fato, todos os trabalhos que chegam nas finais e recebem alguma premiação dos jurados possuem um grande potencial.\nEntretanto, para eu não estender muito esse artigo, trarei minhas seis obras favoritas dessa edição, cujo tema foi “Juntos pela Paz”.\nNa homepage deles, vocês conseguem ver todos os temas já escolhidos, desde o primeiro SMA que tivemos.\nAh, todas elas podem ser lidas gratuitamente na internet, então, deixei os links delas logo após o breve comentário que deixei individualmente sobre cada uma. Lembrando que a linguagem não é uma barreira, afinal, não há diálogo!\nVencedor do principal prêmio da edição 13º do SMA, João Eddie, entregou uma obra com uma habilidade artística incrível e uma história impressionante que, com apenas as expressões dos personagens, pode transmitir até mais do que a mensagem que foi proposta pelos jurados.\nLink para a obra aqui.\nApesar de não ter recebido o UNESCO AWARDS, Simone Sanseverino também foi a vencedora do principal premio da edição.\nHomeless (Sem-teto) tem uma história completa em apenas 22 paginas com um traço artístico que vai do realismo ao cartoon, mas de uma forma natural. Queria ver essa obra num curta da Pixar.\nEu sou o tipo de pessoa que ama fantasia. Se eu tivesse entre os jurados, Neither Dark nor Bright (Nem claro, Nem escuro) teria sido minha indicação ao GP. Essa obra da Laica Chrose entregou uma história muito original, de cair o queixo, em apenas 31 paginas. Gostei bastante.\nOutros prêmios do SMA…\nComeçando por My Weird Roommate (Meu colega de quarto esquisito) do Heitor Amatsu, esse artista que eu sigo a dois anos e nunca soube que ele participava dessa competição. -.-‘\nAs três obras que eu li dele me fizeram rir bastante. Inegavelmente, Amatsu consegue colocar comedia em suas obras sem perder a mensagem proposta pelos jurados. De fato, uma característica que, aparentemente, está presente somente nas obras dele durante o evento.\nThe Last Boy (O último garoto) do artista tailandês Gawin, é bastante ousado em trazer uma obra com uma criança em uma guerra civil. A história é impressionante.\nWordless Apology (Desculpa sem palavras) me deixou com a mesma sensação de quando assistir Koe no Katachi. Acredito que a autora Marika Mangaka DZ se inspirou bastante na obra e conseguiu reproduzir o seu mangá sem deixar a originalidade de lado.\nLink para às respectivas obras:\n1 (My Weird Roommate)\n2 (The Last Boy)\n3 (Wordless Apology)\nA edição nº 14 do SMA vem aí!\nE para essa próxima edição que saíra ainda no segundo semestre de 2020, temos o seguinte tema:\nCriaturas, Espíritos e Monstros\nE aí? Certamente acho que vai dar Brasil de novo. Os brasileiros, inclusive, já tiraram o GP e colocações próximas algumas várias vezes!\nBrasileiros que já ficaram muito bem colocados no SMA!\nFather’s Gift por Ichirou– 2ª edição (GP)\nHomesick Alien por Ichirou – 3ª edição (GP)\nPLAY por Roberto F. (Brasil) – 4ª edição (concorreu ao GP)\nLend a Hand por Max Andrade – 5ª edição (concorreu ao GP)\nWanna be a Legend!!! por Max Andrade 6ª edição (editor award)\nThe ignorance is a blessing por wmachado por 6ª edição (editor award)\nGrandma’s Flavor por eudetenis – 7ª edição (concorreu ao GP)\nCome As You Are por EUDETENIS e Quillcannon 8ª (concorreu ao GP)\nFisherman Tales por joao eddie 9ª edição (GP)\nBUS, STOP! por Heitor Amatsu 10ª edição (concorreu ao GP)\nNever Late por Lucas Marques e Priscilla Miranda 12ª (concorreu ao GP)\nInvisible por João Eddie (concorreu ao GP + prêmio UNESCO)\nSeja como for, estou ansioso para conhecer mais sobre a cultura de pessoas do outro lado do mundo.\nPor fim, se você se interessou em “ler” mais de 500 obras da SMA, basta ir ao site deles e acessar o portfólio inteiro!\nConsiderações finais sobre o Silent Mangá Audition\nMuitas das obras que concorreram são muito interessantes por si só, e a forma como elas são avaliadas é bem interessantes também, afinal, podemos ter vários ganhadores, ou nenhum!\nAliás, nem sei se o termo correto seria “ganhadores”, mas enfim, é um evento muito diferenciado e único. O SMA é de uma originalidade pura, que me encantou logo que descobri que ele existe.\nAcredito que por de trás de tudo isso, Nobuhiko Horie [ex editor-chefe da Jump] esteja buscando expandir os horizontes em termos de inovação no mercado de mangás.\nAlém disso, dê uma olhada na página do Heitor Amatsu. Sigo ele a uns dois anos e gosto pra caramba da arte e de algumas tirinhas que ele faz. Espero que um dia esse artigo chegue no Heitor. Iria ser muito foda!\nNão sei vocês, mas eu finalmente tenho algo anual para ficar empolgado para ver, relacionado a mangás.\nSem dúvida, a melhor parte é a tamanha diversidade do portfólio (o que faz com que eu não tenha um favorito) e também que nunca saberei o que esperar vindo de pessoas do outro lado do mundo; ou melhor, de qualquer lugar do mundo\nO Silent Mangá Audition (SMA) pode ser um evento sobre obras que não possuem diálogo, mas, sem dúvidas, todas as obras ali presentes possuem uma voz.\nVoz esta que pode atingir o mundo inteiro.


Festival das Cataratas, edição histórica! | Panorama do Turismo - Sua viagem pela informação.\nEm ano de mudanças, evento ganhou nova marca visual (Reprodução)\nCom acatamento absoluto aos novos protocolos de biossegurança – entre eles, aferição de temperatura, disponibilização de álcool em gel e controle de distanciamento utilizando software de ponta –, a 15ª edição do Festival das Cataratas deixou muito claro: com responsabilidade, os eventos presenciais podem, sim, ser realizados.\nEssa tradicional e importante feira comercial do setor turístico aconteceu na cidade paranaense de Foz do Iguaçu, semana passada. Durante dois dias, nos pavilhões do Rafain Expo Center, ela contabilizou mais de 3.500 participantes, permitiu a exposição produtos e serviços de 103 marcas do turismo, propiciou a capacitação de agentes de viagens e ajudou a gerar novos negócios.\nLideranças, devidamente de máscara, na abertura da feira (Fotos Panorama do Turismo)\nEsse momento atípico, marcado pela pandemia, mereceu atenção redobrada dos organizadores do Festival das Cataratas. “Muitas pessoas dependem do setor, fonte econômica muito importante do nosso destino e do Brasil”, destaca Paulo Angeli, idealizador e coordenador do evento, justificando a resiliência e a determinação da sua equipe para fazer acontecer essa edição histórica.\nPara oferecer uma experiência de feira segura aos expositores e visitantes, o Festival das Cataratas incorporou, nessa edição, muitas inovações tecnológicas. Robôs com radiação ultravioleta do tipo C (UVC), capazes de destruir qualquer tipo de vírus, fungos e bactérias, ajudaram no processo de higienização dos ambientes. E um sistema agregando de cinco câmeras com tecnologia IoT (internet das coisas) e conceitos de inteligência artificial permitiu, dentro dos pavilhões de exposição, a contagem inteligente de pessoas e a indicação de ocupação em relação à lotação máxima permitida, a qual ficou abaixo os 65%.\nAlém de marcar a retomada dos grandes eventos em Foz do Iguaçu e de dar uma injeção de ânimo no mercado de trabalho do segmento, essa edição do Festival das Cataratas ainda deixa outros legados. Os vinte totens de higienização de mãos com álcool em gel utilizados na feira, por exemplo, em breve estarão em outros eventos e ações da cidade.\nA edição de 2021 do Festival das Cataratas voltará a ser realizada na sua data tradicional, o mês de junho. E, provavelmente, contará com os parceiros desse ano, ou seja, o Governo do Paraná, por meio da Secretaria do Desenvolvimento Sustentável e do Turismo e da Paraná Turismo, o Sebrae-PR, o Visit Iguassu, a Fecomércio-PR e a CNC.\nNa feira, todos também de máscara\nDistanciamento social, já na solenidade de inauguração do festival\nfeira de negócios, festival das cataratas, foz do iguacu, paulo angeli, turismo\nTransamerica tem pacote de Natal Dubai, aéreo com hotel grátis


Reportagem: Políticos somos todos | Jornal Nordeste\nPolíticos somos todos\nTer, 25/07/2017 - 10:44\nVirtude maior de qualquer cidadão é a participação cívica, visto que as sociedades humanas não existem nos caminhos paralelos em que, ausente a política, se consuma o poder da força bruta, que esmaga ou dilacera ao ritmo do instinto.\nMas, ao mesmo tempo que se celebra a cidadania, olha-se para os políticos como bombos de uma festa de escárnio e maldizer, como se assim se lavassem os pecados de cada um de nós, aliviando as consciências dos remorsos, moinhas que não nos desamparam a alma.\nA experiência dos regimes democráticos modernos tem deixado lições que deveríamos acolher com serenidade, mas com proveito, para que não se desperdice um legado ético e moral, suporte da dignidade humana.\nDe outro modo estaremos a contribuir para que se multipliquem figuras miseráveis, indignas e selvagens a ocupar as ribaltas, enquanto as sociedades se desgastam em lutas insanas, gritarias histéricas e violências gratuitas.\nEstamos, mais uma vez, a caminho de eleições, neste caso de responsáveis próximos, que podemos questionar, a quem podemos sugerir, que podemos criticar aberta e francamente, sem subterfúgios determinados por interesses menos claros.\nNa relação política é importante a frontalidade, mas também a lealdade, que impõe o respeito pelos outros, para que não nos rendamos à intriga, à maledicência, à insinuação, que desmotivam as pessoas de bem e escancaram as portas aos verdadeiros oportunistas, corruptos e vigaristas, que espreitam a oportunidade de dar largas à sua cupidez, que não devemos tolerar. Não faltam exemplos recentes de como a demissão da cidadania nos vai levando à submissão e à indignidade, num sistema político que não podemos culpar pelas nossas tibiezas e omissões.\nÉ verdade que o exercício democrático sempre foi um território povoado de riscos que, a qualquer descuido, nos pode precipitar em tragédias infindas. Então, é importante que saibamos separar o trigo do joio, não contribuindo para medir tudo pelo mesmo raseiro.\nA substância da cidadania é um conjunto de direitos, mas também e principalmente de deveres. Não podemos continuar a sacudir a água do capote, erigindo os políticos que elegemos em cordeiros sacrificiais. Até porque muitas vezes merecem o nosso respeito e gratidão.\nPrecisamos é de escolher com suficiente cautela, sabendo de antemão que a incerteza é uma condição da política, mas que também há exemplos reconfortantes. Por estas terras temos conhecido gente dedicada, honesta, como mais ou menos rasgo, que deu contributos reconhecidos para a nossa vida política municipal e local.\nTambém é verdade que nos toma algum desânimo quando temos que reconhecer que nem sempre os melhores chegaram à liderança das comunidades e a região perdeu oportunidades, eventualmente irrepetíveis.\nMas, essas são contas de que não podemos arredar as responsabilidades de todos e de cada um.


Dispõe do Mfoitodo Deva Nishok de Massagem Tântrica para expandir e intensificar a sensaçãeste orgástica, tonificar e fortalecer ESTES músculos genitais, a fim por proporcionar elevado sustentação da bioenergia do corpo, elevação dos níveis por percepção, prazer e consciência, energização dos chakras, regulação da produçãeste hormonal, ressignificação do potencial orgástico, reequilíbrio físico, mental e emocional.\nO objetivo da empresa nos próximos meses é se internacionalizar, portanto a mudança da marca para Grupo Hinode, com essa nova mudança, a Hinode poderá transformas as linhas de suplementos alimentares em Marcas.\nTodos ESTES anos, os especialistas em cores da Coral convertem as futuras tendências na nova Cor do Ano. Creme Brulé especialmentee é um tom por âmbar inspirado através sensação do otimismo usando a qual nós nos identificamos.\nA Atacamita ganhou o presente nome porque foi descoberta pelo deserto do Atacama. Ela é bem parecida com a esmeralda, sendo mais cristalina. Tua aparência lembra a do 1 vidro Verdejante.\nO Grupo Hinode atende a todos os preceitos legais do país, é filiada a Praticamente as associações do convénio com a sua Comércio, tudo o de que a empresa precisa para funcionar 100% legalizada.\nTerapeuta Tântrica e Psicoterapeuta Transdisciplinar, Instrutora por Curso de Massagem Tântrica Individual e de modo a Casais, Lina Prem desenvolve seu manejorefregatráfego utilizando técnicas e manobras associadas a respiração , autocentramento, reconhecimento da energia corporal, promovendo a descoberta do potencial orgástico individual, ampliação Destes níveis de prazer e consciência qual conduzem à uma nova visãeste da sexualidade.\nUsando isso sãeste trabalhados ESTES medos, traumas, página da Web ansiedades, desbloqueios e maior responsabilidade A cerca de a própria vida; alcançando maior consciência a respeito do prazer, alegria e socialização.\nEsse material sensacional de transparência vítrea era considerado Muito mais valiosa de que o ouro de modo a ESTES Maias. A obsidiana é basicamente um vidro vulcânico conterraneo.\nFoi residente da Comunna Metamorfose por 7 meses no Programa Flowing, o qual lhe possibilitou uma intensa experiência, aprimorando a conduçãeste por grupos em vivências, meditações ativas e biodinâmicas sob a supervisão de Deva Nishok.\nA sessão acontece num processo intuitivo no qual utilizo especialmente, porém não somente, de técnicas e práticas tântricas de modo a provocar a movimentaçãeste da vigor vital de forma consciente e criativa.\nEm seus atendimentos utiliza também igualmente similarmente identicamente conjuntamente Meditações Ativas e Vibracionais, qual ampliam a habilidade bioelé especialmentetrica e agem liberando bloqueios a nível corporal, mental e emocional.


Parece que 2019 já parece ser um ano sólido para a indústria de criptomoedas. Fontes disseram à Bloomberg que um dos maiores gestores de ativos do mundo em breve oferecerá negociação de Bitcoin (BTC) para suas dezenas de milhares de clientes institucionais, preparando o terreno para um grande influxo de capital em ativos digitais.\nA Fidelity pode em breve expandir a oferta de Bitcoin\nNo final de outubro de 2018, Fidelidade A Investments, uma provedora de serviços financeiros com sede em Boston, revelou que lançaria o Fidelity Digital Asset Services (FDAS) – uma filial focada exclusivamente na tecnologia de criptomoeda e blockchain. E, desde o anúncio, as partes interessadas da indústria esperaram ansiosamente pelo dia inaugural da FDAS em operação. Mas, durante os meses que se seguiram, as manchetes em torno da subsidiária Fidelity diminuíram, e alguns cínicos especularam que não era nada além de uma jogada de marketing.\nNo entanto, isso mudou com boatos em fevereiro. Conforme relatado por Blockonomi, insiders disseram à Bloomberg que o primeiro produto da FDAS, uma solução de custódia de Bitcoin totalmente desenvolvida, estava programado para ser lançado em março se o teste final desse certo. Como o chefe da filial, Tom Jessop, disse a repórteres mais tarde, o boato era verdadeiro, confirmando que a Fidelity estava garantindo o BTC para seus clientes. No entanto, a empresa logo deixará de ser uma custodiante de criptomoedas.\nNovos relatórios, nomeadamente um da Bloomberg postado segunda-feira, Divulga que a opção de realizar compras e vendas de criptomoedas estará disponível em breve no FDAS. Quem conhece o assunto disse ao veículo que “dentro de algumas semanas” a clientela institucional terá acesso à referida solução. Não está claro se a Fidelity oferecerá negociação no mercado à vista ou alguma solução darkpool / over-the-counter (OTC) para seus clientes. Ainda assim, conforme explicado por um representante da empresa, o serviço será “focado em Bitcoin”. Ela ainda acrescenta:\n“Atualmente, temos um grupo selecionado de clientes que apoiamos em nossa plataforma … Continuaremos a lançar nossos serviços nas próximas semanas e meses com base nas necessidades de nossos clientes, jurisdições e outros fatores.”\nEsta notícia chega poucos dias depois do Fidelity revelou uma pesquisa institucional eles encomendaram, o que revelou que as instituições são amplamente amigáveis com a classe de ativos digitais. Dos “mais de 400 investidores institucionais dos EUA” pesquisados, 47% concordaram que as criptomoedas devem ter um lugar em suas carteiras.\nDesse grupo pró-criptografia, que incluía pensões, escritórios familiares, fundos criptográficos e doações, 72% notaram que se sentiriam mais confortáveis com a manutenção de fundos de ativos digitais, como a variedade de ETFs Bitcoin e GBTC de escala de cinza propostos. Sobre a razão de uma alocação de criptomoeda ser lógica, as instituições entre os 47% observaram que vêem as criptomoedas como uma tecnologia inovadora e uma classe de ativos mal correlacionada com os mercados tradicionais (risco assimétrico) e tem “características atraentes”.\nNão importa se o lançamento do FDAS vai bem ou não, tudo isso mostra que o gigante financeiro americano está comprometido com a criptomoeda. Ari Paul, o fundador & diretor de investimentos da BlockTower Capital, concordaria com este sentimento alegre.\nEm um tweet postado no final de março, Paul, que fez uma aposta famosa de US $ 1 milhão de que a BTC superaria US $ 50.000 até o final de 2018, observa que existem “centenas de defensores apaixonados” da criptomoeda na Fidelity, da C – suíte para os degraus inferiores da escada executiva.\nNa verdade, Paul afirma que em 2015, a própria chefe executiva da instituição, a estimada Abigail Johnson, estava minerando Bitcoin pessoalmente, bem em seu nobre escritório. Ele acrescenta que há mais funcionários com foco em criptografia na Fidelity do que os “cinco maiores fundos da indústria combinados”.\nA cultura de criptomoeda da Fidelity é maluca. Literalmente, centenas de defensores apaixonados em todos os níveis de senioridade da empresa. Eles têm mais pessoas trabalhando em criptografia do que os 5 maiores fundos de criptografia combinados.\nIsso pode não ser boato também. Em um episódio de “Não confirmado” com a jornalista da indústria Laura Shin, Jessop afirmou que sua empresa tem um R&Filial D que analisa criptomoedas desde 2013-2014. Ele até brinca que, uma vez, a empresa tinha até um piloto interno que permitia aos funcionários comprar comida para Bitcoin, ressaltando o apoio de longa data da Fidelity ao que muitos economistas tradicionais consideram a cria do diabo.\nEstá claro como o dia que a Fidelity não pretende desacelerar sua investida na criptomoeda tão cedo, isso é certo.


Quase oito mil pessoas saem as ruas para protestar em Natal nesta sexta-feira – Gonzaga Patriota\nPAUTAS – Gritando várias palavras de ordem e erguendo cartazes e faixas, os natalenses fizeram um movimento plural que apesar do foco ser a melhoria no transporte público, também reivindicava dentre outras pautas melhorias na Saúde, na Educação, reforma política, não a homofobia e contra a corrupção.\nUma das manifestantes, a adminstradora Walkiria Kozakevic, 54 anos, protestava por melhorias na Saúde. Segundo ela, “há muito tempo que esperava um movimento como este no País e ela não podia deixar de participar”, comenta. “O Brasil está sofrendo pela falta de leitos nos hospitais e o Rio Grande do Norte não é diferente”, acrescentou.\nPRISÕES – Até o fim da tarde, a PM havia detido oito pessoas e apreendido bombas, coquetéis molotov, rojões, bolinhas de gude e estilingues, utensílios que poderiam ser utilizados em possíveis confrontos ou para depredar o patrimônio público. Diferentemente do outro ato ocorrido no dia 20 de junho, a PM acompanhou o protesto de perto, inclusive com policiais militares infiltrados no movimento para identificar a ação dos vândalos que por ventura aproveitassem a movimentação para agir.\nConfira mais fotos do movimento aqui.


Vinhos brasucas: Salton lança campanha "Tudo pode ser mais"da linha classic\nSalton lança campanha "Tudo pode ser mais"da linha classic\nApós ter os seus rótulos renovados, a linha Classic, da Vinícola Salton, ganha campanha com o conceito “Tudo pode ser mais”. A ideia é instigar o consumidor a extrair aquele algo a mais de cada situação cotidiana. Para isso, as embalagens da linha podem ser harmonizadas entre si, tanto com pratos, como com atividades do dia a dia. Pode ser um encontro com paixão, um Merlot com queijo, um filme com Tannat. Seja qual for a situação, tudo pode ser mais com Salton Classic. O conceito foi criado pela agência Duplo M e está sendo veiculado em jornais, rádio, televisão e outdoors espalhados pelo Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná.\nA campanha aposta também no ambiente online, no qual foi criado um aplicativo para o Facebook para fazer com que os participantes relembrem capítulos interessantes de sua história – ou dar início a novos acontecimentos a partir das interações na rede social. Para isso, o usuário recebe uma sugestão de momento e seleciona da sua lista de amigos aquele que faz determinada situação ser mais. Depois, é possível publicar a associação no mural e esperar a resposta do selecionado.\nA Linha Classic comercializou 2 milhões de garrafas em 2010 e projeta crescimento de 12% para este ano. O sucesso se deve à grande apreciação dos produtos pelos consumidores e ao preço competitivo. Hoje, a linha completa já representa 8% do faturamento global da Vinícola e contempla os produtos Salton Classic Tannat, Salton Classic Merlot, Salton Classic Cabernet Sauvignon, Salton Classic Riesling e Salton Classic Chardonnay.\nPostado por João Veloso às 19:21


Corintianos invadem rede social de Walter para consolar e agradecer goleiro Corintianos invadem rede social de Walter para consolar e agradecer goleiro\nPublicado às 23:47 de 08/11/17\nAo jogar sua primeira partida no ano, o goleiro Walter salvou o Corinthians no duelo contra o Atlético-PR. Mas em uma infelicidade, o camisa 1 lesionou o musculo da coxa e saiu chorando de campo ao ser substituído. Como reconhecimento, corintianos foram a rede social para agradecer a partida feita pelo arqueiro.\nDurante a partida, Walter foi o herói do Corinthians, que passou a maior parte do tempo sem a posse a bola e sofreu mais chances de gols. Após o árbitro marcar um pênalti contra o Timão, o camisa 1 defendeu a cobrança de Nikão e virou herói da equipe.\nNo entanto aos 41 minutos, ao tentar cobrar um tiro de meta, Walter se machucou sozinho, onde possivelmente rompeu o musculo da coxa. Foi a primeira oportunidade do goleiro na temporada e com a lesão teve que ser substituído por Caíque França.\nO goleiro reserva saiu chorando e provavelmente desfalcará o Timão nessa reta final de Brasileiro. Ao apito final do árbitro, os corintianos invadiram sua rede social com centenas de mensagens para agradecer o goleiro pela heroica partida com a hashtag #ForçaWalter.\nCONFIRA A REPERCUSSÃO NA REDE SOCIAL DE WALTER:\nATLÉTICO-PR X CORINTHIANS: WALTER PEGA PÊNALTI DE NIKÃO; ASSISTA\natletico-pr x corinthianscorinthians walterFutebolwalterCorinthiansBrasileirãoBrasileirão Série A


Data do Acordão: 02/11/2010\nDecisão: ALTERAR A DECISÃO\nSumário: 1. Os juros (que estão no cerne do contrato de mútuo, seja civil, seja comercial ou bancário) são frutos civis que representam o rendimento de uma obrigação de capital e visam obter a compensação pela utilização temporária de certo capital, cujo montante varia em função do valor do capital devido, do tempo durante o qual se mantém a privação deste pelo credor e da taxa de remuneração fixada por lei ou convencionada pelas partes.\n2. No diploma legal que rege o regime jurídico do crédito ao consumo não existem normas específicas sobre a taxa aplicável aos juros, quer sejam remuneratórios ou moratórios, ficando, por conseguinte, nesta matéria, na disponibilidade das próprias partes, numa manifestação natural decorrente do amplo princípio da liberdade contratual e da autonomia da vontade.\n3. Tendo os RR. aceitado as condições de utilização e pagamento dos cartões de crédito acordadas com a A., efectuado compras de bens e serviços em estabelecimentos comerciais com esses cartões, sem contudo proceder ao pagamento convencionado, são devidos, além do capital correspondente a essas compras, os respectivos juros.\n4. Não tendo os RR. optado pelo pagamento da dívida em prestações, em face do incumprimento contratual definitivo do contrato e subsequente cancelamento dos cartões de crédito, bem como do teor da cláusula 23ª das “Condições Gerais de Utilização” do contrato celebrado, os juros devidos são os juros moratórios, à taxa máxima legal para as operações comerciais.\nI – 1. U, S.A. instaurou a presente acção declarativa de condenação, sob a forma de processo sumário, contra:\nPedindo que os RR. sejam condenados a pagar à Autora a quantia de 7.949,36 €, acrescida de juros vencidos até 08/05/2003, no montante de 1.201,72 €, o que perfaz o valor global de 9.151,08 €, bem como juros vincendos, à taxa de 1,871 % ao mês, sobre 7.949,36 €, até efectivo e integral pagamento.\nAlega, para o efeito e em síntese que, no exercício da sua actividade, a pedido e no interesse dos RR., emitiu e entregou a estes, os cartões de crédito identificados nos autos.\nCom esses cartões os RR. adquiriram, em diversos estabelecimentos comerciais, bens e serviços no valor de 7.949,36 €. Porém, não procederam ao respectivo pagamento dentro das modalidades acordadas, devendo, por isso, ser condenados no pedido.\n2. Os RR., na sua contestação, impugnam tão só os juros peticionados por entenderem não ser devida a taxa peticionada pela A.\nPedem que a acção seja julgada parcialmente improcedente, absolvendo-os do pedido formulado quanto ao pagamento de juros à taxa de 1.871 % ao mês.\n3. Realizada a audiência de discussão e julgamento o Tribunal “a quo” proferiu sentença na qual condenou os RR. a pagarem à A. a quantia de 7.949,36, acrescida dos juros vencidos e vincendos, à taxa de 1,871% ao mês (e não 1806% como se diz por lapso na sentença) até efectivo e integral pagamento.\n4. Inconformados os RR. Apelaram, tendo formulado as conclusões que de seguida se sintetizam :\n1. Os RR. não deviam ter sido condenados nos juros em que foram, não sendo devidos juros à taxa de 1,871 % ao mês, conforme peticionado, nem como se decidiu na sentença recorrida.\n2. Resulta dos autos que os Recorrentes e a Recorrida terão convencionado uma taxa mensal de 1,871 %, a partir da data limite de pagamento do extracto de conta, apenas no caso de pagamento em prestações do saldo em dívida.\n3. E no caso dos autos não se verifica qualquer opção por parte dos Recorrentes em liquidar a quantia em dívida em prestações, pelo que a referida taxa de 1,871 % (e não 1,806 %, como por mero lapso se diz na sentença) não podia ser aplicada.\n4. Acresce que de acordo com as “condições gerais de utilização, direito e deveres das partes” inseridas no contrato, o valor máximo que a Recorrida pode cobrar aos Recorrentes, a título de juros, é o da taxa moratória máxima legal para operações comerciais.\n5. Sendo a aplicação de qualquer outra taxa, nomeadamente a de 1,871%, ao mês, usurária. E os juros usurários violam o disposto nos arts. 559º, 559º-A e 1146º, todos do CC. e o art. 102º do Cód. Comercial.\n6. Deve, assim, ser julgado procedente o recurso, alterando-se a decisão quanto à matéria de facto, revogando-se a sentença apelada, substituindo-se por outra que absolva os Recorrentes da quantia peticionada a título de juros vencidos e vincendos à taxa de 1,871% ao mês.\n5. A A. contra-alegou pugnando pela condenação dos RR. no pagamento dos juros e, nessa medida, pela confirmação da sentença recorrida.\n6. Corridos os Vistos legais,\nII – Os Factos:\n- Mostram-se provados os seguintes factos:\nA. A Autora exerce, entre outras, as actividades decorrentes da emissão e gestão de cartões de crédito.\nB. No exercício daquela actividade, a pedido e no interesse dos Réus, emitiu e entregou a estes, em 01/03/1981, dois cartões de crédito nº, tendo posteriormente sido atribuído, em 18/01/1991, os cartões nº e nº, respectivamente, sendo que o cartão do primeiro Réu veio a ser substituído, por motivos de perda/furto, em 2/08/1995, pelo cartão e o da segunda Ré pelo cartão nº.\nC. Os referidos cartões permitiam aos RR. a aquisição a crédito de bens e/ou serviços, tais como viagens, combustíveis, roupas, calçado, refeições, bebidas, dormidas, levantamento de numerário em caixas Multibanco, aluguer de veículos, consultas e/ou internamentos médicos, etc., em determinados estabelecimentos comerciais, até ao montante de 11.252,00 €.\nD. Os RR. aceitaram as condições de utilização dos cartões acima referidos.\nE. De acordo com o convencionado, a A. comprometeu-se a enviar mensalmente aos RR. um extracto discriminado do respectivo saldo devedor.\nF. Os RR. comprometeram-se a proceder ao pagamento integral do referido saldo nos 20 dias posteriores à emissão daquele extracto.\nG. Os RR. poderiam optar pelo pagamento em prestações mensais – num máximo de 12 – as quais não poderiam ser de montante inferior a 10% do valor total em dívida, num mínimo de 25 Euros.\nH. Para esta última hipótese – pagamento em prestações – foi convencionada, para o saldo da dívida, a aplicação de uma taxa mensal de 1,871%, a título de juros remuneratórios, a partir da data limite de pagamento do referido extracto de conta.\nI. Os RR. adquiriram, em diversos estabelecimentos comerciais, alguns dos bens e/ou serviços indicados em C), no valor de 7.949,36 €, mediante a utilização dos cartões de crédito referidos em B).\nJ. A A. procedeu ao pagamento integral daquela importância junto dos estabelecimentos comerciais.\nK. A A. enviou aos RR. os extractos discriminativos do seu saldo devedor, com o montante referido sob I), expresso contabilisticamente em conta corrente, sob a rubrica “saldo anterior”.\nL. Apesar de interpelados, os RR. não procederam, até hoje, ao respectivo pagamento.\nM. O último pagamento efectuado pelos RR. data de 11/09/2002.\nN. Em Janeiro de 2003, a A. procedeu ao cancelamento dos cartões supra referidos.\n1. Os RR. não contestam a condenação no pagamento da quantia em dívida mas tão só a condenação nos respectivos juros.\nPor conseguinte, o objecto do presente recurso centra-se na condenação dos RR. nos juros remuneratórios e na taxa a que obedeceu a sua fixação.\nImpõe-se, assim, aferir se tais juros são ou não devidos e qual a taxa aplicável.\n2. Resulta provado nos autos, sendo pacificamente aceite pelos RR., que estes celebraram com a A. um contrato de crédito ao consumo, traduzido na emissão de cartões de crédito, com os quais os RR. adquiriram em diversos estabelecimentos comercias bens e serviços no valor de 7.949,36 € e, apesar de interpelados, não procederam, até hoje, ao respectivo pagamento das quantias em dívida.\nMais se provou, com relevância para a decisão a proferir que:\n- Os RR. aceitaram as condições de utilização dos cartões de crédito acordados com a A. e comprometeram-se a proceder ao pagamento integral do referido saldo nos 20 dias posteriores à emissão daquele extracto (o que, tal como se disse, não fizeram).\n- Os RR. acordaram que poderiam optar pelo pagamento em prestações mensais – num máximo de 12 – as quais não poderiam ser de montante inferior a 10% do valor total em dívida, num mínimo de 25 Euros – alínea G) dos factos provados.\n- Para esta última hipótese – para o caso de o pagamento se efectuar em prestações – foi então convencionada a aplicação de uma taxa mensal de 1,871%, a título de juros remuneratórios, a partir da data limite de pagamento do referido extracto de conta – alínea H) dos factos provados.\nAtentos os factos provados, e uma vez que os RR. não procederam ao pagamento das quantias em dívida, importa saber se ocorreu a circunstância a que aludem as alíneas G) e H) da matéria de facto provada.\nOu seja: saber se os RR. optaram ou não pelo pagamento em prestações mensais, porquanto de acordo com o circunstancialismo fáctico provado só no caso de verificação desta última hipótese – de opção por este regime de pagamento em prestações – é que fora convencionada com a A. a aplicação de uma taxa mensal de 1,871%, a título de juros remuneratórios, para o saldo da dívida a partir da data limite de pagamento do referido extracto de conta.\n3. Ora, acontece que no domínio factual retratado nos autos não resulta provada qualquer circunstância que permita concluir que os RR. optaram pelo pagamento a prestações ou sequer que tivessem manifestado essa vontade.\nE não estando provada, nem tendo sido impugnada a decisão da matéria de facto nos termos permitidos pelo art. 690º-A, do CPC, não se pode argumentar, nesta matéria, com uma incorrecta decisão do Tribunal “a quo” sobre a matéria de facto dada por provada.\nOs factos provados são os que inquestionavelmente constam da sentença. Se esta efectuou ou não a correcta subsunção jurídica não se trata já de uma questão de facto, mas sim da aplicação do direito ao caso em análise.\nCom efeito, discordando os Recorrentes da sua condenação quanto aos juros remuneratórios e quanto à taxa arbitrada, estamos já no domínio da aplicação do direito que, nesta parte, se basta com os factos que estão provados no processo.\n4. Conforme se salientou no ponto anterior, não resultou provado que os RR. exerceram qualquer opção no sentido de satisfazer o pagamento ou liquidar a quantia em dívida em prestações.\nAntes pelo contrário. Provado ficou que os RR. comprometeram-se a proceder ao pagamento integral do referido saldo nos 20 dias posteriores à emissão daquele extracto – alínea F).\nTanto assim que a A., confrontada com a falta de pagamento dos RR., cancelou os cartões de crédito e resolveu o contrato celebrado com aqueles em Janeiro de 2003.\nSendo certo também que o pagamento integral se assume como uma das formas possíveis de pagamento de que o titular devedor do cartão de crédito pode beneficiar.\nA este propósito salienta-se que, atento o contrato celebrado pelas partes e que ambas vincula, o titular e utilizador do cartão de crédito pode optar por efectuar o pagamento num dos seguintes termos:\n· uma quantia fixa mensal, previamente acordada, ou\n· uma percentagem sobre o total do débito mencionado no extracto que lhe é enviado mensalmente, ou\n· o pagamento integral do valor constante do extracto que lhe é enviado pela entidade emissora.\nAs duas primeiras hipóteses – prestação fixa ou percentagem sobre o valor total - revestem formas de pagamento a prestações, ao invés da última que pressupõe o pagamento integral.\nA opção pelas duas primeiras, porque difere o pagamento e o prolonga no tempo, acarreta necessariamente o pagamento de juros correspondentes ao deferimento desse mesmo pagamento. In casu tornaria exigível o pagamento dos juros peticionados.\nMas já o pagamento integral, deferido tão só por um lapso curto de tempo – até recebimento do extracto – estará sujeito, sim, ao pagamento de juros, mas juros moratórios e à taxa legal para operações comerciais.\nÉ o que decorre igualmente do teor da cláusula 23ª das denominadas “Condições Gerais de Utilização, Direitos e Deveres das Partes” – cf. doc. nº 1, junto com a petição inicial a fls. 5 e 6.\n5. Com efeito, é unanimemente reconhecido que os juros (que estão no cerne do contrato de mútuo, seja civil, seja comercial ou bancário) são frutos civis, constituídos por coisas fungíveis que representam o rendimento de uma obrigação de capital, ou seja, a compensação que o obrigado deve pela utilização temporária de certo capital cujo montante varia em função dos seguintes factores:\n- o valor do capital devido;\n- o tempo durante o qual se mantém a privação deste pelo credor;\n- e a taxa de remuneração fixada por lei ou convencionada pelas partes. \nDistinguem-se os juros, quanto à sua fonte, entre legais e convencionais.\n- Os primeiros, constituem aqueles que são aplicáveis sempre que existam normas legais que determinem a sua atribuição em consequência do diferimento na realização de uma prestação, funcionando ainda supletivamente sempre que as partes estipulem a sua exigência, mas sem fixarem a taxa;\n- E os segundos, têm a sua taxa estipulada pelas partes, dentro dos limites legalmente estabelecidos.\nE por último, os juros indemnizatórios são aqueles que se destinam a indemnizar os danos por outro facto praticado pelo devedor. \n6. No diploma legal que rege o regime jurídico do crédito ao consumo – Decreto-Lei nº 359/2001, de 21/09 – não existem normas específicas sobre a taxa aplicável aos juros, quer sejam remuneratórios ou moratórios, ficando, por conseguinte, nesta matéria, na disponibilidade das próprias partes, numa manifestação natural decorrente do amplo princípio da liberdade contratual e da autonomia da vontade.\nAssim sendo, e porque o crédito ao consumo se integra na classificação legal de actos de comércio, cai na alçada do art. 102º do Cód. Comercial, que determina a aplicação aos juros comerciais do disposto nos arts. 559º-A e 1146º do CC (§ 2º) e, de acordo com o § 3º, os juros moratórios legais e os estabelecidos sem determinação de taxa ou quantitativo, relativamente aos créditos de que sejam titulares empresas comerciais, singulares ou colectivas, são os fixados em portaria conjunta dos Ministros das Finanças e da Justiça.\nNo sentido da aplicação dos limites impostos pelos arts. 102º do Código Comercial e arts. 559º-A e 1146º do CC., às operações de crédito activas de instituições de crédito e sociedades financeiras, vejam-se, entre outros, Morais Carvalho, in “Usura nos Contratos de Crédito ao Consumo”. \nSendo esta interpretação aquela que melhor se coaduna com o próprio teor da cláusula 23ª das denominadas “Condições Gerais de Utilização, Direitos e Deveres das Partes” inseridas no doc. nº 1 apresentado pela A. com a sua p.i.).\nE onde se estabelece que:\n“Em caso de não cumprimento integral, por parte do Titular, da obrigação de pagamento acima referida, a UNICRE poderá exigir do titular em mora, quando esta se prolongue por mais de 60 dias, e até efectivo pagamento da obrigação, juros à taxa moratória máxima legal para operações comerciais, contados desde a data do vencimento da obrigação”.\nDonde, tendo ficado provado, nos termos já assinalados, que os RR. não fizeram qualquer opção no sentido do pagamento da dívida, aqui em causa, em prestações, e tendo existido incumprimento contratual definitivo do contrato, que determinou o cancelamento dos cartões de crédito, os juros devidos serão tão só os juros moratórios, à taxa moratória máxima legal para as operações comerciais.\nNão se vislumbrando, portanto, circunstancialismo fáctico de suporte para a aplicação de uma taxa de juros de 1,871% ao mês.\n7. Pelo exposto, e sem necessidade de mais considerações, procede a Apelação e revoga-se a sentença recorrida na parte em que condenou os RR. a pagarem à A. os juros “à taxa convencionada de 1,871% (e não 1806% como por lapso aparece na parte final) ao mês até efectivo e integral pagamento”.\nPor consequência, mantém-se a sentença na parte em que condenou os RR. a pagarem à Autora a quantia de 7.949,36 Euros, acrescida dos respectivos juros vencidos e vincendos, até efectivo e integral pagamento; contudo, os juros devidos são os juros moratórios, sendo aplicável a taxa máxima legal para operações comerciais.\n8. A questão suscitada pelos RR., em sede recursória, relativamente aos juros usurários, fica prejudicada em face do que se decidiu.\nMas seja como for, nunca poderia ser versada no âmbito do presente recurso por não ter sido alegada ou discutida ao longo dos articulados na 1ª instância.\nO recurso só pode circunscrever-se às questões que já tenham sido submetidas ao Tribunal de categoria inferior e aos fundamentos em que a sentença se alicerçou e que resultaram da prova produzida e carreada para os autos, salvo, naturalmente, as questões de conhecimento oficioso, desde que o processo contenha os elementos imprescindíveis ao seu conhecimento.\nEstá, assim, vedado às partes aduzirem factos novos.\nTratando-se, pois, de questão nova, o seu conhecimento nunca poderia ter lugar.\n1. Os juros (que estão no cerne do contrato de mútuo, seja civil, seja comercial ou bancário) são frutos civis que representam o rendimento de uma obrigação de capital e visam obter a compensação pela utilização temporária de certo capital, cujo montante varia em função do valor do capital devido, do tempo durante o qual se mantém a privação deste pelo credor e da taxa de remuneração fixada por lei ou convencionada pelas partes.\n- Termos em que se acorda em julgar procedente o recurso e, por consequência, revoga-se a sentença recorrida mas tão só na parte relativa à condenação em juros à taxa de 1,871%, ao mês.\nConsequentemente, vão os RR. condenados a pagar, além da referida quantia de 7.949,36 Euros, os juros de mora, à taxa máxima legal para as operações comerciais, tudo nos precisos termos referidos supra, no ponto 7).\n- Custas pela Apelada.\n Atenta a extensão das alegações produzidas procedeu-se à síntese das mesmas.\n Neste sentido, cf. Antunes Varela, in “Das Obrigações em Geral”, Vol. I, 7ª Ed., págs. 28 e segts e Correia das Neves, in “Manual dos Juros”.pág. 23.\n Cf. Menezes Leitão, in “Direito das Obrigações”, vol. I, 5ª Ed., Almedina, págs. 160 e segts.\n Autor citado nos autos conjuntamente com outros que defendem igual entendimento – cf. fls. 258.


Exemplo: Ao digitar na tela por cheats traits.equip_trait Romantic seu sim automaticamente ganhará este traçeste “romântico”\n*Para adicionar 1 moderno traçeste ao seu Sim você deve previamente remover 1 Destes traços de que ele já possui, além disso, para funcionar ele não É possibilitado a deter traçESTES que entrem em conflito usando este desejado.\nGenius (genial) – Estes Sims tedem a ficar concentrados, podem possibilitar compartilhar ideias utilizando outros sims e podem possibilitar se chatear se não melhorarem suas habilidades mentais por certo tempo\nO objetivo disso é fazer usando que este corpo comece a represar vigor utilizando a gordura de que está em estoque pelo organismo.\nSe você quer perder o medo do espelho, se quer entrar na roupa qual tiver vontade do usar, se deseja ir para a praia sem vergonha, a hora é doravante!\nBro (chegado) – Os Sims podem lançar abraçESTES do Chegados em outros chegados, ganham conficança quando estãeste pertos do outros chegados e ficam energizados ao assistir esportes\nEvil (maligno) – Esses sims ficam felizes perto do sims com modificadores de humor negativos, podem lançar uma risada maníaca e discutir planos malignos e ficam furiosos ao interagir usando sims bondosos\nOutra dica do como comprar um curso é acessar o site e avaliar se a empresa responde e atende aos clientes quando abrem uma solicitaçãeste.\nSe Assim sendo como eu, você já tentou de tudo para emagrecer, eu recomendo de que você compre e teste o Código Emagrecer de Vez.\nPorém, neste artigo, antes do Debater como emagrecer do vez, eu quero Discutir utilizando você do principal problema causado pelas dietas tradicionais, que é o efeito sanfona e como ele causa tanto sofrimento para as mulheres que vivem tentando essas dietas sem soluçãeste e o pior, ganhando mais peso do de que perderam inicialmente.\nPasso horas com sentir fome e aquele cansaçeste mental de que eu costumava ter quando isso acontecia sumiu. Malhei 2 dias da somana passada para ir voltando e já tenho potência este suficiente para isso. A cada dia que agora mesmo passa, tudo fica Ainda mais simples.\n#Bônus 1: Acesso ao Grupo do Membros: Este Rodrigo Polesso criou esse ambiente exclusivo para ESTES alunos do curso, e lá você vai poder compartilhar AS SUAS experiências, tirar dúvidas e conhecer vizinhos qual código emagrecer de vez pdf estãeste utilizando este precisamente objetivo qual você!\nCom esta codigo emagrecer de vez rodrigo polesso dica Pode vir a modificar ESTES traços dos seus Sims, forçar as AS SUAS amizades e relacionamentos amorosos ou até as diminuir. Para isso terá qual digitar ‘testingcheats true‘ no Cheat Console.\nSim, ele até inclui 1 bônus usando exercícios físicos para acelerar a perda do peso e definir o corpo (que até mesmo é feito por Vinícius Possebon, do Q48!), mas não espere demasiado mais do que isso.