Der K-RLiToZ - Rey de YR! | Yahoo Respuestas\nLv 32019 points\nUn pensador libre y revolucionario Pacifista con consciencia social Amante del arte, el lenguaje y la literatura Un respondón (por algo estoy aquí, jaja) Un reto de persona ¡Resonad campanas, resonad trompetas, llegó Der K-RLiToZ, el Rey de Yahoo! Respuestas\nAños atrás vi una película que se trataba de varios chicos (creo que eran cinco) que eran muy inteligentes y siempre organizaban discusiones filosóficas. A veces invitaban a una persona más a la conversación y la probaban para ver si era digna de ser incluida en su grupo, y como lo lo era lo asesinaban y lo enterraban en el jardín.\nSolo vi la película una vez y nunca supe cómo se llamaba y quienes actuaron en ella. Busco desesperadamente alguna pista de la existencia de esa película puesto que no creo que haya sido producto de mi imaginación.\nCreo que entre los personajes había una chica rubia y un muchacho de raza negra.\n¿Si en esta vida soy gay, ¿en la anterior lo fui? ¿qué tal en la próxima vida?\nLa pregunta la hago partiendo del supuesto de que existan otras vidas. Me causa mucha curiosidad aquello de las vidas pasadas, si es que las hay.\n¿Por qué vomitó sangre?\nUn amigo que suele tomar mucho el viernes pasado estuvo bebiendo cerveza y se emborrachó; pero se emborrachó bastante, a tal punto que tuvo que vomitar, pero al hacerlo vomitó sangre.\n¿Por qué pudo haber pasado esto?\nP.D. El de la historia, por si acaso, no soy yo. Yo no tomo hace años, creo que le perdí el gusto al licor.\n¿Cómo perdonar a mi familia?\nLa historia es un poco larga así que tratare de resumirla. Mi familia hace un poco más de 6 años se enteró de que soy gay y después les dije. A partir de ahí y por cinco años, no lo aceptaron y tuvieron actitudes que yo considero malas: me enviaron con una psicologa, que me dijo que me iba a ir al infierno si no cambiaba, con un sacerdote que me pregunto si yo era activo o pasivo, y en las típicas peleas familiares al respecto me dijeron cosas como: "estás enfermo", "ya quiero que te mueras para que dejes de hacer sufrir a la familia", "nunca te vamos a aceptar, ojalá te mueras" y sin contar los interminables rezos del rosario frente a mi cuarto y las lágrimas pidiéndole a Dios que me cambiara. Esos años para mí fueron de intenso sufrimiento, pues tuve el abrazo de comprensión que necesitaba, la palabra de cariño o la aceptación que yo sentí que tanto necesitaba en esos momentos de mi vida. Mi familia es buena, y yo sé que me aman, pero en esos momentos y con esas palabras y acciones me hirireron tanto, que yo sufría todos los días, lloraba todos los días, me sentía continuamente solo. Por la culpa que sentía traté tres veces de suicidarme sin éxito. Luego opté por buscar ayuda con un psicoanalista, que después de tres años de sesión me ayudó a que simplemente ya no me importaran las lágrimas de mi madre, de mi padre o de mis hermanas; que ya no me afectaran las palabras hirientes. El tratamiento de psicoanálisis me hizo duro a aquellas manifestaciones que me hacían sentir culpa y me libró de la necesidad del abrazo de cariño o aceptación, como que me hizo hacerme a la idea de que estaba solo en esto.\nY así viví mi vida hasta que hace como un año empecé a notar un cambio en mi familia, más concretamente en mis hermanas hacia mi homosexualidad. Según me dicen ellas, leyeron mucho (ellas y mis padres) para enfrentar el tema de la homosexualidad, del que antes no sabían nada. Dicen que reaccionaron e hicieron lo que hicieron precisamente porque no sabían nada del tema, porque no sabían como enfrentarse a él y porque creían que sufría siendo homosexual (por Dios, si el sufrimiento me lo causaban ellos mismos con su actitud). Me dijeron que ellos también sufrieron porque no sabían nada de mí, ni de cómo estaba yo, ni lo que era yo, que de un buen momento se enteraron que yo era gay sin saber por qué o si me había sucedido algo en la infancia para que yo fuera así. El punto es que ahora los veo más abiertos al tema, aunque no hablan de él, sale a colación cuando discutimos y me sacan en cara algo y yo, por la ira, les respondo echándoles en cara todo lo que sufrí por su culpa, lo solo que me sentí en esos años, los intentos de suicidio, la depresión.\nSinceramente, siento que guardo mucho rencor hacia ellos por todo lo que sufrí en esos años, por todas sus actitudes que me hicieron mucho daño, que me obligaron a buscar ayuda psicológica, que me marcaron de por vida, que me hicieron más duro y desconfiado de la gente (mi razonamiento, si no encontré la comprensión y cariño en ese tema en mi familia, ¿qué me puedo esperar de las demás personas?).\nSon sentimientos encontrados, ellos son una gran familia, siempre me han apoyado en todo, pero me hirieron mucho en aquellos años de mi vida que yo creo que fueron cruciales, y por eso también les guardo rencor, mucho rencor.\nMis hermanas me dicen que ellos también sufrieron, pero creo que no sufrieron tanto como yo, y cuando peleamos, en mi ira y rencor, me siento desahogado cuando les echo en cara todo lo que me hicieron y cuando los veo llorar, porque solo así siento que sufren aunque sea una mínima parte de lo que yo sufrí.\nSé que está mal que les guarde tanto rencor, pero no sé cómo quitármelo. Mi psicoanalista y mi novio me dicen que el perdón llega con el tiempo, pero no sé cuando llegará, es más, no sé si algún día llegara.\nLa pregunta es algo vaga, pero, ¿qué me pueden comentar de todo esto?\nGracias y disculpen si fui cansón o tedioso, gracias por leer, necesitaba desahogarme.\n¿Qué programas hay para acceder a páginas web que están bloqueadas en mi trabajo?\nHay programas como Ultrasurf o FreeGate para navegar por páginas web bloqueadas, pero, ¿cuáles más hay?\nEl Ultrasurf es muy inestable y se cae o causa muchos errores.\nEl FreeGate es bueno, pero hay páginas que no me deja accesar porque dice que solo está hecho para China\n¿Qué debo hacer con este chavo que, al parecer, solo quiere sexo conmigo y amistad?\nEsto es un poco largo, así que tengan paciencia por favor. Estoy saliendo desde hace un poco más de un mes con un chico que es súper buena onda y es bonito físicamente. A mí el chico me gusta, quiero conocerlo más para ver a dónde puedo llegar con él (a ver si quiere ser mi pareja). He conversado con él de esta posibilidad y me ha dicho que, por el momento, tiene miedo de tener una relación (porque dice que lo han lastimado mucho) que yo le gusto, que soy guapo y le caigo bien, pero que no está preparado para una relación. Me dijo también que podemos ser "amigos con derecho" o "amigos especiales" es decir, ser amigos y tener relaciones sexuales. Yo le dije que está bien, pero que sí quiero conocerlo más para ver qué más se da, y me dijo que estaba bien, pero que no me garantizaba nada.\nEntonces, estoy saliendo con él y pos siempre tenemos relaciones, a razón de una vez por semana. Salimos a conversar y todo lo demás, pero más veces nos hemos visto para tener sexo.\nMi pregunta es, ¿debo seguir con este muchacho? muchos me han dicho que si solo quiere amistad y sexo conmigo lo deje porque no me garantiza nada. Yo pienso que igual queda la amistad (de verdad me cae bien) y pues el sexo es simplemente fantástico, jajaja.\nQuizás estoy loco, pero he visto algunos cambios en este muchacho respecto a mí. Cuando tenemos relaciones a veces, de la nada, me abraza y me mira extraño (como con ternura). Me ha contado cosas, según él, muy íntimas suyas, como por ejemplo las veces que lo han lastimado sentimentalmente.\nAhora último incluso me invitó a conocer sus amigos e ir al cine con ellos.\nNo quiero hacerme falsas esperanzas con él, de hecho, no me las hago, pero, ¿puede ser todo eso un signo de que puede cambiar su percepción hacia mí y eventualmente tener una relación estable conmigo?\nGracias de antemano por sus respuestas, chicos y chicas de YR!\nNo está demás que a la mejor respuesta le voy a dar diez puntos y cinco estrellitas.\n¿El Vaticano perdona a Los Beatles, pero, ¿Quién perdona al Vaticano?\nLa pregunta se explica por sí sola.\nLos Beatles, más específicamente John Lennon, dijeron ser "más grandes que Jesús". El Vaticano, muy comedidamente y haciendo alarde de una insospechada misericordia, los perdona, muchos años después.\nSin embargo, ¿Quién perdona al Vaticano por los horrores que la Iglesia y sus miembros han cometido "en nombre de Dios"? Cruzadas, silencio ante el genocidio Nazi, Apartheid, los abusos sexuales de curas pederastas, la homofobia.\n¿¿¿Quién perdona al Vaticano???\nMejor respuesta y cinco estrellas a la mejor respuesta.\n¿Quiero ser el Rey de Yahoo! Respuestas junto con Sabrina Sabrok, ¿qué puedo hacer?\nY si no soy yo, ¿quién más se apunta?\nA hablar, ¡gente!\n¿Me pueden dar los temarios de la UNAM para la Licenciatura de Literatura Hispanoamericana?\nDiez puntitos y estrellita al mejor!!!\n¿Cuáles son los símbolos chinos de...?\nLas palabras "Libertad" y "Revolución". Quiero tatuarme esas palabras, una en cada muñeca. "Libertad" en la derecha y "Revolución" en la izquierda. Necesito cual es su equivalente en símbolos chinos.\n10 pts al mejor de los mejores\n¿Postres y muchachos... ¿Cúal es....?\n... tu postre favorito? Hay tantos tipos de postres, algunos interesantes, de muchos sabores, colores y sorpresas; mientras que hay otros que son planos, aburridos, de un solo color y pues no esperas mucho de ellos. Igual sucede con los chicos. Hay algunos que son una verdadera sorpresa, emoción e interesantes, mientras que los hay aburridos.\nSegún mis gustos en postres (y en chicos, jeje) alguien interesante sería tan provocador y diverso como un Tiramisú, mientras que lo opuesto es un Flan, alguien aburrido, de un solo sabor y siempre un solo color.\n¿Qué postre le asignarías a qué chico según tus gustos?\n¿Me quiero poner un arete en la lengua, ¿qué puede pasar?\nBueno, creo que el título lo dice todo. Tengo varias dudas que me gustaría alguien las solucione.\n1. ¿Por cuánto tiempo no podré hablar o usar bien la lengua si me pongo el arete?\n2. ¿Por cuánto tiempo no podré hablar, esto es si es que no podré hablar?\n3. Yo a veces en mi trabajo debo locutar reportajes para televisión, esto afectará mi desempeño?\n4. Si yo me lo quito, ¿en cuanto tiempo se me cerrará el hueco en la lengua?, ¿se cerrará algún día?\n5. Luego de todo esto, ¿me quedará rara la lengua quizás?\n6. ¿Es seguro, podré contraer alguna infección? (bueno, creo que esto es obvio si no me cuido, lo que me lleva a la pregunta 7\n7. ¿Qué medidas de cuidado debo adoptar luego de hacerme la perforación?\nEspero que me puedan ayudar, recuerden, 10 pts y cinco estrellitas a quien me pueda solucionar esas dudas...\n¿Creen que se me paso la mano con lo que dije?\nMe gustaría una respuesta sincera:\nUn compañero de trabajo (tiene 23 años de edad y está por tener un hijo no deseado con una chica que fue su enamorada y con la que se casará por obligación) , durante una discusión estrictamente laboral, se alteró y me dijo: "ya no me jodas maricón" (yo soy gay).\nYo le respondí: "Si yo soy maricón entonces tú muy machito porque le hiciste un hijo bastardo a tu novia solamente porque se te rompió el condón, no se cuidaron o ella no se tomó las pastillas". Él me contesto: ¿Qué me dijiste?, ¡con eso no te metas! y yo le respondí nuevamente "Yo me meto con lo que quiero, tendrás un hijo bastardo y no deseado... tú sabes que es así... no te olvides nunca... porque toda la vida sabrás que tu niño, el que nacerá pronto... es, fue y será un accidente... siempre un bastardo".\nEntonces, luego de leer todo esto, ¿Se me pasó la mano? Sinceridad por favor...


El CEIP José Luis Villar Palasí acogió el acto de inicio de curso en Vélez-Málaga – Educación en Málaga\nInicio » Educación » Centros » El CEIP José Luis Villar Palasí acogió el acto de inicio de curso en Vélez-Málaga\nEl CEIP José Luis Villar Palasí acogió el acto de inicio de curso en Vélez-Málaga\npor admin|Publicada 23 de septiembre de 2015\nEste curso, el CEIP José Luis Villar Palasí ha sido elegido por el Ayuntamiento de Vélez-Málaga para realizar la inauguración oficial del curso 2015-2016, que tuvo lugar el pasado viernes 11 de septiembre.\nAcudieron miembros de la corporación municipal, entre ellos el alcalde Antonio Moreno Ferrer y el concejal de Educación Pepe Alarcón. La directora, Soledad Pino, dio la enhorabuena a toda la comunidad educativa por el trabajo realizado desde el Proyecto Escuela Espacio de Paz “Mar Abierto” y por los logros conseguidos, habiendo sido el Centro de la provincia de Málaga con mayor puntuación en el reconocimiento de Convivencia +.\nEl alumnado, por su parte, retomó una actividad realizada el curso pasado dentro del Proyecto de Paz Interior que llevamos a cabo desde el Proyecto Escuela Espacio de Paz , la Danza del corazón.\nSe trata de una sencilla meditación en movimiento que nos invita a coger lo bueno del pasado, presente y futuro así como a desprendernos de aquello que no nos ayuda a avanzar. Para la preparación de la danza, hemos contado con Meme Gallardo, profesora de yoga que colabora con el colegio.\nComo símbolo de bienvenida, los alumn@s han colgado lazos con mensajes de bienvenida en la puerta de la paz del centro.\nEntrada anterior El Cánovas y la Sala Gades presentan seis estrenos nacionales en una temporada de carácter contemporáneo para la infancia y la juventud\nEntrada siguiente La Junta invierte 70.000 euros en la mejora de las instalaciones del CEIP Neill


Las promotoras inmobiliarias piden bajar al 4% el IVA para la compra de una primera vivienda. Así como recuperar las deducciones que tenía en el IRPF tanto para compradores como para el alquiler\nAmpliado el plazo para pedir la moratoria del alquiler de vivienda hasta el 2 de julio por el covid-19\nLas inmobiliarias podrán abrir sus locales con cita previa previsiblemente el 4 de mayo\nEl Plan de Transición hacia una nueva normalidad tras el covid-19 que ha presentado el Gobierno contempla la desescalada del confinamiento y la reactivación económica con un ritmo diferente en cada provincia e isla, en función de la situación sanitaria. Así, desde varias portavocías del sector inmobiliario se señala que la apertura de locales y establecimientos comerciales con cita previa y atención individualizada podría ser el 4 de mayo y de manera generalizada, el 11 de mayo.\nEl 86% de las operaciones inmobiliarias abiertas antes de la llegada del coronavirus (unas 60, con una inversión conjunta de unos 4.000 millones de euros) se mantienen activas, según la consultora inmobiliaria Savills Aguirre Newman. El 14% restante ha sido cancelada.\nLa irrupción de la crisis del covid-19 dificulta la compra de una vivienda, debido al estado de alarma decretado por el Gobierno. Los contribuyentes, cuyo plazo de reinversión por la compra de una casa esté a punto de finalizar, deben saber que cuentan con una ampliación del plazo para invertir el dinero de la venta de su vivienda habitual en otra nueva y, así, disfrutar de la exención del pago en el IRPF.\nLas grandes promotoras han detenido las obras de 170 promociones hasta el próximo 9 de abril, debido a la crisis del coronavirus. Asprima, calcula que 157.000 viviendas sufrirán el parón de la construcción. De alargarse más el periodo de inactividad, se producirán retrasos en la entrega de las viviendas en construcción. Pero ante esta situación fortuita, no sería exigible penalización alguna por el retraso a la promotora que incumpla.\nComprar, vender o alquilar en pleno covid-19\nidealista/news repasa en este especial toda la información que necesitas para comprar, vender o alquilar una casa, cómo afecta el confinamiento a las hipotecas y claves para organizar y poner a punto tu hogar durante la cuarentena. También recoge las previsiones de los expertos sobre el impacto que tendrá el coronavirus en el sector inmobiliario y la economía.


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Noticia Madrid. Entra en funcionamiento el protocolo anticontaminación de la capital\nEl nuevo protocolo anticontaminación de Madrid entra en vigor hoy, lunes 8 de octubre.\nLa ordenanza introduce cambios con respecto al pliego anterior, no centrándose en la arbitrariedad de las matriculas pares o impares sino en el etiquetado a la hora de acceder a la capital con el vehículo privado -siendo los más afectados los vehículos de gasolina anteriores al año 2000 y los diésel anteriores a 2006-. Igualmente, el consistorio ha incluido las motocicletas en el protocolo y ha previsto nuevos escenarios para atajar el problema de la contaminación en la ciudad, no permitiéndose aparcar en la zona SER a aquellos vehículos que no sean cero emisiones.\nAl igual que en el protocolo anterior, la activación de episodios y escenarios se producirá cuando la previsión de la AEMET sea desfavorable para la contaminación. Así, se dispondrá el primer escenario, el cual irá avanzando de manera gradual en función de las circunstancias. En el escenario 2, además de la limitación del aparcamiento en la zona SER a los vehículos que no sean CERO o ECO, se introducen medidas de limitación del tráfico, con la limitación de la circulación de los vehículos sin distintivo ambiental, los más contaminantes, en la M-30 y su interior.\nYa en el escenario 3, la restricción de circulación a los vehículos más contaminantes se extenderá a toda la ciudad. Como novedad, se crea un nuevo escenario 4 para cuando el nivel de aviso se mantenga durante cuatro días consecutivos, en el que la limitación de circulación se extenderá también a los vehículos con clasificación ambiental B en la M-30 y su interior. El escenario 5 se corresponde con el nivel de alerta definido por la Unión Europea. En esta situación sólo se permitirá en toda la ciudad, la circulación de vehículos CERO y ECO, y el aparcamiento en el SER de los CERO emisiones, sin incluir los ECO.\nLos vehículo de residentes podrán continuar estacionando en plazas SER, si bien deberán de hacerlo exclusivamente en las inmediaciones de su vivienda. También se beneficiarán del servicio los vehículos de las personas con movilidad reducida, los autorizados como comerciales e industriales del SER con calificación ambiental CERO, ECO y C, y los B hasta el 31 de diciembre de 2020, los vehículos estacionados en zonas reservadas para su actividad y los autotaxis y vehículos de alquiler de servicio público con conductor que estén en servicio y su conductor esté presente, entre otras.


Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions | Protocol (Translated to Spanish)\ninteracciones de proteínas están en el corazón de la función de la célula. técnicas calorimétricas y espectroscópicas son comúnmente utilizados para caracterizarlos. Aquí describimos anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar la interacción entre la proteína mutada en el síndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) y el factor de elongación 1 similar GTPasa (EFL1).\nLas interacciones proteína-proteína desempeñan un papel esencial en la función de un organismo vivo. Una vez que una interacción ha sido identificado y validado es necesario caracterizar en el nivel estructural y mecánica. Existen varios métodos bioquímicos y biofísicos para tal fin. Entre ellos, anisotropía de fluorescencia es una técnica poderosa particularmente cuando se utiliza la intensidad de fluorescencia de una proteína marcada con fluoróforo permanece constante tras la interacción proteína-proteína. En esta técnica, una proteína marcada con fluoróforo se excita con luz polarizada verticalmente de una longitud de onda apropiada que excita selectivamente un subconjunto de los fluoróforos en función de su orientación relativa con el haz entrante. La emisión resultante también tiene una direccionalidad cuya relación en los planos vertical y horizontal define la anisotropía (r) como sigue: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), donde I VV y yo\nLas células contienen una multitud de biomacromoléculas que interactúan constantemente entre sí. Esta asociación da lugar a complejos que participan en las vías celulares responsables de su funcionamiento en la transducción de señales, regulación de la expresión génica y la migración celular entre otros. Todas las interacciones proteína-proteína que se producen en una célula comprenden una red conocida como el interactome. En Saccharomyces cerevisiae más de 70% de sus proteínas se ha demostrado que tiene que interactúan socios 1. La comprensión de la interactoma de una célula y sus funciones proporcionar información relevante sobre la complejidad y la diversidad de los organismos vivos. Varios métodos han sido descritos para identificar y caracterizar las interacciones proteína-proteína. Diferentes alta a través de métodos tales como poner dos híbridos de levadura 2, ensayos de complementación de proteínas fragmento 3, 4 purificación por afinidad acoplada a espectrometría de masas y microarra proteínasys se utilizan para identificar una interacción 5,6. Una vez identificados, es necesario para validar y esto puede variar sobre una base de caso por caso. Típicamente, estos experimentos implican la interrupción de la interacción en sí misma en el nivel de los miembros individuales de la pareja de interacción, por ejemplo, por deleción del gen o la sobreexpresión de una de las proteínas y, a continuación en busca de cambios en las propiedades o la función del otro miembro en el nivel celular. Posteriormente, técnicas biofísicas 7 se utilizan para caracterizar la interacción proteína-proteína en el nivel molecular. Con este fin, la estructura de los complejos de proteínas se determinó por cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear y crio-microscopía electrónica mientras calorimetría y espectroscopía de fluorescencia se utilizan para describir cuantitativamente y de manera mecánica.\nEn este trabajo, la anisotropía de fluorescencia se usó como una técnica para caracterizar la interacción entre la GTPasa EFL1 y el SBDproteína S. Estas proteínas participan en la síntesis de los ribosomas mediante la promoción de la liberación del factor de iniciación eucariótico 6 de la superficie de las subunidad 60S ribosomal 8. La proteína SBDS está mutado en una enfermedad conocida como el síndrome de Shwachman-Diamond 9 y actúa como un factor de intercambio de nucleótidos de guanina para EFL1 disminuyendo su afinidad por difosfato de guanosina 10,11. mutaciones de la enfermedad en SBDS abolir la interacción con EFL1 de materiales, evitando su activación.\nLa anisotropía de fluorescencia se utiliza comúnmente en aplicaciones biológicas para estudiar la proteína-péptido o interacciones proteína-ácido nucleico. Se basa en el principio de que un fluoróforo excitado con los resultados de luz polarizada en una emisión parcialmente polarizada. La anisotropía de fluorescencia se define por la Ecuación 1:\ndonde VV y VH son laintensidades de fluorescencia de la vertical (VV) y horizontalmente (VH) de emisión polarizadas cuando la muestra se excita con luz polarizada verticalmente 12. La anisotropía de fluorescencia es sensible a los factores que afectan a la tasa de la difusión rotacional del fluoróforo y por lo tanto depende de la temperatura, la viscosidad de la solución y el tamaño molecular aparente del fluoróforo. El tamaño aparente de una proteína que contiene un fluoróforo aumenta cuando interactúa con otra proteína y tal cambio, entonces se puede evaluar como un cambio en la anisotropía. Más específicamente, un fluoróforo que gira lentamente en solución con respecto a su tiempo de vida fluorescente tendrá un valor grande I VV y valor pequeño I VH y por lo tanto exhibirá un relativamente grande anisotropía. Para fluoróforos que caen rápidamente en relación a su tiempo de vida fluorescente, me VV y VH será similar y su valor será pequeña anisotropía 12 (Figura 1). Además, para una buena señal de anisotropía para la medición del ruido, es necesario disponer de un fluoróforo con una vida de fluorescencia similar al tiempo de correlación rotacional de la molécula de interés. De lo contrario, no es posible registrar con precisión la diferencia de anisotropía entre la proteína libre y que en el complejo. Por ejemplo, la anisotropía de una sonda fluorescente con una vida útil cerca de 4 nseg tales como fluoresceína o rodamina unidos a un compuesto de bajo peso molecular de 100 Da es 0,05. La unión a una molécula de 160 kDa aumentará su valor de anisotropía a 0,29; una diferencia que se puede medir con precisión. Por el contrario, la misma sonda fluorescente que participan en una reacción de unión cuyo aumento en el tamaño molecular varía de 65 a 1000 kDa sólo resultará en un cambio de anisotropía de 0,28 hasta 0,3, que es demasiado pequeña para ser medida con precisión. En este escenario, una sonda con un tiempo de vida de 400 nseg sería más adecuado 12.\nFigura 1. Representación esquemática del equipo utilizado para medir la anisotropía de fluorescencia y el procedimiento. Representación esquemática del equipo utilizado para realizar una medición de anisotropía de fluorescencia proteína-proteína experimento interacción. Fluoróforos que caen rápido pantalla pequeña anisotropía que aumenta tras la unión a un compañero de interacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\naplicaciones de fluorescencia requieren la presencia de un fluoróforo en cualquiera de las moléculas estudiadas. Para el estudio de las interacciones proteína-proteína hay tres tipos de fluoróforos: 1) los residuos de triptófano presentes en las proteínas, 2) fluoróforos unidos químicamente y 3) parejas de fusión fluorescentes tales como proteína verde fluorescente (GFP) y su derivatantes. La mayoría de las proteínas tienen residuos de triptófano en su estructura, por tanto, la manera más fácil de medir una interacción es mediante el control de los cambios en los espectros de fluorescencia correspondiente o mediante el control de los cambios en la intensidad de fluorescencia de los residuos de triptófano. Sin embargo, los residuos de triptófano pueden estar presentes en ambas proteínas que complican el análisis. Por otra parte, por un fluoróforo para cambiar sus propiedades fluorescentes debido a una interacción que tiene que estar situado en o cerca del sitio de unión y que podría interferir con la interacción en sí misma. Esto necesita una atención especial cuando se utiliza fluoróforos voluminosos tales como GFP. Si ninguno de estos fluoróforos se puede utilizar para estudios de unión es necesario, entonces, para introducir fluoróforos extrínsecas a la de las proteínas implicadas. Existen muchos fluoróforos sintetizados químicamente y pueden ser unidos covalentemente a las proteínas a través de sus grupos reactivos tales como los grupos amina (cadena lateral de lisinas o N-terminal) y los grupos tiol en cisteína. Fderivados luorophore con ésteres de isotiocianato y succinimidilo reaccionan con grupos amida mientras yodoacetamida y maleimida son grupos reactivos con tiol 13. Los colorantes más comunes utilizados en aplicaciones de fluorescencia son derivados de la fluoresceína y los colorantes rodamina verde, cumarinas, fluoróforos BODIPY y colorantes Alexa Fluor. Una lista detallada de fluoróforos disponibles en el mercado y su uso se puede encontrar en las referencias 14,15. Para el etiquetado de éxito, el grupo reactivo debe ser expuesto en la superficie de la proteína, pero debido a la gran cantidad de grupos funcionales reactivos típicamente presentes en polipéptidos que es muy difícil de conseguir la modificación específica de sitio. La proteína de interés en este estudio, SBDS, contiene 5 cisteínas libres y 33 lisinas que pueden resultar en el etiquetado de múltiples sitios. etiquetado no uniforme puede afectar a la unión y complicará el análisis de datos como diferentes moléculas de fluoróforo pueden provocar diferentes señales de intensidad de fluorescencia tras la unión. para overcome este problema, hemos utilizado el fluoróforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína a la etiqueta sitio directa la proteína SBDS. Este es un colorante de arsenóxido con una alta afinidad por cuatro cisteínas espaciadas en un motivo de saber como Flash-tag consiste en la secuencia CCXXCC donde X es cualquier aminoácido distinto de cisteína 16,17. Este motivo de tetracisteína se añade a la N- o C-terminal de la proteína por ingeniería genética junto con un enlazador adecuado para evitar la interrupción del pliegue general de la proteína. La pareja que consiste en FLASH tinte y Flash-tag fue diseñado originalmente para las proteínas de etiquetas específicas del lugar en las células 17 que vivían, pero también puede ser utilizada para etiquetar proteínas purificadas in vitro como se ejemplifica aquí. Además, las estrategias enzimáticos también se han desarrollado para permitir la funcionalización específica de sitio de proteínas 18.\nEn este manuscrito se describe la utilidad de anisotropía de fluorescencia de unaherramienta sa para estudiar las interacciones proteína-proteína. La unión puede evaluarse por simple inspección de la forma de la curva de unión mientras que la información cuantitativa puede obtenerse a partir del ajuste de los datos experimentales.\n1. SBDS-flash expresión de la proteína Tag y Purificación\nNOTA: Para los experimentos de anisotropía, una etiqueta de flash correspondiente a la secuencia de-Pro-Cys-Cys-Cys Gly Cys se añadió a la C-terminal de la secuencia de codificación SBDS humanos por PCR. Este constructo se subclonó en el vector de expresión pRSET-A y se transformó en células C41 Escherichia coli para expresar una proteína que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal (His-tag), los SBDS humanos secuencia y un C-terminal etiqueta FLASH 10 de codificación.\nExpresión de la proteína SBDS-Flash\nTransformar E. competente células de E. coli C41 con el plásmido pRSET-HisSBDS-flash utilizando un protocolo estándar de choque térmico 19. Placa de las células en medios sólidos Luria-Bertani (LB) suplementado con ampicilina 100 mg / ml. LB composición medios sólidos se compone de 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, 10 g de triptona y 20 g de agar para el volumen de 1 L.\nbacterias transformadas cultivo a 37 ° C hastaabsorbancia a 600 nm (A 600) alcanza 0,5 a 0,7 en 1 L de medio líquido LB suplementado con 100 g de ampicilina / ml.\nInducir la expresión de la proteína mediante la adición de 0,5 mM isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido a la cultura y continuar la incubación durante más de 5 horas.\nRecoger la suspensión bacteriana por centrifugación a 3.800 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. En este punto, ya sea almacenar el sedimento celular a -20 ° C o utilizar inmediatamente para la purificación de proteínas.\nLa purificación de proteínas SBDS-Flash\nNOTA: Todas las etapas cromatográficas se realizan usando un sistema de cromatografía líquida (FPLC) de proteínas rápida o una bomba peristáltica. Cromatografía de Ni 2+ -affinity utiliza una columna de flujo rápido de 5 ml. cromatografía de intercambio aniónico utiliza una columna de intercambio de sulfopropilo catiónico fuerte 5 ml. Una velocidad de flujo de 3 ml / min fue utilizado para todas las etapas cromatográficas.\nResuspender las células en 35 ml de SBDS lisis bUffer (50 mM tampón de fosfato pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y se lisan por sonicación durante un tiempo total de 4 min usando ciclos de 10 seg ON y 30 seg OFF, en 4 DO.\nCentrifugar la muestra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C.\nMantenga el sobrenadante y desechar el sedimento para eliminar los restos celulares.\nEquilibrar la columna de afinidad de Ni 2+ con 3 volúmenes de columna (CV) de tampón de lisis SBDS e introducir el conjunto sobrenadante clarificado en la columna.\nEliminar la proteína no unida mediante lavado con 3 CV de tampón de lisis SBDS y se eluye con 3 CV de tampón de elución SBDS (tampón fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM).\nDiluir la proteína 6 veces se eluyó con tampón fosfato 50 mM pH 6,5 y eliminar los posibles agregados por filtración a través de una membrana de 0,22 micras de celulosa.\nEquilibrar la columna de intercambiador de cationes de sulfopropilo con 3 CV de falta de sal columna Stampón (tampón fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) e introducir la muestra de proteína de la etapa anterior.\nel material no unido de lavado con 3 CV de baja sal S tampón de columna y se eluye la proteína en un solo paso con tampón fosfato 50 mM pH 6,5, 1 M NaCl.\nDiluir la proteína 3,3 veces eluida con 50 mM de tampón de fosfato de pH 6,5. Se concentra la proteína con dispositivos de ultrafiltración por centrifugación a 3800 xg durante 15 min. Flash congelar la proteína en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior.\nVerificar la pureza de la proteína por análisis de SDS-PAGE y tinción de Coomassie 20.\n2. EFL1 Expresión y Purificación de Proteínas\nNOTA: EFL1 se expresó bajo la regulación del promotor Gal 1/10 divergentes 21 y el Saccharomyces cerevisiae MAT Un 3'UTR en el vector pRS426. La proteína recombinante codifica la isoforma humana EFL1 1 fusionado a una proteasa de virus del grabado del tabaco (TEV) sitio de reconocimiento y una etiqueta de hexahistidina en el extremo C-terminal.\nExpresión de la proteína EFL1\nTransformar S. células cerevisiae BCY123 con el plásmido pRS426-EFL1TevHis usando un protocolo de acetato de litio estándar 22. Placa de todas las células transformadas en caída sintético a cabo los medios de comunicación sin uracilo (SD-URA) suplementado con 2% (w / v) de glucosa. Composición de los medios de comunicación SD-URA consiste en 8 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11 g de casaminoácidos, 55 mg de sulfato de adenina, 55 mg de tirosina, 60 mg de leucina y 60 mg de triptófano para el volumen de 1 L.\nCultivo transformado levadura a 30 ° C hasta 600 A llega a 1,8 en 1 l de medio SD-ura suplementado con 0,5% (w / v) de glucosa.\nInducir la expresión de proteína mediante la adición de 2,8% de galactosa (v / w) al cultivo y continuar la incubación durante otras 18 horas a 30 ° C.\nRecoger la suspensión de levadura por centrifugación a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.En este punto, ya sea almacenar el sedimento celular a -20 ° C o utilizar inmediatamente para la purificación de proteínas.\nLa purificación de proteínas EFL1\nNOTA: Todas las etapas cromatográficas se realizan usando un sistema FPLC o una bomba peristáltica. Cromatografía de Ni 2+ -affinity utiliza una columna de flujo rápido de 5 ml a un caudal de 3 ml / min. cromatografía de exclusión por tamaños utiliza una columna de 125 ml pre-empaquetada con resina Superdex 200 a una velocidad de flujo de 1 ml / min.\nResuspender las células en 50 ml de EFL1 tampón de lisis (Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol) suplementado con PMSF 1 mM y benzamidina 1 mM y romper las células por la fricción en un batidor de bolas usando perlas de vidrio (Ø = 0,5 mm) para un tiempo total de 6 min utilizando ciclos de 2 min ON y OFF 15 min, a 4 ° C.\nEquilibrar la columna de afinidad de Ni 2+ con 3 CV de tampón de lisis EFL1 e introducir todo el sobrenadante clarificado en la columna.\nEliminar la proteína no unida mediante lavado con 3 CV de tampón de lisis EFL1 y se eluye con 3 CV de tampón de elución EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol).\nEquilibrar la columna de exclusión de tamaño con 1,5 CV de tampón de Anisotropía (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol, 5 mM β-mercaptoetanol).\nSe concentra a 1 ml de la proteína EFL1 eluida de la columna de afinidad de Ni 2+ con dispositivos de ultrafiltración por centrifugación a 3.800 xg hasta el volumen deseado. Introducir la muestra en la columna de exclusión de tamaño.\nRecoger la proteína eluida y se concentra por ultrafiltración a una concentración final de aproximadamente 30 mM. Flash congelar la proteína en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior. verificar THe pureza de la proteína por análisis de SDS-PAGE y tinción de Coomassie 20.\n3. El etiquetado de SBDS-flash con el flash colorante fluorescente 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína\nMezclar 3 nmol de la proteína SBDS-flash con 3 nmol de la 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína en un volumen de 5 l de tampón de anisotropía.\nDeje que la reacción transcurra durante 8 horas a 4 ° C. Se dializa la muestra frente a tampón de anisotropía durante la noche para eliminar el colorante libre.\nUsar la ley de Lambert-Beer para cuantificar el% de proteína marcada. Medir la absorbancia a 280 nm y 508 nm en un espectrofotómetro usando una cubeta de cuarzo de volumen apropiado. NOTA: Tenga en cuenta los siguientes coeficientes de absorción molar (M -1 cm -1):\nCalcular la concentración de proteína SBDS-flash marcada usando la ecuación 2.\nCalcular la concentración de proteína total SBDS utilizando la Ecuación 3, sustituyendo el calculado C SBDS-flash de la etapa anterior.\nCalcular el porcentaje de proteína marcada utilizando la ecuación 4.\n4. Experimentos de anisotropía de fluorescencia\nNOTA: los experimentos de anisotropía se realizaron en un espectrofluorómetro equipado con una caja de herramientas de recogida de polarización y los datos se realizó utilizando el programa de anisotropía proporcionada en el software del equipo. La longitud de onda de excitación se fijó a 494 nm con un ancho de banda espectral de 8 nm y la emisión se registró usando un filtro de paso de banda de 530 ± 25 nm. Las mediciones se realizaron a 25 ° C en una cubeta de 200 l con una longitud de la trayectoria 5 mm 10.\nEn una cubeta de fluorescencia, colocar 200 l de 30 nm SBDS intermitencias en tampón de anisotropía y se valora 2 l de EFL1 30 mM. Mezclar bien y dejar reposar la reacción durante 3 minutos antes de medir el valor de anisotropía.\nRepita el paso 4.1 hasta un volumen total de 40 l de EFL1 se ha añadido.\nAjustar los datos al modelo de unión apropiada usando un algoritmo de regresión de mínimos cuadrados no lineal. Las ecuaciones para los modelos de unión más comunes se presentan en la Tabla 1.\nEvaluar el mejor modelo que describe la interacción entre las proteínas mediante la inspección de los residuos de la forma 23. Apoyar el modelo elegido con experimentos adicionales.\nTabla 1. Modelos de unión común la interacción proteína-proteína y las ecuaciones matemáticas que los describen.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.\nPara llevar a cabo cualquier experimento anisotropía es importante para descartar grandes cambios en la intensidad de fluorescencia del fluoróforo ya que la anisotropía observada de una mezcla de especies está representada por la Ecuación 5:\ndonde F i representa la fluorescencia fraccional de cada componente y r i es la anisotropía correspondiente. La fluorescencia fraccional de cada componente depende tanto, su concentración y su fluorescencia relativa, que se define por la ecuación 6:\ndonde X i representa la fracción molar de THe i ª especie y Ø i es el rendimiento cuántico de la i-ésima especie.\nPor lo tanto, si la intensidad de fluorescencia cambia dramáticamente a lo largo de la titulación es mejor, ya sea medir la formación del complejo como una función del cambio en la señal de fluorescencia y no de la señal de anisotropía, o corregir el valor de anisotropía observada por el ajuste tanto de la intensidad de fluorescencia y la anisotropía datos. La fluorescencia de SBDS-flash hace el cambio no es perceptible tras la unión a EFL1 (Figura 2) lo que sugiere que anisotropía de fluorescencia es adecuado para medir la unión entre las dos proteínas.\nFigura 2. La fluorescencia emisión de SBDS-flash al hacer la valoración de concentraciones crecientes de EFL1. Los cambios en la emisión de fluorescencia del fluoróforo son negligible y al azar a lo largo de la titulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nUn ejemplo de la curva obtenida a partir de la valoración de EFL1 a SBDS-Flash de unión anisotropía de fluorescencia se muestra en la Figura 3. Cualitativamente, la forma de la gráfica muestra claramente que las dos proteínas interactúan como se evidencia por un aumento en la señal de anisotropía tras la adición de EFL1. Por otra parte, los valores de anisotropía alcanzaron una meseta que sugiere que al final de la titulación toda la proteína SBDS-flash estaba presente en un complejo con EFL1. Es posible, entonces, para describir cuantitativamente la interacción entre estas proteínas y ajustar los datos usando regresión no lineal de mínimos cuadrados a un modelo de unión presunta y obtener la disociación correspondiente constante de equilibrio. Montaje de un modelo de un sitio de unión no hizo appropritamente describir los datos experimentales (Figura 3A). Esto es evidente no sólo desde el rastro de ajuste en la curva de unión, sino también de las desviaciones de los residuos de la forma (la diferencia entre los datos teóricos y experimentales) que son apreciables y no aleatoria. Esto concuerda bien con el hecho de que un único modelo de sitio de unión se describe matemáticamente mediante una curva hiperbólica en lugar de una curva sigmoidal como la observada para los datos experimentales presentados en la Figura 3. Por otra parte, los modelos tales como dos idénticos o dos diferentes de unión sitios describen mejor los datos experimentales y los residuos de la serie sin ajuste de desviación sistemática el apoyo a un modelo de asociación de dos sitios (Figura 3B-C). En ausencia de cualquier otra información experimental es difícil establecer cuál de los dos modelos se corresponde con el mecanismo de unión entre EFL1 y SBDS. Sin embargo, SBDS y EFL1 son dos proteínas monoméricas, por lo que es difficULT prever una idéntica modelo de dos sitios de unión.\n. Figura 3. anisotropía de fluorescencia isoterma de unión de la interacción entre EFL1 y SBDS-flash La línea continua en cada una de las parcelas superiores corresponde al ajuste de los datos a diferentes modelos de fijaciones: (A) solo sitio, (B) dos sitios idénticos y (C) dos sitios no idénticos. Parcelas inferiores representan los residuos del ajuste al modelo correspondiente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nLa mayoría de los experimentos bioquímicos con proteínas requieren no sólo proteína pura, sino también grandes cantidades de ellos, independientemente de la técnica utilizada. Por esta razón, las proteínas utilizadas para este tipo de experimentos se obtienen mediante la expresión heteróloga, como era el caso que aquí se presenta. espectroscopia Florescence requiere la presencia de un fluoróforo en la molécula estudiada. residuos aromáticos constituyen los fluoróforos intrínsecos de una proteína, sin embargo, el uso de su señal para estudiar las interacciones proteína-proteína complica el análisis ya que son comunes a la mayoría de las proteínas y estarían presentes en ambos, la proteína receptora y el ligando. Además, la vida útil de triptófano es demasiado corto para los experimentos de anisotropía de fluorescencia. Por esta razón, es común añadir fluoróforos extrínsecos a una de las proteínas estudiadas. Con este fin, se añadió un fluoróforo al extremo C-terminal de SBDS a través de un enlace de coordinación entre el colorante 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluorescein con un motivo de tetracisteína introducido en la proteína por ingeniería genética. La elección de la proteína que desnuda el fluoróforo no es una cuestión aleatoria. Debido al tamaño de las proteínas estudiadas aquí (SBDS 29 kDa y EFL1 127 kDa), que esperábamos un cambio mayor en la anisotropía entre el libre marcado con SBDS y que en el complejo con EFL1, en comparación con el cambio esperado entre el libre marcado con EFL1 y que unido a SBDS. Teniendo esto en cuenta, una etiqueta de Flash se introdujo en SBDS en lugar de EFL1. Otro parámetro importante a tener en cuenta al configurar un experimento de anisotropía de fluorescencia es la absorción de las soluciones utilizadas. La densidad óptica de la solución en la cubeta no debe ser mayor que 0,1 en la longitud de onda de excitación y emisión, y debe permanecer constante a lo largo de toda la titulación. De lo contrario, el efecto de filtro interno puede interferir en la medición y debe ser corregido para. En el experimento que aquí se presenta, las proteínas estudiadas no absorben a la longitud de onda de excitation o emisión de la 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) colorante de fluoresceína; por lo tanto el efecto de filtro interno no supone un problema.\nEn cuanto a la recogida de datos, y para encajar posteriormente correctamente los datos, es necesario tener líneas de base inferior y superior bien definidas con varios puntos de datos a través de la transición a lo largo de la curva de unión. De lo contrario, ajuste de los datos es inexacta e información sobre el modo de unión se puede perder. Para describir una curva de unión decente es necesario que la concentración de ligando libre se diferencia por dos unidades logarítmicas debajo y por encima de la constante de disociación, sin embargo, experimentalmente que esto puede ser difícil de lograr. En el límite inferior, problemas con la sensibilidad del equipo pueden surgir en particular cuando la afinidad entre las proteínas es muy alta, mientras que las grandes concentraciones pueden no ser alcanzables debido a problemas de solubilidad del ligando. Esto fue ejemplificado claramente cuando se prueba la interacción entre el SBDSS143L mutante de la enfermedad y EFL1. Este mutante interrumpe la unión a EFL1 hasta tal punto que no era posible obtener una curva de unión adecuada desde EFL1 solamente se puede concentrar hasta 70 mM y la proteína se diluye ≈ 5 veces durante la valoración 10. Por lo tanto, es necesario disponer de una estimación aproximada de la afinidad para optimizar el esquema de titulación y asegúrese de que salta en la concentración de ligando no se producen en las posiciones que podría causar un ajuste menos preciso. Por ejemplo, faltan los puntos iniciales de la curva de unión presenta en la Figura 3 hará que se vea como una hipérbola engañar al investigador hacia un modelo único sitio de unión.\nUna vez recogidos, los datos se ajustaron a un modelo de unión presunta. En comparación a la fluorescencia de datos, datos de anisotropía se pueden utilizar sin manipulación adicional y no necesitan corrección para efectos de dilución. Las ecuaciones que se presentan en la Tabla 1 consideran que [L] ≈[L] 0 en cada punto de la valoración. Esto no puede suceder cuando la afinidad entre las proteínas es muy alta de tal manera que en los primeros puntos de la depleción de ligando de valoración se produce. En este escenario, ecuaciones de segundo grado más complejas describen en otra parte 23 se necesitan para ajustar los datos. En el experimento descrito aquí, el EFL1 ligando estaba siempre en gran exceso en comparación con la concentración de SBDS-Flash y el cambio en la concentración EFL1 en cada punto de la titulación puede no tomarse en cuenta. Como se discutió en la sección de resultados, un modelo de dos sitios de unión no idénticos describe mejor los datos experimentales (Figura 3C). información bioquímica adicional obtenido en el grupo apoya la idea de que este es el modelo correcto para describir la interacción entre EFL1 y SBDS (datos no mostrados). Este modo de interacción es común en las proteínas multi-dominio, como EFL1 y SBDS son, y existen varios ejemplos en la literatura 24-26. Sin embargo, es unalso importante descartar una interacción no específica que puede aparecer como un modelo de interacción de los distintos sitios de unión con diferentes afinidades por su ligando. Con este fin, una representación de Scatchard es muy útil. En comparación con otras técnicas, la señal de anisotropía de fluorescencia informa de la cantidad de complejo formado y por lo tanto es posible construir una representación de Scatchard con los datos. Una curva convexa Scatchard sugiere un modelo de dos sitios de unión diferentes con cooperatividad negativa o la unión no específica, mientras que una trama cóncava Scatchard implica un modelo de dos sitios de unión diferentes con cooperatividad positiva o inestabilidad ligando (Figura 4). El análisis de los datos experimentales mostraron una representación de Scatchard con una forma cóncava de soporte el modelo de dos sitios de unión independientes para EFL1 y SBDS (Figura 4D). Además, la cooperatividad positiva se confirmó después de realizar un análisis de la colina que resultó en un valor coeficiente de Hill de 1,8 ± 0,02 (datos no mostrados).\nFigura 4. representaciones de Scatchard para modelos diferentes de unión proteína-proteína. (A) sitio de unión únicas o múltiples sitios idénticos que no interactúan. (B) los sitios de unión diferentes múltiples con cooperatividad negativa o la unión no específica. (C) los sitios de unión diferentes múltiples con cooperatividad positiva o inestabilidad ligando. Plot (D) resultante de Scatchard análisis de los datos de anisotropía experimentales obtenidos a partir de la valoración de EFL1 a SBDS-Flash. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nLa anisotropía de fluorescencia es una técnica cierto equilibrio basado en la solución que requiere las moléculas estudiadas a permanecer en solución en las condiciones ensayadas. Se puede utilizar para estudiar no enly la interacción entre proteínas de longitud completa, sino también a la interacción entre los dominios de proteínas, proteínas mutantes o incluso péptidos con modificaciones post-traduccionales. Además, la anisotropía de fluorescencia también se puede utilizar para medir la unión de las proteínas a las membranas de lípidos utilizando sondas fluorescentes membranas sensibles. Este enfoque ha sido utilizado con éxito para estudiar el efecto que alfa-sinucleína tiene en vesículas sinápticas de embalaje 27. Una de las principales ventajas de la anisotropía de fluorescencia es que proporciona información cuantitativa sobre la unión de las moléculas estudiadas tales que los verdaderos constantes de disociación se pueden obtener junto con la información mecanicista. Aunque otras técnicas biofísicas también pueden ser utilizados para obtener dicha información, anisotropía de fluorescencia requiere pequeñas cantidades de muestra y se puede realizar no sólo en equilibrio, como se presenta aquí, sino también el uso de cinética rápida, tales como fluorometría de flujo detenido, para obtener la asociación y la velocidad de disociaciónconstantes (k encendido y apagado k, respectivamente) 28. Un cuadro comparativo con las ventajas y desventajas de anisotropía de fluorescencia con respecto a otras técnicas biofísicas se presenta en la Tabla 2. Todos los métodos descritos son técnicas verdadero equilibrio, ya que ninguno de ellos incluye un proceso de separación mecánica de las fracciones libre y unida. Como se mencionó en la sección de resultados, si la intensidad de fluorescencia de una proteína marcada cambia en gran medida de la interacción, esta propiedad puede entonces ser utilizada para cuantificar la afinidad de la unión. Sin embargo, los cambios en la intensidad de fluorescencia resultantes de la interacción sugieren una posible interferencia del fluoróforo extrínseco en la interacción molecular en sí; a saber, una posible alteración del valor de constante de disociación (K d) de las correspondientes proteínas no marcadas. Como tal, la anisotropía de fluorescencia se puede considerar una técnica menos invasiva que la changes en la intensidad de fluorescencia ya que el primero se debe aplicar cuando la intensidad de la fluorescencia no cambia tras la interacción. En este sentido, aunque se requieren grandes cantidades de la proteína, calorimetría de titulación isotérmica (ITC) puede proporcionar un verdadero valor Kd de la interacción molecular, ya que es un método libre de etiquetas. Por otro lado, la información mecanicista no se obtiene debido a las diferencias en el calor solamente informan sobre la entalpía del proceso y no la cantidad de complejo formado 29.\nEn comparación, en métodos in vivo, tales como la levadura de dos híbridos o de complementación fragmento ensayos no requieren proteínas purificadas, pero que sólo proporcionan información semi-cuantitativa sobre el modo de unión. A pesar de que en la levadura técnica de dos híbridos es posible expresar la fuerza de los que utilizan unidades Miller de unión, esto no es un verdadero equilibrio factores constantes y muchos fuera del control del investigador puede alterarlo.\nTabla 2. Ventajas y desventajas de las técnicas biofísicas utilizados comúnmente utilizados para estudiar las interacciones proteína-proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.


NOTICIAS: Joven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte | Publimetro Colombia\nJoven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte\nSábado 29 de junio de 2019, a las 09:48\nPor medio de redes sociales se dio a conocer este nuevo caso de acoso. Joven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte.\nSe presentó un caso de acoso por parte de un conductor de la plataforma de transporte BEAT.\nPor medio de la red social Twitter, Catalina Montoya relató que fue víctima de acoso mientras se dirigía a su casa.\n27/06/2019 a las 8pm fui víctima de acoso sexual por parte de un conductor (Humberto Reyes) de la plataforma BEAT (placas HBL 980) cuando me dirigía de mi trabajo a mi casa, aprovechando lo solo y oscuro de la zona empezó a masturbarse. pic.twitter.com/uFtyJsUamu\n— Cat (@ColdnessSoul) June 28, 2019\nSegún relata la joven en un video que dio a conocer por medio de su cuenta de Facebook, el hecho se dio cuando se dirigía de su lugar de trabajo para su residencia.\nMontoya comenta que todo empezó luego que dejaran a su novio en la casa de él.\n"Después de que dejamos en la casa a mi novio, el tipo se empezó a comportar súper raro, era muy ansioso… a eso de la 170 con conejera… el tipo pierde un poco el control del carro, por lo cual yo me giro y miro que el tipo está con su ropa interior y con el pantalón en las rodillas", denuncia Catalina Montoya.\nLa joven también relata que cuando se encontraban transitando por la calle 170 con Avenida Boyacá el acosador se empieza a masturbar mientras conducía.\nEn medio de su desesperación la joven aprovecha un pequeño trancón para tirarse del vehículo y correr hasta lograr perder al conductor.\nDespués de lo sucedido la Montoya realizó la denuncia ante la aplicación BEAT, quienes realizaron una pronta respuesta al caso.\nSegún comentan la víctima de acoso, las directivas de BEAT suspendieron la cuenta del conductor.\nEsta información fue corroborada por medio de las directivas de BEAT quienes manifestaron que, "En Beat rechazamos tajantemente cualquier tipo de comportamiento que atente contra la integridad física y emocional de nuestros usuarios pasajeros. Desde que conocimos el reporte realizado por la pasajera el pasado 27 de junio, nos pusimos a su entera disposición y se tomaron las medidas correspondientes respecto al conductor, quien ya fue bloqueado permanente de la plataforma".\nLa denuncia también fue interpuesta ante la Fiscalía.\nJoven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte.\nTenga en cuenta los cierres viales y desvíos del fin de semana por Rock al Parque\nacoso sexual acoso a mujeres\ncolombia noticias Joven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte\nJoven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte noticias\nnoticias bogotá Joven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte\nnoticias colombia Joven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte\nnoticias Joven denuncia caso de acoso sexual por parte de un conductor de conocida plataforma de transporte


Led Zeppelin ganó el premio al mejor solo de guitarra de la historia – Ultrabrit\nLed Zeppelin está de festejo. Su clásico indiscutible, “Stairway to heaven“, tiene el mejor solo de guitarra de la historia según una revista especializada.\nLa Classic Rock magazine hizo que sus lectores, un grupo de músicos y otro de críticos elijan el mejor solo de la historia del rock, y el de Jimmy Page fue el más votado.\nPage opinó que no es su mejor solo pero que “está muy bien“. Según su relato, no tardó demasiado en preparar el punteo, de hecho aseguró que le tomó un par de minutos. Y bueno, así son los talentosos. ¿Lo escuchamos?\nLa revista Classic Rock eligió los 100 mejores solos de la historia del rock, y este es el TOP 10. ¿Qué opinás?\nTemas relacionados:Led Zeppelin


Hamburguesas de trigo sarraceno y champiñones | el blog del bada\nPublicado por elbada el abril 25, 2015\nRemojamos el alga wakame en un vaso aparte.\nSalteamos el ajo y la cebolla bien picados y añadimos una pizca de sal y pimienta. Dejamos ‘sudar’ la cebolla durante 10 minutos y añadimos los champiñones cortados. Una vez éstos hayan soltado el agua, añadimos la cúrcuma, 2 cucharadas de soja y retiramos del fuego.\nTrituramos el trigo sarraceno con la mezcla de champiñones y cebolla, el alga wakame escurrida y la harina de almendra. Según la consistencia que obtengamos, podemos ir aligerándola poco a poco añadiendo de leche de arroz de cucharada en cucharada.\nUna vez tengamos la pasta lista, calentamos un poquito de aceite en la sartén y vamos haciendo montoncitos. Yo he utilizado un aro metálico dentro de la sartén para darles una forma redonda. Una vez pasados unos minutos, con un cuchillo he contorneado el perfil interior para separar la masa del aro. Con la forma hecha, ya podemos dar la vuelta para que se dore por el otro lado. Cread vuestro método propio según lo ‘perfectas’ que quedéis que queden.\nSi no recuerdo mal, salen 4 hamburguesas bastante hermosas para satisfacer sanamente vuestras barriguitas veganas más hambrientas 🙂 A disfrutarlas!\nEsta entrada fue publicada en carnes vegetales y hamburguesas, cereales y etiquetada alga wakame, cebolla, champiñones, harina de almendra, tringo sarraceno. Guarda el enlace permanente.


Por Redacción\ton Febrero 10, 2020\nPor Redacción\ton Febrero 3, 2020\nPor Redacción\ton Enero 28, 2020\nPor Redacción\ton Enero 27, 2020\nPor Redacción\ton Enero 21, 2020\nPor Redacción\ton Enero 13, 2020\nLarry Gamboa, Kevin Lazo y Josué Sánchez, son tres ingenieros nacidos en Huancayo que han creado el primer robot interactivo en el Perú, con la particularidad de que esta máquina ayuda a la rehabilitación de los niños con el trastorno del espectro autista (TEA).\n“Baymax”, así es como se llama esta innovación, está inspirada en la película animada “Grandes Héroes” para que así, los menores reciban mejor el tratamiento\nEste aparato tecnológico tiene una altura de 30 cm y trabaja con pequeños de 1 año y 8 meses hasta los 6 años. Gracias a la pantalla de alta resolución que posee, los niños pueden desarrollar sus habilidades de comunicación, ya que la máquina describe las imágenes que aparecen y ellos pueden repetirlas. De esta manera, los pacientes interactúan con el robot a través de sus preguntas sobre lo que ven o oyen.\nLos tres ingenieros, quienes son egresados de la carrera de mecatrónica de la Universidad Continental en Huancayo, crearon a “Baymax” con una impresora 3D del Fab La de su centro de estudios.\nEste miércoles 12 de febrero, “Baymax” estará en Lima, en el “OpenConti 4.0”, el cual se desarrollará en la Universidad Continental, campus de Los Olivos. !El ingreso será totalmente libre!\nCon el reciente brote de la infección del Coronavirus, las imágenes de personas luciendo mascarillas quirúrgicas, en transportes y lugares públicos, han sido más que evidentes. La también conocida “neumonía de Wuhan” ya ha tomado la vida de más de 40 personas y afectado a más de un millar. Por dicha razón, no es de esperar que la población del gigante asiático haga uso de los tapabocas en su día a día. Sin embargo, ¿qué tan efectivos son?\nSi bien hay pruebas que la utilización de las mascarillas ayuda a prevenir contagios, algunos especialistas son escépticos respecto a su efectividad en contra los virus. Uno de ellos es el doctor David Carrington, médico del hospital de St George’s de Londres, quien en diálogo con la BBC, sostuvo que las mascarillas no son una opción efectiva para evitar los virus y bacterias presentes en el aire.\nCarrignton señaló que dicho objeto deja los ojos en exposición, no posee un filtro de aire y son sueltos. Asimismo, Jonathan Ball, virólogo en la Universidad de Nottingham, detalló que el uso de estos en la población en general, no genera gran impacto en el intento de evitar contagios. Caso contrario sucede en los hospitales, donde sí existe un tratamiento mejor controlado, y en consecuencia, se pueden prevenir infecciones.\nPor otro lado, Connor Bamford, doctor del Instituto Wellcome-Wolfson, indica que es mejor mantener una buena higiene personal. Esto implica lavarse las manos, no tocarse la cara antes de tenerlas limpia y cubrirse al estornudar. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), para evitar el contagio del Coronavirus es preferible mantenerse alejado de las personas con infecciones respiratorias graves.\nEn el Pacifico del Sur, las islas que forman parte de Kiribati corren el peligro de quedar en el pasado debido al incremento del nivel del mar, a consecuencia del cambio climático.\nEste archipiélago cuenta con una extensión de 811 kilómetros cuadrados y uno de sus problemas es que la densidad poblacional excede de lejos. Se estima que en 10 o 15 años la población de Kiribati quedarán sepultadas por el océano Pacifico, dejando así, sin casa a los más de 100.000 ciudadanos. Y de acuerdo con el estudio Environmental Justice Foundation (EJF) elaborado en el 2017, la crisis del cambio climático traerá la mayor cantidad de refugiados que nunca se haya visto.\nA raíz de sus dificultades para construir una economía fuerte y el peligro inminente del clima y el ambiente, las personas no pueden acceder a servicios básicos como el agua, la comida, entre otros. Por ello, las familias de Kiribati han intentado solicitar refugio en otros países, sin embargo, esta ayuda aun no se ha hecho realidad.\nTarawa Sur, la capital de Kiribati, es la ciudad más poblada de la tierra ya que en 1947 existían 1,600 personas mientras que actualmente, la cifra asciende hasta poco más de 50,000.\nPor Redacción\ton Enero 10, 2020\nUna nueva plataforma de contenidos audiovisuales por streaming se adentra a la fuerte competencia contra Netflix, Apple TV+, y Youtube. Sin embargo, este busca ser totalmente diferente e, incluso, opuesto. Vídeos de tan solo de 10 minutos o menos de duración, imágenes a pantalla completa que se mantienen en modo horizontal o vertical, boletines informativos de las principales cadenas de noticias como la BBC, NBC y Telemundo, caracterizan a Quibi y lo convierten en mucho más que interesante.\nSus creadores son Jeffrey Katzenberg, ex directivo de Walt Disney y también fundador de DreamWorks, y Meg Whitman, ex CEO de eBay y HP. Ambos, anunciaron los detalles de este nuevo servicio en las Vegas, para el CES 2020.\nEllos sostuvieron que Quibi tendrá un costo de 4,99 dólares por el plan básico, mientras que el plan especial sin publicidad de por medio, costará 7,99 dólares. La aplicación que apunta exclusivamente a los usuario móviles, exhibirá películas que estarán divididas en secciones o episodios. Además, Withman señaló que junto con el director cinematográfico Steven Spielberg, se creará After Dark, una serie de terror que solo podrá ser reproducido tras el atardecer. Para ello, la plataforma verificará la ubicación y zona horaria de los usuarios.\nSi bien no hay la certeza de que este nuevo servicio de entretenimiento logré el éxito, Quibi ya cuenta con la colaboracion de directores de como Guillermo del Toro, Sam Raimi, y así como de reconocidos actores como Reese Witherspoon y Bill Murray.\nJames Webb, el telescopio capaz de mirar hacia el pasado\nPor Redacción\ton Enero 7, 2020\nLas agencias espaciales de Estados Unidos (NASA), Europa (ESA) y Canadá (CSA), están trabajando conjuntamente en un proyecto valorizado en miles de millones de dólares. Se trata del telescopio James Webb (JWST) que podrá capar otras galaxias en el universo. Y lo qué mas impresiona de este aparato, es que uno de los cuatro detectores, el MIRI, posibilitará una mirada hacia unos cientos de millones de años luego del Bing Bang.\nLa luz tiene sus propios limites. La luz de Sol tarda ocho minutos para llegar a la Tierra, así observamos el estado del Sol ocho minutos atrás.\nEl JWST, el cual viajará millones de kilómetros de nuestro planeta, advertirá estrellas y planetas alejados, ya que se sabe que existen más de 4000 exoplanetas. Pero, con la particularidad de que estaríamos viendo cómo era dicha estrella hace mil millones de años.\nEl telescopio espacial observará con luz infrarroja, lo cual permitirá divisar y entender el universo sin problemas, ya que esta logra atravesar el polvo interestelar que bloquea la visibilidad de la luz.\nEn una entrevista para la BBC, el científico del MIRI, el profesor Alistair Galsse, detalló sobre las funcionalidades del detector: “Este puede ver los colores de los objetos, por ejemplo, los que están a aproximadamente temperatura ambiente. Esto hace particularmente interesante el estudio de planetas que orbitan otras estrellas”.\nEl tamaño del JWST es la de una cancha de Tenis y su espejos miden 6,5 metros, por lo cual será doblado en 18 despliegues hexagonales que se extenderán en el espacio. Se ha planeado su lanzamiento para el 2021 y la duración de la misión en menos de seis años.


En medio de la crisis sanitaria y sus variantes a veces nos perdemos en las soluciones inmediatas\nHay una labor permanente, eficiente que lleva a cabo el Gobierno de México, que le ha valido ser el Séptimo País con mayor número de vacunados, de tal manera que de cada 10 adultos mayores de 18 años ocho han sido vacunados contra el Covid-19 con al menos una dosis, de acuerdo a datos específicos de la Secretaría de Salud, esta cifra no la han alcanzado muchos países de Europa como Alemania, como Rusia, lo cual habla del gran trabajo que aquí se está haciendo a pesar de las limitaciones.\nHasta diciembre pasado se habían aplicado aquí más de 148 millones, nueve mil 786 dosis, con una inversión cercana a los 39 mil millones de pesos. Lo cual hace referencia a un gran compromiso, a medidas extraordinarias que sumadas a un esfuerzo heroico de los trabajadores del sistema de salud, hacen posible que la realidad de México en este rubro sea otra, mejor que la de otros países que se autodenominan de avanzada.\nEn números gruesos, se ha informado oficialmente que en el estado de Chihuahua se han administrado cuatro millones 533 mil 700 dosis, aplicadas a 2.5 millones de personas, para lo cual se cuentan 72 vuelos de la Fuerza Aérea Mexicana, de donde se han recibido cinco millones 146 mil dosis.\nEn Ciudad Juárez en particular se han aplicado poco más de un millón 844 mil vacunas, que han alcanzado a un millón siete mil 934 ciudadanos. Una cifra que es muy fácil plasmarla, pero que habla de muchos meses de trabajo, recursos humanos y materiales, riesgos… pero también de muchas satisfacciones, por las vidas que se han salvado.\nDesde este lunes comienza la vacunación para personas de 76 años o más, el martes de 70 a 75, y así sucesivamente hasta el viernes cuando se aplicarán vacunas a adultos de 60 a 62 años, bajo el esquema de tercera dosis (AstraZéneca).\nNo por nada México se coloca entre los siete países con mayor número de personas vacunadas, la batalla ha sido sin tregua, sin pretexto, y con un compromiso que debemos reconocer en especial al Gobierno de la República, que ha puesto todo su empeño en que los mexicanos salgamos bien librados de esta pandemia que nos ha hecho replantear objetivos, cambiar estrategias de vida; también nos ha hecho reconocer habilidades y capacidades que creíamos desconocidas, ha sido un reto pero también un impulsor de nuestras mejores aptitudes.


Super Pop Venezuela (Gozadera, 2005)\nHay dos razones por la cual no mucha gente sabe de la existencia de este disco fuera de Venezuela: 1) es un álbum de covers de música pop venezolana de los 70's y 80's y 2) la verdad que comparado con sus trabajos previos, el disco es flojo y para algunos de los fanaticos, simplemente malo. Guardando distancias, éste puede ser su Magical Mystery Tour: Aquel disco producido pensando en que a todos les va a gustar porque los Invisibles, tanto como los Beatles, creen que cualquier cosa que saquen va a pegar con ganas.\nA continuación: la versión original de "Caramelo y Chocolate":\nRaffaella Carrà es la mujer perfecta de la música popular europea. Es imposible pensar en otra, al menos para mi que la conozco desde que estoy en este mundo. Mi abuelo italiano la adoraba y tenía uno que otro cassette de ella. Quizás los LPs desaparecieron gracias a la mano negra de mi abuela porque, en verdad, la artista es despampanante y una portada bastaba para derretir a cualquier hombre. Mi abuelo sabía, al igual que yo lo sé ahora, que Raffaella Carrà es la cantante más atractiva y talentosa que ha habido. Una fuente de entretenimiento que sólo se da una vez en la vida, y es tan única que es imposible compararla con alguna otra cantante contemporánea.\nCuriosamente los gays adoran a la Carrà, y digo curiosamente porque ella tiene un sex appeal para el hombre heterosexual mucho más intenso. Esta mujer es una diosa de esas que pasan por la vida muy raras veces... y ahora que me pongo a pensar, es probable que ella sea una de las primeras que cantó a grito pelado, y en varios idiomas, el grito de liberación sexual de la mujer italiana. No se me viene a la mente otra cantante, por el momento.\n“Felicità”, otro ejemplo frívolo, no tiene un ápice de melancolía ni amargura. Es fiesta, pachanga, jarana, orgía, alcohol, individualismo, Rock and Roll en 2/2. Todo eso juntado en tres o cuatro minutos a toda velocidad. El funk melódico –ácido jazzídico- del “Drin Drin” puede recordarnos a Donna Summer y a Giorgio Moroder, aunque sea producido por el novio de la Carrà de aquel entonces. Es de 1979, año del fin de la música Disco como tal.


Coronavirus Navidad Madrid: reuniones de hasta 10 personas\nCovid | Madrid eleva de 6 a 10 personas el límite para las cenas de Navidad\nLa comunidad propone al Ministerio de Sanidad retrasar el toque de queda el 24 y 31 de diciembre hasta las 1:30 horas\nmié 25 noviembre 2020. 09.15H\nLa Comunidad de Madrid ha propuesto al Ministerio de Sanidad elevar a 10 el número máximo de personas en las reuniones familiares de Navidad y retrasar el toque de queda a la 1:30 de la madrugada.\nSin embargo, en las reuniones sociales, en general, se mantiene el número máximo de seis personas, “siempre manteniendo las medidas de prevención”.\nDIRECTO | Siga aquí toda la información sobre el Covid-19\nEn relación con el toque de queda, la propuesta de la Comunidad de Madrid, que ya ha sido remitida al Ministerio de Sanidad, contempla que los días 25 de diciembre y 1 de enero “se ampliará el horario, limitándose la movilidad nocturna desde las 1:30 a las 6:00” horas.\nPor otro lado, el Ejecutivo de Díaz Ayuso apela a la “colaboración con corporaciones locales para evitar aglomeraciones” en la vía pública.\nCovid-19: medidas en residencias para estas Navidades\nEn relación con los centros sociosanitarios, la Comunidad de Madrid prevé permitir la salida de los residentes para pasar vacaciones con sus familias en Navidad.\nEn cambio, los que presentan IgG negativa y no han pasado la enfermedad, a la vuelta al centro sociosanitario deberán permanecer en aislamiento y se les realizará una prueba diagnóstica.\nLimitaciones en Navidades por el coronavirus\nEl Gobierno central ha propuesto limitar a seis personas las reuniones familiares y sociales que se celebren durante las fiestas de Navidad y limitar la movilidad entre la 1 y las 6 horas los días 24 y 31 de diciembre.\nEl ministro de Sanidad, Salvador Illa, ha señalado que las restricciones aún no son definitivas, ya que todavía se está trabajando con las comunidades autónomas en el documento final de medidas.\nMadrid estudia "excepciones" en las restricciones Covid-19 para Navidad\nCoronavirus: las medidas comunes de Navidad tendrán rango de recomendación


Alexander Strauffon: Top 10: Tíos favoritos de la ficción\nJ.P. Alexander 29 mayo, 2021 22:36\nMi favorito es el pato Donald. Genial entrada , Te mando un beso\nNocturno 07 junio, 2021 23:44\nDRACO 30 mayo, 2021 00:02\nyo he visto al tío jesse, al pato donald y al tío lucas de la familia addams; pero también recuerdo al tío buck de "el gran chaparral", un gran tipo.\nAlbada Dos 30 mayo, 2021 00:26\nUn repaso estupendo. Esa familia, la que sea, que da tanto juego, ¿no?\nSaruski 30 mayo, 2021 01:35\nQue genial 👏👏👏, me has hecho recordar muchas series y personajes\nMi nombre es Mucha 30 mayo, 2021 03:41\nNo tengo tio\nethan 30 mayo, 2021 04:17\nMi favorito es "Mi Tío" de Jacques Tatí. Buena entrada y buen blog, pasaré por aquí.\nEnrique T.F. 30 mayo, 2021 11:34\nYo, por antigüedad, me quedaría con el Pato Donald.\nMe alegra saberte ahí, AS, en esa labor de divulgación de lo que tú llamas tus tíos favoritos. Loable.\ncarlos perrotti 30 mayo, 2021 12:25\nEl Tío Lucas. Sigue siendo mi ídolo aún hoy... Jackie Googan. Inolvidable!!\nConchi 30 mayo, 2021 12:56\nyessykan 30 mayo, 2021 14:58\nMira que hay unos que los he adorado y odiado. El tío Buck, El tío Buck es una comedia conmovedora y divertida. Siempre recordaré a John Candy como el tío Buck. El tío Jesse, la verdad tenía sentimientos encontrados con él. Sin duda alguna una muy buena selección de tios.\nDyhego 30 mayo, 2021 16:29\nEl que mejor me cae es el tío Phil del príncipe de Bel-Air.\nhanna 30 mayo, 2021 22:52\nMe has hecho recordar algunas, pero no soy de mirar mucho.. un abrazo\nSandra Figueroa 31 mayo, 2021 00:05\nMe has hecho recordar viejos tiempos. Que buen post. Saludos.\nMargarita HP 31 mayo, 2021 03:40\n¡Una muy buena entrada! Ay ese Pato Lucas. Besos :D\nEtienne 31 mayo, 2021 10:19\nEs verdad que los tíos tienden a ofrecer lo que le falta al protagonista de turno, una especie de balance actitudinal para que no descarrile.\nExcelente texto y mejor selección!\nFrodo 31 mayo, 2021 17:56\nJaaa, muy buena la idea, y muy buena selección. Un tío (en el sentido hispanoamericano, y no el español) es como un padre pero relajado, casi al nivel del niño.\nPor eso el que agregaría es el tío Ted, el de "El mundo de Bobby". Que era jodón, asustaba al niño, se la pasaba con bromas y participaba en todo. Crack\nSakuranko 31 mayo, 2021 18:33\nEl tio Fester sin duda es mi tio favorito\nTheresa Mahoney 31 mayo, 2021 21:52\nTantos tíos abuelos enumerados aquí, pero el tío Buck es mi favorito.\nErnesto. 01 junio, 2021 00:45\nAbrazo Alexander... en lontanaza.\nVerónica Calvo 01 junio, 2021 03:05\nTío Fester for ever!!!\nRocío G. Tizón 01 junio, 2021 04:00\nMe quedo con Fester.\nGuillermo Palacio 01 junio, 2021 04:33\nExcelente selección, recuerdo alguno de ellos, aunque no era muy asiduo a ver este tipo de series.\nCabrónidas 01 junio, 2021 09:55\nA mí siempre me gustó Poly, el cuñado de Rocky Balboa.\nRajani Rehana 01 junio, 2021 10:27\nSteve 01 junio, 2021 17:13\nHi Alex great post I have watched and read lots of fictional characters, they are amazing.\nCarlos Augusto Pereyra Martínez 02 junio, 2021 16:10\nEl tío Ben, se siente el afecto. Bueno te faltó poner un tío, muy malo. El tíos Sam.\nVENTANA DE FOTO 03 junio, 2021 12:16\nNo está mal la lista...han dado mucho juego.\neli mendez 03 junio, 2021 22:04\nMe quedo con Lucas, donald y Phil como favoritos y la verdad no tengo vistos a los 8,9 y 10 asi es que no puedo opinar. Buena entrada!abrazo Alexander y buena noche para vos.\nAnónimo 04 junio, 2021 13:13\nEl Tio Lucas y el Tio Cosa son la onda en Los Locos Addams.\nDevoradora de libros 06 junio, 2021 02:31\nOhhh, me quedo con el tío Jesse.\nDisfruté mucho con esa serie 😊\nColotordoc 06 junio, 2021 06:16\nEl tío favorito mío es el tío lucas de los Addams. Y además su tocayo el Pato Lucas.\nNocturno 06 junio, 2021 06:58\nRecomiedo MOTU (Masters of the universe) He Man y todo eso ejeje\nJLO 06 junio, 2021 12:19\nSiempre me gustó Donald a pesar de su carácter ja... y el Tío Lucas al saber que fue el pibe de la película de Chaplin también.... saludos!\nCarlosMxAx 06 junio, 2021 16:08\nSe da mucho eso que un tío toma el cuidado de un sobrino, y por ser tío a veces es menos estricto que un padre pero sin dejar de lado la responsabilidad de un adulto ante un menor.\nTenemos el caso en Chole de famoso Condorito es tío de Coné; siempre al cuidado de su sobrino que no haga travesuras, que estudie y sea mejor que su tío en el futuro.\nPara mí de los "tíos" que nombraste me quedo con el último, lo comprensible que era con Will y siempre enseñándole el esfuerzo en la vida...\nCarolina 06 junio, 2021 17:18\n¡Hola! La verdad es que se les coge cariño al final, creo que de todos los que dices no podría elegir solo a uno. Esto me ha hecho recordar al tío de la película de Miss Sunshine. Un saludo.\nEl Demiurgo de Hurlingham 07 junio, 2021 09:16\nHerbert Powell no era tan bueno. Es recibió que fue generoso con sus sobrinos.\nPero le echó la culpa de su bancarrota a Homero. Siendo que este puso voluntad y dedicación, mucho más que en su trabajo en la planta nuclear. No fue una buena idea presentar algo ante los accionistas, sin haberlo visto antes. Y tampoco ayudó el mostrarse desesperado ante esos accionistas. Se podría sospechar que lo estafaron sus ingenieros, los encargados de armar el auto.\nLuke Skyalker, célebre personaje de Star Wars. En Star War Legends es tío de Jacen, Jaina y Anakin Solo, quienes son hijos de Leia Organa y Han Solo.\nHerman Munster. De The Monster, algo parecido al monstruo de Frankenstein, casado con una vampira, con un hijo licántropo. Y tío de Lily Munster, quien no se parece la familia, es una atractiva rubia. Herman le ha hecho burla pero la acepta en la familia, no la discrimina.\nmiquel zueras 07 junio, 2021 15:43\n¿Sabías que Fester era Jackie Cooper, el protagonista de "El chico" de Charles Chaplin?\nEs curioso eso de que los personajes de cómic no podían tener hijos propios, los niños eran siempre sus sobrinos.\nHay otro personaje curioso en las familias, el llamado "amigo de la familia" un señor rarito, soltero y que ha resultado como "adoptado" por un grupo familiar.\nFilifionka 08 junio, 2021 11:00\nInteresting post 😊!!!\nregioboi 09 junio, 2021 00:13\nHola, primero que nada sí, estoy bien haha. Perdí un poco (mucho) de inspiración. Además el tiempo pasa muy rápido cuando trabajas.\nNo puede ser que conozca casi todos esos personajes pero olvide lo que representan. Buscaré el de The Simpsons. Esos son capítulos que no envejecen en cuanto a calidad de sus tramas y temas.\nSaludos! Y gracias por acordarte de uno.\nUn Destino entre mis Manos 09 junio, 2021 08:05\nCoincido con ese tío Phil, también es una de mis series favoritas. Desde ahí, Will Smith pasó a ser uno de mis actores favoritos.\nbellabrownsdiary 09 junio, 2021 15:07\nRud 13 junio, 2021 15:43\nNo me ha gustado mucho la televisión, prefiero leer.\nSí me caía bien el tío Hesse. A los Simposons, no los he visto, las imágenes me parecen anti estéticas. El tío que esté siempre listo para lo divertido y diferente ha de ser sencillamente un tío maravilloso. La figura del Pato Donald, es agradable. Deberían existir muchos “tío Ben” y “tío Phil, el mundo está necesitado de gente amable, que sientan empatía por sus semejantes y sean generosos en todo sentido.\nCath.Hartfiel 14 junio, 2021 14:06\nMe quedo con el tio Phil... que penita que falleciera.\nAnónimo 17 junio, 2021 09:46\nY el favorito del mundo capitalista: el Tio Sam.\nmalaschambas 21 junio, 2021 03:26\nPues el tio gamboin representa toda una generacion en México, asi como la mejor epoca televisiva, dificilmente se podra lograr algo similar actualmente, ah no ser que, de entre los tantos mamarrachos youtubers, surja alguno con personalidad y cultura, que por lo menos sepa decir su nombre, con cortesia alguna, saludos mi buen Strauffon\nEnca Gálvez 22 junio, 2021 05:35\nGenial excelente post, me ha encantado leerte, estos personajes de ficción siempre me han sacado una sonrisa.\nDorotea Hyde 06 julio, 2021 04:16\nMe encanta el tío Buck, pero creo que me quedo con Fry.\nHola, me llamo Julio David 14 julio, 2021 03:13\nFry, el pato Donald y mi tío José.


EL TRASTERO AZUL: 17 noviembre 2015 (4) elconfidencial.com (opinión)\n17 noviembre 2015 (4) elconfidencial.com (opinión)\nLa historia del 'no-héroe' musulmán que jamás evitó la tragedia del Stade France\nLos atentados del pasado viernes en París dispararon todo tipo de noticias sin confirmar, rumores que, paso a paso, (en la mayoría de las ocasiones tuit a tuit) tomaron la forma de hechos reales pero que en verdad jamás existieron. Un campo abonado para historias en algunos casos trágicas y en otras heróicas que en verdad no fueron más que fantasías de sus autores. Una de ellas creció como un torrente durante el fin de semana y hablaba de un portero musulmán que trabajaba en los accesos al Stade de France y que, según este relato, habría sido el encargo de impedir que un de los terroristas accediera al estadio e hiciera explotar su cazadora-bomba evitando, por lo tanto, la tragedia en el interior del recinto. Una fábula cargada de simbolismos que, en verdad, jamás se produjo. Esta es la historia del no-héroe que jamás evitó una desgracia de proporciones históricas en el interior del campo donde se disputaba el Francia - Alemania.\nUna historia que detalla Sportyou y que comienza con un nombre: Zouheir. Así bautizaron en redes sociales a este supuesto portero que jamás existió. Un relato fantástico que nació de Facebook y que corrió de manera exponencial hasta salpicar al mismísimo Wall Street Journal.\nEl diario norteamericano lo citó en uno de sus artículos e incluso incluyó palabras puestas en su boca en las que habría relatado como fue un cacheo rutinario lo que hizo que saltara la alerta.\nTiempo después, una información de Liberation desmontaba el mito. Lo hacía a través de una de las voluntarias del partido que relataba como en ningún momento se habló de un relato como el de este 'no-héroe'.\nLas comunicaciones por walkie-talkie no confirman estos hechos y tampoco lo hace Jackes Lambert, presidente del comité organizador de la Eurocopa 2016, quien afirmó que "ningún guarda o portero reportó esa información". Zouheir jamás existió.\nCasos como el que comenta el artículo no son únicos. A veces, para el imaginario colectivo, es necesaria la aparición de héroes que suplanten y consigan lo que habríamos querido conseguir nosotros (como individuos o como grupo).\nLo peor del tema es que, en el mundo real, siempre hay quien intenta obtener derechos a costa del sufrimiento ajeno. Ya ocurrió en los atentados del 11S, también en los del 11M... incluso hay quien insiste una y otra vez en reclamarle el reconocimiento como víctima de ETA a la administración (y ésta se lo deniega constantemente porque no tiene una sola prueba consistente). Y luego están los que se copian las desgracias de otros, las mezclan en una coctelera y de la mezcla que aparece viven como si fueran sus propias vivencias y secuelas.\nHay mucho geta suelto por ahí.


Segunda fecha Liga LITZO\n25 abril, 2017 - 10:10 am\nEste fin de semana se disputó una nueva jornada de la Liga Independiente de Tenis Zona Oeste. El Tenis de Libertad comienza a participar este año de dicho Torneo. En esta oportunidad hubo acción en tres ciudades simultaneas.\nFue muy bueno el desempeño de los chicos aurinegros en el segundo Torneo del año de la LITZO. Tomas Josviack y Nicolás Hoffmann llegaron hasta Cuartos de final, mientras que Santiago Lattanzi alcanzó los octavos en Villa Trinidad (asistencia 7 alumnos).\nEn San Guillermo, Matías Bonafede logró meterse entre los mejores ocho de la competencia, y Franco Audagnotti, Juan Borgnino y Alejo Peralta culminaron su participación en los octavos de final.\nPor último, en Morteros, Lucrecia Solís se quedó con el primer premio en ronda consuelo. Además también participaron Santiago Llull, Tomas Temporeli y Ramiro Álvarez, quien cumplieron una destacada labor.


Cooperativa Metalúrgica de Bariloche crece y se consolida en épocas de pandemia\nInicionotaCooperativa Metalúrgica de Bariloche crece y se consolida en épocas de pandemia\nRío Negro cuenta con 243 cooperativas y más de 40 mutuales, y una de ellas es la Cooperativa de Trabajadores Metalúrgicos (CooTraMet), la cual da trabajo a 15 familias de forma permanente y hasta 30 en épocas de mucha demanda.\nEn Bariloche, está compuesta por hombres y mujeres que construyen galpones y escaleras, y reparan de todo tipo de muebles. La sensación de trabajo conjunto y aprendizaje prevalece en un espacio que ya funciona hace más de ocho años.\nLa directora de Cooperativas y Mutuales, dependiente del ministerio de Desarrollo Humano y Articulación Solidaria de Río Negro, Patricia Rodríguez Sabato, comentó que “En la provincia hay 243 cooperativas vigentes y 43 mutuales. Y en Bariloche, 58 cooperativas y cinco mutuales. Tenemos rubros muy variados desde la Escuela Los Andes, la cooperativa de remises COREBA, la CEB, las cooperativas de trabajo del estacionamiento medido, otras vinculadas a la informática o al traslado de personas con discapacidad, entre otras”.\nAsimismo, agregó que “la dirección de Cooperativas viene trabajando hace 50 años en la Provincia, Rio Negro tiene una de las mayores presencias en territorio en todo el país, trabajando en conjunto con la federación provincial”.\nEn cuanto a la forma de trabajo de la Dirección en el contexto actual, informó que “estamos cambiando el sistema para dar un servicio de asesoramiento virtual, hoy por la situación de pandemia, se está resolviendo las consultas que se reciben en el correo electrónico delegacionescym@gmail.com”.\nPor su parte, el presidente de la Cooperativa de Trabajadores Metalúrgicos, Robinson Jaldo, dijo que “somos quince personas que conformamos la Cooperativa y seguramente en la próxima asamblea incorporaremos mas socios. De todos modos, cuando hay mucho trabajo llegamos a ser 30”.\nSobre la Cooperativa, resaltó que “me doy cuenta que lo que vengo haciendo desde hace años es cooperativismo porque cuando te interiorizas te das cuenta que lo venís haciendo casi naturalmente. Cooperativismo es ayuda mutua, es buscar la solución a necesidades que de forma individual es mucho más complejo y en conjunto es mejor”.\nMás adelante, Eva Parada miembro de CooTraMet, puntualizó que “nuestro trabajo es muy variado, hacemos una parrilla simple ó el montaje de una escalera comunitaria. A veces se acercan los vecinos para soldar la pata de una silla u otros para hacer estructuras más grandes como galpones y techos”.\nPor último, otro de los socios fundadores de la Cooperativa, César Yáñez, relató que “el día laboral es bastante agitado, aunque cuando comenzamos fue difícil, tuvimos que salir a buscar el trabajo, ejecutarlo y al mismo tiempo ir enseñando a nuestros compañeros y compañeras”.\nLa Cooperativa de Trabajadores Metalúrgicos está en constante crecimiento y emprendiendo nuevos desafíos. Tiene la particularidad que muchas de sus integrantes son mujeres haciendo trabajos tradicionalmente masculinos.\nSe encargan de la capacitación de nuevos integrantes y no pierden de vista los dos pilares que sostienen a la forma cooperativa, la empresarial y la social. Han aplicado a subsidios y beneficios desde Nación por intermedio del Instituto Nacional de Asociativismo y Economía Social.\nCootramet surge de titulares del programa Argentina Trabaja; se especializaron en trabajos metalúrgicos y han concretados varios proyectos como por ejemplo el Puente Negro de Villa Los Coihues y las escaleras de Pampa de Huenuleo a través del PROMEBA.


La consellera de Sanidad de la Comunidad Valenciana, Ana Barceló, en una rueda de prensa. EFE\nAseguró que no se vacunó a los profesionales de la privada porque no lo pidieron. La Generalitat ha sido condenada por discriminarlos en el suministro de dosis.\n21 enero, 2022 13:33\nEl Colegio Oficial de Médicos de Alicante ha remitido una carta a la consellera de Sanidad de la Comunidad Valenciana, Ana Barceló, en la que le solicita "una rectificación" por las declaraciones que realizó en sede parlamentaria en las Cortes Valencianas el pasado martes 18 de enero, al considerar que mintió en sede parlamentaria.\n"En estas declaraciones manifestó que en la sede colegial se procedió a vacunar a los médicos no mutualizados, y, posteriormente, en la réplica afirmó que no se hizo porque no se solicitó", indicaron desde el órgano colegial. "Estas afirmaciones no responden a la realidad, por lo que se le solicita que de manera formal proceda públicamente a su rectificación".\nEn la carta, el Colegio recuerda que desde el primer momento en que se puso en marcha la vacunación del personal sanitario conforme a las directrices del Ministerio de Sanidad "se manifestó en diversas comunicaciones escritas y verbales a la Conselleria de Sanidad que no se estaba procediendo a vacunar en las mismas condiciones a los médicos de ejercicio privado".\nA pesar de esto la Conselleria hizo "caso omiso la Consellería a dichas peticiones", por lo que se interpusieron primero las medidas Cautelarísimas que posteriormente fueron ratificadas como Cautelares. Finalmente, la Sentencia del Juzgado de lo Contencioso-Administrativo del pasado día 13 de enero estimó la demanda interpuesta por este Colegio por "discriminación de dicho colectivo".\nAdemás, "una vez en cumplimiento de la orden judicial se iniciaron las gestiones para proceder a la vacunación de los médicos de ejercicio privado, se remitieron diversos escritos ofreciendo las instalaciones colegiales (los días 8 y 10 de febrero de 2021), para ser "utilizados como lugar de administración de la vacuna".\nLo mismo sucedió en otros colegios como el de Valencia, "pero el COMA ni tan siquiera recibió contestación, y por vía de hecho negaron dicha posibilidad, por lo que igualmente resulta incierto que este Colegio no hubiese solicitado vacunar a los médicos no mutualizados".\n"Es obligación de este Colegio profesional la defensa de sus colegiados, y no podemos entender que se realicen afirmaciones carentes de veracidad y que afectan a la honorabilidad de todos los miembros de la Junta Directiva que se implicaron hasta el punto de interponer acciones judiciales por la inacción y abandono de un colectivo como los colegiados que ejercen de manera privada", indicaron las mismas fuentes.\n"Es inasumible para esta Junta frente a sus colegiados que la consellera de Sanidad realice manifestaciones que no responden a la verdad y realidad", agregan, por lo que "el Colegio espera una rectificación de la titular, poniendo a su disposición los documentos justificativos de lo expuesto".\nEl PP de Alicante critica el "sainete" de Ximo Puig con la tasa turística: "Que la rechace donde toca"


AME contribuye a la prevención de accidentes viales – AME\n26 octubre, 2018 17 septiembre, 2019 ecuadesigners116 Views\nGuayaquil, Guayas.- El primer semestre del 2018 tuvo la tasa más alta de mortalidad de los últimos cinco años en el país, según las estadísticas de los organismos públicos. Frente a ello la Asociación de Municipalidades Ecuatorianas (AME, incorporó en su plan anual de fortalecimiento el taller “Puntos Críticos de Accidentabilidad y Diseño de Seguridad Vial”, el cual se lleva a cabo este 25 y 26 del presente mes en el auditorio de la Regional 5.\nLa actividad se desarrolla con la participación de delegados de los Gobiernos Autónomos Descentralizados Municipales de Bolívar, Los Ríos, Guayas, Santa Elena, Galápagos y Guayas, que están en el territorio de las unidades de Tránsito y Seguridad Vial.\nLos contenidos del taller tanto de manera teórica como práctica a través de mesas de trabajo permitieron desarrollar habilidades para reforzar el área de señalización y levantar la información en territorio.\nEdgar Estrella, técnico de Tránsito de AME nacional, explicó que lo que se ha implementado en esta mesa de trabajo son proyectos de seguridad vial, para luego cuadrillas que pintan las señalizaciones y a los contratistas que implementan estas señales en forma vertical y horizontal. El funcionario señaló también que AME a través de estas capacitaciones a los municipios, apuntan a la excelencia, «ellos van hacer eficiente en esta área y ello se revierte en salvar vidas», indicó.\nTambién permitirá que funcionarios puedan hacer una evaluación permanente de lo dispuesto en este tema, de tal manera que se tomen los correctivos que sean necesarios a fin de mejorar las condiciones en las que la ciudadanía se desplaza y garantiza su seguridad.\nUno de los objetivos es contribuir con la reducción del alto nivel de siniestros que hay en el país y que se convierten en una de las principales causas de muerte de los ecuatorianos.\n← Municipio de Flavio Alfaro trabaja con el sector Cacaotero\nRamiro Maita, es el nuevo presidente de La Mancomunidad “Bosque Seco” →