Virus de la influenza causan más de 500.000 muertes en todo el mundo1 y se asocian con un costo anual de US $ 12 billones en los Estados Unidos solo considerando médica directa y gastos de hospitalización y ausentismo de trabajo2. Modelos animales son cruciales en los estudios de Influenza A virus (IAV) evaluar patogenesia viral, interacciones huésped-patógeno, respuesta inmune, y la eficacia de la vacuna actual o nuevos enfoques así como antivirales. Los ratones son un modelo animal pequeño ventajoso porque su sistema inmunológico es evolutivamente similar a ése encontrado en los seres humanos, están disponibles de proveedores comerciales como sujetos genéticamente idénticos, existen múltiples cepas que pueden ser aprovechadas para evaluar la base genética de las infecciones, y son relativamente baratas y fáciles de manipular. Para recapitular la infección IAV en los seres humanos a través de las vías respiratorias, ratones primero son anestesiados antes de la inoculación intranasal con gripe infecciosa bajo contención de bioseguridad adecuado. Después de la infección, la patogenesia de la gripe se determina mediante el control diario de la morbilidad (pérdida de peso corporal) y la tasa de mortalidad (supervivencia). Además, patogenesia viral también puede evaluarse mediante la evaluación de replicación del virus en la parte superior (mucosa nasal) o tracto respiratorio (pulmones) inferior de ratones infectados. Las respuestas humorales sobre infección de IAV pueden rápidamente evaluar sangrado no invasiva y la detección del anticuerpo secundario ensayos destinados a detectar la presencia de total o anticuerpos neutralizantes. Aquí, describimos los métodos comunes utilizados para infectar ratones intranasal (i.n) con IAV y evaluar patogénesis, respuesta inmune humoral y eficacia de protección.\nGripe es virus envueltos, clasificados en la familia de Orthomyxoviridae 3. Contienen ocho moléculas de ARN monocatenario con polaridad negativa3. En los seres humanos, gripe causa epidemias estacionales y pandemias ocasionales de consecuencia importante cuando se introducen nuevos virus en la población humana4. Por otra parte, gripe estacional es altamente y rápidamente transmitida entre los seres humanos produciendo una elevada pérdida económica en todo el mundo cada año2,5. IAV los síntomas incluyen tos, congestión nasal, fiebre, malestar general, cefalea, anorexia y mialgias, pero el virus también puede producir una enfermedad más severa en pacientes inmunocomprometidos6. De hecho, la Organización Mundial de la salud (OMS) calcula que el virus de la gripe estacional causan 300.000-500.000 muertes en todo el mundo cada año1. Hay sólo dos clases de medicamentos actualmente aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) para la profilaxis de la gripe y tratamiento en seres humanos: inhibidores de la neuraminidasa (NA) (p. ej., oseltamivir) y bloqueadores del canal iónico M2 (p. ej., amantadina); sin embargo, la aparición de variantes del virus resistentes a los medicamentos es una preocupación cada vez mayor. Vacunación, por lo tanto, sigue siendo la mejor opción médica para proteger a los seres humanos contra las infecciones de gripe. Hasta la fecha, tres tipos de influenza hay vacunas aprobadas por la FDA para el uso humano: las vacunas de proteínas recombinantes virales hemagglutinin (HA), inactivadas vacunas contra la influenza (IIV) y viva atenuada de influenza vacunas (LAIV)5, 7. las tres vacunas están diseñadas para inducir la respuesta inmune adaptativa contra la proteína viral de la HA, el objetivo principal de neutralizar anticuerpos contra la gripe.\nUn modelo de ratón validado para el estudio de infección de IAV en vivo\nSe han utilizado modelos animales para estudiar, entre otros, IAV patogenesia8,9,10,11, factores virales que contribuyen a la enfermedad12 o transmisión viral13 ,14, y probar la eficacia de nuevas vacunas o antivirales fármacos9,10,15. Ratones (Mus musculus) son el modelo animal más ampliamente utilizado para la investigación IAV por varias razones: 1) el sistema inmune es evolutivamente similar al que presentan en los seres humanos; compra animal de bajo costo, incluyendo 2), la vivienda y la reproducción; 3) pequeño tamaño fácilmente manipular y almacenar; 4) variabilidad de host mínimo para obtener respuestas homogéneas y resultados; 5) un gran conocimiento de la biología de ratones, incluyendo la secuencia del genoma; 6) muchos disponible biología molecular y/o reactivos de Inmunología; 7) disponible knock out (KO) de ratones para estudiar la contribución de una proteína huésped dado en infección viral; y, 8) múltiples cepas de ratón que pueden ser aprovechadas para evaluar las bases genéticas de las infecciones.\nHay varias cepas de ratón disponibles actualmente para el estudio de IAV en vivo. Edad, estado inmunitario, sexo, cepa genética de fondo y el ratón, así como rutas de infección, dosis y cepas del virus de influyen en el resultado de la infección del IAV en ratones. Las cepas de ratón más comunes utilizadas en la investigación IAV son C57BL/6, BALB/C y, más recientemente, DBA.2 ratones ya que son más susceptibles a la enfermedad IAV que dos cepas anteriores16,17,18, 19 , 20. lo que es importante, la respuesta inmune también puede ser diferente dependiendo de la cepa de ratón18,19,20. Por lo tanto, es muy importante recuperar toda la información disponible sobre el ratón y la cepa IAV a elegir la mejor opción para el experimento a realizarse.\nAunque el ratón es un buen modelo animal de infección para los estudios en vivo IAV, tienen varias limitaciones, que deben considerarse en el diseño experimental. Por ejemplo, una limitación importante de la utilización de ratones en vivo estudios es que la gripe no transmite entre ratones. Así, para la transmisión de los estudios, más aceptado modelos animales (e.g., hurones o cobayas) son usados16,17,21. Además, hay varias diferencias entre las manifestaciones del IAV en ratones y seres humanos. A diferencia de los seres humanos, ratones no desarrollan fiebre con infección de IAV; por el contrario presentan hipotermia16,17. En ratones, replicación de IAV se concentra en el tracto respiratorio inferior (pulmones) en lugar de las vías aéreas superiores. Por lo tanto, virulencia del IAV en ratones no se correlaciona siempre al que se observa en los seres humanos. En conjunto, ya que las ventajas compensan las desventajas limitadas, ratón representa el primer modelo animal para evaluar patogenesia viral gripe, inmunogenicidad y eficacia protectora en los estudios de vacunas y antivirales. Por otra parte, no sería éticamente aceptable para llevar a cabo estudios con IAV usando modelos animales grandes sin pruebas previas en un pequeño modelo animal de infección IAV. En este manuscrito, describimos cómo infectar ratones intranasal (i.n.) con IAV, cómo controlar la severidad y progreso de la infección viral y cómo llevar a cabo los experimentos necesarios para evaluar la respuesta inmune humoral y la eficacia de protección.\ntodos los protocolos animal descritos aquí fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y el Comité institucional de bioseguridad (IBC) en la Universidad de Rochester escuela de medicina y odontología y cumplir con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la 22 de Consejo de investigación nacional. Las instalaciones y programas del vivero y la división de medicina del laboratorio Animal de la Facultad de medicina y odontología están acreditados por AAALAC International y cumplan con la política de institutos nacionales de salud (NIH), ley federal y ley estatal. Requisitos similares se apliquen en cada institución se adhieran a los protocolos animal descritos en este manuscrito.\n1. uso de animales vertebrados pequeños\nNota: el equipo de Protección Personal apropiado (PPE) se requiere para trabajar con los ratones. Requisitos mínimos incluyen batas desechables, cubre zapato, capucha cabeza, mascarilla y guantes.\nAcuerdo con el protocolo IACUC, coloque un máximo de 5 ratones por jaula. Siguiendo el protocolo IACUC, eutanasia ratones con dos métodos de eutanasia (la segunda debe ser un método físico) para asegurarse de que el animal está muerto.\nNota: En los experimentos en que IAV se evalúan morbimortalidad, ratones que perdieron 20% de su peso corporal inicial se considera haber alcanzado el extremo experimental y fueron sacrificados con CO 2 y la dislocación cervical como la método secundario físico. Este porcentaje de peso corporal puede ser diferente en otras instituciones. En los procedimientos donde se recogen los pulmones de ratones y la mucosa nasal después de la infección de IAV, ratones son sacrificados con una dosis letal de 2,2,2-tribromoethanol (TBE) y cortando el hepático vena como método secundario físico. Mujer ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad fueron comprados y mantenidos en las instalaciones de cuidado de los animales en la Universidad de Rochester escuela de medicina y odontología en condiciones libres de patógenos específicas.\nNota: en este informe, la gripe utilizada para infectar ratones es la cepa de laboratorio adaptados al ratón común de gripe H1N1 de A/Puerto Rico/8/34 (PR8 WT) 22 , 23 y una temperatura sensible LAIV variante, PR8 LAIV 8. Realizar todos los procedimientos que implican las infecciones IAV (en la vitro o en vivo), cultivos celulares y muestras biológicas, en un gabinete bajo nivel biosafety (BSL) -2 de seguridad biológica condiciones. Utilizar los otros trajes BSL o condiciones de contención si se utilizan cepas altamente virulentas de IAV.\nLimpie el gabinete con desinfectante del dióxido de cloro antes y después de realizar todos los procedimientos experimentales descritos en este manuscrito de bioseguridad. Esterilizar todo el material de disección (tijeras, bisturí y disección pinzas) y los homogeneizadores Dounce antes y después de su uso siguiendo las recomendaciones adecuadas de IBC. Descarte todo el material producido durante los procedimientos bajo pautas adecuadas de IBC y IACUC.\n3. Infección intranasal\nlugar del 6 a 8 semanas de edad hembra C57BL/6 ratones en condiciones libres de patógenos específicas. Organizar y etiquetar el ratón jaulas con el virus y la dosis utilizada. Identificar los ratones en cada jaula mediante un código de punzón de oreja o con otro método aprobado, como la pintura de las colas. Colocar un máximo de 5 ratones por jaula.\nPreparar la dilución de IAV (fluorescente formando unidades (FFU) ratón) bajo condiciones asépticas en un volumen total de 30 μL/ratón estéril 1 x solución salina buffer fosfato (PBS). Mantener el inóculo de virus en el hielo. Calcular la cantidad de IAV a añadir en la dilución viral con la fórmula: ((X FFU por ratón/30 μL) x volumen final) / stock título viral.\nLos ratones con una escala de pesar y registrar el peso de cada ratón (día 0). Mantenga el ratón en una posición dorsal al recoger por el scruff del cuello entre el dedo índice y el pulgar. Sujete la cola contra la mano con el dedo meñique.\nAnestesiar el ratón por vía intraperitoneal (i.p.) con 240-250 mg/kg de TBE insertando la aguja en el 2/3 caudal del lado derecho del abdomen. PAUSE brevemente antes de retirar la aguja. El ratón a la jaula y esperar 5 minutos\nAplique ungüento oftálmico estéril a los ojos para evitar la sequedad mientras el ratón está anestesiado. Compruebe si el ratón está anestesiado por falta del reflejo de retirada del pedal (es decir, presión del dedo del pie). Si los ratones no están completamente anestesiados tosen por el virus de la.\nCuando el ratón está totalmente anestesiado, coloque el ratón en recumbency dorsal. Poner la punta de la pipeta que contiene 30 μL del inóculo de virus en la nariz y lentamente pero constantemente expulsar la solución. Asegúrese de que el ratón es inhalar la preparación observando el inóculo gota desapareciendo.\nCompruebe que el ratón está respirando como TBE puede deprimir la tasa de respiración y temperatura. Devolver el animal a la jaula en recumbency dorsal. Controlar los ratones para detectar cualquier signo de dificultad respiratoria y si observan, el ratón para respirar por animal sosteniendo verticalmente e inducen impacto impulsado por la respiración 24. Controlar el ratón hasta que recupere conciencia (30-45 minutos después de fue anestesiada).\n4. Caracterización de la patogenesia Viral ( figura 1)\nevaluación de la morbilidad y mortalidad ( figura 1 y figura 2)\nInfectar i.n. 3-4 grupos de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (por lo menos 5 ratones por grupo, n = 5) con dosis 10 veces (10, 10 2 10 3 y 10 4 FFU y ratón) de PR8 WT como se describe en la sección 3.\nMonitor y pesan los ratones con una escala en los próximos 14 días en aproximadamente el mismo tiempo para minimizar las variaciones del peso debido a la ingestión de alimentos. Eutanasia a ratones que pierden 20% de su peso corporal inicial como se describe en la sección 1.\nDespués de 14 días, eutanasia a los ratones que sobreviven a la infección viral como se describe en la sección 1.\nCalcular el viral ratón 50% la dosis letal (MLD 50) basada en los datos de supervivencia obtenidos mediante el método de Reed y Muench 25. En primer lugar, calcular la distancia de la proporción (PD):\na continuación, calcular el MLD 50 mediante la siguiente fórmula:\nevaluación de los títulos virales en los pulmones y la mucosa nasal ( figura 1 y figura 2. )\nrecuperación de pulmones y mucosa nasal\ninfectar ratones de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad hembra i.n. (n = 6) con la dosis viral a la prueba 10-10 4 FFU de PR8 WT como se describe en la sección 3.\nRecoger los pulmones de ratón y la mucosa nasal en los días 2 (n = 3) y 4 (n = 3).\nEutanasia a los ratones con una dosis letal (i.p.) de TBE (500 mg/kg). Coloque el animal en dorsal recumbency y desinfectar la piel sobre el tórax con etanol al 70%. Cortar la piel con un escalpelo desde el esternón hasta la base del abdomen. Hacer cortes de 1 cm de la base de la incisión a las partes laterales de los ratones con las tijeras.\nCortar la vena hepática con tijeras a sangrar el ratón como el método de eutanasia secundaria. Coloque el animal en posición ventral y esperar 2 minutos para permitir que la sangre drene hacia fuera. Este paso es importante para reducir la sangre en los pulmones.\nQuitar la piel de toda la parte superior del ratón (incluido el jefe) a la base del abdomen donde se hizo la primera incisión con la ayuda de pinzas y tijeras de disección. Cortar la cabeza con las tijeras y colocarlos en un plato de Petri seca estéril.\nCortar a las uniones entre el maxilar y la mandíbula con las tijeras y deseche la mandíbula. Con las tijeras, hacer dos cortes en los extremos de los arcos cigomáticos y eliminarlos. Quitar los ojos con la ayuda de las pinzas de disección.\nSostener el cráneo con el fórceps de disección y cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital con un bisturí. Levante las dos mitades del cráneo con el cerebro para ver la mucosa nasal. Las mucosas nasales están rodeadas por los huesos etmoides y huesos anteriores del cráneo, incluyendo el nasal, maxilar, Palatino, malar,.\nCon el bisturí, cortar la parte del cráneo con el cerebro y deseche. Colocar la otra parte del cráneo con la mucosa nasal en un tubo estéril. Guarde el tubo en hielo (4 º C) si las muestras son procesadas el mismo día, o en hielo seco para congelarlos rápidamente si las muestras se procesará más tarde.\nPara evitar la contaminación de las muestras, limpiar y desinfectar las herramientas de disección entre cada tejido recuperado y entre cada disección animal con desinfectante del dióxido de cloro.\nPara recoger los pulmones, coloque el animal en recumbency dorsal y corte la pleura con las tijeras. Abrir la caja torácica cortando las costillas a 1 cm a ambos lados del esternón. Hacer los recortes de la base de la caja torácica en la parte superior con las tijeras.\nHacer un corte transversal con las tijeras entre las dos incisiones en la parte superior de la caja torácica y retire la placa del pecho. Mantenga los pulmones con las pinzas, cortar al final de la tráquea (justo antes de los pulmones) con las tijeras y poner los pulmones en un tubo estéril. Guarde el tubo en hielo (4 º C) si las muestras son procesadas el mismo día, o en hielo seco para congelarlos rápidamente si las muestras se procesará más tarde.\nNota: Homogeneizar las muestras de tejido en el mismo día que se recogen y almacenan a-80 ° C para analizar títulos virales más adelante. Es importante que las muestras no se someten a congelación y descongelación repetida ciclos antes de que se determinan los títulos de virus. Como alternativa, guardar las muestras de tejido a-80 ° C hasta que se procesarán.\nHomogeneización de pulmones y mucosa nasal\nColoque los pulmones o la mucosa nasal en un homogeneizador de Dounce estéril y añadir 1 mL de medio de infección fría. Homogeneizar la muestra moviendo la mano hacia arriba y hacia abajo durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente (RT) hasta que los pulmones están completamente interrumpidos. Poner la muestra homogeneizada en un tubo estéril y tienda a 4 ° C. utilizar un homogeneizador de Dounce nueva para cada muestra.\nCentrifugar las muestras a 300 x g durante 5-10 min a RT. recoger el sobrenadante en un tubo estéril nuevo. Guarde el sobrenadante a 4 ° C si la titulación viral se realiza en el mismo día y descartar el precipitado. O bien, congelar (-80 ° C) del sobrenadante de homogeneizado de la muestras para evaluar los títulos virales más tarde.\nTitulación de virus por inmunofluorescencia indirecta\nel día antes de la titulación, placas de 96 pocillos con células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK) (4 x 10 4 células/pocillo) para llegar a la confluencia de ~ 80-90% en medios de cultivo de tejidos de la semilla. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2. El día de la titulación viral, compruebe las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa antes de iniciar la infección viral.\n1:10 de preparar las diluciones del sobrenadante de las muestras homogeneizadas (pulmón o mucosa nasal) en medios de infección en una placa de 96 pocillos. Realizar la titulación viral por triplicado para determinar con precisión los títulos virales.\nAgregar 90 μl de medio de infección para cada uno de los pozos de la placa de 96 pocillos. Añadir 10 μl de uno del sobrenadante de las muestras homogeneizadas a pozos A1, A2 y A3 para evaluar el título viral de cada muestra por triplicado. Añadir 10 μl de sobrenadante de otra de las muestras homogeneizadas a pozos A4, A5 y A6. Realizar la misma dilución consecutivamente con el resto de las muestras.\nDespués de la adición la muestra sobrenadante a la columna A, usa una pipeta multicanal para mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Transferir 10 μl de la columna A fila B. cambio las puntas entre diluciones y mezclar bien. Repetir este proceso hasta llegar a la última fila (H).\nRetire el medio de cultivo de tejidos (paso 4.2.3.1) usando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal de las células MDCK en placas de 96 pocillos y lavar dos veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x.\ntransferir 50 μL/pocillo del sobrenadante diluido en serie de las muestras homogeneizadas a la placa de 96 pocillos con MDCK. Empezar a transferir las diluciones más altas (columna H) a las diluciones más bajas (columna A). En este caso, no es necesario cambiar las puntas entre hileras diferentes.\nPoner las placas de 96 pozos en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral. Después de la adsorción viral, eliminar el inóculo utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de los medios de comunicación después de la infección. Incube las células infectadas para 8 h en un incubador de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO 2. Proceder a la fijación, tinción, proyección de imagen y cálculo del título viral como se describe en pasos 4.2.3.6 – 4.2.3.12.\nRetire el medio de cultivo de tejidos de las placas de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Fijar y permeabilizar las células con 100 μL/pocillo de solución de fijación/permeabilización por 20 min a TA.\nPRECAUCIÓN: Use la solución de fijación/permeabilización en una campana de humos para evitar la exposición al formaldehído.\nQuitar la solución de fijación/permeabilización utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal, lavado con PBS 1 x, incubar las células fijas con el bloqueo de solución por 1 h a RT. tienda las células al bloquear la solución a 4 ° C o proceder al siguiente paso.\nQuitar la solución de bloqueo. Añadir 50 μL/pocillo de 1 μg/mL anticuerpo monoclonal (mAb) anti-NP HB-65 diluido en solución de dilución del anticuerpo. Incubar durante 1 h a 37 ° C. diversos mAb o polyclonpuede ser utilizado al (pAb) los anticuerpos anti-PR8.\nMientras tanto, diluir 1: 200 el isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anticuerpo secundario conjugado del anti-ratón en solución de dilución del anticuerpo. Centrifugue la solución a 1.700 x g durante 5-10 min a TA. Pueden utilizarse otros anticuerpos secundarios conjugados con otros fluoróforos.\nQuitar el anticuerpo primario y lavar 3 veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x. Añadir 50 μL/pocillo de la dilución del anticuerpo secundario e incube durante 30-45 min a 37 ° C. quitar el anticuerpo secundario y lavado 3 veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x. Deje el último lavado de la placa.\nObservar las células bajo un microscopio de fluorescencia para determinar el número de células positivas (verde). Calcular el título viral contando FFU/mL. Calcular el título viral expresado en FFU/mL de la dilución con 30-50 las células manchadas positivas mediante la fórmula: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/dilución.\n5. Evaluación de la respuesta inmune Humoral ( figura 3)\ninfectar i.n. 3 grupos de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 5) con diferentes dosis (10 2 10 3 y 10 4 FFU / ratón) de LAIV PR8 y mock-infectar a un grupo (n = 5) con 1 x PBS estéril como control negativo. Realizar las infecciones de ratón i.n como se describe en la sección 3.\nRatón sangrado por punción submaxilar\ncatorce días después de la inmunización, recoger la sangre de ratones submaxilar sangrado utilizando una lanceta 26 de 4 mm, o con IACUC otro método aprobado.\nMantenga el ratón recogiendo por el scruff del cuello entre el dedo índice y el pulgar. Sujete la cola contra la mano con el dedo meñique para inmovilizar el ratón.\nPoner el ratón en una posición lateral a la mejilla. Realizar la punción en la Unión de las venas retro orbital y submaxilares con la vena yugular. Fregadero de la lanceta (4 mm) y recuperar la sangre en un tubo estéril (aproximadamente 0.2 - 0.4 mL/ratón se recuperan). Aplique presión sobre la punción con una toalla estéril durante unos segundos. Coloque el ratón en la jaula.\nPoner los tubos por 1-2 h a 37 ° C y luego los Centrifugue a 700 x g durante 30 min a temperatura ambiente para separar el suero de la sangre. Transferir la capa superior que consiste en el suero con una pipeta en un tubo estéril nuevo. Deseche los pellets de células de sangre rojas (RBCs). Almacenar el suero a -20 ° C.\nAnálisis de anticuerpos totales contra proteínas virales\npreparación de extractos de células MDCK infectados\nel día antes de la infección, la semilla un plato de 100 mm con 4-5 x 10 6 células MDCK (a ~ 80-90 confluencia de % al día siguiente) en medios de cultivo de tejidos. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2. El día de la infección viral, compruebe las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa antes de iniciar la infección viral.\nPreparar una dilución viral con una multiplicidad de (0.001) bajo de infección (MOI) de PR8 WT en los medios de infección en 4 mL de volumen final total. Calcular la cantidad de PR8 WT con la fórmula ((MOI X x células n °) x volumen final) / stock título viral.\nAspirar el medio de cultivo de tejido de la placa de células MDCK y lavar dos veces con 4 mL de PBS 1 x. Añadir el inóculo viral (4 mL) y poner la placa en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral. Retirar el inóculo viral con vacío y añadir 8-10 mL de medio de infección posterior al que contiene 1 μg/mL de tripsina tratada TPCK. Incube las células infectadas durante 48-72 h en una incubadora de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO 2.\nSeparar las células con la ayuda de un raspador celular y recoger las células y el medio de cultivo de tejidos con una pipeta en un tubo de 15 mL. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5-10 min a RT. aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón RIPA y poner la mezcla en un tubo de 1,5 mL estéril. Incubar en hielo durante 20-30 minutos\nCentrifugar el tubo a 1.300 x g por 20-30 min a 4 ° C. con cuidado, se recupera el sobrenadante. Tienda la célula extrae en alícuotas de μl 100-20 ° C.\nValorar los extractos de células como se describe por el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) antes de evaluar la presencia de anticuerpos 9 , 10 , 11 , 27. celular incluyen extractos de células MDCK infectados de mock (preparadas como se indicó anteriormente) como control negativo.\ncapa de poliestireno, placas de 96 pocillos con la dilución de células MDCK infectados extracción en PBS 1 x (generalmente entre 1: 200 - 1:1, 000). Cubra la otra placa con la misma dilución del extracto de células MDCK infectados mock como control negativo. Incubar durante la noche (O/N) a 4 ° C.\nQuitar el sobrenadante utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y lavar una vez con 100 μL/pocillo de PBS 1 x con una pipeta multicanal. Bloque de fijación no específica mediante la adición de 100 μL/pocillo de bloquear la solución por 1 h a RT.\nMientras tanto, hacer diluciones seriadas 2 veces (a partir de dilución 1:50) de los sueros de cada ratón infectado en el paso 5.1 en la solución de dilución del anticuerpo en una placa de 96 pozos.\nQuitar la solución de bloqueo de las placas poliestireno de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Añadir 50 μl de cada dilución de suero de ratón en el pozo apropiado e incubar 1 h a 37 ° C.\nRetirar los sueros de ratones con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada utilizando una pipeta multicanal. Añadir 50 μL/pocillo de un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) diluido 1:2,000 en la solución de dilución del anticuerpo. Incubar 1 h a 37 ° C.\nQuitar el anticuerpo secundario con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada utilizando una pipeta multicanal. Preparar la solución de sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) mezclando la solución de 1:1 A y B. Añadir 100 μL/pocillo de sustrato e incube durante 5-10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.\nDetener la reacción añadiendo 100 μL/pocillo de 0,2 N H 2 hasta 4. Leer las placas a 450 nm en un lector de placas ELISA.\nReste el valor obtenido en cada dilución de la placa de 96 pocillos de infectados mock MDCK desde el valor obtenido en la placa de 96 pocillos MDCK infectados. Calcular los valores medios para cada dilución con los diferentes sueros y representarlos en un gráfico que muestra las desviaciones estándar (SD).\nAnálisis de anticuerpos neutralizantes\nensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) ( figura 5)\nantes de realizar el ensayo HAI, tratar el suero de ratón con receptor destruir la enzima (RDE) para eliminar todos inhibidores no específicos presentes en el suero. Agregar 1 volumen de suero de ratón a 4 volúmenes de la dilución de trabajo RDE (dilución de suero es ahora de 1:5). Incubar O/N (12- 18 h) en un baño de agua de 37 ° C.\nCalor de las muestras de suero a 56 ° C durante 30 min para inactivar el RDE.\nPreviamente para determinar la actividad de hemaglutinación (HAU) de PR8 peso estándar HA ensayo 28. Una vez determinada la HAU viral, diluir la acción viral que HAU 8 por 50 μl de PBS 1 x.\nPreparar diluciones seriadas 2 veces (12 diluciones) de los sueros tratados con RDE en una placa de 96 pocillos fondo V. Utilice una fila para cada muestra de suero (por ejemplo, A1 a A12).\nAñadir 25 μl de 1 x PBS desde A1 a A12 pozos. Prueba cada una de las muestras de suero en una fila. Añadir 25 μl del suero tratado con RDE (1:5) a 25 μl de PBS 1 x en el primer pocillo de la columna (A1). La primera dilución del suero es de 1:10.\nUna vez que todos los sueros tratados con RDE se agregan a la primera columna, (por ejemplo, A1, B1, C1), utilice una pipeta multicanal para mezclar el suero y 1 x PBS mediante pipeteo arriba y abajo. Transferencia 25 μl de los sueros diluidos de la primera columna a la segunda columna (por ejemplo, de A1 a A2). Cambiar las puntas entre las diluciones y mezcla de.\nRepetir pasos 5.3.1.4.2. hasta llegar a la última columna (p. ej., A12, B12, C12). Deseche los 25 μl de la última columna, manteniendo el volumen constante en todos los pozos (25 μl). Incluyen una fila de pocillos que contengan sólo 25 μl de PBS 1 x sin ninguna sera como control negativo.\nAñadir 25 μl de la IAV diluido a 8 HAU/50 μl a cada uno de los pozos con los sueros en la placa de 96 pocillos fondo V, el volumen final en cada uno es bien 50 μL, que contiene 4 HAU de virus. Mezcle el contenido mediante pipeteo repetido. Incubar durante 1 h a RT.\nAñadir 50 μl de Turquía 0.5% glóbulos rojos a cada uno de los pozos. Mezcle el contenido mediante pipeteo repetido. Incube la placa durante 30-45 min en hielo. Lea el ensayo HAI visualmente cuando los hematíes en los pocillos de control (1 x PBS) forman un precipitado rojo (es decir, pellets) en la parte inferior de los pozos de.\nNota: los glóbulos rojos de otras especies como pollo, cuy o caballo también se puede utilizar.\nCalcular los títulos HAI identificando la última en que los hematíes forman una pelotilla roja y no se produce hemaglutinación.\nNota: El valor recíproco de esta dilución es el título HAI. El valor recíproco se multiplica por un factor de 20 para corregir para la 1:20 dilución del suero en la primera fila.\nEnsayo de microneutralización virus (VNA) ( figura 6)\nel día antes de VNA, preparar las células MDCK en una placa de 96 pozos para llegar a 80-90% de confluencia al día siguiente como se describe en el paso 5.2.1.1. Preparar una dilución de PR8 WT en los medios de infección que 200 FFU/25 μl.\nInactivate el suero de ratón a 56 ° C por 1 h. hace diluciones seriadas 2 veces (12 dilución) por suero de ratón en triplicado utilizando una placa de 96 pocillos.\nAgregar 40 μl del suero a 160 μl de medio de infección en el primer pozo de la primera fila, (por ejemplo, A1) (dilución de suero 1:5). Mezclar por pipeteo. Añadir 100 μl de medio de infección para los otros pozos (A2 a H12).\nTransferir 100 μl de la primera fila a la segunda fila para hacer diluciones de 1:2 (p. ej., de A1 a A2). Cambiar consejos entre diluciones y mezclar mediante pipeteo. Repetir este proceso hasta la última fila (p. ej., A12). Descartar 100 μl de la última fila, manteniendo el volumen constante en todos los pozos (100 μL).\nAgregar 100 μl de dilución de IAV en todos los pocillos. Incubar 1 h a TA. Mientras tanto, retire el medio de cultivo de tejidos las células MDCK la placa de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y lavar dos veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x.\nEn cada placa de 96 pocillos de células MDCK, dejar dos filas de los controles. Una fila es el control negativo (células sin sueros y virus), y la otra fila es el control positivo de la infección (células con virus en ausencia de sueros o sueros de ratones infectados mock).\nTransferir 50 μL/pocillo de la placa del anticuerpo del virus a las placas de 96 pocillos de células MDCK. Poner las placas en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral.\nRetirar el inóculo de anticuerpo del virus utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de post-infección medios que contenga 1 μg/mL de tripsina tratada TPCK.\nIncubar las células ~ 3-4 días en una incubadora de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO 2 hasta que se observa efecto citopático (CPE) en el control positivo (células infectadas en ausencia de suero o de suero control).\nRetire el medio de cultivo de tejidos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de la violeta cristalina de 0.1%. Incubar durante 1 h a RT. Retire la solución de cristal violeta con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada. Secar las láminas en RT.\nCalcular los títulos VNA identificando la dilución más alta que conserva una monocapa celular confluente de células MDCK.\nNota: El valor recíproco de esta dilución correspondiente es el título del anticuerpo neutralizante. El valor recíproco se multiplica por un factor de 10 para corregir el 1:10 dilución de los sueros en el primer pocillo de la fila.\n6. Evaluación de las vacunas de eficacia de protección ( figura 3)\nvacuno i.n. un grupo de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 11) con la dosis de la LAIV PR8 para probar (FFU/ratón) y mock-vacunar a otro grupo de ratones (n = 11) con 1 x PBS estéril. Realizar las inmunizaciones de i.n. de ratón como descritas en la sección 3.\nVacunación después de catorce días, sangran los ratones y recoger el suero como se describe en la sección 3. Analizar la presencia de total y de neutralizar anticuerpos contra PR8 WT como se describe en la sección 5.1.1.\nVacunación después de quince días, mida y registre el peso del ratón (día 0). Desafío i.n. de ratones con una dosis letal de la WT de PR8 (desafío homólogo) como se describió anteriormente en la sección 3.\nMedir el peso corporal y la supervivencia (n = 5 / Grupo) durante 14 días después del desafío para evaluar la morbilidad y la mortalidad producidas por el desafío de peso PR8 en ratones vacunados (sección 4.1).\nRecuperar los pulmones de ratón y mucosa nasal (n = 3 al día) en el día 2 y día 4 posterior desafío con PR8 pesos homogeneizar y analizar los pulmones y mucosa nasal tal como se describe en la sección 4.2 a evalúa la replicación viral del PR8 WT en ratones vacunados.\nCaracterización de la patogenesia viral en ratones\nLa patogenesia de IAV se relaciona con la morbilidad y la mortalidad causada por la infección. Estos dos parámetros pueden evaluarse fácilmente en ratones: morbilidad IAV se asocia con pérdida de peso corporal en ratones infectados y el porcentaje de supervivencia indicará la tasa de mortalidad (figura 1). El peso corporal y la supervivencia en ratones infectados IAV generalmente son monitoreados diariamente durante al menos dos semanas después de la infección8,9,10,29. Los datos de supervivencia obtenidos pueden determinar la MLD50 que se calculó utilizando el método de Reed y Muench25. Otro indicador de la patogenesia IAV se relaciona con la replicación viral en la parte inferior (pulmones) y en el tracto respiratorio superior (mucosa nasal) (figura 1). La información obtenida con el título viral en estos órganos corresponde a la morbilidad y mortalidad valores y en conjunto proporcionan una buena indicación de la patogenesia viral. Se sabe que replicación de IAV en los pulmones de ratón de pico entre los días 2 y 4 post-infección (p.i.), y por lo tanto se recomienda recuperar estos órganos en los días 2 y 4 p.i.\nFigura 1: caracterización de la patogenesia IAV en ratones: Patogenesia IAV en los ratones está relacionado con su morbosidad (pérdida de peso corporal) y mortalidad (% de supervivencia) y también la capacidad de IAV para replicar en la parte superior (mucosa nasal) y vías respiratorias (pulmones) más bajas. Brevemente, en el día 0 ratones son pesados y anestesiados por vía intraperitoneal con 2,2,2-tribromoethanol (TBE) antes de que están infectados vía intranasal con IAV. Desde el día 1 al día 14, ratones se pesaron diariamente para evaluar la pérdida de peso corporal (morbilidad) y % de supervivencia (mortalidad) para calcular la dosis letal ratón 50 (MLD50). En los días 2 y la post-infección día 4, mucosa nasal y los pulmones de ratones son recuperados y homogeneizadas para evaluar la replicación viral. Experimentos de ratones para caracterizar la patogenesia IAV usando PR8 WT se realizan bajo condiciones BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nEn la figura 2, se representan los datos obtenidos en la evaluación de la patogenesia de PR8 WT. Cuatro grupos de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 11) fueron infectados i.n. con las dosis indicadas (10, 102103 y 104 FFU y ratón) de PR8 WT. Se midieron el peso corporal y la supervivencia de 5 ratones por grupo por 14 días p.i. (figura 2A–B). Todos los ratones inmunizados con 104 FFU de PR8 WT perdió peso rápidamente (figura 2A) y todos ellos murieron en los días 5 y 6 p.i. (figura 2B). Ratones inmunizados con 103 FFU de PR8 WT perdió peso en el más adelante épocas p.i. (figura 2A) y todos murieron por p.i. días 7 y 8 (figura 2B). Todos los ratones inmunizaron con 102 FFU de PR8 peso perdida de peso corporal (figura 2A) pero solo 2 de ellos murieron en el día 9 p.i. (figura 2B). Finalmente, los ratones inmunizados con 10 FFU de PR8 WT no perdió peso (figura 2A) y todos ellos sobrevivieron a la infección (figura 2B). El MLD50 WT PR8 en este experimento calculado con el método de Reed y Muench25 fue de 1.5 x 102 FFU (figura 2).\nPara evaluar la replicación PR8 en la parte superior e inferior respiratorio tracto de ratones infectados i.n. con las dosis indicadas (10, 102103y 104 FFU y ratón), los pulmones y la mucosa nasal se recuperaron en los días 2 y 4 p.i. (n = 3). Después de la homogeneización del pulmón, la cantidad de virus presente en este órgano se analizó mediante análisis de la inmunofluorescencia (Figura 2D). El título viral detectado en los pulmones de los grupos de ratones diferentes estuvo relacionado con la dosis utilizada para inmunizarlos: títulos virales más altos se detectaron en los pulmones de los ratones inmunizados con 104 FFU de PR8 WT en p.i. de días 2 y 4, mientras que los títulos virales menores fueron detectados en los pulmones de los ratones inmunizados con 10 FFU de PR8 WT.\nFigura 2: representación de los datos obtenidos en la evaluación de la patogenia Viral: Analizar la morbilidad y la mortalidad de PR8 WT, ratones C57BL/6 femeninos de 6 a 8 semanas de edad (n = 5) fueron infectados i.n. con el número indicado de forma fluorescente unidades (FFU) de PR8 WT y luego supervisados diariamente por 2 semanas (A) pérdida de peso corporal (morbilidad) y (B) supervivencia (mortalidad). Los datos representan las medias y desviaciones estándar de resultados determinados para los ratones (n = 5). (C) valores de supervivencia % evaluadas durante 2 semanas se utilizan para calcular el MLD50 utilizando el método de Reed y Muench25. (D) para evaluar la replicación viral, ratones C57BL/6 femeninos de 6 a 8 semanas de edad (n = 6) fueron infectados i.n. con el número indicado de FFU. Replicación viral en los pulmones o la mucosa nasal de los ratones infectados se evalúa generalmente en días 2 y 4 p.i. usando un análisis immunofocus. Títulos virales se registran como FFU/mL. Los datos representan los medios y SDs de resultados obtenidos en cada ratón. Las líneas punteadas se incluyen para indicar el límite de detección (FFU 200/mL) del ensayo. Ratones y experimentos de cultivo de tejidos para evaluar morbilidad, mortalidad y los títulos virales usando PR8 IAV se realizaron bajo condiciones BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nEvaluación de la respuesta humoral inducida después de la vacunación\nRespuesta humoral inducida frente a la infección de IAV juega un papel esencial en el control de la infección viral. Por esta razón, es muy importante analizar las respuestas humorales sacadas por infecciones IAV WT o nuevas vacunas IAV (figura 3). En el modelo murino, 14 días después de la inmunización, ratones se sangraron para analizar la presencia de anticuerpos contra las proteínas virales totales por ELISA (figura 4) y la presencia de anticuerpos contra la proteína viral de la HA, que suele ser neutralizantes analizadas por métodos serológicos comunes, como un HAI ensayo (clase de NG = "xfig" > Figura 5) o un VNA (figura 6).\nFigura 3: esquema de los diferentes pasos en la caracterización de la seguridad, inmunogenicidad y eficacia de la protección de una vacuna viva atenuada contra: Cuando se desarrolla una nueva vacuna viva atenuada contra, el modelo murino de infección IAV se utiliza generalmente para probar la eficacia de la seguridad, inmunogenicidad y protección. En este esquema, los experimentos para evaluar la seguridad (A), (B) de inmunogenicidad y eficacia de protección (C) de un candidato de vacuna viva atenuada contra se indican. (A) para evaluar la seguridad de una vacuna viva atenuada contra es necesario analizar los mismos parámetros (morbilidad, mortalidad y replicación viral en la parte superior y el tracto respiratorio inferior) se describe en la figura 1. Para evaluar la inmunogenicidad, se vacunan ratones y 14 días después de la vacunación son sangrados por punción submaxilar. Las respuestas humorales son analizadas mediante la evaluación de la presencia de anticuerpos totales contra las proteínas IAV por análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) y evaluando la presencia de anticuerpos por ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) o virus neutralizantes ensayo de microneutralización (VNA). (C) para evaluar la eficacia de la protección, 15 días después de la vacunación, se reta a ratones con IAV WT. Protection eficacia es evaluada por la medición de ratones morbilidad, mortalidad y los títulos virales en los pulmones de los ratones desafiados como se describe en figura 1 . Se realizaron experimentos de ratones para caracterizar la eficacia de la seguridad, inmunogenicidad y protección de un candidato de vacuna viva atenuada contra condiciones BSL-2. Otros trajes BSL o condiciones de contención pueden ser requeridas dependiendo de la cepa IAV utilizada para el reto de los ratones vacunados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nPara evaluar la inmunogenicidad de PR8 LAIV, tres grupos de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 5) fueron inmunizados con diferentes dosis (102103y 104 FFU/ratón) PR8 LAIV o mock vacunados con PBS 1 x como control negativo. Catorce días después de la vacunación, se recogieron sueros de ratones por sangrado submaxilar26 (figura 3). Respuestas de anticuerpos contra proteínas virales totales se evaluaron por ELISA utilizando una dilución de 1: 200 del extracto celular de células MDCK infectados PR8 (figura 4). Cada suero se analizó individualmente. Los resultados indican que el suero de ratones inmunizados con la dosis más alta (104 FFU) de LAIV PR8 tenía más altos títulos de anticuerpos contra proteínas totales PR8 que el suero de ratones inmunizados con la dosis más baja (102 FFU). Control de sueros (ratones infectados de mofa) no presentaron reactividad contra los antígenos de PR8.\nFigura 4: representación esquemática de la análisis del inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) para evaluar las respuestas del anticuerpo Humoral: Niveles de anticuerpos de PR8-específica presentes en ratones infectados están determinados por ELISA en placas de poliestireno de 96 pozos recubiertas con extractos celulares de mock (control) o células MDCK infectados PR8. Brevemente, en 14 días p.i. (figura 3), ratones vacunados con las dosis indicadas de LAIV PR8 fueron sangrados por punción submaxilar y se recolectaron sueros. Cada suero fue evaluado individualmente por ELISA para anticuerpos IgG contra las proteínas totales de PR8. Datos del gráfico representan los medios y las desviaciones estándar de los resultados obtenidos de ratones individuales sueros (n = 6). OD, densidad óptica. Se realizaron ensayos de ELISA en un gabinete BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nPara analizar la presencia de anticuerpos en el ratón neutralizantes suero usando el HAI ensayo, diluciones seriadas 2 veces de sueros (previamente inactivados a 56 ° C) de cada grupo de ratones inmunizados con diferentes dosis (102103y 104 FFU) de LAIV PR8 se incubaron con 4 HAU de PR8 WT por 1 h a temperatura ambiente (figura 5). Entonces, 0.5% de glóbulos rojos de Turquía fueron agregado a las mezclas de PR8-sera. La parte superior de la figura 5 es una representación esquemática de los resultados posibles de HAI: cuando el suero contiene anticuerpos de neutralización, precipitación de glóbulos rojos se observa en el fondo del pozo porque los anticuerpos a la proteína viral HA prevenir la hemaglutinación de los hematíes. Por otra parte, en la ausencia de anticuerpos neutralizantes, se observa hemaglutinación de los hematíes. Luego, el título HAI se calcula como el recíproco de la dilución del suero en la hemaglutinación bien pasado. Los resultados HAI demostrados en la parte inferior de la figura 5 indican que el suero de ratón vacunado con la mayor cantidad de LAIV PR8 (104 FFU) tienen el más alto título de anticuerpos neutralizantes, mientras que el suero de un ratón inmunizado con la dosis más baja (102 FFU) tienen el título bajo de anticuerpos contra PR8 neutralizantes. No hay anticuerpos neutralizantes estaban presentes en el suero control (ratones infectados de mock).\nFigura 5: ensayo de hemaglutinación inhibición (HAI): Niveles de anticuerpos contra la WT PR8 en ratones infectados neutralizantes pueden evaluarse fácilmente por análisis de HAI. Brevemente, diluciones seriadas 2 veces (a partir de dilución 1:10) de los sueros de ratones inmunizados con las dosis indicadas de LAIV PR8 se mezclaron (1:1) con 4 HAU de PR8 WT por 1 h a RT en una placa de 96 pocillos fondo V. Después de 1 h de incubación, 0.5% glóbulos rojos fueron agregados a las mezclas de virus suero durante 30-60 min en hielo. Títulos HAI se determinan mediante la identificación de la última en que los hematíes forman un botón rojo y hemoaglutinación no ocurre (arriba). Análisis HAI con PR8 WT fueron realizados en un gabinete BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nEn la figura 6, se representan los datos obtenidos en la evaluación de anticuerpos en suero de ratón neutralizantes por VNA. FFU 200 de PR8 WT se mezclaron con diluciones seriadas 2 veces de sueros (previamente inactivatEd a 56 ° C) de los ratones inmunizados con diferentes dosis (102103y 104 FFU) de PR8 LAIV durante 1 h a TA. Cada muestra de suero se evaluó por triplicado. Las mezclas de sueros de virus fueron utilizadas para infectar monocapas de células MDCK en una placa de 96 pocillos. La parte superior de la figura 6 es una representación esquemática de los resultados posibles de VNA: ausencia de anticuerpos en el suero como resultado CPE en aproximadamente 3-4 días p.i. neutralizantes En cambio, cuando están presentes anticuerpos neutralizantes (monocapa de células intactas), se unen a la HA vírica y prevenir la infección viral, y no hay CPE. Presencia de CPE es generalmente visualizado por tinción de las células infectadas con cristal violeta, y los títulos de neutralización viral se calcularon como el recíproco de la última dilución en que la infección se bloquea totalmente. En la parte inferior de la figura 6se representan los resultados de la VNA. El suero de ratones inmunizados con la gran cantidad de LAIV PR8 (104 FFU) tienen el mayor título de anticuerpos neutralizantes mientras que los sueros de ratones inmunizados con la menor dosis o LAIV PR8 (102 FFU) tienen la concentración más baja de neutralizar anticuerpos, similar a los resultados obtenidos con el ensayo HAI. No hay anticuerpos neutralizantes fueron presentes en el suero de ratones infectados con mofa.\nFigura 6: ensayo de microneutralización Virus (VNA): Una alternativa para el ensayo HAI, el ensayo VNA puede evaluar la presencia de PR8 WT anticuerpos neutralizantes. Brevemente, los sueros de ratones vacunados con las dosis indicadas de LAIV PR8 eran en serie 2 veces diluido (dilución 1:5 al inicio) en placas de 96 pocillos y mezclado 1:1 con 200 FFU de PR8 WT por 1 h a TA. Después de 1 h, las mezclas de virus suero fueron utilizadas para infectar a placas de 96 pocillos de células MDCK. Las células infectadas fueron incubadas durante 3-4 días hasta el completo efecto citopático. Las placas de 96 pocillos entonces fueron manchadas con 0.1% de cristal violeta. Títulos VNA son determinados mediante la identificación de la dilución más alta para retener una monocapa celular confluente. VNA con PR8 WT se realizaron bajo condiciones BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nEvaluación de la eficacia de la protección de las vacunas IAV en ratones\nCuando se desarrolla una nueva vacuna viva atenuada contra, su eficacia, seguridad, inmunogenicidad y protección debe ser probado en vivo, y el modelo de ratón suele ser el primer modelo animal elegido para analizar estos parámetros. Figura 3 es un esquema de los diferentes pasos necesarios para caracterizar una nuevo LAIV en ratones. Para evaluar la seguridad de una vacuna viva atenuada contra (Figura 3A), los ratones son infectados i.n. utilizando un protocolo similar a los procedimientos experimentales descritos en la sección de patogénesis (sección 4), y el peso corporal y el seguimiento de supervivencia proporcionará información relacionada con la morbilidad y la mortalidad de la LAIV (figuras 2A–2B), incluyendo el MLD50. Además, a la inoculación con dosis de diferentes vacunas, la replicación de LAIV en las inferiores (los pulmones) y en el tracto respiratorio superior (mucosa nasal) debe ser evaluados8,9,10, 11,29 (Figura 2D). Para prueba de inmunogenicidad, se recogen los sueros de ratones vacunados con la vacuna viva atenuada contra ante reto con PR8 WT (desafío homólogo), utilizando protocolos similares a los descritos en la sección de inmunogenicidad (sección 5) (figura 3B). Puede detectó la presencia de total y de neutralizar los anticuerpos en el suero por ELISA y HAI o VNA, respectivamente.\nPor último, para probar la eficacia de protección, ratones de la vacuna LAIV se enfrentan con WT de PR8 y la eficacia de protección se caracteriza por la vigilancia de morbilidad, mortalidad y la presencia de desafío PR8 WT en los pulmones, según se describió anteriormente en la sección 4 ( Figura 3)8,9,10,11. Si la LAIV induce la protección contra el desafío de peso PR8, ratones no perderá peso y sobreviven el desafío mortal con WT de IAV. Por otra parte, los títulos virales WT IAV en los pulmones no serán detectados, o se reducirá significativamente en comparación con mock (PBS) vacunados ratones8,9,10,11.\nSoluciones y medios de cultivo de tejido Composición Almacenamiento de información Uso Comentarios\nMedios de cultivo de tejido: Dulbecco de modificado medio de águila (DMEM), 10% suero bovino Fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina-L-glutamina (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG) 445 ml DMEM, 50 ml de SBF y 5 ml de 100 x 1% penicilina (100 unidades/ml)-estreptomicina (100 μg/ml) - L - glutamina (2 mM) (PSG) Conservar a 4° C Este medio se utiliza para el mantenimiento de las células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK)\nLos medios de comunicación después de la infección: DMEM 0.3% albúmina bovina (BA), 1% PSG (DMEM 0.3% BA 1 PSG) 491 ml DMEM, 4,2 ml de 35% BA y 5 ml de 100 x PSG Conservar a 4° C Este medio se utiliza para el mantenimiento de células MDCK después de infección con el virus de la gripe (IAV)\n10 x tamponada fosfato salino (PBS de x 10) 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na2HPO4.7H2O, 2 g de KH2PO4. Añadir ddH2O hasta 1 L. ajustar pH a 7.3 Almacenar a temperatura ambiente (RT) Esterilizar en autoclave\n1 x PBS Diluir 10 x PBS 1:10 con ddH2O Tienda en RT Esterilizar en autoclave\nMedios de infección: 1 x PBS, 0.3% BA, 1% penicilina-estreptomicina (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1 x PBS estéril, 4,2 ml de 35% BA y 5 ml de 100 x 1% penicilina (100 unidades/ml)-estreptomicina (100 μg/ml) (PS) Conservar a 4 ° C Este medio es utilizado para infecciones de IAV\nSolución de fijación/permeabilización: formaldehído al 4%, 0.5% Tritón X-100 diluido en PBS 1 x 400 mL neutro tamponado con formol al 10%, 5 ml de Triton X-100 y 595 ml de PBS 1 x\nd > Tienda en RT Esta solución se utiliza para fijar y permeabilizar las células MDCK en experimentos de titulación viral La solución en una campana de humos para evitar la exposición al formaldehído\nSolución de bloqueo: 2,5% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS 1 x 2,5 g de BSA en 97,5 mL de PBS 1 x Conservar a 4 ° C Esta solución se utiliza como una solución de bloqueo por ensayos de inmunofluorescencia y ELISA. Esterilizar por filtración con filtro de 0.2 μm.\nSolución de dilución del anticuerpo (1% de BSA en PBS 1 x) 1 g de BSA en 99 mL de PBS 1 x Conservar a 4 ° C Esta solución se utiliza para la dilución de los anticuerpos primarios y secundarios en ensayos de inmunofluorescencia y Elisa Esterilizar por filtración con filtro de 0.2 μm\n0.1 violeta cristal en solución % 1 g de cristal violeta en 400 ml de metanol. Agregar 600 ml de ddH2O Tienda en RT Esta solución se utiliza para fijar y teñir las células MDCK en ensayos de neutralización viral\nTosylsulfonyl Fenilalanil clorometil cetona (TPCK)-tratado de tripsina Preparar una solución madre de 1.000 x 1 mg/ml en ddH2O Conservar a-20 ° C La tripsina TPCK se agrega en las infecciones de IAV Hacer 100 μl alícuotas\nAlmacenador intermediario RIPA 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1% Tritón X-100, desoxicolato de sodio 0.1%, 0.1% SDS, 140 mM NaCl Conservar a 4 ° C Esta solución se utiliza para hacer la célula extractos\nTabla 1: medios de cultivo de tejidos y soluciones.\nEl modelo de ratón de IAV es ampliamente utilizado en vivo estudios de eficacia IAV patogenesia, inmunogenicidad y protección. El pequeño tamaño de los ratones los hace fáciles de manipular y almacenar en comparación con otros modelos animales tales como hurones o cobayas. Además, la facilidad en términos de costo de animal, alojamiento y reproducción permiten su uso en pruebas de vacunación pre clínicos en los que se necesitan grandes cantidades de animales. En particular, ya que los ratones se han utilizado en investigaciones múltiples disciplinas, varios molecular y murino reactivos de Inmunología están disponibles para facilitar su uso para estudios IAV. Además, la variabilidad de host mínimo y la presencia de un sistema inmune que es evolutivamente similar al presente en los seres humanos les hacen un modelo robusto de animal pequeño para estudios IAV. Finalmente, el estudio de las interacciones de la proteína viral de host y su contribución a la patogenia viral están actualmente factibles el acceso a los ratones KO. Sin embargo, al lado de las varias ventajas de utilizar ratones para estudios IAV, no son útiles para estudios de transmisión de IAV. Por lo tanto, hurones o cobayas son más adecuados modelos animales para estudiar la transmisión de IAV. Los síntomas clínicos en ratones infectados con IAV generalmente aparecen 2-3 días post-infección, aunque esto puede variar dependiendo de la edad de ratón, estado inmune, sexo, antecedentes genéticos y tensión; así como de la cepa y dosis utilizada. Los síntomas incluyen anorexia, letargo, acurrucados, con volantes de piel, pérdida del cuerpo16,de peso y muerte17.\nEn este manuscrito, describimos cómo evaluar patogenesia viral en i.n. de ratones infectados con IAV mediante el control de pérdida de peso corporal (morbilidad), porcentaje de supervivencia (mortalidad) y mediante la evaluación de la replicación viral en la parte superior (mucosa nasal) e inferior (pulmones) tracto respiratorio (figura 1 y figura 2). La patogenesia de IAV es un parámetro muy importante en el contexto de nuevas cepas IAV, sino también en la ejecución segura de los candidatos LAIV vacuna (figura 3). Temporada de gripe y gripe que infecta a otros mamíferos (como caballos, perros o cerdos) no suelen producir signos de enfermedad en ratones11,27. En este caso, el análisis de títulos virales en los pulmones o la mucosa nasal de los ratones infectados es el parámetro principal para evaluar la patogenia viral de cepas IAV. Una vez que los pulmones y la mucosa nasal se recogen, homogeneizó y la cantidad de virus presente en estos órganos puede ser analizada por el ensayo de placa, análisis de la inmunofluorescencia, cultivo de tejidos infeccioso dosis 50 (TCID50) u otro método validado8 ,29. Recomendamos evaluar títulos virales mediante inmunofluorescencia indirecta ya que el ensayo de placa requiere una mayor cantidad de células MDCK (formato de placa de 6 pozos) y, como el TCID50, más tiempo (3-4 días) es necesaria para calcular los títulos virales. Sin embargo, para realizar el ensayo de inmunofluorescencia indirecta, es necesario disponer de: 1) principal anticuerpos contra una proteína IAV (se recomienda utilizar un anticuerpo contra la nucleoproteína IAV, NP, ya que es la más abundante proteína viral producida durante la infección viral); 2) secundarios anticuerpos conjugados a un fluoróforo; y 3) un microscopio de fluorescencia para contar las células infectadas positivo fluorescentes.\nYa que el sistema inmune de ratones es evolutivamente similar al sistema inmune de los seres humanos16 y ratones pueden provocar una respuesta humoral fuerte y protectora contra la infección de IAV, la inmunogenicidad de la gripe (o candidatos vacunales) puede ser fácilmente evaluado mediante la determinación de total (ELISA; Figura 4) y neutralizar (HAI, figura 5) o las respuestas del anticuerpo VNA (figuras 6). Para analizar la respuesta humoral después de la inmunización, ratones pueden purgarse por diferentes métodos aprobados tales como punción retro-orbitales, clip de cola, punción de la vena safena o punción submaxilar. Elegimos la técnica de punción submaxilar26 porque el procedimiento no requiere el uso de la anestesia y nos permite obtener un volumen aceptable de sangre para estudios inmunológicos; en lugar de la punción de retro-orbital, donde ratones deben ser anestesiados y con la cola clip o punción de la vena safena, donde el volumen de sangre recuperado generalmente es bajo.\nEn este manuscrito, nos describe cómo evaluar la presencia de anticuerpos contra proteínas virales totales por ELISA utilizando extractos de células infectadas por virus. Puesto que la infección IAV induce una inmunidad protectora mediada, principalmente, por anticuerpos específicos contra la HA vírica (la antigénica viral objetivo), se recomienda evaluar la cantidad de anticuerpos inducidos contra HA por ELISA usando recombinante purificada HA proteínas10. Para analizar la presencia de anticuerpos neutralizantes, se aceptan métodos HAI y VNA pero ambos tienen ventajas y desventajas. La HAI es rápida (2-3 h) y aprobado por el centro para la enfermedad y Control de enfermedades (CDC) evaluar la presencia de IAV neutralizar anticuerpos30. La VNA es más desperdiciador de tiempo (3-4 días) pero es más específica ya que se evalúa sólo los anticuerpos que pueden neutralizar la infección viral. En particular, la VNA ha demostrado detectar tallo reactiva HA neutralizar anticuerpos31, así como NA neutralizar anticuerpos32. Otra ventaja de la VNA es la sensibilidad del ensayo, desde el menos IAV (FFU 200) es necesario en comparación con el ensayo HAU que requiere aproximadamente 10 ~4-105 FFU. Por otra parte, el ensayo HAI puede ser problemático para la detección de anticuerpos neutralizantes contra la gripe aviar debido a dificultad con la interpretación de resultados33,34,35. Además, VNA no requiere el uso de glóbulos rojos para la identificación de anticuerpos neutralizantes de la gripe.\nFinalmente, describimos los procedimientos experimentales para evaluar los tres aspectos principales que deben considerarse en el desarrollo de nuevas vacunas IAV (figura 3): 1) seguridad: la vacuna debe ser seguro y no produce la enfermedad; 2) inmunogenicidad: la vacuna debe ser inmunogénica e inducir respuestas protectoras humorales y celulares; 3) eficacia de protección: la vacuna debe inducir protección contra el desafío con virus homólogos o heterólogos WT. El modelo de ratón es una buena opción para la primera proyección de un nuevo IAV vacuna en vivo ya pueden evaluar esquemas de vacunación diversas condiciones, incluyendo el uso de diferentes adyuvantes, dosis de vacuna de antígeno, administración y amplia protección contra el desafío con homólogas o heterólogas gripe cepas16,17. Sin embargo, antes de proceder a ensayos clínicos en humanos, candidatos de vacuna al menos analizarse en un segundo modelo en vivo .\nInvestigación sobre el virus de la gripe en laboratorio LM-S es financiada parcialmente por la Nueva York Influenza centro de excelencia (NYICE), miembro de la NIAID centros de excelencia para la investigación de la Influenza y vigilancia (CEIRS). Agradecemos a Wendy Bates por su apoyo en las correcciones del manuscrito.


Tema: Concurso de Pesca del Surub� con Devoluci�n\nConcurso Argentino de Pesca del Surub� con Devoluci�n\nDel 13 al 16 de octubre se llevar� a cabo en Reconquista, Santa Fe, el XIX Concurso Argentino de Pesca del Surub� con devoluci�n. En virtud de ello, autoridades de la comisi�n organizadora ofrecieron una conferencia de prensa de lanzamiento en el Sal�n �Pin�n� Palma de la Subsecretar�a de Turismo de Corrientes.\nCarlos Buyatti, Vicepresidente primero de la organizaci�n, junto a colaboradores, fueron los encargados de brindar los detalles del evento.\nA manera de introducci�n, Buyatti dijo: �con la Secretar�a de Turismo de Corrientes tenemos una relaci�n muy estrecha y venimos a promocionar nuestro concurso�.\nInform� que se trata del �quinto a�o que hacemos pesca con devoluci�n. Hemos sido los pioneros en esto y es el granito de arena que aportamos a la conservaci�n de los peces. Es una gran fiesta con una concurrencia masiva de pescadores. A 20 d�as de concurso tenemos 300 embarcaciones inscriptas. Reconquista engalana su ciudad para recibir a los turistas y pescadores�.\nPara finalizar sostuvo: �siempre hemos tenido una participaci�n importante de pescadores de Corrientes. Incluso el a�o pasado el ganador fue de Corrientes en un equipo que se form� con gente de Posadas. Corrientes tiene muy buenos pescadores que saben lo que es un concurso y les gusta participar�.\nReconquista es una ciudad que posee la magn�fica capacidad de amalgamar variadas virtudes, que habitualmente son patrimonio de peque�os pueblos con otras que identifican importantes ciudades. As� es como la sencillez y el tranquilo andar de su gente, se entremezcla con el vertiginoso ritmo de sus industrias y su exuberante entorno natural se completa con la m�s variada red de servicios.\nUbicada en cercan�as de una ex�tica mara�a de arroyos, riachos y lagunas sobre las m�rgenes del r�o San Jer�nimo. Posee un m�gico parque natural de islas, en cuya foresta habitan toda clase de aves aut�ctonas y gran variedad de fauna salvaje. Estas caracter�sticas hacen propicios los paseos por la ciudad (museos, casas antiguas y parque industrial), como as� tambien las excursiones a islas que, diferentes empresas de la localidad, brindan para que el turista se deleite con los 5 sentidos.\nEl surub� es el protagonista principal del Concurso Argentino de Pesca del Surub� que todos los a�os convoca a fan�ticos, profesionales y aficionados de toda Sudam�rica.\nCaracter�sticas del Concurso\nEl Concurso, a realizarse en el Puerto de Reconquista reparte m�s de 70.000 pesos en premios en efectivo y �rdenes de compra y a la pieza mayor, le corresponder� la suma de $ 20.000. Los premios corresponden a los rubros embarcado a pieza mayor; embarcado por equipos; pesca de costa pieza mayor; Dama mejor calificada a pieza mayor y al pescador m�s lejano pieza mayor\nPodr�n participar todos los pescadores que cuenten con la licencia de pesca deportiva otorgada por la Direcci�n de Ecolog�a y Protecci�n de la Fauna del Ministerio de Agricultura, Ganader�a y Comercio de la Provincia de Santa Fe o sus similares de otras provincias.\nHasta el pasado 15 de septiembre el costo era de $ 330 por embaraci�n, luego de esa fecha y hasta el hasta el d�a del concurso es $380. Se puede pagar en 6 cuotas iguales, mensuales y consecutivas de $55 c/u.\nPara contactarse con la comisi�n del XIX Concurso Argentino de Pesca del Surub�, los interesados pueden dirigirse a: Tel Fax: 03482 � 425022; Email:info@surubi.com; surubi@surubi; secretaria@surubi.\nFuente: Planeta Corrientes\nPor juanTPCPA en el foro Turismo\n�ltimo mensaje: 22/08/2016, 12:16\nayudita con un concurso !\nPor racing14 en el foro Inform�tica\n�ltimo mensaje: 08/11/2011, 01:33\nPor zasek30 en el foro Presentaciones\n�ltimo mensaje: 01/09/2011, 20:26\nPor pekeland en el foro Animales y Mascotas\n�ltimo mensaje: 19/04/2010, 21:05\nFinaliz� el XXI Concurso de Pesca del Surub�\n�ltimo mensaje: 20/10/2008, 19:31\nconcurso, devoluci�n, pesca, surub�


THE KAYON JUNGLE RESORT desde $124.665 (Ubud, Indonesia) - opiniones y comentarios - hotel - TripAdvisor\nHoteles cerca de Ubud Driver Wins\nN.º 138 de 206 hoteles en Ubud\nNos topamos con este hotel en Internet mientras buscábamos lugares donde alojarnos en Ubud. Como era un complejo nuevo, había muy pocas reseñas en Tripadvisor, lo que siempre me pone un poco preocupado, sin embargo, por el precio que pensamos que valía la pena ir....Reservamos cuatro noches de alojamiento con desayuno incluido y podemos decir que verdaderamente nos encantó cada segundo. Nos recibieron con una amabilidad genuina y una hospitalidad increíble. Nos pusieron en una de las villas de 1 cama con piscina privada y nos quedamos impresionados, la habitación / piscina / vista de todo fue simplemente increíble y perfecto. El personal hizo nuestra estancia memorable especialmente chacha! ! Nada en absoluto era demasiado problema, todo el personal estaba constantemente atento a nuestras necesidades. Cenamos para el desayuno y la cena y todo estaba tan delicioso! El desayuno era enorme en las selecciones hechas a pedido y no hubo problemas con la mezcla y combinación. También definitivamente recomendaría el Nasi goreng con panceta de cerdo para la cena, el sabor era el de morirse. Muchas gracias a los maravillosos chefs! Toda la comida y las bebidas tenían un precio realmente razonable y significaban que no tenía que irse si no quería. El té de la tarde de cortesía de 3: 30 - 4: 30 fue una deliciosa selección de pasteles y sabores. Ahora, en el complejo, las 3 piscinas y las vistas son realmente las mejores que hemos encontrado, con bolsas flotantes de frijoles para sentarse y relajarse y disfrutar de las terrazas de arroz y el área de la selva. También hay un servicio de transporte de cortesía que lo llevará a Ubud cada 2 horas y regresa de nuevo cada 2 horas hasta las 9:45 pm, por lo que nos aventuramos en la ciudad un par de días para cenar y ver el bosque de monos. También hay un paseo que puede tomar con uno de los empleados alrededor del pueblo local y las terrazas de arroz, esta fue una experiencia hermosa y agradable para ver la verdadera cultura. Este complejo realmente es un complejo de 5 *. Si volvemos a Ubud, no dudaríamos en quedarnos aquí, el personal, el ambiente, el complejo y la comida son excelentes. Muchas gracias por una estancia brillante en Bali! ! Emma y John.Más\nRespuesta de The Kayon R, Resort Manager de The Kayon Jungle ResortRespuesta de 1 semana atrás\nEl complejo acaba de abrir hace dos días. No hay palabras para describir. . Este es el paraíso en el cielo? Bienvenido a casa dice la oficina principal, ¡todos quieren una casa como esta! Personal excepcional, ubicación inmejorable, vegetación increíble, el mejor chef de Bali...desde el desayuno hasta el té de la tarde, desde el almuerzo hasta la cena, todo es perfecto. ! ¡El personal, incluida la gerencia, hace un esfuerzo extraordinario para sentirse en el paraíso a un precio asequible! ¡No te lo pierdas! No Dónde en el mundo csn encuentra Esta hospitalidad! ????? ¡La fiebre es hermosa, las piscinas infinitas son tan hermosas que ni siquiera pensarás en el mar! ¡El mejor lugar para vacaciones!Más\nRespuesta de The Kayon Jungl... R, Resort Manager de The Kayon Jungle ResortRespuesta de 8 de septiembre de 2018\nMi novia y yo estamos comenzando actualmente la segunda semana de nuestras vacaciones de dos semanas en Bali y tuvimos el placer de ser algunos de los primeros huéspedes en alojarse en The Kayon Jungle Resort, que se inauguró recientemente. Después de haber disfrutado de...4 días en Nusa Dua, íbamos a embarcarnos en nuestra aventura por la selva en Ubud durante 3 días y honestamente podemos decir que nos trataron como realeza durante nuestra estancia aquí. Ambos hemos sido afortunados de hospedarnos en algunos hoteles de lujo de 5 estrellas en los últimos años, ¡pero el nivel de amabilidad y el servicio al cliente en The Kayon Jungle Resort estaban completamente fuera de este mundo! Los balineses son personas muy amables de todos modos, pero realmente parecían preocuparse por hacer que nuestra estancia corta fuera inolvidable y después de haber sido ascendido a una suite de la piscina, no se dejó piedra sin mover e incluso tuvimos nuestro propio mayordomo privado. Si está considerando alojarse en Ubud como parte de su experiencia en Bali, entonces le recomiendo este hotel. Las piscinas y las vistas de los campos de arroz y la jungla son impresionantes y la comida en el restaurante es de calidad estrellas Michelin. En general, esta fue la experiencia romántica perfecta en la jungla que mi novia y yo podríamos haber deseado y estábamos muy tristes de despedirnos del personal que incluso nos despidió cuando partimos para Seminyak.Más\nRespuesta de The Kayon Jungl... R, Resort Manager de The Kayon Jungle ResortRespuesta de 7 de septiembre de 2018\nEl hotel es un paraíso en Ubud. El hotel es nuevo y las condiciones del hotel son fantásticas. El restaurante es muy bonito y la comida es increíble. Las villas de la piscina tienen muy buenas condiciones y la vista a la terraza de arroz...marca la diferencia. El wanna bar y las 3 piscinas de borde infinito son algo que nunca olvidarás. Si elige una villa, tiene un mayordomo y un buggy que proporcionan todo para que su estancia sea la mejor. Intentamos el masaje en el spa y fue el mejor masaje que llevamos en la vida. Desafortunadamente solo me quedé 2 noches y fue algo que nunca olvidaré. Es un hotel de alto nivel con 5 estrellas. . . el personal y las condiciones te hacen sentir mejor que en casa. Tenemos que volver en el próximo Holliday's. . . ¡Ya viajo por más de 25 países y nunca encuentro un lugar como este! ????Más\nSuites, Kitchenette, Habitaciones para no fumadores, Habitaciones para fumadores\nUS$186 - US$347 (Basado en tarifas promedio para una habitación estándar)\nObtén respuestas rápidas del personal y de los huéspedes anteriores de The Kayon Jungle Resort.


CRONICAS DE CUCUTA: diciembre 2015\nPublicado por Gastón Bermúdez Vargas en 6:06 No hay comentarios:\n865.- LA PARROQUIA DE SAN ANTONIO EN EL BARRIO EL LLANO\nEl Barrio El Llano fue uno de los primeros sectores urbanos levantados en de San José de Cúcuta, como extensión del casco urbano central. Se llamó así por encontrarse en terreno plano inclinado y árido, cubierto de cujíes junto al centro, desde donde se inició la expansión urbana de la ciudad.\nSe ha considerado tradicionalmente uno de los espacios más significativos, porque en él se tejió buena parte de la historia social y económica local. Ahí se erigió el segundo curato parroquial de San José de Cúcuta.\nSus primeros pobladores alzaron casas con techos de paja, paredes de bahareque y otras de adobe o tapias pisadas. La aridez mencionada y el clima ardiente los obligó a buscar la forma asegurar la sombra de sus ranchos y para ello sembraron árboles especialmente de matarratón y almendros.\nLas aguas lluvias fueron la salvación de los árboles y de otros sembrados, en épocas de sequía llevaban el agua en burros del río Pamplonita, que entonces aún se le llamaba río Pamplona.\nLa memoria popular cuenta que el nombre del barrio, probablemente fue tomado a raíz de la llegada de una familia venezolana que al asentarte por esos lares, abrieron una tienda de pulpería llamada El Llano, porque les recordaba a su lugar de origen (los llanos de Carora, Estado Lara).\nY como ha sido tradicional el territorio se fue poblando alrededor de la tienda donde vendían algunos alimentos y especialmente guarapo para calmar la sed producida por el calor. Aunque hay una fecha exacta de creación del barrio, (esto es improbable, porque no existen documentos que lo respalden), dicen que fue el 16 de julio de 1851.\nLos limites propuestos correspondían a los terrenos incluidos entre la calle 12 bajando por la avenida 8ª hasta el callejón o canal Bogotá, luego se toma el mismo rumbo del canal hacia la avenida 11 y de ahí hacia arriba para cerrar la poligonal nuevamente con la calle 12. La única vía que existió en un principio fue la del ferrocarril que venía desde la estación Cúcuta (Hoy central de transportes) y se dirigía hacia puente espuma que quedaba en el camellón del cementerio.\nMucho tiempo después se fueron arreglando las calles aplicándoles empedrados, a finales del siglo XIX y principios del XX las viviendas no tenían servicios públicos, el agua la tomaban de dos tubos que estaban colocados en la esquina de Miramar, Calle 11 con Avenida 11 y otro en el puente Cartagena calle 8ª con Avenida 14. Tampoco tenían luz eléctrica, ni servicio de alcantarillado, las viviendas empleaban letrinas.\nDespués del Terremoto y con el trazo de la nueva ciudad, se levantaron allí algunas viviendas de estilo republicano a donde se mudaron parte de las familias acaudaladas y extranjeras que poblaban el nuevo casco urbano.\nHacia el año 1925 se generalizó el empleo del ladrillo, adobe, tapia pisada y la teja para los techos, a finales del siglo XX, aún se encontraban casas con estas características.\nLa construcción de un canal y las consiguientes tomas públicas arrancadas de los brazos del rio Pamplonita, pusieron fin al sufrimiento por la carencia de agua de los habitantes de San José de Cúcuta.\n“En la avenida 8ª con calle 9ª había una toma o cogedero de agua que más tarde la canalizaron y se construyó un puente, donde hoy existe una placa de mármol con el nombre de “Puente Bolívar” construido en 1881.\nSe construyeron otras tomas públicas tales como la Nariño en la calle 10 con avenida 8ª, la Murillo Toro avenida 6ª con calle 13, la Briceño Andressen calle 11 entre avenidas 8ª y 9ª, la Tatuco avenida 6ª entre calles 6 y 7, la Centenario en la calle 16 entre avenidas 1ª y 2ª y la Curazao en la calle 11 entre avenidas 0 y 1ª” (García Herreros, 1983:100).\nEn el año 1935 se construyó el puente Bogotá, el cual divide la Loma de Bolívar de este sector. Los nuevos límites fueron: Por el norte con la Calle 6ª, el Canal Bogotá a la Avenida 7ª. Por el sur con la calle 10ª desde el Canal Bogotá a la Av. 7ª. Oriente con la Av. 7ª desde la calle 6ª a la calle 10ª. Por el occidente con el Canal Bogotá, desde la Calle 6ª a la Calle 10.\nCon el crecimiento de la ciudad y los nuevos usos del suelo, este barrio pasó a ser parte del centro comercial popular de Cúcuta y la mayoría de las familias, que por décadas lo habitaron se fueron a otros sectores de la ciudad, debido a la inseguridad que produjo la llegada de nuevos vecinos poco deseables como ladrones, drogadictos, prostitución y mendicidad, especialmente en los alrededores del parque Mercedes Ábrego, que lo hicieron invivible.\nCapilla de San Antonio antes del Terremoto de Cúcuta de 1875\nActualmente aunque cuenta con todos los Servicios Públicos como agua, luz, alcantarillado y telefonía y la totalidad de sus calles están pavimentadas, además de trasporte para todos las Comunas, muy pocas familias lo habitan.\nEste es el entorno se encuentra el segundo Templo católico construido en la ciudad posterior al terremoto.\nPero antes del actual templo amplio y moderno, los habitantes del barrio El Llano construyeron una capilla consagrada a San Antonio de Padua, era pequeña y bastante sencilla. Había sido construida en un pequeño lote de terreno ubicado en la esquina diagonal al frente Norte Occidental del mercado cubierto, hoy calle 11 Av. 7ª y 8ª.\nEn esa capilla se veneraba la imagen de San Antonio, una pequeña efigie que las gentes adoraban con suma devoción y creencia en los favores y milagros concedidos. La Fe en aquel Santo hacía creer a la gente que sólo en esa imagen de San Antonio encontraban la redención para muchos de sus males y clamores, tanto espirituales como terrenos.\nLa fama del milagroso se propagó por pueblos y regiones circunvecinas, generando la realización de grandes romerías y festividades, aumentando las rentas parroquiales, el ornamento y la ostentación en este beneficiado eclesiástico.\nCuenta don Luis A. Medina que después del terremoto aquella imagen de San Antonio desapareció de su originaria capilla y fue encontrada en El Salado, donde los vecinos le construyeron también una capilla, lo cual dio lugar a una reclamación de los devotos cucuteños.\nSus primigenios devotos reclamaron y clamaron por el retorno de su adorada imagen, y en nombre de los ellos llevó la palabra un popular orador, a la hora de hacer explícita la reclamación, a manera de gran manifestación religiosa reclamando la propiedad del Santo.\nLos vecinos del caserío “El Salado” también lo reclamaban para sí.\nEl Prefecto Departamental, ante quien habían acudido los cucuteños, se halló perplejo para dirimir el conflicto. Luego, después de amenazas recíprocas entre los grupos enfrentados, la primera autoridad ordenó que se trajera el Santo a su despacho para tenerlo presente, como si fuera cuerpo de delito, y después de algunos días, cuando ya los ánimos se habían calmado, lo entregó a la Iglesia de San Antonio de Cúcuta (Medina, 1988).\nEn 1891, después de permanecer cerca de 16 años sin iglesia y sin administración religiosa ni sacramental en su comunidad, la feligresía del barrio de El Llano, sintiendo vivamente la necesidad del “pastor espiritual”, decidieron poner remedio a tal calamidad.\nLiderados por uno de los vecinos más destacados, don Trinidad Ferrero, acometieron la construcción de una nueva capilla donde habrían de oír misa y recibir los sacramentos y oficios litúrgicos. La obra requirió de ingentes esfuerzos comunitarios, como el de recolectar dineros y materiales para la fábrica de la referida capilla. Un templo en honor y bajo la advocación del mismo San Antonio de Padua, quien era su venerado patrono.\nTodos o la mayoría de los fieles de la localidad y de un numeroso y creciente grupo vecinos, asistían en romería a venerarle y rendirle culto, así como a pagar los votos de sus promesas por los favores recibidos del Santo.\nA esta capilla de culto y veneración religiosa, se le dio el mismo nombre de San Antonio de Padua, siguiendo la tradición llevada hasta el fatídico terremoto de 1875 que había destruido el asiento o Barrio de sus devotos.\nY, según promesa realizada por uno de sus más enconados fieles, Don Trinidad Ferrero, al venerado Santo, los fieles contribuyeron e intensificaron las donaciones para la construcción del templo. Petición que según el Señor Ferrero fue concedida como un verdadero milagro, dada la situación y lo difícil de los tiempos modernos.\nHasta el año de 1926 solo había en la pujante Cúcuta la Iglesia de San José, sede de la Parroquia del mismo nombre. El crecimiento poblacional y urbanístico hizo que fuera muy difícil la atención espiritual de todos sus habitantes, por lo tanto Monseñor Rafael Afanador y Cadena obispo de Pamplona, a cuya diócesis correspondía esta parroquia, decidió dividir esta en dos parroquias, fijando como límite jurisdiccional la actual Avenida 8.\nLa parroquia fue erigida el 12 de diciembre de 1926 y oficializados sus servicios sacramentales y pastorales a partir del primero de enero de 1927, fabricándose al frente a la Plaza Mercedes Ábrego, en la Calle 9ª con Avenida 8º.\nLa primera piedra se puso el 14 de junio de 1931 y la obra se inició el 2 de enero de 1932, en terrenos donados por don José Rafael Unda. Los planos los diseño el arquitecto Gustavo Maldonado y su primer párroco fue el Padre Raúl Angarita.\nComo parte de la remembranza y la tradición de San José de Cúcuta antes del Terremoto de 1875, aunada a la celebración dentro del Santoral romano de los 700 años de la muerte de San Antonio de Padua, (Fernando de Tavera), se volvió a designar esta advocación al patronato de la nueva parroquia.\nLa voluntad y el trabajo de la comunidad beneficiada, permitió conseguir los fondos necesarios para su construcción, acondicionamiento, ornamentación y decoración del templo. Fiestas populares y festivales en los teatros, especialmente en el Santander, permitieron recaudar fondos.\nLa Asamblea departamental asignó al nuevo templo una partida mensual de $1.800, y para los años 40 fue de $5.000, terminando la construcción en 1944, cuando Monseñor Afanador y Cadena inauguró el Presbiterio y al año siguiente asignó como párroco al padre Guillermo Santamaría, quien finalizó la tarea.\nAl templo lo adornan frescos sobre los milagros de San Antonio, así como pasajes de la tradición como: la mula arrodillada ante el Santísimo Sacramento y las Visiones del Niño Jesús con quien jugaba el Santo.\nLos frecuentes temblores han hecho mella en la edificación. El daño más grande lo hizo el temblor de 1981, que resquebrajó las torres y el techo. Estos fueron arreglados durante el oficio administrativo del padre Luis Alejandro Jaimes, quien además de reestructurar las partes afectadas, reconstruyó la casa cural y cambio la fachada, abriendo algunos locales comerciales, de cuyo arriendo recibe parte del sustento la parroquia.\nUna de las obras que actualmente (2015) hace parte de la tradición navideña de la ciudad, es el pesebre mecánico, con movilidad, artísticamente muy original, que logra congregar buena parte de la comunidad católica del Municipio, además de turistas.\nEl enchape del frontis del Templo y otras obras se las reconocen al Padre Eloy Mora, quien dicen sirvió este feligresado con mucho esmero.\nPublicado por Gastón Bermúdez Vargas en 4:12 No hay comentarios:


Ofertas de trabajo de videojuegos - Semana del 30 de enero al 5 de febrero de 2017 - HobbyConsolas - HobbyIndustria\nOfertas de trabajo de videojuegos - Semana del 30 de enero al 5 de febrero de 2017\nUna semana más, como estamos haciendo desde que dio comienzo el 2017, volvemos con una recopilación de algunas de las ofertas de trabajo en el mundo del videojuego más interesantes para esta semana. Si la semana pasada os pusimos algunas ofertas de trabajo en SEGA (que aún están vigentes, por si les queréis echar un ojo) esta semana volvemos con algunas ofertas realmente interesantes tanto dentro de nuestras fronteras como fuera.\nSin más, os dejamos con las ofertas de trabajo de videojuegos más destacables de esta semana y, como siempre, si aparece alguna más que sea lo suficientemente jugosa, actualizaremos la entrada.\nSon Remedy y, por si algunos no los conocéis, son los responsables de Max Payne 1 y 2, Alan Wake o Quantum Break. También desarrollaron un juego de coches, Death Rally, pero su nuevo proyecto parece que seguirá la línea narrativa de los anteriores.\nEspoo, Finlandia. Desde la compañía asegura que la relocalización del nuevo miembro del equipo es una prioridad.\nBuscan una persona que muestre pasión por los videojuegos, tenga un buen nivel de inglés (si es nivel nativo, mejor) y tenga experiencia como escritor en un juego AAA. Además, será un plus si le gustan las películas o las series o tiene experiencia con actores. Si os interesa la oferta de trabajo, aquí podéis inscribiros y ver más detalles.\nWay of Redemption Galería\nGameplay de Way of Redemption, el juego de Pixel Cream para PS4 y PC que pretende recuperar el espíritu de Windjammers y ofrecer una jugabilidad única gracias a la inclusión de habilidades.\nSon los ganadores de los premios PlayStation 2015 y se encuentran desarrollando el espectacular Way of Redemption para PS4 y Steam.\nEs una compañía dispersa por toda la geografía.\nProgramador Unity. Trabajo remoto y, obviamente, remunerado. Programación de elementos de interfaz, de menú, elementos de progresión de usuario y conexión con diversos servicios (como por ejemplo PlayFab o Photon). Colaboración con el resto del equipo para ofrecer una gran experiencia de usuario en cuanto a jugabilidad y progresión.\nPersona con conocimientos de programación en C# y de programación en el engine Unity. Conocimientos de integración de elementos 3D en unity, creación y gestión de Canvas, animator, blend trees, etc. Conocimientos demostrables mediante potfolio. Experiencia en proyectos de videojuegos terminados y apacidad para trabajar sobre deadlines. Si os interesa la oferta de trabajo, podéis inscribiros a través de este enlace.\nSon especialistas en juegos descargables, entre los que se incluyen N.O.V.A., Asphalt, Dungeon Hunter o Modern Combat, además de adaptaciones de juegos de Ubisoft.\nBuscan muchísimos perfiles, como productor, programador de interfaz de usuario, Senior C++ Online Programmer o artista de entornos 3D.\nCada uno de los puestos de trabajo y los respectivos requisitos, además de poder mandar currículo, podréis verlos desde aquí.\nPersona con un mínimo de 2 años de experiencia en testeo de software, con un inglés avanzado tanto a nivel oral como escrito y que tenga pasión por los videojuegos. Además, se necesita que sepa señalar los errores del software con las herramientas de la compañía y dar feedback desde el punto de vista del usuario. Si os interesa la oferta, podéis ver más detalles desde aquí.\nScrapland, Clive Barker's Jericho, saga Castlevania Lord of Shadows y, actualmente, Raiders of the Broken Planet.\nTexturizador del departamento 3D.\nPersona experta en la elaboración de mapas de textura, tanto en base fotográfica como pintada. Experiencia en programas de pintado sobre geometría tipo Mari o Substance Painter y que tenga solvencia en el mapeado de texturas sobre todo tipo de geometrías 3D. Es importante contar con un año de experiencia mínimo en el desarrollo de videojuegos. Si os interesa la oferta, podéis encontrar más detalles a través de este enlace.\nGalería de Werewolves Within\nTráiler de lanzamiento de Werewolves Within para PS4 y PC.\nSon Ubisoft, tampoco necesitan presentación. En concreto, en este estudio de Barcelona se han ayudado a desarrollar juegos de las sagas Assassin's Creed o Just Dance. Además, Werewolves Within para la realidad virtual también es suyo.\nOfrecen varios puestos de trabajo como Gameplay Programmer, FX Artist o Gameplay Animator.\nPinchando en cada uno de los puestos que demandan podréis acceder a los requisitos de cada uno.\nHan desarrollado Aerial Strike, el fabuloso Spec Ops The Line y se encuentran trabajando en Dreadnought.\nQA Technician para trabajar en Dreadnought, un nuevo AAA free to play.\nPersona con dos años de experiencia como tester profesional con bagaje tanto en PC como en las consolas actuales. Destacan que el candidato debe dominar el inglés, tanto a nivel escrito como oral, y ponen como ''plus'' tener experiencia con Unreal Engine. Si os interesa la oferta, podéis inscribiros desde aquí.


Becarias acusan acoso sexual de funcionario en Banderilla | e-consulta.com Veracruz2021\nBecarias acusan acoso sexual de funcionario en Banderilla\nA través de un escrito, acusaron que el director de obras las hostiga y se entromete en su vida personal; alcalde desconoce acusaciones\nPor Isabel Ortega | Viernes, Octubre 8, 2021 |\nBeneficiarias del programa Jóvenes Construyendo el Futuro, denunciaron que el director de Obras Públicas del Ayuntamiento de Banderilla, José Antonio Morales Padilla, las acosó sexualmente, condicionando su permanencia en el Ayuntamiento.\nEn una carta dirigida a la nueva titular de la Secretaría del Trabajo Dorheny Calletano García se acusó al funcionario municipal de incurrir en acciones contra las mujeres que estaban becadas en el Ayuntamiento.\nAl respecto, el alcalde José Manuel Rivera González comentó que a él no le llegó ninguna queja, y que están revisando, a través de la Contraloría si hay alguna denuncia contra funcionarios de su administración.\nEn la carta que fue recibida el 7 de octubre en la oficina de la titular del Trabajo se informó que Morales Padilla ha incurrido en abuso y acoso sexual contra mujeres del programa, entrometiéndose en su vida personal, afectando así su desempeño.\nEn varias ocasiones, denunciaron, acudieron ante el presidente municipal, pero no encontraron respuesta ni apoyo; situación que se repitió con el DIF Municipal donde pidieron una audiencia, pero no obtuvieron respuesta.\nPor lo anterior, pidieron la intervención del titular de la Secretaría del Trabajo, Previsión Social y Productividad, Dorheny Cayetano García.\nDenunciaron que la violencia de género en la que incurre el funcionario es un delito, por lo que pidieron que sea sancionado o inhabilitado; además, de que acusaron que el alcalde José Manuel Rivera González estaba al tanto de la situación y la minimizó al considerar que el tema se estaba malinterpretando.\nEn entrevista el alcalde aseguró que después de enterarse de la denuncia pública consultó con la Contraloría si existía alguna queja contra los directores de área, sin embargo, destacó que no tienen ningún reporte.\n“Puse a mi gente, pregunté en el DIF Municipal, en la Contraloría, aquí mismo en Presidencia si hay alguna situación de algún acercamiento o queja de jóvenes construyendo el futuro, y hasta el momento no tenemos nada; sin embargo, vamos a seguir investigando”.\nConfirmó que darán seguimiento a la denuncia pública; y recordó que es la Contraloría Municipal el área de recibir y canalizar a los jóvenes a las áreas del municipio.


Historiadores y antropólogos han investigado la historia milenaria del QìGōng y estiman que esta disciplina china cuenta con más de 5,000 años de evolución. Desde su origen el QìGōng era una disciplina reservada para un grupo exclusivo y muy reducido de personas. En 1981 el Dr. Pang Ming, médico de medicina occidental y tradicional china y experto en QìGōng, abre la práctica de esta disciplina para beneficio de la población en general. En 1988 el gobierno chino apoya el proyecto para abrir el Centro Huaxia ZhìNéng QìGōng, el hospital sin medicinas más grande del mundo. En 1997 el Ministerio de Salud y el Ministrio de Deportes publican una investigación en la que se afirma que el ZhìNéng QìGōng es la disciplina más efectiva entre los 11 tipos de QìGōng reconocidos, sistemas estructurados que buscan el bienestar del ser humano.\n¿Por qué el Dr Pang creó el ZhìNéng QìGōng?\nEl pasado 26 de septiembre de 2019 el maestro Pang cumplió 79 años, vive en su casa de Beijing, continua escribiendo y está atento a la comunidad de practicantes de ZhìNéng QìGōng y a sus logros. Es un maestro de muy alto nivel, pero a la vez es una persona muy compasiva, amorosa, divertida, disciplinada y exigente.


Milica Jovanovic, más talento balcánico para el Campus Promete | Federación Española de Baloncesto\nMilica Jovanovic, más talento balcánico para el Campus Promete\n11/16/2017 - 2:24 PM\nLa ala-pívot llega a Logroño tras firmar cinco grandes temporadas en la exigente liga turca y posicionarse como una de las referentes en la selección de Montenegro.\nEl Campus Promete LF1 suma a la ala-pívot montenegrina Milica Jovanovic (28 años y 1,89m) a su proyecto de la Liga Día.\nLa nueva incorporación del equipo riojano se caracteriza por su experiencia en importantes ligas como la italiana o la turca y su capacidad para encontrar oportunidades y ejecutarlas con maestría. Una jugadora que se crece en los momentos importantes de partido y que cuando entra en racha aporta solidez al grupo y garantiza un espectáculo de aciertos desde el exterior.\nLa montenegrina ya compitió en canchas nacionales bajo el mando de Lucas Mondelo en el C.B. Olesa-Espanyol, en el que en la temporada 2009-10 logró el séptimo puesto de la Liga Femenina.\nTras su temporada en España, Jovanovic maduró su juego en Italia, donde completó dos temporadas en el Liomatic Umbertide, donde terminó promediando 8,5ppg que le permitieron participar en las semifinales de A1 y copa, y dar el salto a la liga turca.\nDe la mano del Besiktas CT Istambul logró, en la temporada 2012-13 sumar los 15,7 puntos y 5,3 rebotes por partido. Un año más tarde defendió la camiseta del Orduspor y en 2014-15 jugó por el Adana ASKI, junto al que compitió en la final de la Turkish Cup y la seminfinal de la TKBL, y donde volvió a demostrar su garra desde el perímetro y consiguió renovar aportando 13,6ppg y 4rpg.\nEn la pasada temporada, tras el inicio en el Olimpiacos Pireus griego, Milica retornó a Turquía, donde firmó 9,1 anotados y 3,1 rebotes por partido de la mano del Mersin BK Dogus Hastanesi. Milica inició esta campaña en la liga griega con el Panionios GSS Athens, donde en 4 victorias ha logrado promediar 12,8 puntos 3 rebotes y 8 asistencias.\nJovanovic es una de las referentes en la selección absoluta montenegrina, uno de los equipos más peligrosos de Europa por la efectividad y el espíritu balcánico de sus jugadoras, como ya comprobó el combinado de Mondelo en el preolímpico de 2016, en el que Milica anotó un peligrosísimo triple a 20 segundos de la bocina y sumó 10 tantos para concluir 75-74 para España.\nEl pasado sábado, 11 de noviembre, Jovanovic logró una nueva victoria con su selección en su compromiso ante Islandia por la clasificación al Eurobasket 2019 (62-84), donde sumó 7 tantos, 3 rebotes y 2 asistencias en 21 minutos de juego.\n“La incorporación de Jovanovic es garantía de calidad desde el exterior, un importante refuerzo que aportará experiencia, templanza y buena mano al equipo de Elorduy” apunta Txisko Sainz, gerente del Club Deportivo Promete.\nMilica Jovanovic llega al Campus Promete (Foto: FIBA)


Canarias24Horas.com - Ashotel y la Cátedra de Turismo proponen a Puerto de la Cruz impulsar el reciclaje en hoteles con una tasa de pago por generación\nMelwani indicó que la Concejalía que dirige Montañés "ha realizado un trabajo intenso junto al sector alojativo, que se está traduciendo en la adopción de medidas valientes que van a revertir la situación de la gestión de los residuos del municipio". Además, añadió que, si bien esta gestión es mucho mejor que la media de Canarias, "debe mejorar aún hasta niveles que el Ayuntamiento considera óptimos". Recordó que Puerto de la Cruz recibe al año 2 millones de visitantes, de los cuales casi un millón se alojan en ella, "lo que supone que un importante porcentaje de los residuos generados proviene del sector turístico". "Cualquier esfuerzo en esta materia no es suficiente sin un compromiso firme de los establecimientos hoteleros", dijo Melwani, quien felicitó el trabajo conjunto realizado por el área que dirige Montañés, Ashotel y la Cátedra de Turismo.\nTalg apuntó también que "los hoteleros de Puerto de la Cruz toman una vez más la iniciativa en estos asuntos medioambientales y de sostenibilidad, como ya lo hicieron al ser pioneros en la creación de la Q de Calidad en 1995 o de la implantación de certificados europeos de ecoauditoría EMAS".\nPadrón, por su parte, comentó que la propuesta de implantación de la tasa de pago por generación "es fruto de todo el trabajo que viene realizando en esta materia Ashotel, que ya sugirió activamente durante la elaboración del Plan Territorial de Ordenación de Residuos de Tenerife en 2006.\nDe forma resumida, en el estudio previo se analizaron diferentes alternativas y se optó finalmente por una, consistente en el cobro de una parte fija de la tarifa, que es igual a lo que pagan actualmente los establecimientos por generación de basura, más una parte variable, en función de la intensidad de uso de los contenedores de la 'fracción resto' (grises o verdes) sobre la media hotelera para disponer sus residuos. El objetivo final es que se produzca una transición hacia un pago por generación completo o exclusivo, a medida que más establecimientos hoteleros reduzcan el número de estos contenedores y mejore la tecnología aplicada.\nEl sector hotelero de Puerto de la Cruz, coordinado por Ashotel, viene participando activamente desde hace algún tiempo en el 'Plan 70/20: el Puerto Recicla', una iniciativa promovida por el área de Servicios Generales, Obras e Industria del ayuntamiento portuense, que tiene como objetivo mejorar los ratios de recogida selectiva de residuos de la ciudad turística, con el fin de que en el año 2020 se alcance un 70% de reutilización y reciclado. Este proyecto de implantación de un sistema de pago por generación también se enmarca entre las acciones desprendidas del proyecto europeo Horizonte 2020 Urban Waste, del que Ashotel participa como socio del proyecto.\nMás en esta categoría: « El Aeropuerto de Tenerife Norte invierte 2,4 millones de euros en su nueva Terminal de Carga\tArona, único destino de Tenerife que entra en la Red de Destinos Turísticos Inteligentes\t»