A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk | Protocol (Translated to Spanish)\nUn modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell\nDescribimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.\nLa matriz extracelular (ECM) desempeña un papel central en la regulación de la homeostasis tisular, participando en la conversación cruzada con las células y regulando múltiples aspectos de la función celular. El ECM desempeña un papel particularmente importante en la función del tejido adiposo en la obesidad, y las alteraciones en la deposición y composición del ECM del tejido adiposo se asocian con enfermedades metabólicas en ratones y humanos. Los modelos in vitro tractables que permiten la disección de las funciones del ECM y las células para contribuir al fenotipo tisular global son escasos. Describimos un novedoso modelo 3D in vitro del cultivo humano ECM-adipocyte que permite estudiar las funciones específicas del ECM y los adipocitos en la regulación del fenotipo metabólico del tejido adiposo. El tejido adiposo humano se descelulariza para aislar la ECM, que posteriormente se repobla con preadipocitos que luego se diferencian dentro del ECM en adipocitos maduros. Este método crea construcciones ECM-adipocitos que son metabólicamente activas y retienen características de los tejidos y pacientes de los que se derivan. Hemos utilizado este sistema para demostrar la conversación cruzada ECM-adipocyte específica de la enfermedad en el tejido adiposo humano. Este modelo de cultivo proporciona una herramienta para disección de las funciones de la ECM y los adipocitos en la contribución al fenotipo metabólico del tejido adiposo global y permite el estudio del papel del ECM en la regulación de la homeostasis del tejido adiposo.\nLa matriz extracelular (ECM) no sólo proporciona un andamio mecánico para los tejidos, sino que también se involucra en una compleja conversación cruzada con las células que residen dentro de ella, regulando diversos procesos necesarios para la homeostasis tisular, incluida la proliferación celular, diferenciación, señalización y metabolismo1. Mientras que el ECM sano desempeña un papel esencial el mantenimiento de la función normal del tejido, ECM disfuncional se ha implicado en múltiples enfermedades2.\nEl tejido adiposo desempeña un papel importante en la patogénesis de la enfermedad metabólica. La obesidad se asocia con hipertrofia excesiva de adipocitos e hipoxia celular, defectos en el metabolismo celular de los adipocitos, y el retículo endoplasmático del tejido adiposo y el estrés oxidativo y la inflamación. Si bien no se entienden bien, estos procesos complejos conspiran para afectar la capacidad de amortiguación de nutrientes del tejido adiposo, lo que conduce al desbordamiento de nutrientes del tejido adiposo, toxicidad en múltiples tejidos y enfermedad metabólica sistémica3,4 ,5. La secuencia de eventos y mecanismos específicos que subyacen a la insuficiencia del tejido adiposo se entienden mal, pero se han implicado alteraciones en el tejido adiposo ECM. La composición de ECM se altera dentro del tejido adiposo en la obesidad humana y murina, con una mayor deposición de la proteína ECM junto con diferencias bioquímicas y estructurales cualitativas en el tejido adiposo ECM asociado con la enfermedad metabólica humana, incluyendo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia6,7,8,9,10,11.\nA pesar de estas observaciones, el papel del ECM del tejido adiposo en la mediación de la disfunción del tejido adiposo no está bien definido. Esto se debe en parte a la falta de modelos experimentales tractables que permiten la disección de las funciones específicas de ECM y adipocitos en la regulación de la función final del tejido adiposo. El cultivo de ECM-adipocyte simula mejor el entorno in vivo del tejido adiposo nativo en al menos dos aspectos. En primer lugar, el cultivo ECM proporciona un entorno molecular similar al tejido adiposo nativo, incluyendo colágenos nativos, elastinas y otras proteínas de matriz ausentes en el cultivo 2D estándar. En segundo lugar, se ha demostrado que el cultivo en plástico 2D altera el metabolismo de los adipocitos a través de efectos mecánicos debido a la disminución de la elasticidad del sustrato plástico12,que elimina el cultivo ECM.\nSe han estudiado métodos para diseñar andamios biológicos mediante el aislamiento de ECM de la adiposa descelularizada y otros tejidos en el contexto de la medicina regenerativa y reconstructiva y la ingeniería de tejidos13,14, 15,16,17,18. Hemos publicado previamente una metodología en la que adaptamos estos métodos para desarrollar un modelo 3D in vitro del cultivo humano de ECM-adipocitos, utilizando ECM y células madre de adipocitos (preadipocitos) derivadas de tejidos adiposos viscerales humanos11. En el presente artículo, describimos estos métodos en detalle. El procedimiento de descelularización para el tejido adiposo humano es un proceso de cuatro días que implica tratamientos mecánicos y enzimáticos para eliminar células y lípidos, dejando un andamio biológico que mantiene las características del tejido del que se deriva. El ECM descelularizado apoya la diferenciación adipogénica de los preadipocitos humanos, y cuando se reconstituye con adipocitos, mantiene la microarquitectura y las características bioquímicas y específicas de la enfermedad del tejido adiposo intacto y participa en características del tejido adiposo nativo. Esta matriz se puede estudiar sola o resembrada con células, permitiendo el estudio de interacciones y interrelación entre los componentes celulares y extracelulares del tejido adiposo.\nLos tejidos adiposos se obtienen de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica electiva bajo la aprobación de la junta de revisión institucional.\n1. Aislamiento de preadipocitos y preparación de reactivos de cultivo\nPreparar albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS). Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.\nPreparar la colagenasa tipo II: 2 mg/ml en 2% de BSA en 1x PBS. Prepárese inmediatamente antes de usar.\nPreparar red blood cell (RBC) Lysing Solution: 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodium EDTA in deionized EDTA (DI/H2O). Conservar a 4oC. Preparar 1 solución de lising RBC a partir de una solución de stock 10x en DI/H2O inmediatamente antes de su uso.\nPreparar medios de crecimiento: 15% suero bovino fetal (FBS), 1% solución antibiótica-antimicótica (ABAM) en el medio de águila modificado de Dulbecco:Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.\nPreparar la solución de congelación de preadipocitos: 10% Sulfóxido de dimetil, 15% FBS en medios DMEM/F12. Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.\nPreparar medios de diferenciación: 10 mg/L de transferrina, biotina de 33 m, solución de insulina humana de 0,5 m, sal hemicáltica de ácido D-pantoténico de 17 m, 100 nM de xametasona, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironina sal sódica (T3), 1 m de ciglitizona, 540M 3- 3- Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX),1% ABAM en DMEM/F12. Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.\n2. Preparación de reactivos ECM\nPreparar la solución tampón de congelación: 10 mM Tris base, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% flúor fenilmetilsulfonil (PMSF) en DI / H2O. Agitar la solución para disolver EDTA. Ajuste el pH a 8,0 con HCl o NaOH.Store a 4 oC durante un máximo de 3 meses.\nPreparar la solución enzimática #1: 1% ABAM en 0.25% trypsin-EDTA. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.\nPreparar solución tampón de entrada: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4,1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. esterilizado O. Revuelva para disolver sales. Ajuste el pH a 8.0 con HCl o NaOH. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.\nPreparar la solución enzimática #2: 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO4x 7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. Almacenar 4 oC durante un máximo de 3 meses. Revuelve para disolver las sales. Inmediatamente antes de su uso, añadir 80 U/ml de lipasa de páncreas porcino, tipo VI-S; 160 U/ml desoxirribonucleasa I de páncreas bovino, tipo II-S; y 100 g/ml ribonucleasa A del páncreas bovino, tipo III-A.\nPreparar solución de extracción de disolvente polar: 1% ABAM, 1% PMSF en isopropanol.\nADVERTENCIA: El isopropanol es inflamable; almacenar en un armario inflamable a 25 oC y desechar en residuos inflamables.\nPreparar 70% etanol, 1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. Añadir ABAM y PMSF justo antes de su uso.\nADVERTENCIA: El etanol es inflamable; almacenar en un armario inflamable a 25 oC y desechar en residuos inflamables.\nPreparar la solución de almacenamiento: 1% ABAM, 1% PMSF en 1x PBS. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.\n3. Preparación de reactivos de fenotipado metabólico\nPreparar medios de hambre sérica: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtrar esterilizar y almacenar a 4 oC\nPreparar 200 nM solución de insulina humana en 1x PBS inmediatamente antes de su uso.\nPreparar 200 nM de insulina humana, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glucosa, 1 ci/bien Deoxy-D-glucosa, 2-[1,2-3H(N)]-, en 1x PBS. Prepárese inmediatamente antes de usar.\nPreparar el isoproterenol diluido en PBS: solución de stock de 3 mM. Diluir a una concentración de trabajo de 3 m para el ensayo.\nTinción de petróleo rojo-O\nPreparar 4% de formalina en DI/H2O. Almacenar a temperatura ambiente.\nPrepare la solución de trabajo de Oil Red-O. Diluir aceite Rojo-O Solución (ORO) con DI/H2O en una relación de 3:2 (ORO:DI/H2O). Prepárese inmediatamente antes de usar. Filtrar por papel de filtro(Tabla de materiales).\n4. Adquisición de tejido adiposo\nNOTA: El tejido adiposo visceral (IVA) se recoge del mayor omento al comienzo de la operación por el cirujano y se transporta de vuelta al laboratorio sobre hielo para su procesamiento inmediato. Se deben tomar precauciones universales al manipular todos los tejidos humanos y reactivos cáusticos, incluida la realización de todo el trabajo en una campana de flujo laminar, el uso de un desgaste de seguridad de laboratorio completo y la no recapitulación de agujas.\nAñadir 5-10 g de IVA intacto a 15-25 mL de solución de tampón de congelación en un tubo cónico de 50 ml para sumergir la muestra de tejido. Almacene las muestras a -80 oC hasta la descelularización, hasta 1 mes.\nUtilice una muestra nueva separada del IVA para el aislamiento de los preadipocitos, tal como se describe en la sección 5.\n5. Aislamiento de preadipocitos\nColocar 2 g de IVA intacto en 20 ml de la colagenasa, tipo II, solución en un tubo cónico de 50 ml. A continuación, picar a fondo insertando tijeras estériles en el tubo cónico y picando el tejido dentro del tubo. Una vez completamente picado a una lodos finas, incubar el tejido en la solución de colagenasa en un agitador orbital a 130 rpm y 37 oC durante 60 min.\nFiltrar el digestato resultante a través de una malla de nylon de 100 m en un tubo cónico fresco de 50 ml vertiendo el digestato desde un tubo cónico a través de un pedazo de malla doblada sobre la parte superior de un tubo cónico fresco. El digestato en este punto debe ser un líquido amarillo-naranja con viscosidad moderada, con pequeñas cantidades de hebras residuales de tejido fibroso no digerido. La malla debe capturar trozos más grandes de tejido no digerido, que se descartan.\nCentrifugar la muestra a 270 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 2 ml de 1 solución de lising RBC con una pipeta.\nIncubar durante 1 min a 25oC y añadir 10 mL de 15% FBS-DMEM/F12. Centrífuga a 270 x g durante 10 min.\nRetire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de 15% de FBS-DMEM/F12 con una pipeta. Transfiera la suspensión celular a una placa Petri de 100 mm con una pipeta e incubar a 37 oC y 5% de CO2,hasta que las células alcancen una confluencia del 80-100%, normalmente 2-6 días. Cambie el medio cada 2-3 días.\nSepare y lave las células.\nRetire los medios con una pipeta y aplique 4 ml de trippsina-EDTA al 0,25% de trippsina-EDTA a las células adherentes. Incubar a 37oC durante 10 min, girando periódicamente la placa suavemente para separar las células.\nAgregue 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12 y vuelva a suspender las células separadas en este medio con una pipeta. A continuación, transfiera a un tubo cónico fresco de 50 ml y centrífuga 270 x g durante 10 min.\nRetire el sobrenadante y deseche. Lavar el pellet celular una vez en 1x PBS, y luego resuspender el pellet celular en 20 ml de fresco 15% FBS-DMEM/F12 con una pipeta. Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo T-150.\nCélulas de cultivo a 37oC y 5% CO2. Divida y amplíe las células cada 2-3 días a medida que alcanzan una confluencia del 80-100% aplicando 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25%, expandiéndose de un matraz a 8 matraces.\nNOTA: Esto normalmente requiere 3-4 pasajes, lo que permite la expansión adecuada y conserva el potencial adipogénico y fenotipos metabólicos celulares específicos del paciente y del depósito. El paso de preadipocitos por encima de 4-5 pasajes conduce a la pérdida de potencial adipogénico.\nSepare las células en 8 matraces con 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25% por matraz como se ha descrito anteriormente, e incubar a 37 oC durante 10 min.\nAñadir 8 ml de 15% FBS-DMEM/F12 por matraz y resuspender las células separadas con una pipeta. Transfiera toda la suspensión celular dividida uniformemente en tres tubos cónicos de 50 ml y centrífuga a 270 x g durante 10 min.\nResuspender los gránulos de células resultantes en 5 ml de 15% DE FBS-DMEM/F12 en un tubo cónico de 15 ml y células de recuento utilizando contador de celdas y azul Trypan.\nCentrifugar la suspensión celular a 270 x g durante 10 min. A continuación, resuspenda el pellet celular en Preadipocyte Freezing Solution a una concentración celular final de 1 x 106/mL, y alícuota 1 mL de suspensión celular por tubo criovial de 1,5 ml.\nConservar las células en crioviales durante 1 día a -80oC. A continuación, transfiera crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo durante 3-6 meses.\nCuando esté listo para su uso, descongelar un criovial en un baño de agua de 37 oC durante 3-5 min. Resuspender las células en 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12, y centrifugar a 270 x g durante 10 min.\nResuspender el pellet celular en 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12, pipeta en un solo matraz T-150, y luego crecer a 80% de confluencia durante 2-3 días a 37 oC y 5% CO2.\nSepare las células con 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25% por matraz como se describe anteriormente en el paso 5.6. Resuspenda a 3 millones de células por ml (es decir, 6 x 104 células por 20 ?L) en 15% FBS-DMEM/F12, y utilícelo como se describe a continuación (sección 7, paso 7.4).\n6. Preparación de ECM de tejido adiposo\nDía 1: Congelación-descongelación y digestión enzimática #1\nCongelación-descongelación previamente congelada (paso 4.2) Muestras de IVA almacenadas en La solución de tampón de congelación en tubos cónicos de 50 ml de -80 oC a 37 oC en un baño de agua precalentado, incubando 20 min con agitación manual suave. Una vez descongelado, transfiera de nuevo a -80 oC e incubar 20 min. Repita la congelación-descongelación 3x, terminando por descongelar las muestras en un baño de agua de 37 oC.\nCon fórceps estériles, transfiera las muestras de IVA a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de Solución Enzimática #1, asegurando que las muestras de IVA estén completamente sumergidas. A continuación, incubar durante la noche en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC).\nDía 2: Digestión enzimática #2\nLas muestras de lavado 3x con 15-25 ml de Solución tampón de enjuague en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado). Vierta la solución de tampón de enjuague después de cada lavado.\nTransfiera las muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de Solución Enzimática #2 e incubar en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, durante la noche).\nDía 3: Delipidación\nTransfiera las muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de extracción de disolventepolar e incubar en un agitador orbital (130 rpm, 25 oC, durante la noche). Después de este paso, se debe eliminar la mayoría de los lípidos, y las muestras deben ser de color blanco o translúcido.\nADVERTENCIA: La solución de extracción de disolvente polar es inflamable y debe almacenarse y utilizarse a 25 oC.\nDía 4: Lavado y almacenamiento\nTransfiera muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de tampón de entrada. Las muestras de lavado 3 x en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos por lavado).\nEnjuague las muestras 3 veces con 15-25 ml de etanol al 70% en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos cada lavado) vertiendo la solución de etanol al 70% después de cada lavado.\nLave las muestras una vez con la solución de almacenamiento en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos por lavado).\nUsando fórceps estériles, transfiera muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de almacenamiento. Asegúrese de que se utiliza suficiente solución de almacenamiento para sumergir completamente las muestras. Conservar a 4oC durante un máximo de 1 mes.\n7. Preparación de ECM-adipocyte\nTransfiera fragmentos de ECM almacenados a pozos individuales de placa de 24 pocillos utilizando fórceps estériles. Agregue tantos fragmentos de ECM en tantos pozos como sea necesario para el ensayo descendente planificado (por ejemplo, la acumulación de glucosa o la lipólisis, ver más abajo), incluidos duplicados o triplicados. Lavar con 500 oL de 70% de etanol 3 veces en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado).\nRehidratar el ECM lavando 3 veces en 1x PBS estéril en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado).\nUsando tijeras estériles, corte y pese ECM en fragmentos de 100 mg. Usando fórceps estériles, coloque un fragmento de 100 mg en cada pocal de una placa de 24 pocillos. Incubar a 25oC durante 15 min para permitir que el exceso de PBS extruya de fragmentos. Retire con cuidado cualquier exceso de PBS con una pipeta.\nSemilla cada fragmento de ECM de 100 mg con 20 ml de suspensión celular de preadipocitos (3 millones de células por ml, 6 x 104 células por 20 l, en 15% FBS-DMEM/F12, del paso 5.10). Pipetear las células directamente en el ECM colocando la punta de la pipeta en el ECM y expulsando suavemente la suspensión celular en el centro de la matriz, teniendo cuidado de que la suspensión celular no se desborde y termine en la parte inferior del pozo.\nSi la suspensión celular está desbordada del ECM donde se ha colocado la punta de la pipeta, retire la punta de esa ubicación e insértela en otro lugar del ECM. ECM sembrado por 40 min a 37oC.\nNOTA: Para la extracción de ARN para qrtPCR, semilla cada 500 mg de fragmentos de ECM con 3 x 105 células en 100 l (3 millones de células por ml, es decir, 3 x 105 células por 100 l, en 15% FBS-DMEM/F12).\nLlene cada pocal de la placa de 24 pocillos con 500 ml de medios de crecimiento para cubrir los fragmentos de ECM sembrados. Cultivo a 37oC y 5%CO2 durante 72 h.\nDespués de 72 h, aspirar cuidadosamente 15% FBS-DMEM/F12, inclinando ligeramente la placa para permitir que los medios se agrupen debajo del fragmento, y colocando la punta de la pipeta justo adyacente al fragmento de ECM sin molestarla. Después de aspirar, añadir 500 l de medios de diferenciación, cambiando los medios cada 2-3 días utilizando una técnica similar, durante un período de cultivo total de 14 días.\nCompruebe la diferenciación mediante microscopía ligera: las células acumularán lípidos, se volverán de color marrón-amarillo y más esféricas en forma.\nNOTA: Las matrices sembradas se pueden utilizar para pruebas metabólicas (por ejemplo, ensayo de admisión de glucosa, ensayo de lipólisis, ORO), histología o inmunohistoquímica (IHC) o imágenes de tejido estándar. Para la tinción e imágenes de ORO de tejido fijo, congele muestras de ECM-adipocitos en nitrógeno líquido.\n8. Fenotipado metabólico\nFijar muestras en 2.5% glutaraldehído en tampón de fosfato de Sorensen a 25 oC durante 12 h. Postfijo en 1% tetróxido de osmio en tampón de fosfato de Sorensen a 4 oC durante 1 h.\nDeshidratar en serie muestras en etanol. Lavar en hexamethyldisalizane y secar al aire. A continuación, montar en un talón de microscopía electrónica de barrido con grafito coloidal. Seca, y esputo-capa con oro.\nCapture imágenes con un microscopio electrónico de barrido.\nTejido vivo: Solución de aceite Rojo-O\nAspirar con cuidado los medios de los pozos con una pipeta. A continuación, lave las muestras una vez con 500 ml de 1 pbS por poca.\nFijar muestras con 200 ml de formalina al 4% en H2O desionizado estéril a 25 oC durante 15 minutos. Aspirar formal con una pipeta, lavar las muestras dos veces con 1 x PBS (500 ol cada lavado).\nAñadir 200 s de muestras de isopropanol al 60% a 25 oC durante 5 min. Aspirar 60% isopropanol con una pipeta.\nMuestras de manchas con solución de trabajo Oil Red-O a 25oC durante 5 min. Aspirate Oil Red-O con una pipeta y luego lave las muestras 3 veces con 1pbS (500 ml cada lavado). A continuación, la imagen con un microscopio óptico.\nTejido fijo: Kit de manchas de aceite rojo-o\nMuestras de ECM-adipocitos de congelación de flash en compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y sección (5 m) en un criostato.\nColocar el portaobjetos en 85% propilenglicol en DI/H2O durante 2 min. Coloque la corredera en la mancha ORO a 60 oC durante 6 min. Coloque el lide dela estega en 85% de propilenglicol en DI/H2O durante 1 min.\nColoque la corredera en Hematoxilina modificada de La hematoxilina de aceite rojo-o kit de tinción durante 1 min. Enjuague la diapositiva dos veces con agua del grifo. Enjuague el portaobjetos dos veces con DI/H2O.\nMonte el cubreobjetos con un medio de montaje acuoso y una imagen en un microscopio.\nExtracción de ARN de ECM para qrtPCR\nNOTA: Para maximizar el rendimiento del ARN, utilice 500 mg de fragmentos de ECM sembrados con 3 x 105 preadipocitos en 100 l y diferencie como se indica anteriormente en placas de 6 pocillos en medios de diferenciación de 3 ml por poca.\nUna vez diferenciada, transfiera cada muestra individual de ECM-adipocyte a un tubo cónico de 50 ml sobre hielo utilizando fórceps estériles.\nLavar bien con 500 l de Tampón RLT. Añadir Tampón RLT a tubo cónico de 50 ml con muestra de ECM-adipocitos coincidentes.\nUsando tijeras estériles, picar finamente cada muestra de ECM-adipocyte dentro del tubo cónico de 50 ml, mientras sostiene el tubo en hielo, insertando las tijeras en el tubo cónico para picar el tejido.\nCongele y descongele completamente los tubos cónicos de -80 oC a 37 oC 3x.\nCentrífuga tubos cónicos a 500 x g y 4oC durante 10 min.\nRetire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y utilícelo para la extracción de ARN con un kit de extracción de ARN de tejido fibroso(Tabla de materiales).\nEnsayo de acumulación de glucosa\nDiferenciar 6 x 104 preadipocitos en fragmentos de ECM de 100 mg en 0,5 ml de medio de diferenciación en placas de 24 pocillos como se ha descrito anteriormente (sección 5).\nDespués de 14 días de diferenciación, retire el medio y lave los ECM-adipocitos una vez con 1x PBS. Añadir 0,5 ml/bien Medio de hambre sérica y cultivo a 37oC y 5%CO2 durante 12 h.\nRetire las células medianas y lave las células dos veces con 1 pbS. Añadir 0,5 mL/pozo 2% BSA en PBS y cultivo a 37oC y 5%co2 durante 2 h.\nLavar las células una vez con 1x PBS, añadir 0,5 ml/bien 1x PBS con o sin 200 nM de insulina e incubar a 37 oC durante 40 min.\nAspirar 1x PBS, añadir 0,5 mL/bien 1X PBS con 0,1 mM 2-desoxigen-D-glucosa, 2 ci/mL desoxi-D-glucosa, 2- [1,2-3H(N)], con o sin 200 nM de insulina, e incubar a 37 oC y 5% co2 durante 40 min. reactivos y residuos radiactivos, según lo manenten las leyes reguladoras institucionales locales.\nRetire el medio con una pipeta y lave las células 3 veces con 1 PBS. Añadir 420 sl de solución SDS al 1% en DI/H2O, y alas con pipeteo vigoroso. Incubar 25oC durante 10 min.\nRecoger 5 l de cada pocto para el ensayo de proteína Bradford. Transfiera 400 ml de lisado de célularestante restante a 2 ml de líquido centelleo en un vial de centelleo. Cuente 3actividades H-2DG en el contador de centelleo. Analizar los datos como recuentos por minuto normalizados a proteína, mg/ml.\nEnsayo de lipólisis\nDiferenciar 6 x 104 preadipocitos en fragmentos de ECM de 100 mg en 0,5 ml de medio de diferenciación humana en placas de 24 pocillos como se ha descrito anteriormente (sección 5).\nDespués de 14 días de diferenciación, retire las células medianas y lave dos veces con 1 pbS caliente. Añadir 0,5 ml de medio de inanición sérica (sin insulina) con o sin isoproterenol de 3 m, y cultivo de adipocitos a 37 oC y 5% de CO2 durante 72 h.\nRecoger los supernatantes de cultivo, que pueden almacenarse a -80 oC hasta que estén listos para el ensayo. Recopile el ECM en tubos de microcentrífuga para la cuantificación del ADN para la normalización de datos.\nPipet2 l de cada sobrenadante en una microplaca de 96 pocillos. Conservar pozos para espacios en blanco (destilados H2O) y solución estándar de glicerol proporcionada en el kit de determinación de triglicéridos.\nAñadir 270 ml de reactivo de glicerol libre del kit de determinación de triglicéridos a cada pocto, pipeta para mezclar. Incubar placa a 37oC durante 5 min.\nMida la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro de microplacas.\nCalcular la concentración de glicerol y normalizar con el ADN de ECM:\nLa preparación de ECM de tejido adiposo, la sembración con preadipocitos y la diferenciación in vitro en adipocitos maduros dan lugar a claros cambios morfológicos secuenciales en el tejido que permiten la evaluación visual del progreso a lo largo del protocolo(Figura 1) . Los preadipocitos utilizados para la semilla del ECM se aíslan mediante la digestión de la colagenasa de muestras de IVA separadas(Figura 2). La microscopía electrónica de barrido de construcciones ECM-adipocitos en cada etapa del procesamiento revela la descelularización de ECM y la posterior recapitulación de adipocitos que contienen lípidos tras la resedación y diferenciación(Figura 3). La inmunohistoquímica específica de colágeno 1 de ECM descelularizado revela el mantenimiento de la microarquitectura de colágeno, mientras que la tinción de aceite rojo-o de construcciones e-adipocitos 3D en vivo y fijos/seccionados revela adipocitos que contienen lípidos(Figura 4 A). qrtPCR de adipocitos diferenciados en ECM demuestra una marcada regulación ascendente de genes adipogénicos en relación con los preadipocitos indiferenciados cultivados en ECM(Figura 4B). El fenotipado metabólico de construcciones de ECM-adipocitos que estudian todas las combinaciones de ECM y adipocitos de sujetos diabéticos (DM) y no diabéticos (NDM) revela una absorción de glucosa deteriorada y la función liofótica en construcciones ECM-adipocitos de DM en relación con NDM tejidos, recapitulando defectos metabólicos específicos de DM que hemos informado previamente en adipocitos humanos en el cultivo 2D estándar11. Es importante destacar que NDM ECM rescata la ingesta de glucosa estimulada por insulina y la capacidad liolítica en adipocitos DM (Figura 4C)11. Juntos, estos datos demuestran la regulación específica de la enfermedad del metabolismo celular de los adipocitos por el ECM. Más detalles se informan en Baker et al.11.\nFigura 1: Flujo de trabajo para la preparación de ECM-adipocyte. Día 1: Las muestras enteras de tejido adiposo visceral se someten a tres ciclos de congelación-descongelación seguidos de incubación durante la noche con solución de digestión enzimática #1. Día 2: Después de la digestión con solución enzimática #1, las muestras se digieren durante la noche con solución de digestión enzimática #2. En este punto, las muestras serán parcialmente deslipidadas. Día 3: Después de la digestión enzimática #2, las muestras se someten a incubación durante la noche con solución de extracción de disolvente polar, que completará la deslipidación. Después del día 3, las muestras deben ser completamente deslipidadas y de color blanco/translúcido. Las muestras se lavan a fondo con solución tampón de enjuague y luego 70% de etanol y se almacenan en una solución de almacenamiento en 40 oC hasta que estén listas para volver a sellarse con preadipocitos. Día 4: Los preadipocitos se sembran en el IVA descelularizado seguido de la diferenciación adipogénica durante 14 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 2: Flujo de trabajo para el aislamiento de preadipocitos. El IVA se pica, se digiere con colagenasa, se filtra, centrifuga, y el pellet de células estromavasculares resultante salpicado y cultivado para expandir los preadipocitos. Para obtener más detalles sobre el aislamiento de preadipocitos humanos y el cultivo de adipocitos 2D, véase Baker et al.2017 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 3: Escaneo de imágenes de microscopía electrónica. Tejido adiposo intacto, tejido adiposo descelularizado y tejido adiposo descelularizado repoblado con preadipocitos y diferenciado en medios adipogénicos durante 14 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 4: Caracterización de adipocitos en ECM. (A) Tejido adiposo descelularizado ECM mantiene la microarquitectura y apoya la diferenciación de adipocitos: Top: Colágeno 1 inmunohistoquímica de IVA humano entero antes y después de la descelularización demostrando el mantenimiento de microarquitectura; medio: fotomicrografías confocales 3D de adipocitos humanos vivos dentro de ECM; IVA humano descelularizado intacto manchado con petróleo Rojo-O antes de volver a sembrar con preadipocitos, 4 días después de la sembración, y 14 días después de la sembración con preadipocitos seguidos de diferenciación adipogénica; azul: tinción DAPI de núcleos celulares; rojo: Tinción de aceite rojo-O de lípidos intracelulares; fondo: Fijación de formalina, incrustada en parafina, 5 m seccionada, IVA humano manchado de petróleo rojo-O antes de la descelularización, inmediatamente después de la descelularización, y después de la descelularización, preadipocyte-seeding, y 14 días de diferenciación adipogénica, demostrando la acumulación de lípidos citoplasma en adipocitos dentro de ECM. (B) Adipocitos en ECM regulan la expresión génica adipogénica: análisis qrtPCR comparando los niveles de transcripción genética adipogénica en ARN de adipocitos de IVA humano diferenciados en ECM IVA durante 14 días en relación con preadipocitos indiferenciados en el ECM del IVA cultivado durante 72 h en medios no adipogénicos. Los datos son medios - SEM. ACLY: ATP citrato liase, ATGL: lipasa de triglicéridos adiposo, FASN: ácido graso sintasa, PPARg: peroxisoma proliferativo activado receptor gamma; ordinado: diferencia de pliegue en el nivel de transcripción en adipocitos maduros en relación con el referente preadipcito indiferenciado-1; todas las diferencias de pliegue significativas (p<0.001, prueba t emparejada); ECM de 10 sujetos, preadipocitos/adipocitos de n-11 sujetos. (C) ECM regula el metabolismo de los adipocitos de una manera específica de DM: 3D-ECM de sujetos DM o NDM sembrados con preadipocitos de sujetos DM o NDM, diferenciados en adipocitos, y estudiados con fenotipado metabólico. Barras de datos etiquetadas con fuente de paciente (NDM, DM) de ECM y adipocitos (ECM/AD); por ejemplo, NDM/NDM denota tanto ECM como preadipocitos derivados de pacientes con NDM, mientras que NDM/DM denota ECM de pacientes con NDM combinados con preadipocitos de pacientes con DM. Los datos son medios: SEM. Ordinatos: la acumulación de glucosa (cpm), normalizada a la concentración de proteína de lisado ECM/célula (mg/ml); lipólisis: concentración de glicerol sobrenadante de cultivo (mg/ml) normalizado a ECM/concentración de ADN lisado celular (ng/mL); *p<0.050, **p<0.100 comparando el punto de datos indicado con el punto de datos correspondiente (basal o insulin-estimulado para la captación de glucosa, basal o isoproterenol estimulado para la lipólisis) en el brazo DM/DM, utilizando el análisis de modelos mixtos medidas; ECM de n-9 NDM, 8 sujetos DM, preadipocitos de 10 NDM, 9 SUJETOs DM para la ingesta de glucosa; ECM de 6 NDM, 6 sujetos DM, preadipocitos de 6 NDM, 6 sujetos DM para lipólisis. Esta figura ha sido adaptada de O'Rourke y Lumeng11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nEl modelo de cultivo de ECM-adipocitos proporciona una herramienta valiosa para disección de las funciones individuales de ECM y células en dictar fenotipo de tejido final. El protocolo de aislamiento ECM es bastante reproducible, pero se puede observar la variabilidad en el proceso de descelularización. El paso de deslipidación del Día 3 es un punto crítico en el protocolo. Al finalizar la extracción durante la noche, la solución de disolvente polar debe evidenciar la deslipidación de la matriz que se vuelve amarilla, mientras que la matriz debe pasar de un color amarillo-naranja característico del tejido adiposo intacto a translúcido/ blanco (Figura 1). Si estos cambios de color no se producen, es probable que la deslipidación no se complete. La variabilidad entre pacientes en la eficiencia de la deslipidación es común, pero hasta la fecha no hemos observado ninguna correlación de eficiencia de delipidación con el estado de DM del sujeto, edad, IMC u otras variables clínicas. Las muestras grandes (superiores a 20 g) no sufrirán una delipidación eficiente; el procesamiento de muestras <20 g puede prevenir este problema. Si una muestra no aparece completamente deslipidada después del día 3, divida la muestra por la mitad con tijeras estériles, luego transfiera las muestras a 15-20 ml de solución de extracción de disolvente polar y colóquela en un agitador orbital durante 3-5 h. Es posible que algunas muestras no se descelularcen completamente después de repetir el paso de extracción del disolvente polar. Si la mayoría de la muestra está descelularizada, es posible cortar las secciones que contienen lípidos antes de usar la muestra en experimentos.\nLa contaminación puede ocurrir si la esterilidad no se mantiene diligentemente durante todo el proceso. Todo el trabajo debe realizarse en una campana de flujo laminar utilizando precauciones de cultivo celular estándar. Normalmente almacenamos ECM hasta 3 meses a 4 oC, y preadipocitos hasta 6 meses en nitrógeno líquido. No se ha probado la retención de la biofuncionalidad y las propiedades específicas de enfermedades y depósitos más allá de este tiempo.\nLa microscopía confocal permite la visualización de adipocitos maduros dentro del ECM, que pueden mejorarse con la tinción de aceite rojo-o. La microscopía electrónica de barrido (SEM) también proporciona un método no cuantitativo para visualizar adipocitos dentro de ECM. Cabe destacar que la tinción SEM y Oil Red-O sugieren adipocitos unioculares en las construcciones ECM-adipocitos, una morfología similar a los adipocitos in vivo y en contraste con los típicos adipocitos multiloculares observados cuando los preadipocitos se someten a adipogénicos diferenciación en plástico 2D(Figura 3, Figura 4A). Esta observación sugiere que el ECM proporciona un entorno más fisiológico para la diferenciación adipogénica que el cultivo de tejido estándar en plástico. La fijación y seccionamiento de construcciones ECM-adipocitos puede ser difícil, ya que las construcciones incrustadas en OCT son frágiles y no se seccionan fácilmente. Seccionar los tejidos incrustados inmediatamente después de la extracción del almacenamiento del congelador de -80 oC y realizar la sección en una cámara frigorífica (4 oC) en un criostato preenfriado hace factible el seccionamiento.\nEl cultivo eCM-adipocitos proporciona un entorno fisiológico que se aproxima al entorno del tejido adiposo in vivo y proporciona un entorno sostenible para el crecimiento y la diferenciación de células madre de preadipocitos, como lo demuestra la regulación ascendente de genes adipogénicos en el cultivo 3D-ECM-adipocyte. Cultivos de ECM-adipocitos también participan en funciones metabólicas de adipocitos, incluyendo la captación de glucosa y lipólisis8. Reportamos la ingesta de glucosa como cpm normalizada a la proteína total extraída de cultivos ECM-adipocitos medidos con un ensayo de Bradford, o al contenido de ADN medido con un kit de ensayo de ADN, y hemos observado resultados similares con ambos métodos. Del mismo modo, informamos de lipólisis como mg/ml de liberación de glicerol normalizado a proteína o ADN, también con resultados similares obtenidos con cualquiera de los métodos de normalización. Otros sugieren normalizar los datos metabólicos de adipocitos al contenido de lípidos, pero hasta la fecha nuestros intentos de extraer lípidos de forma fiable de las construcciones de ECM no ha tenido éxito. Notificar la tasa de acumulación de glucosa como lunares de glucosa por unidad de tiempo y lipólisis como lunares de glicerol/ácido graso libre por unidad de tiempo puede permitir comparaciones más precisas entre experimentos separados. El aislamiento del ARN de ECM para el análisis qrtPCR se caracteriza por rendimientos más bajos en comparación con las células en el cultivo 2D, pero la preparación de fragmentos de ECM más grandes sembrados con más células supera este problema, como se describe en el paso 8.3.1. Hemos encontrado dificultades para aislar cantidades adecuadas de proteína no degradada con fosfomeaeyas intactas para el análisis de manchas occidentales, lo que representa una limitación del modelo.\nSe ha publicado previamente una metodología similar para aislar la ECM del tejido adiposo y la sembración con preadipocitos, con pruebas que sugieren que la ECM puede promover la diferenciación adipogénica a falta de mediadores adipogénicos clásicos, incluidos los agonistas del juego, insulina, y agonistas PPAR-o12,14. Nuestros datos son los primeros en demostrar la regulación específica de la enfermedad del metabolismo celular por ECM en el tejido adiposo, utilizando métodos en los que se estimulan los adipocitos con factores de diferenciación adipogénicos clásicos11; estudios similares en ausencia de estímulos adipogénicos son un objetivo de futuras investigaciones. Otros han demostrado similares dilatorios de células ECM específicas de la enfermedad utilizando ECM y células aisladas del tejido pulmonar19,20. También se han empleado estrategias alternativas, incluida la creación de matrices mediante la mezcla de preparaciones de ECM de tejido adiposo homogeneizado en hidrogeles peptídrico12.\nSi bien la variabilidad entre pacientes en el metabolismo celular de los adipocitos humanos se observa tanto en el cultivo de plástico 2D como en el cultivo 3D-ECM, cuando se analizan en conjunto, estas células manifiestan diferencias de enfermedad, depósito y sexo en el metabolismo celular, como se describe por nuestro grupo y otros11,21,22,23,24, validar la utilidad y generalización de estos modelos de cultivo para el estudio del metabolismo celular de los adipocitos. Hemos demostrado que los adipocitos diferenciados en ECM (es decir, adipocitos NDM en NDM ECM, adipocitos DM en DM ECM) recapitulan fenotipos metabólicos de adipocitos NDM y DM aislados en el cultivo 2D estándar, apoyando el cultivo de ECM-adipocitos como un modelo para estudiar alteraciones específicas de la enfermedad en el metabolismo celular de los adipocitos en un entorno más fisiológico. No hemos observado diferencias en la magnitud o dirección de las funciones metabólicas, incluyendo la ingesta de glucosa o lipólisis, cuando se estudian ECM y adipocitos de los mismos o diferentes donantes. En cualquier caso, ECM-adipocyte construye fenotipo metabólico específico de DM manifiesto (por ejemplo, disminución de GU en DM/DM en relación con construcciones NDM/NDM), sin diferencia clara al comparar construcciones compuestas por ECM y adipocitos de los mismos donantes o diferentes .\nEl cultivo eCM-adipocitos permite el estudio de combinaciones de ECM y preadipocitos de distintas poblaciones de pacientes y depósitos de tejidos, permitiendo el análisis de las contribuciones específicas de la enfermedad y del depósito de ECM y adipocitos al tejido adiposo definitivo metabólico Fenotipo. Demostrando esta fuerza del modelo de cultivo ECM-adipocitos, hemos demostrado que ECM del tejido NDM tiene la capacidad de rescatar defectos metabólicos en adipocitos DM(Figura 4C)11. Los datos preliminares en tejidos adiposos viscerales y subcutáneos murinos sugieren que la ECM murina regula el metabolismo de los adipocitos murinos de manera similar de manera específica del depósito (datos no publicados, O'Rourke RW, 2019), lo que sugiere que este sistema modelo puede ser utilizado para estudiar ECM-adipocyte habla cruzada tanto en sistemas murinos como humanos. Además, este modelo permite el estudio de la manipulación aislada de ECM como un medio para regular el fenotipo de tejido adiposo. El estudio preliminar de ECM tratado en condiciones que inducen glicación dirigida específicamente al ECM, por ejemplo, sugiere que estas modificaciones regulan el fenotipo metabólico celular de las células posteriormente sembradas en ECM tratadas (datos no publicados, O'Rourke RW, 2019), proporcionando un modelo para el estudio de los efectos de la manipulación dirigida del ECM en el fenotipo de adipocitos.\nLos autores no declaran intereses contradictorios.\nAgradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa y Retha Geiss por su ayuda en la coordinación del estudio. SeM fue realizado por University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este proyecto fue apoyado por niH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) Administración de Veteranos VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopía electrónica de escaneo realizada por la Universidad de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La Figura 4 de este manuscrito fue publicada originalmente en Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, y ha sido reproducido con permiso de Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Para obtener permiso para reutilizar este material, visite http://global.oup.com/academic/rights.


Coronavirus Sevilla: Diecisiete fallecidos ennegrecen un récord de casi 700 altas en un día\nSube el número de nuevos contagios, pero hay 40 hospitalizados menos que el martes\nSalud notifica tres fallecidos y 26 positivos en dos nuevos brotes en residencias de Dos Hermanas\nUn enfermo es atendido en la UCI. / EFE\nCristina Valdivieso 18 Noviembre, 2020 - 15:52h\nLa progresión de la pandemia en la provincia sigue sin permitir ser entusiasta. Aunque los positivos siguen estables, por debajo del millar de casos alcanzados casi diariamente durante las ultimas dos semanas, las últimas horas dejan un importante repunte. Este miércoles se han confirmado con pruebas PDIA (PCR y test de antígenos) la infección en otras 693 personas, mientras que en la jornada anterior fueron 476. Aún así, y en medio de esta montaña rusa en la que se ha convertido la evolución de la pandemia, siguen estando por debajo del número de nuevas altas registradas que ha alcanzado su cifra más alta en esta segunda oleada con 798 en apenas un día. Sin embargo, una cifra de récord que se ha visto ennegrecida por los 17 fallecidos que también notificados este miércoles.\nRemata esta desequilibrante radiografía epidemiológica en la provincia la situación en los hospitales, donde las últimas 24 horas sí han permitido una importante reducción del número de personas ingresadas. En el parte hecho público este miércoles, la Junta de Andalucía cifra en 765 los enfermos atendidos en los complejos sanitarios de la provincia, una reducción muy importante respecto a la jornada previa cuando eran 805. Este número es el más bajo desde el pasado 1 de noviembre, cuando se contabilizaron 734 personas encamadas en Sevilla. Después la presión asistencial empezó a crecer hasta alcanzarse los 890 enfermos hospitalizados sólo 11 días después para después volver a bajar, pese al leve repunte experimentado el martes. Se mantiene alto, no obstante, el número de enfermos atendidos en la UCI, que sigue por encima de los 120 casos (124).\nLos valores acumulados desde marzo en la provincia ascienden este miércoles a 50.192 afectados (49.293 detectados por pruebas PDIA), de los que 17.288 han superado la enfermedad mientras que otros 736 han fallecido. Por los hospitales sevillanos han pasado 4.078 personas contagiadas de las que 336 han necesitado ingresar en la UCI.\nTres ancianos fallecidos en dos nuevos brotes en Dos Hermanas\nLa provincia registra dos nuevos brotes de coronavirus en centros de personas mayores al confirmarse este miércoles 13 positivos en la residencia Los Arcos de Dos Hermanas, que registra tres fallecidos como consecuencia del Covid, y otros 13 casos en el asilo San Rafael, también en el municipio nazareno.


CENTRO ESPAÑOL: Empate agónico\nEl elenco dirigido por Juan Lopetegui igualó 1-1 ante Deportivo Paraguayo y así sumó el tercer partido sin alegrías. Cristian Arín convirtió el único tanto del Gallego.\nCentro Español enfrentaba como local al elenco Guaraní con la premisa de obtener un triunfo que le permita mantener la ilusión de seguir peleando por salir de la zona roja de los promedios. Si bien comenzó perdiendo, logró igualarlo a tres minutos del final para el desahogo del banco Gallego.\nEn un choque de trámite cambiante Deportivo Paraguayo abrió la cuenta en la etapa complementaria por intermedio de Víctor López. Ese tanto le brindó tranquilidad a la visita para manejar los hilos del encuentro, aunque Centro Español jamás se resignó y buscó la igualdad hasta el cierre.\nY justamente a tres minutos del final, el mediocampista Cristian Arín estampó el 1-1 para desatar la euforia del conjunto local por el punto cosechado ante un rival que ya se encuentra más aliviado en los promedios.\nDe este modo, los dirigidos por Juan Lopetegui sumaron el tercer triunfo sin conocer la victoria producto de un empate y dos caídas, aunque la posibilidad de encontrarse con el triunfo estará bien latente en la próxima jornada cuando visite a Yupanqui.\nEl Lobo derrotó al campeón en su casa y escaló aún más en la tabla. Le ganó agónicamente a Victoriano Arenas y quedó quinto en el escalafón del certamen de la Primera D.\nEl Marrón visitará a Deportivo Paraguayo con la misión de sellar su pase al Reducido. Lo logrará si suma al menos un punto. El Rata Rodríguez realizará cambios.\nEl Monarca perdió 3-2 con Muñiz en el Carlos Barraza, dejó atrás una racha positiva de seis partidos y aún deberá esperar una semana más para salvarse de la desafiliación.\nVisita al campeón\nEl Lobo Rojo se enfrentará ante Victoriano Arenas, que ya ascendió a la C, en Valentín Alsina. Los de San Miguel intentarán subir en la tabla para terminar lo más arriba posi\nDespués de ocho partidos sin ganar, el Rayo Rojo volvió a sumar de a tres: fue como local ante Real Pilar, para abandonar momentáneamente la última posición de la tabla.\nEste sábado el Monarca enfrentará a Muñiz en el estadio Carlos Barraza, aunque esta vez será en condición de visitante. Rodolfo De Paoli repetiría el equipo.\nEl conjunto Gallego derrotó 1-0 a Deportivo Paraguayo, cosechó la cuarta victoria en fila y sigue derecho en el torneo. El único tanto lo convirtió Matías Nodar sobre el epílo\nEl Gallego, que consiguió sus dos objetivos primordiales, recibirá este domingo a Paraguayo con la idea de seguir por la senda positiva. La dupla no confirmó el equipo.\nEl conjunto Gallego derrotó 2-0 a Yupanqui y cosechó objetivos por partida doble: se aseguró la permanencia y el Reducido. Pablo Ocampo convirtió ambos tantos.\nEl elenco Gallego buscará asegurar su permanencia cuando visite este martes a Yupanqui. La dupla técnica realizará una sola modificación en el equipo.\n1 ARGENTINO (ROSARIO)\nRobo e indignación\n2 VICTORIANO ARENAS\n“Es el premio al trabajo del día a día”\n3 REAL PILAR FC\n4 GRAL. LAMADRID\nUna buena remontada\nCon dos modificaciones\n6 REAL PILAR FC\n7 CTRAL. BALLESTER\n9 JUVENTUD UNIDA


Trenes Santa María de Alameda Ordizia baratos, billetes desde 25,70 € - Trenes.com\nTrenes Santa María de Alameda Ordizia\nTren Santa María de Alameda Ordizia\nDirigirse a otra localidad es saludable, y llevarlo a cabo reservando nuestras plazas de tren Santa María de Alameda - Ordizia, es inteligente. Haz más especiales tus viajes a Ordizia gastando menos dinero, con los viajes en el tren de Santa María de Alameda a Ordizia más baratos que hemos encontrado para uso y disfrute de nuestros usuarios. Por ser un medio de transporte romántico, evocador de recuerdos, y el más ecológico de los transportes por carretera, además de contar con las más cómodas plazas de tren Santa María de Alameda Ordizia, los viajes en tren han retomado desde hace ya tiempo su posición como reyes del transporte público, especialmente cuando buscamos tener un viaje especial y que nos asegure unos tiempos de llegada y salida puntuales. 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Normalmente el promedio de la duración del viaje es de 6 horas 16 minutos, no suele haber mucha diferencia horaria entre trenes, dependerá de las paradas que tenga que hacer en otras estaciones.\n¿A qué velocidad viajan los trenes de Santa María de Alameda a Ordizia?\nLos trenes que van de Santa María de Alameda a Ordizia viajan a una velocidad media de 52.0 km/h, aunque en algunos momentos pueden llegar a velocidades máximas muy superiores.\n¿Cuándo sale el primer tren de Santa María de Alameda a Ordizia?\nNormalmente, el primer tren sale de Santa María de Alameda a las 13:17 h y llega a Ordizia a las 19:33 h. Es posible que el horario del primer tren cambie si se trata de días festivos o fines de semana.\n¿Qué precio tienen los trenes de Santa María de Alameda a Ordizia?\nLos precios de los trenes de Santa María de Alameda a Ordizia pueden variar mucho, desde 25,70 € hasta los 25,70 €. Lo más importante, si busca el billete más barato, es que lo compre con la máxima antelación posible, así conseguirá las mejores ofertas y precios. El precio también cambia dependiendo de la tarifa o la clase y horario que usted elija.\n¿Existe tren directo de Santa María de Alameda a Ordizia o tendré que hacer transbordo?\nHay trenes directos de Santa María de Alameda a Ordizia, por lo que, normalmente, no necesitará hacer transbordo en el viaje. Puede ir de Santa María de Alameda a Ordizia en tren directamente sin bajar del tren ni cambiar de estación.\n¿Puedo cambiar o anular mis billetes de tren de Santa María de Alameda a Ordizia?\n¿Qué distancia recorre el tren de Santa María de Alameda a Ordizia?\nLos trenes que viajan de Santa María de Alameda a Ordizia cubren una distancia de aproximadamente 326 Km y la media de la duración del viaje en tren es de 6 horas 16 minutos.\n¿Cuándo sale el último tren de Santa María de Alameda a Ordizia?\nNormalmente, el último tren que se puede coger sale de Santa María de Alameda a las 13:17 h y llega a Ordizia a las 19:33 h. Es posible que el horario del último tren cambie si se trata de días festivos o fines de semana.


Crítico en Serie: El ladrillo-móvil de Cordelia y la Lisbeth Salander del Sunnydale\nEl ladrillo-móvil de Cordelia y la Lisbeth Salander del Sunnydale\nEn una de las típicas noches de bailoteo en el Bronze, Cordelia se sacó un móvil del bolso para hacer una llamada. Era alrededor de 1997, ya que era la primera temporada de Buffy la Cazavampiros, y el aparato iba a conjunto con los tiempos: en lugar de un teléfono parecía un walkie-talkie y estéticamente era como un ladrillo de color negro que debía pesar lo suyo. Pero supongo que los guionistas se dieron cuenta que el uso del móvil aún no estaba tan instaurado y que les salía más a cuenta hacer desaparecer ese utensilio que habría avisado a Buffy y salvado a Cordelia de demasiados apuros. Así que ella hizo la llamada, se metió otra vez el móvil en el bolso y veinte episodios después aún no lo he vuelto a ver.\nLa tecnología en las series de televisión es ese as escondido en la manga que tanto sirve para un roto como un descosido, además de ser un portal para observar la evolución de la sociedad en cuánto a sus costumbres tecnológicas. Así, mientras que en los inicios de Buffy desaparecen los móviles por conveniencia, actualmente no se puede obviar este aspecto y más en una ficción juvenil. Ahora, por ejemplo, si los escritores de Supernatural necesitan que los hermanos Winchester queden incomunicados, es tan fácil como argumentar que se han quedado sin cobertura (algo por otra parte comprensible, a tenor de los lugares en los que siempre se hallan: sótanos, bosques aislados y casas derruidas). Tengo curiosidad por ver cuando se introducirá el móvil en las tramas de Buffy en un papel fijo y cómo van cambiando los modelos, a la vez que la señorita Summers adecua su look.\nPero si algún avance tecnológico ha influenciado en la sociedad juvenil en las últimas décadas ha sido el ordenador. Y con Buffy también se puede comprobar cómo ha cambiado su rol. Willow, la rata de biblioteca con problemas de socialización, domina las artes de la informática, mientras que Cordelia, la cheerleader guay, no sabe ni tan siquiera cómo mandar un e-mail (“you have to press ‘deliver’”, le cuela Willow para que así pulse ‘delete’). Una situación increíble hoy en día, cuando se ganan puntos por tener facebook, blog y myspace, aunque los chats con desconocidos hayan perdido fuelle. En esto Willow seguiría siendo una pringada: su cita con un demonio informático demostró las carencias que tenía en algunos aspectos.\nSu maña con los ordenadores, asimismo, también es hija de los tiempos que corrían. Al ser aún unos medio desconocidos y gracias al tono desenfadado de la serie, Joss Whedon se pudo permitir el lujo de resolver unos cuantos pasos de las investigaciones lideradas por Giles con las aptitudes de Willow, algo que ahora salta a la vista. Y es que si Lisbeth Salander ha enseñado algo es que, por buena que sea, se necesita unas herramientas y un tiempo para lograr los objetivos. Y es bastante improbable que la niña buena y empollona del instituto, con un ordenador cualquiera de la biblioteca, lograra navegar por los archivos confidenciales del ayuntamiento de su pueblo. Claro que con el tiempo la maestría de Willow ha palidecido al lado del personaje de Elena Furiase en El Internado (del cual no recuerdo su nombre de tan decorativo que es). Esta chica si que logra milagros con el teclado sin parpadear y con las (mejores) peores frases de la serie ambientada en el acartonado Laguna Negra. Un ejemplo aproximado de lo que es capaz de hacer (y decir) de golpe (y no es su mítico “a mí esto me da muy mal rollo”):\n“¿Qué os pensáis, que puedo introducirme en la página web con contraseña encriptada de esta empresa farmacéutica que experimenta con niños, así como así? (Yon González se la mira casi con cachondeo) Bueno, aunque ahora que lo pienso, puedo hacer una página espejo (así, tal cual) y mandar allí los usuarios (suerte que era a prueba de balas) y así poder ver qué contraseña usan. Dejadme un momento... (la hija de Lolita casi logra fruncir las cejas en señal de concentración y teclea sin parar)¡Ya lo tengo!”\n... y lo que Lisbeth Salander hubiera tardado una tarde en conseguir, la Lolita Jr lo hace en dos minutos con el Toshiba de la habitación. Pero ya me estoy yendo por las ramas que aquí había venido a hablar de Buffy...\nEscrito por Crítico en Serie a las 12:19\nClasificado por: Buffy la Cazavampiros, El Internado, Supernatural\nQue grande! Lo de las patilladas informáticas me fascina. Esos que teclean cinco segundos frenéticamente y construyen una web. Que vengan a trabajar para mí, esos cabrones!!!!\nSi quieres ver la evolución de los teléfonos móviles en una serie de televisión, tienes que verte Expediente X, en la que a lo largo de sus nueve años pasan del zapatófono a teléfonos mucho más pequeños y manejables.\nPues Elena Furiase deja a Mac, la hacker de cabecera de Verónica Mars, a la altura del betún. ¿También se inventará ella un test de pureza? ;)\nSiempre que se habla de zapatófonos ahora en lugar de acordarme de Mortadelo, me acuerdo de los modelos ladrillo de móviles que llevaba Mulder, en los primeros Expedientes X.\nAl menos en TBBT son coherentes, todos tienen myspace, facebook, juegan en línea, chatean, tienen wifi etc... todo acorde con estos tiempos. Willow hasta usaba la magia con el ordenador, que tiempos aquellos\nAixa Sanuy: dijo...\njajaja a mi esto me da muy mal rollo! molt bo! ...a l igual qe "l'altre noia" qe no fa més qe posar cara de susto (cara rara per cert...obre els ulls i es qeda agust). A mi l'altre dia em va sorprendre Ana Celia de Armas dient a la tv: no me importaría ir a holliwood el año qe viene....ola? te molt autoestima aqesta noia ¿no? :S\nPer cert pere: acabo d'estrenar blog: http://thecoolfinder.blogspot.com/\nNi lo volverás a ver xD\nLa verdad que no recuerdo muy bien la evolución tecnológica de Buffy... pero si la estilística. Siempre echaré de menos ese estilo serie B de la primera temporada. Entrañable donde lo haya.\nA pesar de todo me siguen pareciendo más creíbles los superconjuros de Willow que la coña de la Furiase destripando servidores.\nJajaja, lo del internado con la informática es de risa es cierto.\nEn Buffy todo lo utilizaban un poco libremente y la tecnología no iba a ser menos.\njejeje tienes razón, al final has hablado de tecnologia en las series, jop, me ha alegrado saber que tb seguias buffy, es de las series que más me ha enganchado e influenciado, cuando canal + la emitía ahora por verano, qué recuerdos, tio!\nasi que espero que pronto hagas un post monotematico sobre esta gran serie, porfa!\nsin duda la influencia de la tecnologia en las series actuales es muy maracasa. Imaginate a los chicos de Gossip Girl sin sus telefonos celulares.\nCuanta verdad tecnológica hay en este post xD\nEntre mi círculo de teleadictos llamamos a la furiase en El Internado "La finder". La verdad es que ya es una parodia de sí misma. Los guionistas son conscientes de lo absurdo que es y ya que estan, qué más da! From the lost to the river. Yo lo comparto... que hagan cosas cada vez más locas, que así me río.\nEn la tercera temporada de Buffy un personaje que se toma muy en serio lo de cazar vampiros dice: "sincronicemos los relojes". willow y buffy se miran extrañadas y enseñan sus muñecas desnudas.\nme pareció un guiño muy bueno a la relación con la tecnología de la serie.\nah y no busques evolución estilística,,, la ropa de Buffy es igual de hortera con el paso de los años.\nAsesino , ya veo que vas por la cuarta temporada del Internado, je, je, pues nada a disfrutar , yo particularmente de Ivan, Julia, Fermin, Maria, Hector , Jacinta y el gran Noiret del resto paso .\nLo de disfrutar lo digo porque despues de ver la quinta la cuarta le da cuarenta patadas , en la quinta hay un primer capitulo bestial , seis que son basura, uno medianamente bueno y un final espectacular perooooooo con trampas como el final de la cuarta.\nY si lo de la finder o "salero" que tambien la llaman asi , es de juzgado de guardia , vamos que no se como no la ha contratado Microsoft y la han sacado de ahí.\nCon el ordenador hay momentos realemente delirantes , ahora que con lo zopencos que son el resto también se agradece que la chica sea un poco más listilla y tenga dos dedos de frente , sepa donde esta el enter al menos , je, ej\nBueno una petición alguna serie cortita para ver este verano , sin pretensiones sólo para reirme un ratin\nPatricia, si quieres una serie para este verano con la que pasar un buen rato... te recomiendo MEN IN TREES con Anne Heche. Ya terminó y es sobre una 'relationship coach' neoyorkina que se va a vivir a un pueblecito de Alaska de 243 habitantes. La he empezado este verano y es con la que mejor me lo paso. Es light, pero perfecta. Ah, y para reírte (y aunque el piloto no convenza) está GREEK. Es muy básica y es sobre hermandades universitarias, pero a mí me parece muy conseguida (es típica, pero aprovecha muy bien todos los elementos). Yo es que, por gafapastadas que mire, soy fan de los productos de simple y llano entretenimiento.\nAllegra, aún voy por la segunda temporada de Buffy. Pero al hablar de conjuros informáticos, tengo muy claro que me queda mucho por ver ;)\nÁngel, tengo muchas ganas de ver esa escena. Lo bueno que tiene Buffy es que no se toma en serio. Por este simple motivo, no aguanto Dollhouse y en cambio disfruto de Buffy (además de que Dollhouse es muy mala e incluso aburrida). Otro día me tocará hablar de ambas.\nÁngel ¿Que no hay evolución estilística? Hemos visto dos Buffys distintas xD\nCrítico en serie... lo que te queda por ver no te lo imaginas, yo he visto la serie unas... no sé... doscientas veces, y aún así hay cosas q me siguen dejando O_O (ni para bien ni para mal... simplemente pienso q Joss Wheddon utiliza su cerebro de forma diferente al del resto de los humanos). Creo q podría estar hablando de las 4 últimas temporadas de Buffy durante meses, y no llegar a ninguna conclusión. Eso sí, como las 3 primeras, para mí, no hay otra serie mejor de tipo sobrenatural (reconozco que con Buffy jamás podré ser objetiva y a pesar de lo cachondos que están los hermanos Winchester xD). Lo dejo aquí y esperaré ansiosa tu post sobre Buffy y Dollhouse (dios mío, Dollhouse... uffff madre xD ¡¡¡renovada!!! ¿Alguien se lo cree?).\nAllegra: por supuesto que Buffy es hortera antes, durante y despues...\nlos modelitos de la fith season finale por ejemplo: chaqueta y pantalones de cuero mezclado con camiseta básica blanca de punto, y luego el pantalón de pata de elefante! o ese final de serie con una chaqueta de ante... como diría la Cuore: ARGH!\nmuy mona, eso sí, en el final de la sexta.\nHombre, yo te reconozco que los pantalones pesqueros acampanados con botas/botines de tacón merecían un puñado de AAAARGs (y tenía mucha costumbre de llevarlos así). Obviamente Wheddon de moda sabe bien poco... pero el cambio de las minifaldas y los tops ombligueros a la ropa más básica y más normal es evidente (así como el maquillaje, el pelo, la nariz (ejem)... me hacen deducir un aumento de presupuesto en este campo). Aunque me refería a todos los de la serie en general, más que a ella en particular. Para mí el cambio grande está de la segunda a la tercera temporada para unos y de la tercera a la cuarta para otros.


Tipos de liposucción o lipoescultura: ¿Cuál es mejor?\n¿Qué tipo de liposucción o lipoescultura es mejor?\nEn la actualidad existen cuatro tipos diferentes de liposucción posibles: la liposucción tumescente y sus variantes como Aqualipo o Body-Jet, la técnica súper-húmeda en la que el volumen de anestesia local es la mitad del utilizado en la tumescente, la liposucción asistida por ultrasonidos o Váser y la liposucción asistida por láser.\nCánulas empleadas en la liposucción-lipoescultura\nFue la pionera de la técnica, comenzó a desarrollarse en París por los años 70 del siglo pasado y supuso el arranque de la técnica y el descubrimiento de las posibilidades que ofrecía.\nPero presentaba muchos problemas, ya que entonces las cánulas que se idearon eran de gran calibre, median un centímetro más o menos de grosor, lo que provocaba hoyos y depresiones cutáneas en los resultados postoperatorios.\nTampoco se infiltraban los tejidos con líquido vasoconstrictor como ahora, por lo que al poco de empezar la liposucción el sangrado distorsionaba tanto los tejidos, que era muy difícil realizar un cálculo adecuado de la grasa a extraer.\nTambién este sangrado limitaba mucho la liposucción que se podía realizar por no exanguinar al paciente.\nEs la fórmula que usamos en la actualidad; consiste en la infiltración previamente a la liposucción en todos los tejidos de una mezcla anestésica y vasoconstrictora.\nNosotros usamos la solución de Klein que está formada por:\nAspiración de la grasa medicante la cánula\nSolución de Klein:\n1000 cc de Ringer Lactato.\nLidocaína 10 cc al 2%.\n75cc de Bicarbonato 1/6 molar.\nEsta solución se infiltra a temperatura más baja de la ambiente procurando que el frío ayude en la vasoconstricción.\nHay que ser muy precavido en no inducir una hipotermia al paciente, aunque sea leve, ya que luego tienen cierto disconfort por la sensación de frío y los escalofríos.\nCon esta solución infiltramos a una proporción de 1:1 la zona que deseemos aspirar.\nSi en una zona hemos calculado que hay un exceso de unos 400 cc de grasa, para extraerla deberemos usar más o menos la misma cantidad de líquido anestésico.\nEsto a veces no es fácil, y varía mucho en función de la experiencia del cirujano.\nUna vez realizada la infiltración, procedemos mediante cánulas a extraer la grasa de la zona que deseemos.\nEste proceso debe de realizarse siguiendo un orden muy meticuloso pera crear un enrejado tridimensional que permita que la extracción de grasa se realice de un manera uniforme.\nComenzaremos por cánulas de calibre moderado, de 4 mm de diámetro en la capa profunda, a través de no menos de dos puntos de entrada cuyas trayectorias se crucen en aproximadamente unos 90 grados.\nA medida que nos acerquemos a la piel usaremos cánulas más finas, de 3 mm de diámetro e incluso de 2 mm en zonas más delicadas o que busquemos una mayor retracción cicatricial, como las zonas de la papada o el cuello.\nDurante todo el proceso, colocando la mano contraria plana sobre la zona que lipoaspiramos, realizamos un control meticuloso de la trayectoria y de la profundidad de la punta de la misma.\nPeriódicamente deberemos interrumpir la aspiración para realizar lo que conocemos por su término en ingles como un “pinch test” que consiste en pellizcar para ver el grosor de la capa de grasa que vamos dejando.\nUna vez obtenido el resultado deseado, suturamos con monofilamento de cinco ceros los puntos de entrada, con el fin de obtener una cicatriz óptima(la mayor parte de de las veces invisible) y colocamos la faja o la prenda de liposucción que hayamos diseñado.\nLiposucción Body-Jet: chorro de agua o hidroliposucción\nBásicamente es un aparato que despide un chorro de agua a presión al final de una cánula, este chorro se encargaría de ir disgregando el tejido graso, y en una maniobra posterior un aparato de succión, eliminaría agua y células grasas.\nEste método, que no ha tenido demasiada aceptación entre la comunidad médica, presenta como posible ventaja que esta forma de extracción de grasa resultaría menos traumática para las células extraídas, lo que permitiría su uso posterior para injertarlas como material de relleno.\nAdemás presenta como ventajas adicionales menos sangrado y menor tiempo de recuperación para el paciente.\nFoto: http://aestheticmt.com/cannulas.htm Liposucción láser: el lipoláser\nCon las modernas técnicas de fibra óptica, es posible hacer que un láser circule por dentro de una cánula muy fina de fibra óptica y al introducirla en el organismo y activarla, va destruyendo las células grasas.\n¿Cómo sabemos que quemamos la grasa y no todo lo demás que hay dentro de nuestro organismo?\nEl láser tiene una forma muy particular de actuar, según la frecuencia de su longitud de onda, atraviesa algunas moléculas como si fueran transparentes y calienta otras, que son la “diana” específica de cada láser.\nAsí el láser de CO2 (anhídrido carbónico) pulveriza las células epidérmicas sin diferencias, hay otros láseres con longitud de onda diferente que hace que su objetivo sean las manchas de la piel o los tatuajes, otros sólo calientan, y por lo tanto destruyen las moléculas de hemoglobina, lo que será útil para eliminar estructuras muy vascularizadas como los angiomas…y así un largo etc.\nEl lipoláser es un láser que tiene una longitud de onda que destruye las sustancias que tiene la misma refractariedad que la grasa.\nEs decir, aunque parezca un milagro, tiene la capacidad de calentar y destruir sólo la grasa, dejando intactos vasos sanguíneos y nervios u otras estructuras de nuestro interior.\n¿Esto es así de exacto?\nBueno, si haces caso de las casas comerciales sí.\nLa realidad es que hay que manejarlo con muchísima precaución debido a que muchas estructuras como los nervios, también tienen grasa en sus paredes, pues forma parte de la composición natural de ellas y por lo tanto este tipo de láser podrá dañarlas.\nAdemás por proximidad, el calor que irradia en el interior hace que las estructuras vecinas a la grasa se calienten de igual manera, por lo que, por proximidad, podremos dañarlas.\nPor lo tanto el uso de estos láseres requiere mucha experiencia y un control exhaustivo de la energía que programamos en cada cuadrante, junto a una técnica meticulosa de pasadas uniformes y bien programadas previamente.\nUna vez hemos realizado la pasada de láser en el interior de la zona que tenemos que tratar, hemos de proceder a la retirada de la grasa licuada mediante una liposucción convencional.\n¿Qué beneficios aporta el laser en la técnica de la liposucción?\nNosotros pensamos que no tantos como las casas comerciales pretenden hacernos creer.\nNo existe ningún estudio que corrobore que la recuperación de estos pacientes sea mejor que la de la liposucción tumescente con cánula fina.\nNi la recuperación mas precoz. Es más, en algunas circunstancias pensamos que el daño que podemos ocasionar en estructuras muy valiosas como los nervios sensitivos superficiales, debería contraindicar su uso.\nAsí nosotros somos firmes defensores de la liposucción láser, en aquellas zonas como el abdomen en mujeres post parto con cierta flacidez que no deseen otro tipo de cirugía.\nAl mismo tiempo en las papadas podemos ver cierta modificación del contorno, aunque aquí la piel tan fina puede causar quemaduras que acaben externalizándose, y aunque nunca nos ha pasado están en la literatura científica.\n¿Cuál es el fundamento en el que se basan los lipoláseres?\nSe piensa que el calentamiento próximo a la dermis profunda, generaría una reacción inflamatoria que generaría la síntesis de colágeno en forma de cicatriz, de la misma manera que las quemaduras de la piel generan amplias cicatrices muy ricas en colágeno.\nLos defensores de la liposucción convencional argumentan que las cánulas finas que usan, al perforar la dermis en todas las direcciones, generan una cantidad de colágeno aún mayor, y lo que es mas útil, ordenado en el espacio en la dirección que el cirujano desea, por lo que parece que ofrece una tracción anti-flacidez superior a la cicatriz incontrolada del láser.\nNosotros hemos obtenido buenos resultados con las dos técnicas, por lo que las usamos indistintamente en función de la zona a tratar o de los deseos del paciente según se haya informado.\nLa liposucción ultrasónica fue la primera en aparecer asociada a un aparato que implementaba el poder destructivo de la cánula.\nTiene un mecanismo de acción muy parecido al lipoláser, solo que aquí la fuente energética que destruye los tejidos a la punta de la cánula son los ultrasonidos.\nLos ultrasonidos es un sonido a una frecuencia mucho más elevada de la que es capaz de percibir el oído humano, y que tiene tal energía que destruye tejidos.\nDe la misma manera que un sonido muy agudo puede conseguir que un objeto de cristal estalle, un ultrasonido es capaz de hacer que una célula de grasa estalle.\nAl igual que la liposucción laser, la técnica consiste en introducir la cánula que a su extremo emite un haz de ultrasonidos, y hacer múltiples pasadas por la grasa mientras vamos destruyendo los adipocitos.\nPosteriormente a eso, al igual que en la liposucción laser, es necesario realizar una liposucción convencional para eliminar todos los restos celulares y los adipocitos que han quedado medio destruidos.\n¿Cuál es el mecanismo de acción que argumentan los que defienden esta técnica?\nEl mecanismo de acción es que el daño celular a los fibroblastos de la capa profunda de la dermis hace que ésta reaccione con síntesis de colágenos que actuará al igual que el lipoláser, a modo de tensor de la piel evitando que se pueda producir un aumento de la flacidez.\n¿Porqué no es de nuestras técnicas preferidas?\nPues porque al igual que el lipoláser, no se ha conseguido que ningún estudio serio, aparte de los que te proporcionan y que están hechos por las propias casas comerciales, que acredita un resultado objetivo superior.\nAdemás, el liposuctor por ultrasonidos ya no tiene un mecanismo de acción tan selectivo como el láser, que solo quema grasa, los ultrasonidos dañan todos los tejidos que tocan, por lo tanto en manos de un cirujano inexperto, o en un descuido, se pueden dañar órganos vitales, fascias, nervios u otras estructuras.\n¿Qué tipo de liposuccion es mejor?\nSuele decirse que la liposucción Vaser que utiliza la energía ultrasónica para romper los adipocitos o células grasas, sigue siendo la forma más avanzada y eficaz de liposucción. Este tipo de liposucción ataca a las células grasas sin tocar los tejidos de alrededor.\nEn las clínicas Dr. Moltó no utilizamos la liposucción por ultrasonidos, porque no se ha conseguido que ningún estudio serio, aparte de los que te proporcionan y que están hechos por las propias casas comerciales, acredite un resultado objetivo superior.\n¿Cuál es la forma más efectiva de liposucción?\nLa forma más efectiva de la liposucción y la más común en España es la liposucción tumescente, Aqualipo o Body-Jet, que es más eficaz, más segura y menos dolorosa que la liposucción tradicional, y tiene un tiempo de recuperación más rápido.\n¿Qué diferencias hay entre la «liposucción clásica» y la lipoescultura láser?\nEn una liposucción «clásica», hay más trauma y sangrado ya que los depósitos de grasa se tratan a través de una cánula. El procedimiento de lipo láser coagula los pequeños vasos sanguíneos (reduciendo el sangrado y los hematomas) causando menos trauma mecánico.


COMUNICAR 20: En 2019 Colombia redujo su deforestación\nEn 2019 Colombia redujo su deforestación\nEl Ideam entregó la cifra oficial de monitoreo a la deforestación en el país para el año anterior. Mientras en 2018 la reducción fue del 10%, para 2019 fue del 19,2% con relación a la medición anterior, quiere decir que se evitó la desaparición de 38.264 hectáreas de bosques en este período.\nEl país perdió 158.894 hectáreas de bosque natural en 2019, en 2018 la cifra fue de 197.159 (ha), mientras que en 2017 alcanzó 219.973 hectáreas.\nOtro gran avance que destaca este informe es la disminución de deforestación en la región amazónica, que pasó de concentrar el 70% de la deforestación total en el país en 2018, al 62% en 2019. Por departamentos, Caquetá fue el de mayor reducción de la deforestación, seguido por Meta, Guaviare y Antioquia. En contraste, Chocó y el Sur de Bolívar no reflejaron reducción en ese periodo.\nPosted by ECORADIO at 19:11\nLabels: En 2019 Colombia redujo su deforestación, Ideam


Vuelve a subir la carne este martes – Estación Claridad\n04:41 - jueves 23 mayo\nVuelve a subir la carne este martes\nAsí lo afirmaron carniceros del microcentro sanjuanino. Se prevé que sea el mismo incremento que tuvo la divisa extranjera que aumentó casi un peso.\nRedacción de Estación Claridad 9 marzo, 2019\n“El martes bajarán la media res con aumentos”, dijo a diario Estación Claridad Paula Montaño, propietaria de carnicería Doña Vaca. La comerciante había dicho la semana pasada en el programa “Con Alma y Vida” que la carne había aumentado en lo que va del año un 35% y que no descartaba llegue al 45% antes que cierre marzo. Explicó que cuando el dólar sube la carne también ya, que los insumos para la alimentación del ganado vacuno son en dólares.\nDe esta manera un kilo de carne molida común que figura en pizarra en los 120 pesos, podría superar la barrera de los 150 pesos en los próximos días. El kilo de asado que actualmente se comercializa en 340 pesos el kilo, “podría estar tocando en poco tiempo los 400 pesos”, apuntó Montaño.\nOtros carniceros consultados por este diario, tuvieron la misma apreciación. Fue el caso de los carniceros del mercado de abasto de la Capital. Allí, a fines de febrero, los empleados de las carnicerías remarcaban los precios en las pizarras e irónicamente dijeron, “estamos gastando más en tiza para remarcar que en otra cosa”.\nLa semana que pasó dejó a la divisa por encima de los 41 pesos subiendo 87 centavos. El brusco aumento se dio el viernes pasado mientras el presidente Mauricio Macri pronunciaba su discurso en la apertura de las sesiones ordinarias del Parlamento Nacional.\nEn este sentido el economista Jorge Dávila, entrevistado por el noticiero “Claridad en las Noticias, primera edición”, sostuvo que, “el presidente habló y el dólar subió 0,70 centavos”.\nOtro economista como Claudio Spotorno estimó que “el tema del dólar va a estar presente todo el año, porque el problema es la debilidad del peso” a lo que agregó: “cualquier resfrío en el mundo nos agarra a nosotros y nos deja en coma”, aseveró.\nAunque los comerciantes de pollo y pescado no anunciaron aumentos, desde la Feria de Abasto de la Capital advirtieron a este diario “no poder sostener más” los precios por las fuertes tarifas de las últimas boletas de servicio como la luz.\naumento nuevo carne dolar en alza


Luego de disipar las dudas, Kevin Mac Allister llegó a Boca - Doble Amarilla\nlunes 28 de enero de 2019 13:33\n(De la Redacción de DOBLE AMARILLA) Boca sumó hoy a Kevin Mac Allister como refuerzo. El hijo del "Colorado" llegó a préstamo, a cambio de u$s 200 mil. Se retrasó su revisación médica, que debía ser a las 8 de la mañana y comenzó recién cerca de las 13.\nAdemás, según se pudo saber, entre la Comisión Directiva y la Secretaría Técnica, con Nicolás Burdisso a la cabeza, no había pleno acuerdo para traer al joven de Argentinos Juniors, que, finalmente por la tarde firmó su contrato con el club de La Ribera.\nPor otro lado, en las últimas horas, Paolo Goltz fue operado por el Doctor Jorge Batista de una artroscopía por "un cuerpo libre intraarticular" que tiene en la rodilla derecha. A partir de hoy empieza el camino de su recuperación que le demandará entre uno y dos meses.\nKevin Mac Allister Nicolás Burdisso Facundo Sánchez Boca Argentinos Juniors Mercado de Pases Mundo Boca Paolo Goltz Paolo Goltz\nBoca llegó a un acuerdo para que Kevin Mac Allister sea nuevo refuerzo\nEl Xeneize se movió callado y abrochó a otra incorporación. Se trata del lateral derecho de Argentinos Juniors, hermano de Alexis y de Francis. Llega a préstamo por un año con cargo y opción de compra.


Trabajadores chinos vuelven a sus labores; muertes por coronavirus suben\nHome / Salud / Trabajadores chinos vuelven a sus labores mientras muertes por coronavirus siguen al alza\nTrabajadores chinos vuelven a sus labores mientras muertes por coronavirus siguen al alza\nEl número de muertes causadas por la enfermedad se acerca a las mil\nChina levantó algunas de las trabas impuestas a sus trabajadores para prevenir la propagación del coronavirus de Wuhan, que continúa causando daños severos al interior del país.\nEl número de muertes por coronavirus es de 910, mientras que el total de casos confirmados llega a los 40 mil 631.\nCabe subrayar, sin embargo, que el número de casos que han registrado mejoras también se viene acelerando; la cifra ya supera los 3 mil 300.\nLa batalla todavía no termina para China. El presidente chino, Xi Jinping, quien fue visto portando un cubrebocas en su más reciente aparición pública, declaró el lunes que el combate al coronavirus de Wuhan presenta un panorama “sombrío”.\nLa Organización Mundial de la Salud (OMS), por su parte, aún teme que el virus toque tierra en países con una infraestructura de salud débil, permitiendo que el número de muertes y casos se dispare.\nAdemás, permanece latente el temor de que los casos de infección fuera de China estallen, alcanzando proporciones similares a las vistas en suelo chino.\n(Con información de Reuters y The South China Morning Post)\nNo te lo pierdas Multa CNBV a presidente del consejo de Grupo Lala\n¿Que mas hay? Ingresos por turismo internacional crecieron 1.5% en diciembre


Freelancer profesional experto en Escritura de artículos: Jimmy B. E. de Colombia - Wor...\nJimmy B. E.\nJimmy B. E. freelancer experto en Transcripción, Español, Escritura de artículos\nEl fruto de la justicia se siembra en la paz\nTranscripción Español Escritura de artículos\nObservador de mi entorno, perspicaz en la selección de los recursos, consciente del tiempo y persistente en mis objetivos por alcanzar.\nInvestigador en ciencia Acústica, académico por vocación, docente por decisión, mas de dos años trabajando con colegios y escuelas; voluntario por un mundo mejor en la generación de espacios para cultivar y enseñar cultivando en medios agro-ecológicos. Administrador ambiental de profesión con interés en mejorar mi retorica.\nExpertos Transcripción en ColombiaExpertos Transcripcióntraductores Españolprofesionales Escritura de artículos


Raiders presentan documentación para mudarse a Las Vegas |\nRaiders presentan documentación para mudarse a Las Vegas\nEL NUEVO DIARIO, LAS VEGAS (AP) — Los Raiders de Oakland presentaron la documentación necesaria para mudarse a Las Vegas.\nLa NFL y funcionarios de Las Vegas confirmaron el jueves que los Raiders solicitaron a los otros dueños de equipos que aprueben la mudanza. El club no hizo ningún comentario, y un grupo que quiere que se quede en Oakland prometió que todavía sigue "en la contienda".\nEl director de la comisión del condado de Clark, Steve Sisolak, anunció por Twitter que los documentos fueron presentados, y dijo a The Associated Press que habló al respecto con dirigentes del equipo.\n"Estoy contento porque el proceso está avanzando, y agradezco el compromiso de los Raiders y el trabajo de la familia Adelson con la esperanza de convertir a Las Vegas en el hogar de los Raiders", dijo Sisolak.\nSisolak dirige una comisión que supervisa el famoso Strip de Las Vegas, e integra el grupo de 11 personas creado por el gobernador de Nevada, Brian Sandoval, para analizar una propuesta de la compañía Las Vegas Sands Corp., propiedad del magnate de los casinos Sheldon Adelson, para construir un estadio techado para atraer a los Raiders a la capital de las apuestas de Estados Unidos.\nAndy Abboud, el ejecutivo de Sands que trabaja en el proyecto, dijo que la radicación de los documentos "es uno de esos momentos que convierte todo esto en algo real", y prometió que se completarán las negociaciones necesarias.\n"La gente de Las Vegas debe estar emocionada porque viene la NFL a la ciudad", dijo Abboud a la AP. "Se necesita tiempo para pactar cualquier negocio, pero al final todo se resolverá".\nSandoval también confirmó la radicación, y elogió al dueño de los Raiders, Mark Davis, por cumplir con su promesa de solicitar la mudanza.\n"Mark Davis es un hombre de palabra, y la radicación de la solicitud reubicación de los Raiders ante la NFL es un paso importante para traer el equipo a Las Vegas", dijo el gobernador.\nTodavía no se ha elegido un lugar para construir el estadio, que tendría capacidad para 65.000 espectadores y costaría 1.900 millones de dólares. El financiamiento saldría de 750 millones en impuestos hoteleros, 650 millones de Adelson, y 500 millones de los Raiders y la NFL. La mudanza tiene que ser aprobada por tres cuartas partes de los dueños de equipos.\n"Los Raiders de Oakland presentaron hoy la solicitud para mudar su equipo a Las Vegas, como lo dicta el reglamento y los procedimientos de la NFL para la reubicación de franquicias", indicó la liga. "La solicitud será evaluada en las próximas semanas por el personal de la liga y los comités de estadios y finanzas".\nSi los Raiders reciben el visto bueno, sería la tercera aprobación de mudanza en un año. Los Rams se mudaron de St. Louis a Los Ángeles el año pasado, y construyen un estadio por 2.600 millones de dólares en Inglewood. Los Chargers anunciaron la semana pasada su reubicación a Los Angeles y también jugarán en ese estadio, que abrirá en 2019.


Hotel Albatros, Puerto Escondido – Precios actualizados 2020\nOfertas en Hotel Albatros (Hotel), Puerto Escondido (México)\nTlacochahuaya esquina Guelatao, Fraccionamiento Bacocho, 71980 Puerto Escondido, México – Ubicación ideal. Mostrar mapa\nPersonal amable seguro limpio instalaciones muy limpias buena vegetacion\ntodo el hotel muy gusto, tranquilidad total , la alberca en muy buenas condiciones, los baños y cuartos limpios, el personal muy atento, los 4 días fueron excelentes.\nLa distancia a la playa, la limpieza del hotel y los costos.\nLa atención del personal, queda muy cerca a las mejores playas, no está ubicado en el centro centro lo que da mayor tranquilidad y descanso. Me alojé en la habitación con cocina y era tal cual las fotos\nNos gustó la alberca , en lugar no hay ruido y el personal muy amable ...y limpio todo !!! Las playas se localizan caminando a diez minutos pienso q está dentro de lo excelente !!!!y donde me hospedé tenia cocina pude usarla y favorecer aún más mi estancia\nLa ubicación y la atención del personal muy amables\nEs un hotel muy limpio en todas sus instalaciones, la atención es sensacional. Está a 800 metros de la playa más bonita de Puerto Escondido y a 400 metros de la zona de restaurantes.\nEsta hotel es muy cómodo, céntrico, muy limpio, la atención del personal muy atentos, tienen lugar para guardar los carros están seguros, personalmente me encanto lo tranquilo que es en la noche, en el día, no con los niños y la alberca a todo lo que da, pero aun así en los cuartos no se percibe mucho el ruido, son amplios, las camas son cómodas un poco duras, pero están bien, el baño es limpio, hay agua caliente y fría sin problemas de presión, hay tv con cable, sobre todo lo mas importante aire acondicionado que trabaja muy bien, en general si es una opción buena de hospedaje y si regresare.\nMe gustó mucho la atención en recepción, la ubicación es buena ,y sin duda la relación calidad y precio es muy buena Sin duda regresaremos\nLa atención fue excelente, muy cómodo y limpio todo.\n“Personal amable seguro limpio instalaciones muy limpias buena vegetacion”\n“todo el hotel muy gusto, tranquilidad total , la alberca en muy buenas condiciones, los baños y cuartos limpios, el personal muy atento, los 4 días fueron excelentes.”\n“La distancia a la playa, la limpieza del hotel y los costos.”\n“La atención del personal, queda muy cerca a las mejores playas, no está ubicado en el centro centro lo que da mayor tranquilidad y descanso.”\n“Nos gustó la alberca , en lugar no hay ruido y el personal muy amable ...y limpio todo !!!”\n“La ubicación y la atención del personal muy amables”\n“Es un hotel muy limpio en todas sus instalaciones, la atención es sensacional. Está a 800 metros de la playa más bonita de Puerto Escondido y a 400 metros de la zona de restaurantes.”\n“Esta hotel es muy cómodo, céntrico, muy limpio, la atención del personal muy atentos, tienen lugar para guardar los carros están seguros, personalmente me encanto lo tranquilo que es en la noche, en...”\n“Me gustó mucho la atención en recepción, la ubicación es buena ,y sin duda la relación calidad y precio es muy buena Sin duda regresaremos”\n“La atención fue excelente, muy cómodo y limpio todo.”\nLas luminosas habitaciones del Albatros Hotel incluyen 2 camas dobles, ventilador y TV. Todas tienen una pequeña zona de estar y un baño privado.\nEl Albatros dispone de un restaurante y un bar. También puede encontrar bares y restaurantes en el centro de Puerto Escondido, a 10 minutos a pie.\nLa zona es ideal para practicar surf y snorkel. La bahía de Puerto Angelito está a solo 10 minutos a pie y el aeropuerto internacional de Puerto Escondido se encuentra a 2 km del hotel.\nHotel Albatros recibe clientes de Booking.com desde el 27 de feb de 2013.\nSe han reservado 8 alojamientos como Hotel Albatros en Puerto Escondido en las últimas 12 horas en nuestra página\nCAFE AZUL Restaurante\nEL NENE Restaurante\nEL ADOQUIN Mercado\nLAGUNAS DE MANIALTEPEC Lago\nServicios de Hotel Albatros\nEs necesario abonar el importe total de la reserva por adelantado mediante PayPal o transferencia bancaria. Una vez efectuada la reserva, el Hotel Albatros le facilitará las instrucciones para hacerlo.\nTenga en cuenta que la piscina del establecimiento no está climatizada y que hay que utilizar unas escaleras para llegar a la playa.\nPodrás hacer el check-in en Hotel Albatros a partir de las 14:00 y el check-out hasta las 12:00.\nTodos los clientes Familias (58) Parejas (16) Grupos de amigos (5) Personas que viajan solas (4) Personas en viaje de negocios (5)\nVer todas las puntuaciones Fantástico: 9+ (42) Bien: 7 – 9 (30) Ok: 5 – 7 (12) Mal: 3 – 5 (8) Muy mal: 1 – 3 (1)\nBacocho Beach Nadar, Comer y beber, Ver la puesta de sol\nCómo llegar a Hotel Albatros desde el Aeropuerto internacional de Puerto Escondido\n“Personal amable seguro limpio instalaciones muy limpias buena vegetacion ”\n“La atención del personal, queda muy cerca a las mejores playas, no está ubicado en el centro centro lo que da mayor tranquilidad y descanso. Me alojé en la habitación con cocina y era tal cual las fotos ”\n“Nos gustó la alberca , en lugar no hay ruido y el personal muy amable ...y limpio todo !!! Las playas se localizan caminando a diez minutos pienso q está dentro de lo excelente !!!!y donde me hospedé tenia cocina pude usarla y favorecer aún más mi estancia”\n“Esta hotel es muy cómodo, céntrico, muy limpio, la atención del personal muy atentos, tienen lugar para guardar los carros están seguros, personalmente me encanto lo tranquilo que es en la noche, en el día, no con los niños y la alberca a todo lo que da, pero aun así en los cuartos no se percibe mucho el ruido, son amplios, las camas son cómodas un poco duras, pero están bien, el baño es limpio, hay agua caliente y fría sin problemas de presión, hay tv con cable, sobre todo lo mas importante aire acondicionado que trabaja muy bien, en general si es una opción buena de hospedaje y si regresare.”\nya le hace falta renovar la pintura\nla alberca con su enorme cantidad de area verde\nlos cuartos un poco descuidados\nla atención del personal y las áreas verdes\nFalta un poco de mantenimiento; pero en calidad y precio está bien. Lo mejor aceptan mascotas y los tratan igual de bien.\nLa atención que tienen\nLo q mas influyó en mi elección fue la alberca y cuando la vi estaba muy sucia, me molestó mucho eso\nEl cuarto bien\n“El servicio fue bueno y todo fue muy tranquilo”\nLa chapa de la puerta no funcionaba bien\nQue todo era tranquilo\nEl personal tiene muy mala actitud, nos hicieron pasar muy mal rato con ellos. Principalmente el administrador que estaba a cargo. No generalizo, pero la mayoría de los empleados son flojos y proporcionan un muy mal servicio.\nLa ubicación. Pero que sea tu última opción de hospedaje.\n“Buena ubicación, instalaciones no tanto”\nLas habitaciones del hotel ya son un poco viejas, solo hay ventilador, el baño se inunda\nLa ubicación esta muy cerca de las playas y adoquines\nQue tengan desayunos aunque los cobren en la tarifa.\nHay que invertir un poco más en la camas, son de malísima calidad, las instalaciones bien\nno me gusto que no tiene servicio de restaurant, pienso que estaría super con servicio de resturant así ya no se sale de hotel.\nFalta una área de restaurante.\nSuper tranquilo, excelente para unas vacaciones....!!!


Nueva moratoria de ARBA: cómo acceder a la financiación de las deudas en la Provincia - Minuto Argentina\nNueva moratoria de ARBA: cómo acceder a la financiación de las deudas en la Provincia\nLos contribuyentes podrán obtener un plan de pagos de hasta 24 cuotas sin interés.\nLa página de ARBA está disponible en la web. Fuente: (Twitter).\nEn un intento de acompañar a los contribuyentes, la Agencia de Recaudación de la Provincia de Buenos Aires (ARBA) lanzó hoy una nueva moratoria para las deudas vencidas durante el 2020 de los impuestos Inmobiliario, Automotores y Embarcaciones Deportivas.\nPara acceder al plan de pago, los contribuyentes podrán suscribirse al programa de financiación del ente regulador bonaerense, a través de la página oficial de ARBA. Este beneficio ofrecerá un plazo de regularización de las deudas de hasta 24 cuotas y estará segmentado en función de la capacidad de pago de las familias y empresas, por lo que priorizará mayores quitas y facilidades para quienes más perjudicados se vieron por la pandemia.\nEl programa de ARBA estará habilitado entre el 14 de junio y el 19 de diciembre de este año, pero abarcará deudas de tributos patrimoniales vencidas o devengadas el año pasado. Por esto mismo, la moratoria beneficiará a más de 3 millones de contribuyentes.\nEl plan de pagos prevé una reducción de hasta el 100% de los intereses y multas de aquellas personas que fueron más afectadas por el avance del coronavirus. La financiación facilitará, de manera temprana a los inscriptos que adhieran tempranamente a la moratoria, puesto que las quitas decrecerán con el paso del tiempo.\nEl director ejecutivo de ARBA, Cristian Girard, explicó que esta medida apuesta que todos los bonaerenses puedan regularizar sus deudas. Además, el titular del organismo recalcó que la moratoria forma parte de un paquete de herramientas extraordinarias dispuestas por el gobernador Axel Kicillof para auxiliar y acompañar a los bonaerenses.\nEl mensaje de Girard en Twitter.\nLos conflictos con la AFIP\nMuchas de los contribuyentes alcanzados por el beneficio de ARBA se vieron afectadas por la recategorización del monotributo realizado por la Administración Federal de Ingresos Públicos (AFIP), que endeudó de manera retroactiva a miles de contribuyentes.\nDe esta manera, los trabajadores autónomos deberán pagar sus obligaciones fiscales adeudadas en un plazo de 9 cuotas o hasta le 19 de julio.\nQué restricciones rigen hasta el viernes en el país\nDurante toda esta semana, hay una serie de restricciones que intentan evitar la propagación del coronavirus. Por esto mismo, en las zonas más afectadas por el virus, la circulación está restringida entre las 20 y las 6 horas, por lo que los comercios no esenciales deben cerrar sus puertas a las 19. En ese sentido, las clases deben dictarse de manera virtual y las actividades recreativas, deportivas, religiosas y culturales en lugares cerrados están suspendidas. Estas medidas preventivas perderán efecto el próximo viernes, cuando el Gobierno anuncie la próxima normativa.\nARBA MORATORIA PROVINCIA DE BUENOS AIRES