Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition | Protocol (Translated to Spanish)\nAquí presentamos un protocolo de purificación de proteínas anaerobias, anaerobias proteína concentración y posterior caracterización cinética mediante un sistema de electrodo de oxígeno. El método se ilustra utilizando la enzima DesB, una enzima dioxigenasa que es más estable y activo cuando purificada y almacenada en un medio ambiente anaeróbico.\nProteínas sensibles al oxígeno, como las enzimas que utilizan oxígeno como sustrato, pueden han reducido la estabilidad cuando se purificaron usando métodos tradicionales de depuración aerobia. Este manuscrito muestra los detalles técnicos involucrados en el proceso de depuración anaerobio, incluyendo la preparación de buffers y reactivos, los métodos para cromatografía en columna en una caja de guante y la desalación de la proteína antes de la cinética. También se describe son los métodos para la preparación y uso de un electrodo de oxígeno para realizar la caracterización cinética de una enzima utilizando oxígeno. Estos métodos se ilustran mediante la enzima dioxigenasa DesB, una dioxigenasa galato de la bacteria de cepa de SP Sphingobium SYK-6.\nLas enzimas que utilizan el hierro u otros metales para activar el oxígeno son a menudo susceptibles a la inactivación durante el proceso de purificación debido a su retiro del ambiente reduciendo de una célula. Por lo tanto, estas proteínas deben utilizarse como lysates de la célula, ser sometidas a agentes reductores externos o purificadas anaeróbicamente para asegurarse que tengan una óptima actividad enzimática1,2,3,4. Para las enzimas que son sensibles al oxígeno (específicamente hierro-que contienen enzimas), realizando todos los pasos de purificación y caracterización manteniendo condiciones anaerobias es necesario caracterizarlas totalmente. Esto ha llevado a investigadores a desarrollar montajes de laboratorio todo dentro de los límites de cámaras anaeróbicas para estudios de expresión de la proteína a través Cristalografía5,6,7,8 .\nAdjunto, Divulgamos los métodos para la depuración anaeróbica y caracterización cinética de la enzima DesB mediante un sistema de electrodo de oxígeno. DesB es una dioxigenasa galato de la bacteria de cepa de SP Sphingobium SYK-6 que está relacionado con la LigAB, un protocatecuate dioxygenase del mismo organismo. Ambas enzimas pertenecen a la superfamilia tipo II protocatechuate dioxigenasa (PCAL) que no ha sido extensamente estudiada a la fecha9, probablemente en parte debido a las enzimas de esta superfamilia es susceptible a la inactivación cuando se purificaron usando estándar aeróbico métodos de purificación de proteínas. Puesto que algunas de las enzimas de PCAL Mostrar promiscuidad de sustrato, mientras que otros son específicos del sustrato2,10, mayor caracterización de esta superfamilia es necesario identificar determinantes de especificidad. Como se ha observado en varias enzimas superfamilias11,12,13,14,15, pequeñas moléculas pueden alterar la actividad mediante inhibición competitiva directa o la Unión de moléculas a separar bolsillos alostéricos que causa un aumento o disminución de la actividad enzimática16. Mientras que la cinética solamente no puede distinguir la situación de la Unión de un modulador, determinar la magnitud de un cambio de actividad es importante para la comprensión de los efectos. Como tales, los métodos para la caracterización cinética de la actividad de DesB nativa y su actividad en presencia de 4-nitrocatechol (4NC), un compuesto utilizado para caracterizar e inhibir dioxygenase enzimas2,17, 18, se muestran.\nDesB es capaz de romper galato, un aromático lignina derivado compuesto mediante una reacción de extradiol dioxigenasa (EDO) en que anillo de apertura es catalizada utilizando oxígeno como uno de los sustratos10,19. Esta reacción enzimática se produce en el contexto de la descomposición de la lignina, un CASET aromático encontrado en la pared celular de las plantas. Lignina puede ser despolimerizada, produciendo una variedad de compuestos aromáticos puede además dividirse en metabolitos central3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) cataliza un reacción de compuestos aromáticos dihydroxylated, donde se produce la hendidura adyacente a un diol coordinado de metal; la abertura del anillo en cambio, intradiol dioxygenases cleave análogos compuestos aromáticos entre los dos grupos hidroxilo (figura 1). EDOs, como muchas otras metaloenzimas, tienen un centro metálico divalente de coordinación fe (II) compuesto por una dos-histidina, uno-carboxylate tríada9,34,35. Estos metaloenzimas ser oxidados, a través de autoxidación o basadas en el mecanismo de inactivación, mientras que la enzima se hace inactivo2,36,37,38.\nEn los procedimientos experimentales descritos en este manuscrito, utilizamos DesB, un miembro de la superfamilia del PCAL de la bacteria Sphingobium SP., SYK-6, catalizan la adición de oxígeno a través de los bonos de C4-C5 de galato (figura 2A). La regioquímica de este escote es análogo a LigAB, que es un protocatechuate-4,5-dioxigenasa (figura 2B). Hasta el momento, las investigaciones de este dioxygenase galato incluyen ningunos informes de compuestos que inhiben la DesB10,19,39. Con el uso de métodos de depuración aerobia, DesB exhibió actividad variable, mientras que con el uso de métodos anaerobios pudimos obtener constantemente proteínas con actividad reproducible. Los estudios cinéticos descritos aquí muestran los métodos de depuración anaerobia de DesB, caracterización cinética de la reacción de DesB con saúco y la inhibición de DesB por 4-nitrocatechol (4NC).\n1. Generalidades los materiales y métodos\nPreparar todos los medios necesarios como se describe en la tabla 1. Autoclave a 120 ° c durante 15 minutos estéril filtrar la solución SOC, después de la adición de MgCl2 y glucosa, haciéndola pasar por un filtro de 0.2 μm. Ajustar el pH de la solución de caldo de lisogenia (media libra) de Miller antes de autoclavar. Complementar la solución de los medios de comunicación de LB-Amp después de autoclavar soluciones estériles de 0,2 mM de L-cisteína, luego 0,1 mM amonio Sulfato ferroso para mejorar la solubilidad y la expresión de la proteína.\nPreparar el Tampón Laemmli y corriente buffer para electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) como se describe en la tabla 2. Ajustar el pH de las soluciones (con 1 M de HCl y Tris base para la preparación de buffer) antes de diluir los componentes para sus volúmenes finales.\nPreparar los buffers para la purificación de la proteína como se describe en la tabla 3. Ajustar el pH de las soluciones (con 1 M de HCl y Tris base para la preparación de buffer) antes de diluir los componentes para sus volúmenes finales.\nTransferencia de los buffers dispuestos a una botella que puede ser sellada con un tapón de goma 1 orificio y que contiene un tubo de vidrio.\nUse una manguera para conectar el tubo de vidrio en el tapón a una fuente de vacío. Deje que la solución de desgasifica bajo presión negativa para aproximadamente 30 min agitación a velocidad media.\nRomper el sello primero, y luego apague la aspiradora de vacío. A continuación, perfore a través del tapón de goma con dos agujas de 20G (una que es suficiente para llegar a la parte inferior de la botella y una aguja más corta que puede ser utilizada como un ducto de escape de gas). Burbuja en un flujo continuo de nitrógeno agitación a velocidad media durante 30 minutos.\nRetire las agujas y repita la desgasificación y burbujeante en nitrógeno para un total de tres ciclos. Cuando haya terminado, selle correctamente la botella con un tapón de goma sólida. Fijar el obturador con la película de parafina y alambre de cobre (20G) y colocarlos en la guantera.\nNota: Todos los materiales se colocan en la guantera y sometidos a 3 ciclos de purga de la antecámara, seguida de aspirar oxígeno y llenado con nitrógeno. Buffers utilizados para la purificación y concentración pueden ser capsuladas y almacenados indefinidamente en la guantera.\nPreparar la solución dithionate de sodio disolviendo aproximadamente una espátula (0,31 "x 2", el extremo más pequeño de una espátula de acero inoxidable de micro cónica doble) de dithionate de sodio en aproximadamente 1 mL de agua desgasificada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL . Sellar el tubo con la película de parafina antes de sacarlo de la caja de guante.\nNota: Guarde el dithionate de sodio sólido en la guantera para evitar la oxidación.\n2. preparación de la columna de amilosa para purificación de proteínas\nHacer una mezcla de resina de alto flujo amilosa (15 mL) combinada con 5 volúmenes de columna (75 mL) de tampón de la columna de amilosa. Transferir la mezcla de resina en dos botellas de suero de 50 mL y cada botella con una membrana de goma del sello. Perfore un 20G, aguja de 305 mm a través de los septos y nitrógeno de la burbuja en la mezcla durante aproximadamente 1 minuto extraer oxígeno de la suspensión. Transferencia de la resina y la solución que contiene la proteína en la guantera.\nEn la guantera, vierta la resina en una columna de borosilicato de 2 x 30 cm con una simple llave de paso, permitiendo a la resina para asentarse y crear una cama nivel. Vaciar el búfer de columna y equilibrar la columna con 3 volúmenes de columna (total de ~ 30 mL) de tampón de la columna de amilosa desgasificada con gas nitrógeno a presión para empujar el tampón a través de la resina en aproximadamente 1 gota/s o 5 mL/min, hasta que el solvente es justo por encima de la cama de resina.\nNota: Después de la proteína es eluted (ver paso 3.5 más abajo), la resina de la columna de amilosa es regenerada por lavado con el volumen de la 1 columna (10 mL) de agua, luego volumen 1 columna de dodecil sulfato de sodio al 1% (SDS) y finalmente, 3 volúmenes de columna (30 mL) de agua. Este paso puede completarse fuera de la caja de guante. La resina de la columna se almacena a 4 ° C en 20% de etanol y se puede regenerar hasta 5 veces.\n3. proteína expresión y purificación anaerobio de DesB\nNota: El gen DesB fue sintetizado comercialmente, que han colocado en pET-15b, pET-32a y pMAL-c5x vectores usando la restricción NdeI y BamHI sitios de clonación.\nCompletar los análisis de expresión de proteína según las instrucciones del fabricante para determinar las condiciones adecuadas para la expresión de gran escala (se describe brevemente a continuación).\nTransformar la plásmidos que contienen DesB comercialmente hechos, químicamente competentes de e. coli BL21 (DE3) células, según las instrucciones del fabricante. En Resumen, descongelar las células en hielo durante 10 min, añadir aproximadamente de 10-50 ng de ADN plásmido a la mezcla de la célula, shock térmico las células a 42 ° C por 10 s e incubar en hielo por un adicional 5 min medios SOC añadir para obtener un volumen final de 1 mL y permitir la células a temblar (~ 200 rpm) a 37 ° C durante 60 minutos. Una placa de LB-Amp, agregar y difundir 100 μl de la solución de la célula e incubar durante una noche a 37 ° C.\nSeleccionar una sola unidad formadora de colonias de la placa después de la incubación durante la noche y esta colonia para inocular 10 mL de medio LB-Amp. Crecen las células durante la noche, con agitación (~ 200 rpm) a 37 ° C.\n10 mL de medio, añada 100 μl de la solución de crecimiento durante la noche y sacuda los nuevos medios tal como se describe en el paso 3.1.2 a 37 ° C. Cuando la densidad óptica a 600 nm (OD600) está entre 0.4-0.8, añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para obtener una concentración de la solución final de 1 mM.\nInmediatamente retire una alícuota de 1 mL de la solución y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con etiqueta tiempo = 0 horas. Girar el tubo a 15.000 x g durante 10 minutos para que sedimenten las células. Después del centrifugado, quite el sobrenadante y almacenar las células a 4 ° C.\nRetirar alícuotas adicionales (1 mL) a intervalos de tiempo después de la adición de IPTG (normalmente en 5, 10, 12, 18 y 24 h). Como se describe en el paso 3.1.4, cada tubo de centrífuga, decante el sobrenadante y almacenar las células a 4 ° C.\nUna vez que todas las porciones se obtienen, resuspender las células de cada punto en 30 μl de solución de extracción de proteína bacteriana, les incube a temperatura ambiente durante 10-15 minutos y centrifugar los tubos a 15.000 × g por 5 min separar el soluble e insoluble proteínas.\nTransferir la solución de la proteína soluble a un tubo nuevo de microcentrífuga y resuspender los gránulos insolubles restantes con 30 μl de solución de extracción de proteína bacteriana.\n30 μl de cada solución (soluciones solubles e insolubles para cada punto) se combinan con un volumen igual de buffer Laemmli, entonces visualizar en un gel de SDS-PAGE40. Seleccione las condiciones correspondientes a las rutas que contienen las bandas de tamaño correcto en la fracción soluble para expresión de proteínas a gran escala y purificación.\nNota: Puesto que la proteína soluble mínima inicialmente fue generada usando las condiciones anteriores, varios complementos fueron agregados para probar efectos sobre la expresión de la proteína soluble, 0,2 mM de L-cisteína y sulfato ferroso de amonio 0,1 mM mostrando mayor proteína expresión. Según esta pantalla de expresión de la proteína, un vector de expresión apropiado para la producción de soluble de DesB era vector pMAL-c5x.\nDespués de la transformación en Escherichia coli BL21 (DE3), hacer un balance de DesB/pMal-c5x mediante la combinación 900 μl de cultivo bacteriano (crecida durante la noche con agitación a 200 rpm y 37 ° C) con 100 μl de glicerol al 80%. Almacenar el stock a-80 ° C en un tubo criogénico.\nNota: Hacer un nuevo caldo congelado aproximadamente cada 6-8 meses.\nUtilizar una pipeta para raspar las células de la acción congelada y empezar un cultivo bacteriano, aumentando durante la noche en 5 mL de medio LB-Amp a 37 ° C con agitación. Inocular el 1.5 litros de media libra-Amp en un matraz de 2 L a 37 ° C y 200 rpm, mediante el cultivo bacteriano crecido durante la noche.\nNota: Debido a la sensibilidad observada de la proteína al oxígeno, se encontró ese espacio reducido en el frasco y velocidades proteína mejor rendimiento para la expresión a gran escala de agitación moderada.\nInducir la expresión de la proteína cuando la densidad óptica a 600 nm (OD600) está entre 0.4-0.8 con 1 mM IPTG y suplementado con 0.2 mM L-cisteína y 0,1 mM sulfato ferroso amónico. Bajar la temperatura de incubación a 30 ° C y agitar a 200 rpm. Desactivación de las células mediante centrifugación después de la inducción después de 24 h a 4.700 x g durante 10 minutos y desechar el medio gastado.\nResuspender el precipitado de células en 20 mL de tampón de columna de amilosa por cada 1,5 L de crecimiento, seguido por la adición de 1 mg de lisozima. Agitar durante 20 minutos en hielo.\nNota: Más tampón puede añadirse si la solución es muy viscosa, como proteína de soluciones que son demasiado viscosas pueden interrumpir el paso siguiente de la homogeneización.\nLisar la solución celular resuspendido mediante homogeneización de alta presión con pases de 3-5 a aproximadamente 15.000 psi. Transferencia de la proteína a un tubo de centrífuga de 50 mL y lavar los espacios vacíos con nitrógeno durante 1 minuto. Luego, centrifugar el lisado a 20.000 x g durante 40 minutos eliminar los residuos insolubles de la célula.\nNota: Éxito de homogeneización hace la proteína micelas forma fluye a través del tubo y en el frasco de colección, y la solución aparece como un color gris-marrón translúcido. Mantener la proteína homogeneizada en hielo durante todo el proceso.\nDespués de la centrifugación, transferencia el sobrenadante en un tubo de 50 mL (más de uno puede que sea necesario), cerrar el tubo con una membrana de goma y con una aguja de calibre 20, lentamente la burbuja nitrógeno gaseoso a través de la solución por 2 min desplazar oxígeno. Envuelva el tabique con la película de parafina y asegurar con el alambre de cobre y traer el sobrenadante en la guantera junto con los materiales de la columna.\nEquilibrar la columna (ver paso 2.3) y la proteína sobrenadante a la columna de la carga. Recoge el flujo a través en fracciones de 5 mL bajo nitrógeno a presión moderada (1 gota por segundo o unos 5 mL/min). A continuación, lavar la columna mediante otra columna 3 volúmenes de amortiguador de columna de amilosa y manualmente recoger fracciones de 3 mL en tubos de ensayo de vidrio bajo nitrógeno a presión moderada (aproximadamente 5 mL/min). Eluir la proteína utilizando 5 volúmenes de columna (50 mL) de tampón de elución y manualmente recoger fracciones de 3 mL bajo presión moderada de nitrógeno (aproximadamente 5 mL/min).\nNota: Las fracciones también se pueden recoger mediante filtración de gravedad. Aproximadamente 12 fracciones elución deben ser recogidas.\nRecoger 30 alícuotas de μl de fracciones y quitarlos de la caja de guante para permitir la visualización de la proteína que contiene fracciones mediante análisis de SDS-PAGE.\nNota: Las fracciones recogidas permanecen en la caja de guante para la duración de esta prueba. DesB purificada normalmente elutes de la columna en fracciones de 3 a 5.\n4. anaerobio proteína concentración tampón intercambio\nMonte el concentrador a presión, revuelto de la célula con un filtro de membrana de celulosa reconstituida de 76 mm (corte 10 kDa). Añadir una cantidad suficiente de etanol al 20% en el concentrador de oxígeno para mantener la membrana mojada como se transfiere el concentrador montado en la guantera.\nNota: Asegúrese de que no sin lágrimas en la membrana y que la junta tórica no está arrugada.\nDespués de traer el concentrador celda agitada en la guantera, la solución de etanol apagado la membrana con agua de lavado. La tapa y presionar la celda agitada para limpiar la tubería y la membrana de cualquier exceso de agua.\nAñadir todas las fracciones que contienen proteína según lo determinado por SDS-PAGE (figura 3) al concentrador. Añadir el tampón de intercambio suficiente para obtener 150 mL de volumen de solución de proteína total.\nPresurizar la cámara de agitación celular utilizando una línea externa de2 N y concentrado de la proteína a 50 mL con agitación a velocidad moderada.\nNota: Lograr una concentración de 50 mL toma aproximadamente 20 minutos.\nCompletar 100 mL de tampón de intercambio con 0,1 mM Ditiotreitol (DTT) y sulfato ferroso de amonio 0,1 mM, añadir la solución a la celda agitada y concentrado de la proteína para un volumen total de 50 mL con una moderada velocidad de agitación.\nDespués de que la solución alcance un volumen de 50 mL, agregar en el búfer de intercambio completada una vez más, pero concentrar la solución hasta un volumen total de 10 mL con agitación a velocidad moderada.\nFiltro de la proteína concentrada utilizando un 0,45 μm filtro de la jeringuilla de tamaño de poro y alícuota en tubos de reacción en cadena (pcr) de polimerasa individuales de 0,2 mL (cada uno contiene aproximadamente 150 μL de la solución de la proteína). Quitar las alícuotas tapa de la guantera e inmediatamente flash congelarlas con nitrógeno líquido. Almacenar las alícuotas a-80 ° C.\n5. desalación DesB\nEnjuague la bolsa de guante con gas de nitrógeno de aproximadamente 1,5 horas antes de su uso.\nDescongelar una alícuota de 150 μL de proteínas purificadas de DesB dentro de la bolsa de guante en el hielo.\nMientras que la proteína se descongela, preparar una pequeña gravedad, columna que contiene 3 mL de gel gruesa de desalación Sephadex G-25, en una columna de borosilicato de 9 mL de la desalación. Lavar la columna con 2 volúmenes de columna (~ 6 mL) de desgasificado buffer del desalt.\nNota: Cambie el gel de desalación cuando hay un cambio en el gel de color de blanco a amarillo (después de aproximadamente 7 aplicaciones).\nEl DesB descongelada a la columna mediante un proceso controlado por la gravedad de la carga. Deseche el flujo a través. Eluir la proteína con aproximadamente 5 mL de tampón de la desalación.\nNota: La presión del tanque de gas continuamente llenando la bolsa de guante afectará la tasa a la que las soluciones del goteo de la columna.\nPara la determinación inicial de elución de la proteína de la columna, recoge 12 frascos/elutions (contiene 3 gotas por frasco). Sellado con un septum de goma, quitar de la bolsa de guante y prueba para la presencia de la proteína ya sea directamente (a través del análisis del gel de SDS-PAGE) o indirectamente (a través de examen de la actividad de cada fracción).\nNota: Por lo general, las fracciones se prueban individualmente para la actividad, como se describe en el paso 7.1, con la mayor actividad corresponde a la fracción con mayor concentración de proteína activa. DesB elutes generalmente a partir de la caída de 7, después de lo cual se recogen las siguientes 9 gotas de proteína desalada. Alícuotas de proteínas se almacenan en el hielo durante las mediciones de cinética (pasos 7.1-7.4).\n6. preparar el electrodo de oxígeno\nPulir el anillo de plata ánodo y cátodo de platino con electrodo limpiador y un q-tip humedecido hasta que no hay signos visibles de depósitos de óxido negro.\nCon las tijeras, corta aproximadamente un cuadrado de 1.5 pulgadas de espaciador de papel (o papel de balanceo del cigarrillo, que funciona así). Luego, corte 1) triángulos en cada cara de la Plaza y 2) ranuras en las esquinas para facilitar el embalaje del electrodo.\nAñadir 5 gotas de una solución de KCl 50% en el ánodo de plata del surco y unirlos para formar un anillo continuo de solución. Añadir 2 gotas de la solución de KCl 50% a la parte superior del electrodo de platino. Cuidadosamente coloca el papel separador en la parte superior del electrodo de platino y suavizar el papel separador, por lo que no hay burbujas de aire.\nNota: Tenga cuidado para evitar rasgar el papel separador.\nCortar un trozo de la membrana PTFE (politetrafluoetileno) de 30m de S4 que es de aproximadamente 2 pulgadas de largo y colóquela sobre el papel separador. Corte los bordes de la membrana para que estén alineados con el aro exterior del electrodo.\nCon el aplicador de anillo o, pulse la pequeña junta tórica sobre el electrodo para asegurar al espaciador de papel y membrana en el electrodo. Coloque el O-ring más grande en la ranura circular del electrodo, haya no hay membrana debajo de ella. Deslice la cámara superior del electrodo en la base y enroscar los dos juntos.\nNota: Los dos se atornillan en correctamente si no palo de burbujas de aire a los lados de la cámara.\nColoque el electrodo montado en su base y conecte el electrodo para el sistema de vigilancia. Iniciar el programa de control de electrodo y calibrar el electrodo realizando el protocolo de calibración de fase líquida (Figura 4A). La variable de temperatura debe ser la temperatura de la habitación en la que se realiza el experimento, y la variable de la presión ambiente es dependiente en la región y las condiciones actuales del tiempo.\nNota: La presión ambiente puede obtenerse un informe del tiempo para la región.\nAñadir 1 mL de tampón de Tris 25 mM a la cámara del electrodo, inserte el émbolo, comenzar la calibración de una solución saturada de oxígeno y ajustar la velocidad del agitador a 100. Después de que el electrodo se estabiliza, el punto de ajuste de calibración para el oxígeno se determina la solución saturada (Figura 4B).\nSin quitar el émbolo, use una jeringa de aguja y 1 mL de 1.2 x 40 mm para inyectar aproximadamente 1 mL de solución de Ditionito de sodio en la cámara, teniendo cuidado de evitar la adición de burbujas de aire (figura 4). Use un tapón de caucho para sellar la cámara del electrodo inmediatamente después de la adición de Ditionito de sodio.\nPermite la calibración continuar hasta que todo el oxígeno se utiliza y se completa el programa y guardar la calibración (figura 4). Aspirar la solución de la cámara y enjuague el pistón y la cámara con agua desionizada 5 - 6 veces para asegurar el retiro completo del Ditionito de sodio. Cuando enjuague, use un tubo de plástico equipado con una punta de pipeta conectada a un termo de brazo lateral. Evitar dañar la membrana.\n7. cinéticos ensayos usando el electrodo de oxígeno\nIdentificar las alícuotas desaladas que contengan proteína activa en pruebas en serie de 1 μl de solución enzimática para la actividad en una solución de tampón Tris 25 mM, pH 7,5 y que contiene 100 μm galato. Use el aliquot(s) con la mayor actividad observada para los experimentos restantes. (Ver paso 5.5.1)\nDetermine la velocidad de la reacción enzimática, midiendo el consumo de O2 con una O2-electrodo de Clark-tipo sensible con integración de equipo a través de la unidad de control del electrodo.\nPara cada dato de la cinética del punto medición de DesB, añadir 1 mL de tampón de Tris 25 mM (pH 7.5) a la cámara del electrodo. Añadir un volumen calculado de una solución 25 mM de saúco al buffer Tris para lograr la concentración del substrato final deseado (0.05-25 mM).\nNota: Preparar soluciones frescas de saúco y compuestos inhibitorios con agua todos los días y ajustar el pH a 7.5 con la adición de 0,1 mM NaOH, si es necesario.\nDespués de 10 s de agitación para permitir la mezcla de la solución, sellar la cámara con el émbolo lentamente y atornille la parte superior. Puede utilizarse un paño limpio para absorber el exceso de líquido que es desplazado de la cámara. Permita que el electrodo se equilibren donde puede producir una medida estable de la concentración de oxígeno en la solución durante al menos 1 minuto antes de proceder a la adición de la enzima (fondo O2 consumo tasa de ± 0.5 μm/min).\nUtilizando una jeringa de μl 10 tight gas, añadir aproximadamente 1 μl de enzima (aproximadamente 3-7 μm enzima) a la cámara del electrodo por el émbolo.\nNota: La cantidad de enzima puede aumentar o disminuir en respuesta a la actividad observada de la alícuota específica para permitir velocidades de reacción suficiente.\nCalcular la velocidad de reacción basada en la cuesta de los primeros 30 s de datos lineales después de la adición del enzima y correcto para el fondo usando el 30 el consumo de O2 s de datos inmediatamente antes de la adición de la enzima. El tipo de catálisis es igual a la tasa de consumo de O2 (figura 5A).\nDespués de la recolección de los datos de velocidad para una concentración dada de substrato, vaciar la cámara de electrodos mediante aspiración mediante el uso de un tubo de plástico conectado a un frasco de vacío de brazo lateral y enjuague repetidamente con agua durante 4-6 ciclos. Configurar la solución en el electrodo como se describe en paso 7.2.1 usando una concentración de sustrato nuevo.\nVariar las concentraciones de sustrato en forma desordenada y replicar a lo largo del experimento para tener en cuenta las disminuciones en la actividad enzimática con el tiempo (figura 5B).\nNota: Cuando se replica de una concentración específica se ejecuta y demuestra más que una disminución de 30% de tasa en comparación con un anterior ejecución, ningún análisis adicionales deben realizarse con ese lote de enzima. Por lo general, después de 30-40 funcionamientos, la enzima muestra una disminución de 30% en la actividad.\nDeterminar los parámetros cinéticos kcat (la constante catalítica para la conversión de sustrato a producto) y Km (la constante de Michaelis, operacionalmente se define como la concentración de sustrato en el que la tasa inicial es la mitad de la velocidad máxima), por un ajuste de mínimos cuadrados de los datos de cada una de las concentraciones de sustrato a la ecuación de Michaelis−Menten (figura 6) mediante GraphPad Prism.\nAñadir 4-nitrocatechol (4NC) para probar sus efectos sobre la cinética de dioxygenation y determinar la constante de inhibición (K) con DesB. Para cada condición de reacción, acción soluciones de Tris (50 mM), galato de (25 mM) y 4NC (25 mM) se combinan y diluido con agua para producir una solución de 2 mL de tampón de Tris 25 mM (pH 7.5) con galato de 1 mM y variando las concentraciones de 4NC. El volumen de 4NC fue variado para lograr la concentración de inhibidor final deseado (0.05-20 mM).\nDespués de 10 segundos de agitación para permitir la mezcla de la solución, coloque el émbolo en la cámara lentamente y atornille la parte superior. Puede utilizarse un paño limpio para absorber el exceso de líquido que es desplazado de la cámara. Permita que el electrodo equilibrar y producir una medición estable de la concentración de oxígeno en la solución durante al menos 1 minuto antes de proceder a la adición de la enzima (fondo O2 consumo tasa de ± 0.5 μm/min).\nComo se describió anteriormente, agregar la proteína (paso 7.2.3), determinar la velocidad de reacción (paso 7.2.4) y restablecer el electrodo para la siguiente condición.\nComo parte de esta serie de experimentos, determinan la velocidad de la reacción en ausencia de inhibidor varias veces. Determinar la inhibición por la normalización de las tasas de consumo de oxígeno en presencia de diferentes concentraciones de inhibidor con sustrato de 1 mM y ausencia de inhibidor (v/vo).\nAjuste la inhibición de la dioxygenation galato a ecuación 7.3A y, a continuación, los datos de inhibición a ecuación 7.3B usando un programa de graficación (figura 7).\nDeterminar la concentración de enzima precisa para cada experimento mediante la realización de un ensayo de Bradford después de la terminación de todas las ejecuciones de cinéticas.\nNota: Todas las tarifas fueron corregidas para la concentración de enzima. Este paso no es necesario hacerlo en una caja de guante o bolsa de guante.\nEs el análisis del gel de SDS-PAGE de fracciones individuales de la purificación de la construcción de fusión DesB-maltosa vinculante proteínas (MBP) (figura 3). El gel revela que la proteína es pura (MW = 91.22 kDa), excepto por la presencia de DesB (MW = 49.22 kDa) y el dominio de la proteína MBP (42 kDa) divididos unos de otros. Fracciones E2 y E3 fueron seleccionados para la concentración (paso 4.2).\nLa reproducibilidad del análisis cinéticos DesB depende de su montaje, calibración y técnica experimental. Es necesario introducir la correcta temperatura y presión ambientes, estas variables determinarán el porcentaje de O2 que se disuelven en soluciones durante el ensayo (Figura 4A). La señal inicial debe estar entre 1800 y 2000 nmol/mL y debe producir una tasa estable cercano a cero, indicando que la saturación de oxígeno de la solución es cambiar mínimamente (Figura 4B). Una vez que se agrega el dithionate de sodio y la cámara está sellada, la tasa de consumo de O2 debe rápidamente y constantemente aumentar hasta que haya un mínimo de O2 (< 60 nmol/mL) en la solución. Una pendiente negativa constante indica que 1) el electrodo montado sin fugas de aire y 2) el electrodo está respondiendo adecuadamente a los cambios en la concentración de O2 (figura 4 y D). Si el O2 en solución no es suficientemente baja, el valor del offset de calibración será incorrecta. La calibración debe repetirse con el electrodo montado correctamente, y debe utilizarse dithionite del sodio fresco.\nCuando el electrodo está correctamente calibrado, se pueden realizar ensayos de cinéticos. La primera medición establece la actividad de la enzima recién desalada con 100 μm galato en tampón de Tris 25 mM y 1 uL de la enzima. Antes de la adición de la enzima, el tampón Tris y galato se revuelven en la cámara con el émbolo en posición. Esto deberá producir una señal inicial aproximada entre 250 y 350 nmol/mL, y la señal debe estabilizar (±5 nmol/mL/min) antes de añade la enzima. Una señal estable indica que no hay ninguna variables (p. ej., rasgada la membrana, dithionite del sodio sobrante, electrodo sucio) que pueden causar las medidas inconsistentes. Cuando se agrega la enzima, la señal debe rápidamente y constantemente disminuir, indicando que la reacción de DesB proceder, ya que el O2 se consume en la reacción con galato. La pendiente de la tasa inicial antes de adición de enzima y la tasa catalítica se determinaron utilizando las herramientas de índice y ajustando la ventana de 30 segundos (figura 5A). Después de aproximadamente 1-1.5 horas de uso, la actividad enzimática disminuye en un 30-50%, momento en el que ya no debe ser utilizado (figura 5B).\nUna vez que se han tomado todas las medidas cinéticas, se pueden trazar los datos utilizando un programa de modelado (figura 6). La actividad de DesB con galato se obtiene mediante la medición de la tasa de consumo de O2 en concentraciones variables de galato. La tasa de fondo antes de adición de enzima se resta de la tasa catalítica para obtener la tasa corregida. La tasa corregida de fondo es dividida por la concentración de enzima y equipada para ecuación 7.3A (ver paso 7.3.3). Un ajuste suficiente depende de los parámetros iniciales para KM y Ksi, (inicial de parámetros:KM = 320 μM, Ksi = 1600 μM). El resultado muestra una curva hiperbólica que alcanza una meseta máxima, a continuación, las pistas hacia abajo ligeramente [galato] aumenta. Se trata de una curva típica para una enzima que presenta inhibición de sustrato a concentraciones altas de sustrato.\nLa tasa de inhibición de DesB con 4 nitrocatechol se determinó mediante la observación de la reducción en la tasa de consumo de oxígeno de DesB con galato de 1 mM en presencia de diferentes concentraciones de 4-nitrocatechol (figura 7). La concentración de 4-NC se enfrenta a la actividad normalizada (la tasa en presencia del inhibidor fue dividida por la tasa desinhibida) y ajuste a la ecuación 7.3B (ver paso 7.3.3). Los resultados indican que 4-NC inhibe el consumo de oxígeno, lo que inhibe la reacción de DesB.\nTipo de medio Componentes\nCaldo Super óptima con represión catabólica (media SOC) 2% (w/v) triptona\n0.5 extracto de levadura % (p/v)\n10 mM de MgCl2 (agregado después de la esterilización)\n20 mM de glucosa (agregado después de la esterilización)\nCaldo de lisogenia de Miller con ampicilina (media libra-Amp) 0.5 extracto de levadura % (p/v)\ntriptona 1% (p/v)\n1% (p/v) de NaCl\n0,1 mg/mL de ampicilina (agregado después de la esterilización)\nTabla 1. Ingredientes para la preparación de caldo super óptima con represión catabólica (medios SOC) y caldo de lisogenia de Miller con ampicilina (media libra-Amp).\nSolución de trabajo Concentraciones finales de componente\nLaemelli tampón, pH 6.8 100 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris)\n200 mM Ditiotreitol (DTT),\n4% sodio dodecil sulfato (SDS)\nazul de bromofenol 0.05%\nCorriente de solución amortiguadora de pH 8.3 25 mM Tris\nTabla 2. Ingredientes para la preparación de Laemelli y buffer de corriente para análisis de SDS-PAGE.\nAmilosa columna tampón, pH 7.4 20 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris)\nácido de 1 mM etilendiaminotetracético (EDTA)\nElución de tampón pH 7,4 20 mM Tris\nmaltosa de 10 mM\nCambio de tampón, pH 7.5 50 mM Tris\nDesalar el tampón, pH 7.5 50 mM Tris\nTabla 3. Ingredientes para preparación de buffers para la purificación de proteínas.\nFigura 1: comparación de las reacciones catalizadas por anillo hendiendo dioxygenases. Las líneas onduladas muestran el correspondiente bono de carbono que es hendido durante la reacción dioxigenasa, donde intradiol escote (rojo) rompe el vínculo entre los dos grupos del oxhidrilo y extradiol escote (azul) se rompe un enlace carbono-carbono adyacente a la grupos del oxhidrilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 2: las reacciones catalizadas por DesB y LigAB, dos relacionados con dioxygenases extradiol que pertenecen a la superfamilia de tipo II protocatechuate dioxigenasa (PCAL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 3: gel de SDS-PAGE de DesB con purificación y concentración de pasos resultados. Carriles están etiquetados como sigue: S = proteína estándar, FT1 y FT2 = las recogida a través de flujo de fracciones, W1 y W2 = las fracciones recogidas lavado, E1-E4 = fracciones eluir la recogida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 4: curvas de generación de calibración para el electrodo de oxígeno. (A) antes de la calibración, presión y temperatura ambiente se introducen en el programa para determinar las concentraciones de oxígeno para soluciones de aire equilibrado. (B) la solución saturada de oxígeno alcanza el equilibrio y genera un mensaje. Solución de dithionate de sodio (C) se agrega al utilizar todo el oxígeno, como se indica por la disminución en la señal de oxígeno. (D) calibración se obtiene cuando la señal se estabiliza en cero concentración de oxígeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 5: curvas cinéticas representante ilustrando una pérdida típica de la actividad en el tiempo. (A) la reacción de 100 μm de epigalocatequina DesB fresco, con una tasa de utilización de2 O de-56.61 μm/min (B) la reacción de galato de 100 μm con DesB después de 2 h de recogida de datos, con una tasa de utilización de2 O de-29.56 μm/min haga clic aquí para ver un una versión ampliada de esta figura.\nFigura 6: Diagrama de actividad de DesB con galato, ajuste a la ecuación de Michaelis-Menton (negro) y ajuste a la ecuación de Haldane para la inhibición del substrato (rojo; Ecuación 7.3B). Parámetros cinéticos derivados de los dos ajustes son los siguientes: Michaelis-Menten - kcat = 316 +-17 sec-1, Km = 123 +-26 μM; Haldane - kcat = 570 +-110 seg-1, Km = 320 +-100 μM, Ksi = 1600 +-600 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 7: Diagrama de la inhibición de la 4-nitrocatechol de dioxygenation DesB de galato (1 mM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 8: coordinación de galato de DesB (pdb ID = 3wr3). Como se ve en muchos dioxygenases, el ligando se coordina a un átomo de hierro (II) del sitio activo de manera bidentado. En base a las similitudes estructurales entre galato y 4-nitrocatechol (4NC), la inhibición de DesB por 4NC fue predicha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nLos pasos críticos en la obtención de proteína activa purificada DesB implican la formación y el mantenimiento de la reducción fe (II) activo en la enzima. Como tal, correcto funcionamiento de la inducción, purificación, concentración y desalación pasos son esenciales para obtener con éxito la enzima activa. Inducir la expresión de la proteína en presencia de sulfato de amonio ferroso 1 mM asegura que el fe (II) se incorpora correctamente en el sitio activo de DesB. Este método está inspirado en estudios como los metaloenzimas amidohidrolasa, que a menudo requieren la adición de metal para medios de cultivo para permitir el correcto plegamiento y ocupación completa del metal de la Unión sitio6,41,42 ,43.\nLa depuración anaerobia y la concentración en la guantera quizás están los pasos más críticos y técnicamente difíciles en este protocolo. Es esencial para mantener una atmósfera libre de oxígeno en la guantera. Esto requiere mantener el catalizador de la desoxigenación en la guantera, de acuerdo con el manual, cambiar periódicamente los tanques de nitrógeno que se unen a la caja cuando están bajas, asegurando que no hay agujeros en los guantes de la guantera, y mantener una bandeja de desecante fresco en la guantera. Tiras sensibles al oxígeno que cambian de color cuando se expone al ambiente O2 se pueden colocar en la caja de prueba para una O2-ambiente libre. Además, es necesario desgasificar totalmente todos los buffers y soluciones que se utilizarán durante el proceso de purificación y concentración. Para asegurar el mínimo de O2 en los buffers, tener mucho cuidado para limitar la exposición desgasificada buffer al aire al cambiar entre nitrógeno burbujea y aspirar los ciclos.\nCuando se ejecuta la columna en la guantera, un buen test para determinar si hay oxígeno presente en los buffers es tomar una pequeña porción de una de las fracciones de lavado (aproximadamente 0.1-0.5 mL) y colóquelo en un tubo de microcentrífuga con una pequeña porción de ferroso ammoni sulfato de UM y TDT (menos de la cantidad necesaria para el paso de la concentración). Entonces es importante mezclar bien el contenido del tubo y observar el cambio de color. Si la solución da vuelta negro, oscuro amarillo, o naranja, hay oxígeno presente en las fracciones de proteína y habrá probablemente ser actividad catalítica reducida tras el proceso de purificación y concentración. Si la solución es una luz de color lavanda o amarillo muy claro, puede ser mínimo O2 presente, pero es probable que la enzima aún tendrá alta actividad. El amarillo oscuro al cambio de color naranja cuando el oxígeno está presente probablemente es causado por la oxidación del hierro en el sulfato de amonio ferroso a fe (III), formando óxido44. Para solucionar este problema, se recomienda desgasificar los buffers y nitrógeno a la solución de proteína de burbuja a través de crudo para 1-2 minutos antes de colocarlos en la guantera. También, es importante asegurarse de que la atmósfera en la guantera es realmente O2-libre usando O2-tiras sensibles.\nEl último paso crítico, la enzima antes de caracterización cinética, la desalación requiere un ambiente libre de oxígeno y debe realizarse en hielo, como la proteína purificada es propensa a la desnaturalización a temperatura ambiente. Determinar cuándo la proteína desalada sale de la columna es esencial para éxito ensayos cinéticos, como las fracciones más concentradas dan los resultados más reproducibles. La fracción que se eluya la proteína desalada debe determinarse cada vez que un nuevo lote de proteína es purificado y cuando la columna es reembalada con resina nueva. Si actividad es baja durante los ensayos cinéticos y domines técnicamente los pasos de purificación y concentración, la cuestión puede mentir en el paso de la desalación. Cuando este paso de solución de problemas, es crucial para comprobar que el búfer de 50 mM Tris/10% t-butanol es completamente desgasificado, vuelva la columna con resina Sephadex fresca y asegurarse de que no hay ningún agujero en la bolsa de guante.\nDespués de DesB ha sido purificado con éxito y desalado, ensayos cinéticos utilizando el electrodo de oxígeno se deben realizar cuidadosamente para obtener datos sobre la actividad catalítica de la enzima. Medidas cinéticas son típicamente reproducibles cuando se utiliza una proteína catalíticamente activa y concentrada. Si los puntos de datos no son reproducibles cuando repitiendo una carrera por un punto de datos de concentración de sustrato o inhibidor, el problema puede ser que la proteína desnaturalizada u oxidado después del uso prolongado. Proteína recién desalada puede generarse para permitir la continuación de la recopilación de datos. Es importante mantener todos los frascos de la enzima, por lo que la concentración exacta de la proteína puede ser determinada después de la terminación de la recolección de datos usando un análisis de Bradford. Este paso se realiza después de las mediciones de cinética ya que la enzima pierde actividad con el tiempo, así que primero realizarlo puede llevar a menor actividad y mediciones de cinética inexacta. La concentración de proteína se utiliza para convertir tasas catalíticas observadas en las tasas de reacción son necesarios para determinar el número de facturación. Además de la preocupación por la pérdida de actividad enzimática cinética irreproducible resultados, degradación de la membrana que cubre el electrodo después de uso prolongado también puede causar problemas al reproducir datos. Degradación de la membrana se indica normalmente por un incremento en la señal inicial (entre 250-350 nmol/mL y >350 nmol/mL) o una incapacidad para alcanzar una tasa de fondo estable antes de adición de enzima (> ±5 nmol/mL/min). Si bien se observa, se recomienda desmontar el electrodo, limpiar cualquier óxidos apagado el electrodo con el polvo de limpieza suministrado, vuelva a montar el electrodo, y vuelva a calibrar.\nEl método de depuración anaerobia es muy importante para las enzimas con un centro de metal que puede ser oxidado, especialmente para aquellos que han enlazado firmemente metales que no pueden ser canjeados después de los pliegues de la proteína. Aunque las enzimas han evolucionado para protegerse a sí mismos mediante la coordinación de oxígeno solamente después de la coordinación de sustrato, lo han hecho en un ambiente celular - las cantidades de saturación de oxígeno en un ambiente en vitro pueden conducir a la rápida oxidación de los metales y la conversión de fe (II) a fe (III) forma inactivo31. Esta oxidación/inactivación puede conducir a resultados sesgados en la que la enzima no está en su estado catalítico activo. Los ensayos cinéticos utilizando un electrodo sensible de oxígeno pueden aplicarse a las enzimas que utilizan oxígeno como sustrato. En el lugar de obtención de parámetros de la cinética con el cambio en la intensidad de la absorción del sustrato o del producto, este método permite la visualización del consumo de oxígeno saturado en solución. Este método se ha utilizado previamente con LigAB, otro dioxygenase extradiol en la superfamilia de dioxigenasa protocatechuate que igualmente se basa en una fe (II) en su sitio activo para coordinar y unirse a sus sustratos.\nEste manuscrito también proporciona información adicional sobre la enzima DesB de cepa de SP Sphingobium SYK-6. Tras la obra que definió la función enzimática y la estructura de DesB10,19,39, se determinó en el presente que DesB es un catalizador competente de la dioxygenation de saúco, con kelgato de 17,8 ± 1.0 s-1 y Km de 45 μm ± 13, dando por resultado kgatokm de 3.98 x 105 M/s. Estas tasas son comparables a los determinados por otras enzimas dioxigenasa, incluyendo LigAB (kgato 51 s-1 y kcat/KM de 4,26 x 106 M-1s-1 ) y otros dioxygenases que tienen kcat/Km valores que van desde 105-108 M-1s-136,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.\nEl sitio activo de DesB fue demostrado previamente para ser en la interfaz de dimer, con residuos de ambos monómeros que contribuyen a la coordinación de sustrato [residuos provenientes del monómero que se une el fe (II) se indican por su número de residuo, mientras que los residuos desde el otro monómero se indican por su número de residuo y de un primer (es decir, Glu377ʹ)]6. En la ausencia de información estructural que muestra las interacciones de enlace de 4NC con DesB, las semejanzas estructurales y diferencias entre galato y 4NC permiten comprender mejor cómo DesB puede ser inhibida por 4NC. Gallate tiene tres sustituyentes hidroxilo en C3, C4 y C5, con sus C3 y C4 hidróxilos coordinados con el centro de fe (II) y el hidroxilo del C5 siendo coordinado por Glu377ʹ (figura 8). El grupo de ácido carboxílico C1 está coordinado por Tyr-391ʹ, 412ʹ de Tyr, Thr-13 y Thr-267 en el sitio activo de DesB. 4NC, que demostró para ser un inhibidor moderado de DesB, tiene dos hidróxilos disponibles para coordinar el centro de fe (II) y un grupo de nitro de C1 que es isosteric a un carboxilato (teniendo también dos oxígenos para la coordinación de residuos 391 412, 13 y 267), pero es mucho más electrón-retirar a los ácidos carboxílicos en galato. Desde 4NC muestra sólo el 36.6% inhibición de la dioxygenation DesB de galato de cuando el inhibidor estuvo presente en 5-fold exceso sobre el sustrato, no es de extrañar que no es un inhibidor muy potente (con una K de 2.3 ± 0,3 mM). Esto sugiere que el hidroxilo del C5 y C1 sustituto juegan un papel importante en la promoción del complejo enzima-ligando. Puesto que los residuos Glu377ʹ, Tyr-391ʹ y Tyr-412ʹ están implicados en estas interacciones, esto sugiere que DesB sitio activo contactos con monómeros adyacentes son importantes para la colocación de un compuesto y estructurar el sitio activo.\nLos autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.\nNos gustaría agradecer a Dr. Camille Keller de la Universidad de Wesleyan por soporte técnico. Agradecimiento especial a profesor Lindsay D. Eltis y Jenna K. Capyk de la Universidad de Columbia Británica, así como Christian Whitman de la Universidad de Texas en Austin, por su asesoramiento sobre métodos de purificación de la proteína anaerobia y el uso de una O2 -electrodo sensible.


Rusia frena una tregua en Alepo, donde Asad ya controla el 40% de la zona rebelde - Faro de Vigo\nRusia frena una tregua en Alepo, donde Asad ya controla el 40% de la zona rebelde\nEspaña, Egipto y Nueva Zelanda defendieron ayer en el Consejo de Seguridad de la ONU un proyecto de resolución para establecer una tregua humanitaria de diez días en la ciudad siria de Alepo, una iniciativa a la que se opuso Rusia, principal aliado del régimen de Damasco, que amenazó con vetarla.\nLa tregua era un intento por aliviar la situación que vive la población afectada por los combates en Alepo, donde el régimen sirio tiene en marcha una gran ofensiva contra los grupos rebeldes en el sector oriental de la ciudad. El jefe humanitario de la ONU, Stephen O'Brien, urgió a las partes en conflicto a proteger a los civiles y permitir la entrada de ayuda humanitaria en Alepo oriental, antes de que la zona "se convierta en un gigantesco cementerio".\nSegún la ONU, hasta 25.000 personas que vivían en la zona oriental de la ciudad se han visto obligadas a huir de sus hogares desde el pasado sábado, en medio de la gran ofensiva del régimen del dictador Al Asad para recuperar esos distritos.\nEl enviado especial de la ONU para Siria, Staffan de Mistura, aseguró que, gracias a la ofensiva en curso, el Gobierno sirio ha logrado recuperar el 40 por ciento del territorio que los grupos armados de la oposición controlaban en la zona oriental de Alepo, que ha quedado partida en dos.


Cuento XXXV El conde Lucanor - Juan Manuel - Ciudad Seva\nCuento XXXV El conde Lucanor[Cuento. Texto completo.]Juan ManuelLo que sucedi� a un mancebo que cas� con una muchacha muy rebelde\nOtra vez hablaba el Conde Lucanor con Patronio, su consejero, y le dec�a:\n-Patronio, un pariente m�o me ha contado que lo quieren casar con una mujer muy rica y m�s ilustre que �l, por lo que esta boda le ser�a muy provechosa si no fuera porque, seg�n le han dicho algunos amigos, se trata de una doncella muy violenta y col�rica. Por eso os ruego que me dig�is si le debo aconsejar que se case con ella, sabiendo c�mo es, o si le debo aconsejar que no lo haga. -Se�or conde -dijo Patronio-, si vuestro pariente tiene el car�cter de un joven cuyo padre era un honrado moro, aconsejadle que se case con ella; pero si no es as�, no se lo aconsej�is. El conde le rog� que le contase lo sucedido. Patronio le dijo que en una ciudad viv�an un padre y su hijo, que era excelente persona, pero no tan rico que pudiese realizar cuantos proyectos ten�a para salir adelante. Por eso el mancebo estaba siempre muy preocupado, pues siendo tan emprendedor no ten�a medios ni dinero. En aquella misma ciudad viv�a otro hombre mucho m�s distinguido y m�s rico que el primero, que s�lo ten�a una hija, de car�cter muy distinto al del mancebo, pues cuanto en �l hab�a de bueno, lo ten�a ella de malo, por lo cual nadie en el mundo querr�a casarse con aquel diablo de mujer. Aquel mancebo tan bueno fue un d�a a su padre y le dijo que, pues no era tan rico que pudiera darle cuanto necesitaba para vivir, se ver�a en la necesidad de pasar miseria y pobreza o irse de all�, por lo cual, si �l daba su consentimiento, le parec�a m�s juicioso buscar un matrimonio conveniente, con el que pudiera encontrar un medio de llevar a cabo sus proyectos. El padre le contest� que le gustar�a mucho poder encontrarle un matrimonio ventajoso. Dijo el mancebo a su padre que, si �l quer�a, pod�a intentar que aquel hombre bueno, cuya hija era tan mala, se la diese por esposa. El padre, al o�r decir esto a su hijo, se asombr� mucho y le pregunt� c�mo hab�a pensado aquello, pues no hab�a nadie en el mundo que la conociese que, aunque fuera muy pobre, quisiera casarse con ella. El hijo le contest� que hiciese el favor de concertarle aquel matrimonio. Tanto le insisti� que, aunque al padre le pareci� algo muy extra�o, le dijo que lo har�a. March� luego a casa de aquel buen hombre, del que era muy amigo, y le cont� cuanto hab�a hablado con su hijo, dici�ndole que, como el mancebo estaba dispuesto a casarse con su hija, consintiera en su matrimonio. Cuando el buen hombre oy� hablar as� a su amigo, le contest�: -Por Dios, amigo, si yo autorizara esa boda ser�a vuestro peor amigo, pues trat�ndose de vuestro hijo, que es muy bueno, yo pensar�a que le hac�a grave da�o al consentir su perjuicio o su muerte, porque estoy seguro de que, si se casa con mi hija, morir�, o su vida con ella ser� peor que la misma muerte. Mas no pens�is que os digo esto por no aceptar vuestra petici�n, pues, si la quer�is como esposa de vuestro hijo, a m� mucho me contentar� entregarla a �l o a cualquiera que se la lleve de esta casa. Su amigo le respondi� que le agradec�a mucho su advertencia, pero, como su hijo insist�a en casarse con ella, le volv�a a pedir su consentimiento. Celebrada la boda, llevaron a la novia a casa de su marido y, como eran moros, siguiendo sus costumbres les prepararon la cena, les pusieron la mesa y los dejaron solos hasta la ma�ana siguiente. Pero los padres y parientes del novio y de la novia estaban con mucho miedo, pues pensaban que al d�a siguiente encontrar�an al joven muerto o muy mal herido. Al quedarse los novios solos en su casa, se sentaron a la mesa y, antes de que ella pudiese decir nada, mir� el novio a una y otra parte y, al ver a un perro, le dijo ya bastante airado: -�Perro, danos agua para las manos! El perro no lo hizo. El mancebo comenz� a enfadarse y le orden� con m�s ira que les trajese agua para las manos. Pero el perro segu�a sin obedecerle. Viendo que el perro no lo hac�a, el joven se levant� muy enfadado de la mesa y, cogiendo la espada, se lanz� contra el perro, que, al verlo venir as�, emprendi� una veloz huida, perseguido por el mancebo, saltando ambos por entre la ropa, la mesa y el fuego; tanto lo persigui� que, al fin, el mancebo le dio alcance, lo sujet� y le cort� la cabeza, las patas y las manos, haci�ndolo pedazos y ensangrentando toda la casa, la mesa y la ropa. Despu�s, muy enojado y lleno de sangre, volvi� a sentarse a la mesa y mir� en derredor. Vio un gato, al que mand� que trajese agua para las manos; como el gato no lo hac�a, le grit�: -�C�mo, falso traidor! �No has visto lo que he hecho con el perro por no obedecerme? Juro por Dios que, si tardas en hacer lo que mando, tendr�s la misma muerte que el perro. El gato sigui� sin moverse, pues tampoco es costumbre suya llevar el agua para las manos. Como no lo hac�a, se levant� el mancebo, lo cogi� por las patas y lo estrell� contra una pared, haciendo de �l m�s de cien pedazos y demostrando con �l mayor ensa�amiento que con el perro. As�, indignado, col�rico y haciendo gestos de ira, volvi� a la mesa y mir� a todas partes. La mujer, al verle hacer todo esto, pens� que se hab�a vuelto loco y no dec�a nada. Despu�s de mirar por todas partes, vio a su caballo, que estaba en la c�mara y, aunque era el �nico que ten�a, le mand� muy enfadado que les trajese agua para las manos; pero el caballo no le obedeci�. Al ver que no lo hac�a, le grit�: -�C�mo, don caballo! �Pens�is que, porque no tengo otro caballo, os respetar� la vida si no hac�is lo que yo mando? Est�is muy confundido, pues si, para desgracia vuestra, no cumpl�s mis �rdenes, juro ante Dios daros tan mala muerte como a los otros, porque no hay nadie en el mundo que me desobedezca que no corra la misma suerte. El caballo sigui� sin moverse. Cuando el mancebo vio que el caballo no lo obedec�a, se acerc� a �l, le cort� la cabeza con mucha rabia y luego lo hizo pedazos. Al ver su mujer que mataba al caballo, aunque no ten�a otro, y que dec�a que har�a lo mismo con quien no le obedeciese, pens� que no se trataba de una broma y le entr� tant�simo miedo que no sab�a si estaba viva o muerta. �l, as�, furioso, ensangrentado y col�rico, volvi� a la mesa, jurando que, si mil caballos, hombres o mujeres hubiera en su casa que no le hicieran caso, los matar�a a todos. Se sent� y mir� a un lado y a otro, con la espada llena de sangre en el regazo; cuando hubo mirado muy bien, al no ver a ning�n ser vivo sino a su mujer, volvi� la mirada hacia ella con mucha ira y le dijo con much�sima furia, mostr�ndole la espada: -Levantaos y dadme agua para las manos. La mujer, que no esperaba otra cosa sino que la despedazar�a, se levant� a toda prisa y le trajo el agua que ped�a. �l le dijo: -�Ah! �Cu�ntas gracias doy a Dios porque hab�is hecho lo que os mand�! Pues de lo contrario, y con el disgusto que estos est�pidos me han dado, habr�a hecho con vos lo mismo que con ellos. Despu�s le orden� que le sirviese la comida y ella le obedeci�. Cada vez que le mandaba alguna cosa, tan violentamente se lo dec�a y con tal voz que ella cre�a que su cabeza rodar�a por el suelo. As� ocurri� entre los dos aquella noche, que nunca hablaba ella sino que se limitaba a obedecer a su marido. Cuando ya hab�an dormido un rato, le dijo �l:\n-Con tanta ira como he tenido esta noche, no he podido dormir bien. Procurad que ma�ana no me despierte nadie y preparadme un buen desayuno. Cuando a�n era muy de ma�ana, los padres, madres y parientes se acercaron a la puerta y, como no se o�a a nadie, pensaron que el novio estaba muerto o gravemente herido. Viendo por entre las puertas a la novia y no al novio, su temor se hizo muy grande. Ella, al verlos junto a la puerta, se les acerc� muy despacio y, llena de temor, comenz� a increparles: -�Locos, insensatos! �Qu� hac�is ah�? �C�mo os atrev�is a llegar a esta puerta? �No os da miedo hablar? �Callaos, si no, todos moriremos, vosotros y yo!\nAl o�rla decir esto, quedaron muy sorprendidos. Cuando supieron lo ocurrido entre ellos aquella noche, sintieron gran estima por el mancebo porque hab�a sabido imponer su autoridad y hacerse �l con el gobierno de su casa. Desde aquel d�a en adelante, fue su mujer muy obediente y llevaron muy buena vida. Pasados unos d�as, quiso su suegro hacer lo mismo que su yerno, para lo cual mat� un gallo; pero su mujer le dijo: -En verdad, don Fulano, que os decid�s muy tarde, porque de nada os valdr�a aunque mataseis cien caballos: antes tendr�ais que haberlo hecho, que ahora nos conocemos de sobra. Y concluy� Patronio: -Vos, se�or conde, si vuestro pariente quiere casarse con esa mujer y vuestro familiar tiene el car�cter de aquel mancebo, aconsejadle que lo haga, pues sabr� mandar en su casa; pero si no es as� y no puede hacer todo lo necesario para imponerse a su futura esposa, debe dejar pasar esa oportunidad. Tambi�n os aconsejo a vos que, cuando hay�is de tratar con los dem�s hombres, les deis a entender desde el principio c�mo han de portarse con vos. El conde vio que este era un buen consejo, obr� seg�n �l y le fue muy bien.\nComo don Juan comprob� que el cuento era bueno, lo mand� escribir en este libro e hizo estos versos que dicen as�: Si desde un principio no muestras qui�n eres,\nnunca podr�s despu�s, cuando quisieres. FINM�s cuentos de este autor


Postres fríos: Prueba estas deliciosas opciones para el verano - Gastrolab\nLas presentaciones ideales para días soleados y lluviosos se caracterizan por ser fríos, tales como gelatinas, mousses, bavaresas, y por supuesto, los que se elaboran con helado\nHelado. El postre ideal para el verano. Foto: Especial\nviernes, 17 de julio de 2020 · 02:08\nLos postres son todos aquellos platillos dulces que se sirven al final de una comida. Un aspecto importante en la selección de este plato es la estacionalidad, esto por dos factores: el primero es la temporalidad de los productos y el segundo, es la temperatura ambiental que va a influir en los gustos y preferencias del comensal.\nConsiderando lo anterior, ahora que nos encontramos en verano y que tenemos días soleados y lluviosos, los postres ideales son los fríos, tales como las gelatinas, mousses, bavaresas, y por supuesto, aquellos elaborados a base de helados.\nPara conocer más de su origen, te contamos de dónde proviene cada presentación que conocemos:\nLos chinos hacían bebidas y postres con hielo desde hace miles de años.\nLos árabes aprendieron a congelar almíbares y le dieron el nombre de sorbetes.\nLos italianos mejoraron el sabor y consistencia del helado gracias al uso de huevo, leche, crema y mezcla de frutas y licores.\nEs el tradicional del Oriente próximo. Se elabora con leche, azúcar y la raíz de una orquídea a la que se debe su nombre. Además, se le agrega agua de rosas o agua de jazmín.\nEs un helado italiano que contiene nata, huevo, azúcar y fruta.\nEl gelato que comenzu00f3 nuestra historia. Gelato de aceite de oliva ud83cudf66 . . . #helado #icecream #gelato #sweet #dessert #pastry #patisserie #mexican #art #natural #food #foodpic #foodporn #foodphotography #foodie #instafood #instapic #oliveoil #olive #foodstagram #picoftheday #cdmx #mexico #italian #tasty #yummy #delicious #foodlovers #instagram #happy\nA post shared by Joe Gelato (@joegelatomx) on May 29, 2020 at 11:42am PDT\nTambién es italiano, tiene una textura suave y cremosa. Se sirve a temperatura media.\nEl tradicional de la India. Se elabora al hervir leche hasta que se reduce y condensa. Se le da sabor con fruta, agua de rosas y cardamomo.\nSe elabora a base de agua, por lo que su textura es granulada y gruesa. Es un líquido congelado y sin batir, en donde los cristales de hielo se deshacen removiéndolos. Los más tradicionales son los de limón y de café.\nTambién se prepara con agua, no tiene productos lácteos, suele contener claras. Posee una textura de grano fino. Éste se puede comer entre los tiempos del menú para limpiar el paladar y ayudar a la digestión.\nEs un postre helado elaborado con crema fresca, yemas y un ingrediente especial como café, licor, fruta o chocolate. Se identifica por su forma de pan de caja.\nElaborado con helado, jarabe y fruta. Se decora con crema batida y cereza. Los clásicos son el Banana Split y el Kerbocker.\nDirectora de Academia Gastronomía y Servicio de ESDAI UP, CDMX\ncomida para verano Postres Gastronomía


Escolaso: un mes ideal para "montar a caballo" | Crónica | Firme junto al pueblo\nEL 24. Es el más salidor de julio en los últimos tres años.\n6 de Julio 2021 · 10:9hs.\nEscolaso: un mes ideal para montar a caballo.\nArrancó julio, el mes patrio en el que celebramos nuestra independencia que, esperemos, nos trate de buena manera económicamente hablando porque la situación es harto difícil. ¿Habrá resto para un buen locro familiar el 9? Ojalá que sí, pero si no, no hay problema: ¡Para eso están nuestros datos! Y también las estadísticas, aquellas que no se toman descanso en esta rueda infernal diaria de escolaso.\nEntonces, además de nuestras guías y de cualquier método particular, nada mejor que estar bien orientados con los numeritos más rendidores en este mes en los últimos tres años, para intentar acertar y cobrar unos pesos para llenar las billeteras, o lo que es lo mismo, respirar un poco mejor… ¡Pero con el barbijo puesto!\nComo se sabe, las estadísticas son el elemento más confiable en este rubro lúdico. Y para no extendernos demasiado se tomaron los resultados de 2020, 2019 y 2018 de este séptimo mes calendario, y el seguimiento arrojó que el ambo que más rédito produjo fue el 24, con nada menos que ¡13 cabezas!\nEn efecto, el caballo el año pasado salió cuatro veces (dos en Ciudad y dos en Santa Fe), mientras que en 2019 lo hizo en cinco oportunidades (tres en Provincia y dos en Santa Fe), y las cuatro restantes en 2018 (tres en Entre Ríos y una en Montevideo). De esto se desprende que tuvo muy buena onda en todas las Quinielas que se comercializan por estas pampas, sin sobresalir abrumadoramente en ninguna de ellas. Por lo tanto, a la hora del “fichaje” habrá que repartir equitativamente “las inversiones”… ¡Y a cobrar a todo galope!\nLuego, en el ranking de números que más beneficios dieron, aparecen el 08 y el 91, empatando en diez salidas. Con respecto al incendio, a diferencia del ambo anterior, arrasó en Ciudad con siete “bochos” (cuatro en 2018 y tres en 2019), mientras que los tres restantes fueron impactos cordobeses en 2019.\nEn cuanto al escusado, tuvo un idéntico comportamiento, es decir que se coronó en siete ocasiones pero en la Lotería santafesina (cuatro en 2019 y tres en 2018), correspondiéndole a Córdoba las otras tres cabezas, el año pasado.\nPor último, para subrayar lo llamativo de lo concretado por el 80 (la bocha), porque en los tres años anteriores salió ocho veces pero en todas las ocasiones en Córdoba. En efecto, dio triplete el año pasado y en 2018, y en 2019 lo hizo por duplicado. Cuánta efectividad, ¿no?\nEn la tabla adjunta se pueden observar los otros numeritos que también sumaron de lo lindo en este mes, y a los que obviamente se deberán considerar factibles de que ahora brinden ganancias.


Actualizado el: 03 DE MARZO DE 2017\nVMware Tools | 25 DE OCTUBRE DE 2016 | Compilación 4449150\nAdministración del ciclo de vida de VMware Tools: VMware Tools 10.1.0 es una versión principal con varias mejoras. Esta versión incorpora un enfoque simplificado y escalable para instalar y actualizar VMware Tools, además de actualización sin reinicio para las distribuciones de Linux más recientes. Asimismo, agrega también la compatibilidad con las actualizaciones OSP, una versión mejorada utilizando la IU y el envío de informes de estado con la API y la IU. Esta versión incluye varias mejoras de funciones, mejoras relacionadas con los controladores y compatibilidad con sistemas operativos invitados más recientes. VMware Tools 10.1.0 está disponible para sistemas operativos invitados actuales. VMware Tools 10.0.12 está disponible para sistemas operativos invitados heredados.\nCompatibilidad de VMware Tools con sistemas operativos invitados en la versión 10.1.0\ndarwin.iso admite la versión de Mac OS X 10.11.x y versiones posteriores.\nActualización sin reinicio para distribuciones recientes de Linux: Con la versión actual de VMware Tools, no es necesario reiniciar la mayor parte de los sistemas operativos Linux después de su actualización.\nNota: Para distribuciones de Linux anteriores donde los controladores PVSCI, VMXNET o VMXNET3 están actualizados, los sistemas operativos invitados se deben reiniciar después de la actualización.\nPrograma de mejora de la experiencia de cliente: El programa de mejora de la experiencia de cliente (CEIP) proporciona a VMware información que le permite mejorar sus productos y servicios, además de solucionar problemas. Cuando el usuario opta por participar en el CEIP, VMware recopila con regularidad la información técnica sobre el uso de los productos y los servicios de VMware en los informes del CEIP. Esta información no identifica al usuario de forma personal. Para obtener más detalles, consulte el Centro de documentación de vSphere.\nAutenticación del sistema operativo invitado VGAuth: VGAuth ofrece autenticación del sistema operativo invitado con diferentes mecanismos de autenticación. Se han solucionado problemas críticos en esta versión de VMware Tools 10.1.0.\nCompatibilidad con TLS: VMware Tools 10.1.0 es compatible con TLSv1.2.\nProblemas resueltos: Esta versión de VMware Tools 10.1.0 soluciona los problemas que se documentaron en la sección Problemas resueltos.\nEn las versiones anteriores, las imágenes ISO de VMware Tools se enviaban con la imagen ESXi. Las imágenes ISO al final de la vida de los sistemas operativos invitados se congelan. Las imágenes ISO congeladas están disponibles para su descarga desde http://my.vmware.com. Estas imágenes ISO no se envían con ESXi en tools-light VIB. Para obtener más información, consulte la página Documentación de VMware Tools.\nVMware Tools 10.1.0 está disponible en los siguientes idiomas:\nVMware Tools 10.1.0 es compatible con versiones admitidas de VMware vSphere ESXi 5.5 y versiones posteriores, VMware Workstation 12.0 y VMware Fusion 8.0. Consulte la Guía de compatibilidad de VMware para obtener más información.\nVMware Tools 10.1.0 habilita la compatibilidad con DirectX 10.0 y OpenGL 3.3 en invitados de Windows cuando se utiliza con VMware Workstation 12.0, VMware Fusion 8.0 y versiones de VMware vSphere en las que el dispositivo virtual admita la función requerida. El controlador OpenGL del sistema operativo invitado de VMware para Windows y Linux solo admite el perfil principal OpenGL 3.3. No se admite el perfil de compatibilidad de OpenGL3.3. El controlador del invitado OpenGL solo admite la versión 3.0 para los perfiles de compatibilidad.\nEl marco de agente común (CAF) es compatible en sistemas operativos invitados de 64 bits. No admite sistemas operativos invitados de 32 bits.\nNota: Para instalar o actualizar VMware Tools 10.0.12 en los sistemas operativos invitados heredados, se requieren las siguientes versiones: VMware ESXi 5.5, la versión de parche ESXi550-201608001, VMware ESXi 6.0, y la versión de parche ESXi600-201608001 y posteriores.\nLas siguientes versiones del controlador son compatibles con VMware Tools 10.1.0 en un sistema operativo invitado de Windows.\nControladores VMware Tools 10.1.0\n11.0.14.2 - Para sistemas operativos Windows Vista y posteriores\n10.1.0.0 - Para firma de código del modo Kernel\nActualización de OpenSSL.\nOpenSSL se actualiza a la versión 1.0.2h.\nLa máquina virtual de Windows en un host ESXi con VMware Tools instalado falla y aparece una pantalla de diagnóstico azul y un error\nLa máquina virtual de Windows en un host ESXi con VMware Tools instalado falla y aparece una pantalla de diagnóstico azul y un error similar al que aparece a continuación:\nEste problema se produce debido a una gran cantidad de asignación de memoria y a procesos de desasignación que se ejecutan en el sistema operativo invitado Windows. Esto produce un error de memoria en el controlador de la memoria de VMware Server.\nError en el inicio de VMware Tools después de la actualización del kernel del sistema operativo invitado de Linux\nError en la ejecución de VMware Tools después de su reinicio en un kernel diferente del sistema operativo invitado de Linux. Este problema ocurre debido a la incompatibilidad entre los módulos del kernel de VMware Tools con el kernel de Linux. Es necesario volver a instalar los kernels.\nEl problema está resuelto en esta versión. Los módulos kernel automáticos de VMware están habilitados de forma predeterminada en VMware Tools 10.1 y posteriores.\nError al ejecutar VMware Tools 10.0.x en el sistema operativo invitado Ubuntu 16.10\nSe produce un error al ejecutar VMware Tools 10.0.x en el sistema operativo invitado Ubuntu 16.10 cuando VMware Tools se instala utilizando un paquete .tar. Este problema se produce al reiniciar el sistema operativo invitado tras la instalación.\nError en la instalación de VMware Tools en FreeBSD si la versión de Perl es posterior a la 5.20\nError en la instalación de VMware Tools en FreeBSD si la versión de Perl es posterior a la versión 5.20, ya que la ruta al archivo ejecutable Perl ha sido modificada. Se muestra un error similar al siguiente:\nLa operación de la snapshot inactiva en un sistema operativo invitado de Linux puede producir un error en el host después de que el sistema de archivos del invitado pase al estado inactivo. Si este error persiste, el sistema de archivos del invitado pasará al estado inactivo incluso después de finalizar la operación de la snapshot y aparecerá un error en el cliente. En el archivo vmware.log, se generan mensajes de error similares a los siguientes.\nSe tiene constancia de que los siguientes problemas se producen en VMware Tools 10.1.0:


Clima en Minamata en febrero 2022 - Tiempo, Temperatura y Clima en febrero\nMinamata en febrero\nMinamata en febrero: Tiempo medio, Temperatura y Clima\nUsted piensa ir Minamata en Japón en febrero: compruebe cómo es el clima y las normas estacionales aquí.\nTiempo en Minamata en febrero 2022\nEl tiempo en Minamata en el mes de febrero procede de datos estadísticos de los últimos años. Puede ver las estadísticas climatológicas de todo el mes, pero también pulsando en las pestañas para comienzos, mediados y a finales del mes.\nEvolución diaria media de las temperaturas y precipitaciones en Minamata en febrero\nEstos gráficos permiten ver la evolución de las temperaturas mínimas/máximas medias así como el volumen de precipitaciones promedio diario por día en Minamata en febrero.\nClima de Minamata en febrero\nEl clima de Minamata en febrero es malo\nEl tiempo en febrero en Minamata es húmedo (con 2.8in de precipitaciones en 9 días). Debería notarse un empeoramiento en comparación con el mes anterior desde enero hay una media de 1.7in de lluvia en 8 días.\nEl clima es bastante frío en esta ciudad este mes, pero es pasable con ropa de abrigo. Las temperaturas suben hasta 54°F. Por la mañana la temperatura desciende hasta 50°F. Así que, el promedio de temperatura para este mes de febrero en Minamata es de 52°F. Estas temperaturas están muy alejadas de aquellos registros observados en Minamata en el mes de febrero con un registro máximo de 67°F en 2009 y un registro mínimo de 34°F en 2013. Puede esperar tener unos 1 días con temperaturas de hasta 65°F, o 3% del tiempo.\nEn febrero en Minamata, los días duran como promedio 11:02. El amanecer se produce a las 07:02 y se pone a las 18:04.\nCon un mal tiempo, febrero no es recomendado para visitar el lugar en Japón.\nSi quiere ir a Japón en febrero, hay más destinos con tiempo adecuado que en Minamata:\nEn febrero, Naha, Ishigaki-jima, Kagoshima (Kyushu), Yakushima, Miyazaki y Nago tienen un tiempo solo bueno, pero mejor que Minamata.\nMedia de la estación y temperaturas de Minamata en febrero\nTemperatura media del mar 64°F 62°F 62°F\nTemperatura más baja del mar 60°F 60°F 60°F\nLluvia 1.7in 2.8in 2.6in\nCaídas de nieve 3.6cm 1.8cm 0cm\nVisibilidad 9.58km 9.6km 9.75km\nHora de amanecer 07:20 07:02 06:28\nAquí está el tiempo registrado de Minamata en febrero 2021 día por día:\nSobre los datos meteorológicos en Minamata en febrero:\nLos datos meteorológicos en Minamata en febrero derivan de una media de la previsión meteorológica desde 2009 en Minamata. Además, hay un margen de error y estas previsiones deben ser consideradas solamente como información general. El tiempo en Minamata puede variar ligeramente de año a año, pero estos datos limitarán las sorpresas. Así que puede hacer sus maletas o verificar la cuando es la mejor época del año para ir a Minamata.


Caligrafía de luces...: Tereré jeré\nBastante se puede decir del tereré, sus ingredientes, su origen, lo imprescindible que es para muchos y sobre todo, cuánto nos identifica. Particularmente, creo que son más las cosas que se dicen en las rondas de tereré, los debates que nacen, o el silencio, que también habla.\nSin embargo, lo más importante de todo es esa mano que se extiende refrescante del hombre a la mujer, del padre a los hijos, del abuelo al nieto, y al revés. Sin clases, sin géneros, sin edad, porque, más que nada, el tereré es un lazo.-\n▲El tereré es para muchos una forma de trabajo, que los digan las infaltables vendedoras de guampas o poha ro’ysa. Para otros es una bebida indispensable en el día a día laboral\n▼¿quién no tomó tereré en una jarrita como esta?\npreciosa primera imagen, pasando el testigo. no lo he probado nunca, pero debe tener un sabor... espiritual!\nmuy lindas imagenes, emocionante porque trae lindos recuerdos de tantas rondas de terere!!!\nTomas excelentes !!!


La UE y Japón enarbolan la bandera del libre comercio con acuerdo ante el G20 | Profesionales Hoy\nInicioMercadoLa UE y Japón enarbolan la bandera del libre comercio con acuerdo ante el G20\n“Japón y la UE enarbolaremos la bandera del libre comercio” frente a las “tendencias proteccionistas”, dijo el primer ministro japonés, Shinzo Abe, en una rueda de prensa al término de la cumbre celebrada en Bruselas.\nEl mandatario nipón subrayó que el acuerdo, que une a dos socios que copan el 40 % del comercio y el 30 % del PIB mundial, es un “logro” del que “estar orgullosos” y al mismo tiempo “envía un mensaje fuerte al mundo”.\n“Aunque algunos dicen que estamos volviendo al tiempo del aislacionismo y la desintegración, estamos demostrando que ese no es el caso”, dijo Tusk.\n“He dejado claro que los tribunales privados no tienen cabida a la hora de decidir sobre temas de interés público”, dijo el presidente de la Comisión Europea, Jean-Claude Juncker, quien agregó que la UE consultará con sus socios para establecer un sistema multilateral de tribunales de inversiones.\nUna vez entre en vigor, el tratado permitirá liberalizar el 91 % de las importaciones desde la UE hacia Japón y hasta el 99 % cuando se aplique en su totalidad. A día de hoy, estas importaciones suponen unos 86.000 millones de euros y generan 600.000 empleos en los Veintiocho, según la Comisión Europea.\nLa UE, por su parte, liberalizará en un primer momento el 75 % de las importaciones niponas para pasar, a lo largo de un periodo de 15 años, a liberalizar el 100 %.\nEl “gran ganador”, según la UE, será el sector agroalimentario comunitario, donde se eliminarán los aranceles para el 85 % de las importaciones.\nSe suprimirán desde el primer día las tarifas para el vino, lo que permitirá al sector ahorrar 134 millones de euros, mientras que para el queso -que ahora tiene aranceles de hasta el 29,8 %- estas se eliminarán o reducirán en función de la variedad.\nEl acuerdo incluye también una cláusula que permite a la UE reintroducir tarifas arancelarias en caso de que Japón coloque “barreras” a las exportaciones europeas.\nJapón y la UE firmaron hoy también un Acuerdo de Asociación Estratégica que servirá de “marco” para su cooperación en áreas tradicionales, como energía o clima, pero también nuevas, como el ciberdelito o la gestión de desastres.


Vinaròs sigue pidiendo soluciones a la reversión de la N-340 – Vinaròs News\nVinaròs sigue pidiendo soluciones a la reversión de la N-340\nVINARÒS 8 gener, 2018 Vinaròs News\nX.FLORES-E. F. El año 2018 ha comenzado en Vinaròs sin que desde el consistorio se cuente ya con una solución satisfactoria desde el Ministerio...\nEl año 2018 ha comenzado en Vinaròs sin que desde el consistorio se cuente ya con una solución satisfactoria desde el Ministerio de Fomento para la reversión del tramo urbano de la antigua N-340.\nEl ayuntamiento pide la concreción de lo que se ha ido hablando desde que se hizo la demanda de cesión: una carretera asfaltada correctamente y el alumbramiento de los cruces de la nueva variante con las nacionales 232 y 238, como se pedía en el acuerdo del plenario. Así lo ha hecho constar el alcalde Enric Pla, añadiendo que al ayuntamiento le gustaría alguna actuación sobre el puente sobre el Cervol de la antigua N-340, “con graves problemas de inundabilidad”.\nEl alcalde lamenta que “se nos dijo hace cuatro meses que se nos haría llegar una propuesta y todavía no hemos recibido nada. Pienso que hablamos de una obligación que no se puede resolver en un dinero de remanentes para hacer unos parches”. Pla destaca que “Vinaròs tiene, entre la antigua N-340 y los tramos de las N-232 y 238 que van hasta la variante, más del doble de carretera que los otros municipios afectados. No podemos aceptar esa cesión de un elemento tan caro de mantener en las mejores condiciones, las que el gobierno de España debe garantizar como ciudadanos que tenemos los mismos derechos, vivamos donde vivamos. No es comprensible que, después de una variante que ha costado más de 60 millones (y no es ninguna maravilla), el gobierno de España no tenga un millón por cedernos esta carretera en buenas condiciones”.\nFinalmente, decir que el pleno ha aprobado el plan normativo anual, en el que están las ordenanzas a modificar. Entre ellas, las regulaciones del aparcamiento, de bolsas de locales comerciales, espacios sin uso para oenegés, o sobre la construcción de una bolsa de viviendas destinadas al alquiler social. Asimismo, figuran los reglamentos de medio rural, la tenencia de animales, del uso del centro de conocimiento Vinalab y el de participación ciudadana.


Crecer felices ante grandes cambios de vida – Montessori Mami\nEl nuevo libro de Marta Prada, autora del blog Pequefelicidad, es como abrir un regalo un día inesperado. No porque sea tu cumpleaños o Navidad, es un regalo porque te lo mereces. Crecer felices ante grandes cambios de vida es el libro que te va ayudar a encontrar tu camino, ese que está lleno de imprevistos y situaciones no deseadas. Todas y cada una de las piedras han sido analizadas por Marta para ayudarte a pasar por encima de ellas en vez de tenerlas enquistadas para siempre en tu mochila de vida.\nUna guía por los diversos cambios que vivimos en diferentes esferas y que incluye un tema de total actualidad como es la pandemia por la COVID-19. Un análisis pormenorizado del confinamiento pasado y del baile emocional que sentimos ante la incertidumbre del próximo otoño-invierno mezclado con las ganas de nueva normalidad.\nYo creo que es como si en la misma discoteca sonara a la vez reguetón y un vals, cada uno va con el paso que puede fijándose en los demás. Y en medio de la pista está Marta, como una bola, repartiendo luz, para que paremos, dejemos de prestar atención al ruido y enfoquemos en nuestro cuerpo y nuestra mente. Sabiendo que en los reflejos que provocamos están siendo observados por los peques.\nYa solo con el índice te das cuenta de lo especial y único que es este manual de felicidad. Porque sí, aunque trate en profundidad todos los obstáculos que nos encontramos niños y adultos, el mensaje del libro no puede ser más positivo. La separación en tres bloques (Adulto; Niño; Cambios) aporta una visión global de cómo acompañar a los peques cuando su día a día se transforma. Cada uno de los capítulos está pensado para conocerte y reconocer emociones, creencias limitantes a la par que te ofrece soluciones en el terreno práctico con pequeños cambios que van a la capa más profunda de la conexión con la infancia.\nTu actitud, la clave\nSi algo deja claro Crecer felices ante grandes cambios de vida es que nuestra forma de pensar, de mirar y de obrar va a dejar una huella en los niños y niñas de nuestro entorno. Nuestro patrón de respuesta es lo que ellos normalizarán en su esquema de orden mental. Toda la formación montessoriana de la autora está patente, junto a su estilo cercano y lleno de vivencias reales (suyas y de asistentes a sus talleres presenciales). Cada párrafo del libro es Marta hablándote como si te tuviera enfrente.\nMudanzas, separaciones, escolarización, divorcios, llegada de hermanos, dificultades económicas… cada uno de estos grandes cambios de vida vistos desde el cristal de la infancia. Solo Marta nos podía brindar un libro del desarrollo humano así, haciendo humor y poniendo bondad cuando todo parece derrumbarse. La descripción, ese ponerse en la piel de lo que vivencian los niños, está muy detallada y con citas de expertos en cada materia.\nAunque lo que de verdad te va a llamar la atención son los destacados. Cada uno de los testimonios reales recogidos te van a dejar una huella, bien para cerrar una cicatriz, bien para un tatuaje de lo que no quieres que se te olvide en el futuro. Y como guinda, soluciones sencillas, concretas y dinámicas para adaptarnos a la individualidad de nuestros hijos e hijas.\nEl poso que me ha dejado\nAparte de una reafirmación en muchos de los aspectos de mi crianza, el libro Crecer felices ante grandes cambios de vida me ha dado una bofetada de realidad. María, lo que cuenta es el aquí y el ahora. La infancia se pasa en un pestañeo, pero marca para siempre suelo decir yo en mis cursos. Tenía tantas ganas de comprender experiencias que he vivido que me lo he devorado en dos mañanas, mientras hacía de “figura sombra” (léase el libro capítulo de escolarización) en la adaptación real de mi hijo en su escuela Montessori.\nSi me sigues por redes sociales, sabrás que me he mudado recientemente. Un salto al vacío que es uno de los grandes cambios de vida. Empezar de cero a 400 kilómetros de distancia de la familia, empaquetar tu casa e ir a un lugar desconocido. Por suerte, este cambio era profundamente deseado por mí para mejorar la educación de mi hijo y la calidad de vida de la playa.\nAún así, el libro me ha permitido profundizar en lo que han sentido los de mi alrededor. Y comprobar que algunas de las dinámicas propuestas por Marta, son las que mejor funcionaron a nuestra familia. Así que doy fe de la ayuda real que es.\nY ahora, es cuando tengo que parar y respirar. Quiero hablarte de la parte del libro que me ha removido hasta dejarme sin lágrimas. Esa en la que aún me queda trabajo por hacer. Marta dice que escribió el libro con el corazón en la mano y no hay duda de ello porque lo que hay en sus páginas es pura emoción. La esencia de la vida misma: la muerte. Porque sin una no existe la otra.\nEn este capítulo, relata cómo afecta a una familia la pérdida de la madre. Me ha hecho revivir el fallecimiento de mi madre por cáncer. Y es duro dejar aflorar esas emociones, dejarlas ir y sanar. Para estar preparada con la fortaleza mental suficiente para que cuando de nuevo la muerte, lo propio del ciclo de la vida, nos llegue, saber cómo transmitir el mensaje y que necesidades hay que cubrir ahora que lo viviré también como madre.\nPara mí el dolor propio y ajeno, las quebraduras del corazón y de la razón, lo que nos desestabiliza requiere de mucha meditación, apoyo y abrazos sin medida. Marta te lo da con ese calor de quien ha escuchado mucho y quien ha vivido intensamente por hacer felices a los demás. Gracias por esta obra.\nPuedes comprar su libro en Amazon:\nTambién puedes leer las reseñas de otros libros publicados por la autora que he escrito\nReseña Cuentos Montessori para crecer felices\nReseña Cuentos Montessori para las buenas noches\nPorque crecer felices es tener adultos que cambian su mente para que lo esencial se quede estable: las risas en la infancia ♥\nCategorías Blog Etiquetas libro, montessori, reseña Navegación de entradas


Euskadi no se adhiere a la declaración sobre Atención Primaria porque no contempla su plena competencia en la materia – Noticias de Política Online\nEuskadi no se adhiere a la declaración sobre Atención Primaria porque no contempla su plena competencia en la materia\nGobierno Vasco considera que la declaración anuncia actuaciones que “se adentran dentro del ámbito de sus competencias”\nEuskadi no se ha adherido a la declaración institucional del Sistema Nacional de Salud sobre la Atención Primaria porque el texto “no contempla la plena competencia” del País Vasco en esta materia, según ha destacado el Gobierno Vasco.\nEl Departamento vasco de Salud, en un comunicado, ha explicado que Euskadi comparte con el Ministerio de Sanidad y las consejerías Salud del resto de las comunidades y ciudades autónomas el “importante papel” que la Atención Primaria ha desempeñado en la lucha contra la Covid-19 y en el proceso de vacunación.\nTambién comparte que la Atención Primaria es “un pilar fundamental para lograr el derecho a la protección de la salud de la población”, así como para “garantizar una atención cercana, equitativa y cohesionada”. Euskadi entiende, asimismo, que es necesario evaluar de forma continua este servicio sanitario para “fortalecerlo y para que pueda hacer frente a las nuevas necesidades que se plantean en la sociedad”.\nSin embargo, el Gobierno Vasco no comparte es que en la declaración se anuncie la elaboración de planes de acción antes de la finalización de este año 2021 “sin tomar en consideración que Euskadi, como el resto de las Comunidades Autónomas, tiene competencias exclusivas en esta materia”.\nSegún ha declarado la consejera de Salud del Gobierno Vasco, Gotzone Sagardui, Euskadi ha participado en la elaboración de un marco estratégico de Atención Primaria y “siempre está dispuesta a colaborar con otras instituciones y a aportar su experiencia”.\n“Lo que no comparte es que se anuncien planes que incluyen materias que son competencia exclusiva de Euskadi, tales como la práctica clínica, la resolución diagnóstica, el crecimiento profesional, los sistemas de información, la digitalización, política presupuestaria o los recursos humanos”, ha subrayado.\nDe este modo, el Ejecutivo vasco comparte la puesta en valor de la Atención Primaria, pero considera que la declaración “anuncia actuaciones que se adentran dentro del ámbito de sus competencias” y, por ello, no ha votado a favor de la declaración y, por lo tanto, no se ve vinculada a los compromisos que en la misma se adoptan. “Euskadi establecerá compromisos y líneas de trabajo propias en función de las competencias que le asisten”, ha concluido.\nEtiquetas: españa, guipúzcoa, país vasco, salud\nDoscientas personas participarán en un proyecto piloto europeo para reforzar sus competencias básicas y digitales\nErdogan ve en una nueva Constitución turca el “regalo perfecto” para celebrar el centenario de la república


Una avería deja casi ocho horas sin luz a los vecinos de Frula\nEl alcalde del municipio ha mostrado su malestar por la falta de información proporcionada por la compañía, que recuerda que dispone de un teléfono preferente para ayuntamientos que no llegó a ser utilizado.\nPlaza Mayor de Frula\nUna avería en una instalación particular dejó este pasado viernes casi ocho horas sin luz a los vecinos de la localidad de Frula.\nLa incidencia, que comenzó cerca de las 14.00, se prolongó 7 horas y 25 minutos y en total, afectó a 355 clientes. La causa fue la desconexión de la línea Montesusín-Frula, que se produjo a consecuencia de una avería registrada en las instalaciones de bombeo de la comunidad de regantes de Montesusín, según han explicado desde Endesa.\nLa falta de luz impidió un normal funcionamiento del bar, la farmacia o la tienda de la localidad de Frula. También causó afecciones en las viviendas, especialmente en aquellas cuya calefacción y agua caliente dependen del sistema eléctrico, según ha detallado el alcalde del municipio, Joaquín Monesma.\nA raíz de esta incidencia, el primer edil tiene previsto elevar una queja al departamento aragonés de Industria así como a Endesa, "por la desinformación sufrida durante toda la jornada". "Las averías pueden darse en cualquier momento y además, pueden ser difíciles de localizar y reparar, pero, una vez ocurren, lo lógico es que un ayuntamiento y sus vecinos tengan acceso a una explicación en lugar de ser atendidos solo por una máquina", ha señalado Monesma.\nDesde Endesa, explican que los ayuntamientos y sus responsables disponen de un teléfono preferente en el que reciben información de las diferentes incidencias y que en este caso no fue utilizado. El número ya ha sido facilitado para futuras averías.\nEl dinero de un viaje de estudios de Binéfar servirá para apoyar al comercio local\nEl libro ‘Ingenieros y fotógrafos’ incluye las fotos más antiguas del Monasterio de Sijena\nLa SD Huesca se encarga de la nueva iluminación navideña de la plaza Navarra


Apto Todo Publico: ¡Colaboremos con el Censo 2010!\n¡Colaboremos con el Censo 2010!\nEl Censo Nacional 2010 se realizará mañana, entre las 8 y las 20, de la mano de 650 mil personas que recorrerán nuestro país. El censista estará identificado con una tarjeta inviolable de 10 por 15 centímetros, que su titular deberá llevar colgada del cuello, en cuyo frente tiene impreso el logotipo del censo, el nombre del censista y su documento de identidad.\nEl Censo 2010 es considerado por las autoridades como el "más inclusivo de la historia". Solo sabiendo cuantos y quienes somos, podremos avanzar mejor hacia una mejor calidad de vida para todos.\nEl formulario debe ser completado por el censista que fue capacitado para esa función, quien debe usar un lápiz especial ya que los datos serán leídos por un lector óptico.\nHay tres tipos de cuestionarios: el básico contiene 35 preguntas -9 referidas a la vivienda y al hogar, y 16 referidas a cada uno de los integrantes del hogar (dura 11 minutos)-; el ampliado tiene 67 preguntas -28 referidas a la vivienda y al hogar; 39 referidas a cada uno de los integrantes del hogar (dura 20 minutos)-, y un tercer cuestionario para las viviendas colectivas, como hospitales, geriátricos, penales y hoteles.\nRecuerde responder claramente y con la verdad, ya que si bien no le exigen documentación, sólo así se podrán generar los programas mas adecuados e inclusivos. No necesita abrir la puerta para que el censista ingrese a su domicilio, ya que el o la censista no necesita ver el interior de su casa, pero tenga en cuenta que es una persona que estará con Ud. no más de 20 minutos, por lo que no estaría mal que le brinde un lugar para que realice su trabajo con mas comodidad.\nSitio oficial del Censo 2010\nNo nos olvidemos que las visitas del censista pueden ser desde las 8:30 hasta las 20hs.\nEl censista llama tres veces y si no ya no insiste en ese domicilio.


Gran carreria terciaria para deportistas (Recomendado) - General - tuRiver\nGran carreria terciaria para deportistas (Recomendado)\nrodolfitous August 16, 2019, 7:09pm #1\nLes comento que en River Plate esta abierta la inscripción para aquellos que quieran seguir con la carrera “Educación física”. La misma se dicta dentro del mismo club. Me parece una linda carrera para aquellos amantes del deporte.\nMás información: https://www.facebook.com/iuniversitarioriverplate\nrodolfitous August 25, 2019, 3:26am #2\nnico August 25, 2019, 3:26am #3\nTema: Promocionar la Universidad River\nNo, no te envió el viejo sodomita. :lol:\nEvidentemente el viejo pedobear necesita mas muchachitos en sus filas y los quiere fornidos :lol:\nSivori August 25, 2019, 3:26am #4\nNo, gracias. Mira si se agarran los barras :lol:\nRiojano August 25, 2019, 3:26am #5\nVIEJO PUTO SUCCIONADOR DE MINI PENES DE NENITOS DE 3 AÑOS ASQUEROSO\nNico_El_Pueblito August 25, 2019, 3:26am #6\nYo la estudiaba en Avellaneda gratis. Buenas materias hay , tendría q ver si vuelvo el prox año\nmorlock August 25, 2019, 3:26am #7\nmenores de 15 años estudian gratis (?)\nGuido747 August 25, 2019, 3:26am #8\nLas clases se dictan en la confiteria que dicen que el ambiente es mas tranqui para estudiar.\nMichael_The_Hen September 25, 2019, 10:09am #9\nLas clases se dictan en la confiteria que dicen que el ambiente es mas tranqui para estudiar\nHay exhibiciones de MMA cada 2 horas dicen por el club\ndie_palermo14 August 25, 2019, 3:26am #10\nLa tesis se hace sobre el arte marcial “KALI”, con palos y cuchillos. Obviamente a rendir en el auditorio de la confiteria.\nnico August 25, 2019, 3:26am #11\nImaginate estas dando un examen aparecen las barras a darse facasos, a cagarse a palos… jajaajjj\nRamiroMillonario August 25, 2019, 3:26am #12\nbori August 25, 2019, 3:27am #13\nMarto August 25, 2019, 3:27am #14\nY la parte de la “gran carrera” es cuando tenés que salir corriendo del club. Sería una especie de 400 metros solo que en lugar de vallas tenés que saltar las mesas.\nCalzada_Proxeneta September 25, 2019, 10:09am #15\nY la parte de la “gran carrera” es cuando tenés que salir corriendo del club. Sería una especie de 400 metros solo que en lugar de vallas tenés que saltar las mesas\nes que nunca vas a ser un gran deportista si no rendis bajo presión.\nes como un examen final, te tiran una patada…wooop, salto de rana, un palazo…wop lagartija…\nMax_Power August 25, 2019, 3:27am #16\nRicky August 25, 2019, 3:28am #17\nno se toman nada en serio, la puta madre… :lol::lol:\nRaul_Carp September 25, 2019, 10:09am #18\nno se toman nada en serio, la puta madre… :lol::lol\nEn eso pensaba, capaz que el tipo realmente se llama Rodolfo y viene con toda la onda a compartir algo interesante totalmente imparcial, alejado de la politica del club ó de cualquier tipo de especulación. Y lo matan de una :lol:\nnico September 25, 2019, 10:09am #19\nY bueno, justamente en River arranco Crossfit, es parte del entrenamiento.\nMarto September 25, 2019, 10:09am #20\nEn eso pensaba, capaz que el tipo realmente se llama Rodolfo y viene con toda la onda a compartir algo interesante totalmente imparcial, alejado de la politica del club ó de cualquier tipo de especulación. Y lo matan de una :lol\nSerían dos casualidades. Que se llame Rodolfo y venga con toda la onda. No creo en dos casualidades simultáneas, qué querés que te digas.\nY además el nombre Rodolfo es una verga. :lol: